CN113564106A - 基于通心络预处理的间充质干细胞的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种基于通心络预处理的间充质干细胞的制备方法。本发明提供了一种提高间充质干细胞治疗急性心梗效能的方法，所述方法包括：采用药物通心络预处理间充质干细胞，其中，提高间充质干细胞治疗急性心梗的效能包括提高趋化因子受体CXCR4的表达。本发明采用通心络预处理间充质干细胞，可制备出具有抗凋亡能力增强、定向迁移能力增强，且能够改善心梗后微环境、缩小梗死面积、提高心功能功效的间充质干细胞。

Description

基于通心络预处理的间充质干细胞的制备方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体而言，本发明是关于一种基于通心络预处理的间充质干细胞来的制备方法。
背景技术
WHO统计数据表明：2016年心血管疾病是全球第一大死因(约1760万人，32.2％)，其中有948万人死于缺血性心脏病(17.3％)，急性心肌梗死(acute myocardialinfarction,AMI)及其所致的心力衰竭已成为全球重要致死致残的原因(CollaboratorsGM.Global,regional,and national under-5mortality,adult mortality,age-specificmortality,and life expectancy,1970–2016:a systematic analysis for the GlobalBurden of Disease Study 2016.The Lancet 2017；390(10100):1084-1150；Virani,S.S.,et al.,Heart Disease and Stroke Statistics-2020Update:A Report From theAmerican Heart Association.Circulation,2020.141(9):p.e139-e596.)。急性心肌梗死导致大量心肌缺血坏死，继而被瘢痕组织替代引发心衰和死亡。现有治疗手段无法有效再生和修复心肌。近年来干细胞移植治疗，尤其是间充质干细胞(MSCs,mesenchymal stemcells)，例如骨髓间充质干细胞(bone marrow-mesenchymal stem cells,BM-MSCs)，移植治疗AMI被寄予厚望(Orlic D,Kajstura J,Chimenti S,Jakoniuk I,Anderson SM,Li B,Pickel J,McKay R,Nadal-Ginard B,Bodine DM and others.Bone marrow cellsregenerate infarcted myocardium.Nature 2001；410(6829):701-705；Fisher SA,DoreeC,Mathur A,Martin-Rendon E.Meta-Analysis of Cell Therapy Trials for PatientsWith Heart Failure.Circulation Research 2015；116(8):1361-1377；Afzal MR,Samanta A,Shah ZI,Jeevanantham V,Abdel-Latif A,Zuba-Surma EK,Dawn B.AdultBone Marrow Cell Therapy for Ischemic Heart Disease:Evidence and InsightsFrom Randomized Controlled Trials.Circ Res 2015；117(6):558-575)。然而移植的间充质干细胞在梗死心肌归巢有限、存活率低下，因此通过改善移植的间充质干细胞的性能能够有效提高间充质干细胞治疗急性心肌梗死的疗效。虽然目前有多种手段可以用于改善间充质干细胞的性能，例如基因修饰、组织工程等(Chen,Z.,et al.,FunctionallyImproved Mesenchymal Stem Cells to Better Treat Myocardial Infarction.StemCells Int,2018.2018:p.7045245.)，但是实际用于临床直接转化仍存在困难。通心络(Tongxinluo,TXL)作为一个在临床上治疗心肌梗死患者中广泛使用的中药，具有降脂、抗炎、抗凋亡等性质(Zhuo,Q.,et al.,Tongxinluo capsule for acute stroke.CochraneDatabase Syst Rev,2008(4):p.Cd004584；Chen,W.Q.,et al.,Chinese medicinetongxinluo significantly lowers serum lipid levels and stabilizes vulnerableplaques in a rabbit model.J Ethnopharmacol,2009.124(1):p.103-110；Chen,G.,etal.,Cardiomyocyte-derived small extracellular vesicles can signal eNOSactivation in cardiac microvascular endothelial cells to protect againstIschemia/Reperfusion injury.Theranostics,2020.10(25):p.11754-11774；Cai,M.,etal.,Tongxinluo reduces brain edema and inhibits post-ischemic inflammationafter middle cerebral artery occlusion in rats.J Ethnopharmacol,2016.181:p.136-145.)。
因此，探究采用临床广泛使用的药物来预处理间充质干细胞，以提高间充质干细胞治疗心肌梗死疗效以及为后期临床直接转化提供新思路是本领域需要解决的技术问题。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种提高间充质干细胞治疗急性心梗效能的方法。
本发明的研究发现，药物通心络(Tongxinluo,TXL)预处理间充质干细胞，可显著提高间充质干细胞的抗凋亡及定向迁移能力，制备出具有显著改善心梗微环境、缩小梗死面积及提高心功能功效的间充质干细胞。
从而，一方面，本发明提供了一种提高间充质干细胞治疗急性心梗效能的方法，所述方法包括：采用药物通心络预处理间充质干细胞，其中，提高间充质干细胞治疗急性心梗的效能包括提高趋化因子受体CXCR4的表达。
本发明中所用TXL为一种药物，其应符合相关质量标准要求。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所用通心络的浓度为100μg/mL-400μg/mL；优选为400μg/mL。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述方法包括：
将通心络溶于培养基中，配成溶液；在间充质干细胞的培养基中加入通心络溶液预处理间充质干细胞。
根据本发明的具体实施方案，本发明的TXL溶液的配制包括：
将TXL粉末加入无血清IMDM培养基中，60℃水浴促溶30分钟；5000rpm离心10分钟，重复3次后将溶液用0.22μm滤器过滤，测量称重剩余残渣质量后算出通TXL溶液浓度，并加入适量IMDM培养基将溶液浓度配至2mg/mL。
根据本发明的具体实施方案，本发明的间充质干细胞的制备方法中，所述预处理包括步骤：
将间充质干细胞培养基移除，用PBS冲洗两次以去除残留的培养基后，加入IMDM培养基，并加入通心络溶液使其终浓度为400μg/mL,处理24小时后获得经TXL预处理的间充质干细胞。
根据本发明的具体实施方案，本发明的间充质干细胞的制备方法中，所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
另一方面，本发明还提供了按照本发明所述方法制备得到的间充质干细胞。
另一方面，本发明还提供了TXL在制备提高间充质干细胞抗凋亡能力和/或定向迁移能力，以及显著改善心梗微环境、缩小梗死面积和/或提高心功能的能力的制剂中的应用。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，利用400μg/mL TXL预处理间充质干细胞24小时。
根据本发明的具体实施方案，本发明中，所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞或脂肪间充质干细胞。
在本发明的一个具体实施方案中，利用400μg/mL TXL预处理间充质干细胞24小时可获得具有高效显著改善心梗微环境、缩小梗死面积及提高心功效的间充质干细胞。
附图说明
图1A-图1F显示间充质干细胞表面标志物及正常状态和用不同浓度TXL预处理对于间充质干细胞在缺氧/无血清(hypoxia/serum deprivation,H/SD)状态下的活性影响和凋亡的情况。
图2A-图2B显示间充质干细胞经/不经TXL预处理的趋化因子受体CXCR4的mRNA及蛋白水平的表达情况。
图3A-图3D显示TXL预处理间充质干细胞改善大鼠心梗后心功能、减少心梗面积。
图4A-图4D显示TXL预处理间充质干细胞能够有效心肌细胞凋亡减少并改善大鼠心梗后微环境。
图5A-图5B显示经TXL预处理能比阿托伐他汀预处理更显著得降低MSC在H/SD条件下凋亡。
具体实施方式
下面通过具体实施例进一步详细说明本发明的特点及所具有的技术效果，但本发明并不因此而受到任何限制。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。
实施例中所用TXL购自石家庄以岭药业股份有限公司，其主要成分如下：
通心络主要成分 药材部位 比例(％)
人参 根和地下茎 1.7
赤芍 根 1.6
酸枣仁 种 1.2
檀香提取物 树干心材 0.4
降香 树干心材和根 4.0
乳香 树脂 6.0
冰片 C<sub>10</sub>H<sub>18</sub>O 3.6
水蛭 干体 23.6
全蝎 干体 18.1
土蟞虫 雌性干体 18.1
蜈蚣 干体 3.6
蝉蜕 皮 18.1
实施例1
TXL溶液的配制：将TXL粉末加入无血清IMDM培养基中，60℃水浴促溶30分钟；5000rpm离心10分钟，重复3次后将溶液用0.22μm滤器过滤，测量称重剩余残渣质量后算出通TXL溶液浓度，并加入适量IMDM培养基将溶液浓度配至2mg/mL。
TXL预处理的间充质干细胞的制备方法：利用差速贴壁法分离原代大鼠(Sprague-Dawley大鼠，60-80g)BM-MSCs并传代扩增至第3-4代备用。将间充质干细胞培养基移除，用PBS洗两次后，加入IMDM完全培养基，在BM-MSCs完全培养基(IMDM,Gibco,美国)中加入400μg/mL TXL预处理24小时后获得经TXL预处理的间充质干细胞。
对制备好的间充质400μg/mL浓度TXL预处理制备的MSCTXL进行功能学评价，包括在H/SD条件下其凋亡的数量、凋亡通路中重要分子caspases3的活性，和心肌内注射后改善大鼠心梗后心功能、减小梗死面积的效果，以及心梗后炎症因子的表达及血管新生的情况。
评价指标(研究结果)
利用差速贴壁法分离得到的MSC在显微镜下呈梭形，流式分析仪检测显示MSC表面标志物CD29(+)、CD90(+)、CD45(-)、CD11(-)。TXL预处理后与无预处理的BM-MSC在形态和表面蛋白标志物上没有显著差异。给予100μg/mL、200μg/mL、400μg/mL TXL预处理的MSC在正常状态下与未经预处理的MSC活性无明显差异，而在H/SD状态下，MSCTXL的活性明显优于MSC，且400μg/mL最佳，具体结果可参见图1A-图1D。在H/SD状态下，流式细胞术显示经TXL预处理的MSC凋亡细胞比例显著降低，且与凋亡密切相关的caspase 3的值也显著降低，具体结果可参见图1D-图1F。其中，图1A：流式分析仪检测MSC表面标志物，CD29(+)，CD90(+)，CD45(-)，CD11(-)，经TXL预处理后表面标志物表达情况不变；图1B：用CCK-8试剂盒(Dojindo，日本)分析MSC的活性，TXL预处理浓度在100μg/mL、200μg/mL和400μg/mL与未处理的MSC在正常培养条件下活性无明显差异，当TXL达到800μg/mL及1600μg/mL时MSC活性显著降低；图1C：而在H/SD模拟心梗的条件下经400μg/mL TXL预处理的MSC(即MSCTXL)活性显著高于未经预处理的MSC,因此400μg/mL预处理浓度为最佳，后续皆采用预处理组400μg/mL浓度TXL预处理；图1D、图1E：在H/SD条件下，流式细胞术显示MSCTXL中凋亡的细胞比例显著低于MSC；图1F：在H/SD条件下，TXL预处理可以显著降低凋亡通路中重要分子caspase3的活性。
注射的MSCs的定向迁移能力也是影响其治疗效率的关键因素之一。其中，CXCR4表达于细胞表面，其表达增加可以增强其定向迁移能力。与未经TXL预处理的MSC相比，qPCR结果显示MSCTXL的CXCR4 mRNA水平显著提高，约3.4倍(图2A)；western blot结果显示MSCTXL的CXCR4蛋白水平提高了1.6倍(图2B)。
与未经TXL预处理的MSC相比，MSCTXL心肌内注射后可显著改善大鼠心梗后心功能、减小梗死面积。具体可参见图3A-图3D，其中，图3A、图3B：MSCTXL移植显著改善心梗后大鼠心功能；图3C、图3D：Masson染色显示MSCTXL移植显著减小大鼠心梗面积。
与未经TXL预处理的MSC相比，MSCTXL心肌内注射后可显著心肌细胞凋亡，且能够减少相关炎症因子的表达，改善微环境。具体可参见图4A-图4D，其中，图4A、图4B：MSCTXL移植显著减少心肌细胞凋亡；图4C、图4D：梗死周边区心肌组织Elisa检测提示：MSCTXL移植显著降低炎症因子IL-6和TNF-α的表达。
结论：利用400μg/mL TXL预处理BM-MSC 24小时可获得具有高效改善心梗后微环境、促进血管新生和减少心肌梗死的间充质干细胞，其机制与TXL预处理增加了间充质干细胞抗凋亡能力，且通过增加间充质干细胞表面趋化因子CXCR4的表达提高间充质干细胞的定向迁移能力有关。
对比例
在缺氧无血清(H/SD)条件下，经阿托伐他汀预处理的MSC(MSCATV)在流式检测(图5A和图5B)和Hochest 33342染色条件下，均显示能够减少MSC在H/SD条件下的凋亡，而经TXL预处理的MSC(MSCTXL)在H/SD条件下凋亡的比例更低。

Claims (10)

1.一种提高间充质干细胞治疗急性心梗效能的方法，所述方法包括：采用药物通心络预处理间充质干细胞，其中，提高间充质干细胞治疗急性心梗的效能包括提高趋化因子受体CXCR4的表达。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，所述通心络的浓度为100μg/mL-400μg/mL；优选为400μg/mL。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括：
将通心络溶于培养基中，配成溶液；在间充质干细胞的培养基中加入通心络溶液预处理间充质干细胞。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，所述方法包括：
将通心络粉末加入无血清IMDM培养基中，60℃水浴促溶30分钟；5000rpm离心10分钟，重复3次后将溶液用0.22μm滤器过滤，测量称重剩余残渣质量后算出通心络溶液浓度，并加入适量IMDM培养基将通心络溶液浓度配至2mg/mL。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，所述预处理包括步骤：
将间充质干细胞培养基移除，用PBS洗后，加入IMDM完全培养基，并加入通心络溶液使其终浓度为400μg/mL，处理24小时后获得经通心络预处理的间充质干细胞。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中，所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞和/或脂肪间充质干细胞。
7.按照权利要求1-6中任一项所述的方法制备得到的间充质干细胞。
8.药物通心络在制备提高间充质干细胞的抗凋亡能力和/或提高间充质干细胞的定向迁移能力的制剂中的应用。
9.药物通心络在制备提高间充质干细胞改善心梗微环境、促进心脏修复功效的制剂中的应用。
10.根据权利要求8或9所述的应用，其中所述间充质干细胞包括骨髓间充质干细胞和/或脂肪间充质干细胞。
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