CN113373112B - 基于通心络预处理的间充质干细胞来源外泌体及其制备方法 - Google Patents

基于通心络预处理的间充质干细胞来源外泌体及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种基于通心络预处理的间充质干细胞来源外泌体及其制备方法。本发明提供一种上调miR‑146a的表达水平的间充质干细胞来源外泌体的制备方法，该方法包括：采用通心络预处理间充质干细胞，并培养处理后的间充质干细胞以收集其分泌的外泌体。本发明可制备出具有促进血管新生和/或心肌修复能力的间充质干细胞来源外泌体。

Description

基于通心络预处理的间充质干细胞来源外泌体及其制备方法
技术领域
本发明是关于一种基于药物预处理的间充质干细胞来源外泌体及其制备方法，具体是关于一种基于药物通心络预处理的间充质干细胞来源的高效外泌体及其制备方法。
背景技术
WHO统计数据表明：2016年心血管疾病是全球第一大死因(约1760万人，32.2％)尽管目前医疗水平已大大提升，但急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)仍然是目前全球致死致残的主要原因之一(GBD 2016Mortality Collaborators.Global,regional,and national under-5mortality,adult mortality,age-specificmortality,and life expectancy,1970-2016:a systematic analysis for the GlobalBurden of Disease Study 2016.Lancet.2017Sep 16；390(10100):1084-1150；Roth,G.A.,et al.,Global,Regional,and National Burden of Cardiovascular Diseasesfor 10Causes,1990to 2015.J Am Coll Cardiol,2017.70(1):p.1-25；Virani,S.S.,etal.,Heart Disease and Stroke Statistics-2020 Update:A Report From theAmerican Heart Association.Circulation,2020.141(9):p.e139-e596.)。AMI可导致大量心肌在短时间内缺血坏死，继而被瘢痕组织替代引发心衰和死亡。现有治疗手段无法有效再生和修复心肌。近年来干细胞移植治疗，尤其是间充质干细胞(MSCs,mesenchymalstem cells)，例如骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs)，移植治疗AMI被寄予厚望(Orlic D,Kajstura J,Chimenti S,Jakoniuk I,Anderson SM,LiB,Pickel J,McKay R,Nadal-Ginard B,Bodine DM and others.Bone marrow cellsregenerate infarcted myocardium.Nature 2001；410(6829):701-705；Fisher SA,DoreeC,Mathur A,Martin-Rendon E.Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for PatientsWith Heart Failure.Circulation Research 2015；116(8):1361-1377；Afzal MR,Samanta A,Shah ZI,Jeevanantham V,Abdel-Latif A,Zuba-Surma EK,Dawn B.AdultBone Marrow Cell Therapy for Ischemic Heart Disease:Evidence and InsightsFrom Randomized Controlled Trials.Circ Res 2015；117(6):558-575)。MSCs的旁分泌功能是他们发挥作用的重要方式(Ranganath,S.H.,et al.,Harnessing the mesenchymalstem cell secretome for the treatment of cardiovascular disease.Cell StemCell,2012.10(3):p.244-58.)，然而临床研究表明，间充质干细胞虽能一定程度通过旁分泌保护作用改善梗死后心功能，但效果并不显著。进一步研究表明，MSCs通过旁分泌的方式分泌的一种细胞外囊泡结构——外泌体(exosome)被广泛报道可参与AMI后改善微环境以及修复心肌(Cheng,H.,et al.,Hypoxia-challenged MSC-derived exosomes delivermiR-210to attenuate post-infarction cardiac apoptosis.Stem Cell Res Ther,2020.11(1):p.224；Tan,S.J.O.,et al.,Novel Applications of Mesenchymal StemCell-derived Exosomes for Myocardial Infarction Therapeutics.Biomolecules,2020.10(5)；Xiao,C.,et al.,Transplanted Mesenchymal Stem Cells ReduceAutophagic Flux in Infarcted Hearts via the Exosomal Transfer of miR-125b.Circ Res,2018.123(5):p.564-578.)。外泌体可以广泛携带生物活性分子，包括RNA、蛋白质等，其中microRNA被广泛报道可以参与心脏修复过程中(Gebert,L.F.R.andI.J.MacRae,Regulation of microRNA function in animals.Nat Rev Mol Cell Biol,2019.20(1):p.21-37；Zhou,S.S.,et al.,miRNAS in cardiovascular diseases:potential biomarkers,therapeutic targets and challenges.Acta Pharmacol Sin,2018.39(7):p.1073-1084.)，而miRNA-146a被广泛报道具有心脏修复、抗纤维化等功能(Boon RA,Dimmeler S.MicroRNAs in myocardial infarction.Nat Rev Cardiol.2015Mar；12(3):135-42；Wang X,Ha T,Liu L,Zou J,Zhang X,Kalbfleisch J,Gao X,WilliamsD,Li C.Increased expression of microRNA-146a decreases myocardial ischaemia/reperfusion injury.Cardiovasc Res.2013Mar 1；97(3):432-42；Barile L,Moccetti T,Marbán E,Vassalli G.Roles of exosomes in cardioprotection.Eur Heart J.2017May7；38(18):1372-1379)。同时外泌体具有来源广、稳定、无免疫原性等优点。另一方面，BM-MSCs来源的外泌体(MSC-Exo)可改善心梗微环境及促进心脏修复，因此，有望成为新一代的心肌修复产品，为临床治疗急性心肌梗死提供新思路(Lamichhane TN,Sokic S,SchardtJS,Raiker RS,Lin JW,Jay SM.Emerging Roles for Extracellular Vesicles inTissue Engineering and Regenerative Medicine.Tissue Engineering Part B:Reviews 2015；21(1):45-54)。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种基于通心络药物预处理提高间充质干细胞来源外泌体效能的制备方法。
本发明的另一目的在于提供所制备的间充质干细胞来源外泌体。
本发明的研究发现，通心络(Tongxinluo,TXL)预处理间充质干细胞，可制备出具有显著改善心梗后心功能、减少心梗面积、减少心肌细胞凋亡及减轻炎症能力的间充质干细胞来源外泌体。
从而，一方面，本发明提供了一种上调miR-146a的表达水平的间充质干细胞来源外泌体的制备方法，该方法包括：采用通心络预处理间充质干细胞，并培养处理后的间充质干细胞以收集其分泌的外泌体。
本发明中所用通心络(Tongxinluo,TXL)为一种药物，其应符合相关质量标准要求。
根据本发明的具体实施方案，本发明的上调miR-146a的表达水平的间充质干细胞来源外泌体的制备方法包括：
在间充质干细胞的培养基中加入通心络预处理间充质干细胞12-24小时后，更换细胞培养基为无外泌体的完全培养基继续培养；48小时后收集条件培养基并利用超速离心法分离得到经通心络预处理间充质干细胞分泌的外泌体。
根据本发明的具体实施方案，优选地，采用通心络预处理间充质干细胞的时间为24h。本发明发现，处理时间为24h时，收集到的细胞上清里面的外泌体表达的miR-146a显著上调。
根据本发明的具体实施方案，本发明的上调miR-146a的表达水平的间充质干细胞来源外泌体的制备方法中，超速离心法包括：
收集条件培养基后，依次离心去除细胞、离心去除细胞碎片、离心去除大囊泡，然后离心收取沉淀并重悬后，再次离心获得外泌体。
具体地，本发明的上调miR-146a的表达水平的间充质干细胞来源外泌体的制备方法中，离心法包括：收集条件培养基后，300g离心10min去除细胞；2000g离心20min去除细胞碎片；16500g高速离心30min去除大囊泡；120000g超速离心70min收取沉淀并重悬后，再次120000g超速离心70min获得外泌体。
根据本发明的具体实施方案，本发明的上调miR-146a的表达水平的间充质干细胞来源外泌体的制备方法中，所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
另一方面，本发明还提供了按照本发明所述方法制备得到的外泌体。
与现有技术得到的外泌体相比，本发明制备得到的外泌体高表达miR-146a；所述miR-146a可减轻心梗后反应炎症、细胞凋亡、缩小心梗面积。
另一方面，本发明还提供了通心络在制备间充质干细胞分泌高表达miR-146a并且具有改善心梗后心功能、减少梗死面积、减少心肌细胞凋亡及减轻炎症的外泌体的制剂中的应用。
根据本发明的一些具体实施方案，本发明中，利用400μg/mL通心络预处理间充质干细胞12-24小时，优选为24h。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
在本发明的一个具体实施方案中，利用400μg/mL TXL预处理BM-MSC 24小时可获得miR-146a含量更高的外泌体，可改善心梗后心功能、减小梗死面积、减少心肌细胞凋亡及减轻炎症。
附图说明
图1A-图1B显示本发明实施例中间充质干细胞来源外泌体在电镜下的形态结构以及外泌体粒径分析(NTA)的结果。
图2显示本发明实施例中间充质干细胞来源外泌体高表达Alix,TSG101,CD63等外泌体标记蛋白。
图3A-图3B显示通心络预处理间充质干细胞来源外泌体可显著改善大鼠心梗后心功能的检测结果。
图3C-图3D显示通心络预处理间充质干细胞来源外泌体可减少心梗面积的检测结果。
图4显示通心络预处理间充质干细胞来源外泌体可减少心肌细胞凋亡有效。
图5显示通心络预处理间充质干细胞来源外泌体可显著减轻相关炎症因子的释放。
图6显示通心络预处理间充质干细胞来源外泌体与普通间充质干细胞来源外泌体差异的火山图。
图7显示通心络预处理间充质干细胞来源外泌体中与心脏保护作用相关的miRNA-146a比普通间充质干细胞来源外泌体升高了近10倍。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的特点及所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例中所用TXL购自石家庄以岭药业股份有限公司，其主要成分如下：
通心络主要成分 药材部位 比例(％)
人参 根和地下茎 1.7
赤芍 根 1.6
酸枣仁 种 1.2
檀香提取物 树干心材 0.4
降香 树干心材和根 4.0
乳香 树脂 6.0
冰片 C<sub>10</sub>H<sub>18</sub>O 3.6
水蛭 干体 23.6
全蝎 干体 18.1
土蟞虫 雌性干体 18.1
蜈蚣 干体 3.6
蝉蜕 皮 18.1
实施例1
间充质干细胞来源外泌体的制备方法：
间充质干细胞来源外泌体的制备方法：利用差速贴壁法分离原代大鼠(Sprague-Dawley大鼠，60-80g)BM-MSCs并传代扩增至第3-4代备用。在BM-MSCs完全培养基(IMDM,Gibco,美国)中加入400μg/mL通心络预处理24小时后，更换细胞培养基为IMDM部分培养基(不加入胎牛血清)继续培养。48小时后收取条件培养基并利用超速离心法分离得到经通心络预处理BM-MSCs分泌的外泌体(MSCTXL-Exo)。超速离心法具体步骤包括：收取条件培养基后，300g离心10min去除细胞；2000g离心20min去除细胞碎片；16500g高速离心30min去除大囊泡；120000g超速离心70min收取沉淀并重悬后，再次120000g超速离心70min获得外泌体。
对制备好的MSCTXL-Exo进行鉴定：包括电镜(FEI，Tecnai G2 Spirit BioTwin)分析观察形态结构，NTA(PARTICLE METRIXs,ZetaVIEW S/N 17-310)分析外泌体的粒径分布。
对通心络预处理制备的MSCTXL-Exo进行鉴定，然后进行功能学评价，包括证明心肌内注射后改善大鼠心功能、减少心梗面积、减轻心肌细胞凋亡及改善微环境；MSC-Exo和MSCTXL-Exo高通量测序，找出显著改变的miRNA，并进一步进行MSCTXL-Exo中miRNA-146a RT-PCR水平检测，即证明MSCTXL-Exo对心脏的保护主要是由miRNA-146a介导。
评价指标(研究结果)
利用超速离心法分离得到的MSCTXL-Exo在电镜下呈现球形或圆盘形，大小在100nm左右；NTA分析其粒径分布在30-150nm范围内。通心络预处理后与无预处理的BM-MSC分泌的外泌体在形态、粒径分布上没有显著差异。具体结果可参见图1A-图1B，其中，图1A：电镜下观察间充质干细胞来源外泌体(MSC-Exo)的形态结构，呈球形或圆盘形，大小在100nm左右，经通心络预处理后形态不变；图1B：用NTA分析MSC-Exo的粒径分布，通心络预处理和未处理的MSC-Exo的粒径分布均在30-150nm范围内；图2，western blot显示外泌体高表达Alix,TSG101,CD63等外泌体标记蛋白。
与未经通心络预处理的MSC-Exo相比，MSCTXL-Exo心肌内注射后可显著改善大鼠心梗后心功能、减小梗死面积，并能减少心肌细胞凋亡、减少炎症因子的释放。具体可参见图3A-图5，其中，图3A-图3B：经通心络预处理间充质干细胞来源外泌体(MSCTXL-Exo)移植显著改善心梗大鼠心功能；图3C-图3D：Masson染色显示MSCTXL-Exo移植显著减小大鼠心梗面积；图4：凋亡细胞染色提示MSCTXL-Exo移植可以减少心肌细胞凋亡；图5:ELISA检测提示MSCTXL-Exo移植可以有效减轻炎症因子的释放，从而改善移植微环境。*：P<0.05；**：P<0.01；***：P<0.001。
与未经通心络预处理的MSC-Exo相比，高通量测序的结果显示MSCTXL-Exo中miRNA-146a显著增加，升高了近4倍。图6:高通量测序的结果显示，MSCTXL-Exo中miRNA-146a显著增加；图7：RT-PCR结果显示MSCTXL-Exo中miRNA-146a较MSC-Exo升高了约10倍。而miR-146a在减轻心肌纤维化、减少细胞凋亡、减轻炎症反应等方面发挥着重要作用。
结论：利用400μg/mL TXL预处理间充质干细胞24小时后可获得具有改善心功能、减少心梗面积、促进血管新生的外泌体，其机制与上调外泌体中的miR-146a水平有关。

Claims (9)

1.一种上调miR-146a的表达水平的间充质干细胞来源外泌体的制备方法，该方法包括：采用通心络预处理间充质干细胞，并培养处理后的间充质干细胞以收集其分泌的外泌体。
2.根据权利要求1所述的方法，该方法包括：
在间充质干细胞的培养基中加入通心络预处理间充质干细胞12-24小时后，更换细胞培养基为无外泌体的完全培养基继续培养；48小时后收集条件培养基并利用超速离心法分离得到经通心络预处理间充质干细胞分泌的外泌体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中，通心络预处理间充质干细胞的时间为24h。
4.根据权利要求2所述的方法，其中，超速离心法包括：
收集条件培养基后，依次离心去除细胞、离心去除细胞碎片、离心去除大囊泡，然后离心收取沉淀并重悬后，再次离心获得外泌体。
5.根据权利要求4所述的方法，其中，收集条件培养基后，300g离心10min去除细胞；2000g离心20min去除细胞碎片；16500g高速离心30min去除大囊泡；120000g超速离心70min收取沉淀并重悬后，再次120000g超速离心70min获得外泌体。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
7.通心络在制备促进间充质干细胞分泌高表达miR-146a并且具有改善心梗后心功能、减少梗死面积、减少心肌细胞凋亡及减轻炎症的外泌体的制剂中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用，其中，利用400 μg/mL通心络加入间充质干细胞的IMDM培养基中预处理12-24小时。
9.根据权利要求7或8所述的应用，其中，所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
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