CN113908170A - miR2911在制备抗EV71的药物中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了miR2911在制备抗EV71的药物中的应用。本发明根据前期研究积累及相关预实验，提出传统中药金银花抗EV71病毒的主要组分是其中含有的高稳定性高丰度的miR2911，并且预期可以阐明miR2911作用于EV71病毒VP1基因，抑制VP1蛋白的表达，最终抑制病毒的复制从而到达抗病毒效果的具体分子机制。通过本项目的研究，预期可为中药金银花抗EV71病毒的研究提供基于植物miRNA的新思路，还可能为临床治疗EV71重症患者提供基于miRNA的新方法。
Description
技术领域
本发明属于生物药物领域，涉及miR2911在制备抗EV71的药物中的应用。
背景技术
肠道病毒71型(Enterovirus 71，EV71)属于小RNA病毒科(Picornaviridae)，人类肠道病毒A组。EV71是手足口病(Hand,Foot,and Mouth Disease,HFMD)最主要的病原体之一，我国报告的HFMD病例中，40％左右是由于EV71感染引起的，重症和死亡的HFMD病例中，EV71 感染的构成比更达到74％和93％。HFMD一年四季都可发生，春夏多发且主要感染5岁以下儿童，急性起病，潜伏期3-5天，大多数患儿以发热和手、足和口腔等部位的皮疹或疱疹为主要特征，该病为自限性疾病，多数患儿一周左右自愈，少数患儿可能会出现中枢神经系统、呼吸系统损害，引发无菌性脑膜炎、脑炎、急性驰缓性麻痹、神经源性肺水肿和心肌炎等，个别重症患儿病情进展快，容易发生死亡。EV71感染疾病是全球性传染病，世界大部分地区均有此病流行的报道。
EV71血清型多，抗原易发生变异，对一般抗生素不敏感，因此目前临床上并没有针对EV71 感染的特效药，只能对症治疗。外源性干扰素、IL-2等能抑制病毒复制，提高机体细胞免疫功能，但费用昂贵，目前仍在基础研究和临床试验阶段。常用的抗病毒西药主要有病毒唑、利巴韦林、阿昔洛韦、更昔洛韦等，有一定疗效但不良反应大，长期应用对机体损害大且存在耐药性。我国自主研发的EV71灭活疫苗虽已批准上市，但其为二类疫苗且尚未在全国范围内推广，临床预防效果仍不明确。
中药金银花为忍冬科植物忍冬(Lonicera Japonica Thunb)的干燥花蕾，于1963年版中国药典首次收载。金银花性甘、寒，归肺、心、胃经，其药用历史悠久，有“中药中的抗生素”之称，具有清热解毒、疏散风热的功效，可用于治疗痈肿疔疮、喉痹、丹毒、热毒血痢、风热感冒和温热发病。根据文献资料，金银花入药最早出现在晋代葛洪的《肘后备急方》中，以“忍冬”为名，其后陶弘景的《名医别录》中也有记载，“忍冬，味甘温，无毒，列为上品，主治寒热身肿”。而“金银花”这一名词则首载于宋代的《苏沈内翰良方》，“其四月开花，极芬，香闻数步，除开白色，数日则变黄，每黄白相间，故名金银花”。在宋代及以前多以忍冬的藤、叶入药，而到了明代，对花的应用越来越多，并逐渐发展至茎、叶和花并用。李时珍的《本草纲目》记载，“忍冬茎叶及花功用皆同。昔人称其治风、除胀、解痢为要药，后世称其消肿，散毒、治为要药”。而明代以后，随着人们对温病学的认知，对金银花功效的掌握更加全面，更强调用花，清朝张璐的《本经逢源》中写道，“金银花主下痢脓血，为内外臃肿之要药。解毒祛脓，泻中有补，痈疽溃后之圣药”。《得配本草》也写道“藤、叶皆可用，花尤佳”。后来，忍冬的茎叶逐渐分化为另一种独立的药材——忍冬藤。
近年来，中外学者对金银花化学成分和生物活性物质研究较多，其现代药理学研究表明，金银花具有广谱抗菌、抗病毒、解热、抗炎、保肝利胆、止血等药理作用。然而，现有研究成果对于金银花抗病毒的有效成分主要集中于其含有的绿原酸、异绿原酸和咖啡酰奎宁酸等化学单体，对于这些化学单体组分以外的抗病毒物质，目前几乎未见报道，对于金银花抗EV71的详细分子机制也尚未阐明。
发明内容
本发明的目的是针对现有技术的上述不足，提供miR2911在制备抗EV71的药物中的应用。
本发明的另一目的是提供金银花总RNA提取物在制备抗EV71的药物中的应用。
本发明的目的可通过如下技术方案实现：
miR2911在制备抗EV71的药物中的应用。
金银花总RNA提取物在制备抗EV71的药物中的应用。
一种抗EV71的药物组合物，其特征在于包含miR2911及药用辅料。
有益效果：
本发明首次发现并提出传统中药金银花抗EV71病毒的主要组分是其中含有的高稳定性高丰度的miR2911，可为中药金银花抗EV71病毒的研究提供基于植物miRNA的新思路，还可能为临床治疗EV71重症患者提供基于miRNA的新方法。
附图说明
图1.金银花水提物和绿原酸抗EV71效果。
图2.金银花和金银花汤中小RNA高通量测序结果。(A)干金银花中miRNA分布；(B)金银花汤中miRNA分布。
图3.金银花干花和鲜花及相应汤剂中miR2911含量的检测。(A)Northern blot检测结果；(B) Real-time RT-PCR检测结果。
图4.miR2911稳定性研究。(A)miR167(control)和miR2911在热水和血清中稳定性试验；(B) 金银花提取miR2911，合成miR2911及两种突变miR2911在血清中稳定性试验。
图5.靶点验证。(A)靶点预测；(B)Luciferase assay。
图6.靶点验证免疫共沉淀实验。
图7.miR2911对EV71抑制作用预实验
具体实施方式
实施例1绿原酸和金银花水提物在细胞水平抗EV71预实验
在使用终浓度为20ug/ml的绿原酸时，培养物中的病毒滴度与PBS组无显著差异，而加入金银花水提物(细胞培养液含约0.2g干花/ml)具有较强的抑制EV71病毒作用(图1)。以上预实验提示，金银花抗EV71有效物质并非绿原酸，还有其它有效成分。
实施例2金银花中小RNA高通量测序
用Solexa深度测序方法检测金银花及金银花汤剂中是否能稳定存在高丰度的miR2911。我们用10克金银花及10克金银花煎制后的总RNA用植物总RNA提取试剂盒(Bioteke,RP3311)进行提取。将这些RNA中小于30个碱基的小RNA用15％尿素变性聚丙烯酰胺电泳分离并纯化回收。将这些小RNA两端加上接头后预扩增，最后用Illumina GenomeAnalyzer深度测序。结果提示金银花中存在高丰度的多种植物miRNA(包括miR2911)，但经过传统方法煎制后，只有miR2911 仍具有较高含量，其余植物miRNA都基本降解，提示miR2911具备高丰度和高稳定性，为其抗EV71病毒提供了基本的可能性(图2)。
实施例3miR2911在不同样本中含量检测
首先根据miR2911序列，分别合成特异性茎环TaqMan探针及引物，用Real-timeRT-PCR 方法检测金银花及金银花汤剂中所提取的总RNA中miR2911的绝对浓度，具体方法如下：用植物总RNA提取试剂盒(Bioteke,RP3311)提取金银花及金银花汤中总RNA，用AMV及特异性RT引物将2μg RNA逆转录成cDNA(20μl反应体系)，取2μl cDNA按如下条件进行Real-time PCR检测：95℃2min；95℃15s，58℃30s，72℃1min，40个循环。根据检测结果，用人工合成miR2911做标准曲线计算样本中miR2911的绝对含量。
为进一步确认Real-time RT-PCR结果，我们用Northern blot方法对样本中miR2911加以检测。我们将从10克金银花及10克金银花煎制后的总RNA用尿素变性PAGE胶分离，转膜固定后与地高辛标记的对应探针杂交24小时，洗膜后曝光，显影，根据RNA marker判断在20nt 处是否有特异性杂交信号。此外，我们拟用30pmol、7.5pmol、1.5pmpl和0.75pmol RNA标准品作为对照，以确定miR2911相对含量。
对金银花和金银花汤中miR2911的含量用Northern blot和Real time RT-PCR检测，发现在金银花干花和鲜花及相应汤剂中，都存在较高浓度的miR2911(图3)。
实施例4
以miR167作为对照，发现其在热水及血清中都具有很高的稳定性(图4A)。关于其高稳定性的成因，我们推测是由于其本身序列高GC含量所致(GGCCGGGGGACGGACUGGGA)。根据推测，我们合成了两种在不同位置引入突变的miR2911突变RNA，发现提取于金银花和人工合成的miR2911在血清中都具有高稳定性，而突变后的RNA由于其GC含量降低，很容易降解，提示我们miR2911本身的序列特点是其高稳定性的原因(图4B)。
实施例5
(1)miR2911在EV71病毒中靶基因生物信息学预测
将NCBI数据库中EV71中国流行株(EV71 BrCr株)3’-UTR序列和miR2911序列(5′ -GGCCGGGGGACGGACUGGGA-3′)分别导入RNAhybrid在线软件，设定窗口大小为100nt，递进单位10nt，设定每个结合靶点最低得分为115，其窗口值最低为-25kcal/mol。根据上述参数，最终预测到miR2911可能结合到VP1基因mRNA 3’-UTR区域的具体序列信息及相关结合自由能，将预测到的可能靶点进行后续研究。预测结果显示miR2911种子序列可以和EV71病毒VP1基因 mRNA 3’-UTR区域特异性结合且结合能量达到-38.9kcal/mol(图5，左)。
(2)VP1 mRNA 3′-UTR荧光素酶报告质粒的构建
取EV71感染RD细胞48h后总RNA 1μg,用oligo d(T)15引物和AMV逆转录酶42℃逆转录30分钟，所得cDNA用Pfu高保真酶PCR扩增，引物为：Forward primer:TTGAGTTGGGTAGCATATC,Reverse primer:CTGGAAGAGGACATAAGC。PCR反应条件：94℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃45s，30个循环；72℃10min。所得PCR产物在1％琼脂糖胶电泳后，切胶回收，与T载体连接，转化感受态细菌，获得VP1 3′-UTR的T载体克隆，随后将T 载体用SpeI和HindIII双酶切，回收DNA片段，亚克隆到pGL3质粒。测序验证序列的准确性。利用点突变技术，对该载体的miR2911结合位点突变为互补序列，重新构建到pGL3质粒。用无内毒素的质粒提取试剂盒抽提总量200ug的质粒用于后续的细胞转染实验。
(3)荧光素酶活性和β-gal酶活性的检测
HEK293T细胞按1.0×104每孔的密度接种到24孔板，24小时后，用lipofectamine2000 (Invitrogen)分别将miR2911分子或NC分子以及荧光素酶质粒和β-gal对照质粒同时转染 HEK293T细胞。每组3个孔，剩余的未转染荧光素酶质粒和β-gal对照质粒的细胞作为空白对照。6小时后换成新鲜培养液，24小时后，每孔用100μl裂解液裂解细胞，液氮冻融2次后，简单离心转移上清到新的离心管中。按下面方法进行检测：
a)混匀后,取30μl加到270μl含有Mg2+和ONPG的0.1M的磷酸盐缓冲液中，37℃孵育30分钟,加入500μl 1M碳酸钠溶液终止反应，在420nm处检测吸光值，所得吸光度数值即是β-gal酶活性的数据。
b)混匀后,逐个取20μl加到100μl含有荧光素酶底物的溶液中，混匀，在荧光分光光度计上检测荧光强度，所得数值即是荧光素酶活性的数据。将荧光素酶活性的数据用β-gal酶活性的数据校正后，即得所需实验数据。
荧光素酶实验初步验证了靶点(图5，右)，以上实验结果表明VP1基因可能是miR2911的作用靶点。
实施例6免疫共沉淀(co-IP)
按照以下实验方法进行：
a)细胞用预冷的PBS洗涤细胞两次，最后一次吸干PBS，加入预冷的裂解Buffer；
b)冰上裂解30min，中间用移液器吹打3次；
c)12000g离心15min，立即将上清转移到一个新的离心管；
d)BCA法测定蛋白浓度；
e)将蛋白浓度调至1μg/μl,加3μg mouse monoclonal anti-Ago2抗体到500ul总蛋白中，以正常的鼠IgG为negative control；
f)4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜；
g)准备Protein A/G agarose，用PBS洗3遍珠子，然后用PBS配制成50％浓度；
h)加入100μl Protein A琼脂糖珠来捕捉抗原抗体复合物，4℃缓慢摇动抗原抗体混合物过夜；
i)3000rpm离心2min，收集琼脂糖珠-抗原抗体复合物，去上清，用预冷的RIPAbuffer洗 4遍，800μl/遍；
j)用60μl 1×上样缓冲液将琼脂糖珠-抗原抗体复合物悬起，煮沸5min做SDS-PAGE或 Western，或者加入500ul Trizol reagent裂解提RNA，做qRT-PCR。
实验结果显示miR2911可以和VP1 mRNA在RISC中特异性结合，进一步提示VP1是miR2911 的靶基因(图6)。
实施例7金银花汤剂及人工合成miR2911在细胞水平对EV71病毒抑制作用
将RD细胞接种于96孔板，待次日细胞生长覆盖率达70％～80％用Lipofectamine分别转染人工合成随机RNA、miR2911、金银花总RNA提取物及无miR2911金银花总RNA提取物(加入anti2911，特异性去除miR2911)，6h后用EV71感染细胞(MOI＝0.5)，37℃、5％CO2条件下吸附1h，弃病毒稀释液，设空白对照组和病毒感染对照组，每组3个复孔，37℃、5％CO2条件下培养24、48和72h后收集细胞上清液于-20℃保存，测TCID50。检测结果显示，miR2911、金银花总RNA提取物可有效抑制EV71病毒的复制，而随机RNA及无miR2911金银花总RNA 提取物(加入anti2911，特异性去除miR2911)几乎无抑制作用，初步提示金银花中内源miR2911是其抗EV71病毒的主要成分(图7)。
Claims (3)
1.miR2911在制备抗EV71的药物中的应用。
2.金银花总RNA提取物在制备抗EV71的药物中的应用。
3.一种抗EV71的药物组合物，其特征在于包含miR2911及药用辅料。
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