CN112972459A - 黄根单体在保肝护肝方面的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了黄根单体在保肝护肝方面的应用。发明人对从黄根乙酸乙酯部位中提取分离的黄根单体化合物(HG2、HG3、HG4)进行了高通量筛选，结果显示差异上调基因有21个，其中实验组与对照组比较，对Klf15表达差异存在非常显著性差异。由于Klf15能调节肝脏内源性和外源性代谢，调控MMp3的表达，减少肝脏细胞凋亡水平，因此可以预计黄根单体可以通过上调Klf15基因的表达从而调节肝脏内源性和外源性代谢，最终发挥保肝护肝作用。综上，黄根在研制保肝护肝药物中具有极大的潜力，值得进一步研究开发。

Description

黄根单体在保肝护肝方面的应用
技术领域
本发明属于肝病治疗技术领域，尤其涉及一种黄根单体在保肝护肝方面的应用。
背景技术
黄根来源于茜草科植物南山花Prismatomeris connata Y.Z.Ruan.的根，又名狗骨木、南山花、三角瓣花，是广西特色壮药材之一，具有利湿退黄，强筋壮骨，祛瘀生新，凉血止血等功效，可用于风湿骨痛，跌打损伤，白血病，矽肺，贫血、牙龈出血，尿路感染的治疗。现代文献报导，黄根的化学成分主要有1-羟基-2-甲基蒽醌、2-羟基-3-甲氧基蒽醌、1,3-二羟基-2-甲氧基蒽醌、2-甲基蒽醌(tecto-quinone)、甲基异茜草素(rubiadine)、甲基异茜草素-1-甲醚(rubiadine-1-methyl ether)、虎刺醛(damnacanthal)和B-谷甾醇(B-sitosterol),在其叶中还含有熊果酸、B-sitosteryl-3-D-B-D-glucopyranoside。
发明人前期研究发现黄根乙酸乙酯部位在体外能抑制大鼠肝星状细胞(HSC-T6)的增殖，还可降低肝纤维化大鼠的肝脏系数和AST水平。发明人对乙酸乙酯部位浸膏经反复的硅胶柱色谱及Sephadex LH-20柱色谱进行分离纯化，分离并鉴定了7个化合物，分别为东莨菪内酯(HG2)，豆甾-4-烯-3-酮，去甲虎刺醛，2-羟甲基-3-羟基-9,10-蒽醌，甲基异茜草素-1-甲醚(HG3),甲基异茜草素(HG4)，胡萝卜苷。经进一步研究表明，黄根的蒽醌类成份抗肝纤维化的作用机制应与其能抑制HSC细胞增殖并诱导HSC细胞发生凋亡有关。通过抑制作用和诱导其发生凋亡，进而减少细胞外基质在肝组织内沉积，发挥抗肝纤维化作用，其中HG3抗肝纤维化作用较好，而HG2和HG4作用很弱。
尽管如此，目前尚无黄根单体在保肝护肝方面的研究报道。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种黄根单体在保肝护肝方面的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：
黄根单体在制备调控Klf15基因药物中的应用。
黄根单体为HG2、HG3或HG4。
调控Klf15基因为上调Klf15基因的表达。
黄根单体在制备保肝护肝药物中的应用。
黄根单体为HG2、HG3或HG4。
保肝护肝为通过上调Klf15基因的表达从而调节肝脏内源性和外源性代谢。
为深入发掘黄根的药用价值和作用机理，发明人对从黄根乙酸乙酯部位中提取分离的黄根单体化合物(HG2、HG3、HG4)进行了高通量筛选，结果显示差异上调基因有21个，其中实验组与对照组比较，对Klf15表达差异存在非常显著性差异。由于Klf15能调节肝脏内源性和外源性代谢，调控MMp3的表达，减少肝脏细胞凋亡水平，因此可以预计黄根单体可以通过上调Klf15基因的表达从而调节肝脏内源性和外源性代谢，最终发挥保肝护肝作用。综上，黄根在研制保肝护肝药物中具有极大的潜力，值得进一步研究开发。
附图说明
图1是高通量测序的工艺流程。
图2是高通量测序的结果。
具体实施方式
一、黄根单体的制备
黄根采自广西壮族自治区防城市，经广西民族医药研究院兰日春副主任药师鉴定为南山花Prismatomeris tetrandra(Roxb.)K.Schum)的干燥根。60kg黄根的根部用95％乙醇回流提取3次，每次3小时，浓缩后得到浸膏1200g，加入适量的水使之充分溶解，水溶液依次采用石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，减压浓缩得石油醚萃取浸膏58g、乙酸乙酯萃取浸膏112g和正丁醇萃取浸膏200g。将乙酸乙酯浸膏112g，经硅胶(200～300目)柱色谱，以石油醚-丙酮系统梯度洗脱,收集各流分。Fr.2-3经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱分离纯化得化合物HG2(60mg),Fr.7-9经硅胶柱色谱、Sephadex LH-20柱色谱分离纯化得化合物HG4(22mg)，Fr.11经硅胶柱色谱分离纯化得化合物HG3(35mg)。经结构鉴定，HG2为东莨菪内酯，HG3为甲基异茜草素-1-甲醚，HG4为甲基异茜草素。HG2、HG3、HG4均溶于DMSO中，给药终浓度时DMSO不超过0.1％。
二、大鼠细胞HSC中药处理实验
1、移弃培养基，加入2ml PBS洗一遍，加2ml Tripsin Solution，37℃消化3min，加入3ml DMEM+10％FBS+1％SP的培养基中和，收集大鼠肝星状细胞HSC-T6细胞悬液，1200rpm，离心3min，接种于6个6cm皿。
2、第二天细胞融合度达到50％-60％左右，任选3个6cm皿将培养基换为黄根单体甲基异茜草素-1-甲醚浓度为20ug/ml的培养基4ml，培养48h。
3、将黄根处理48h的3个6cm皿分别编号为实验组1、2、3，未处理的3个6cm皿编号为对照组1、2、3，分别消化，离心，弃上清，收各组细胞沉淀。
三、高通量测序
如图1所示，高通量测序操作流程如下：
通过Oligo(dT)磁珠富集总RNA中带有polyA结构的mRNA，采用离子打断的方式，将RNA打断到长度300bp左右的片段。以RNA为模板，用6碱基随机引物和逆转录酶合成cDNA第一链，并以第一链cDNA为模板进行第二链cDNA的合成。其中，选择长度为300bp的片段，是因为接头长度是固定的，如被打断的片段长度较短，将导致接头序列的比例偏高，从而降低了有效数据的比例；如被打断的片段长度较长，则不利于上机测序过程中簇的生成。
文库构建完成后，采用PCR扩增进行文库片段富集，之后根据片段大小进行文库选择，文库大小在450bp。接着，通过Agilent 2100Bioanalyzer对文库进行质检，再对文库总浓度及文库有效浓度进行检测。然后，根据文库的有效浓度以及文库所需数据量，将含有不同Index序列(各样本加上不同的Index，最后根据Index区分各样本的下机数据)的文库按比例进行混合。混合文库统一稀释到2nM，通过碱变性，形成单链文库。
样品经过RNA抽提、纯化、建库之后，采用第二代测序技术(Next-GenerationSequencing，NGS)，基于Illumina测序平台，对这些文库进行双末端(Paired-end，PE)测序。
四、结果分析
采用DESeq对基因表达进行差异分析，筛选差异表达基因条件为：表达差异倍数|log2FoldChange|>1，显著性P-value<0.05。
如图2所示，结果发现，差异上调基因有21个，其中实验组与对照组比较，对Klf15表达差异存在非常显著性差异：P-value＝5.09×10-6，而文献报道Klf15能调节肝脏内源性和外源性代谢，调控MMp3的表达，减少肝脏细胞凋亡水平，提示上调Klf15有保肝护肝作用。

Claims (6)

1.黄根单体在制备调控Klf15基因药物中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述黄根单体为HG2、HG3或HG4。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控Klf15基因为上调Klf15基因的表达。
4.黄根单体在制备保肝护肝药物中的应用。
5.根据权利要求4的应用，其特征在于：所述黄根单体为HG2、HG3或HG4。
6.根据权利要求4的应用，其特征在于：所述保肝护肝为通过上调Klf15基因的表达从而调节肝脏内源性和外源性代谢。
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