CN112933100B - 去甲泽拉木醛在白癜风药物上的应用及其软膏 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物医学技术领域,涉及去甲泽拉木醛在白癜风药物上的应用及其软膏,本发明确定了雷公藤单体去甲泽拉木醛在治疗白癜风方面的有效治疗作用;药物中活性成分去甲泽拉木醛通过降低炎性刺激和氧化应激下角质形成细胞趋化因子CXCL9/10/16的生成和分泌,抑制CD8+T细胞的皮肤迁移、活化、增殖及分化治疗白癜风。该药物可以制作成口服给药的内用型剂型,或非口服给药的注射剂,或外用剂型,制备的药物用于治疗白癜风,该软膏毒性低、效果好,为今后白癜风靶向治疗药物的研发奠定基础。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学技术领域,尤其涉及去甲泽拉木醛在白癜风药物上的应用及其软膏。
背景技术
白癜风是以表皮黑素细胞破坏为特征的色素脱失性常见的慢性、获得性、自身免疫性皮肤病。其皮损典型的临床表现为皮肤及黏膜部位边界清楚的色素脱失斑,皮损可分布全身,通常多分布于口周、眼周、手指、足背等部位,并可出现毛发的变白。目前本病全球发病率大约为0.5-1%,其中有报道印度发病率最高,约为8.8%,其次是墨西哥,约2.6-4%、日本发病率约0.06%-2.3%。我国国内的一项大样本流行病学调查结果显示在2004年陕西地区白癜风患病率约为0.09%。
白癜风是一个严重危害心理健康的疾病,特别是深色皮肤的患者更易被人注意。因常发生在面部和手部等暴露区域,对患者自尊和自我感受都有重大影响。很多患者担心病情的恶化,影响他们的社会生活,并且感到困窘、沮丧。白癜风的治疗目前主要根据患者病情的分型和分期不同而采用外用药物(如糖皮质激素、免疫调节剂等)、系统用药(如糖皮质激素、抗氧化剂等)、光疗及手术治疗等,但是由于白癜风发病机制尚不清楚,国际上缺乏针对白癜风发病关键环节进行治疗的药物,故尽管目前白癜风临床治疗手段众多,但是治疗周期长、疗效差、易反复,并且花费较高、耗费精力,最终疗效却尚难以让人满意,故而严重影响患者的身心健康,同时也给患者和社会带来巨大经济负担。因此,急需研究出白癜风的发病机制、研发出疗效好的靶向治疗药物。
雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)为卫矛科藤本植物,具有祛风活络,破淤止痛等功效,临床常用于类风湿性关节炎的治疗。雷公藤的化学成分复杂,故药材提取以单一成分为指标时,难以保证其质量,特别是部分单体如雷公藤红素和雷公藤甲素存在毒副作用过大、致突变性较强的缺陷,因此限制了雷公藤在临床上的应用。雷公藤中分离到一种分子量为480,分子式为C29H36O6的酚性去甲基三菇化合物,定名为去甲泽拉木醛。已证实去甲泽拉木醛在急性和亚急性毒性实验中,提示其有较大的值,与目前所知的从雷公藤分离出的单体化合物雷公藤内酷醇、雷公藤红素以及有效部位雷公藤多普相比较,去甲泽拉木醛毒性作用最低。去甲泽拉木醛在大剂量应用时,可能的毒性靶器官是肠、肝和骨髓,毒性作用与剂量成正相关,但给予小鼠应用20mg/kg口服时,未出现明显的毒性副作用。
因此,我们目前急需一种毒性低、效果好的白癜风治疗药物。
发明内容
有鉴于此,本发明的目是提供去甲泽拉木醛在白癜风药物上的应用及其软膏,制备的药物用于治疗白癜风,该软膏毒性低、效果好,为今后白癜风靶向治疗药物的研发奠定基础。
本发明通过以下技术手段解决上述技术问题:
去甲泽拉木醛在制备白癜风药物上的应用。
进一步,所述去甲泽拉木醛用于降低炎性刺激和氧化应激下角质形成细胞趋化因子CXCL9/10/16的生成和分泌。
进一步,所述去甲泽拉木醛用于抑制CD8+T细胞的皮肤迁移、活化、增殖及分化。
进一步,所述去甲泽拉木醛提取自雷公藤。
进一步,所述药物包含去甲泽拉木醛、药学上可以接受的载体和/或赋型剂,按照常规方法制成经口服给药的内用型剂型,或非口服给药的注射剂,或外用剂型。
进一步,所述药物还可以用于治疗红斑狼疮、银屑病等自身免疫性皮肤病。
进一步,所述去甲泽拉木醛在角质形成细胞和CD8+T细胞中的安全有效浓度为0.1-2.0μM。
进一步,所述去甲泽拉木醛的提取方法包括如下步骤:
S1:提取,将雷公藤药材粉碎,过筛,按料液比1:10(kg/L)加入去离子水,调节pH,加入纤维素酶、果胶酶进行酶解,酶量为原料质量的7%,酶解温度25-60℃,酶解时间1.5h。反应液过滤后收集滤渣,加入3-10倍量的60-80wt%的乙醇液超声提取2-3次,合并提取液,浓缩得浸膏;
S2:纯化,向S1步骤中的浸膏中加入适量pH=7.5-9的碱液溶解,过滤,取滤液加酸调节至pH=5-7,再加入1-3倍量的乙酸乙酯萃取2-3次,合并萃取液,蒸干得去甲泽拉木醛粗品;
S3:精制,将S2步骤获得的去甲泽拉木醛粗品采用高效液相色谱法分离,色谱柱:十八烷基键和硅胶,流动相:乙腈-水(40-55∶45-60),以示差折光检测器监视指导产品收集,收集液浓缩干燥得到去甲泽拉木醛提取物。
本申请经过大量的实验验证得出了提取去甲泽拉木醛的最佳工艺流程,提取得到的去甲泽拉木醛纯净度高,有效减小了去甲泽拉木醛的毒性。
进一步,所述提取的去甲泽拉木醛用于制备白癜风软膏,包括以下重量份的原料:10-15份去甲泽拉木醛、10-20份水杨酸、10-20份透明质酸钠、30-70份甘油、20-30份凡士林、5-15份羊毛脂。
进一步,将去甲泽拉木醛加入含0.1wt%的DMSO蒸馏水中,超声波溶解混匀,得到去甲泽拉木醛溶液,所述去甲泽拉木醛的药物浓度为10-20μg/ml;
称取液状石蜡、水杨酸、甘油、凡士林、硬脂酸、尼泊金乙酯用蒸馏水稀释,搅拌混匀后,滴入碳酸钠搅拌调节至中性,于20℃保温得到基质溶液;
将去甲泽拉木醛溶液分成均等两份,一份以压力为0.02-0.03Mpa、流速为0.3L/min的速度喷至基质溶液中,于20℃的温度下搅拌15min后将另一份去甲泽拉木醛溶液以0.04-0.05Mpa、流速为0.4L/min的速度喷至其中,再次于20℃搅拌15min后,于频率为20kHz,功率为200W的条件下超声分散20min,随后加热至40℃保温2h,得到乳膏,装入无菌容器中密封保存。
本发明的有益效果:
(1)本发明确定了去甲泽拉木醛在治疗白癜风方面的有效治疗作用。
(2)本发明还提供了从雷公藤中提取去甲泽拉木醛的最佳工艺,该方法提取的去甲泽拉木醛纯度高,可减小其毒性,克服了雷公藤由于成分复杂、单体作用不一、有些单体甚至有毒而限制其在白癜风临床治理中的应用的难题。
(3)去甲泽拉木醛一方面通过JAK1/3-STAT3/5通路降低CD8+T细胞活化和效应功能;另一方面通过靶向氧化应激下NF-κB-CXCL16和IFN-γ刺激下JAK-STAT1-CXCL9/10通路,阻断CD8+T细胞皮肤迁移,保护黑素细胞免受免疫损伤,这为白癜风的治理提供了安全、有效的靶向治理药物,并为自身免疫性皮肤病如红斑狼疮、类风湿性关节炎和银屑病等的治疗提供了新的方法。
(4)制备的去甲泽拉木醛软膏常温静置30天以上药效仍然稳定,未出现分层、沉淀等现象,保存时间长,保存方便。
附图说明
图1:T-96和Tofa对CD8+T细胞杀伤功能的影响结果图;
图2:计算机分子模拟技术发现T-96可以和JAK2结合图;
图3:计算机分子模拟技术发现T-96可以和NF-κB结合图;
具体实施方式
以下将结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明:
实施例1:去甲泽拉木醛提取制备
S1:采取新鲜雷公藤洗净表面污泥,切成小段,再用蒸馏水清洗干净,减压干燥后将雷公藤药材粉碎,过筛,加入纤维素酶、果胶酶进行酶解,酶量为原料质量的7%,酶解温度为30℃,酶解时间1.5h。反应液过滤后收集滤渣,加入5倍量的60wt%的乙醇液超声提取3次,合并提取液,浓缩得浸膏;
S2:向S1步骤中的浸膏中加入适量pH=8的碱液溶解,过滤,取滤液加酸调节至pH=7,再加入2倍量的乙酸乙酯萃取3次,合并萃取液,蒸干得去甲泽拉木醛粗品;
S3:将S2步骤获得的去甲泽拉木醛粗品采用高效液相色谱法分离,色谱柱:十八烷基键和硅胶,流动相:乙腈-水(40-55∶45-60),以示差折光检测器监视指导产品收集,1h后沉析分离除去杂质并脱除残留溶剂,收集液浓缩干燥得到去甲泽拉木醛提取物,取出粉碎得到去甲泽拉木醛,用高效液相色谱法测得其纯度为98.5%。
实施例2:去甲泽拉木醛对白癜风患者CD8+T细胞的增殖、活化及杀伤影响实验
实验用白癜风患者外周血来源于西京医院皮肤科白癜风专科门诊,纳入非节段型白癜风患者外周血共10例,纳入标准:
1)符合中国中西医皮肤性病学色素病学组于2014年修订的白癜风诊断、临床分型及疗效判定标准;
2)受试者自愿参加本次研究并签署知情同意书。
排除标准:
1)患器质性功能障碍者;
2)肝、肾功能异常;
3)患有其他自身免疫性疾病;
4)近半年患有感染性疾病;
5)近期有过糖皮质激素或免疫抑制剂治疗者。
采集进展期白癜风患者外周血后,采用Ficoll密度分离法从外周血分离出外周血单核细胞(PBMCs),流式细胞术分选出CD8+T细胞,用于相关实验。
Ficoll密度分离法分选细胞的具体操作如下:
使用等体积PBS缓冲液稀释外周血,轻柔上下颠倒混匀,缓慢加在等体积的人淋巴细胞分离液面上,常温下2000rpm离心20min(加速度设置为1)后,可见液体可为3层,用无菌吸管采集中间白膜层,加入3-4mL PBS洗涤,轻柔上下颠倒混匀,常温下1200rpm离心10分钟,弃上清后加入4mL红细胞裂解液重悬细胞,室温静置5分钟,加入5mL PBS中止裂红;1200rpm离心10分钟,弃上清,加入4mL改良型1640培养基重悬细胞,转移至25cm2培养瓶,在细胞培养箱(37℃、5%CO2)中培养过夜。第2天无菌条件下将培养瓶中的细胞悬液转移至15ml无菌离心管,1200rpm离心5min,弃上清后加入无菌PBS缓冲液重悬,1200rpm离心5min;
抗体孵育:弃上清后,100μL无菌PBS缓冲液重悬细胞沉淀,加入CD8a抗体5μL,轻柔吹打混匀,常温下避光孵育30分钟,准备单标管和空白管(含细胞,不加任何流式抗体);
洗涤和过滤:加入3mL无菌PBS缓冲液洗涤,1200rpm离心5min,离心两次;
流式分选:依据细胞数量,加入800μL-1000μL无菌PBS缓冲液重悬细胞沉淀,200目无菌滤网过滤,使用流式细胞分选仪分选CD8+T细胞,流速控制在6000-8000个细胞/秒。
分选结束后将目的细胞置于10%胎牛血清改良型RPMI-1640培养液中常规培养。具体实验过程及结果如下:
1、去甲泽拉木醛在CD8+T细胞中的IC50值测定及安全有效浓度筛选,并与目前已知的治疗白癜风的小分子药物托法替尼进行比较:首先我们配置出10种不同浓度的去甲泽拉木醛(T-96)和托法替尼(Tofa)工作液(100μM,50μM,25μM,12.5μM,6.25μM,3.125μM,1μM,0.1μM,0.01μM 0μM),结果可见T-96在CD8+T细胞中的IC50=4.54μM,与托法替尼的IC50=6.31μM相近,进一步我们缩小浓度范围进行浓度梯度实验,得出T-96和Tofa在在CD8+T细胞中的安全有效浓度为1μM,具体结果见图1:a-d。
2、T-96和Tofa对CD8+T细胞增殖的影响:进行CFSE荧光染色,按照1*106细胞加入2μL CFSE染色溶液(2μM),37℃避光孵育10-15分钟,1200rpm离心10分钟,弃上清,加入适量改良型1640培养基重悬,培养5天后流式细胞仪检测和记录FITC-CFSE荧光强度的衰减,具体结果见图1:e。
3、T-96和Tofa对CD8+T细胞活化的影响:流式检测去甲泽拉木醛处理后CD8+T细胞表面分子CD69:收集处理后细胞,转移至流式管,每管加入2ml无菌PBS缓冲液混匀,1200rpm离心7分钟,弃上清,离心两次后加入适量PBS缓冲液重悬细胞沉淀,依次设置裸细胞管(不加入任何荧光抗体)、单标管以及各组样品管。各组样品管及单标管中加入相应适量的细胞表面分子荧光流式抗体,室温避光孵育30分钟,每管加入2mL PBS缓冲液,1200rpm离心7分钟,弃上清,离心两次后加入400μL流式样品固定液,流式仪检测结果,具体结果见图1:f。
4、T-96和Tofa对CD8+T细胞杀伤功能的影响:流式检测CD8+T细胞胞内细胞因子IFN-γ,GzmB和PRF:收集细胞,转移至流式管,每管加入2ml无菌PBS缓冲液混匀,1200rpm离心7分钟,弃上清,离心两次。按照转录因子染色固定和破膜试剂盒说明书步骤,对CD8+T细胞进行固定、破膜并洗涤,离心后加入适量PBS缓冲液重悬,依次设置裸细胞管(不加入任何荧光抗体)、单标管以及各组样品管。各组样品管及单标管中加入相应适量的胞内细胞因子荧光流式抗体,室温避光孵育30分钟,每管加入2mL PBS,1200rpm离心7分钟,弃上清,离心两次后加入400μL流式样品固定液,具体结果见图1:g-i。
实施例3:去甲泽拉木醛处理原代人角质形成细胞的细胞实验
称取实施例1中提取的去甲泽拉木醛,使用DMSO溶解后再用1640培养基稀释到实验所用浓度1μM,得到含去甲泽拉木醛的1640培养基,用于去甲泽拉木醛处理原代人角质形成细胞的细胞实验。
角质形成细胞SFM培养基重悬细胞沉淀后,转移到细胞培养瓶,在37℃、5%CO2细胞培养箱中常规培养。待贴壁细胞密度增加至80-90%,加入0.25%胰蛋白酶-EDTA消化液进行差速消化,倒置显微镜下连续观察细胞形态,去除黑素细胞与成纤维细胞后进行细胞传代,鉴定原代人角质形成细胞。
使用H&E(苏木精和伊红)染色对原代人角质形成细胞纯度进行鉴定,纯度达95%以上,采用第2代至第4代细胞用于去甲泽拉木醛处理后进行酶联免疫吸附测定(ELISA),RT-PCR实验,蛋白质印迹法(WEATERN)及激光扫描共聚焦显微镜(CONFOCAL)等相关实验。
1、计算机分子模拟技术发现T-96可以和JAK2结合见图2:a-c。RT-PCR及Wstern发现T-96同Tofa可显著降低JAK2的蛋白表达(图2:d)及stat1的mRNA及蛋白表达(图2:e),免疫荧光实验表明T-96明显抑制STAT1入核及磷酸化表达(图2:f)。进一步ELISA结果表明T-96同托法替尼一样可显著降低CXCL9和CXCLl0的mRNA及蛋白分泌水平,二者联用具有协同作用(图2:g)。而当过表达JAK2时上述作用消失(图2:h),以上结果表明T-96通过结合JAK2进而影响下游STAT-CXCL9/10。
2、计算机分子模拟技术发现T-96可以和NF-κB结合见图3:a-c。RT-PCR及ELISA结果表明T-96显著降低氧化应激下角质形成细胞中CXCL16的mRNA及分泌水平(图3:d)。通过免疫荧光实验我们发现T-96可显著抑制NF-κB入核(图3:e)。RT-PCR和Wstern发现T-96可显著降低NF-κB的mRNA及蛋白表达(图3:f),过表达p65后发现T-96对CXCL16的mRNA及蛋白分泌水平消失(图3:g)。此外我们还发现T-96对NF-κB的抑制作用呈时间及浓度依赖趋势(图3:h和i)。
实施例4:含去甲泽拉木醛的外用软膏的制备
取实施例1中提取的去甲泽拉木醛进行外用软膏的制备。
将10g去甲泽拉木醛加入含0.1wt%的DMSO蒸馏水中,超声波溶解混匀,得到去甲泽拉木醛溶液,使其药物浓度为10ug/ml;
将10g液状石蜡、10g水杨酸、50g甘油、20g凡士林、9g硬脂酸、1g尼泊金乙酯用蒸馏水稀释,搅拌混匀后,滴入碳酸钠搅拌调节至中性,于20℃保温得到基质溶液;
将去甲泽拉木醛溶液分成均等两份,一份以压力为0.03Mpa、流速为0.3L/min的速度喷至基质溶液中,于20℃的温度下搅拌15min后将另一份去甲泽拉木醛溶液以0.05Mpa、流速为0.4L/min的速度喷至其中,再次于20℃搅拌15min后,于频率为20kHz,功率为200W的条件下超声分散20min,随后加热至40℃保温2h,得到乳膏,装入无菌容器中密封保存。
对比例:
(1)将与实施例4相同的去甲泽拉木醛溶液、基质溶液混合,直接搅拌15min后,于频率为20kHz,功率为200W的条件下超声分散20min,随后加热至40℃保温2h,得到乳膏,装入无菌容器中密封保存。
(2)将与实施例4相同的去甲泽拉木醛溶液全部以0.04Mpa、流速为0.3L/min的速度喷至基质溶液中,于20℃搅拌15min后,于频率为20kHz,功率为200W的条件下超声分散20min,随后加热至40℃保温2h,得到乳膏,装入无菌容器中密封保存。
对比制备的三种乳膏,将其全部于常温下敞口静置,静置过程每天模拟日光照射8h,实验过程中需要避免污染情况出现,得到的结果如下:对比例(1)制备的乳膏于第5天出现轻微分层现象,于第7天出现明显分层沉淀现象;对比例(2)制备的乳膏于第9天出现轻微分层现象,第12天出现明显分层沉淀现象;按照实施例4制备的乳膏于30天时仍未出现轻微分层现象。
实施例5:含去甲泽拉木醛的外用软膏临床实验
选择年龄18-45岁(排除标准:1)患器质性功能障碍者;2)肝、肾功能异常;3患有其他自身免疫性疾病;4)近半年患有感染性疾病;5)近期有过糖皮质激素或免疫抑制剂治疗者),且记录完整40例患者,男20例,女20例,病程最短1个月,最长2年,根据白癜风临床分型及疗效标准,进展期23例,稳定期17例,其中局限性32例,节段性8例。共观察42个皮损部位,其中颊部15例,眶周11例,腔口(鼻孔、口角等)6例,鼻部5例,颈部4例,耳后1例;皮损面积1.8~20cm2
治疗方法:外用含去甲泽拉木醛的外用软膏,在患处皮肤涂上一薄层,轻轻擦匀,并完全覆盖,一天两次,2次间隔时间≥8h;连续治疗3个月为一个疗程。
疗效判断标准:痊愈:白斑全部消退,恢复正常肤色;显效:白斑部分消退或缩小,恢复正常肤色的面积占皮损面积≥50%;好转:白斑部分消退或缩小;无效:白斑无色素再生或范围扩大。
得到的结果如下:
42处皮损中,痊愈4处(9.5%),显效17处(40.5%),有效19处(45.2%),无效2处(4.8%),有效率95.2%,显效率50%。
23例进展期白斑中27处皮肤损害全部有效。17例稳定期中15处皮损有2处无效。有效病例见效时间平均2.78周。
根据以上结果可知,本发明所制备的含去甲泽拉木醛的外用软膏治疗白癜风效果较好,这为白癜风的治理提供了安全、有效的靶向治理药物。
本发明相关实施例的实验材料来源:CXCL9、CXCL10、CXCL16的ELISA试剂盒,欣博盛(中国);原代人角质形成细胞培养基,Gibco公司(美国);合成引物,生工生物工程公司(上海);预染蛋白Marker Thermo,公司(美国);PierceTMBiotinylated ProteinInteraction Pull-Down Kit,Thermo ScientificTM;CD8 MicroBeads,Miltenyi;M-280Streptavidin Dynabeads,Invitrogen;JAK、STAT1、NF-κB、Actin抗体,CST;HRP-羊抗鼠IgG抗体,Pierce公司(美国;FITC-羊抗鼠IgG抗体,壮志生物科技公司(陕西);CY3-羊抗兔IgG抗体,壮志生物科技公司(陕西);FITC-羊抗兔IgG抗体,壮志生物科技公司(陕西);CY3-羊抗鼠IgG抗体,壮志生物科技公司(陕西);CD3/CD28磁珠抗体,Sigma公司(美国);CD8a、CXCR3、CXCR6、IFN-γ、GzmB、PRF、CD69、STAT3、STAT5等流式抗体及同型对照,eBioscience(美国),Biolegend(美国);SYBR Premix Ex Taq II kit,Takara公司(日本);反转录cDNA试剂盒,Takara公司(日本);ECL化学发光试剂盒,Advansta公司(美国);DAPI,碧云天公司(上海)。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。本发明未详细描述的技术、形状、构造部分均为公知技术。
Claims (6)
1.一种去甲泽拉木醛白癜风软膏的制备方法,其特征在于,包括以下重量份的原料:10-15份去甲泽拉木醛、10-20份水杨酸、10-20份透明质酸钠、30-70份甘油、20-30份凡士林、5-15份羊毛脂;所述制备方法如下:
将去甲泽拉木醛加入含0.1wt%的DMSO蒸馏水中,超声波溶解混匀,得到去甲泽拉木醛溶液,去甲泽拉木醛的药物浓度为10-20μg/ml;
称取液状石蜡、水杨酸、甘油、凡士林、硬脂酸、尼泊金乙酯用蒸馏水稀释,搅拌混匀后,滴入碳酸钠搅拌调节至中性,于20℃保温得到基质溶液;
将去甲泽拉木醛溶液分成均等两份,一份以压力为0.02-0.03Mpa、流速为0.3L/min的速度喷至基质溶液中,于20℃的温度下搅拌15min后将另一份去甲泽拉木醛溶液以0.04-0.05Mpa、流速为0.4L/min的速度喷至其中,再次于20℃搅拌15min后,于频率为20kHz,功率为200W的条件下超声分散20min,随后加热至40℃保温2h,得到乳膏,装入无菌容器中密封保存。
2.根据权利要求1所述的一种去甲泽拉木醛白癜风软膏的制备方法,其特征在于,所述去甲泽拉木醛用于降低炎性刺激和氧化应激下角质形成细胞趋化因子CXCL9/10/16的生成和分泌。
3.根据权利要求1所述的一种去甲泽拉木醛白癜风软膏的制备方法,其特征在于,所述去甲泽拉木醛用于抑制CD8+T细胞的皮肤迁移、活化、增殖及分化。
4.根据权利要求1所述的一种去甲泽拉木醛白癜风软膏的制备方法,其特征在于,所述去甲泽拉木醛提取自雷公藤。
5.根据权利要求4所述的一种去甲泽拉木醛白癜风软膏的制备方法,其特征在于,所述药物还可以用于治疗红斑狼疮、银屑病。
6.根据权利要求1-5任一权利要求所述的一种去甲泽拉木醛白癜风软膏的制备方法,其特征在于,所述去甲泽拉木醛在角质形成细胞和CD8+T细胞中的安全有效浓度为0.1-2.0μM。
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