KR102101468B1

KR102101468B1 - 섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 조성물

Info

Publication number: KR102101468B1
Application number: KR1020180134663A
Authority: KR
Inventors: 노문철; 이승웅; 김학렬; 이소영; 이승재; 정경숙
Original assignee: 한국생명공학연구원
Priority date: 2017-06-30
Filing date: 2018-11-05
Publication date: 2020-04-16
Also published as: KR20190003421A; KR20190003422A; KR20190003434A; KR102084758B1; KR102206591B1; KR101957632B1; KR20190003319A

Abstract

본 발명은 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물에 관한 것으로, 상기 조성물은 상피-간엽 이행을 억제하고, 폐섬유화에 의하여 감소된 폐용적을 증가시키며, 간섬유화 및 산화적 스트레스를 개선하는 효능이 있으므로 섬유화증의 예방, 개선 또는 치료 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

Description

섬유화증 예방, 개선 또는 치료용 조성물{Composition for preventing, improving or treating of fibrosis}

본 발명은 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 섬유화증의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다.

섬유화증(fibrosis)은 정상적인 조직이 파괴되면서 섬유성 결합조직으로 대체되는 섬유화로 인하여 조직의 기능을 상실하는 증상을 말하며, 섬유화 과정이 만성적으로 진행되기 때문에 완벽한 치료가 어려운 실정이다.

섬유화증의 하나인 특발성 폐섬유화증(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)은 만성적으로 진행하는 폐의 섬유화를 특징으로 하는 원인불명의 질환으로 주로 폐에 국한되어 나타나며 조직학적으로 특징적인 통상형 간질성 폐렴(usual interstitial pneumonia, UIP) 소견을 보인다. 이 질환의 유병률은 인구 10만 명당 2 내지 29명으로 알려져 있으며 국내에서는 희귀 난치성 질환으로 지정되어 있다. 상기 질환에 대한 임상 경과는 다양하며, 일반적으로 서서히 진행되는 폐의 기능 저하로 인하여 호흡부전으로 진행하고, 진단 이후 평균 생존기간이 2 내지 3년 이내인 치명적인 질환으로 알려져 있다.

최근 국내에서는 가습기 살균제에 함유된 폴리헥사메틸렌 구아디닌(Polyhexamethylene guanidine, PHMG) 및 염화에톡시에틸구아디닌 (Oligo(2-)ethoxy ethoxyethyl guanidine chloride; PGH)에 노출된 소비자에서 기도 및 폐 손상, 호흡 곤란, 기침 등과 같은 증상을 동반하는 폐섬유화증 환자가 발생하여 사회, 경제적으로 큰 파장을 일으키고 있다. 이러한 파장은 유사물질인 클로로메틸이소티아졸리논(5-chloro-2-methyl-4-isothiazolin-3-one)과 메틸이소티아졸리논(2-methyl-4-isothiazolin-3-one)을 사용한 제품의 판매 중단에까지 이르렀으며, 폐섬유화증의 발병 원인이 명확하지 않음으로 인하여 국민적 불안감이 더욱 증폭되고 있다.

상기 물질들 이외에도 폐섬유화증의 발병 원인으로는 화학물질, 흡연, 미세먼지, 바이러스 감염 및 유전적 요인 등이 위험 인자로 거론되고 있으나, 확실한 발병 인자는 아직까지 밝혀지지 않는 상태이며, 또한 병인기전에 대한 기초 연구가 부족하여 뚜렷한 치료 표적도 아직까지 발굴되지 않은 상태이다.

폐섬유화증의 치료에는 스테로이드(glucocorticoids), 면역 억제제 (immunosuppressive agents) 및 사이토카인 제제(anti-viral cytokines)가 대표적으로 사용되고 있으나, 2011년 특발성 폐섬유화증에 대한 ATS/ERS 가이드라인에 의하면 스테로이드와 면역 억제제인 아자티오프린(azathioprine)의 병용요법이 오히려 사망률을 증가시키는 결과를 보였다.

상기 가이드라인과 같이 면역 또는 염증 억제 방식을 이용하는 기존의 폐섬유화증 치료법은 한계를 보이고 있기 때문에 염증을 억제할 뿐만 아니라 섬유화 진행을 직접 저해하는 약물의 개발이 시급한 실정이다. 최근 섬유화 진행에 중요한 TGF-β 신호전달 체계를 직접적으로 저해하는 물질이 임상시험 중에 있으나, TGF-β는 섬유화를 촉진시키는 역할뿐만 아니라 염증 자체를 억제시키는 작용이 있기 때문에 폐섬유화를 치료하기 위하여 TGF-β를 전반적으로 억제하는 방법은 많은 부작용을 초래할 수 있다.

이러한 배경 하에서 본 발명자들은 독성 및 부작용이 거의 없는 천연물 유래의 섬유화증 예방 및 치료용 물질을 찾기 위해 연구한 결과, 적소두(팥 및 이팥) 추출물이 폐섬유화증 및 간섬유화증을 억제하는 효능이 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

1. 대한민국 등록특허 제10-1478109호

본 발명의 하나의 목적은 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 폐섬유화증 또는 간섬유화증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.

삭제

본 발명의 다른 목적은 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 폐섬유화증 또는 간섬유화증 예방 또는 개선용 개인 위생용품을 제공하는 것이다.

본 발명의 일 양상은 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 폐섬유화증 또는 간섬유화증 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

본 명세서에 사용된 용어, '적소두(赤小豆)'는 콩과 식물인 팥(Phaseolus angularis Wight)의 종자를 의미하는데, 원주 모양으로 조금 납작하고, 종피는 적갈색으로 매끈하여 광택이 있다. 약리활성의 측면에서는 이뇨, 소염, 배농, 해열, 전신부종, 간경화, 황달, 종기, 화농성 질환, 수종, 각기병, 소갈, 이질설사 등의 치료를 위한 민간요법에 사용되어 왔다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 적소두는 팥(Phaseoli angularis Wight) 또는 이팥(또는 덩굴팥, Phaseolus calcaratus Roxburgh)의 종자를 의미하는 것으로 사용될 수 있으나 이에 제한되지는 않는다.

상기 적소두 추출물은 적소두에 용매를 첨가하여 수득한 추출물을 의미하며 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 제조될 수 있다. 예를 들어 적소두를 분쇄한 후 추출에 통상적으로 사용되는 용매를 첨가하고, 적절한 온도와 압력을 가하여 적소두 추출물을 제조할 수 있다. 상기 적소두 추출물은 추출물 원액, 추출물의 희석액 또는 농축액, 추출물을 건조하여 제조되는 건조물, 또는 이들의 정제물 등을 모두 포함한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 용매는 정제수, 헥산, 1,3-부틸렌글리콜, 탄소수 1 내지 4의 알코올, 에틸아세테이트, 디에틸에테르, 디클로로메탄, 아세톤 및 이들의 혼합물로 이루어진 군에서 선택될 수 있으며, 정제수 또는 탄소수 1 내지 4의 알코올을 이용하는 것이 바람직하다.

본 명세서에 사용된 용어, '분획물'은 다양한 구성성분을 포함하는 혼합물로부터 특정 성분 또는 특정 그룹을 분리하는 분획방법에 의하여 얻어진 결과물을 의미한다. 본 발명의 일 실시예에 따르면 적소두의 추출물을 n-헥산, 에틸아세테이트 등의 용매를 이용한 용매 분획방법으로 분획한 결과물일 수 있으며, 극성 용매 분획물과 비극성 용매 분획물을 모두 포함하고, 구체적으로는 헥산 분획물, 에틸아세테이트 분획물 및 물 분획물 등이 모두 사용될 수 있다.

본 명세서에 사용된 용어, '섬유화증(fibrosis)'은 정상적인 조직이 파괴되면서 섬유성 결합조직으로 대체되는 섬유화로 인하여 조직의 기능을 상실하는 증상을 의미하며, 예를 들어 피부에 상처가 생긴 후 섬유화가 발생하는 경우를 '흉터'라고 한다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 섬유화증은 폐섬유화증 및 간섬유화증으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 간섬유화증(liver fibrosis)은 간의 반복적인 손상 및 회복으로 인하여 간 조직이 딱딱하게 굳는 증상을 말한다.

폐섬유화증(pulmonary fibrosis)은 만성적 간질성 폐질환의 일종으로서, 폐조직세포가 섬유세포로 변화되어, 호흡곤란, 기침, 청색증(cyanosis), 곤봉지(clubbing) 등의 증상을 유발하는 질환을 의미한다. 지금까지는 스테로이드계 치료제, 인터페론 감마, 아세틸시스테인, 피르페니돈, 보세탄 등을 치료제로서 사용하고 있으나, 특이적인 치료효과를 나타내는 제제는 아직 보고되어 있지 않다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 폐섬유화증은 급성 및 만성 기관지염, 천식, ssRNA 및 dsRNA 바이러스 감염증, 세균 및 진균 감염증, 폐렴, 폐혈증, 만성폐쇄성폐질환, 폐결핵, 폐(석회화) 결절, 폐기종, 특발성 폐섬유화증 및 간질성 폐질환으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따르면 상기 조성물은 섬유화 과정의 주요 증상의 하나인 상피-간엽 이행을 억제할 수 있으며, 상피-간엽 이행에 관여하는 E-cadherin, N-cadherin, Vimentin, Snail, α-SMA 및 Collagen I의 발현을 억제할 수 있다. 또한, 상기 조성물은 폐섬유화증 동물모델에서 섬유화의 진행을 억제하고, 감소된 폐용적을 증가시킬 수 있으므로 섬유화증 개선 및 치료 용도로 유용하게 이용될 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 '약학적으로 허용되는'이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르브산과 같은 항산화제가 있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).

상기 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있다. 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량'이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다.

삭제

상기 적소두 추출물 또는 이의 분획물은 간독성 지표인 AST(aspartate aminotransferase)와 ALT(alanine aminotransferase)를 수치를 개선하고, 간섬유화증 진행에 의한 세포괴사를 억제하며, 간세포의 산화적 스트레스를 감소시킬 수 있으므로 간섬유화증 예방 및 개선 용도로 유용하게 사용될 수 있다.

본 발명의 다른 양상은 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 폐섬유화증 또는 간섬유화증 예방 또는 개선용 개인 위생용품을 제공한다.

상기 개인 위생용품은 비누, 화장품, 물티슈, 에어프레쉬너, 세정겔 등의 형태로 제조될 수 있으나 이에 제한되지 아니한다.

본 발명의 일 실시예에 따른 적소두 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하는 조성물은 상피-간엽 이행을 억제하여 섬유화의 진행을 지연시키고, 폐섬유화에 의하여 감소된 폐용적을 증가시키며, 간섬유화 및 산화적 스트레스를 개선시킬 수 있다.

도 1은 비소세포폐암(NSCLC) 세포주에 올레아놀린산 아세테이트(oleanolic acid acetate, OAA) 또는 적소두 추출물을 처리한 후 세포 생존율을 측정한 결과를 보여준다.
도 2는 A549 세포에서 EMT(epithelial-mesenchymal transition)를 유도한 후 OAA 투여에 의한 세포 증식 변화를 확인한 결과를 보여준다.
도 3은 A549 세포에서 EMT를 유도한 후 적소두 추출물 또는 OAA를 처리하여 세포 이동 정도를 확인한 결과를 보여준다.
도 4는 A549 세포에서 EMT를 유도한 후 매트리겔을 이용하여 적소두 추출물 및 OAA의 세포 침투 억제 효과를 확인한 결과를 보여준다.
도 5는 A549 세포에 TGF-β1을 처리하여 EMT를 유도한 후 적소두 추출물 또는 OAA 처리에 의한 단백질 발현 변화를 확인한 결과를 보여준다.
도 6은 A549 세포에 IL-6을 처리하여 EMT를 유도한 후 적소두 추출물 또는 OAA 처리에 의한 단백질 발현 변화를 확인한 결과를 보여준다.
도 7은 A549 세포에 TGF-

1를 처리하여 EMT를 유도한 후 적소두 추출물 또는 OAA 처리에 의한 E-cadherin, N-cadherin, Vimentin 및 α-SMA의 발현 변화를 확인한 결과를 보여준다.
도 8은 블레오마이신을 투여하여 폐섬유화증을 유도한 동물모델에서 OAA 투여에 의한 폐섬유화 억제 효과 및 폐용적 변화를 측정한 결과를 보여준다.
도 9는 사염화탄소를 투여하여 급성 간섬유화증을 유도한 동물모델에서 체중, 간 무게, AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase)를 측정한 결과를 보여준다.
도 10은 사염화탄소를 투여하여 간섬유화증을 유도한 동물모델에서 체중, 간 무게, AST(aspartate aminotransferase) 및 ALT(alanine aminotransferase)를 측정한 결과를 보여준다.
도 11은 간섬유화증 동물모델의 간조직을 헤마토자일린&에오신으로 염색한 결과를 보여준다.
도 12는 간섬유화증 동물모델의 간조직에서 마손 삼색 염색(Masson trichrome stain)을 수행한 결과를 보여준다.
도 13은 간섬유화증 동물모델의 간조직에서 유도성 산화질소 합성효소(inducible NO synthase) 및 글루타티온 과산화효소(glutathione peroxidase)의 mRNA 발현량을 측정한 결과를 보여준다.

이하 하나 이상의 구체예를 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 적소두 추출물, 분획물 및 활성 성분의 분리

1-1: 적소두 추출물 제조

적소두(팥 또는 이팥)를 물로 깨끗이 세척하여 그늘에서 건조시킨 후, 와링 블랜더(waring blender)로 분쇄하여 분말로 제조하였다. 적소두 분말 20 ㎏에 메탄올 100 ℓ를 첨가하고, 실온에서 3일 동안 냉침 추출하였다. 3일 후 추출액을 여과지(Whatman, 미국)로 감압 여과하고, 진공회전농축기로 메탄올을 제거하여 적소두 추출물 450 g을 수득하였다.

1-2: 분획물 제조

상기 수득한 적소두 추출물에서 활성 분획물을 분리하기 위하여 적소두 추출물을 물 1ℓ에 현탁시키고, 동량의 n-헥산을 첨가하여 혼합한 후 분획하였다. 이 과정을 4회 반복하여 수가용성 분획물 1ℓ와 n-헥산 가용성 분획물 4ℓ를 수득하였다. 이후, 상기 n-헥산 가용성 분획물을 감압 농축하여 n-헥산 가용 추출물 50 g을 수득하였다.

또한, 상기 수가용성 분획물 1ℓ에 동량의 에틸아세테이트(C₄H₈O₂)를 첨가하여 혼합한 후 분획하고, 이 과정을 3회 반복하여 수가용성 분획물 1ℓ와 에틸아세테이트 가용성 분획물 3ℓ를 다시 수득하였다. 상기 수득한 에틸아세테이트 가용성 분획물을 감압농축하여 에틸아세테이트 가용 추출물 35 g을 수득하고, 남은 수가용성 분획물을 감압농축하여 35 g을 수득하였으며, 이를 물 분획물로 사용하였다.

1-3: 적소두 추출물 및 분획물의 HPLC 분석

상기 실시예 1-1 및 1-2에서 수득한 각각의 적소두 추출물 및 분획물을 대상으로 하여 HPLC 분석을 수행하였다.

HPLC는 Agilent Technologies 1200 series를 사용하였고, 분석용 컬럼은 YMC(일본)의 J'sphere ODSH80(YMC, 4 ㎛, 4.6 ㎜ I.D.x150 ㎜) 컬럼을 사용하였다. 분석용매는 5% 내지 90% 아세토나이트릴(CH₃CN)을 1 ㎖/min 속도로 흘려주면서 210 ㎚에서 분석하였고, 시료는 10 ㎕를 주입하였다. HLPC 분석조건은 하기 표 1에 기재하였다.

시간(분)	용매(%)
시간(분)	CH₃CN	H₂O
0	5	95
15	5	95
25	30	70
30	30	70
50	90	10
70	90	10

HPLC 분석 결과 카테킨-7-글루코피라노시드(catechin-7-glucopyranoside, catechin-7-glu), 루틴(rutin), 올레아놀린산 아세테이트(oleanolic acid acetate, OAA) 및 스티그마스테롤(stigmasterol)의 피크가 각각 5.5, 24.5, 35.5, 35.5분대에 나타나는 것을 관찰할 수 있었으며, 팥 및 이팥의 HPLC 크로마토그램은 상호 유사한 패턴을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.

1-4: 유효성분의 정제

상기 실시예 1-2에서 수득한 n-헥산 분획물 80 g을 헥산:에틸아세테이트(100:1→1:1)로 구성된 단계농도 구배(step gradient) 용매 시스템을 이용하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography)에 적용하여 5개의 활성분획(Fr.1 내지 5)을 수득하였다. 상기 활성분획 중에서 3번 및 4번 분획에 메탄올을 첨가하여 재결정과정을 수행함으로써, 흰색 분말상을 나타내는 2종의 화합물을 정제하였다.

상기 정제한 2종의 화합물을 기기분석(¹H-, ¹³C-NMR, MS) 및 문헌 값(Voutquenne L. et al. Phytochemistry 2003, 64, 781-789; Kongduang D. et al. Tetrahedron letters 2008, 49, 4067-4072)에 적용한 결과 각각 올레아놀린산 아세테이트(oleanolic acid acetate; 화학식 1)임을 확인할 수 있었다.

[화학식 1] 올레아놀린산 아세테이트

4aS,6aR,6aS,6bR,8aR,10S,12aR,14bS-10-hydroxy-2,2,6a,6b,9,9,12a-heptamethyl-1,3,4,5,6,6a,7,8,8a,10,11,12,13,14b-tetradecahydropicene-4a-carboxylic acid acetate

실시예 2: 올레아놀린산 아세테이트 처리에 의한 세포 생존율 변화 확인

상기 실시예 1에서 수득한 적소두 추출물 및 올레아놀린산 아세테이트가 세포 생존율에 영향을 미치는지 확인하기 위하여 MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide]로 세포 생존율을 확인하였다.

비소세포폐암(non-small cell lung cancer, NSCLC) 세포주를 1x10⁴/㎕ 농도로 배지에 부유시킨 후 96-웰 플레이트(96-well plate)에 200 ㎕씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 올레아놀린산 아세테이트(이하, OAA로 기재함; 0, 1, 3, 6, 10 및 30 uM) 또는 적소두 추출물(0, 5, 10, 30 및 60 ng/㎖)을 포함하는 배지를 웰에 200 ㎕씩 첨가하여 각각 24시간 또는 48시간 동안 배양하였다.

배양이 끝난 후 PBS(phosphate buffered saline)에 MTT를 희석(0.5 ㎎/㎖)하여 각 웰에 20 ㎕씩 분주하고, CO₂ 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 4시간 후 MTT 용액을 제거하고, 각 웰에 DMSO(dimethyl sulfoxide)를 200 ㎕씩 분주하여 포르마잔(formazan) 침전물을 5분 동안 용해시킨 다음 595 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과, 적소두 추출물 처리군에서는 세포 생존율에 영향이 없지만, OAA 처리군에서는 OAA의 농도가 증가할수록 세포 생존율이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

도 1은 비소세포폐암 세포에 OAA 또는 적소두 추출물을 처리하여 24시간 또는 48시간 동안 배양한 후 세포 생존율을 측정한 결과를 보여주는 그래프이다.

실시예 3: TGF-β1 유도성 상피-간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition, EMT)에 대하여 OAA 투여에 의한 EMT 억제 효과 확인

상피-간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition, 이하 EMT로 기재함)은 상피세포(epithelial cell)가 간엽세포(mesenchymal cell)로 전환되어 가는 과정으로 폐섬유화증의 발병 과정에서 중요한 역할을 하는 것으로 알려져 있다. EMT가 진행되면 상피세포의 증식 및 이동이 증가하기 때문에 적소두 추출물 및 OAA의 EMT 억제 효능을 하기와 같이 확인하였다.

폐암 유래 세포인 A549 세포 및 섬유아세포인 NIH-3T3 세포를 1x10⁴/㎖로 배지에 부유시킨 후 96-웰 플레이트에 200 ㎕씩 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 각 웰에 TGF-β1을 처리하고, OAA(30 uM) 또는 피르페니돈(Pirfenidone; 0.3 ㎎/㎖)을 포함하는 배지를 200 ㎕씩 첨가하여 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝나면 Cell Counting Kit-8(CCK-8 kit; Dojindo, 일본) 용액을 각 웰에 20 ㎕씩 분주하고, CO₂ 배양기에서 1시간 동안 배양하였다. 이후 450 ㎚에서 흡광도를 측정하였다.

측정 결과, TGF-

1 투여에 의하여 증가된 EMT 관련 세포 증식이 OAA 투여에 의하여 A549 세포 및 NIH-3T3 세포 모두에서 유의적으로 감소된 것을 확인할 수 있었다.

도 2는 A549 세포에 TGF-β1을 투여하여 EMT를 유도한 후 OAA 투여에 의한 세포 증식 변화를 확인한 결과를 보여주는 그래프이다. 도 2에서 Pir은 피르페니돈을 의미하고, 도 2의 A는 A549 세포, 도 2의 B는 NIH-3T3 세포에서 확인한 결과이다.

실시예 4: TGF-β1 유도성 EMT에 대한 적소두 추출물 및 OAA의 효과 확인

4-1. 스크래치 운드 힐링(Scratch wound healing) 방법을 이용한 적소두 추출물 및 OAA의 세포 이동 억제 효과 확인

A549 세포를 6-웰 플레이트에 1x10⁵/㎖로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 24시간 후 200 ㎕ 팁(tip)으로 단일 세포층을 스크래치(scratch)하고, OAA(10 및 30 uM) 또는 적소두 추출물(30 및 60 ㎍/㎖)을 포함하는 배지를 각 웰에 1 ㎖씩 첨가하였다. 48시간 동안 배양한 후 세포의 이동 정도를 현미경으로 확인하고, 이미지를 촬영하였다.

확인 결과 대조군(Control)과 비교하여 TGF-β1을 처리한 세포에서 세포 이동이 증가한 것을 알 수 있었으며, 적소두 추출물 또는 OAA를 처리한 경우 세포 이동이 감소한 것을 확인할 수 있었다. 특히 고농도의 OAA를 처리한 경우 세포 이동이 현저하게 감소하였다.

도 3의 A는 A549 세포에 TGF-β1을 투여하여 EMT를 유도한 후 적소두 추출물 또는 OAA를 처리하여 세포 이동 정도를 촬영한 사진이다.

4-2. ECIS (Electrical Cell-Substrate Impedance Sensing) 방법을 이용한 적소두 추출물 및 OAA의 세포 이동 억제 효과 확인

ECIS는 세포의 형태학적 변화 및 여러 가지 약물에 대한 반응을 실시간으로 모니터링하는 장치이며, TGF-β1 처리에 의하여 세포 이동이 증가하면 저항값이 증가하기 때문에 OAA 또는 적소두 추출물 처리에 의한 세포 이동 변화를 간접적으로 측정할 수 있다.

전극이 장착되어 있는 웰 플레이트에서 A549 세포를 배양하고, 상기 실시예 3-1과 동일한 방법으로 OAA(10 및 30 uM) 또는 적소두 추출물(30 및 60 uM)을 처리하였다. 이 과정에서 발생되는 전류에 대한 저항값(Impedance)의 변화를 측정하였다.

측정 결과 대조군(Con A549)과 비교하여 TGF-β1을 처리한 경우 저항값이 증가하여 세포 이동이 증가하는 것을 알 수 있었으며, OAA를 30 uM 처리한 경우 저항값이 현저하게 감소하여 세포 이동이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

도 3의 B는 A549 세포에 TGF-β1을 처리하여 EMT를 유도한 후 적소두 추출물 또는 OAA를 처리하여 세포 이동 정도를 ECIS로 확인한 결과를 보여주는 그래프이다.

실시예 5: TGF-β1 유도성 EMT에 대하여 적소두 추출물 및 OAA의 세포 침투 억제 효과 확인

트랜스-웰 인서트(Trans-well insert; Corning, 미국)에 매트리겔(matrigel; Corning)을 2 ㎎/㎖로 코팅하였다. 무혈청 배지(serum free media) 100 ㎕에 A549 세포를 약 2x10⁴개가 되도록 희석하고, 여기에 OAA(10 및 30 uM) 또는 적소두 추출물(30 및 60 ㎍/㎎)을 첨가하여 트랜스-웰 인서트에 분주하였다. 리시브 챔버(Receive chambers)에는 10% 혈청을 포함하는 배지를 분주하여 세포를 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 인서트에 남아 있는 세포는 제거하고, 리시브 챔버로 침투한 세포를 크리스탈 바이올렛(crystal violet)으로 염색하여 현미경으로 확인하였다.

확인 결과 대조군(control)과 비교하여 TGF-β1을 처리한 세포의 경우 리시브 챔버로 침투한 세포의 수가 증가한 것을 알 수 있었으며, 이와 반대로 적소두 추출물 또는 OAA를 처리한 세포의 경우 리시브 챔버로 침투한 세포의 수가 감소한 것을 확인할 수 있었다.

도 4는 A549 세포에 TGF-β1을 처리하여 EMT를 유도한 후 매트리겔을 이용하여 적소두 추출물 및 OAA의 세포 침투 억제 효과를 확인한 결과를 보여주는 사진이다.

실시예 6: TGF-β1 유도성 EMT에 대하여 적소두 추출물 및 OAA 처리에 의한 단백질 발현 변화 확인

A549 세포를 6-웰 플레이트에 1x10⁵/㎖로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 OAA(10 및 30 uM) 또는 적소두 추출물(30 및 60 ㎍/㎎)을 포함하는 배지를 각 웰에 1 ㎖씩 첨가하여 다시 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 각 웰에 RIPA 용해 버퍼[50 mM Tris-Cl(pH, 7.4), 1% NP40, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride), 1 ㎍/㎖ aprotinin, 1 ㎍/㎖ leupeptin, 및 1 mM Na₃VO₄]를 500 ㎕씩 첨가하여 4℃에서 15분 동안 세포를 용해시켰다. 다음으로 4℃에서 원심분리(14,000 rpm 및 10분)하여 상등액만을 수거하고, SDS-PAGE(SDS-polyacrylamide gel electrophoresis)로 단백질을 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 막(polyvinylidene difluoride membrane)으로 이동시키고, 일차 항체와 4℃에서 12시간 동안 반응시켰다. 12시간 후 각각의 일차항체에 대한 이차항체와 추가로 반응시킨 후 ECL kit(Thermo Fisher Scientific, 미국)를 이용하여 제조사의 프로토콜에 따라 단백질 밴드를 확인하였다.

확인 결과 TGF-β1 처리에 의하여 증가된 E-cadherin, N-cadherin, Vimentin, Snail, α-SMA 및 Collagen I의 발현이 적소두 추출물 또는 OAA 처리에 의하여 발현이 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

또한, IL-6을 처리한 경우 상기 단백질의 발현 이외에도 인산화된 STAT3의 수준이 증가하지만 적소두 추출물 또는 OAA 처리에 의하여 STAT3의 인산화가 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

도 5는 A549 세포에 TGF-β1을 처리하여 EMT를 유도한 후 적소두 추출물 또는 OAA 처리에 의한 단백질 발현 변화를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

도 6은 A549 세포에 IL-6을 처리하여 EMT를 유도한 후 적소두 추출물 또는 OAA 처리에 의한 단백질 발현 변화를 확인한 결과를 보여주는 그림이다.

실시예 7: TGF-β1 유도성 EMT에 대하여 적소두 추출물 및 OAA 처리에 의한 세포의 형태 변화 확인

A549 세포를 4-웰 플레이트에 1x10⁵/㎖로 분주하여 24시간 동안 배양하였다. 이후 OAA(10 및 30 uM) 또는 적소두 추출물(30 및 60 ㎍/㎎)을 포함하는 배지를 각 웰에 1 ㎖씩 첨가하여 다시 48시간 동안 배양하였다. 배양이 끝난 후 세포를 PBS(phosphate buffered saline)로 세척하고, 4% 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)로 20분 동안 고정하였다. 상기 고정시킨 세포에 TritonX-100(0.2% in PBS)을 첨가하여 상온에서 반응시키고, 5% 정상 염소 혈청(normal goat serum)으로 상온에서 1시간 동안 블록킹(blocking)시켰다. 블록킹 버퍼(blocking buffer)에 1차 항체를 1:200으로 희석하여 4℃에서 12시간 동안 반응시키고, 각각의 일차항체에 대한 이차항체와 90분 동안 추가로 반응시켰다. 반응이 종료한 후 DAPI가 포함된 마운팅 용액(mounting solution)을 분주하여 현미경으로 관찰하고, 이미지를 촬영하였다.

확인 결과, TGF-β1 처리에 의하여 증가된 E-cadherin, N-cadherin, Vimentin 및 α-SMA의 발현이 적소두 추출물 또는 OAA 처리에 의하여 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

도 7은 A549 세포에 TGF-β1을 처리하여 EMT를 유도한 후 적소두 추출물 또는 OAA 처리에 의한 E-cadherin, N-cadherin, Vimentin 및 α-SMA의 발현을 확인한 결과를 보여주는 사진이다.

실시예 8: OAA의 폐섬유화증 억제 효과 확인

8-1. 폐섬유화증 동물모델 제작

마우스의 기도를 절개하고, 블레오마이신(bleomycin; 2 ㎎/㎏)을 50 ㎕ 부피로 기도 내에 주입하였다. 주입 후 절개 부위는 5-0 나일론으로 봉입(suture)하였으며, 블레오마이신을 주입한 후 24시간이 지난 시점에 OAA를 투여하였다. 블레오마이신 주입 후 각각 3일, 7일, 10일, 13일, 17일, 20일 및 21일 차에 마우스를 희생시키고, BALF(broncho-alveolar lavage fluid) 및 폐조직을 분리하여 추가 실험에 이용하였다.

8-2. OAA 투여에 의한 폐섬유화 억제 효과 확인

원추-빔형(cone-beam type)의 평판형 X-선 영상센서(flat-panel detector)를 기반으로 하는 볼륨 CT(computed tomography)를 이용하여 CT 영상을 촬영하였다. 이때 엑스선 발생장치의 관전압 및 관전류는 각각 50 kV와 120 ㎄로 하였다. CT는 한 조사(projection)당 0.5°씩 회전하여 360° 회전에 총 720개의 영상을 촬영하여 재조합하였다. 재조합된 영상은 화상을 구성하는 최소 단위의 화소가 1,024x1,024 픽셀(pixel)이며, 총 512개의 재조합 단층 영상을 얻을 수 있었다.

3D-렌더링 소프트웨어 프로그램인 Xelis(Infinitt Technology, Seoul, Korea)를 이용하여 재조합된 영상을 삼차원으로 확인하였으며, 영상 분석은 시상면(Sagittal plane), 축상면(axial plane) 및 관상면(coronal plane)의 각 방향에서 관찰하였다.

관찰 결과, 블레오마이신을 주입한 경우 폐섬유화가 진행되지만 블레오마이신 주입 후 OAA를 투여한 경우 OAA 농도의존적으로 폐섬유화가 억제된 것을 확인할 수 있었으며, 시간이 경과해도 폐섬유화가 진행되지 않는 것을 알 수 있었다.

도 8은 블레오마이신을 투여하여 폐섬유화증을 유도한 동물모델에서 OAA 투여에 의한 폐섬유화 억제 효과를 보여주는 것으로, 2번째 및 4번째 패널이 재조합 단층 영상을 보여주는 것이다.

8-3. OAA 투여에 의한 폐용적(Lung volume) 변화 확인

폐섬유화가 진행되면 폐용적이 감소하기 때문에 폐섬유화증 동물모델에 OAA를 투여한 후 폐용적을 측정하였다. 그 결과 블레오마이신을 투여하면 폐용적이 감소하지만, OAA를 투여하면 감소된 폐용적이 다시 회복하는 것을 확인할 수 있었다.

도 8은 블레오마이신을 투여하여 폐섬유화증을 유도한 동물모델에서 OAA 투여에 의한 폐용적 변화를 측정한 결과를 보여주는 것으로, 1번째 및 3번째 패널이 폐용적 측정 결과를 보여주는 것이다.

실시예 9: OAA의 급성 간섬유화증 억제 효과 확인

9-1. 급성 간섬유화증 동물모델 제작

체중 200 내지 250 g의 4주령 수컷 SD 랫트(SD rat; 오리엔탈바이오, 서울, 대한민국)를 구입하여 SPF 동물 사육실에서 일정 온도(23±3℃), 습도(55±15%) 및 조사량(7:00시부터 19:00시까지) 조건에서 사육하였다. 랫트는 1주일 동안 안정시킨 후 실험에 사용하였으며, 무작위로 5개 그룹으로 분류하였다: 대조군(생리식염수 투여군; Control, CON), 사염화탄소 단독 투여군(carbon tetrachloride; CCl₄), 사염화탄소&올레아놀린산(oleanolic acid, OA) 병용 투여군(CCl₄+OA 50 ㎎/㎏), 사염화탄소&올레아놀린산 아세테이트 병용 투여군(CCl₄+OAA 10 ㎎/㎏) 및 사염화탄소&올레아놀린산 아세테이트 병용 투여군(CCl₄+OAA 50 ㎎/㎏). OA와 OAA는 정해진 용량으로 3일 동안 매일 경구투여하고, 경구투여 3일차에 사염화탄소(100 ㎕/g)를 복강 투여한 후 24시간 뒤에 랫트를 희생시켰다.

9-2. 급성 간섬유화증 동물모델에서 체중, 간 무게 및 간기능 지표 확인

랫트를 희생시킨 후 체중을 측정하고, 간을 적출하여 무게를 측정하였다. 또한, 심장에서 혈액을 채취하여 4℃에서 원심분리(3000rpm, 15분)하고, 혈청만을 분리하여 자동분석장치(automatic analyzer; Fuji Dry-Chem NX500i, 일본)로 간 기능과 관련된 생화학적 지표인 AST(aspartate aminotransferase)와 ALT(alanine aminotransferase)를 측정하였다. AST와 ALT는 간세포 내에 존재하는 효소로 급성 간 손상시 혈청 내로 유출되며, 혈중 AST와 ALT 수치의 상승은 일반적으로 간 손상을 의미한다.

측정 결과, 도 9에 나타난 바와 같이 CCl₄ 투여군에서는 대조군과 비교하여 체중과 간의 무게가 감소하여 급성 간섬유화가 유발된 것을 알 수 있었다. 또한, CCl₄ 투여군에서는 간 독성으로 인하여 AST 및 ALT 수치가 크게 증가한 반면, CCl₄+OA 병용 투여군 또는 CCl₄+OAA 병용 투여군에서는 증가된 AST 및 ALT 수치가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, CCl₄+OA 병용 투여군보다 CCl₄+OAA 병용 투여군에서 AST 및 ALT 수치 감소 효과가 더 현저하여 OA보다 OAA의 간섬유화 치료 효과가 더 우수한 것을 알 수 있었다.

실시예 10: OAA의 간섬유화증 억제 효과

10-1. 간섬유화증 동물모델 제작

상기 실시예 9-1과 동일한 조건에서 랫트를 사육한 후 무작위로 4개 그룹으로 분류하였다: 대조군(생리식염수 투여군; Control, CON), 사염화탄소 단독 투여군(carbon tetrachloride; CCl₄), 사염화탄소&올레아놀린산 병용 투여군(CCl₄+OA 50 ㎎/㎏) 및 사염화탄소&올레아놀린산 아세테이트 병용 투여군(CCl₄+OAA 50 ㎎/㎏). OA와 OAA는 정해진 용량으로 3주 동안 매일 경구투여하고, 사염화탄소(100 ㎕/100 g)는 주 3회씩 3주 동안 복강 투여하여 22일차 되는 날에 랫트를 희생시켰다.

10-2. 간섬유화증 동물모델에서 체중, 간 무게 및 간기능 지표 확인

랫트를 희생시킨 후 상기 실시예 9-2와 동일한 방법으로 체중, 간 무게, ALT 및 AST 수치를 측정하였다.

측정 결과, 도 10에 나타난 바와 같이 CCl₄ 투여군에서는 대조군과 비교하여 체중과 간의 무게가 감소하여 간섬유화가 유발된 것을 알 수 있었다. 또한, CCl₄ 투여군에서는 대조군에 비해 AST 및 ALT 수치가 현저하게 증가한 반면, CCl₄+OA 병용 투여군 또는 CCl₄+OAA 병용 투여군에서는 증가된 AST 및 ALT 수치가 감소하는 것을 확인할 수 있었다. 특히, CCl₄+OA 병용 투여군보다 CCl₄+OAA 병용 투여군에서 AST 및 ALT 수치 감소 효과가 더 현저하여 OA보다 OAA의 간섬유화 치료 효과가 더 우수한 것을 알 수 있었다.

10-3. 간섬유화증 동물모델의 간조직 병리 분석

랫트를 희생시킨 후 간을 분리하고, 일부를 4% 포름알데하이드로 고정시킨 후 파라핀에 포매하여 파라핀 블록을 제작하였다. 파라핀 블록을 박절하여 간조직 절편을 제작하고, 절편에 헤마토자일린&에오신(hematoxylin & eosin; H&E) 염색 또는 마손 삼색 염색(Masson trichrome stain)을 수행한 후 광학현미경으로 관찰하였다.

헤마토자일린&에오신 염색 결과, 도 11에 나타난 바와 같이 CCl₄ 투여군에서는 간문맥 주위의 세포괴사를 관찰할 수 있었으나, CCl₄+OA 병용 투여군 또는 CCl₄+OAA 병용 투여군에서는 세포괴사 현상이 완화된 것을 확인할 수 있었다.

또한, 마손 삼색 염색으로 간조직 내 콜라겐을 염색한 결과, 도 12에 나타난 바와 같이 CCl₄ 투여군에서는 간세포의 섬유화가 심한 것을 확인할 수 있었다. 반면, CCl₄+OA 병용 투여군 또는 CCl₄+OAA 병용 투여군에서는 섬유화 정도가 완화된 것을 알 수 있었다.

10-4. 간섬유화증 동물모델의 간조직에서 항산화 효소의 발현량 분석

랫트를 희생시킨 후 간을 분리하고, Trizol reagent(Invitrogen; 미국)를 첨가하여 균질화하였다. 여기에 클로로폼을 첨가하여 RNA를 분리한 후 이소프로판올을 첨가하여 침전시켰다. 침전된 RNA를 75% 에탄올로 세척한 후 2100 Bioanalyzer system(Agilent Technologies, 미국)으로 RNA의 농도 및 순도를 측정하였다. 분리한 RNA를 주형으로 하여 Taqman reverse transcription reagents kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)로 cDNA를 합성하였다. 염증성 인자의 발현 정도는 SYBR Green PCR master mix kit(Applied Biosystem, Foster City, CA, USA)를 사용하여 Real-time PCR로 확인하였다.

간세포내 산화스트레스를 확인하기 위해 유도성 산화질소 합성효소(inducible NO synthase, iNOS)의 mRNA 발현량을 측정한 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 CCl₄ 투여군에서 증가한 iNOS 발현량이 CCl₄+OA 병용 투여군 및 CCl₄+OAA 병용 투여군에서는 현저하게 감소하는 것을 확인할 수 있었다.

산화스트레스에 의해 과잉으로 생성된 활성산소는 글루타티온 과산화효소(glutathione peroxidase, GPx)에 의하여 제거된다. GPx의 mRNA 발현량을 측정한 결과, 도 13에 나타난 바와 같이 CCl₄ 투여군에서는 산화적 스트레스 및 간세포 손상에 의해 GPx mRNA의 발현량이 대조군보다 감소한 것을 확인할 수 있었다. 그러나 CCl₄+OA 병용 투여군 및 CCl₄+OAA 병용 투여군에서는 CCl₄에 의해 감소된 GPx mRNA의 발현량이 다시 증가하는 것을 확인할 수 있었다.

상기 결과들을 통하여 올레아놀린산 아세테이트는 사염화탄소에 의해 유발된 간섬유화를 개선하고, 산화적 스트레스 관련 유전자의 발현을 억제하며, 활성산소를 효과적으로 제거할 수 있으므로 간섬유화증 치료 용도로 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims

섬유화증(fibrosis) 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 있어서,
상기 조성물은 적소두 메탄올 추출물 또는 이의 분획물을 유효성분으로 포함하고,
상기 섬유화증은 폐섬유화증 또는 간섬유화증인 것인 섬유화증 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
삭제
제 1 항에 있어서, 상기 분획물은 적소두 메탄올 추출물을 에탄올, 헥산, 에틸아세테이트, 물 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군에서 선택되는 용매로 분획한 것인 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 폐섬유화증은 특발성 폐섬유화증인 것인 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 상피-간엽 이행(epithelial-mesenchymal transition, EMT)을 억제하는 것인 조성물.
삭제
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