CN112402413A

CN112402413A - 野马追倍半萜内酯b在制备抗肝癌药物中的应用及一种抗肝癌药物

Info

Publication number: CN112402413A
Application number: CN202011349496.5A
Authority: CN
Inventors: 张永慧; 魏勇; 陈地龙; 刘桂元; 张昊洋; 牟金阿哥; 韩美月; 潘李安; 曹志豪; 王婷婷; 董凤; 罗雾晶; 余明洁; 刘欢; 李佳鑫; 金俐杉; 丁文轩; 杨婉龙; 刘丹; 刘奉
Original assignee: Chongqing Three Gorges Medical College
Current assignee: Chongqing Three Gorges Medical College
Priority date: 2020-11-26
Filing date: 2020-11-26
Publication date: 2021-02-26
Anticipated expiration: 2040-11-26
Also published as: CN112402413B

Abstract

本发明涉及野马追倍半萜内酯B在制备抗肝癌药物中的应用及一种抗肝癌药物，属于医药技术领域。野马追倍半萜内酯B在体内、体外对人源肝癌均有一定的抑制作用，能够显著抑制肝癌细胞生长，具体机制为将细胞周期阻滞在S期、下调肝癌细胞周期相关蛋白CDK2和Cyclin E1表达。野马追倍半萜内酯B抑制肝癌细胞迁移，具体机制为下调Vimentin表达和上调E‑cadherin表达。同时，野马追倍半萜内酯B使肝癌细胞线粒体皱缩，膜密度增加，可以增加肝癌细胞活性氧并诱导细胞铁死亡信号通路，从而发挥抗肝癌的作用。

Description

野马追倍半萜内酯B在制备抗肝癌药物中的应用及一种抗肝癌药物

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及野马追倍半萜内酯B在制备抗肝癌药物中的应用及一种抗肝癌药物。

背景技术

原发性肝癌是临床上常见的恶性肿瘤之一，按组织学分析，大多数肝癌(75-85％)为原发性肝癌。肝癌的高发病率和高死亡率给社会带来巨大的经济负担，因此，探索肝癌的有效治疗方案仍是急需解决的临床问题。

目前，肝癌的治疗方案主要包含手术治疗与非手术治疗。虽然目前治疗原发性肝癌最有效的方法为手术治疗，但由于原发性肝癌起病隐匿，早期无症状或症状不明显，确诊时大多数患者已经到中晚期或发生远处转移，失去手术机会，因此，全身药物治疗在肝癌治疗中发挥重要作用。肝癌治疗药物包括分子靶向药物(索拉非尼)和传统的细胞毒性药物(阿霉素、顺铂、氟尿嘧啶等)，但索拉非尼仅对部分患者有效，传统的细胞毒药物有效率不高，且毒副作用大。中医药治疗，作为肝癌综合治疗的重要组成部分，在预防肝癌发生、减少复发及提高生存质量和延长生存期等方面发挥独特优势。传统的中医理论从“整体观念”对肝癌进行“辨证论治”，认为肿瘤即癥瘕、积聚、痈疽、疮肿等，其发病病机由内外交互产生，与脏腑虚弱、气血瘀滞、癌毒内生密切相关。因此，中药复方通过调节阴阳、气血、血瘀平衡，发挥补气、化痰、祛瘀作用，消除病理因素治疗肝癌。常用的中药复方包括双莲方、小柴胡汤、扶正抑瘤颗粒、解毒消癥饮等。但是，总体而言，中药治疗存在作用靶点多、药物成分复杂，机制难以明确，且缺乏高级别的循证医学证据充分支持证明其作用。而中药提取物不仅能充分发挥中药毒副作用低，耐受性好的优势，同时还能结合现代学科理论、临床实践基础和完善的实验方法。因此，从中药中筛选出更高效的活性成分，探究中药提取物的抗肝癌作用及其具体的抗癌机制具有重要的临床意义，为肝癌的综合治疗提供更多有效手段。

野马追是菊科泽兰属植物尖佩兰的全草，主要产于江苏、甘肃、山东、湖南等地。野马追具有化痰止咳、清热解毒、利尿消肿、降压的功能，临床常用于治疗慢性气管炎、支气管炎、高血压病，枝叶入药有解表祛湿，和中化湿之效，用于劳伤咳嗽、吐血咳血以及淋浊白带、无名肿痛等。迄今为止，从野马追植物中提取的化学成分主要为挥发油类、有机酸类、黄酮类、三萜类、倍半萜类及其他类成分，关于野马追提取物抗肿瘤作用的研究较少，已有研究显示野马追提取物具有抗乳腺癌、肺癌的作用，中国科学院上海药物研究所岳建民课题组早在2004年就已经发现野马追提取物可以对小鼠白血病细胞系P-388和人肺癌细胞系A-549 具有细胞毒性作用，但未做后续验证实验和机制研究。2016年，浙江中医药大学赵华军课题组研究显示：野马追提取物野马追内酯O(EO)可以显著抑制乳腺癌细胞活力，其机制为通过降低细胞周期相关蛋白CyclinB1和CDC2水平，阻滞乳腺癌细胞在G2/M期，并能诱导caspase 依赖的凋亡信号通路。该课题组随后分离鉴定出野马追新型化合物EupalinolideJ(EJ)和F1012 －2，Eupalinolide J可降低STAT3荧光素酶活性，为天然的Michael反应受体，F1012-2可激活细胞自噬、诱导凋亡、抑制细胞周期，两种化合物均对三阴乳腺癌发挥抑制作用。但关于野马追在肝癌的研究及机制研究较少。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供野马追倍半萜内酯B在制备抗肝癌药物中的应用；目的之二在于提供一种抗肝癌药物。

为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：

1、野马追倍半萜内酯B在制备抗肝癌药物中的应用，所述野马追倍半萜内酯B的化学结构式如下：

优选的，所述药物具有抑制肝癌细胞生长的作用。

优选的，所述抑制肝癌细胞生长通过将细胞周期阻滞在S期和/或下调肝癌细胞周期相关蛋白表达中的方式实现；所述相关蛋白为CDK2和/或Cyclin E1。

优选的，所述药物具有降低肝癌细胞迁移能力的作用。

优选的，所述降低肝癌细胞迁移能力通过下调肝癌细胞迁移相关蛋白Vimentin表达和/ 或上调肝癌细胞迁移相关蛋白E-cadherin表达的方式实现。

优选的，所述药物具有诱导肝癌细胞铁死亡信号通路的作用。

优选的，所述诱导肝癌细胞铁死亡信号通路通过下调肝癌细胞铁死亡相关蛋白GPX4表达的方式实现。

优选的，所述药物具有增加肝癌细胞活性氧的作用。

优选的，所述药物具有影响肝癌细胞线粒体形态的作用，使肝癌细胞线粒体皱缩，膜密度增加。

2、一种抗肝癌药物，所述药物以野马追倍半萜内酯B作为唯一活性成分，或以野马追倍半萜内酯B和其它具有抗肝癌的成分共同作为活性成分。

本发明的有益效果在于：本发明提供了野马追倍半萜内酯在制备抗肝癌药物中的应用及一种抗肝癌药物，野马追倍半萜内酯B(EB)在体内、体外对人源肝癌均有一定的抑制作用，能够显著抑制肝癌细胞生长，具体机制为将细胞周期阻滞在S期、下调肝癌细胞周期相关蛋白CDK2和Cyclin E1表达。野马追倍半萜内酯B抑制肝癌细胞迁移，具体机制为下调Vimentin 表达和上调E-cadherin表达。同时，野马追倍半萜内酯B使肝癌细胞线粒体皱缩，膜密度增加，可以增加肝癌细胞活性氧并诱导细胞铁死亡信号通路，从而发挥抗肝癌的作用。

本发明的其他优点、目标和特征在某种程度上将在随后的说明书中进行阐述，并且在某种程度上，基于对下文的考察研究对本领域技术人员而言将是显而易见的，或者可以从本发明的实践中得到教导。本发明的目标和其他优点可以通过下面的说明书来实现和获得。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图对本发明作优选的详细描述，其中：

图1为野马追倍半萜内酯B对肝癌细胞株生长抑制作用测试结果图(图1中A为野马追倍半萜内酯B对SMMC-7721人源肝癌细胞株生长抑制作用测试结果图，图1中B为野马追倍半萜内酯B对HCCLM3人源肝癌细胞株生长抑制作用测试结果图)；

图2为野马追倍半萜内酯B阻滞肝癌细胞周期测试结果图(图2中A为野马追倍半萜内酯B对SMMC-7721人源肝癌细胞株细胞周期影响测试结果图，图2中B为野马追倍半萜内酯B对HCCLM3人源肝癌细胞株细胞周期影响测试结果图)；

图3为野马追倍半萜内酯B下调肝癌细胞周期相关蛋白表达测试结果图；

图4为野马追倍半萜内酯B对肝癌细胞株迁移能力降低作用测试结果图；

图5为野马追倍半萜内酯B影响肝癌细胞迁移相关蛋白表达测试结果图；

图6为野马追倍半萜内酯B下调肝癌细胞铁死亡相关蛋白表达测试结果图；

图7为野马追倍半萜内酯B增加肝癌细胞活性氧作用测试结果图；

图8为野马追倍半萜内酯B影响肝癌细胞线粒体形态作用测试结果图；

图9为野马追倍半萜内酯B对裸鼠移植瘤体积抑制作用测试结果图；

图10为野马追倍半萜内酯B对裸鼠移植瘤重量抑制作用测试结果图。

具体实施方式

以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。

实施例1

野马追倍半萜内酯B对肝癌细胞株生长抑制作用及机制研究

通过CCK8法，将SMMC-7721和HCCLM3两种人源肝癌细胞分别培养至密度为90％左右，进行细胞计数，按实验分组分别接种于96孔培养板中，每孔的细胞数为5×10³个，每组设6个复孔，接种后置于37℃、5％CO₂培养箱中分别培养24h。分别在给药组中加入终浓度为6、12、24μmol/L的野马追倍半萜内酯B，培养24h、48h和72h后，加入10μL CCK8 溶液，置于37℃培养箱中孵育4h，在酶标仪上测定其在450nm处OD值，结果如图1所示，图1中A为野马追倍半萜内酯B对SMMC-7721人源肝癌细胞株生长抑制作用测试结果图，图1中B为野马追倍半萜内酯B对HCCLM3人源肝癌细胞株生长抑制作用测试结果图。进行数据分析，细胞生长抑制率＝(对照组OD值-试验组OD值)/对照组OD×100％。统计学处理以SPSS15.0统计软件分析，两组间的均数比较采用t检验。可知，野马追倍半萜内酯B 对肝癌细胞株SMMC-7721和HCCLM3的生长均有抑制作用，且抑制作用均随着野马追倍半萜内酯B浓度的增加而增大。

(1)野马追倍半萜内酯B阻滞肝癌细胞周期

培养SMMC-7721和HCCLM3两种人源肝癌细胞，实验分组：对照组(DMSO)，野马追倍半萜内酯B中剂量组(12μM)，野马追倍半萜内酯B高剂量组(24μM)，分别药物处理 48h，待两种细胞处于对数生长期时，均按如下操作进行：以胰蛋白酶消化1-2min，收集细胞，用PBS洗涤细胞，离心2000rpm，5min，调整细胞浓度为1×10⁶/mL，取1mL单细胞悬液。制备的单细胞悬液离心后，去除上清，在细胞中加入70％冷乙醇500μL固定，4℃保存；加入提前配制好的500μL PI/RNaseA染色工作液，室温避光30-60min；上机检测，记录激发波长488nm处红色荧光，收集数据并用ModFit软件分析。结果如图2所示，图2中A为野马追倍半萜内酯B对SMMC-7721人源肝癌细胞株细胞周期影响测试结果图，图2中B为野马追倍半萜内酯B对HCCLM3人源肝癌细胞株细胞周期影响测试结果图，由图2可知，经野马追倍半萜内酯B处理后，两种细胞的细胞周期均阻滞在S期，且阻滞作用均随着野马追倍半萜内酯B浓度的增加而增大。

(2)野马追倍半萜内酯B下调肝癌细胞周期相关蛋白表达

培养SMMC-7721和HCCLM3两种人源肝癌细胞，实验分组：对照组(DMSO)，野马追倍半萜内酯B低剂量组(6μM)、野马追倍半萜内酯B中剂量组(12μM)，野马追倍半萜内酯B高剂量组(24μM)，分别药物处理48h，待两种细胞处于对数生长期时，倒掉培养基，均按如下操作进行：用PBS洗涤2次，加入RIPA、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂(100:10:1)，用细胞刮刀将贴壁细胞刮下来，吸到离心管中，3000rpm，4℃离心5min。离心后取上清，整个过程均在冰上完成，收集上清液提取总蛋白；用BCA法测定蛋白浓度，计算上样量，100℃样品变性5min快速置冰上。8-12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，湿转至 PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的封闭液中，室温摇晃2h，将封闭后的PVDF膜用PBS缓冲溶液轻轻漂洗5min，根据目的蛋白不同，用不同的一抗孵育，放在4℃摇床孵育过夜。一抗孵育完毕，用TBS-T缓冲溶液清洗4次，每次5min。室温避光孵育荧光二抗45min，再用 TBS-T缓冲溶液清洗4次，每次5min，最后用ECL发光显色及结果分析。结果如图3所示，由图3可知，经野马追倍半萜内酯B处理后，两种细胞的细胞周期相关蛋白CDK2和Cyclin E1表达显著下降，且抑制作用均随着野马追倍半萜内酯B浓度的增加而增大。

实施例2

野马追倍半萜内酯B对肝癌细胞株迁移能力降低作用及机制研究

将处于对数生长期的SMMC-7721和HCCLM3两种人源肝癌细胞接种于6孔板内，5×10⁵个细胞/孔，2mL培养基/孔。放入37℃、5％CO₂的细胞恒温培养箱中孵育24h。细胞铺满底壁，用20μL移液枪的枪头在培养皿底部均匀划线，PBS洗细胞3遍，分别用含6μM、12μM、 24μM野马追倍半萜内酯B的无血清培养基处理实验组细胞，用含0.1％DMSO的无血清培养基处理对照组细胞。用倒置显微镜，按0、6、24、48h时间点取样拍照，用Image J统计数据，计算划痕伤口愈合率＝(0h划痕宽度-培养后划痕宽度)/0h划痕宽度×100％。结果如图4 所示，由图4可知，野马追倍半萜内酯B对肝癌细胞株SMMC-7721和HCCLM3的迁移均有抑制作用，且抑制作用均随着野马追倍半萜内酯B浓度的增加而增大。

(1)野马追倍半萜内酯B影响肝癌细胞迁移相关蛋白表达

培养SMMC-7721和HCCLM3两种人源肝癌细胞，实验分组：对照组(DMSO)，野马追倍半萜内酯B低剂量组(6μM)、野马追倍半萜内酯B中剂量组(12μM)，野马追倍半萜内酯B高剂量组(24μM)，分别药物处理48h，待两种细胞处于对数生长期时，倒掉培养基，均按如下操作进行：用PBS洗涤2次，加入RIPA、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂(100:10:1)，用细胞刮刀将贴壁细胞刮下来，吸到离心管中，3000rpm，4℃离心5min。离心后取上清，整个过程均在冰上完成，收集上清液提取总蛋白；用BCA法测定蛋白浓度，计算上样量，100℃样品变性5min快速置冰上。8-12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，湿转至 PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的封闭液中，室温摇晃2h，将封闭后的PVDF膜用PBS缓冲溶液轻轻漂洗5min，根据目的蛋白不同，用不同的一抗孵育，放在4℃摇床孵育过夜。一抗孵育完毕，用TBS-T缓冲溶液清洗4次，每次5min。室温避光孵育荧光二抗45min，再用 TBS-T缓冲溶液清洗4次，每次5min，最后用ECL发光显色及结果分析。结果如图5所示，由图5可知，经野马追倍半萜内酯B处理后，两种细胞的细胞周期相关蛋白Vimentin表达显著下降，E-cadherin表达显著增加，且调控作用均随着野马追倍半萜内酯B浓度的增加而增大。

实施例3

野马追倍半萜内酯B诱导肝癌细胞铁死亡信号通路作用机制研究

(1)野马追倍半萜内酯B下调肝癌细胞铁死亡相关蛋白GPX4表达

培养SMMC-7721和HCCLM3两种人源肝癌细胞，实验分组：对照组(DMSO)，野马追倍半萜内酯B高剂量组(24μM)，分别药物处理48h，待两种细胞处于对数生长期时，倒掉培养基，均如下操作进行：用PBS洗涤2次，加入RIPA、磷酸酶抑制剂、蛋白酶抑制剂 (100:10:1)，用细胞刮刀将贴壁细胞刮下来，吸到离心管中，3000rpm，4℃离心5min。离心后取上清，整个过程均在冰上完成，收集上清液提取总蛋白；用BCA法测定蛋白浓度，计算上样量，100℃样品变性5min快速置冰上。8-12％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质，湿转至PVDF膜上，用含5％脱脂奶粉的封闭液中，室温摇晃2h，将封闭后的PVDF 膜用PBS缓冲溶液轻轻漂洗5min，根据目的蛋白不同，用不同的一抗孵育，放在4℃摇床孵育过夜。一抗孵育完毕，用TBS-T缓冲溶液清洗4次，每次5min。室温避光孵育荧光二抗 45min，再用TBS-T缓冲溶液清洗4次，每次5min，最后用ECL发光显色及结果分析。结果如图6所示，由图6可知，经野马追倍半萜内酯B处理后，两种细胞的铁死亡相关蛋白GPX4 表达显著下降。

实施例4

野马追倍半萜内酯B增加肝癌细胞活性氧作用

培养SMMC-7721和HCCLM3两种人源肝癌细胞，实验分组：对照组(DMSO)，野马追倍半萜内酯B高剂量组(24μM)，分别药物处理48h，待两种细胞处于对数生长期时，均按如下操作进行：按照1:1000用无血清培养液稀释DCFH-DA，使终浓度为10μmol/L。细胞收集后悬浮于稀释好的DCFH-DA中，37℃细胞培养箱内孵育20min。每隔3-5min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无血清细胞培养液洗涤细胞3次，以充分去除未进入细胞内的DCFH-DA。用流式细胞仪检测细胞中的荧光强度(激发波长为488nm，发射波长为 525nm)，以此表现细胞内活性氧自由基的产量。结果如图7所示，由图7可知，经野马追倍半萜内酯B处理后，两种细胞内产生更多的活性氧。

实施例5

野马追倍半萜内酯B影响肝癌细胞线粒体形态作用

培养SMMC-7721和HCCLM3两种人源肝癌细胞，实验分组：对照组(DMSO)，野马追倍半萜内酯B高剂量组(24μM)，分别药物处理48h，待两种细胞处于对数生长期时，均按如下操作进行：用不含EDTA的胰酶将细胞消化吹打离心后，弃置上清液后，用完全培养基再次离心，弃上清液，保持细胞团块位于1mL的EP管中，沿管壁慢慢加入1mL 2.5％的戊二醛固定液(4℃)，在室温下用1％OsO₄中在PBS中后固定1h。使用乙醇脱水并用环氧树脂包埋并切片。在网格上收集超薄(60nm)切片，并用乙酸双氧铀和柠檬酸铅染色，使用透射电子显微镜获得图像。线粒体形态的变化也是铁死亡的特征之一,结果如图8所示，由图8 可知，经野马追倍半萜内酯B处理后，两种细胞的细胞线粒体出现明显的皱缩，膜密度增加。

实施例6

野马追倍半萜内酯B体外抗肝癌作用研究

小鼠皮下成瘤模型实验：4周龄左右的雌性BALB/C无胸腺免疫缺陷裸鼠，将无胸腺免疫缺陷裸鼠在SPF级动物房IVC系统中饲养7天，观察其生长状况。取对数生长期 SMMC-7721和HCCLM3两种人源肝癌细胞，按1:3比例传代，分别接种到6个10cm的培养皿中，待其密度为培养皿面积的80％时，胰酶消化并计数。将6盘细胞收集到同一无菌离心管中，PBS洗一遍，分别加入1.2mL预冷的PBS重悬细胞，置于冰盒上备用。取三只1mL 注射器，分别标记好DMSO组、野马追倍半萜内酯B低剂量组(25mg/kg)和野马追倍半萜内酯B高剂量组(50mg/kg)，吸取制备好的细胞悬组，小心排尽气泡，每只裸鼠皮下注射1 ×10⁶个细胞。分别将三组小鼠放到标好的ICV笼中继续饲养中。当观察到小鼠皮下出现肉眼可见的肿瘤时，使用游标卡尺测量肿瘤直径，记录肿瘤大小变化。连续测量3周左右，观察野马追倍半萜内酯B对肿瘤生长的影响。完成最后一次测量后，脱颈处死小鼠并取出小鼠皮下的肿瘤，称量肿瘤重量，拍照采集图片，对数据进行分析，测绘肿瘤的生长曲线，如图9和图10所示，图9为野马追倍半萜内酯B对裸鼠移植瘤体积抑制作用测试结果图，图10 为野马追倍半萜内酯B对裸鼠移植瘤重量抑制作用测试结果图。肿瘤组织放入备好的含有组织冻存液的冻存管中，-80℃保存备用。由图9和图10可知，与对照组相比，野马追倍半萜内酯B处理后裸鼠移植瘤的体积和重量显著下降。

最后说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims

1.野马追倍半萜内酯B在制备抗肝癌药物中的应用，其特征在于，所述野马追倍半萜内酯B的化学结构式如下：

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物具有抑制肝癌细胞生长的作用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述抑制肝癌细胞生长通过将细胞周期阻滞在S期和/或下调肝癌细胞周期相关蛋白表达中的方式实现；所述相关蛋白为CDK2和/或Cyclin E1。

4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物具有降低肝癌细胞迁移能力的作用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述降低肝癌细胞迁移能力通过下调肝癌细胞迁移相关蛋白Vimentin表达和/或上调肝癌细胞迁移相关蛋白E-cadherin表达的方式实现。

6.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物具有诱导肝癌细胞铁死亡信号通路的作用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述诱导肝癌细胞铁死亡信号通路通过下调肝癌细胞铁死亡相关蛋白GPX4表达的方式实现。

8.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物具有增加肝癌细胞活性氧的作用。

9.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物具有影响肝癌细胞线粒体形态的作用，使肝癌细胞线粒体皱缩，膜密度增加。

10.一种抗肝癌药物，其特征在于，所述药物以野马追倍半萜内酯B作为唯一活性成分，或以野马追倍半萜内酯B和其它具有抗肝癌的成分共同作为活性成分。