PT2254586E

PT2254586E - Partículas de células estaminais mesenquimais

Info

Publication number: PT2254586E
Application number: PT97125710T
Authority: PT
Inventors: Sai Kiang Lim
Original assignee: Agency Science Tech & Res
Priority date: 2008-02-22
Filing date: 2009-02-21
Publication date: 2015-05-18
Also published as: US20150190430A1; US20170189449A1; US10780128B2; CN104127438A; JP5718648B2; DK2254586T3; CN102014934B; US20110003008A1; SI2254586T1; PL2254586T3; HUE026536T2; HRP20150510T1; EP2254586A1; KR20100122087A; KR101640381B1; EP2254586B1; ES2537516T3; AU2009215934B2; WO2009105044A1; AU2009215934A1

Description

DESCRIÇÃO "PARTÍCULAS DE CÉLULAS ESTAMINAIS MESENQUIMAIS"

CAMPO A presente invenção diz respeito aos campos de desenvolvimento, biologia celular, biologia molecular e da genética. Mais particularmente, a invenção refere-se a exossomas e a métodos de obtenção de exossomas a partir de células estaminais mesenquimais .

ANTECEDENTES

As células estaminais, ao contrário de células diferenciadas, têm a capacidade de se dividir e de se autorrenovar ou diferenciar em células filhas fenotipicamente e funcionalmente diferentes (Keller, Genes Dev. 2005;19:1129-1155; Wobus e Boheler, Physiol Rev. 2005;85:635-678; Wiles, Methods in Enzymology. 1993;225:900-918; Choi et al, Methods Mol Med. 2005;105:359-368).

As células estaminais mesenquimais (MSCs) são células estaminais multipotentes que documentaram provas de eficácia terapêutica no tratamento de lesões musculoesqueléticas, melhoria da função cardíaca na doença cardiovascular e melhoria da gravidade de GVHD (Le Blanc e Pittenger, 2005). Sendo restritas em termos de linhagem, elas têm um limitado mas robusto potencial para se diferenciarem em tipos de células mesenquimais, por exemplo, adipócitos, condrócitos e osteócitos, e têm risco negligenciável de formação de teratomas. A rejeição imunológica de hospedeiro da MSCs transplantadas é rotineiramente contornada através de transplante autólogo ou alogénico. As MSCs podem ser isoladas a partir de vários tecidos adultos incluindo a medula óssea (BM), os tecidos adiposos (ad), sangue de cordão umbilical e ser expandidas ex vivo.

As células estaminais mesenquimais têm sido usadas em aplicações clinicas e pré-clinicas para o tratamento de uma ampla gama de doenças1'2 incluindo a biomanipulação3'4 do tecido musculoesquelético e doença cardíaca5'6. A capacidade terapêutica das MSCs para tratar um amplo espetro de doenças em aplicações clínicas e pré-clínicas para o tratamento de uma ampla gama de doenças [Al, A2 ] , por exemplo, GVHD [Al] em biomanipulação de tecido musculoesquelético [A3, A4], e doença cardíaca [A5, A6] tem sido atribuída ao seu potencial para se diferenciarem em muitos tipos de células reparadoras diferentes.

No entanto, a disponibilidade de tecidos para o seu isolamento permanece limitante e requer procedimentos invasivos de risco, e a expansão ex vivo das MSCs embora significativa é, no entanto, finita. No entanto, a eficiência de MSCs transplantadas em se diferenciarem em células reparadoras funcionais nos tecidos ou órgãos lesados, e em números terapeuticamente relevantes nunca foi devidamente documentada ou demonstrada.

Relatórios recentes sugeriram que alguns destes efeitos reparadores podem ser mediados por fatores parácrinos secretados pelas MSCs7. Esses fatores são postulados como promovendo a arteriogénese através de mecanismos8 de paracrina, apoiam a cripta de células estaminais no intestino9, protegem contra a isquemia renal10'11, lesão do miocárdio12-15 e tecido do limbo16; apoiam e mantêm a hematopoiese17, formam de suporte de megacariócitos e pró-plaquetas18 . Há uma necessidade não atendida de uma opção terapêutica "pronta a usar", baseada em MSC, a custos acessíveis, com melhor controlo de qualidade e consistência. Este é um requisito para proteção urgente contra a lesão, como a lesão de reperfusão em pacientes com enfarte agudo do miocárdio MI.

SUMÁRIO

Descrevemos uma partícula segregada por uma célula estaminal mesenquimal e compreendendo pelo menos uma propriedade biológica de uma célula estaminal mesenquimal.

De acordo com um primeiro aspeto da presente invenção, nós fornecemos um exossoma isolado a partir de uma célula estaminal mesenquimal e tendo um tamanho compreendido entre 50 nm e 100 nm, tal como determinado por microscopia eletrónica, o exossoma compreendendo pelo menos uma propriedade biológica de uma célula estaminal mesenquimal. A propriedade biológica pode compreender uma atividade biológica de um meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM). A atividade biológica pode compreender a cardioproteção. O exossoma pode ser capaz de reduzir a dimensão do enfarte. A redução do enfarte pode ser ensaiada num modelo de ratinho ou suíno com isquemia do miocárdio e danos de reperfusão. 0 exossoma pode ser capaz de reduzir o stress oxidativo. A redução do stress oxidativo pode ser avaliada num ensaio in vitro de morte celular induzida por peróxido de hidrogénio (H2O2) . 0 exossoma pode conter pelo menos 70% de proteínas em meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM). As proteínas podem ser selecionadas a partir da lista mostrada na Tabela Dl ou E2 ou podem ser produtos de genes dos genes mostrados na Tabela D2 ou compreender um ou mais miARNs como mostrado na Tabela E3. O exossoma pode compreender um complexo de peso molecular >100 kDa. O complexo de peso molecular >100 kDa pode compreender proteínas de <100 kDa. O exossoma pode compreender um complexo de peso molecular >300 kDa. O complexo de peso molecular >300 kDa pode compreender proteínas de <300 kDa. O exossoma pode compreender um complexo de peso molecular >1000 kDa. O tamanho do exossoma pode ser determinado por filtração contra um filtro de 0,2 μΜ e concentração contra uma membrana com um limite de peso molecular de 10 kDa. O exossoma pode compreender um raio hidrodinâmico de abaixo de 100 nm. Pode compreender um raio hidrodinâmico de entre cerca de 30 nm e cerca de 70 nm. Ele pode ser de entre cerca de 40 nm e cerca de 60 nm, tal como entre cerca de 45 nm e cerca de 55 nm. O exossoma de células estaminais mesenquimais pode compreender um raio hidrodinâmico de cerca de 50 nm. O raio hidrodinâmico pode ser determinado por difração de laser ou por dispersão de luz dinâmica. 0 exossoma pode compreender um lípido selecionado a partir do grupo que consiste em: fosfolípido, fosfatidil serina, fosfatidil inositol, fosfatidil colina, esfingomielina, ceramidas, glicolípido, cerebrósido, esteroides, colesterol. A proporção de colesterol-fosfolípido pode ser maior do que 0,3-0,4 (mol/mol). O exossoma pode compreender uma secção lipídica. O exossoma pode ser insolúvel em detergente não-iónico, de preferência Triton-X100. O exossoma pode ser tal que as proteínas de pesos moleculares substancialmente especificados permaneçam nos complexos dos pesos moleculares determinados, quando o exossoma é tratado com um detergente não iónico. O exossoma pode ser sensível à ciclodextrina, de preferência 20 mM de ciclodextrina. O exossoma pode ser tal que o tratamento com ciclodextrina provoque dissolução substancial dos complexos referidos. O exossoma pode compreender ácido ribonucleico (ARN). O exossoma pode ter uma razão de absorvância de 1,9 (260:280 nm) . O exossoma pode compreender um antigénio de superfície selecionado de entre o grupo que consiste em: CD9, CD109 e Thy-1.

Descreve-se um método de produção de uma partícula, tal como descrito acima, compreendendo o método o isolamento da partícula a partir de um meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM).

De acordo com um 2o aspeto da presente invenção, é proporcionado um método de produção de um exossoma como descrito acima, compreendendo o método: (a) obtenção de um meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM); (b) concentração do meio condicionado de células estaminais mesenquimais; (c) submeter o meio condicionado de células estaminais mesenquimais concentrado a cromatografia de exclusão de tamanho; e (d) seleção de frações absorventes UV. 0 tamanho pode ser selecionado a partir dos tamanhos acima enunciados.

Também é descrito um método de produção de uma partícula, tal como descrito acima. 0 método pode compreender a obtenção de um meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM). Pode compreender a concentração do meio condicionado de células estaminais mesenquimais. 0 meio condicionado de células estaminais mesenquimais pode ser concentrado por ultrafiltração através de uma membrana >1000 kDa. O método pode compreender a sujeição do meio condicionado de células estaminais mesenquimais concentrado para cromatografia por exclusão de tamanho. Uma coluna TSK Guard SWXL, 6x40 mm ou um gel TSK G4000 SWXL, 7,8 x 300 mm de coluna pode ser empregue. Frações absorventes de UV podem ser selecionadas, por exemplo, a 220 nm, que apresentam dispersão dinâmica de luz. A dispersão de luz dinâmica pode ser detetada por um detetor de dispersão de luz quasi-elástico (QELS). Frações podem ser obtidas, as quais eluem com um tempo de retenção de 11-13 minutos, tal como 12 minutos.

Proporciona-se, de acordo com um 3o aspeto da presente invenção, uma composição farmacêutica que compreende um exossoma como descrito em conjunto com um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.

Como um 4o aspeto da presente invenção, o exossoma acima descrito ou a composição farmacêutica é proporcionado para utilização num método de tratamento de uma doença.

Proporciona-se, de acordo com um 5o aspeto da presente invenção, a utilização do exossoma acima descrito para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença, em que a doença é selecionada a partir do grupo consistindo de: falha cardíaca, doença da medula óssea, doença de pele, queimaduras e doenças degenerativas tais como a diabetes, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, cancro, enfarte do miocárdio, ferida cutânea, um distúrbio dermatológico, uma lesão dermatológica, dermatite, psoríase, condiloma, verrugas, hemangioma, queloide, cancro da pele, dermatite atópica, doença de Behcet, doença granulomatosa crónica, linfoma cutâneo das células T, ulceração, uma condição patológica caracterizada por a inflamação que induz a lesão e a desregulação imunitária conduzirem à remodelação de tecidos crónica incluindo fibrose e perda de função, lesão isquémica renal, fibrose cística, rinite e sinusite ou uma doença ortopédica. 0 exossoma também é descrito para ser utilizado para ajudar a cicatrização de feridas, redução de cicatrizes, a formação óssea, o enxerto ósseo ou transplante de medula óssea num indivíduo. 0 exossoma também é descrito para ser utilizado (i) na regulação de uma via selecionada a partir de qualquer um ou mais dos seguintes: regulação do citoesqueleto por Rho GTPase, ciclo celular, via de sinalização de integrina, inflamação mediada por via de sinalização de quimioquina e citoquina, via de sinalização de FGF, via de sinalização do recetor EGF, angiogénese, cascata de ativação do plasminogénio, coagulação do sangue, glicólise, via do proteassoma ubiquitina, biossintese de novo purina, ciclo TCA, biossintese de fenilalanina, heme biossintese; (ii) na regulação de processos, incluindo qualquer um ou mais dos seguintes: a estrutura celular e a motilidade, a estrutura da célula, a comunicação celular, motilidade celular, a adesão celular, a endocitose, a mitose, exocitose, a citocinese, ciclo celular, imunidade e defesa, imunidade mediada por citocina/quimiocina, imunidade mediada por macrófagos, a imunidade mediada por granulócitos, sinalização mediada pelo ligante, via de sinalização mediada por citoquina e quimioquina, transdução de sinal, sinalização mediada por proteína da matriz extracelular, fator de crescimento de homeostase, via de sinalização do recetor de proteína tirosina cinase, sinalização mediada por adesão celular, transdução de sinal mediada por recetor de superfície celular, cascata JAK-STAT, antioxidação e remoção de radicais livres, a homeostase, resposta ao stress, a coagulação do sangue, processos de desenvolvimento, o desenvolvimento mesoderme, o desenvolvimento do esqueleto, a angiogénese, o desenvolvimento muscular, contração muscular, o metabolismo e modificação de proteínas, proteólise, o dobramento de proteínas, proteína de montagem complexa, a ativação de aminoácidos, o tráfego de proteínas intracelulares, direcionamento e localização de outras proteínas, metabolismo de aminoácidos, biossíntese proteica, a reação dissulfureto-isomerase de proteína, metabolismo de hidratos de carbono, glicólise, derivação de pentose-fosfato, metabolismo de outros polissacáridos, metabolismo das purinas, regulação do metabolismo do fosfato, o metabolismo da vitamina, a biossíntese de aminoácidos, o processamento de pré-ARNm, a regulação de translação, junção de ARNm; ou (iii) no fornecimento de funções, incluindo qualquer uma ou mais das seguintes: molécula de sinalização, quimiocina, o fator de crescimento, citocinas, interleuquinas, outras citocinas, matriz extracelular, proteínas estruturais da matriz extracelular, outra matriz extracelular, glicoproteína de matriz extracelular, protease, metaloprotease, outras proteases, inibidor de protease, inibidor de metaloprotease, inibidor de serina protease, oxidorredutase, desidrogenase, peroxidase, chaperona, chaperonina, família da chaperona Hsp 70, outras chaperonas, sintetase, sintase e sintetase, proteína de ligação a cálcio, aminoacil-ARNt-sintetase, liase, isomerase, outra isomerase, ATP sintase, hidratase, transaminase, outra liase, outro regulador de enzima, molécula reguladora seletiva, proteína de a ligação à actina do citoesqueleto, a proteína do citoesqueleto, a proteína de ligação à actina não-motora, actina e proteína relacionada com actina, anexina, tubulina, molécula de adesão celular, proteína de ligação à actina motora, filamento intermediário, RNP, proteína ribossómica, fator de tradução, outra proteína de ligação de ARN, histona, proteína relacionada com a calmodulina, proteína de revestimento da vesícula.

Num 6o aspeto da presente invenção, proporciona-se um sistema de fornecimento para a fornecer um exossoma, compreendendo um exossoma como descrito acima, em conjunto com um dispensador que pode funcionar para fornecer o exossoma a um alvo.

Também é descrita a utilização de um tal sistema de distribuição num método de administração de uma partícula a um alvo. A prática da presente invenção empregará, a menos que seja indicado o contrário, técnicas convencionais de química, biologia molecular, microbiologia, ADN recombinante e imunologia, que estão dentro das capacidades de um perito na arte. Estas técnicas são explicadas na literatura. Ver, por exemplo J. Sambrook, E. F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, segunda edição, Livros 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 e suplementos periódicos; Current Protocols in Molecular Biology, cap. 9, 13, e 16, John Wiley & Sons, Nova Iorque, N.Y.); B. Roe, J. Crabtree, e A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak e James O'D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, Irl Press; D. M. J. Lilley e J. E. Dahlberg, 1992, Methods of Enzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual: Portable Protocol NO. I por Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies: A Laboratory Manual por Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855, Editado, Jane Roskams e Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3.

Breve Descrição das Figuras

Figura 1. Dimensão de enfarte do miocárdio. Imagens representativas de coloração com Evans Blue (azul) e TTC (vermelho) em corações de suínos tratados com não-CM (A) , CM (B) ou soro fisiológico (C) . Quantificações da dimensão do enfarte do miocárdio como uma percentagem do ventrículo esquerdo (LV) e a área em risco (TAA) são mostrados nas Figuras D e E, respetivamente. Não-CM, n = 9; CM, n = 9; soro fisiológico, n = 8

Figura 2. Função sistólica local e global. Espessamento sistólico de parede local, avaliado por meio de ecocardiografia da área de enfarte em suínos tratados com Não-CM, CM ou soro fisiológico (A) . Função sistólica global, zona de encurtamento fracionai ecocardiográfica (FAS) é mostrado na Figura B. Não-CM, n = 9; CM, n = 9; soro fisiológico, n = 8. *p <0,05 vs. não-CM e soro fisiológico.

Figura 3. Stress Oxidativo. Viabilidade de células CEM em qualquer CM ou não-CM e tratadas com H2O2. (* p<0,05, A) . O meio condicionado protege as células da morte induzida por H2O2. Para avaliar o stress oxidativo in vivo, secções de enfarte de suínos tratados com Não-CM (B) , CM (C) , ou soro fisiológico (D) foram marcadas para 8 OHdG, um produto do stress oxidativo nuclear. A quantificação de núcleos positivo a 8-OHdG foi avaliada pelo aumento de 200x e está representada na Figura E. Também in vivo, CM reduz o stress oxidativo. Não-CM, n = 9; CM, n = 9; soro fisiológico, n = 8

Figura 4. Sinalização e apoptose de TGF-β. Western blot para SMAD fosforilada 2 (A, B) e caspase 3 ativa (C, D) em suínos tratados com não-CM, CM ou soro fisiológico. Beta-tubulina foi avaliada como um controlo de carga, e não foram encontradas diferenças na expressão de beta-tubulina entre os grupos (E). Não-CM, n = 9; CM, n = 9; soro fisiológico, n = 8

Figura 5. Propriedades cardioprotetoras de Frações CM. A quantificação da dimensão do enfarte do miocárdio em ratinhos tratados com soro fisiológico, fração <1000 kD de CM ou CM não fracionado. O meio condicionado não fracionado reduz significativamente a dimensão do enfarte do miocárdio em comparação com animais tratados com soro fisiológico. A fração <1000 kDa, no entanto, não o faz, o que indica que o(s) fator (es) cardioprotetor(es) é/são maiores do que 1000 kDa. Soro fisiológico, n = 10; <1000 kD, n = 8; não fracionado, n = 12. *p <0,01 vs soro fisiológico.

Figura 6. O meio quimicamente definido condicionado por células hESC-MSC HuES9.El (que não fazem parte da invenção) durante três dias, foi filtrado através de um pfiltro de 0,22. O meio condicionado (CM) foi concentrado 25 vezes por filtração através de uma membrana com um limite de PM de 10 kD. O CM concentrado foi então centrifugado através de uma membrana com limite de PM de 100 kD ou 300 kD, resultando numa razão de filtrado para retentado de 4:1 (vol: vol). O CM não-fracionado, o filtrado e retentado de amostras foram carregados na razão em volume de 5:4:1.

Figura 7. Identificação de componentes do filtrado após filtração através de uma membrana com um limite de PM de 100 kD. a) Comparação de componentes proteicos no filtrado vs componentes proteicos do meio não condicionado (NCM). O meio condicionado (CM), o filtrado após CM foi filtrado através de membrana com limite de PM de 100 kDa (filtrado 100 kD) e o NCM foi separado em SDS-PAGE. O gel foi corado com prata para visualizar as bandas de proteína; b) CM foi filtrado através de uma membrana com limite de PM de 100 kD para produzir uma proporção em volume de retentado para filtrado de 4:1. O retentado, filtrado, e os diferentes suplementos de proteína no meio quimicamente definido, nomeadamente a proteína insulina-transferrina-seleno, FGF2, EGF e PDGF AB foram separadas em SDS-PAGE. O retentado e o filtrado foram carregados numa proporção em volume de 4:1.

Figura 8 . As dimensões relativas de materiais biológicos e dimensões de poros em membranas. Reimpressão de Spectrum© Laboratory.

Figura 9. AAR Relativa em ratinhos após a isquemia/reperfusão. O enfarte do miocárdio foi induzido por oclusão da artéria coronária esquerda (LCA) por ligação de sutura durante 30 minutos, e a reperfusão foi iniciada por remoção da sutura. Cinco minutos antes da reperfusão, os ratinhos foram tratados com injeção na veia da cauda de 20 pL de MSC-CM não fracionado (10-220 nm) , 20 pL de fração <100 ou 1.000 kD, 4 pL de retentado > 1000 kD ou soro fisiológico. 24 horas mais tarde, os corações foram excisados. Antes da excisão, a área de risco (AAR) foi determinada por religação da LCA e, em seguida, irrigando Evans azul através da aorta. A AAR foi definida como a área não corada pelo corante e foi expressa como uma percentagem da área da parede do ventrículo esquerdo.

Figura 10. Efeitos do meio condicionado e meio condicionado fracionado na dimensão relativa do enfarte em ratinhos após isquemia/reperfusão. Após a excisão do coração, a dimensão do enfarte foi avaliada 24 horas mais tarde utilizando TTC e expressa como uma percentagem da AAR.

Figura 11. Entidades físicas de entre 50-100nm de diâmetro foram observadas por microscopia eletrónica. Figura 12. A dimensão do fracionamento de CM, após tratamento com Triton X-100, o CM foi tratada com um Triton X-100 final a 0,5 ou 1,0% (v/v) durante 30 minutos e, em seguida, fracionado por filtração através de uma membrana com limite de PM de 100 kD para gerar uma razão em volume de filtrado:retentado de 4: 1. Figura 13. As proteínas encontradas a partir de análise por MS/MS que são comuns aos exossomas a partir de diferentes tipos de células44.

Figura 14. Propriedades cardioprotetoras de Frações CM. A quantificação da dimensão do enfarte do miocárdio em ratinhos tratados com soro fisiológico, meio condicionado HEK293, hESC-CM não fracionado, CM filtrado com limite de PM de 100 kDa, 300 kDa, 500 kDa e 1000 kDa ou CM concentrado 50 vezes contra membrana com fração de limite de PM de 100 kDa de CM ou CM não fracionado.

Figura 15. Imunoprecipitação. CM imunoprecipitado com anti-CD81 ou IgG de ratinho como controlo negativo. O imunoprecipitado e sobrenadante foram analisados por hibridação western blot usando anticorpos contra CD9, Alix, TSP-1, piruvato cinase e SOD1.

Figura 16. Ultracentrifugação de CM. CM foi concentrado cinco vezes por filtração através de uma membrana com limite de peso molecular de 500 kDa. O retentado e o CM não filtrado foram ultracentrifugados a 200.000g durante 2 horas. O sobrenadante e o pelete foi analisado por Western blot para a presença de CD9. Linha 1-3: diferente concentração de proteína de CM.

Linha 4 e 5: 0 pelete (P) e sobrenadante (S) após ultracentrifugação do CM não filtrado. Linha 6: Retentado após filtração de CM através de uma membrana com limite de peso molecular de 500 kDa. Linha 7-8: O pelete (P) e sobrenadante (S) após ultracentrifugação de retentado. Linha 9: filtrado após filtração de CM através de uma membrana com limite de peso molecular de 500 kDa.

Figura 17. O fracionamento em gradiente de densidade de sacarose. Um gradiente de densidade de sacarose foi preparado por 14 camadas de soluções de sacarose a concentrações de 22,8-60% (p/v) num tubo de centrífuga SW60TÍ com a solução mais concentrada na parte inferior do tubo da ultracentrífuga. A amostra foi carregada no topo do gradiente e ultracentrifugada durante 16,5 horas à 200.000X g, 4 °C num rotor SW60TÍ (Beckman Coulter, Inc.). Foram recolhidas 13 frações a partir de cima para a parte inferior do gradiente de sacarose. A densidade de cada fração foi calculada por ponderação de um volume fixo de cada fração. As frações foram então analisadas por análise de Western blot e sondadas para a piruvato-cinase, CD9, CD81 e SOD1. Marcadores de peso molecular normalizado de proteína foram fracionados num gradiente semelhante e a distribuição dos marcadores entre as diferentes frações do gradiente de sacarose foram indicadas na parte inferior da figura, a) CM foi fracionado, b) CM foi tratado com tampão de lise, antes de ser fracionado no gradiente de sacarose.

Figura 18. Tripsinização de CM. CM foi digerido com tripsina durante 0, 0,5, 2, 10 e 20 minutos. O CM parcialmente digerido foi analisado quanto à presença de CD 9 e SOD1.

Figura 19. Análise de ARN no CM. (a, b) 0 ARN foi extraído a partir de MSCs e MSC-CM. 0 ARN purificado foi desnaturado e separado num gel de agarose glioxal e ureia-PAGE, respetivamente, (c) Um volume igual de CM foi tratado com PBS, ciclodextrina, tampão de lise ou fosfolipase A2. 0 CM tratado e não tratado foi extraído para o ARN. 0 ARN foi separado nem ureia-PAGE. (d) o ARN de CM foi tratado com ARNase III e o ARN tratado foi separado em paralelo com o ARN não tratado em ureia-PAGE. ARN em géis foi visualizado por coloração com brometo de etídio.

Figura 20. Densidade de ARN no CM. Após fracionamento de CM, o CM pré-tratado com tampão de lise e padrões de PM de ARN num gradiente de densidade de sacarose em equilíbrio de centrifugação, tal como descrito na figura 4, cada fração foi extraída para o ARN. a) O rendimento de ARN relativo para cada fração de cada amostra foi representado graficamente em função do número de frações. A concentração relativa foi normalizada para a concentração mais elevada de ARN em cada gradiente que foi definido arbitrariamente como 100%. b) O ARN extraído a partir de cada fração foi separado em ureia-PAGE.

Figura 21. ARN não estava em exossomas CD81+. A imunoprecipitação de CD81 que também precipitou CD9 foi realizada como descrito na fig 2. O imunoprecipitado e o sobrenadante foram extraídos para o ARN e os extratos foram separados em ureia-PAGE e visualizados por coloração com brometo de etídio.

Figura 22. Análise em micro-matriz de miARN no CM. As amostras de ARN a partir da MSC e do CM foram hibridadas com chips de micro-matriz contendo sondas para transcrições de miARN listadas em Sanger miRBase lançamento 10.1. A hibridação foi realizada utilizando duas réplicas biológicas de cada amostra de ARN. a) foram detetados 149 miARNs na MSC e 63 foram detetados no CM. Destes, 47 foram expressos em níveis semelhantes em MSCs e no CM. 16 foram expressos a um nível detetável em CM, mas não em MSCs, enquanto que 47 foram detetados em MSCs mas não no CM. b) Nível de expressão relativo de miARN guia ao seu miARN anti-guia com base em sinais de hibridação no chip de micro-matriz.

Figura 23. fracionamento por HPLC de CM e NMC. CM e NCM foram fracionados em HPLC utilizando uma coluna BioSep S4000, com 7,8 mm x 30 cm. Os componentes em CM ou NCM foram eluídos com 20 mM de tampão de fosfato com 150 mM de NaCl a pH 7,2. O modo de eluição foi isocrático e o tempo de funcionamento foi de 40 minutos. O eluente foi controlado com um detetor de UV-visível fixado em 220 nm. A área % sob cada pico foi integrada a partir do detetor de UV-visível.

DESCRIÇÃO DETALHADA A presente invenção baseia-se na demonstração de que as células estaminais mesenquimais derivadas de ESC humana (MSCs) mediam efeitos cardioprotetores através de grandes complexos segregados de -50-100 nm de diâmetro. Tais complexos ou partículas podem, portanto, ser utilizados para meios terapêuticos, incluindo a proteção cardíaca, em lugar das próprias células.

Os exemplos descrevem a análise proteómica destes complexos, revelando a presença de proteínas associadas a exossoma, por exemplo, CD81, CD9 e Alix que também co-imunoprecipitam, e de proteínas de membrana e citosólicas que exibiram proteólise sensível ao detergente consistente com proteínas ligadas a membranas e encapsuladas por uma membrana, respetivamente.

Os Exemplos demonstram ainda outras propriedades destas partículas ou complexos. Mostra-se que as proteínas de tais partículas ou complexos têm densidades de sedimentação independentes de PM de 1,016- 1,215 g/mL, que revertem para densidades dependentes de PM mediante tratamento com um tampão de lise da membrana. A secreção contém também ARNs (<300 nts) em vesículas lipídicas ricas em colesterol. Estudos de fracionamento de HPLC e dispersão dinâmica de luz indicam ainda que as únicas partículas detetáveis na secreção dentro do intervalo de raio hidrodinâmico (rh) de 1-1000 nm tinham uma rh de 45-55 nm.

Estas observações, juntamente com a presença de lípidos da membrana, por exemplo, esfingomielina de colesterol e fosfatidilcolina demonstram que os complexos cardioprotetores na secreção são exossomas ou vesículas lipídicas secretadas.

Estas partículas de células estaminais mesenquimais, complexos ou exossomas podem ser usados para uma variedade de finalidades, tais como o tratamento ou prevenção de doenças cardíacas ou do coração, tais como isquemia, inflamação cardíaca ou insuficiência cardíaca. Eles também podem ser utilizados para a reparação após uma lesão de perfusão.

PARTÍCULA

Descreve-se uma partícula que pode ser derivada a partir de uma célula estimai mesenquimal (MSC). A partícula pode ser derivável a partir da MSC por qualquer um de vários meios, por exemplo, por secreção, brotamento ou dispersão a partir da MSC. Por exemplo, a partícula pode ser produzida, exsudada, emitida ou eliminada a partir da MSC. Sempre que a MSC estiver em cultura de células, a partícula pode ser segregada para o meio de cultura celular. A partícula pode, nomeadamente, compreender uma vesícula. A partícula pode compreender um exossoma. As partículas descritas aqui podem compreender qualquer uma ou mais das propriedades dos exossomas aqui descritos. A partícula pode compreender vesículas ou uma esfera achatada limitada por uma bicamada lipídica. As partículas podem compreender diâmetros de 40-100 nm. As partículas podem ser formadas por gemulação para dentro da membrana endossómica. As partículas podem ter uma densidade de -1,13-1,19 g/mL e podem flutuar em gradientes de sacarose. As partículas podem ser enriquecidas em colesterol e esfingomielina, e marcadores de secções lipídicas, tais como GM1, GM3, flotillina e a proteína src cinase Lyn. As partículas podem compreender uma ou mais proteínas presentes nas células estaminais mesenquimais ou meio condicionado células estaminais mesenquimais (MSC-CM), tais como uma proteína ou característica específica para a MSC ou MSC-CM. Elas podem compreender ARN, por exemplo miARN.

Descreve-se uma partícula que compreende um ou mais genes ou produtos de genes encontrados nas MSCs ou meio, que é condicionado por cultura de MSCs. A partícula pode compreender moléculas segregadas pela MSC. Tal partícula, e combinações de qualquer uma das moléculas contidas na mesma, incluindo, em particular, proteínas ou polipéptidos, pode ser usado para complementar a atividade de, ou em lugar de, as MSCs ou meio condicionado pela MSC para o propósito de por exemplo, tratar ou prevenir uma doença. A partícula pode compreender um proteína citosólica encontrada no citoesqueleto em, por exemplo tubulina, actina e proteínas de ligação de actina, fusões de membranas intracelulares e transporte, por exemplo anexinas e proteínas rab, proteínas de transdução de sinal, por exemplo, proteínas cinases, proteínas 14-3-3 e G heterotriméricas, enzimas metabólicas, por exemplo, peroxidases, piruvato e lipídios cinases, e enolase-1 e a família de tetraspaninas eg CD9, CD63, CD81 e CD82. Em particular, a partícula pode compreender uma ou mais tetraspaninas. As partículas podem compreender o ARNm e/ou microARN. 0 termo "partícula", tal como usado neste documento pode ser entendido como uma entidade discreta. A partícula pode ser algo que é isolado a partir de uma célula estaminal mesenquimal (MSC) ou domínio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSCCM). A partícula pode ser responsável por pelo menos uma atividade da MSC ou MSC-CM. A partícula pode ser responsável por, e levar a cabo, substancialmente a maior parte ou a totalidade das funções da MSC ou MSC-CM. Por exemplo, a partícula pode ser um substituto (ou substituto biológico) para a MSC ou MSC-CM. A partícula pode ser usada para qualquer um dos fins terapêuticos que a MSC ou MSC-CM pode ser colocada em uso. A partícula tem de preferência pelo menos uma propriedade de uma célula estaminal mesenquimal. A partícula pode ter uma propriedade biológica, tal como uma atividade biológica. A partícula pode ter qualquer uma das atividades biológicas de uma MSC. A partícula pode, por exemplo, ter uma atividade terapêutica ou restauradora de um MSC.

Os exemplos mostram que os meios condicionados por MSCs (tais como meios condicionados de células estaminais mesenquimais ou MSC-CM, conforme descrito abaixo) compreendem atividades biológicas de MSC e são capazes de substituir as MSCs em si mesmas. A propriedade biológica ou atividade biológica de uma MSC pode, portanto, corresponder a uma propriedade ou atividade biológica de um meio condicionado de células estaminais mesenquimais. Assim, a partícula pode compreender uma ou mais propriedades ou atividades biológicas de um meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM).

Meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM) 0 meio de cultura celular condicionado, tal como um meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM) pode ser obtido por cultura de uma célula estaminal mesenquimal (MSC), um descendente da mesma ou uma linha celular dela derivada, num meio de cultura celular; e isolamento do meio de cultura de células. A célula estaminal mesenquimal pode ser produzida por um processo compreendendo a obtenção de uma célula por dispersão de uma colónia de células estaminais embrionárias (ES) . A célula, ou um descendente da mesma, pode ser propagada na ausência de co-cultura em meio livre de soro que compreende FGF2.

Partícula de células estaminais mesenquimais A partícula pode ser produzida ou isolada num número de maneiras. Tal método pode compreender o isolamento da partícula a partir de uma célula estaminal mesenquimal (MSC) . Tal método pode compreender o isolamento da partícula a partir de um meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM). A partícula pode ser isolada, por exemplo, por separação de componentes não associados com base em qualquer propriedade da partícula. Por exemplo, a partícula pode ser isolada com base no peso molecular, tamanho, forma, composição ou atividade biológica. 0 meio condicionado pode ser filtrado ou concentrado, ou ambos, durante, antes ou após a separação. Por exemplo, pode ser filtrado através de uma membrana, por exemplo uma com um tamanho ou limite de peso molecular. Pode ser sujeito a filtração de força tangencial ou ultrafiltração.

Por exemplo, uma filtração com membrana com limite de peso molecular ou tamanho adequado, tal como descrito nos ensaios para Peso Molecular noutras partes deste documento, pode ser usada. 0 meio condicionado, opcionalmente filtrado ou concentrado, ou ambos, pode ser sujeito a mais uma separação, tal como cromatografia em coluna. Por exemplo, a cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com várias colunas pode ser usada. As colunas podem ser colunas de exclusão de tamanho ou colunas de ligação.

Uma ou mais propriedades ou atividades biológicas da partícula podem ser usadas para controlar a sua atividade durante o fracionamento do meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM). Como um exemplo, a dispersão de luz, índice de refração, dispersão dinâmica de luz ou detetores de UV visíveis podem ser utilizados para seguir as partículas. Por exemplo, uma atividade terapêutica, tal como atividade cardioprotetora pode ser usada para controlar a atividade durante o fracionamento.

Os parágrafos seguintes fornecem um exemplo concreto de como uma partícula de células estaminais mesenquimais, como um exossoma, pode ser obtida.

Uma partícula de células estaminais mesenquimais pode ser produzida através da cultura de células estaminais mesenquimais num meio para o seu condicionamento. 0 meio pode compreender DMEM. A DMEM pode ser tal que não compreenda vermelho de fenol. 0 meio pode ser suplementado com insulina, transferrina, ou selenoproteína (ITS), ou qualquer combinação das mesmas. Pode compreender FGF2. Pode compreender PDGF AB. A concentração de FGF2 pode ser de cerca de 5 ng/mL de FGF2. A concentração de PDGF AB pode ser de cerca de 5 ng/mL. 0 meio pode compreender glutamina-penicilina-estreptomicina ou b-mercaptoetanol, ou qualquer combinação dos mesmos.

As células podem ser cultivadas por cerca de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 dias ou mais, por exemplo, 3 dias. O meio condicionado pode ser obtido por separação das células do meio. O meio condicionado pode ser centrifugado, por exemplo, a 500 g. Pode ser concentrado por filtração através de uma membrana. A membrana pode compreender uma membrana de >1000 kDa. O meio condicionado pode ser concentrado cerca de 50 vezes ou mais. O meio condicionado pode ser sujeito a cromatografia liquida como a HPLC. O meio condicionado pode ser separado por exclusão de tamanho. Qualquer matriz de exclusão de tamanho tal como Sefarose pode ser utilizada. Como um exemplo, uma coluna TSK Guard SWXL, 6 x 40 mm ou um gel TSK G4000 SWXL, 7,8 x 300 mm pode ser empregue. O tampão eluente pode compreender qualquer meio fisiológico, tais como solução salina. Ele pode compreender tampão fosfato 20 mM com 150 mM de NaCl a pH 7,2. O sistema de cromatografia pode ser equilibrado a um caudal de 0,5 mL/min. O modo de eluição pode ser isocrático. Absorção de UV a 220 nm pode ser usada para monitorizar o progresso da eluição. As frações podem ser analisadas para a dispersão de luz dinâmica (DLS), utilizando um detetor de dispersão de luz quasi-elástico (QELS).

As frações que são encontradas para expor dispersão dinâmica de luz podem ser retidas. Por exemplo, uma fração que é produzida pelo método geral tal como foi descrito acima, e que elui com um tempo de retenção de 11-13 minutos, tal como 12 minutos, é demonstra exibir dispersão dinâmica de luz. A rh de partículas neste pico é de cerca de 45-55 nm. Essas frações compreendem partículas de células estaminais mesenquimais, como exossomas.

PROPRIEDADES DAS PARTÍCULAS A propriedade de uma célula estaminal mesenquimal pode compreender uma propriedade de um meio condicionado por uma célula estaminal mesenquimal (MSC-CM). Métodos de produção de um tal meio condicionado de células estaminais mesenquimais são descritos noutro local neste documento e são ilustrados, por exemplo, no Exemplo 1 abaixo. A propriedade pode compreender uma propriedade biológica, tal como uma atividade biológica. Exemplos de atividades biológicas incluem a cardioproteção, redução do stress oxidativo e redução da dimensão do enfarte.

CARDIOPROTEÇÃO A partícula pode ter uma propriedade de células estaminais mesenquimais e/ou de meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM), que compreende a cardioproteção. A cardioproteção pode compreender o restabelecimento ou a manutenção da função cardíaca durante a isquemia e/ou reperfusão.

Ensaio para Cardioproteção A cardioproteção pode por exemplo ser ensaiada utilizando qualquer um ou mais dos métodos descritos nos Exemplos 5, 10, 14 e 20.

STRESS OXIDATIVO A partícula pode ter uma propriedade de células estaminais mesenquimais e/ou de meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM), que compreende a capacidade de reduzir o stress oxidativo (ou citoproteção).

Ensaio para stress oxidativo A redução do stress oxidativo pode, por exemplo, ser testada utilizando um ensaio in vitro de morte celular induzida por peróxido de hidrogénio (H2O2) . Em resumo, o stress oxidativo mediado por peróxido de hidrogénio (H2O2) é induzido em células leucémicas humanas CEM e a viabilidade das células é monitorizada por exclusão de tripano azul. As células CEM leucémicas humanas são incubadas com partículas, meio condicionado ou células estaminais mesenquimais (com solução salina como controlo) e tratadas com H2O a 50 μΜ para induzir o stress oxidativo. A viabilidade celular é avaliada através de exclusão com tripano azul a 12, 24, 36 e 48 horas após o tratamento com H2O2 · A redução do stress oxidativo pode ainda ser analisada utilizando um ensaio in vivo de oxidação do DNA. O stress oxidativo in vivo pode também ser ensaiado como se segue. Os suínos são tratados com a partícula, ou meio condicionado ou células estaminais mesenquimais (com solução salina como controlo). As secções de tecido de coração de suíno são obtidas. O stress oxidativo nuclear em cortes de tecidos de suínos tratados e não tratados é quantificado por imunocoloração de 8-OHdG de DNA oxidado. As secções de tecido são testadas quanto a coloração nuclear intensa indicativa da oxidação do ADN e stress oxidativo.

DIMENSÃO DE ENFARTE A partícula pode ter uma propriedade de células estaminais mesenquimais e/ou de meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM), que compreende a capacidade de reduzir a dimensão do enfarte.

Ensaio para dimensão de enfarte A dimensão de enfarte pode por exemplo ser ensaiada utilizando qualquer um ou mais dos métodos descritos nos Exemplos 6 e 13.

PESO MOLECULAR DA PARTÍCULA A partícula pode ter um peso molecular superior a 100 kDa. Pode ter um peso molecular superior a 500 kDa. Por exemplo, pode ter um peso molecular superior a 1000 kDa. 0 peso molecular pode ser determinado por vários meios. Em princípio, o peso molecular pode ser determinado por fracionamento por tamanho e filtração através de uma membrana com o limite de peso molecular correspondente. O tamanho de partícula pode então ser determinado pelo seguimento da segregação de proteínas de componentes com SDS-PAGE ou por um ensaio biológico.

Ensaio de peso molecular por SDS-PAGE A partícula pode ter um peso molecular superior a 100 kDa. Por exemplo, a partícula pode ser tal que a maioria das proteínas da partícula com menos de 100 kDa de peso molecular segregam na fração de retentado com mais de 100 kDa de peso molecular, quando sujeita a filtração. Da mesma forma, quando submetida a filtração com uma membrana com limite de 500 kDa, a maioria das proteínas da partícula com menos de 500 kDa de peso molecular podem segregar na fração de retentado com mais de 500 kDa de peso molecular. Isto indica que a partícula pode ter um peso molecular superior a 500 kDa.

Ensaio de Peso Molecular por Atividade Biológica A partícula pode ter um peso molecular de mais de 1.000 kDa. Por exemplo, a partícula pode ser tal que, quando sujeita a uma filtração com uma membrana com um limite de peso molecular de 1000 kDa, a atividade biológica relevante permanece substancialmente ou predominantemente na fração retida. Alternativamente ou em adição, a atividade biológica pode estar ausente na fração do filtrado. A atividade biológica pode compreender qualquer uma das atividades biológicas da partícula descritas noutras partes deste documento.

Ensaio de peso molecular por dimensão de enfarte Por exemplo, a atividade biológica pode incluir a redução da dimensão do enfarte, tal como testado em qualquer modelo adequado de isquemia de miocárdio e danos de reperfusão. Por exemplo, a atividade biológica pode ser avaliada num modelo de ratinho ou suíno, tal como descrito nos Exemplos.

Em resumo, a isquemia do miocárdio é induzida em 30 minutos por oclusão da artéria coronária esquerda (LCA) por sutura de ligação e a reperfusão é iniciada pela remoção da sutura. Os ratinhos são tratados com o líquido contendo as partículas (tal como o MSC-CM não fracionado) , filtrato (tal como fração de <100 ou 1.000 kD), retentado (tal como retentado >1000 kD) ou soro fisiológico por via intravenosa através da veia da cauda, a 5 minutos antes da reperfusão. 24 horas mais tarde, os corações são excisados. Antes da excisão, a área de risco (AAR) é determinada por religação da LCA e, em seguida, irrigando Evans azul através da aorta. A AAR é definida como a área não corada pelo corante e é expressa como uma percentagem da área da parede do ventrículo esquerdo. A dimensão do enfarte é avaliada 24 horas após Evans azul e TTC. Se a dimensão do enfarte relativa for significativamente reduzida nos animais tratados com meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM) e a fração de retentado (tal como > 1000 kD), quando comparado com solução salina, isto indica que a partícula tem um peso molecular que é mais elevado do que limite correspondente da membrana (por exemplo, superior a 1000 kDa).

TAMANHO DE PARTÍCULA A partícula pode ter um tamanho maior do que 2 nm. A partícula pode ter um tamanho maior do que 5 nm, 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm ou 50 nm. A partícula pode ter um tamanho maior do que 100 nm, tal como superior a 150 nm. A partícula pode ter um tamanho de substancialmente 200 nm ou superior. A partícula ou partículas podem ter uma gama de tamanhos, tal como entre 2 nm a 20 nm, 2 nm e 50 nm, 2 nm a 100 nm, 2 nm a 150 nm ou 2 nm a 200 nm. A partícula ou partículas podem ter um tamanho entre 20 nm a 50 nm, 20 nm a 100 nm, 20 nm a 150 nm ou 20 nm a 200 nm. A partícula ou partículas podem ter um tamanho entre 50 nm a 100 nm, 50 nm a 150 nm ou 50 nm a 200 nm. A partícula ou partículas podem ter um tamanho entre 100 nm a 150 nm ou 100 nm a 200 nm. A partícula ou partículas podem ter um tamanho entre 150 nm a 200 nm. O tamanho pode ser determinado através de vários meios. Em princípio, o tamanho pode ser determinado por fracionamento por tamanho e filtração através de uma membrana com o limite de tamanho relevante. O tamanho de partícula pode então ser determinado pelo seguimento da segregação de proteínas de componentes com SDS-PAGE ou por um ensaio biológico. O tamanho pode também ser determinado por microscopia eletrónica, como descrito no Exemplo 21. 0 tamanho pode compreender um raio hidrodinâmico. 0 raio hidrodinâmico da partícula pode ser inferior a 100 nm. Ele pode ser de entre cerca de 30 nm e cerca de 70 nm. O raio hidrodinâmico pode ser entre cerca de 40 nm e cerca de 60 nm, tal como entre cerca de 45 nm e cerca de 55 nm. O raio hidrodinâmico pode ser de cerca de 50 nm. O raio hidrodinâmico da partícula pode ser determinado por quaisquer meios adequados, por exemplo, difração de laser ou por dispersão de luz dinâmica. Um exemplo de um método de dispersão de luz dinâmica, para determinar o raio hidrodinâmico é definido no Exemplo 33 abaixo.

COMPOSIÇÃO A partícula pode compreender uma ou mais proteínas secretadas por uma célula estaminal mesenquimal. A partícula pode compreender uma ou mais proteínas presentes no meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM).

Por exemplo, a partícula pode compreender 10% ou mais, 20% ou mais, 30% ou mais, 40% ou mais, 50% ou mais, 60% ou mais ou 70% ou mais destas proteínas. A partícula pode compreender substancialmente cerca de 75% dessas proteínas. As proteínas podem ser definidas por referência a uma lista de proteínas ou produtos de genes de uma lista de genes.

Proteínas

As proteínas podem ser selecionadas a partir das listadas na Tabela Dl em baixo. A Tabela Dl compreende as seguintes proteínas numeradas de 1 a 250, bem como as "proteínas com funções não identifcadas", nos parágrafos em baixo: 1. IPI00021428 Actina, músculo esquelético alfa; 2. IPI00414057 Actina alfa 1 proteína músculo esquelética; 3. IPI00008603 Actina, músculo mole da aorta; 4. IPI00021439 Actina, citoplasmica 1; 5. IPI00023006

Actina, alfa cardíaco; 6. IPI00021440 Actina, citoplasmática 2; 7. IPI00025416 Actina, músculo mole gama-entérico; 8. IPI00479925 agrina; 9. IPI00015102 precursor do antigénio CD166; 10. IPI00007423 fosfoproteína nuclear acídica rica em leucina 32 membro da família B; 11. IPI00413331 proteína 36 kDa; 12. IPI00412577 proteína 34 kDa; 13. IPI00413506 proteína 33 kDa; 14. IPI00418169 proteína hipotética DKFZp686P03159; 15. IPI00003815 inibidor de dissociação Rho GDP 1; 16. IPI00004656 precursor de Beta-2- microglobulina; 17. IPI00218042 Isoforma de junção BMP1-5 do precursor da proteína morfogenética do osso 1; 18. IPI00009054 Isoforma de junção BMPl-3 do precursor da proteína morfogenética do osso 1; 19. IPI00014021 Isoforma de junção BMP1-1 do precursor da proteína morfogenética do osso 1; 20. IPI00218040

Isoforma de junção BMP1-4 do precursor da proteína morfogenética do osso 1; 21. IPI00006980 Proteína C14orfl66; 22. IPI00296165 precursor de subcomponente complementar Clr; 23. IPI00152540 OTTHUMPO0000016748; 24. IPI00305064 Isoforma de junção CD44 do precursor do antigénio CD44; 25. IPI00297160 proteína hipotética DKFZp451K1918; 26. IPI00293539 Isoforma de junção 2 do precursor de Caderina-11; 27. IPI00304227 Isoforma de junção 1 do precursor de Caderina-11; 28. IPI00386476

Caderina 11, tipo 2, pré-proteína de isoforma 1; 29. IPI00024046 precursor de Caderina-13; 30. IPI00290085 precursor de Caderina neuronal; 31. IPI00029739 Isoforma de junção 1 do precursor do fator complementar Η; 32. IPI00012011 Cofilina, isoforma não-muscular; 33. IPI00007257 calsintenina 1 isoforma 2; 34. IPI00218539 Isoforma de junção B do precursor da cadeia de colagénio alfa-l(XI); 35. IPI00477350 colagénio, tipo XI, alfa 1; 36. IPI00329573 Isoforma de junção Longa de precursor de cadeia de colagénio alfa-l(XII); 37. IPI00221384 Isoforma de junção curta de precursor de cadeia de colagénio alfa-l(XII); 38. IPI00400935 precursor de cadeia de colagénio alfa-1 (XVI); 39. IPI00297646 precursor de cadeia de colagénio alfa-1 (I); 40. IPI00164755 precursor de colagénio Prepro-alfa2(I); 41. IPI00304962 precursor de cadeia de colagénio alfa-2(I); 42. IPI00021033 precursor de cadeia de colagénio alfa-1(III); 43. IPI00167087 COL3A1 proteína; 44. IPI00021034 precursor de cadeia de colagénio alfa-1(IV); 45. IPI00479324 pré-proteína de colagénio alfa 2 tipo IV; 46. IPI00306322 precursor de cadeia de colagénio alfa-2(IV); 47. IPI00303313 precursor de cadeia de colagénio alfa-1 (V) ; 48. IPI00477611 proteína 184 kDa; 49. IPI00293881 proteína COL5A2; 50. IPI00018279 precursor de cadeia de colagénio alfa-3(V); 51. IPI00291136 precursor de cadeia de colagénio alfa-1 (VI); 52. IPI00304840 Isoforma de junção 2C2 de precursor de cadeia de colagénio alfa-2(VI); 53. IPI00220613 Isoforma de junção 2C2A de precursor de cadeia de colagénio alfa-2(VI); 54. IPI00022200 isoforma de precursor de colagénio alfa 3 tipo VI 1; 55. IPI00072918 precursor de isoforma de colagénio 4 alfa 3 tipo VI; 56. IPI00220701 Isoforma de junção 2 de precursor de cadeia de colagénio alfa-3(VI); 57. IPI00072917 precursor de isoforma de colagénio 3 alfa 3 tipo VI; 58. IPI00021828 Cistatina B; 59. IPI00007778 precursor de Di-N- acetilchitobiase; 60. IPI00295741 precursor de

Catepsina B; 61. IPI00299219 precursor de proteína CYR61; 62. IPI00514900 proteína 42 kDa; 63. IPI00333770 Semelhante ao dedicador de proteína citocinese 10; 64. IPI00478332 Semelhante ao dedicador de proteína citocinese 9; 65. IPI00000875 fator de alongamento 1-gama; 66. IPI00465248 Alfa-enolase; 67. IPI00013769 Alfa-enolase, específica do pulmão; 68. IPI00216171 Gama-enolase; 69. IPI00218803 Isoforma de junção B do precursor Fibulina-1; 70. IPI00296537 Isoforma de junção C do precursor

Fibulina-1; 71. IPI00328113 precursor de Fibrillina-1; 72. IPI00019439 precursor de fibrillina 2; 73. IPI00385645 Isoforma de junção 2 do precursor do fator de crescimento de fibroblastos 17; 74. IPI00216602

Isoforma de junção 5 do precursor do recetor de fator de crescimento de fibroblastos 2; 75. IPI00216604

Isoforma de junção 8 do precursor do recetor de fator de crescimento de fibroblastos 2; 76. IPI00034099

Proteína hipotética FLJ21918; 77. IPI00333541 Filamin- A; 78. IPI00302592 Filamin A, alfa; 79. IPI00339227

Proteína hipotética DKFZp68601166; 80. IPI00414283 precursor de Fibronectina (FN) (globulina insolúvel a frio) (CIG) . Isoforma de junção 3; 81. IPI00339225

Isoforma de junção 5 do precursor de Fibronectina; 82. IPI00339319 Isoforma de junção 11 do precursor de Fibronectina; 83. IPI00556632 Isoforma de junção 12 do precursor de Fibronectina; 84. IPI00411462 Proteína hipotética DKFZp686B18150; 85. IPI00029723 precursor de proteína relacionada com Folistatina 1; 86. IPI00005401 N-acetilgalactosaminiltransferase Polipeptídica 5; 87. IPI00219025 Glutaredoxin-1; 88. IPI00171411 fosfoproteina Golgi 2; 89. IPI00026314 precursor de

Gelsolin; 90. IPI00219757 Glutationa S-transferase P; 91. IPI00027569 ribonucleoprotelna heterogena nuclear tipo C 1; 92. IP100003881 proteína HNRPF; 93. IPI00442294

Isoforma de junção 1 do precursor Neurotrimina; 94. IPI00003865 Isoforma de junção 1 da proteína cognato de choque térmico 71 kDa; 95. IPI00037070 Isoforma de junção 2 da proteína cognato de choque térmico 71 kDa; 96. IPI00220362 proteína cognato de choque térmico 10 kDa, mitocondrial; 97. IPI00024284 precursor de proteína nuclear de proteoglicano heparan especifica de membrana Basement; 98. IPI00297284 precursor da proteína de ligação ao fator de crescimento do tipo insulina 2 ; 99. IPI00297284 precursor da proteína de ligação ao fator de crescimento do tipo insulina 2; 100. IPI00029236 precursor da proteína de ligação ao fator de crescimento do tipo insulina 5; 101. IPI00029236 precursor da proteína de ligação ao fator de crescimento do tipo insulina 5; 102. IPI00029235 precursor da proteína de ligação ao fator de crescimento do tipo insulina 6; 103. IPI00029235 precursor da proteína de ligação ao fator de crescimento do tipo insulina 6; 104. IPI00016915 precursor da proteína de ligação ao fator de crescimento do tipo insulina 7; 105. IPI00016915 precursor da proteína de ligação ao fator de crescimento do tipo insulina 7; 106. IPI00328163 proteína K-ALPHA-1; 107. IPI00021396 precursor do recetor do fator decrescimento vascular endotelial 2; 108. IPI00298281 precursor de cadeia Laminin gama-1; 109. IPI00219219 Galectina-1; 110. IPI00023673 precursor de proteína de ligação a Galectina-3; 111. IPI00021405 Isoforma de junção A de Lamina-A/C; 112. IPI00216953 Isoforma de junção ADeltalO de Lamina-A/C; 113. IPI00180173 PREVISTO: semelhante a tropomiosina 4; 114. IP100401614 PREVISTO: semelhante a FKSG30; 115. IPI00374397 PREVISTO: semelhante a tropomiosina 4; 116. IPI00374732 PREVISTO: semelhante a proteína PPIA; 117. IPI00402104 PREVISTO: semelhante a peptidilprolil isomerase A isoforma 1; ciclofilin A; peptidil-pro; 118. IPI00455415 PREVISTO: semelhante a ribonucleoproteína heterogena nuclear tipo C dJ8 4 502 4.4; 119. IPI00454722 PREVISTO: semelhante a proteína de ligação a fosfatidiletanolamina; 120. IPI00454852 PREVISTO: semelhante a fator de crescimento derivado de Teratocarcinoma 1; 121. IPI00002802 Protein-lysine 6-oxidase precursor; 122. IPI00410152 proteína de ligação beta do fator de crescimento de transformação latente 1 isoforma LTBP-1L; 123. IPI00220249 precursor de proteína de ligação beta do fator de crescimento de transformação latente, isoforma 1L ; 124. IPI00220249 precursor de proteína de ligação beta do fator de crescimento de transformação latente, isoforma 1L"; 125. IPI00410152 proteína de ligação beta do fator de crescimento de transformação latente 1 isoforma LTBP-1L; 126. IPI00020986 precursor de Lumican; 127. IPI00291006 Malato desidrogenase, precursor mitocondrial; 128. IPI00005707 precursor do recetor de manose de macrofágos 2; 129. IPI00020501

Miosina-11; 130. IPI00019502 Miosina-9; 131. IPI00604620 Nucleolina; 132. IPI00220740 Isoforma de junção 2 de Nucleofosmina; 133. IPI00219446 proteína de ligação a Fosfatidiletanolamina; 134. IPI00299738 precursor do potenciador de C-endopeptidase de Procolagénio 1; 135. IPI00015902 precursor do recetor do fator de crescimento derivado de plaquetas Beta; 136. IP100216691 Profilina-1; 137. IPI00169383 Fosfoglicerato cinase 1; 138. IPI00219568 Fosfoglicerato cinase, especifica de teste; 139. IPI00296180 precursor ativador de plasminog'neio do tipo Urocinase; 140. IPI00215943 Isoforma de junção 3 de Plectina 1; 141. IPI00215942 Isoforma de junção 2 de Plectina 1; 142. IPI00014898 Isoforma de junção 1 de Plectina 1; 143. IPI00398777 isoforma 8 de plectina 1; 144. IPI00398776 isoforma 7 de plectina 1; 145. IPI00186711 isoforma 6 de plectina 1; 146. IPI00420096 isoforma 3 de plectina 1; 147. IPI00398779 isoforma 11 de plectina 1; 148. IPI00398778 isoforma 10 de plectina 1; 149. IPI00398002 isoforma 1 de plectina 1; 150. IPI00419585 Peptidil-prolil cis-trans isomerase A; 151. IPI00472718 isoforma 2 de peptidilprolil isomerase A; 152. IPI00000874 Peroxiredoxina-1; 153. IPI00024915 Peroxiredoxina-5, precursor mitocondrial; 154. IPI00375306 precursor de peroxiredoxina 5, isoforma b; 155. IPI00012503 Isoforma de junção Sapmu-0 do precursor de polipéptido Proactivador; 156. IPI00374179 subunidade ativadora de proteasomas 1 isoforma 2; 157. IPI00030154 subunidade de complexo ativador de proteasomas 1; 158. IPI00168812 PTK7 precursor de proteína tirosina cinase 7 isoforma d; 159. IPI00419941 PTK7 precursor de proteína tirosina cinase 7 isoforma a; 160. IPI00003590 Quiescina Q6, isoforma a; 161. IPI00015916 fator de crescimento derivado do osso (Fragmenta); 162. IPI00015916 fator de crescimento derivado do osso; 163. IPI00298289 Isoforma 2 de Reticulon-4; 164. IPI00021766 Isoforma de junção 1 de Reticulon- 4; 165. IPI00013895 Calgizzarin; 166. IPI00010402 proteína hipotética; 167. IPI00218733 dismutase de superóxido; 168. IPI00014572 precursor SPARC; 169. IPI00005614 Isoforma de junção de cadeia longa beta de espectrina, cérebro 1; 170. IPI00008780 precursor de estaniocalcina-2; 171. IPI00301288 proteína SEL-OB; 172. IPI00216138 Transgelina; 173. IPI00018219 precursor de proteína induzida por fator de crescimento de transformação beta ig-h3; 174. IPI00304865 recetor beta do fator de crescimento de transformação III 175. IPI00296099 precursor de Trombospondina-1; 176. IPI00032292 precursor inibidor de Metaloproteinase 1; 177. IPI00027166 precursor inibidor de Metaloproteinase 2; 178. IPI00220828 Timosina beta-4; 179. IPI00180240 tipo timosina 3; 180. IPI00299633 OTTHUMP00000031270 (Fragmento); 181. IPI00465028 variante de Triosefosfato isomerase 1 (Fragmento); 182. IPI00451401 Isoforma de junção 2 de Triosefosfato isomerase; 183. IPI00010779 Tropomiosina 4; 184. IPI00216975 Isoforma de junção 2 de cadeia de Tropomiosina alfa-4; 185. IPI00180675 cadeia de Tubulina alfa-3; 186. IPI00218343 cadeia de Tubulina alfa-6; 187. IPI00216298 Tioredoxina; 188. IPI00472175 ADNC FLJ46672 fis, clone TRACH3009008, altamente semelhante a Tioredoxina redutase; 189. IPI00450472 enzima de conjugação de Ubiquitina E2I; 190. IPI00018352 isozima de hidrolase terminal em carboxilo de Ubiquitina Ll; 191. IPI00010207 precursor modificador de vezes de Ubiquitina 1; 192. IPI00260630 URB; 193. IPI00021263 proteína zeta/delta 14-3-3; 194. IPI00642991 proteína Hipotética DKFZp686F10164; 195. IPI00470919 proteína Hipotética DKFZp686K08164; 196. IPI00719088 precursor de colagénio, tipo VI, alfa 1; 197. IPI00654685 semelhante ao precursor SPARC; 198. IPI00641961 Colagénio, tipo XII, alfa 1; 199. IPI00645849 proteína de matriz extracelular 1; 200. IPI00554786 Tioredoxina reductase 1; 201. IPI00645018 ativador de Plasminogénio, urocinase; 202. IPI00552339 inibidor de tecidos de metaloproteinase 1; 203. IPI00642997 Actina, citoplásmica 2; 204. IPI00719778 semelhante a Anexina A2; 205. IPI00647915 Transgelina 2; 206. IPI00552815 Colagénio, tipo V, alf 1; 207. IP 100552981 ADNC PSEC0266 fis, clone NT2RP3003649, altamente semelhante a ARNm de finulina de Homo-sapiens 1D; 208. IPI00180776 proteína 29 kDa; 209. IPI00552416 Filamina A, alfa; 210. IPI00640698 Actina, músculo mole gama-entérico; 211. IPI00514530 Actina, alfa 1, músculo esquelético; 212. IPI00556442 proteína de ligação ao fator de crescimento do tipo insulina, variante 2 (Fragmento); 213. IPI00513782 Gelsolina; 214. IPI00478731 proteína 29 kDa; 215. IPI00396479 proteína 24 kDa; 216. IP 100334627 proteína 39 kDa; 217. IPI00555762 PTK7 variante de proteína tirosina cinase 7 isoforma a (Fragmento); 218. IPI00658202 proteína 97 kDa; 219. IPI00006273 proteína CYR61; 220. IPI00719405 proteína TMSL6; 221. IPI00658096 Timosina beta-4; 222. IPI00376163 proteína 5 kDa; 223. IPI00556217 Fibrilina 1 variante (Fragmento); 224. IPI00514817 semelhante a

Lamina A/C; 225. IPI00644087 Progerina; 226. IPI00655812 antigénio de rabdomiosarcoma MU-RMS-40.12; 227. IPI00604517 semelhante a Nucleolina; 228. IPI00444262 CDNA FLJ45706 fis, clone FEBRA2028457, altamente semelhante a Nucleolina; 229. IPI00412473 proteína; 230. IPI00414489 proteína; 231. IPI00411463 proteína; 232. IPI00556415 variante Transgelina (Fragmento); 233. IPI00718825 Calmodulina; 234. IPI00478156 17 proteína kDa; 235. IPI00386621 proteína CALM3; 236. IPI00647001 Acídica; 237. IPI00642650 semelhante ao precursor de estaniocalcina 2; 238. IPI00641471 proteína tipo Colagénio; 239. IPI00514669 do tipo proteína rica em ácido glutâmico de ligação ao domínio SH3 3; 240. IPI00719422 Triosefosfato isomerase (Fragmento); 241. IPI00003734 proteína de ligação a cálcio S100 putativa H_NH0456N16.1; 242. IPI00029574 proteína 11 kDa; 243. IPI00641047 Gelsolina; 244. IPI00647556 Gelsolina; 245. IPI00654821 proteína hipotética LOC54845 isoforma 1; 246. IPI00647572 precursor de proteína relacionada com Dickkopf 3; 247. IPI00639879 semelhante a proteína Citocinese sepA; 248. IPI00657746 semelhante ao dedicador da proteína citocinese 8; 249. IPI00555993 variante do recetor do fator de crescimento vascular endotelial 3; 250. IPI00552545 Dedicador de proteína de citocinese 8. proteínas com funções não identificadas: IPI00642991 proteína hipotética DKFZp686F10164; IPI00470919 proteína hipotética DKFZp686K08164; IPI00654685 semelhante ao precursor SPARC; IPI00719778 semelhante a Anexina A2; IPI00552981 CDNA PSEC0266 fis, clone NT2RP3003649, altamente semelhante a ARNm de fibulina de Homo sapiens ID; IPI00180776 proteína 29 kDa; IPI00478731 proteína 29 kDa; IPI00396479 proteína 24 kDa; IPI00334627 proteína 39 kDa; IPI00658202 proteína 97 kDa; IPI00376163 proteína 5 kDa; IPI00514817 semelhante a Lamina A/C; IPI00644087 Progerina; IPI00655812 antigénio de rabdomiosarcoma MU-RMS-40.12; IPI00604517 semelhante a Nucleolina; IPI00444262 CDNA FLJ45706 fis, clone FEBRA2028457, altamente semelhante a Nucleolina; IPI00412473 proteína; IPI00414489 proteína; IPI00411463 proteína; IPI00478156 proteína 17 kDa; IPI00386621 CALM3 proteína; IPI00647001 acídica; IPI00642650 semelhante a ao precursor estaniocalcina 2; IPI00641471 proteína tipo Colagénio; IPI00514669 do tipo proteína rica em ácido glutâmico de ligação ao domínio SH3 3; IPI00003734 proteína de ligação a cálcio S100 putativa H_NH0456N16.1; IPI00029574 proteína 11 kDa; IPI00654821 proteína hipotética LOC54845 isoforma 1; IPI00647572 precursor de proteína relacionada com

Dickkopf 3; IPI00639879 semelhante a proteína

Citocinese sepA; IPI00657746 semelhante a dedicador de proteína de citocinese 8; IPI00555993 variante do recetor do fator de crescimento vascular endotelial 3.

Produtos de genes

As proteínas podem ser selecionadas a partir dos produtos de genes listados na Tabela D2 em baixo: A tabela D2 compreende os seguintes genes nos parágrafos que se seguem: ACTAl; COL5A2; HSPA8; PSAP; ACTA2; COL5A3; HSPEl; PSME1; ACTB; C0L6A1; HSPG2; PTK7; ACTC; COL6A2; IGFBP2; QSCN6; ACTG1; COL6A3; IGFBP5; RTN4; ACTG2; CSTB; IGFBP6; S100A11; AGRN; CTBS; IGFBP7; SH3BGRL3; ALCAM; CTSB; K-ALPHA-1; S0D1; ANP32B; CYR61; KDR; SPARC; ANXA2; DOCKIO; LAMC1; SPTBN1; ARHGDIA; D0CK8; LGALS1; STC2; B2M; ECM1; LGALS3BP; SVEP1; BMP1; EEF1G; LMNA; TAGLN ; C14orfl66; EN01; LOX; TAGLN2; C1R; EN01B; LTBP 1; TGFBI; CALM 1; EN02; LUM; TGFBR3; CD10 9; FBLN 1; MDH2; THB S 1; CD44; FBN 1; MRC2; TIMP 1; CDH11; FBN2; MYH11; TIMP2; CDH13; FGF17; MYH9; TMSB4X; CDH2; FGFR2; NCL; TMSL3; CFH/HF1; FLJ21918; NPM1; TMSL6; CFL1; FLNA; PBP; TPII; CLSTN1; FN1; PCOLCE; TPM4; C0L11A1; FSTL1; PDGFRB; TUBA3; C0L12A1; GALNT5; PFN1; TUBA6; COL16A1; GLRX; PGK1; TXN; C0L1A1; G0LPH2; PGK2; TXNRD1; C0L1A2; GSN; PLAU; UBE2I; C0L3A1; GSTP1; PLEC1; UCHL1; C0L4A1; HNRPCL1; PPIA; UFM1; COL4A2; HNRPF; PRDX1; URB; C0L5A1; HNT; PRDX5; YWHAZ. 201 genes em 58 processos biológicos A partícula pode adicionalmente, ou alternativamente, compreender qualquer um dos produtos do gene dos 201 genes listados abaixo na Tabela D3. Estes genes são caracterizados de acordo com um processo biológico em que o gene está envolvido.

Em consequência, a partícula pode ser utilizada para afetar, controlar ou regular qualquer desses 58 processos biológicos.

Tabela D3. Listagem de 201 genes em cada vim dos 58 Processos Biológicos (Genes de meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM))

201 Genes em 30 Vias A partícula pode adicionalmente, ou alternativamente, compreender qualquer um dos produtos do gene dos 201 genes listados abaixo na tabela D4. Estes genes são caracterizados de acordo com uma via do gene envolvido.

Em consequência, a partícula pode ser utilizada para afetar, controlar ou regular qualquer uma destas 30 vias.

Tabela D4. Listagem de 201 genes em cada uma das 30 vias (Genes de meio condicionado a células estaminais mesenquimais (MSC-CM))

593 Genes em 794 produtos de gene A partícula pode adicionalmente, ou alternativamente, compreender qualquer um dos produtos do gene dos 593 genes e/ou produtos do gene listados abaixo na tabela D5.

Em consequência, a partícula pode ser utilizada para afetar, controlar ou regular qualquer um dos processos biológicos ou vias em que os genes ou gene estão envolvidos.

EXOSSOMA A partícula pode, nomeadamente, compreender uma vesícula. A partícula pode compreender um exossoma.

Os exemplos descrevem o isolamento do componente ativo na secreção que confere a cardioproteção contra a lesão por reperfusão. 0 componente ativo pode compreender um exossoma secretado pelas células estaminais mesenquimais (MSCs).

Os exossomas são pequenas vesículas de membrana formadas em compartimentos de endocitose final (corpos multivesiculares) descritas pela primeira vez como sendo secretadas por reticulócitos em 198321 e posteriormente tendo sido descoberto que são secretadas por muitos tipos de células, incluindo várias células hematopoiéticas, tumores de origem hematopoiética ou não-hematopoiética e células epiteliais22. São entidades distintas do mais recentemente descrito "complexo de ribonuclease" também designado de exossoma23.

Os exossomas podem ser definidos por parâmetros morfológicos e bioquímicos (ver comentários22' 24~35) . Deste modo, as partículas aqui descritas podem compreender um ou mais destes parâmetros morfológicos ou bioquímicos.

Os exossomas são classicamente definidos como vesículas "tipo disco" ou uma esfera achatada limitada por uma bicamada lipídica com diâmetros de 40-100 nm e são formadas por brotamento para dentro da membrana endossomal. Como todas as vesículas lipídicas e ao contrário de agregados da proteína ou de fragmentos nucleossomais que são libertados por células apoptóticas, os exossomas têm uma densidade de -1,13 - 1,19 g/mL e flutuam sobre gradientes de sacarose. Os exossomas são enriquecidos em colesterol e esfingomielina, e marcadores de secções lipídicas, tais como GM1, GM3, flotilina e a proteína src cinase Lyn sugerindo que as suas membranas são enriquecidas em secções lipídicas. A composição molecular de exossomas a partir de diferentes tipos de células e de espécies diferentes foi analisada. Em geral, os exossomas contêm proteínas ubíquas que parecem ser comuns a todos os exossomas e proteínas que são específicas do tipo de célula. Além disso, as proteínas em exossomas a partir do mesmo tipo de célula, mas de diferentes espécies são altamente conservadas. As proteínas associadas a exossoma ubíquas incluem proteínas citosólicas encontradas no citoesqueleto por exemplo tubulina, actina e proteínas de ligação a actina, fusões de membrana intracelular e transporte, por exemplo anexinas e proteínas rab, proteínas de transdução de sinal, por exemplo, proteínas cinases, 14-3-3 e proteínas G heterotrimérica, enzimas metabólicas, por exemplo, peroxidases, piruvato e lipídios cinases, e enolase-1 e da família de tetraspaninas, por exemplo, CD9, CD63, CD81 e CD82. As tetraspaninas são altamente enriquecidas em exossomas e são conhecidas por estar envolvidas na organização de grandes complexos moleculares e subdomínios de membrana.

Os exemplos de proteínas específicas do tipo de célula em exossomas são moléculas MHC de classe II em exossomas a partir de células MHC que expressam classe II, CD86 em exossomas derivados de células dendriticas, os recetores de células T em exossomas derivados de células T etc. Nomeadamente, os exossomas não contêm proteínas de retículo nuclear, mitocondrial, endoplasmático ou origem em aparelho de Golgi. Além disso, as proteínas de membrana de plasma altamente abundantes estão ausentes em exossomas, sugerindo que não são simplesmente fragmentos da membrana plasmática. Muitas das proteínas associadas a exossoma ubíquas relatados também estão presentes no perfil proteómico da secreção de hESC-MSC.

Os exossomas são também conhecidos por conterem ARNm e microARN, que pode ser entregue a outra célula, e pode ser funcional neste novo local36. As funções fisiológicas dos exossomas permanecem pouco definidas. Pensa-se que ajudem a erradicar proteínas obsoletas, reciclar proteínas, mediar a transmissão de partículas infecciosas, como prions e vírus, a induzir resistência complementar, facilitar a comunicação célula-célula imune e transmitir sinalização celular1' 22' 25~ 28, 37-40 _ qs exossomas foram usados em imunoterapia para o tratamento do cancro34.

USOS DE PARTÍCULAS A PARTIR DE CÉLULAS ESTAMINAIS MESENQUIMAIS A partícula pode ser utilizada como um substituto para um MSC ou MSC-CM, tal como descrito acima. Em particular, a partícula pode ser utilizada para qualquer uma das finalidades terapêuticas em que as MSCs ou os MSC-CMs estão atualmente a ser usados, ou podem ser utilizados no futuro. É evidente que os métodos e composições aqui descritos permitem a produção de partículas a partir de células estaminais mesenquimais. Assim, qualquer uso das células estaminais mesenquimais irá igualmente prender-se às partículas de células estaminais mesenquimais.

As células estaminais mesenquimais e células diferenciadas produzidas pelos métodos e composições aqui descritos podem ser utilizadas para, ou para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença. Tal doença pode compreender uma doença tratável por terapia de regeneração, incluindo a insuficiência cardíaca, doenças da medula óssea, doenças de pele, queimaduras, doenças degenerativas, tais como diabetes, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, etc., e cancro. Por conseguinte, as partículas de MSCs podem ser usadas para tratar essas doenças.

As partículas de células estaminais mesenquimais, tais como as produzidas de acordo com os métodos e composições aqui descritos podem ser usadas para uma variedade de pesquisas comercialmente importantes, para efeitos diagnósticos e terapêuticos.

As partículas de células estaminais mesenquimais podem ser utilizadas em particular para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento da doença. Tal doença pode compreender uma doença tratável por terapia de regeneração, incluindo a insuficiência cardíaca, doenças da medula óssea, doenças de pele, queimaduras, doenças degenerativas, tais como diabetes, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, etc, e cancro.

As células estaminais mesenquimais produzidas pelos métodos e composições aqui descritos têm propriedades semelhantes ou idênticas às células estaminais mesenquimais derivadas de medula óssea (BM-MSCs). Portanto, as células estaminais mesenquimais, e quaisquer células diferenciadas produzidas a partir daquelas, bem como partículas derivados daquelas, podem ser utilizadas em qualquer das aplicações para as quais as BM-MSCs são conhecidas por serem usadas, ou em que é possível que sejam usadas.

DOENÇAS TRATÁVEIS POR PARTÍCULAS A PARTIR DE CÉLULAS ESTAMINAIS MESENQUIMAIS A análise do proteoma de MSCs mostra que as proteínas expressas estão envolvidas em três processos biológicos: metabolismo, respostas de defesa, e diferenciação de tecidos incluindo a vascularização, a hematopoiese e o desenvolvimento do esqueleto. Por conseguinte, as partículas de MSCs descritas aqui podem ser utilizadas para tratar doenças cujas funções podem ter um papel em, ou cujo tratamento ou reparação envolve qualquer um ou mais destes processos biológicos. Do mesmo modo, as proteínas expressas pelas MSCs, isoladas ou em combinação, de preferência sob a forma de partículas tal como aqui descritas, podem ser usadas para complementar a atividade de, ou em lugar das MSCs, ou meios condicionados por MSCs, para o propósito por exemplo, do tratamento ou prevenção de tais doenças.

Os 201 produtos de genes expressos pelas MSCs demonstram ativar as vias de sinalização importantes na biologia cardiovascular, o desenvolvimento dos ossos e a hematopoiese, tais como vias de sinalização Jak-STAT, MAPK, recetor de tipo Toll, sinalização de TGF-beta e mTOR. Por conseguinte, as partículas de MSC, etc., podem ser utilizadas para prevenir ou tratar uma doença em que qualquer uma destas vias de sinalização esteja envolvida, ou cuja etiologia envolva um ou mais defeitos em qualquer uma ou mais destas vias de sinalização.

Deste modo, tais partículas podem ser usadas para tratar a insuficiência cardíaca, doenças da medula óssea, doenças de pele, queimaduras e doenças degenerativas, tais como diabetes, doença de Alzheimer, doença de Parkinson e cancro.

Este tipo de partículas pode também ser utilizado para tratar o enfarte do miocárdio, uma ferida cutânea, um distúrbio dermatológico, uma lesão dermatológica, dermatite, psoríase, condiloma, verrugas, hemangioma, queloide, cancro da pele, dermatite atópica, doença de Behcet, doença granulomatosa crónica, linfoma cutâneo de células T, ulceração, uma condição patológica caracterizada por lesão inicial que induz inflamação e desregulação imunitária conduzindo a remodelação de tecidos crónica incluindo fibrose e perda de função, a lesão isquémica renal, fibrose cística, rinite e sinusite ou uma doença ortopédica.

As partículas podem ser usadas para ajudar a cicatrização de feridas, redução de cicatrizes, a formação óssea, o transplante de medula óssea ou enxerto de osso num indivíduo. A menos que o contexto indique de outro modo, o termo "meio condicionado" deve ser entendido como incluindo não só meio de cultura de células expostas a MSCs, bem como de uma tal composição que compreende um ou mais, de preferência substancialmente todos, os polipéptidos que se encontram presentes no meio condicionado.

As partículas podem também ser utilizadas como fontes de qualquer uma das proteínas segregadas ou expressas por MSCs. Por isso, descreve-se um método de produção de um polipéptido como mostrado em qualquer uma das Tabelas Dl a D5, o método compreendendo a obtenção de uma partícula, tal como descrita, e o isolamento do polipéptido a partir da partícula.

DOENÇA CARDÍACA

Os métodos de partículas de células estaminais mesenquimais e composições aqui descritos podem ser utilizados para o tratamento ou prevenção de doenças cardíacas. A doença cardíaca é um termo genérico para uma variedade de diferentes doenças que afetam o coração. A partir de 2007, é a principal causa de morte nos Estados Unidos, Inglaterra, Canadá e País de Gales, matando uma pessoa a cada 34 segundos nos Estados Unidos apenas. As doenças cardíacas incluem qualquer uma das seguintes.

Doença cardíaca coronária A doença arterial coronária é uma doença da artéria causada pela acumulação de placas de ateroma dentro das paredes das artérias que irrigam o miocárdio. A angina de peito (dor no peito) e enfarte do miocárdio (ataque cardíaco) são sintomas de e condições causadas por doença coronária. Mais de 459.000 americanos morrem de doença cardíaca coronária por ano. No Reino Unido, 101.000 mortes por ano são devidas à doença cardíaca coronária.

Cardiomiopatia A cardiomiopatia é a deterioração da função do miocárdio (isto é, o músculo do coração real) por qualquer motivo. Pessoas com cardiomiopatia estão muitas vezes em risco de arritmia e/ou morte súbita cardíaca. Cardiomiopatias extrínsecas, cardiomiopatias onde a patologia primária está fora do próprio miocárdio, compreendem a maioria das cardiomiopatias. De longe, a causa mais comum de uma cardiomiopatia é a isquemia. A Organização Mundial da Saúde inclui como cardiomiopatias específicas: cardiomiopatia alcoólica, doença arterial coronária, doença cardíaca congénita, doenças nutricionais que afetam o coração, cardiomiopatia isquémica (ou de isquemia), cardiomiopatia hipertensiva, cardiomiopatia valvular, cardiomiopatia inflamatória.

Também estão incluídas:

Cardiomiopatia secundária a uma doença metabólica sistémica cardiomiopatias intrínsecas (fraqueza no músculo do coração que não é devida a uma causa externa identificável)

Cardiomiopatia dilatada (DCM, a forma mais comum, e uma das principais indicações para o transplante cardíaco. Em DCM coração (especialmente o ventrículo esquerdo) é alargado e a função de bombeamento é diminuída) Cardiomiopatia hipertrófica (HCM ou HOCM, um distúrbio genético causado por várias mutações em genes que codificam proteínas sarcoméricas. Na HCM, o músculo cardíaco é engrossado, o que pode obstruir o fluxo de sangue e impedir que o coração funcione corretamente) , cardiomiopatia arritmogénica do ventrículo direito (ARVC, que surge a partir de uma perturbação elétrica do coração em que o músculo cardíaco é substituído por tecido cicatricial fibroso. 0 ventrículo direito é geralmente mais afetado)

Cardiomiopatia restritiva (RCM, que é a cardiomiopatia menos comum. As paredes dos ventrículos ficam rígidas, mas podem não engrossar, e resistem ao enchimento normal do coração com sangue).

Cardiomiopatia de não compactação - a parede do ventrículo esquerdo não foi capaz de crescer adequadamente desde o nascimento e tal, tem uma aparência esponjosa quando visto durante um ecocardiograma.

Doença Cardiovascular A doença cardiovascular é qualquer uma de um número de doenças especificas que afetam o coração em si mesmo e/ou o sistema de vasos sanguíneos, especialmente as veias e artérias que conduzem para e a partir do coração. A investigação sobre o dimorfismo da doença sugere que as mulheres que sofrem com a doença cardiovascular geralmente sofrem de formas que afetam os vasos sanguíneos, enquanto os homens geralmente sofrem de formas que afetam o músculo cardíaco. As causas conhecidas ou associadas de doença cardiovascular incluem a diabetes mellitus, hipertensão, hiperhomocisteinemia e hipercolesterolemia.

Os tipos de doenças cardiovasculares incluem a aterosclerose.

Doença cardíaca isquémica A doença cardíaca isquémica é a doença do próprio coração, caracterizada pela diminuição do suprimento sanguíneo aos órgãos. Isso ocorre quando as artérias que fornecem o oxigénio e os nutrientes fica parada e o coração não obtém oxigénio e os nutrientes suficientes e, eventualmente, para de bater.

Insuficiência Cardíaca A insuficiência cardíaca, também chamada de insuficiência cardíaca congestiva (ou CHF), e a insuficiência cardíaca congestiva (CCF), é uma condição que pode resultar de qualquer doença cardíaca estrutural ou funcional que prejudique a capacidade do coração de encher com sangue ou bombear uma quantidade suficiente de sangue por todo o corpo. Cor pulmonale é uma falha do lado direito do coração.

Doença cardíaca hipertensiva A cardiopatia hipertensiva é a doença cardíaca causada por hipertensão arterial, pressão arterial alta especialmente localizada. As condições que podem ser causadas por uma doença cardíaca hipertensiva incluem: hipertrofia ventricular esquerda, doença cardíaca coronária, insuficiência cardíaca (congestiva), miocardiopatia hipertensiva, arritmias cardíacas, doença cardíaca inflamatória, etc. A doença cardíaca inflamatória envolve inflamação do músculo cardíaco e/ou do tecido que o rodeia. A endocardite compreende inflamação da camada interna do coração, o endocárdio. As estruturas mais comuns envolvidas são as válvulas cardíacas. Cardiomegalia inflamatória. A miocardite compreende inflamação do miocárdio, a parte muscular do coração.

Valvopatia A doença cardíaca valvular é um processo da doença que afeta uma ou mais válvulas do coração. As válvulas do lado direito do coração são a válvula tricúspide e da válvula pulmonar. As válvulas do lado esquerdo do coração são a válvula mitral e a válvula aórtica. Incluem-se estenose da valva aórtica, prolapso da válvula mitral e cardiomiopatia valvular.

[0 texto acima é uma adaptação de Heart disease. (3 de fevereiro 2009) . In Wikipedia, The Free Encyclopedia, retirado em 06:33, 20 fevereiro 2009, de http ://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Heart-disease&oldid=2 6 82 9 0 92 4]

ADMINISTRAÇÃO DE PARTÍCULAS

As partículas tal como descritas no presente documento, podem ser entregues ao corpo humano ou animal por qualquer meio adequado.

Por isso, descrevemos um sistema de administração para a administração de partículas tal como descritas no presente documento a uma célula-alvo, tecido, órgão, do corpo do animal ou humano, e métodos para a utilização do sistema de administração para distribuir partículas a um alvo. 0 sistema de administração pode compreender uma fonte de partículas, tais como um contentor que contém as partículas. 0 sistema de administração pode compreender um distribuidor para distribuir as partículas a um alvo.

Por conseguinte, proporciona-se um sistema de administração para a administração de partículas, que compreende uma fonte de partículas tal como descrito no presente documento em conjunto com um distribuidor que pode funcionar para fornecer as partículas a um alvo. Nós descrevemos também a utilização de um tal sistema de administração num método de administração de partículas a um alvo.

Os sistemas de administração para a administração de fluido para dentro do corpo são conhecidos na arte, e incluem a injeção, gotejamentos cirúrgicos, cateteres (incluindo cateteres de perfusão), tais como os descritos na Patente dos Estados Unidos 6,139,524, por exemplo, os cateteres de distribuição de fármacos, tais como os descritos na Patente dos Estados Unidos 7,122,019. A administração nos pulmões ou vias nasais, incluindo a administração intranasal, pode ser conseguida utilizando, por exemplo, um spray nasal, soprador, inalador, etc, como conhecido na arte (por exemplo, como mostrado no Desenho ou Modelo nos Estados Unidos D544,957). A administração nos rins pode ser conseguida usando um cateter de administração intrarrenal da aorta, tal como o descrito na Patente dos Estados Unidos 7,241,273. É evidente que a administração especifica deve ser configurada para fornecer a quantidade necessária de partículas no intervalo de tempo apropriado, a fim de se conseguir um tratamento ótimo.

As partículas podem, por exemplo, ser utilizadas para o tratamento ou prevenção de aterosclerose. Aqui, a perfusão de partículas pode ser feita por via intravenosa para estabilizar as placas ateroscleróticas ou reduzir a inflamação nas placas. As partículas podem ser utilizadas para o tratamento ou prevenção do choque sético por perfusão intravenosa.

As partículas podem ser utilizadas para o tratamento ou prevenção da insuficiência cardíaca. Isto pode ser conseguido por perfusão intracoronária crónica ou por via intramiocárdica de partículas para retardar ou atrasar a remodelação da insuficiência cardíaca. As partículas podem ser utilizadas para o tratamento ou prevenção da inflamação pulmonar por administração intranasal.

As partículas podem ser utilizadas para o tratamento ou prevenção de condições dermatológicas por exemplo psoríase. A administração a longo prazo de partículas pode ser empregada com o uso de agulhas transdérmicas de microinjeção até que a condição seja resolvida.

Será evidente que o método de administração irá depender do órgão particular ao qual as partículas são para ser administradas, e o perito na arte será capaz de determinar os meios a empregar em conformidade. A título de exemplo, no tratamento de inflamação cardíaca, as partículas podem ser administradas, por exemplo, ao tecido cardíaco (isto é, miocárdio, pericárdio, ou endocárdio), por injeção direta intracoronária através da parede torácica ou utilizando métodos baseados em cateter percutâneo padrão sob orientação fluoroscópica para injeção direta no tecido, tal como o miocárdio ou a infusão de um inibidor de um stent ou cateter que é inserido dentro de um lúmen corporal.

Qualquer variedade de cateteres coronários, ou um cateter de perfusão, pode ser utilizada para administrar o composto. Em alternativa, as partículas podem ser revestidas ou impregnadas com um stent que é colocado num vaso coronário.

REGENERAÇÃO DE TECIDOS

As células estaminais mesenquimais e células diferenciadas produzidas de acordo com os métodos e composições aqui descritos, e as partículas que delas derivam, podem também ser utilizadas para a reconstituição ou regeneração de tecidos de um paciente humano com necessidade das mesmas. As células são administradas de uma forma que lhes permite enxertar para o local do tecido pretendido e reconstituir ou regenerar a área funcionalmente deficiente.

Por exemplo, os métodos e composições aqui descritos podem ser utilizados para modular a diferenciação de células estaminais. As células estaminais mesenquimais e células diferenciadas e partículas derivadas, podem ser utilizadas para manipulação de tecidos, tais como para o crescimento de enxertos de pele. A modulação da diferenciação de células estaminais pode ser utilizada para a biomanipulação de órgãos ou tecidos artificiais, ou para próteses, tais como stents.

CANCRO

As células estaminais mesenquimais e células diferenciadas produzidas pelos métodos e composições aqui descritos e partículas delas derivadas podem ser utilizadas para o tratamento de cancro.

Os termos "cancro" e "canceroso" referem-se ou descrevem a condição fisiológica em mamíferos que é tipicamente caracterizada por crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem, mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma e leucemia.

Exemplos mais particulares de tais cancros incluem o cancro de células escamosas, cancro de pulmão de células pequenas, cancro do pulmão de células não pequenas, cancro gástrico, cancro pancreático, tumores das células gliais, tais como glioblastoma e neurofibromatose, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro do fígado, cancro de bexiga, hepatoma, cancro de mama, cancro de cólon, cancro colorretal, carcinoma endometrial, carcinoma da glândula salivar, cancro de rim, cancro renal, cancro de próstata, cancro de vulva, cancro de tiroide, carcinoma hepático e vários tipos de cancro de cabeça e pescoço. Outros exemplos são o cancro de tumor sólido, incluindo cancro de cólon, cancro de mama, cancro de pulmão e cancro de próstata, doenças malignas hematopoiéticas incluindo leucemias e linfomas, doença de Hodgkin, anemia aplástica, o cancro de pele e polipose adenomatosa familiar. Outros exemplos incluem neoplasias cerebrais, neoplasias colorretais, neoplasias mamárias, neoplasias de colo, neoplasias oculares, neoplasias hepáticas, neoplasias pulmonares, neoplasias pancreáticas, neoplasias de ovário, neoplasias prostáticas, neoplasias cutâneas, neoplasias testiculares, neoplasias, neoplasias ósseas, neoplasias trofoblásticas, neoplasias de trompas de Falópio, neoplasias retais, neoplasias do cólon, neoplasias renais, neoplasias de estômago, e as neoplasias paratiroides. 0 cancro de mama, cancro de próstata, cancro de pâncreas, cancro colorretal, cancro de pulmão, melanoma maligno, leucemia, linfoma, cancro de ovário, cancro de colo uterino e carcinoma das vias biliares também estão incluídos.

As células estaminais mesenquimais e células diferenciadas produzidas de acordo com os métodos e composições aqui descritos podem também ser usadas em combinação com agentes anticancro tais como a endostatina e angiostatina ou fármacos citotóxicos ou agente quimioterapêutico. Por exemplo, fármacos tais como adriamicina, daunomicina, cis-platina, etoposido, taxol, taxotere e alcaloides, tais como vincristina, e antimetabolitos tais como metotrexato. 0 termo "agente citotóxico" tal como aqui utilizado refere-se a uma substância que inibe ou previne a função de células e/ou provoca destruição de células. 0 termo pretende incluir isótopos radioativos (por exemplo, I, Y, Pr), agentes quimioterapêuticos, e toxinas tais como toxinas enzimaticamente ativas de, origem fúngica, vegetal ou animal, bacteriana ou os seus fragmentos.

Além disso, o termo inclui produtos de oncogenes/inibidores da tirosina cinase, tais como as ansamicinas biciclicas divulgadas no documento WO 94/22867; derivados do ácido 1,2-bis(arilamino)benzoico, divulgados na EP 600832; derivados de 6,7-diamino-ftalazin-l-ona divulgados em EP 600831; derivados de 4,5-bis (arilamino)-ftalimida como descrito em EP 516598; ou péptidos que inibem a ligação de uma tirosina cinase de um substrato de proteína contendo SH2 (ver WO 94/07913, por exemplo). Um "agente quimioterapêutico" é um composto químico útil no tratamento do cancro. Exemplos de agentes quimioterapêuticos incluem adriamicina, doxorrubicina, 5-fluorouracilo (5-FU), citosina-arabinósido (Ara-C), Ciclofosfamida, Tiotepa, Bussulfano, Citoxina, Taxol, Metotrexato, Cisplatina, Melfalano, Vinblastina, Bleomicina, Etoposido, Ifosfamida, mitomicina C, mitoxantrona, Vincristina, VP-16, Vinorelbine, carboplatina, Teniposide, Daunomycin, Carminomicina, Aminopterin, Dactinomicina, Mitomicina, nicotinamida, Esperamicinas (ver Pat. nos EUA n° 4,675,187), melfalano e outras mostardas de azoto relacionadas, e terapias endócrinas (tais como o dietilestilbestrol (DES), tamoxifeno, fármacos antagonistas de LHRH, progestinas, anti-progestinas, etc). OBTENÇÃO DE CÉLULAS ESTAMINAIS MESENQUIMAIS (MSC)

As partículas aqui descritas podem ser isoladas ou produzidas a partir de meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM). As MSCs adequadas para utilização na produção de meios condicionados e partículas podem ser feitas por qualquer método conhecido na arte.

Em particular, as MSCs podem ser feitas através da propagação de uma célula obtida por dispersão de uma colónia de células estaminais embrionárias (ES), ou um descendente das mesmas, na ausência de co-cultura em meio livre de soro que compreende FGF2. Isto está descrito em detalhe nas secções que se seguem.

Os métodos dpo estado da técnica de obtenção de células estaminais mesenquimais (MSC) ou células tipo MSC de hESCs envolvem a transfecção de um gene de transcriptase inversa da telomerase humana (hTERT) em hESCs diferenciadoras (Xu et al. , 2004) ou co-cultura com linha celular mouse OP9 (Barberi et al. , 2005) . A utilização de células de ratinho e de material genético exógeno nestes protocolos de derivação introduz riscos inaceitáveis de tumorigenicidade ou infeção de agentes infeciosos xenozoóticos.

As partículas podem, portanto, ser produzidas a partir de MSCs derivadas da utilização de um protocolo clinicamente relevante e reprodutível para o isolamento de populações MSC semelhantes ou idênticas (como homogéneas) a partir de hESCs diferenciadoras. Em geral, o método compreende a dispersão de uma colónia de células estaminais embrionárias (ES) em células. As células são então plaqueadas e propagadas. As células são propagadas na ausência de co-cultura num fator de meio livre de soro que compreende o fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2), a fim de obter as células estaminais mesenquimais (MSCs).

Assim, o protocolo não necessita de soro, o uso de células de ratinho ou de manipulações genéticas e requer menos manipulações e tempo, e é, portanto, altamente escalável. 0 protocolo pode ser utilizado para o isolamento de MSCs a partir de diferentes linhas de hESCs. As MSCs derivadas de célula ES humana (hESC-MSCs) obtidas pelos métodos e composições aqui descritos são muito semelhantes aos das MSCs derivadas de medula óssea (BM-MSCs). A cultura de células estaminais embrionárias pode compreender uma cultura de células estaminais embrionárias humanas (hESC).

Um método para gerar células estaminais mesenquimais (MSC) pode compreender a tripsinização e propagação de hESCs sem apoio alimentador em meios suplementados com FGF2 e opcionalmente PDGF AB antes da separação para células CD105 + CD24. 0 método pode compreender a separação para células CD105 +, CD24- de hESCs tripsinizadas uma semana após a propagação livre de alimentador num meio suplementado com FGF2 e opcionalmente PDGF AB vai gerar-se para gerar uma cultura de células hESC-MSC em que, pelo menos, algumas, tais como substancialmente todas, ou todas as células são semelhantes ou idênticas (tal como homogéneas) umas às outras.

As MSCs produzidas por este método podem ser utilizadas para produzir meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM), a partir do qual as partículas podem ser isoladas.

Desagregação de colónias de células estaminais embrionárias Um método de produção de células estaminais mesenquimais pode compreender a dispersão ou desagregação de uma colónia de células estaminais embrionárias em células.

Exemplos de colónias de células estaminais embrionárias que não se enquadram no âmbito da presente invenção compreendem uma colónia huES9 (Cowan CA, Klimanskaya I, J McMahon, Atienza J, Witmyer J, et al. (2004) Derivation of embryonic stemcell lines from human blastocysts. N Engl J Med 350:1353-1356) ou uma colónia HI ESC (Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, et al. (1998) Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 282:1145-1147.).

As células da colónia podem ser desagregadas ou dispersas de forma substancial, ou seja, pelo menos em aglomerados. A colónia pode ser desagregada ou dispersa na medida em que todas as células na colónia são únicas, isto é, a colónia é completamente desagregada. A desagregação pode ser conseguida com um agente de dispersão. O agente de dispersão pode ser qualquer coisa que seja capaz de separar, pelo menos, algumas células estaminais embrionárias numa colónia, umas das outras. O agente de dispersão pode compreender um reagente que interrompe a adesão entre as células numa colónia, ou entre as células e um substrato, ou ambos. 0 agente de dispersão pode compreender uma protease. 0 agente de dispersão pode compreender tripsina. 0 tratamento com tripsina pode durar, por exemplo, mais ou menos 3 a 37 graus C. As células podem então ser neutralizadas, centrifugadas e ressuspensas em meio antes de plaqueamento. 0 método pode compreender a dispersão de uma placa confluente de células estaminais embrionárias humanas com tripsina e plaqueamento das células. A desagregação pode compreender pelo menos uma parte da seguinte sequência de passos: aspiração, lavagem, tripsinização, incubação, desalojando, extinção, re-semeadura e aliquotas. 0 protocolo a seguir é uma adaptação de Hedrick Lab, UC San Diego (http://hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html) .

No passo da aspiração, o meio é aspirado ou geralmente removido do recipiente, tal como um balão. No passo de lavagem, as células são lavadas com um volume de, por exemplo, 5-10 mis, de um meio tamponado, o qual pode ser isento de Ca2+ e Mg2+. Por exemplo, as células podem ser lavadas com PBS livre de cálcio e magnésio. No passo de tratamento com tripsina, uma quantidade de agente de dispersão em tampão é adicionada ao recipiente, e o recipiente é laminado para o revestimento da superfície de cultura, com a solução de agente de dispersão. Por exemplo, 1 mL de tripsina, em BSS de Hank podem ser adicionados a um frasco.

No passo de incubação, as células são deixadas durante algum tempo a uma temperatura mantida. Por exemplo, as células podem ser deixadas a 37 °C durante alguns minutos (por exemplo, 2 a 5 minutos). No passo de desalojamento, as células podem ser desalojadas por uma ação mecânica, por exemplo, por raspagem ou por bater o lado do recipiente com a mão. As células devem sair em folhas e deslizar para baixo ao longo da superfície.

No passo de extinção, um volume de meio é adicionado ao balão. 0 meio pode compreender um agente de neutralização para parar a ação do agente de dispersão. Por exemplo, se o agente de dispersão for uma protease tal como tripsina, o meio pode conter uma proteína, tal como uma proteína do soro, que vai limpar a atividade da protease. Num exemplo particular, 3 mL de soro contendo meio de cultura de células é adicionado ao frasco para perfazer um total de 4 mis. As células podem ser pipetadas para desalojar ou dispersar as células.

No passo de re-semeadura, as células são re-semeadas em vasos de cultura frescos e meio fresco adicionado. Um número de re-semeaduras pode ser feita em diferentes razões de divisão. Por exemplo, as células podem ser re-semeadas numa diluição de 1/15 e diluição de 1/5. Num exemplo em particular, as células podem ser re-semeadas por adição de 1 gota de células num balão de 25cm2 e 3 gotas na outra para re-semear a cultura, e 7-8 mis de meio são então adicionados a cada para fornecer uma diluição de 1/15 e diluição de 1/5 por exemplo de um frasco de 75cm2. No passo de alíquotas, as células podem ser divididas em alíquotas em placas novas ou qualquer relação de divisão é desejada, e os meios são adicionados. 0 método pode incluir os seguintes passos: as ES humanas são primeiramente cultivadas em suspensão em forma não-aderente para formar corpos embrioides (EB) . EBs com 5-10 dias serão tripsinizadas antes do plaqueamento como células aderentes em placas de cultura de tecidos revestidas com gelatina.

Manutenção como Cultura de Células

As células desagregadas podem ser plaqueadas e mantidas como uma cultura de células.

As células podem ser plaqueadas num vaso de cultura ou substrato tal como uma placa gelatinizada. Fundamentalmente, as células são cultivadas e propagadas sem a presença de co-cultura, por exemplo, na ausência de células alimentadoras.

As células na cultura de células podem ser cultivadas num meio isento de soro que é complementado por um ou mais fatores de crescimento tais como fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2) e opcionalmente o fator de crescimento derivado de plaquetas AB (PDGF AB) , a por exemplo, 5 ng/mL. As células na cultura de células pode ser dividida ou subcultivada a 1:4 quando confluente, por tratamento com tripsina, a lavagem e replaqueamento.

Ausência de Co-Cultura

As células podem ser cultivadas na ausência de co-cultura. O termo "co-cultura" refere-se a uma mistura de dois ou mais tipos diferentes de células que são cultivadas em conjunto, por exemplo, células de alimentação do estroma.

Assim, em cultura de células ES típica, a superfície interior da placa de cultura é normalmente revestida com uma camada alimentadora de células de pele de ratinho embrionárias que foram tratadas de modo a não se dividirem. A camada de alimentação fornece uma superfície aderente para permitir que as células ES se unam e cresçam. Além disso, as células alimentadoras libertam nutrientes para o meio de cultura, que são necessários para o crescimento de células ES. Nos métodos e composições aqui descritos, as células ES e MSC podem ser cultivadas na ausência de tal co-cultura.

As células podem ser cultivadas como uma monocamada ou na ausência de células alimentadoras. As células estaminais embrionárias podem ser cultivadas na ausência de células alimentadoras para estabelecer células estaminais mesenquimais (MSC).

As células estaminais embrionárias dissociada ou desagregadas podem ser plaqueadas diretamente sobre um substrato de cultura. 0 substrato de cultura pode compreender um recipiente de cultura de tecido, tal como uma placa de Petri. 0 recipiente pode ser pré-tratado. As células podem ser plaqueadas e crescer numa placa de cultura de tecido gelatinizado.

Segue-se um exemplo de protocolo para o revestimento de gelatina das placas. Uma solução de 0,1% de gelatina em água destilada é produzida em autoclave. Esta pode ser armazenada à temperatura ambiente. A parte inferior de uma placa de cultura de tecidos é coberta com a solução de gelatina e incubada durante 5-15min. Remove-se a gelatina e as placas estão prontas para usar. O meio deve ser adicionado antes de adicionar células para evitar a lise hipotónica.

Meio livre de soro

As células estaminais embrionárias dissociadas ou desagregadas podem ser cultivadas num meio que pode compreender um meio isento de soro. 0 termo "meio isento de soro" pode compreender meios de cultura celular, que são livres de proteínas do soro, por exemplo, soro fetal de vitelo. Os meios isentos de soro são conhecidos na arte, e são descritos por exemplo nas Patentes nos EUA 5,631,159 e 5,661,034. Os meios isentos de soro estão disponíveis comercialmente a partir, por exemplo, da Gibco-BRL (Invitrogen). O meio isento de soro pode ser isento de proteína, na medida em que pode não ter proteínas, hidrolisados, bem como componentes de composição desconhecida. Os meios isentos de soro podem compreender meios quimicamente definidos, em que todos os componentes possuem uma estrutura química conhecida. O meio isento de soro, quimicamente definido, é vantajoso pois proporciona um sistema completamente definido que elimina a variabilidade, permite uma reprodutibilidade melhorada e desempenho mais consistente, e diminui a possibilidade de contaminação por agentes adventícios. O meio isento de soro pode compreender meio Knockout DMEM (Invitrogen-Gibco, Grand Island, Nova Iorque).

[0184] Os meios isentos de soro podem ser suplementados com um ou mais componentes, tais como meios de substituição de soro, numa concentração de, por exemplo, 5%, 10%, 15%, etc. Os meios isentos de soro podem compreender ou ser suplementados com 10% de meio de soro de substituição da Invitrogen- Gibco (Grand Island, Nova Iorque).

Fator de crescimento O meio isento de soro, em que as células estaminais embrionárias dissociadas ou desagregadas são cultivadas pode compreender um ou mais fatores de crescimento. Um número de fatores de crescimento é conhecido na arte, incluindo PDGF, EGF, TGF-a, FGF, NGF, eritropoietina, TGF-b, IGF-I e IGF-II. O fator de crescimento pode compreender o fator de crescimento de fibroblastos 2 (FGF2). O meio pode também conter outros fatores de crescimento tais como o fator de crescimento derivado de plaquetas AB (PDGF AB). Ambos estes fatores de crescimento são conhecidos na arte. O método pode compreender a cultura de células num meio que compreende tanto o FGF2 como o PDGF AB.

Em alternativa, ou em adição, o meio pode compreender ou ainda compreender o fator de crescimento epidérmico (EGF). O uso de EGF pode aumentar o crescimento das MSCs. O EGF pode ser utilizado em qualquer concentração adequada, por exemplo, de 5-10 ng/mL de EGF. O EGF pode ser usado em lugar de PDGF. O EGF é uma proteína bem conhecida na arte, e é referido com o símbolo EGF, Alt. Os símbolos URG, Entrez 1950, HUGO 3229, OMIM 131530, RefSeq NM_001963, UniProt P01133.

Assim, divulga-se a utilização de meios que compreendem (i) FGF2, (ii) FGF2 e PDGF e (iii) o FGF2 e EGF e outras combinações. 0 FGF2 é um factor de amplo espectro mitogénico, angiogénico, e neurotrófico que é expresso em níveis baixos em muitos tecidos e tipos de células e atinge concentrações elevadas no cérebro e pituitária. 0 FGF2 tem sido implicado numa variedade de processos fisiológicos e patológicos, incluindo o desenvolvimento dos membros, a angiogénese, a cura de feridas, e crescimento tumoral. 0 FGF2 pode ser obtido comercialmente, por exemplo, da Invitrogen, Gibco (Grand Island, Nova Iorque). 0 fator de Crescimento Derivado de Plaquetas (PDGF) é um potente mitógenio para uma ampla gama de tipos de células incluindo fibroblastos, músculo liso e tecido conjuntivo. 0 PDGF, o qual é composto de um dímero de duas cadeias denominadas cadeia e cadeia B, podem estar presentes como homoderos AA ou BB ou como um heterodímero AB. 0 PDGF-AB Humano é uma proteína homodimérica 25,5 kDa consistindo de 13,3 kDa e uma cadeia A e cadeia 12,2 B. 0 PDGF AB pode ser obtido comercialmente, por exemplo a partir de Peprotech (Rocky Hill, New Jersey). 0(s) fator (es) de crescimento, tais como FGF2 e opcionalmente PDGF AB, podem estar presentes no meio a concentrações de cerca de 100 pg/mL, tal como de cerca de 500 pg/mL, tal como cerca de 1 ng/mL, tal como cerca de 2 ng/mL, tal como cerca de 3ng/mL, tal como cerca de 4ng/mL, tal como cerca de 5 ng/mL. O meio pode conter FGF2 em cerca de 5 ng/mL. O meio pode também conter PDGF AB, tal como a cerca de 5 ng/mL.

Divisão de células

As células em cultura irão geralmente continuar a crescer até à confluência, quando a inibição de contacto provoca a cessação da divisão celular e crescimento. Tais células podem, então, ser dissociadas do substrato ou frasco, e "separadas", subcultivadas ou passadas, por diluição em meio de cultura de tecido e replaqueamento.

Os métodos e composições aqui descritos podem, por conseguinte, compreender passagens em, ou fracionamento durante a cultura. As células na cultura de células podem ser divididas numa proporção de 1:2 ou mais, tal como 1:3, tal como 1:4, 1:5 ou mais. 0 termo "passagem" designa o processo que consiste em retirar uma alíquota de uma cultura confluente de uma linhagem celular, em inoculação em meio fresco, e na cultura da linha até a confluência ou saturação ser obtida.

Passo de Seleção, rastreio ou Classificação 0 método pode ainda compreender um passo de seleção ou de classificação, para isolar ainda mais ou selecionar as células estaminais mesenquimais. 0 passo de seleção ou classificação pode compreender a seleção de células estaminais mesenquimais (MSC) a partir da cultura de células por meio de um ou mais marcadores de antigénios de superfície. A utilização de um passo de seleção ou classificação aumenta ainda mais o rigor da especificidade de classificação e seleção para as MSCs e, além disso, reduz potencialmente possível contaminação a partir de células estaminais embrionárias, tais como hESCs e outros derivados de hESCs do material de partida. Isto iria então reduzir ainda mais o risco de formação de teratinhomas e aumentar ainda mais a relevância clinica do protocolo que se descreve.

Um número de métodos é conhecido para a seleção ou classificação com base na expressão do antigénio, e qualquer um destes pode ser utilizado no passo de seleção ou de classificação aqui descrito. A seleção ou classificação pode ser conseguida por meio de células ativadas por fluorescência (FACS). Assim, como é conhecido na arte, FACS envolve a exposição de células a um repórter, tal como um anticorpo marcado, que se liga a e rotula antigénios expressos pela célula. Métodos de produção de anticorpos e de rotulagem, para formar repórteres são conhecidos na técnica, e descritos, por exemplo, em Harlow e Lane. As células são então passadas através de uma máquina de FACS, que classifica as células entre si com base na rotulagem. Alternativamente ou em adição, a classificação de células magnética (MACS) pode ser empregue para classificar as células. Nós percebemos que, enquanto um número de antigénios de superfície candidato se sabe estarem associados com MSCs, por exemplo, CD105, CD73, ANPEP, ITGA4 (CD49d), PDGFRA, alguns dos antigénios de superfície associados a MSCs, CD29 e CD49e também são altamente expressos em células ES tal como hESCs e a sua expressão é verificada através da análise de FACS. A associação de um antigénio de superfície com MSCs pode não ser suficiente para qualificar o antigénio como um marcador de seleção para o isolamento de MSCs a partir de células ES, tais como hESC. Assim, o passo de seleção ou classificação pode empregar antigénios que são diferencialmente expressos entre MSCs e células ES. 0 passo de seleção ou classificação do nosso método pode selecionar positivamente as células estaminais mesenquimais com base na expressão de antigénios. Tais antigénios podem ser identificados, por exemplo, por comparação dos perfis de expressão de genes hESCs e hESCMSCs. A selecção ou classificação especificamente podem fazer uso de qualquer um dos antigénios indicados na tabela abaixo EIA e E1B. 0 passo de seleção ou classificação do nosso método pode selecionar positivamente as células estaminais mesenquimais com base na expressão de antigénios, que são identificados como expressos nas MSCs, mas não expressos nas células ES tal como hESCs. CD73 é altamente expresso em MSCs, embora não sendo altamente expresso em hESCs. Tanto CD73 como CD105 são antigénios de superfície altamente expressos em MSCs e encontram-se entre os 20 principais antigénios de superfície altamente expressos em hESCs-MSCs em relação a hESCs, a utilização quer de CD73 ou CD105 (ou ambos) como marcador selecionável para MSCs putativas serão igualmente eficazes na classificação para MSCs putativas geradas por hESCs diferenciadoras .

Em alternativa, ou além disso, o passo de seleção ou de classificação pode selecionar negativamente contra antigénios baseados em antigénios de superfície que são altamente expressos como antigénios de superfície em células estaminais embrionárias (células ES) , tais como hESCs, e células estaminais não mesenquimais, por exemplo, hESC -MSC. A seleção ou classificação podem ser baseadas em antigénios de superfície conhecidos ou identificados anteriormente específicos de hESCs, tais como MIBP, ITGB1BP3 e PODXL, e CD24. A análise FACS confirma a expressão de CD24 em hESCs, mas não em hESC-MSCs. Portanto, CD24 pode ser usado como um marcador de seleção ou classificação negativa, quer por si só, ou em conjunto com CD105 como um marcador de seleção positiva para isolar MSCs putativas de culturas de hESCs diferenciadoras.

EXEMPLOS

As células estaminais mesenquimais (MSCs) derivadas a partir de medula óssea adulta têm emergido como um dos tipos de células estaminais mais promissores para o tratamento de doença cardiovascular (Pittenger e Martin, 2004) . Embora os efeitos terapêuticos das MSCs autólogas tenha sido atribuídos ao seu potencial para se diferenciarem em muitos tipos de células reparadoras ou de substituição, tais como cardiomiócitos, células endoteliais e células vasculares lisas (Minguell e Erices, 2006; Zimmet e Hare, 2005), a eficiência da diferenciação de MSCs transplantadas em números relevantes a nível terapêutico de células reparadoras funcionais nos tecidos lesados ainda não foi estabelecida.

Relatórios recentes sugerem que alguns destes efeitos reparadores são mediados por fatores parácrinos secretados pelas MSCs (Caplan e Dennis, 2006a;. Gnecchi et ai, 2005; Gnecchi et al, 2006; . Schafer e Northoff, 2008) . Esta hipótese parácrina introduz uma dimensão radicalmente diferente para a utilização de células estaminais, em particular, as MSCs em medicina regenerativa. Os mecanismos potenciais de ações parácrinas de MSCs incluem capacidade endógena regenerativa, angio- e arteriogénese, remodelação atenuante, e redução da apoptose. Se os efeitos terapêuticos das MSCs são, em parte, mediados pelas suas secreções, o repertório de terapias baseadas em células estaminais poderia ser estendido através da aplicação dos seus fatores segregados. Tal abordagem poderia fornecer uma opção terapêutica "pronta a usar", baseada em MSCs, que é um requisito para proteção urgente contra a lesão de reperfusão em pacientes com MI agudo, a custos acessíveis e com excelente controlo de qualidade e consistência.

Em apoio a esta hipótese de paracrina, muitos estudos têm identificado a presença de citocinas, quimiocinas e fatores de crescimento que poderiam reparar tecidos cardíacos lesionados, principalmente através do crescimento e regeneração do tecido cardíaco e vascular (Caplan e Dennis, 2006b; Liu e Hwang, 2005) . Apoiamos ainda mais essa hipótese, realizando a primeira análise proteómica em profundidade da secreção parácrina de MSCs (Sze et ai., 2007) . Isto foi facilitado pela nossa derivação de culturas de MSC altamente expansíveis e idênticas a partir de ESCs humanas (Lian et al., 2007) e o uso de um meio quimicamente definido para a cultura das células e colheita da secreção através do meio condicionado (CM). Surpreendentemente, muitas das proteínas secretadas eram proteínas intracelulares e não são conhecidas por serem segregadas ou transportadas através da membrana plasmática. A análise computacional do secretoma previu que coletivamente, o secretoma tem o potencial para reparar tecidos lesados, como lesão miocárdica por isquemia/reperfusão (MI/R) (Sze et al., 2007) .

Para testar a previsão computacional, a secreção sob a forma de CM foi administrada a um modelo de suíno de lesão MI/R (Timmers et al., 2008). Durante a isquemia do miocárdio causada pela oclusão de uma artéria coronária, a terapia de reperfusão é atualmente a modalidade de tratamento mais eficaz. No entanto, a reperfusão envolve a abertura da artéria bloqueada para restaurar o fluxo sanguíneo ou a reperfusão também induz lesão dos tecidos isquémicos recém-perfundidos (Saraste et al., 1997) . Por conseguinte, a eficácia da terapêutica de reperfusão pode ser grandemente melhorada se a lesão de reperfusão poder ser neutralizada imediatamente no ponto de reperfusão. Quando o CM foi entregue de forma intracoronária ao modelo suíno de lesão MI/R imediatamente após a reperfusão, houve uma redução de 60% no enfarte do miocárdio, a preservação da função cardíaca e redução do stress oxidativo, já em 4 horas após a reperfusão. Isto confirmou que a secreção parácrina das MSCs pode melhorar a lesão MI/R num modelo animal clinicamente relevante (Timmers et al., 2008) .

No entanto, o mecanismo pelo qual a secreção medeia este efeito imediato sobre a lesão MI/R não é clara. É óbvio que a iminência deste efeito protetor impede o processo relativamente moroso de regeneração dos tecidos, como parte do mecanismo. Além disso, muitas das proteínas secretadas são proteínas intracelulares e não são conhecidas por atravessar membranas plasmáticas prontamente. Para compreender melhor os efeitos parácrinos das MSCs, fracionou-se sistematicamente o CM utilizando membranas com diferentes limites de pesos moleculares (MWCO) para identificar a composição e perfil da fração ativa. Nós já mostrámos que o CM filtrado através de membrana de 0,2 pm, mas não 1000 kDa MWCO era cardioprotetor (Timmers et al., 2008). No entanto, o CM parcialmente concentrado contra membrana de MWCO de 1000 kDa era cardioprotetor. Isto sugeriu que o efeito cardioprotetor foi mediado por complexos grandes com diâmetro de 50 -100 nm.

Aqui nós estendemos a nossa lista anteriormente relatada de proteínas na secreção par >700 proteínas e estas proteínas incluem muitas proteínas que são comummente encontradas em exossomas. Nós também identificámos a presença de ARN (<300 nts) na secreção. Além disso, as proteínas e ARN foram encapsuladas em vesículas de fosfolípidos e as únicas partículas detetáveis na secreção dentro do intervalo do raio hidrodinâmico (rh) de 1-1000 nm foram de rh = 45-55 nm. Estas partículas eluidas como um pico único em HPLC de fracionamento. Em conjunto, estes estudos demonstram que o grande complexo cardioprotetor na secreção acarreta muitas das características distintivas de um exossoma levando à nossa hipótese de que o componente cardioprotetor ativo na secreção é um exossoma.

Exemplo Comparativo 1. Materiais e Métodos: Preparação de MSC-CM

Os protocolos para a geração de MSC e preparação de CM foram descritos anteriormente15' 16.

Em suma, um meio de cultura sem soro quimicamente definido é condicionado por MSCs derivadas de células estaminais embrionárias humanas (hESCs), usando um protocolo clinico compatível. Três culturas policlonais, cariótipicamente estáveis, e fenotipicamente do tipo MSC, que não expressam marcadores associados a pluripotência mas que mostram antigénios de superfície do tipo MSC (CD29+, CD44+, CD49a+ /e+, CD105+, CD166+, CD34-, CD45-) e o perfil de expressão do gene, são gerados por tripsinização e propagação de hESCs a partir da linha HuES9 hESC ou linha Hl hESC em meio de seleção isento de alimentador e sem soro15.

Uma dessas culturas, HuES9.El pode ser expandida de forma estável durante pelo menos 80 duplicações da população. Para colher a secreção de MSC, culturas de MSC derivadas de hES são transferidas para um meio de cultura isento de soro quimicamente definido para condicionar o meio durante três dias antes de o meio contendo secreções de MSCs ser recolhido, clarificado por centrifugação, concentrado 25 vezes utilizando um limite de PM de 10 kDa de membranas de ultrafiltração e esterilizado por filtração através de um filtro de 220 nm.

[0212] O proteoma secretor é analisado por tecnologia multidimensional a identificação de proteínas (mudpit) e análise de matriz de anticorpo citoquina, e revelou a presença de 201 produtos de genes únicos. Análises computacionais revelaram que este CM tem potenciais propriedades vitoprotetoras15.

Exemplo 2. Materiais e Métodos: Animais

Todas as experiências são realizadas de acordo com o "Guide for the Care and Use of Laboratory Pigs", elaborado pelo Institute of Laboratory Animal Resources e com a aprovação prévia da Animal Experimentation Committee da Faculty of Medicine, Utrecht University, Países-baixos.

Exemplo 3. Materiais e Métodos: Configuração do estudo

Trinta fêmeas de suínos Landrace Dalland (60-70 kg; IDDLO, Lelystad, Países-Baixos), todas pré-tratadas com clopidogrel 75 mg/dia durante 3 dias e amiodarona 400 mg/dia durante 10 dias, são distribuídas aleatoriamente para tratamento com MSC-CM, não-CM, ou solução salina. O grupo de solução salina é adicionado para avaliar um potencial efeito de meio não condicionado de cultura fresco. Em todos os suínos, MI é induzido por 75 minutos de ligação à artéria coronária esquerda proximal (LCxCA) e 4 horas de reperfusão subsequente. Um período de isquemia de 75 minutos é selecionado para infligir lesão miocárdica grave, sem indução de enfarte do miocárdio completamente transmural. O período de reperfusão de 4 horas é usado, porque a medição da dimensão do enfarte utilizando a coloração TTC é mais fiável após 3 horas de reperfusion17. Após períodos mais longos de reperfusão, torna-se mais difícil avaliar o estado de stress oxidativo e mecanismos apoptóticos. O tratamento é iniciado 5 minutos antes do inicio da reperfusão por infusão intravenosa de MSC-CM (1,0 mL, 2,0 mg de proteína) não-CM ou solução salina. Imediatamente após a reperfusão, um bolus intracoronário adicional (4,0 mL, 8,0 mg de proteína), não-CM ou solução salina é dado. A dimensão do enfarte do miocárdio e função são avaliados 4 horas após a reperfusão.

Exemplo 4. Materiais e Métodos: MI e Procedimentos

Operacionais

Durante toda a operação, ECG, a Pressão Arterial Sistémica, e capnografia são monitorizados continuamente. Sob anestesia geral, como descrito anteriormente18, uma esternotomia mediana é realizada e duas folhas de introdução são inseridas nas artérias carótidas para um cateter guia 6 Fr e um cateter de condutância 8 Fr (CD Leycom, Zoetermeer, Países-Baixos). A ponta distai de um cateter de Swan Ganz é colocada na artéria pulmonar através da veia jugular interna. Sondas de fluxo transónicas (Transonic Systems Inc, Ithaca, NY) são colocadas em torno da aorta proximal e LCxCA para medir o débito cardíaco e fluxo coronário, e um fio é colocado ao redor da veia cava inferior para permitir medidas funcionais em diferentes condições de carga para ciclos PV.

Após medidas funcionais, 10.000 UI de heparina são administrados por via intravenosa e as suturas são apertadas para ocluir o LCxCA proximal. Desfibrilação interna com 50 J é usada quando ocorre a fibrilação ventricular. Após 75 minutos de isquemia, o LCxCA é reaberto pela libertação da sutura. Imediatamente após a reperfusão, nitroglicerina (0,1 mg para evitar nenhum refluxo) é infundida através da LCxCA através do cateter de guia, seguido por tratamento de intracoronária com MSC-CM, não-CM ou solução salina. Após 4 horas de reperfusão, as medidas funcionais finais são realizadas e o coração é explantado para análise da dimensão do enfarte.

Exemplo 5. Materiais e Métodos: Medidas Funcionais A pressão e volume do ventrículo esquerdo (LV) são medidos usando o método de cateter de condutância, como descrito anteriormente18. Sinais de pressão e volume do LV derivados do cateter de condutância são exibidos e adquiridos a uma taxa de amostragem de 250 Hz, com um Leycom CFL-512 (CD Leycom).

Os dados são adquiridos durante o estado estacionário e durante a oclusão da veia cava temporária, todos com o ventilador desligado na expiração final. A análise dos ciclos de pressão-volume é realizada com software personalizado como previamente descrito19. Além disso, imagens ecográficas do epicárdio de eixo curto (Prosound SSD-5000, conda de 5 MHz UST-5280-5, Aloka Holding Europe AG, Zug, Suíça) são obtidas a nível muscular médio-papilar. A espessura da parede (WT) da área de enfarte, área remota (septo) e área interna do LV (LVia) são medidas em diástole (ED) e sístole finais (ES). 0 espessamento da parede sistólica (SWT) é calculado como [(WT(ES)-WT(ED))/WT(ED)]*100%, a área de encurtamento fracionai (FAS), como [(LVia(ES)-LVia(ED))/LVia(ED)]*100%, e a fração de ejeção ventricular esquerda (LVEF) como [ (EDV-ESV)/EDV]*100%. A rigidez da câmara diastólica final é quantificada por meio de regressão linear da relação pressão-volume diastólica final. A Ecocardiografia e os ciclos PV são medidos antes de MI, 1 hora após a isquemia e 4 horas após a reperfusão. Para desafiar o miocárdio aturdido, medições adicionais são executadas durante o stress farmaceuticamente induzido por infusão intravenosa de dobutamina (2,5 pg/kg/min e 5,0 pg/kg/min).

Exemplo 6. Materiais e Métodos: Dimensão de enfarte

Pouco antes da excisão do coração, os LCxCA (suínos) ou LCA (ratinhos) são religados, exatamente no mesmo local como para a indução do MI. Corante azul de Evans é infundido através do sistema coronário para delinear a área em risco (TAA) . 0 coração é então removido, o LV é isolado e cortado em 5 fatias de ápice à base. As fatias são incubadas em 1% de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC, Sigma-Aldrich Chemicals, Zwijndrecht, Páises-baixos) em tampão de Sorensen a 37 °C (13,6 g/L de KH2PC>4+17,8 g/L de Na2H Ρθ4·2Η2θ, pH 7,4) durante 15 minutos discriminar tecido de enfarte a partir de miocárdio viável.

Todas as fatias são digitalizadas a partir de ambos os lados, e em cada fatia, a área de enfarte é comparada com a área de risco e a área total pelo uso do software de planimetria digital (Imagem J) . Após correção para o peso das fatias, a dimensão do enfarte é calculada como uma percentagem da AAR e do LV.

Exemplo 7. Materiais e Métodos: Ensaio de morte celular induzida Oxidação

As células CEM leucémicas humanas são incubadas quer em CM ou não-CM, e tratadas com H2O2 a 50 μΜ para induzir o stress oxidativo. A viabilidade celular é avaliada através de exclusão com Azul de tripano at 12, 24, 36 e 48 horas após o tratamento com H2O2.

Exemplo 8. Materiais e Métodos: Imunocoloração O stress oxidativo nuclear na área de isquemia e reperfusão é avaliado por imunocoloração para 8-hidroxi-2'-desoxiguanosina (8-OHdG), um produto de stress oxidativo para o ADN. As amostras de tecidos foram fixadas em formalina a 4%, antes de serem embebidas em parafina.

Após a recuperação de antigénios, em ácido cítrico a 10 mM, as secções de tecido são incubadas com 10% de soro de cavalo normal durante 30 minutos, anti-ratinho-8-OHdG (OXIS internacional, Foster City, CA, EUA) a 1:20 em 0,1% de PBSA durante a noite a 4 °C, anti-rato de cavalo marcado com biotina (Vector Laboratories, Burlingame, CA, EUA) 1:500 durante 1 hora e com estreptavidina-HRPO 1:1000 durante 1 hora.

Finalmente, as secções são incubadas com H2O2-diaminobenzidina durante 10 minutos. A quantidade de núcleos positivos de 8-OHdG é quantificada em 4 campos escolhidos aleatoriamente por secção com Análise em software de microscopia de imagem digital (Olympus, Munster, Alemanha), com aumento de 200x.

Exemplo 9. Materiais e Métodos: Transferência Western A proteína é isolada a partir de amostras de tecido congeladas recolhidas da zona de isquemia/reperfusão de suínos utilizando 1 mL de Reagente de Isolamento TriPure (Boehringer, Mannheim, Alemanha) de acordo com o protocolo do fabricante. Para transferência Western, 8 pg de proteína total foi separado num gel de 10% SDS-PAGE, transferido para uma membrana de nitrocelulose C (Amersham, Buckinghamshire, Reino Unido) e bloqueada com tampão fosfato salino (PBS) -0,1% de Tween-5% Protifar ( Nutricia, Países-Baixos). A membrana é incubada com um anticorpo de coelho para phosphoSMAD2 1:1000 (Tecnologia de Sinalização Celular), para a caspase 3 ativa a 1:100 (Chemicon, Alemanha), ou para a beta-tubulina 1:5000 (Abeam, Cambridge, Reino Unido) e, posteriormente, com HRP de cabra anti-coelho 1:2000 (Dako, Glostrup, Dinamarca). Substrato de quimiluminescência (NENk Life Science Products) é utilizado para a deteção; as bandas são analisadas utilizando o sistema de Gel Doc 1000 (Biorad, Veenendaal, Países-Baixos) .

Exemplo 10. Materiais e Métodos: Fracionamento MSC-CM 0 MSC-CM é preparado por filtração estéril através de um filtro de 220 nm e concentrado através de um filtro de 10 nm e, por conseguinte, contém componentes entre 10 e 220 nm. Subsequentemente, uma fração de <1000 kDa é preparada por filtração do MSC-CM através de uma membrana com limite de PM de 1000 kDa com um tamanho de poros nominal de 100 nm (Pali Corporation, Singapura), gerando uma fração contendo produtos entre 10 e 100 nm.

Para identificar a fração que contém o(s) fator(es) dentro do meio que confere proteção cardíaca (10-100 nm ou 100-220 nm) , um modelo de ratinho ou suíno da isquemia e da lesão de reperfusão é usado. MI é induzido por 30 minutos com oclusão da artéria coronária esquerda (LCA) e reperfusão posterior. Os ratinhos são tratados com 20 pL de MSC-CM não fracionado (10-220 nm) , a fração <1000 kDa (10-100 nm), ou solução salina por via intravenosa através da veia da cauda, a 5 minutos antes da reperfusão. A dimensão do enfarte é avaliada 24 horas mais tarde usando azul de Evans e TTC como descrito anteriormente.

Exemplo 11. Materiais e Métodos: Análise de Dados

Os dados são apresentados como média ± SEM. Os valores são recolhidos de forma cega e comparados com ANOVA simples com testes Bonferroni post hoc em SPSS 11,5. O valor de p <0,05 foi considerado significativo.

Exemplo 12. Resultados: Mortalidade:

Quatro suínos morreram em decorrência de fibrilação ventricular refratária durante a isquemia, antes do tratamento, e, portanto, estão excluídos do estudo. Todos os suínos que são tratados com CM (n = 9), não-CM (n = 9) ou solução salina (n = 8) também sobreviveram ao período de seguimento.

Exemplo 13. Resultados: Dimensão do enfarte A dimensão do enfarte, em comparação com a área em risco (TAA), bem como em relação ao LV, é marcadamente reduzida nos suínos tratados com o MSC-MC quando comparada com aqueles tratados com não-CM e solução salina (Figura 1) . 0 tratamento MSC-CM resultou em aproximadamente 60% de redução do tamanho da dimensão do enfarte. É importante notar que o AAR é semelhante em todos os suínos, o que indica que a lesão isquémica inicial é semelhante em todos os suínos (Tabela El abaixo).

Unha de base Enfarte do miocárdic

Parâmetro Não-CM CM Soí.Saiina Não-CM CM Sol. Salina 35.1 ±2.9 30.7 ± 1.6 32.4 ± 2.3 IS (% de AAR) - - - 62.2 ± 5.0 25.4 + 4.8 f| 62.5 ± 8.4 IS {% de LV) - - - 22.3 ±2.9 7.6±1.4tt 20.5 ± 3.1 HR, bpm 83.5 ± 5.5 76.4 ± 5.7 77.6 ± 8.1 111.6± 6.3* 86 ± 7.51 97 + 5.5 MAP, mmHg 93.7 ± 10.2 94.0 + 5.4 100.9 + 4.9 70.8 ± 9.1 4 95.8 ± 4.31 68.5 ±7.3* QLCx, mi/min 31.9 ± 2.8 28.7 ± 2.9 28.4 ± 4.1 29.9 ± 2.6 25.1 ± 2.6 25.6 ± 3.3 CO,1/min 3.60 ± 0.14 3.25 ± 0.17 3.79 ± 0.23 2.61 ±0.35* 3.15 ± 0.27 % 2.04 ± 0.20 * WT enfarte, cm 0.71 ± 0.04 0.64 ± 0.04 0.71 ± 0.03 1.23 ±0.09* G.93 ± 0.09 *J 1.30 ±0.09* SWT enfarte, % 56.3 ± 5.6 56.9 ± 4.8 61.8 ±4.3 -6.1 ±1.4* 18.7 ± 4.1 -7.0 ±1.5* SWTremoto, % 43.1 ± 3.3 43.0 ± 3.0 40.9 ± 4.2 43.7 ± 7.4 41.4 ± 6.1 37.8 ± 4.4 FAS, % 42.7 ± 2.9 38.8 ± 2.9 41.3 ± 2.7 24.7 ± 2.6 * 36.5 ± 2.0 tí 21.7 ±1.2* EDV, ml 90.3 ± 8.2 66.2 ± 9.1 101.5 ± 7.1 70.2 ± 8.3 69.7 ± 5.2* 69.1 ± 11.6 ESV, ml 47.8 ± 8.2 43.9 ± 6.2 53.0 ± 4.7 44.2 ± 6.0 31.4± 1.4* 47.5 ± 9.6 SV, ml 44.5 ± 3.2 43.3 ± 5.0 49.6 ± 3.6 24.5 ±4.0* 38.5 ± 4.2 ft 21.9 ±2.7* EF, % 52.5 ±5.0 51.7 ±3.1 49.0 ± 2.7 38.8 ± 3.5 * 54.2 ± 2.6 ft 34.7 + 4.4* dP/dtmax, mmHg/s 1290 + 118 1093 + 83 1299 + 76 1592 + 226 1528 + 130 1075 + 68* dP/dtmin, mmHg/s -1614 ± 143 -1329 ± 113 -1650 + 89 -983 + 130 * -1031 + 116 * -910 ± 102 *

Rigidez mmHg/mi 0.13 + 0.03 0.15 + 0.03 0.14 + 0.01 0.29 + 0.06* 0.13 + 0.01 tí 0.29 + 0.05*

Tabela El. Parâmetros hemodinâmicos e funcionais Os valores de base e valores de enfarte do miocárdio de suínos tratados com não-CM, CM ou soro fisiológico, determinados com medições de pressão e volume de LV com base em cateteres de ecocardiografia e condutância. AAR indica área de risco; IS, a dimensão do enfarte; LV, o ventrículo esquerdo; HR, frequência cardíaca; QLCx, fluxo da artéria coronária circunflexa esquerda; CO, débito cardíaco; WT, a espessura da parede; SWT, espessamento da parede sistólica; FAS, encurtamento da área fracionária; EDV, volume diastólico final; ESV, volume sistólico final; SV, o volume sistólico; EF, fração de ejeção; Ees, elastância sistólica final. Não-CM, n = 9; CM, n = 9; solução salina, n = 8. * p <0,05 vs linha de base; t p <0,05 versus não-CM; Φ p <0,05 vs soro fisiológico.

Exemplo 14. Resultados: Função cardiaca

Os parâmetros basais são semelhantes em todos os grupos (Tabela El acima). Durante a isquemia, a parede póstero-lateral ficou completamente discinética em todos os grupos, como é observado pelos valores negativos de ecocardiograma, o espessamento sistólico de parede (SWT, Figura 2A). Quatro horas após a reperfusão, a parede reperfundida póstero-lateral dos grupos de controlo não-CM e de soro fisiológico, ainda está discinética. Nos suínos tratados com MCS-CM, no entanto, o SWT recuperou parcialmente (Figura 2A). A infusão intravenosa da dobutamina de agonista do recetor βι-adrenérgico aumentou ainda mais o espessamento sistólico nos suínos tratados com MCS-CM, embora não houvesse melhoria nos grupos de controlo. Também a função sistólica ventricular esquerda global diminuiu devido à isquemia (Figura 2B). Nos suínos tratados com CM, o encurtamento da área fracionai aumentou após a reperfusão, quase de volta ao nível de base, e aumentou acima do nível da linha de base durante a infusão de dobutamina.

Em suínos de controlo, a função sistólica global manteve-se prejudicada. Uma melhoria da função cardíaca, também se tornou evidente a partir dos índices derivados de ciclo PV (Tabela El) . EF ventricular esquerdo e volume de ataque cardíaco são significativamente mais elevados em suínos tratados com CM. Isso traduziu-se numa melhoria dos parâmetros hemodinâmicos, como o débito cardíaco, pressão arterial média e frequência cardíaca. A função diastólica diminuiu nos grupos de controlo após isquemia e lesão por reperfusão, como observado pelo aumento da rigidez miocárdica diastólica final. Nos suínos tratados com CM, a função diastólica no entanto não é prejudicada.

Exemplo 15. Resultados: Stress Oxidativo

Tendo demonstrado a redução da dimensão do enfarte e a melhoria da função, utilizou-se um ensaio in vitro de morte celular induzida por peróxido de hidrogénio (H2O2) para determinar os efeitos do CM e não-CM sobre o stress oxidativo, uma causa importante de isquemia e lesão de reperfusão.

Induziu-se stress oxidativo mediado por peróxido de hidrogénio (H2O2) em células leucémicas humanas CEM na presença quer de CM ou não-CM e monitorou-se a viabilidade celular por exclusão de azul de tripano. Os resultados mostraram que o CM protegia de modo significato contra perda induzida por (H2O2) induzida de viabilidade celular em comparação com não-CM (p <0,05) (Figura 3A).

Para determinar se o CM também reduz o stress oxidativo nos corações de suínos tratados com CM, o stress oxidativo nuclear em secções de tecidos de suínos tratados com CM, não-CM ou soro fisiológico é quantificado por imunocoloração com 8 OHdG de ADN oxidado. A coloração nuclear intensa indicativa de oxidação do ADN é observada em secções de suínos tratados com não-CM ou solução salina, em comparação com suínos tratados com CM (Figuras 3B-D). Além disso, há também significativamente mais núcleos positivos em suínos tratados com não-CM ou solução salina (Figura 3E).

Portanto, o CM pode conferir citoprotecção contra o stress oxidativo in vitro e in vivo.

Exemplo 16. Resultados: sinalização TGF-β

As secreções das MSCs continham muitas proteínas envolvidas na sinalização TGF-β16. Para avaliar a influência do tratamento com CM sobre sinalização TGF-β in vivo, quantificámos SMAD-2 fosforilada nas amostras de tecido do miocárdio de suínos tratados com CM e suínos de controlo por Western Blot. 0 tratamento com CM resultou em expressão reduzida de pSMAD2, indicando que o a sinalização TGF-β através de ALK-5 é reduzida (Figuras 4A, B).

Exemplo 17. Resultados: Apoptose A lesão por reperfusão provoca a morte celular por apoptose, em vez de necrose2o-22. Para verificar que o tratamento com CM reduz a apoptose durante reperfusão, foi quantificado o nível de caspase 3 ativa, um mediador chave de apoptose, por western blotting. Nos suínos tratados com MSC-CM, os níveis ativos de caspase-3 são mais baixos em comparação com o controlo não-CM e controlo de solução salina sugerindo que o CM inibe a apoptose in vivo (Figuras 4C, D) .

Exemplo 18. Resultados: Fracionamento MSC-CM 0 MSC-CM não fracionado contém produtos entre 10 e 220 nm. A fim de chegar mais perto de identificar o(s) fator(es) cardioprotetor(es) dentro do MSC-CM, uma fração <1000 kDa é gerada contendo produtos no intervalo de dimensão de 10-100 nm. O MSC-CM não fracionado confere proteção cardíaca, enquanto que a fração <1000 kDa não (Figura 5) , indicando que o(s) fator(es) cardioprotetor(es) estão na fração >1000 kDa com dimensão de 100 a 220 nm.

Exemplo 19. Resultados: O Fracionamento do tamanho não segregou as proteínas secretadas de acordo com pesos moleculares

Para identificar o componente ativo no Meio Condicionado, buscou-se fracionar o tamanho do meio condicionado em frações de PM distinto, filtrando o meio condicionado através de membranas com diferentes limites de PM.

Quando o meio condicionado é filtrada através de uma membrana com limite de PM de 100 kDa para gerar um retentado para filtrar uma razão em volume de 4:1, a maioria das proteínas <100 kD segregadas na fração >100 kD, e não para dentro da fração esperada <100 kD (Figura 6). A razão entre as bandas de proteína individuais, tanto em meio condicionado não fracionado como na fração >100 kD são semelhantes. A maioria das proteínas com PM <300 kD também não filtrou através da membrana com um limite de PM de 300 kDa (Figura 6) . Os tamanhos de PM de algumas das principais bandas de proteínas no filtrado são semelhantes aos que se encontram no meio não condicionado (NMC) , e aos de suplementos de proteínas adicionados exogenamente no meio de cultura: suplemento insulina-transferrina-selenoproteína (ITS), FGF2, EGF e PDGF AB (Figura 7).

Em conjunto, estas observações sugerem que as proteínas segregadas pelas células estão em complexos, e estes complexos de secreção são maiores do que as proteínas de 100 kD que são adicionadas exogenamente ao meio de cultura como suplementos, e que são menos do que 100 kD são rapidamente filtradas através de membranas com limite de PM de 100 kD.

Exemplo 20. Resultados: Atividade Biológica em meio condicionado com fracionamento de tamanho com PM de >1.000kD ou diâmetro de 50-150 nm

Para determinar os limites superior e inferior do complexo de secreção putativa, foi realizado fracionamento por tamanhos do meio condicionado e testou-se a atividade biológica num ratinho com lesão por isquemia-reperfusão. À medida que o meio condicionado é filtrado através de filtro de 0,2 μΜ e concentrado contra uma membrana com um limite de PM de 10 kD, tal efetivamente colocou o complexo de secreção putativa na gama de tamanhos entre 2 a 200 nm (Figura 8).

Para limitar ainda mais este intervalo de tamanhos, determinámos se há atividade biológica no filtrado a partir da filtração do meio condicionado completamente através da membrana com um limite de PM de 100 kD ou 1000 kD, o retentado a partir de filtração do meio condicionado através de uma membrana com limite PM de 1.000 kD. O volume de retentado é 1/5 do volume de entrada. As frações são testadas num modelo de ratinho ou de suíno de isquemia do miocárdio (MI) e lesão de reperfusão.

Neste modelo, a MI é induzida em 30 minutos por oclusão da artéria coronária esquerda (LCA) por sutura de ligação e a reperfusão é iniciada pela remoção da sutura. Os ratinhos são tratados com 20 pL de MSC-CM não fracionado (10-220 nm) , 20 pL de fração <100 ou 1.000 kD, 4 pL de retentado > 1000 kD ou soro fisiológico intravenosamente na veia da cauda, 5 minutos antes da reperfusão. 24 horas mais tarde, os corações são excisados. Antes da excisão, a área de risco (AAR) é determinada por religação da LCA e, em seguida, irrigando Evans azul através da aorta. A AAR é definida como a área não corada pelo corante e é expressa como uma percentagem da área da parede do ventrículo esquerdo. A dimensão do enfarte é avaliada 24 horas mais tarde usando azul de Evans e TTC como descrito anteriormente. A AAR relativa em todos os animais não é significativamente diferente (Figura 9) . No entanto, a dimensão relativa do enfarte é significativamente reduzida nos animais tratados com o meio condicionado e a fração >1000 kD quando em comparação com solução salina (p = 0,01 e 0,05, respetivamente) (Figura 10) . As frações <100 e <1.000 kD não são biologicamente ativas, o que sugere que o complexo ativo putativo é >1000 kD. É, no entanto, ainda possível que o complexo seja <1000 kD, e que a passagem do meio condicionado através dos filtros inative o complexo.

Exemplo 21. Resultados: Microscopia eletrónica de meio condicionado revelou a presença de partículas de 50 a 200 nm A análise por microscopia de eletrões do meio condicionado é realizada usando metodologia padrão. Resumidamente, o meio condicionado em PBS é carregado em redes revestidas de carbono formwar (Ted Pella Inc, Redding, CA, EUA n° cat 01800N-F), fixado em glutaraldeído a 2,5%, lavado, contrastado em acetato de uranilo a 2%, incorporado numa mistura de acetato de uranilo (0,8%) e celulose de metilo (0,13%) e examinado sob um microscópio de eletrões. Consistente com os estudos de fracionamento de tamanho acima, observou-se a presença de numerosas vesículas de ~50- 150 nm, o que sugere que estas vesículas são os complexos ativos putativos na secreção (Figura 11). A hipótese é suportada pela observação de que, quando o meio condicionado é ultracentrifugado a 200,000xg durante uma hora, o pelete quando ensaiadas por LC/LC-MS, como anteriormente descrito20 continha pelo menos 70% das proteínas encontradas na secreção.

Exemplo 22. Resultados: composição lipídica de meio condicionado

Para analisar a composição lipídica do meio condicionado, os componentes lipídicos/esteroides hidrofóbicos de meio condicionado e NCM são extraídos através de um procedimento de Folch. Resumidamente, 50 mL de meio condicionado ou NCM é vigorosamente misturado com 5 mL de clorofórmio e 2 mL de metanol. As fases orgânica e aquosa são deixadas a separar. A camada inferior de clorofórmio é removida e evaporada até à secura por speedvac. 0 resíduo é reconstituído em metanol para análise por LC-MS/MS. A amostra é em seguida injetada a uma coluna de fase normal (sílica de fase) de HPLC com fase móvel de diclorometano/metanol/água/etilamina. 0 fluido é então ionizado em linha por nanopulverização a LTQ-FTMS/Orbitrap. 0 LTQ-FTMS/Orbitrap é executado em modos positivos e negativos alternados para a deteção de lípido/esteroide com propriedades químicas diferentes. Os 5 principais iões precursores de cada varredura MS são ainda analisados por varrimento MS/MS.

As moléculas são, por conseguinte, caracterizadas por uma combinação de FTMS e LTQ. A massa precursora de cada espetro de massa em tandem é a primeira correspondente a um candidato numa base de dados lipídico e metabólico. Espetros MS/MS de iões que têm um erro de massa <5 pmm para qualquer molécula na base de dados são então comparados com espetros padrão conhecidos ou previstos pelo programa de massa Frontier.

Análise de espetrometria massa de extrato de clorofórmio a partir do meio condicionado, revelou a presença de lípidos vulgarmente encontrados na membrana plasmática, a saber, fosfolípidos, glicolípidos, e esteroides, e também em exossomas35. Os fosfolípidos incluem a fosfatidil-serina e fosfatidil-inositol, a fosfatidil-colina, esfingomielina, ceramidas; glicolípidos como cerebrosídeo e esteroides, tais como colesterol.

Tem sido observado que os exossomas têm microdomínios conhecidos como secções lipídicas nas suas membranas lipídicas22' 24~35 41,42. Os exossomas são ricos em colesterol e, geralmente, a sua proporção de colesterol-fosfolípido excede a proporção de 0,3-0,4 (mol/mol) encontrada na membrana do plasma35. Essas secções são caracterizadas pela sua resistência à dissolução por detergentes não-iónicos, tais como Triton X-100 ou Brij-98 a baixas temperaturas, e a sua sensibilidade a ciclodextrina que se liga ao colesterol. Geralmente insolúvel em detergentes tais como Triton X-100 e a insolubilidade detergente é muitas vezes usada para identificar a presença de secções lipídicas.

Quando o meio condicionado é tratado com Triton X-100, as proteínas secretadas continuaram a segregar como um complexo independente das suas experiências de fracionamento de tamanho utilizando filtração por membrana (Figura 12), sugerindo que o complexo putativo é resistente à dissolução por triton X -100, consistente com a presença de secções lipídicas43.

Determina-se se o complexo é sensível à dissolução na presença de 20 mM de ciclodextrina. Se o complexo putativo tiver secções lipídicas na membrana, a extração de colesterol por ciclodextrina causa dissolução e liberta as proteínas que podem então ser fracionadas de acordo com o tamanho para os seus tamanhos moleculares. A composição quantitativa relativa de lípidos no complexo putativo é estimada usando técnicas cromatográficas e de espetrometria de massa como anteriormente descrito35. Isto determina se a composição lipídica pode suportar a presença de secções lipídicas.

Exemplo 23. Resultados: composição de ARN do meio condicionado

Extração por Trizol do meio condicionado, seguida por precipitação com isopropanol como é geralmente usado na extração de ARN a partir de células produz um pelete que, em água, tem uma razão de absorvância de 260:280 nm de 1,9, sugerindo que pode ser ARN.

Isto é consistente com um relatório anterior em que os exossomas contém ARNms e microARNs36. Este pelete é ensaiado quanto à sensibilidade à actividade da RNase. O meio condicionado também será tratado com RNases antes da extração com Trizol. Estes ensaios determinam se o pelete é ARN é, e se o ARN é sequestrado em vesículas lipidicas tais como os exossomas.

Se assim for, o ARN é testado por ensaios de expressão de gene genéricos tais como micro-matriz, sequenciação, RT-PCR e em ensaios de tradução in vitro para determinar a composição e as funções de ARN. Os ARNs são traduzidos in vitro utilizando o sistema de lisado de reticulócitos de padrão comercialmente disponível com e sem 15N-leucina. Os produtos proteicos traduzidos são identificados por espetrometria de massa.

Exemplo 24. Resultados: Perfil Proteómico

Das -700 proteínas descritas como estando presentes na secreção (Pedido de Patente Provisório nos EUA n° 60/878,222 e Pedido Internacional PCT/SG2006/000232. Mesenchymal Stem Cell Conditioned Medium), há muitas proteínas que demonstram estar comummente presentes no proteoma de outros exossomas (Figura 13) 44. Há também muitas proteínas na lista de -700 proteínas que não foram descritas como estando presentes em exossomas. Alguns exemplos notáveis, mas não exaustivos são Thyl, Wnt 5a, Wnt 5b, inibina A (ou activina A).

Exemplo 25. Resultados: Perfil de antigénio de superfície 0 perfil proteómico do meio condicionado também descreve a presença de proteínas que são conhecidas por ser ligadas à membrana. Alguns exemplos notáveis, mas não exaustivos incluem CD9, CD109, thy-120. Outro antigénio de superfície de exossoma conhecido tal como CD24 que se encontra na superfície de exossomas secretados na urina45 não é expresso em MSCs19 ou na sua secreção20.

Além disso, muitos desses antigénios de superfície são expressos de uma forma específica do tipo de célula. Juntas, essas observações sugerem que o perfil de antigénio de superfície irá definir e distinguir exossomas de fonte de células diferentes. Para caracterizar o perfil de antigénio de superfície deste complexo de secreção putativa, o meio condicionado é biotinilado utilizando os kits de biotinilação padrão disponíveis comercialmente. As proteínas são separadas em SDS-PAGE padrão, transferidas em nylon ou nitrocelulose, e sondadas com avidina-peroxidase, utilizando protocolos padrão em análises de Western blot. Neste protocolo, apenas as proteínas que estão nas superfícies sobre os complexos e são fisicamente acessíveis à biotina são biotiniladas. Todas as proteínas que estão dentro do complexo e, portanto não são fisicamente acessíveis são biotiniladas. As proteínas biotiniladas são também isoladas utilizando cromatografia de afinidade de avidina e identificadas utilizando LC/MS. A identidade destas proteínas é confirmada por análise de Western biot, imunomicroscopia eletrónica e expressão do gene de MSCs.

Exemplo 26. Exossomas

Com base nas observações acima, colocamos a hipótese de que a menor unidade cardioprotetora ativa no meio condicionado ser um exossoma.

Para provar esta hipótese, concentramos o meio condicionado utilizando a tecnologia de filtração por membranas com membrana de limite de PM de 100 kD. O meio condicionado concentrado é então utlracentrifugado a~150-200.000 g durante 1-2 horas. O pelete é ressuspenso em PBS, e analisado por microscopia eletrónica para confirmar a presença de partículas com uma gama de tamanhos de 50-150 nm, e ensaiado quanto aos teores de proteína, lípidos e de ARN. A suspensão é ensaiada quanto às atividades biológicas que são computacionalmente previstas para o Meio condicionado20, e é testada quanto a efeitos cardioprotetores nos modelos de ratinho e de suíno tal como descrito acima ou abaixo, respetivamente.

Exemplo 27. Configuração do Estudo para o estudo de suínos

Trinta fêmeas de suínos Landrace Dalland (60-70 kg; IDDLO, Lelystad, Países-Baixos), todas pré-tratadas com clopidogrel 75 mg/dia durante 3 dias e amiodarona 400 mg/dia durante 10 dias, são distribuídas aleatoriamente para tratamento com MSC-CM, não-CM, ou solução salina. O grupo de solução salina é adicionado para avaliar um potencial efeito de meio não condicionado de cultura fresco. Em todos os suínos, MI é induzido por 75 minutos de ligação à artéria coronária esquerda proximal (LCxCA) e 4 horas de reperfusão subsequente. Um período de isquemia de 75 minutos é selecionado para infligir lesão miocárdica grave, sem indução de enfarte do miocárdio completamente transmural. 0 período de reperfusão de 4 horas é usado, porque a medição da dimensão do enfarte utilizando a coloração TTC é mais fiável após 3 horas de reperfusion46.

Após períodos mais longos de reperfusão, torna-se mais difícil avaliar o estado de stress oxidativo e mecanismos apoptóticos. 0 tratamento é iniciado 5 minutos antes do início da reperfusão por infusão intravenosa de MSC-CM (1,0 mL, 2,0 mg de proteína) não-CM ou solução salina. Imediatamente após a reperfusão, um bolus intracoronário adicional (4,0 mL, 8,0 mg de proteína), não-CM ou solução salina é dado. A dimensão do enfarte do miocárdio e função são avaliados 4 horas após a reperfusão.

Para identificar o(s) fator(es) dentro do meio que confere(m) proteção cardíaca, um modelo de ratinho ou suíno da isquemia e da lesão de reperfusão é usado. MI é induzido por 30 minutos com oclusão da artéria coronária esquerda (LCA) e reperfusão posterior. Os ratinhos são tratados com meio condicionado não-fracionado, fração <1000 kD, fração 500 kD, fração <300 kD, fração < 100 kD ou soro fisiológico intravenosamente na veia da cauda, 5 minutos antes da reperfusão. A dimensão do enfrate é avaliada no dia seguinte (24 horas após a reperfusão).

Exemplo 28. MI e Procedimentos Operacionais

Durante toda a operação, ECG, a Pressão Arterial Sistémica, e capnografia são monitorizados continuamente. Sob anestesia geral, como descrito anteriormente47, uma esternotomia mediana é realizada e duas folhas de introdução são inseridas nas artérias carótidas para um cateter guia 6 Fr e um cateter de condutância 8 Fr (CD Leycom, Zoetermeer, Países-Baixos). A ponta distai de um cateter de Swan Ganz é colocada na artéria pulmonar através da veia jugular interna. Sondas de fluxo transsónicas (Transonic Systems Inc, Ithaca, NY) são colocadas em torno da aorta proximal e LCxCA para medir o débito cardíaco e fluxo coronariano, e um fio é colocado ao redor da veia cava inferior para permitir medidas funcionais em diferentes condições de carga para ciclos PV. Após medidas funcionais, 10.000 UI de heparina são administrados por via intravenosa e as suturas são apertadas para ocluir o LCxCA proximal. Desfibrilação interna com 50 J é usada quando ocorre a fibrilação ventricular. Após 75 minutos de isquemia, o LCxCA é reaberto pela libertação da sutura. Imediatamente após a reperfusão, nitroglicerina (0,1 mg para evitar nenhum refluxo) é infundida através da LCxCA através do cateter de guia, seguido por tratamento de intracoronária com MSC-CM, não-CM ou solução salina. Após 4 horas de reperfusão, as medidas funcionais finais são realizadas e o coração é explantado para análise da dimensão do enfarte.

Os ratinhos são anestesiados com fentanil (0,05 mg/kg), Dormicum (5 mg/kg) e Domitor (0,5 mg/kg) e entubados utilizando um cateter intravenoso de calibre 24 com uma extremidade romba. Os ratinhos são ventilados artificialmente a uma taxa de 105 rotações/min utilizando um ventilador de roedor com uma mistura de O2 e N2O (1:2 vol/vol) à qual isoflurano (2,5-3,0% vol/vol) foi adicionado. O ratinho é colocado sobre uma almofada de aquecimento para manter a temperatura corporal a 37 °C. O peito é aberto no terceiro espaço intercostal e uma sutura prolene 8-0 é utilizada para ocluir a artéria coronária esquerda (LCA) durante 30 minutos. O peito é fechado e o dia seguinte (24 horas mais tarde), os corações são explantados para análise da dimensão do enfarte.

Exemplo 29. Medidas Funcionais O ECG, pressão arterial e débito cardíaco, são digitalizados com uma taxa de amostragem de 250 Hz e armazenados para análise off-line (Leycom CFL-512, CD Leycom). A pressão e volume do ventrículo esquerdo (LV) são medidos usando o método de cateter de condutância, como descrito anteriormente47. Sinais de pressão e volume do LV derivados do cateter de condutância são exibidos e adquiridos a uma taxa de amostragem de 250 Hz, com um Leycom CFL-512 (CD Leycom).

Os dados são adquiridos durante o estado estacionário e durante a oclusão da veia cava temporária, todos com o ventilador desligado na expiração final. A análise dos ciclos de pressão-volume é realizada com software personalizado como previamente descrito48. Além disso, imagens ecográficas do epicárdio de eixo curto (Prosound SSD-5000, conda de 5 MHz UST-5280-5, Aloka Holding Europe AG, Zug, Suíça) são obtidas a nível muscular médio-papilar. A espessura da parede (WT) da área de enfarte, área remota (septo) e área interna do LV (LVia) são medidas em diástole (ED) e sístole finais (ES). O espessamento da parede sistólica (SWT) é calculado como [(WT(ES)-WT(ED))/WT(ED)]*100%, a área de encurtamento fracionai (FAS), como [(LVia(ES)-LVia(ED))/LVia(ED)]*100%, e a fração de ejeção ventricular esquerda (LVEF) como [(EDV-ESV)/EDV]*100%. A rigidez da câmara diastólica final é quantificada por meio de regressão linear da relação pressão-volume diastólica final. A Ecocardiografia e os ciclos PV são medidos antes de MI, 1 hora após a isquemia e 4 horas após a reperfusão. Para desafiar o miocárdio aturdido, medições adicionais são executadas durante o stress farmaceuticamente induzido por infusão intravenosa de dobutamina (2,5 yg/kg/min e 5,0 yg/kg/min).

Exemplo 30. Dimensão de enfarte

Pouco antes da excisão do coração, os LCxCA (suinos) ou LCA (ratinhos) são religados, exatamente no mesmo local como para a indução do MI. Corante azul de Evans é infundido através do sistema coronário para delinear a área em risco (TAA). 0 coração é então removido, o LV é isolado e cortado em 5 fatias de ápice à base.

As fatias são incubadas em 1% de cloreto de trifeniltetrazólio (TTC, Sigma-Aldrich Chemicals,

Zwijndrecht, Páises-baixos) em tampão de Sorensen a 37 °C (13,6 g/L de KH2P04 + 17,8 g/L de Na2H Ρ04·2Η20, pH 7,4) durante 15 minutos discriminar tecido de enfarte a partir de miocárdio viável.

Exemplo Comparativo 31. Materiais e Métodos: Preparação do meio condicionado

As células HuES9.El são cultivadas como descrito anteriormente (Lian et al, 2007; Sze et al, 2007) .

Resumidamente, 80% de culturas de células confluentes HuES9.El são lavadas três vezes com PBS e cultivadas durante a noite num meio quimicamente definido, que consiste de meio DMEM sem vermelho de fenol (número de catálogo 31053, Invitrogen) e suplementadas com insulina, transferrina, e selenoproteína (ITS) (Invitrogen), 5 ng/mL de FGF2 (Invitrogen), 5 ng/mL de PDGF AB (Peprotech, Rocky Hill, NJ), glutamina-penicilina-estreptomicina, e b-mercaptoetanol. As culturas são então lavadas três vezes com PBS, e depois meio fresco definido é adicionado.

Passados 3 dias, o meio é colhido, centrifugado a 500xg e concentrado. A amostra de >100 kDa CM é preparada por concentração de CM 50x usando uma filtração de força tangencial (TFF) com 100 kDa de MWCO. Todas as outras concentrações são realizadas utilizando membrana de ultrafiltração. Todos os CMs e outros CMs diferentes processados são filtrados através de 0,2 micrómetros após todos os procedimentos e antes de serem armazenados ou utilizados.

Exemplo 32. Materiais e Métodos: Análise de LC MS/MS

As proteínas em dois mL de dialisado condicionado (CM) ou meio não condicionado (NCM) são reduzidas, alquiladas, e digeridas tripticamente tal como descrito previamente (Sze et al., 2007) . As amostras são então dessalinizadas por passagem da mistura digerida através de um cartucho Sep-Pak C-18 SPE condicionado (Waters, Milford, MA, EUA), lavou-se duas vezes com acetonitrilo a 3% (ACN) (JT Baker, Phillipsburg, NJ) e tampão de ácido fórmico (FA) a 0,1%, e eluiu-se com ACN a 70% e tampão de FA a 0,1%. As amostras eluidas são então secas até cerca de 10% dos seus volumes iniciais por remoção do solvente orgânico numa centrífuga de vácuo.

Para reduzir a complexidade da amostra, fracionamento offline de péptidos é realizado com um sistema de HPLC (Shimadzu, Japão) por meio de uma coluna SCX de

Polissulfoetilo (200 mmx 4,6 mm) (PolyLC, EUA) . A fase móvel A (5 mM de KH4P04 + 30% de acetonitrilo) e a fase móvel B (5 mM de KH4P04 + 30% acetonitrilo + 350 mM de KC1) a 1 mL/min. Oito frações são recolhidas e secas com uma centrífuga de vácuo. As amostras fracionadas são carregadas no amostrador automático de um sistema de HPLC de fase reversa Shimadzu DGU-20A3 C18 acoplado em linha a um espetrómetro de massa de armadilha de iões ultra linear LTQ-FT (Thermo Electron, San José, CA) equipado com uma fonte de nano-pulverização. Peptídeos injetados estão presos numa coluna enriquecida com Zorvax 300SB-C18 (5 mmx03mm, Agilent Technologies, Alemanha) e eluídos numa coluna C18 embalada nano-furada (75 ym x 100Á, Michrom

Bioresources, Auburn, CA) .

Um gradiente de 90 minutos a um caudal 200 nL/min é usado para eluir os péptidos no espetrómetro de massa. O LTQ é operado de um modo dependente de dados através da realização de exames de MS/MS para os 8 dos picos mais intensos de cada varrimento MS no FTMS. Para cada experimento, espetros MS/MS (dta) das oito frações SCX são combinados num único arquivo genérico Mascot por um programa doméstico de escrita. Identificação de proteínas é conseguida através de pesquisa dos dados combinados contra a base de dados de proteína humana IPI (versão 3.34; 67758 sequências) através de um servidor Mascot doméstico (Versão 2.2, Matrix Science, Reino Unido). Os parâmetros de busca são: um máximo de 2 perdeu clivagens utilizando tripsina; modificação fixa é carbaminometilação de cisteina e modificações das variáveis é a oxidação da metionina. As tolerâncias de massa estão definidas para 20 ppm e 0,8 Da para precursor de peptideo e iões de fragmento respetivamente. Identificações de proteína são aceites como verdadeiros positivos se dois peptídeos diferentes demonstrarem estar com classificações superiores às pontuações de homologia.

Exemplo 33. Materiais e Métodos: Fracionamento de HPLC e dispersão de luz dinâmica usando um Detetor quasi-elástico de dispersão de luz (QELS) A configuração do instrumento consistia de um sistema de cromatografia líquida com uma bomba binária, um injetor automático, um forno de coluna termostatizada e um detetor de UV-visível operado pelo software de Class VP da Shimadzu Corporation (Kyoto, Japão). As colunas de cromatografia utilizadas são Guard TSK SWXL, 6 x 40 mm e TSK gel G4000 SWXL, 7,8 x 300 mm da Tosoh Corporation (Tóquio, Japão). Os seguintes detetores, Dawn 8 (dispersão de luz), Optilab (índice de refração) e QELS (dispersão de luz dinâmica) estão ligados em série a seguir ao detetor de UV-visível. Os três últimos detetores são da Wyatt Technology Corporation (Califórnia, EUA) e são operados pelo software ASTRA.

Os componentes da amostra são separados por exclusão de tamanho ou seja, as moléculas de maiores dimensões irão eluir antes das moléculas mais pequenas. O tampão eluente utilizado é o tampão fosfato 20 mM com 150 mM de NaCl a pH 7,2. Este tampão é filtrado através de um tamanho de poro de 0,1 pm e desgaseifiçado durante 15 minutos antes da utilização. O sistema de cromatografia é equilibrado a um caudal de 0,5 mL/min até que o sinal em Dawn 8 estabilize em cerca de 0,3 unidades de detetores de tensão. O detetor de UV-visivel é fixado em 220 nm e a coluna é equilibrada no forno para 25 °C. O modo de eluição é isocrático e o tempo de execução é de 40 minutos. O volume da amostra injetada foi de 50 a 100 μΐ. A % de área de pico de exossoma vs todos os outros picos é integrada a partir do detetor de UV-visivel. O raio hidrodinâmico Rh é calculado pelos detetores QELS e Dawn 8. A mais elevada taxa de contagem (Hz) no máximo do pico é tomado como o Rh.

Os picos dos componentes separados visualizadas em 220 nm, são recolhidos em frações para outros estudos de caracterização.

Exemplo 34. Materiais e Métodos: Centrifugação de equilíbrio de densidade de gradiente de sacarose [0297] Para a centrifugação de equilíbrio de densidade de gradiente de sacarose, 14 soluções de sacarose com concentrações de 22,8-60% (p/v) são preparadas. A solução mais concentrada é mergulhada na parte inferior do tubo de ultracentrífuga SW60TÍ (Beckman Coulter, Inc., Fullerton CA, EUA), seguindo-se a seguinte concentração mais elevada de sacarose. O CM é cuidadosamente colocado em cima antes de ultracentrifugado durante 16,5 horas a 200.000X g, 4 °C num rotor SW60TÍ (Beckman Coulter, Inc.). Recolhem-se 16 frações de cima para a parte inferior do gradiente de sacarose. As densidades de todas as frações de sacarose são calculadas usando uma microbalança, e consolidadas para 13 frações. Para alguns CMs, o CM é pré-tratado com um tampão de lise celular (Cell Extraction Buffer, Biovision, www.BioVision.com) antes de ser carregado na centrifugação de equilíbrio de densidade de gradiente de sacarose. 0 tampão de lise é adicionado ao CM numa proporção de 1:1 em volume com um cocktail de inibidores de protease (Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-free, Thermo Scientific, www.thermofisher.com) . A mistura é incubada durante 30 min à temperatura ambiente com agitação suave.

Exemplo 35. Materiais e Métodos: Quantificação de proteinas A concentração de proteínas do CM é quantificada utilizando o kit de Quantificação de Proteína NanoOrange (Invitrogen) de acordo com as instruções do fabricante.

Exemplo 36. Materiais e Métodos: Análise SDS-PAGE e Western Blot

As proteínas totais do CM são separadas em géis de poliacrilamida, antes de serem transferidas para uma membrana de nitrocelulose (Amersham Biosciences, Uppsala, Suécia). A membrana é bloqueada, incubada com anticorpos de ratinho contra CD9, CD81, SOD-1 humanas, piruvato-cinase, Alix, TSP-1 seguido por anticorpos secundários de acoplados a peroxidase de rábano contra o anticorpo de ratinho primário. A membrana é então incubada com um substrato de HRP quimioluminescente para detetar o anticorpo primário ligado, e, portanto, a presença do antigénio.

Exemplo 37. Materiais e Métodos: Ensaio de esfingomielina, fosfatidilcolina e colesterol

Concentrações de colesterol, fosfatidilcolina e esfingomielina em duas preparações independentes de CM e peletes a partir de ultracentrifugação de CM a 100.000 xg durante 2 horas a 4 °C são medidos utilizando kits de ensaio disponíveis comercialmente. 0 colesterol é medido utilizando um kit de Ensaio de Colesterol Amplex® Red (Molecular Probes, USA), esfingomielina pelo Kit Sphingomyelin Assay (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, EUA) e fosfatidilcolina é medida utilizando ο Phosphatidylcholine Assay Kit (Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, EUA).

Exemplo 38. Materiais e Métodos: Tripsinização limitada do meio condicionado 0 CM é tratado com/sem triton X ou tampão de lise durante 30 min a 4 °C com agitação suave. A digestão proteolítica é deixada a realizar-se por adição de tripsina ao CM tratado durante 3 segundos a 20 minutos à temperatura ambiente com agitação suave. A digestão é parada utilizando um inibidor de tripsina, PMSF.

Exemplo 39. Materiais e Métodos: Análise de micro-matriz de miARN

Duas réplicas biológicas de ARN celular total a partir de MSCs e duas réplicas biológicas de ARN secretado a partir de CM são analisadas por micro-matriz de miARN. A hibridação e análise de dados é delegada a Sciences, LLC (www.LCsciences. com) . O chip continha sondas para transcrições de miARN listadas na Sanger miRBase Release 10.1 (http:// www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/).

Exemplo 40. Resultados: A secreção cardioprotetora contém proteinas associadas ao exossoma que formam complexos Multiproteicos

Para identificar o componente ativo, nós já fracionámos o CM por ultrafiltração através de membranas com MWCO diferente. Mostra-se que, quando o CM é filtrado através de uma membrana com MWCO de 1000 kDa, o filtrado não é protetor. No entanto, o CM que é concentrada em -125 vezes contra uma membrana semelhante é cardioprotetor num modelo de ratinho de lesão por isquemia/reperfusão. Em resumo, a filtração através de filtros com um MWCO menor do que 0,2 pm, tal como lOOkDa, 300kDa, 500 kDa ou lOOOkDa não são cardioprotetores (Figura 14), mas o CM que é concentrado contra uma membrana de 1000 kDa (Timmers et al. , 2008) ou uma membrana de 100 kDa é cardioprotetor (Figura 14). Estas observações sugerem então que a fração ativa consistia de grandes complexos de > 1000 kDa ou tendo um diâmetro de 50-100 nm. Com base na gama de tamanho das partículas, postulamos que as partículas no CM são exossomas. Os exossomas são formados a partir de organismos multi-vesiculares (Fevrier e Raposo, 2004;. Keller et al, 2006) com uma membrana bilipídica que tem a mesma orientação que a membrana plasmática. Eles são conhecidos por ser produzidos por diversos tipos de células e pensa-se serem importantes na comunicação intercelular. Os exossomas têm diâmetros de 40-100 nm. Os exossomas demonstraram ser segregados por muitos tipos de células e a composição de proteína destes exossomas parecia ser específica da célula. No entanto, algumas proteínas, tais como CD9, piruvato-cinase e alix parecem ser vulgarmente expressas nos exossomas (Sze et al., 2007). Nós já identificámos cerca de 201 proteínas na secreção (Sze et al., 2007) .

Aqui alargámos a lista para 793 proteínas (Tabela E2) fazendo modificações à nossa metodologia previamente descrita na nossa análise proteómica, conforme detalhado nos Materiais e Métodos. Os 793 continham muitas das proteínas associadas a exossomas, tais como CD9, CD81, Alix, TSP-1, a SOD-1 e piruvato cinase (Olver e Vidal, 2007). Foi confirmada a presença destas proteínas na secreção por análise de Western blot (Linhal, Figura 15). A co-imunoprecipitação de CD81, CD9 e Alix suportou a sua associação com um exossoma e a presença de exossoma na secreção. TSP-1, a SOD-1 e piruvato cinase não co-imunoprecipitaram com CD81, o que sugere que estas proteínas não estão presentes em exossomas CD81+ ou não presentes sequer em exossomas. (Figura 15).

Tabela E2. Perfil proteómico de CM, tal como determinado por LC MS/MS e matrizes de anticorpo. Foram analisadas quatro amostras independentes. Cada proteína na tabela foi detetada em, pelo menos, 3 de 4 amostras.

Das proteínas acima na tabela E2, TIMP1, TIMP2, TNFRSF11B, LGALS3, ALCAM, DCN, SFRP1, GDF15, PDGFC, PTX3, LTBP1, IGFBP2, GREM1, IGFBP7, MIF, MMP1, PLAU, INHBA e THBS1 foram identificadas por LC MS/MS e matriz de anticorpo. PPIA, HIST1H4, PPIB, HIST1H4A, HIST1H4B, HIST1H4C, HIST1H4D, HIST1H4E, HIST1H4F, HIST1H4H, HIST1H4I, HIST1H4J, HIST1H4K, HIST1H4L, HIST2H2AA3, HIST2H2AA4, HIST2H4A, HIST2H4B, HIST4H4, HLA-A, HLA-B, SDCBP, TUBA1A , TUBA6, TUBA8, GAPDH, TUBB, TUBB2C, TUBB3, TUBB4, TUBB6, TUBB8, HSP90AB1, ANXA1, HSP90B1, ANXA2, ANXA5, ANXA6, PDCD6IP, CD 9, CFL1, CLTC, EN01, PKM2, MSN, e YWHAG são identificadas por LC MS/MS e pelo menos 4 estudos sobre exossomas secretados pelas células em cultura. FGF16, FGFRL1, TNFRSF12A, TNFSF12, CXCL1, CCL18, CXCL12, CCL2, CXCL16, CCL7, CXCL2, CCN4, CXCL9, CCR4, CCR5, ANGPT4, GDF1, GDF11, SFRP4, GDF3, GDF5, GDF8, DKK1, LTA, PDGFA, LTB, MADH4, IFNG..., GPC5, IGF2R, CHRDL1, GRN, VEGFC, IL13, IL 15, EML2, IL15RA, IL1RAP, MMP10, IL2, GZMA, IL21R, IL3, IL6, IL6ST, IL8, HGF e THBS são identificadas por matriz de anticorpo. As proteínas restantes são identificadas por LC MS/MS.

Exemplo 41. Resultados: As proteínas associadas ao exossoma são localizadas em vesículas de fosfolipidos

Para verificar a presença do exossoma no CM, o CM é ultracentrifugado a 200.000g durante duas horas. Existe um enriquecimento de >200 vezes de CD9, uma proteína associada ao exossoma no pelete com nenhum nível detetável de CD9 no sobrenadante (Figura 16). A ultracentrifugação a 100.000 g durante uma hora não é suficiente para sedimentar toda a CD9 (Figura 16). A filtração do CM através de um filtro com um MWCO de 500 kDa, seguido de centrifugação, quer do filtrado ou retido a 200,000g durante 2 horas gerou um pelete na fração de retentado (Figura 16) . Os CD9 que tinham um PM de 19 kDa, respetivamente, estão altamente enriquecidos neste pelete. No entanto, este pelete não confere qualquer proteção cardíaca num modelo de ratinho de lesão de isquemia/reperfusão e postulámos que isto se deve à necessidade de vórtice vigoroso e pipetagem para ressuspender o pelete. Observou-se que apenas uma fração da CD9 sedimentou a 100.000 g e 200.000g durante uma hora e sedimentou mais a 200.000 g durante duas horas. Uma pequena fração sedimentou a 200.000 g, durante quatro horas. Em conjunto, estas observações apoiam a nossa hipótese de que 0 componente ativo é um complexo relativamente grande, que pode ser sedimentado por ultracentrifugação.

Para confirmar que as proteínas associadas ao exossoma estão, de fato, em exossomas, isto é, vesículas de fosfolípidos, o CM é fracionado num gradiente de densidade de sacarose por ultracentrifugação de equilíbrio. Tal como as vesículas lipídicas, a densidade de exossomas varia de 1,13 g mlu1 para 1,19 g mL_1 e é flotada sobre gradientes de sacarose. A flotação em gradientes de sacarose prontamente separa exossomas a partir de materiais contaminantes tais como agregados proteicos ou fragmentos nucleossomais (Thery et ai., 2002) . As frações do gradiente de sacarose são então analisadas quanto à presença de CD9, CD81, Tspl, SOD- 1 e piruvato cinase ao longo do gradiente (Figura 17A). Uma característica notável é que as proteínas não sedimentam com a densidade esperada de proteínas que se correlaciona com o seu peso molecular. Para determinar se estas densidades aparentes são devidas ao facto de as proteínas estarem contidas em vesículas lipídicas, o CM é tratado com um tampão de lise celular (Figura 17B), antes de ser fracionado num gradiente de densidade de sacarose. Este pré-tratamento com um reagente de solubilização da membrana plasmática restaurou cada uma das densidades aparentes para a densidade esperada de proteínas que se correlacionam com o seu peso molecular. Portanto, as proteínas associadas ao exossoma estão localizadas dentro das vesículas lipídicas, consistente com a nossa hipótese de exossoma.

Para confirmar que existem vesículas lipídicas em CM, a concentração de fosfatidilcolina e esfingomielina, os principais fosfolipideos da membrana do plasma, e o colesterol é determinado (Figura 17C) . Como esperado, a concentração relativa destes lípidos por pg de proteína é maior no CM relativo ao meio não condicionado. Além disso, a ultracentrifugação de CM a 200.000 g durante 2 horas aumentou significativamente a concentração dos lípidos (Figura 17C).

Exemplo 42. Resultados: As proteínas exossomais são ligadas à membrana ou encapsuladas

Uma vez que as proteínas associadas a exossoma incluem muitas proteínas de membrana conhecidas, tais como CD9 e proteínas citosólicas como SOD1, por conseguinte, determinámos se estas proteínas são similarmente localizadas na membrana lipidica e lúmen das vesículas. O CM é sujeito a tripsinização limitada ao longo do tempo (Figura 18A). A CD9 que tem um peso molecular semelhante ao SOD1 é relativamente mais suscetível a digestão de tripsina do que SOD1. A digestão de SOD1 só é observada depois de mais de 50% de CD9 ter sido digerido (Figura 18A) . Ao contrário da digestão triptica de S0D1 que não gerou qualquer intermediário detetável, a digestão triptica de CD9 gerou três intermediários de péptidos tripticos, sugerindo que CD9 tem domínios com diferentes sensibilidades à tripsina. Com base no comprimento de intermediários peptídicos e locais tripticos conhecidos de CD9, os três intermediários peptídicos tripticos sensíveis são mapeados para os domínios transmembranares ou citoplasmáticos. Isto sugeriu que o conhecido domínio extra-citoplasmático da CD9 celular é exposta de forma semelhante sobre a CD9 segregada e, por conseguinte, é sensível à tripsina enquanto o domínio trans-membranar e citoplasmático não é exposto e, por conseguinte, é relativamente resistente à digestão triptica. Em conjunto, estas observações sugerem que CD9, uma proteína de membrana conhecida, é também ligada à membrana no exossoma e está orientada na mesma direção que CD9 na membrana plasmática, enquanto que a SOD-1 citosólica está localizada no lúmen e apenas poderia ser digerida quando a integridade da membrana está comprometida pela digestão de proteínas de membrana.

Exemplo 43. Resultados: Presença de ARN encapsulado de vesícula lipídica na Secreção de MSCs

Foi relatado que os ARNs são secretados pelas células em exossomas (Smalheiser, 2007; Taylor e Gercel- Taylor, 2008; Valadi et al., 2007) . Para determinar se o ARN está presente na secreção cardioprotetora, o CM é extraído para o ARN por Trizol para se obter 5-6 ug de ARN por mg de proteína. Quando separados num gel de agarose-glioxal (Figura 19A) ou uma ureia-PAGE (Figura 19B), o ARN continha um nível indetetável de 18S e 28S do ARN ribossómico com a maioria dos ARNs sendo <300 nt. Para determinar se a estabilidade do ARN na secreção é devida à sua encapsulação como uma vesícula de fosfolípidos, como observado para as proteínas, o CM é tratado com ARNase antes de ser extraído para o ARN. 0 rendimento de ARN e a distribuição de tamanho são semelhantes aos do CM não tratado (Figura 19C), sugerindo que os ARNs secretados são protegidos da degradação com ARNase. A seguir testou-se a possibilidade de os ARN serem protegidos por uma membrana lipídica, análoga a uma membrana da célula por tratamento do CM com um tampão de lise celular à base de SDS, ciclodextrina ou fosfolipase A2. Após o tratamento com um dos quatro reagentes, o CM é exposto a ARNase e, em seguida, extraiu-se para o ARN. 0 pré-tratamento com um tampão de lise celular à base de SDS resultou numa perda completa de ARN enquanto o tratamento com fosfolipase A2 ou ciclodextrina teve como consequência uma degradação e perda parcial de ARNs. Estas observações sugerem que o ARN é protegido de atividade de ARNase por uma membrana de fosfolípidos ricos em colesterol de tal modo que a membrana é prontamente dissolvida ou comprometida por um tampão de lise celular à base de SDS, um detergente como Triton X-100, que dissolve lípidos, ciclodextrina que quelata e extrai colesterol ou degradação pela fosfolipase D. Observou-se também que os ARNs de ~70-100nt são mais sensíveis à atividade da ARNase III do que os de PM menor, o que sugere que os ARNs maiores são de cadeia dupla (Figura 19D).

Exemplo 44. Resultados: Os ARNs secretados são sequestrados em vesículas

Uma vez que os ARNs demonstram estar em vesículas lipídicas, determinou-se a seguir a densidade flutuante destas vesículas utilizando ultracentrifugação de equilíbrio de gradiente de sacarose. 0 CM, CM pré-tratado com tampão de lise ou um conjunto de marcadores de PM de ARN é carregado sobre um gradiente de densidade de sacarose e ultracentrifugado como descrito na figura 4a, b. Os gradientes são em seguida removidos em treze frações e cada fração é em seguida extraída para o ARN. Os ARNs secretados equilibraram a uma densidade de 1,074-1,1170 g/mL (Figura 20) . Em contraste, marcadores de PM de ARN exibiram uma densidade flutuante de 1,115-1,1170 g/mL e o pré-tratamento do MC com tampão de lise antes da centrifugação causou um aumento na densidade do ARN segregado para o dos marcadores de PM de ARN, ou seja, 1,115-1,145 g/mL (Figura 20C). Estas observações estão, por conseguinte, em conformidade com os ARNs a serem encapsulados numa vesícula lipídica e, portanto, tinham uma densidade aparente que é muito mais baixa do que o ARN solúvel. O pré-tratamento do CM com tampão de lise libertou o ARN e resultou na sedimentação do ARN à densidade dos marcadores de ARN.

Exemplo 45. Resultados: As vesículas contendo ARN não estão em CD81 contendo exossomas

Tal como mostrado acima, CD9, CD81 e Alix são co-imunoprecipitadas por anticorpos anti-CD81. Aqui, testou-se se o ARN também se imunoprecipita com CD81. Após a imunoprecipitação, o ARN não está presente no precipitado, mas permaneceu no sobrenadante (Figura 21) . Portanto, os ARNs secretados não são sequestrados em vesículas de CD81+, CD81+ CD9 +, ou CD81+ CD9+ Alix+.

Exemplo 46. Resultados: O ARN secretado contém microARNs que incluem pré-miARNs

Foi relatado que os exossomas contêm microARNs (Smalheiser, 2007; Taylor e Gercel-Taylor, 2008; Valadi et al, 2007) e, como a maioria dos ARNs do CM são menos do que 300 nt, testou-se o ARN a partir da MSC e o seu MC quanto à presença de microARNs (miARNs), efetuando uma hibridação de micro-matriz. 149 miARNs são detetados na MSC e 63 são detetados na CM (Figura 22A, Tabela E3 abaixo).

Tabela E3 Lista de miARNs em MSC e CM, conforme determinado por hibridização de micro-matriz. 47 miARNs estão presente tanto em MSC como em CM. São eles: hsa-let-7a, hsa-miR-149*, hsa-miR-214, hsa-let-7b, hsa-miR- 221, hsa-let-7c, hsa-miR-26a, hsa-miR-151-5p, hsa-miR-222, hsa-let-7d, hsa-miR-100, hsa-miR-320, hsa-let-7e, hsa-miR-103, hsa-let-7f, hsa-miR-18 la, hsa-miR-57 4-3p, hsa-miR-574-5p, hsa-let-7i, hsa-miR-107, hsa-miR-575, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-638, hsa-miR-663, hsa-miR-191, hsa-miR-671-5p, hsamiR-132, hsa-miR-191 *, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-21, hsa-miR-31, hsa-miR-143, hsa-miR-22, hsamiR- 145, hsa-miR-23a, hsa-miR-146a, hsa-miR-425*, hsa-miR-92a, hsa-miR-923, hsa-miR-23b, hsa-miR-940, hsamiR- 24, hsa-miR-149 e hsa-miR-483-5p. 16 miARNs são detetáveis no CM mas estão presentes abaixo do nível de deteção em MSCs. são eles: hsa-let-7b*, hsa-miR-124, hsa-miR-296-5p, hsa-miR-765, hsa-miR-1228, hsa-miR-1238, hsa-let-7d*, hsa-miR-150*, hsa-miR-493*, hsa-miR-933, hsa-miR-1234,, hsa-miR-122, hsa-miR-198, hsa-miR-572, hsa-miR-1224-5p e dhsa-miR-1237.

Os seguintes miARNs estão presentes em MSC apenas: hsa-miR-24-2*, hsa-miR-98, hsa-miR-484, hsa-miR-25, hsamiR-99a, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-99b, hsa-miR-503, hsa-miR-26b, hsa-miR-152, hsa-miR-505*, hsa-miR-27a, hsa-miR-155, hsa-miR-324-5p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-27b, hsa-miR-106a, hsa-miR-328, hsa-let-7g, hsa-miR-27b*, hsa-miR-106b, hsa-miR-18 la*, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-28-3p, hsa-miR-181a-2*, hsa-miR-331-3p,hsa-miR-lOa, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR-18lb, hsa-miR-335, hsa-miR-584, hsa-miR-15a, hsa-miR-29a, hsa-miR-18lc, hsa-miR-342-3p, hsa-miR-612, hsa-miR-15b, hsa-miR-29c, hsa-miR-18ld, hsa-miR-345, hsa-miR-625, hsa-miR-16, hsa-miR-30a, hsa-miR-126, hsa-miR-185, hsa-miR-629, hsa-miR-17, hsa-miR-30a*, hsa-miR-128,hsa-miR-186, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-18a, hsa-miR-30b, hsa-miR-130a, hsa-miR-187*, hsa-miR-362-5p, hsa-miR- 18b, hsa-miR-30c, hsa-miR-130b, hsa-miR-365, hsa-miR-19b, hsa-miR-30d, hsa-miR-374b, hsa-miR-708, hsa-miR-20a, hsa-miR-30e, hsa-miR-137, hsa-miR-192, hsa-miR-421, hsa-miR-744, hsa-miR-20b, hsa-miR-30e*, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-766, hsa-miR-195, hsa-miR-424, hsa-miR-768-3p, hsa-miR-31*, hsa-miR-197, hsa-miR-424*, hsamiR-768-5p, hsa-miR-22*, hsa-miR-34a, hsa-miR-145*, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-425, hsa-miR-769-5p, hsa-miR-hsa-let-7i hsa-miR-28-3p hsa-miR-107 hsa-miR-181a-2* hsa-miR-331-3p hsa-miR-575 hsa-miR-lOa hsa-miR-28-5p hsa-miR-125a-3p hsa-miR-181b hsa-miR-335 hsa-miR-584 hsa-miR-15a hsa-miR-29a hsa-miR-125a-5p hsa-miR-181c hsa-miR-342-3p hsa-miR-612 hsa-miR-15b hsa-miR-29c hsa-miR-125b hsa-miR-181d hsa-miR-345 hsa-miR-625 hsa-miR-16 hsa-miR-30a hsa-miR-126 hsa-miR-185 hsa-miR-361-5p hsa-miR-629 hsa-miR-17 hsa-miR-30a* hsa-miR-128 hsa-miR-186 hsa-miR-362-3p hsa-miR-638 hsa-miR-18a hsa-miR-30b hsa-miR-130a hsa-miR-187* hsa-miR-362-5p hsa-miR-663 hsa-miR-18b hsa-miR-30c hsa-miR-130b hsa-miR-191 hsa-miR-365 hsa-miR-671-5p hsa-miR-19b hsa-miR-30d hsa-miR-132 hsa-miR-191* hsa-miR-374b hsa-miR-708 hsa-miR-20a hsa-miR-30e hsa-miR-137 hsa-miR-192 hsa-miR-421 hsa-miR-744 hsa-miR-20b hsa-miR-30e* hsa-miR-140-3p hsa-miR-193a-5p hsa-miR-423-5p hsa-miR-766 hsa-miR-21 hsa-miR-31 hsa-miR-143 hsa-miR-195 hsa-miR-424 hsa-miR-768-3p hsa-miR-22 hsa-miR-31* hsa-miR-145 hsa-miR-197 hsa-miR-424* hsa-miR-768-5p hsa-miR-22* hsa-miR-34a hsa-miR-145* hsa-miR-199a-3p hsa-miR-425 hsa-miR-769-5p hsa-miR-23a hsa-miR-34a* hsa-miR-146a hsa-miR-199a-5p hsa-miR-425* hsa-miR-877 hsa-miR-23a* hsa-miR-92a hsa-miR-146b-5p hsa-miR-199b-5p hsa-miR-454 hsa-miR-923 hsa-miR-23b hsa-miR-92b hsa-miR-148b hsa-miR-210 hsa-miR-455-3p hsa-miR-940 hsa-miR-24 hsa-miR-93 hsa-miR-149 hsa-miR-212 hsa-miR-483-5p hsa-let-7b* hsa-miR-124 hsa-miR-296-5p hsa-miR-765 hsa-miR-1228 hsa-miR-1238 hsa-let-7d* hsa-miR-150* hsa-miR-493* hsa-miR-933 hsa-miR-1234 hsa-miR-122 hsa-miR-198 hsa-miR-572 hsa-miR-1224-5p hsa-miR-1237 34a*, hsa-miR-199a-5p, hsa-miR-877, hsa-miR-23a*, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-199b-5p, hsa-miR-454, hsa-miR-92b, hsa-miR-148b, hsa-miR-210, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-93, hsa-miR-212. A análise de micro-matriz também indicou que o CM continha níveis significativos de miARN anti-guia (assinalados com um asterisco) . Por exemplo, as razões relativas de let7b para let7b*, let7d para let7d* e miR-191 para miR-191* no CM são muito reduzidas em comparação com as da MSC (Figura 22B) . Nas células, a clivagem da ansa estaminal pré-miARN gera o miARN guia maduro e o miARN* anti-guia. 0 último é geralmente degradado na célula. Uma possível explicação para a baixa razão de miARN guia para miARN anti-guia é que os microARNs na secreção são pré-miARNs, e não ARNs maduros. De modo consistente com a possibilidade nas nossas observações é que 70-100nt ARNs têm cadeia dupla (Figura 19D) . Para confirmar esta conclusão, a análise por PCR em tempo real de ARN transcritos inversos é efetuada utilizando iniciadores específicos para ARNm guia e pré-miARN com ou sem tratamento prévio com ARNase III. 0 tratamento de ARNase III irá confirmar a presença da pré-miARN através da degradação do pré-miARN e torná-lo não detetável por RT-PCR.

Exemplo 47. Resultados: A secreção cardioprotetora contém apenas partículas com raio hidrodinâmico de 45-55 nm na razão detetável de 1-1000 nm

Para confirmar que a secreção continha grandes complexos, o CM e NCM são primeiramente separados por exclusão de tamanho numa HPLC (Figura 13) e cada pico de eluição, tal como medido por absorvância a 220 nm, é então examinado quanto à dispersão de luz dinâmica (DLS) usando um detetor de dispersão de luz quasi-elástico (QELS).

Somente um pico de eluição com um tempo de retenção de 11-13 minutos exibiu dispersão de luz dinâmica e a rh de partículas deste pico é de cerca de 45-55 nm. Os outros picos de eluição com um tempo de retenção de 13-16 e de 17-19 minutos, não exibiram dispersão dinâmica de luz. Uma vez que o intervalo de deteção de rh de DLS é de 1 a 1000 nm, e o diâmetro de uma hélice alfa de ADN é de 2 nm, as proteínas globulares são 1-10 nm, o poro nuclear (50 nm) , vírus grande (100 nm) e mitocôndria 3 μΜ, a DLS é, por conseguinte, capaz de detetar a maioria das partículas biológicas.

Com base na nossa observação de que a cardioproteção está associado a uma fração que tem um PM > 1000 kDa, colocamos a hipótese de o pico de eluição num tempo de retenção de 12 minutos ser o componente ativo.

Para confirmar isto, este pico de eluição é recolhido e testado num modelo de ratinho de lesão do miocárdio por isquemia/reperfusão, como previamente descrito acima e em (Timmers et al.r 2008). REFERENCIAS (INCLUINDO PARA OS EXEMPLOS 1 A 18) 1. Lewis EF, Moye LA, Rouleau JL, et al. Predictors of late development of heart failure in stable survivors of myocardial infarction: the CARE study. J Am Coll Cardiol. 15 outubro 2003; 42 (8) : 1446-1453. 2. Kleiman NS, White HD, Ohman EM, et al. Mortality within 24 hours of thrombolysis for myocardial infarction. The importance of early reperfusion. The GUSTO Investigators, Global Utilization of Streptokinase and Tissue Plasminogen Activator for Occluded Coronary Arteries. Circulation, dezembro 1994; 90 ( 6) : 2658-2665. 3. Saraste A, Pulkki K, Kallajoki M, et al. Apoptosis in human acute myocardial infarction. Circulation. 21 janeiro 1997; 95(2) :320-323. 4. Smits AM, van Vliet P, Hassink RJ, et al. 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Lisboa,

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Um exossoma isolado a partir de uma célula estaminal mesenquimal e tendo um tamanho compreendido entre 50 nm e 100 nm, tal como determinado por microscopia eletrónica, o exossoma compreendendo pelo menos uma propriedade biológica de uma célula estaminal mesenquimal, tal como uma atividade biológica de um meio condicionado de célula estaminal mesenquimal (MSC--CM) .
2. O exossoma de acordo com a reivindicação 1, em que a atividade biológica inclui a radioproteção.
3. O exossoma de acordo com a reivindicação 1 ou a reivindicação 2, o qual é capaz de reduzir a dimensão de enfarte por exemplo tal como ensaiado num modelo de ratinho ou suíno de isquemia do miocárdio e danos de reperfusão, ou que é capaz de reduzir o stress oxidativo, por exemplo, tal como testado num ensaio in vitro de morte celular induzida por peróxido de hidrogénio (H2O2) .
4. O exossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o exossoma compreende pelo menos 70% de proteínas num meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM), tal como selecionadas da lista apresentada na Tabela Dl ou E2, ou que são produtos de gene dos genes mostrados na Tabela D2 ou compreendendo um ou mais miARNs como mostrado na Tabela E3.
5. 0 exossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o exossoma compreende: (a) um complexo de peso molecular >100 kDa, por exemplo, compreendendo proteínas de <100 kDa; (b) um complexo de peso molecular >300 kDa, por exemplo, compreendendo proteínas de <300 kDa; ou (c) um complexo de peso molecular >1000 kDa.
6. O exossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o exossoma tem um tamanho compreendido entre 50 nm e 100 nm, conforme determinado por filtração através de um filtro de 0,2 μΜ e concentração contra uma membrana com um limite de peso molecular de 10 kDa, ou um raio hidrodinâmico abaixo de 100 nm, tal como entre cerca de 30 nm e cerca de 70 nm, entre cerca de 40 nm e cerca de 60 nm, tal como entre cerca de 45 nm e cerca de 55 nm, tal como cerca de 50 nm, por exemplo como determinado pela difração de raios laser ou dispersão dinâmica de luz.
7. O exossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o exossoma compreende um lípido selecionado a partir do grupo que consiste em: fosfolípido, fosfatidil serina, fosfatidil inositol, fosfatidil colina, esfingomielina, ceramidas, glicolípidos, cerebrósido, esteroides, colesterol, por exemplo, em que a razão de colesterol-fosfolípido é maior do que 0,3-0,4 (mol/mol).
8. O exossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o exossoma compreende uma secção lipídica, ou em que o exossoma é insolúvel em detergente não-iónico, de preferência de Triton-X100 ou em que o exossoma é tal que as proteínas dos pesos moleculares especificados na Reivindicação 4 permanecem substancialmente nos complexos dos pesos moleculares previstos nessas reivindicações, quando o exossoma é tratado com um detergente não iónico, ou em que o exossoma é sensível à ciclodextrina, de preferência 20 mM de ciclodextrina, de tal modo que, por exemplo, o tratamento com ciclodextrina provoca uma dissolução substancial dos complexos especificados na Reivindicação 5.
9. O exossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, em que o exossoma compreende ácido ribonucleico (ARN), de preferência em que o exossoma tem uma razão de absorvância de 1,9 (260:280 nm) , ou em que o exossoma compreende um antigénio de superfície selecionado a partir do grupo que consiste em: CD9, CD109 e thy-1.
10. Um método de produção de um exossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, o método compreendendo: (a) obtenção de um meio condicionado de células estaminais mesenquimais (MSC-CM); (b) concentração do meio condicionado de células estaminais mesenquimais; (c) submeter o meio condicionado de células estaminais mesenquimais concentrado a cromatografia de exclusão de tamanho; e (d) seleção de frações absorventes UV.
11. Uma composição farmacêutica compreendendo um exossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em conjunto com um excipiente, diluente ou veículo farmaceuticamente aceitável.
12. Um exossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 ou uma composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11 para utilização num método de tratamento de uma doença.
13. Utilização de um exossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de uma doença, em que a doença é selecionada a partir do grupo consistindo de: falha cardíaca, doença da medula óssea, doença de pele, queimaduras e doenças degenerativas tais como a diabetes, doença de Alzheimer, doença de Parkinson, cancro, enfarte do miocárdio, ferida cutânea, um distúrbio dermatológico, uma lesão dermatológica, dermatite, psoríase, condiloma, verrugas, hemangioma, queloide, cancro da pele, dermatite atópica, doença de Behcet, doença granulomatosa crónica, linfoma cutâneo das células T, ulceração, uma condição patológica caracterizada por a inflamação que induz a lesão e a desregulação imunitária conduzirem à remodelação de tecidos crónica incluindo fibrose e perda de função, lesão isquémica renal, fibrose cística, rinite e sinusite ou uma doença ortopédica.
14. Um sistema de administração para fornecer um exossoma, compreendendo um exossoma de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9 em conjunto com um dispensador que pode funcionar para fornecer o exossoma a um alvo. Lisboa,