CN117720551A - 一种倍半萜类化合物及其制备方法和应用 - Google Patents

一种倍半萜类化合物及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了如下所示从湖北金粟兰中提取的2个结构新颖的倍半萜类化合物和3个已知的倍半萜类化合物及其在制备抗神经炎症药物中的应用及其制备方法。本发明的倍半萜类化合物1‑5显示出抗神经炎症活性，其特征是对IL‑1β和或TNF‑α的表达有抑制作用。因此能够用于制备抗神经炎症药物。本发明为制备具有抗神经炎症活性的一类结构新颖的倍半萜类化合物的生产制备提供了一种新的方法，为开发高效的抗神经炎症药物提供了理想的侯选化合物。

Description

一种倍半萜类化合物及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于化合物提取领域，具体涉及2个结构新颖的倍半萜类化合物和3个已知的倍半萜类化合物及其在制备抗神经炎症药物中的应用。
背景技术
炎症是身体的一种保护性反应，以确保去除有害刺激，以及修复受损组织的愈合过程。体内发生氧化损伤和炎症中枢神经系统已经被发现与许多神经系统疾病有关，如阿尔茨海默病、帕金森病、精神疾病、重度抑郁症等。然而，已知与细胞和组织损伤相关的慢性或未控制的神经炎症会加速过敏性或自身免疫性疾病的进展。目前，大多数黄酮类和多酚类药物已成功应用于临床治疗神经炎症。但其难以穿过血脑屏障，生物利用度低，靶点单一，限制了临床应用。因此，开发脂溶性强、高效、副作用小的新型抗神经炎药物是当务之急。天然产物被证明是抗神经炎症的宝贵来源，引起了有机化学家的广泛兴趣。
发明内容
发明人的研究发现湖北金粟兰乙醇提取物具有抗神经炎作用，从有效部位中分离得到2个结构新颖的倍半萜类化合物和3个已知的倍半萜类化合物，药效学评价显示其具有很好的抗神经炎作用。
本发明解决的技术问题在于提供了2个结构新颖的倍半萜类化合物和3个已知的倍半萜类化合物；
本发明解决的另一技术问题在于提供了2个结构新颖的倍半萜类化合物和3个已知的倍半萜类化合物的制备方法；
本发明解决的又一技术问题在于提供一种药物组合物，其含有上述倍半萜类化合物1-5；
本发明解决的技术问题在于提供一种药物组合物，其含有上述倍半萜类化合物作为抗神经炎药物的应用。
具体讲，本发明涉及的化合物：
本发明涉及的2个结构新颖的倍半萜类化合物和3个已知的倍半萜类化合物的制备方法。
(1)、干燥的湖北金粟兰根部粉末用乙醇室温提取，提取液蒸去乙醇得浸膏。
(2)、把步骤1中的浸膏吸附在硅藻土上，并依次用石油醚，乙酸乙酯和甲醇洗脱，得到三部分。
(3)、将步骤2中的乙酸乙酯部分通过正相硅胶柱分离，用体积比为80:1～0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，利用硅胶薄层板进行合并同类项得到九个组分F.A-F.I。
(4)、将步骤3中组分F.B 11.3g用硅胶580.0g，流动相二氯甲烷/甲醇，100:1/1:1,v/v分离得到八个组分F.B1～F.B8。
(5)、将步骤4中组分F.B32.4 g在硅胶100.0g，流动相石油醚/乙酸乙酯，50:1/1:1,v/v分离得到四个馏分F.B3a～F.B3e。
(6)、将步骤5中组分F.B3c 326.0mg在Sephadex LH-20凝胶，流动相甲醇/水，60％-90％分离得到八个馏分F.B3c1～F.B3c8。
(7)、将步骤6中组分F.B3c563.6 mg进一步通过制备YMC-pack ODS-A柱，流动相MeCN/H2O，70:30，流速为7mL/min的半制备HPLC系统纯化得到2、4和5。采用半制备高效液相色谱法，流动相MeCN/H2O，60:40，流速为7mL/min分离步骤6中F.B3c829.0 mg，得到1和3。
本发明建立了LPS诱导的BV-2细胞小胶质神经炎症模型。采用RT-qPCR检测IL-1β和TNF-α的mRNA水平，这是广泛炎症反应中的两种关键免疫反应介质。化合物2、4和5对IL-1β和TNF-α的表达均有抑制作用，化合物1和3仅对IL-1β的表达有抑制作用。
本发明的另一方面提供了一种药物组合物，其采用选自上述倍半萜类化合物中的一种或多种作为原料，包含治疗有效量的选自上述倍半萜类化合物中的一种或多种作为活性成分，该组合物可以进一步包括药剂学上可接受的药物辅料，例如载体、赋形剂、佐剂和/或稀释剂等。所述药物组合物用于治疗神经炎症等。
本发明的又一方面提供了一种治疗神经炎症的方法，所述方法包括向需要该治疗的对象给药治疗有效量的选自上述倍半萜类化合物中的一种或多种或者上述药物组合物。
有益效果
基于该类倍半萜化合物在化学结构新颖、生物活性显著等方面的优点，使其具有很好的开发前景，有望发展成为结构新颖的针对性治疗神经炎症等方面的药物。
附图说明
图1是化合物1-2关键的1H–1H COSY和HMBC相关，其中加粗黑色实线表示的是1H–1HCOSY二维核磁相关，单箭头表示的是HMBC二维核磁相关。进而确定新颖倍半萜类化合物1和2的结构。
图2是化合物2、4和5在不同的浓度条件下的抗神经炎活性测定及其作用机制的研究结果。(A-F)RT-qPCR检测化合物2、4和5对IL-1β和TNF-αmRNA表达的影响。(G)分别进行p-IKBα/IKBα(H)和p-p65/p65(I)的免疫印迹和光密度分析。与Con组比较*p<0.05，**p<0.01；与Mod组相比#p<0.05和##p<0.01。
图3是化合物1和3的体外抗神经炎作用结果。分别为RT-qPCR检测化合物1和3对IL-1β和TNF-αmRNA表达的影响。
具体实施方式
下面的实施及药理活性实验进一步说明本发明，但并不意味着对本发明的任何限制。
干燥的湖北金粟兰根部粉末用乙醇室温提取，提取液蒸去乙醇得浸膏。把浸膏吸附在硅藻土上，并依次用石油醚，乙酸乙酯和甲醇洗脱，得到三部分。将乙酸乙酯部分通过正相硅胶柱分离，用体积比为80:1～0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，利用硅胶薄层板进行合并同类项得到九个组分F.A-F.I。将组分F.B 11.3g用硅胶580.0g，流动相二氯甲烷/甲醇，100:1/1:1,v/v分离得到八个组分F.B1～F.B8。将组分F.B32.4 g在硅胶100.0g，流动相石油醚/乙酸乙酯，50:1/1:1,v/v分离得到四个馏分F.B3a～F.B3e。将组分F.B3c 326.0mg在Sephadex LH-20凝胶，流动相甲醇/水，60％-90％分离得到八个馏分F.B3c1～F.B3c8。将组分F.B3c563.6 mg进一步通过制备YMC-pack ODS-A柱，流动相MeCN/H2O，70:30，流速为7mL/min的半制备HPLC系统纯化得到2、4和5。采用半制备高效液相色谱法，流动相MeCN/H2O，60:40，流速为7mL/min分离组分F.B3c829.0 mg，得到1和3。
上述化合物采用高效液相HPLC进行精细分离，柱子：YMC-pack ODS-A，250×20mm，S-5μm，12nm，流速为7mL/min。
化合物1-5的结构鉴定
对新颖化合物1、2进行结构分析测试，得到以下理化性质数据：
化合物1:Colorless crystals(MeOH)；m.p.169-170℃；[α]D 25＝+56.4(c＝0.05inMeOH)；1H and13C NMR data,see Tables 1and 2；IR:νmax＝1683cm-1(C＝O)；UV(MeOH):λmax(logε)＝245(0.86)nm；(+)-HRESIMS:m/z 279.1222[M+H]+(calcd for C15H19O5,279.1227).
化合物2:Colorless crystals(MeOH)；m.p.170-171℃；[α]D 25＝+51.20(c＝0.05in MeOH)；1Hand 13C NMR data,see Tables 1and 2；IR:νmax＝3434cm-1(O-H),1762cm-1(C＝O)；UV(MeOH):λmax(logε)＝206(0.26),275(0.67)nm；(+)-HRESIMS:m/z 285.1089[M+Na]+(calcd for C15H18O4Na,285.1097).
Table 1
1H NMR spectroscopic data of compounds 1-2 in CDCl3(δH in ppm,Jin Hz,Measured at 600MHz).
Table 2
13C NMR spectroscopic data of compounds 1-2 in CDCl3(δC in ppm,Measured at 150MHz).
化合物1、2、3、4和5的抗神经炎活性测定
研究发现倍半萜类化合物具有广泛的药理活性，并且该类化学成分结构新颖、分布广泛，一直是天然药物化学研究的热点。以下是对于倍半萜类化合物进行的抗神经炎作用的测定工作。
1、细胞培养、刺激和治疗
BV-2小鼠小神经胶质细胞在添加10％胎牛血清和1％抗生素的DMEM培养基中培养，并在提供5％CO2的细胞培养箱中于37℃保存，细胞(1×105个/孔)接种于6孔板，然后进行后续实验。
2、定量逆转录聚合酶链反应
用TRIzolTM试剂提取培养的BV-2细胞的全部RNA样本。RNA通过微孔板阅读器定量，随后使用Evo M-MLV逆转录酶预混料转化为cDNA。然后按照制造商的说明，使用SYBR GreenPro Taq HS qPCR试剂盒进行RT-qPCR检测，检测mRNA水平。
3、蛋白质印迹分析
全部蛋白样品用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA缓冲液提取。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，然后用10％的聚丙烯酰胺凝胶分离约60μg的蛋白质，并将其转移到PVDF膜上，在5％无脂乳液中阻断后，用对IKBα、p-IKBα、NF-κB p65、p-NF-κB p65、β-actin有反应的一抗孵育，随后用二抗孵育，最后，用ECL试剂盒对膜进行可视化处理，并用ImageJ软件进行分析。
4、统计分析
采用GraphPad 9.0软件进行统计分析。所有数据均以至少3个生物重复的均数±标准差SD表示，并采用单因素方差分析ANOVA进行分析。P<0.05为差异有统计学意义。

Claims (3)

1.一种倍半萜类化合物，从湖北金粟兰根部中提取，其特征在于具有如下所示结构：
2.权利要求1上图所述倍半萜类化合物的制备方法，包括以下步骤：
(1)、干燥的湖北金粟兰根部粉末用乙醇室温提取，提取液蒸去乙醇得浸膏；
(2)、把步骤1中的浸膏吸附在硅藻土上，并依次用石油醚，乙酸乙酯和甲醇洗脱，得到三部分；
(3)、将步骤2中的乙酸乙酯部分通过正相硅胶柱分离，用体积比为80:1～0:1的石油醚-乙酸乙酯混合溶剂进行梯度洗脱，利用硅胶薄层板进行合并同类项得到九个组分F.A-F.I；
(4)、将步骤3中组分F.B 11.3g用硅胶580.0g，流动相二氯甲烷/甲醇，100:1/1:1,v/v分离得到八个组分F.B1～F.B8；
(5)、将步骤4中组分F.B32.4 g在硅胶100.0g，流动相石油醚/乙酸乙酯，50:1/1:1,v/v分离得到四个馏分F.B3a～F.B3e；
(6)、将步骤5中组分F.B3c 326.0mg在Sephadex LH-20凝胶，流动相甲醇/水，60％-90％分离得到八个馏分F.B3c1～F.B3c8；
(7)、将步骤6中组分F.B3c563.6 mg进一步通过制备YMC-pack ODS-A柱，流动相MeCN/H2O，70:30，流速为7mL/min的半制备HPLC系统纯化得到2、4和5采用半制备高效液相色谱法，流动相MeCN/H2O，60:40，流速为7mL/min分离步骤6中F.B3c829.0 mg，得到1和3
3.权利要求1或2中如上图所示的倍半萜类化合物1-5在制备抗神经炎药物中的应用。
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