CN113171378A - 一种用于防治男性性功能障碍的干细胞外泌体制剂 - Google Patents

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Abstract

本发明创造提供了一种用于防治男性性功能障碍的干细胞外泌体制剂，其活性成分为由间充质干细胞来源的外泌体负载隐丹参酮而得，所述外泌体通过电转法负载隐丹参酮。本发明的研究人员在钻研间充质干细胞外泌体在治疗非梗阻性无精症的过程中发现，单纯地使用间充质干细胞来源的外泌体效果并不明显，但无意中发现将隐丹参酮通过电转法负载入外泌体中后，其效果显著增强；另外，研究人员也发现不同浓度的负载了隐丹参酮的外泌体所起的效果并不相同。

Description

一种用于防治男性性功能障碍的干细胞外泌体制剂
技术领域
本发明创造属于干细胞制剂领域，尤其是涉及一种用于防治男性性功能障碍的干细胞外泌体制剂。
背景技术
无精症分为梗阻性无精症和非梗阻性无精症，其中，非梗阻性无精子症(NOA)是导致男性不育症中的最为常见的病症之一,其病变部位在于睾丸，睾丸不能产生精子，或者睾丸生精能力低，导致精液化验出现没有精子。
间充质干细胞(MSCs)分泌的外泌体是由活性细胞分泌到外环境的一种具有双层膜结构的纳米级囊性小泡。内富含细胞来源的mRNA、miRNA以及蛋白质等多种成分是一种成体干细胞，具有很强的向多种组织细胞分化潜能。研究发现，MSCs-exo具有抗炎和免疫调节的作用，同时有研究表明骨髓间充质干细胞(BMSCs)来源的外泌体对睾丸缺血再灌注损伤具有保护作用，一方面通过抑制组织细胞的炎症和凋亡，另一方面通过提高组织的抗氧化水平。但其在治疗非梗阻性无精症方便的功能没有报道。
隐丹参酮(CTan)是一种从丹参酮中分得的单体，学名为(R)-1,6,6-三甲基-1,2,6,7,8,9-六氢-菲并[1,2-B]呋喃-10，具有抗氧化、抗衰老功能，对治疗冠心病、心绞痛、心肌损害以及阿尔兹海默症有一定疗效，同时还具有抗菌作用。但目前有关隐丹参酮与间充质干细胞联合在治疗男性非梗阻性无精症中的用途还没有文献报道。
发明内容
有鉴于此，本发明创造旨在克服现有技术中的缺陷，提出一种用于防治男性性功能障碍的干细胞外泌体制剂。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种用于防治男性性功能障碍的干细胞外泌体制剂，其活性成分为由间充质干细胞来源的外泌体负载隐丹参酮而得，所述外泌体通过电转法负载隐丹参酮。
优选的，所述制剂中活性成分的质量百分比为0.3-1.5％。
优选的，所述制剂中活性成分的质量百分比为0.8-1.2％。
优选的，所述间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。
优选的，所述电转法的条件为：电压为420V，电容为150μF。
本发明还提供一种上述制剂在制备治疗男性性功能障碍药物中的应用。
优选的，所述男性性功能障碍为非梗阻性无精症。
相对于现有技术，本发明创造具有以下优势：
本发明的研究人员在钻研间充质干细胞外泌体在治疗非梗阻性无精症的过程中发现，单纯地使用间充质干细胞来源的外泌体效果并不明显，但无意中发现将隐丹参酮通过电转法负载入外泌体中后，其效果显著增强；另外，研究人员也发现不同浓度的负载了隐丹参酮的外泌体所起的效果并不相同。
具体实施方式
除有定义外，以下实施例中所用的技术术语具有与本发明创造所属领域技术人员普遍理解的相同含义。以下实施例中所用的试验试剂，如无特殊说明，均为常规生化试剂；所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下面结合实施例来详细说明本发明创造。
实施例1人骨髓间充质干细胞外泌体(BMSCs-exo)的制备
用含有血清培养基培养的BMSCs，用PBS洗涤3次；加入无血清培养基，48h后收集培养上清；100g，4℃离心10min，取上清；2000g，4℃离心20min，取上清；0.22μm滤膜过滤；100000g，4℃离心70min，去除上清；加入适量PBS吹打洗涤后，100000g，4℃离心70min，去除上清；适量PBS重悬，-80℃保存，
采用透射电子显微镜观察到脂质双层膜包裹的圆形外泌体微粒；采用流式细胞技术检测外泌体表面特异性标志物CD81、CD9蛋白分子的表达阳性率较高；采用纳米颗粒跟踪(NTA)分析结果显示颗粒数与颗粒直径比呈正态分布，平均粒径140nm左右。
实施例2人骨髓间充质干细胞外泌体(BMSCs-exo)负载隐丹参酮(CTan)
将实施例1制备的BMSCs-exo解冻后，并于37℃恒温床保存，取50μg CTan与等质量的BMSCs-exo混合，通过电转的方法制备BMSCs-exo-CTan。电击条件为电压420V，电容150μF，于4mm电转杯进行电转。随后用倒置离心超滤膜过滤，去除未转染进外泌体内的游离化合物，制备得到BMSCs-exo-CTan。
建立小鼠模型和分组
取90只6-7周龄雄性昆明种小鼠，分为实验组1-7以及模型组和对照组，其中实验组1-7以及模型组静脉注射环磷酰胺溶液60mg/kg/d，对照组注射等量的生理盐水，连续注射5天后采集实验组小鼠精液，涂片镜检，直至无精子检出，建模成功。建模成功后，按照表1的浓度给予模型小鼠20mg/kg/d的剂量灌胃，对照组和模组灌胃等量的生理盐水，共计30天。
表1分组数据
分组 小鼠数量 BMSCs-exo-CTan的质量百分比(％)
实验组1 10 0.3
实验组2 10 0.5
实验组3 10 0.8
实验组4 10 1.0
实验组5 10 1.2
实验组6 10 1.5
实验组7 10 1.2(BMSCs-exo)
模型组 10 /
对照组 10 /
BMSCs-exo-CTan体外对精子存活率的影响
将对照组的小鼠采用电刺激法采集精液并用计数板计数，调整细胞浓度为1×108，37℃保存，使用实验组1-7的制剂体外孵育30min后采用伊红染色检测精子存活率。结果见表2。
表2BMSCs-exo-CTan对精子存活率的影响
Figure BDA0003050149620000041
Figure BDA0003050149620000051
从上表中可以看出，在体外BMSCs-exo-CTan可显著提高精子的存活率。
小鼠睾丸SOD含量测定
将各组的小鼠睾丸组织剪碎，于生理盐水中匀浆，3000rpm 4℃离心10min，取上清，严格按照SOD检测试剂盒说明书测定小鼠睾丸组织中SOD活性及蛋白含量。结果见下表。
表3 BMSCs-exo-CTan对小鼠睾丸SOD活性的影响
分组 SOD活性(U/m.gprot)
实验组1 39.05±2.07
实验组2 38.57±4.86
实验组3 45.72±1.23
实验组4 49.19±4.47
实验组5 48.66±3.55
实验组6 36.92±4.13
实验组7 30.48±0.93
模型组 22.07±1.09
对照组 50.10±5.83
从上表中可以看出，实验组1-6的BMSCs-exo-CTa可以显著提高小鼠睾丸组织中SOD活性，降低氧化应激水平，进而提高精子质量，达到提高生育能力的效果。
小鼠睾丸DJ-1蛋白测定
将各组的小鼠睾丸组织剪碎，于RIPA裂解液中匀浆，12000rpm4℃离心20min，取上清，严格按照DJ-1蛋白elisa检测试剂盒说明书测定小鼠睾丸组织总蛋白含量，确定蛋白上样量。
按照DJ-1蛋白elisa检测试剂盒说明书配置凝胶，蛋白样品加入5×上样缓冲液，100℃煮沸5min，使蛋白质变性。按蛋白定量结果上样，50V恒压电泳0.5h，待蛋白进入浓缩胶后改变电压，100V恒压电泳2h。结果见下表。
表4 BMSCs-exo-CTan对小鼠睾丸DJ-1蛋白含量的影响
分组 DJ-1蛋白含量(％)
实验组1 80.6
实验组2 82.7
实验组3 98.2
实验组4 97.1
实验组5 98.6
实验组6 85.9
实验组7 83.7
模型组 61.3
对照组 100
从上表中可以看出，BMSCs-exo-CTan可以显著提高小鼠睾丸组织内DJ-1蛋白的含量，同时相较于单纯的BMSCs-exo，负载了CTan的外泌体可以明显提高小鼠睾丸组织氧化应激水平，进而提高精子质量，达到提高生育能力的效果。
以上所述仅为本发明创造的较佳实施例而已，并不用以限制本发明创造，凡在本发明创造的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明创造的保护范围之内。

Claims (7)

1.一种用于防治男性性功能障碍的干细胞外泌体制剂，其特征在于：其活性成分为由间充质干细胞来源的外泌体负载隐丹参酮而得，所述外泌体通过电转法负载隐丹参酮。
2.根据权利要求1所述的干细胞外泌体制剂，其特征在于：所述制剂中活性成分的质量百分比为0.3-1.5％。
3.根据权利要求1所述的干细胞外泌体制剂，其特征在于：所述制剂中活性成分的质量百分比为0.8-1.2％。
4.根据权利要求1所述的干细胞外泌体制剂，其特征在于：所述间充质干细胞为人骨髓间充质干细胞。
5.权利要求1所述的干细胞外泌体制剂，其特征在于：所述电转法的条件为：电压为420V，电容为150μF。
6.权利要求1-5所述的制剂在制备治疗男性性功能障碍药物中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述男性性功能障碍为非梗阻性无精症。
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