CN114377036A - 一种用于治疗睾丸萎缩的组合物及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

一种用于治疗睾丸萎缩的组合物及其制备方法，涉及治疗睾丸萎缩的药物领域，尤其涉及一种用于治疗睾丸萎缩的组合物及其制备方法。是要解决现有富血小板血浆治疗睾丸萎缩的效果不佳的问题。该组合物包括血小板裂解液和BMSCs外泌体，血小板裂解液和BMSCs外泌体的体积比为1:1。本发明将血小板裂解液sPL和BMSCs外泌体制成一种促进细胞再生的组合物，用于大鼠睾丸萎缩的改善与治疗。以激活恢复精原干细胞功能为切入点，寻找能使EGF、bFGF及IGF‑1三种促精原干细胞增殖的生长因子分泌增多的sPL制备方法及高表达miR‑486‑5p外泌体的BMSCs培养方法。本发明用于睾丸萎缩的治疗。

Description

一种用于治疗睾丸萎缩的组合物及其制备方法
技术领域
本发明涉及治疗睾丸萎缩的药物领域，尤其涉及一种用于治疗睾丸萎缩的组合物及其制备方法。
背景技术
随着人类寿命的延长和老龄化人口的增加，生育问题变得越来越重要。经研究发现，随着年龄的增长，男性精子数量和质量以及生物可用或游离血清睾酮(T)水平逐渐且稳定地下降，从而导致男性睾丸萎缩的发病率有所增加。人类睾丸中与年龄相关的差异包括产生T细胞的睾丸间质细胞体积或数量的减少，以及睾丸支持细胞和生殖细胞形态和数量的变化，这两者都可能导致精子发生期间生殖细胞的年龄相关变性。这些发现表明，与年龄相关的睾丸功能下降的机制是睾丸固有的；但睾丸萎缩并不是衰老动物所独有的，其可由多种因素导致，例如环境因素、内分泌疾病和遗传因素等。而精子发生是发生在睾丸生精上皮中的一个动态同步过程，精原干细胞在此过程中增殖和分化，产生成熟的单倍体生殖细胞，这一复杂的过程依赖于睾丸支持细胞产生的旁分泌作用因子，以及睾丸间质细胞产生的雄激素。可见良好的生殖功能需依靠于睾丸内的各种细胞共同协调作用。
睾丸是男性生殖器官的一部分，具有分泌雄性激素、产生精子、维持正常男性生育功能和性功能的作用。近年来，由于生活环境等因素的影响，睾丸萎缩症状越来越多，且目前尚无较好的治疗方法。由于雄激素特殊的生理功能，部分人群选择外源性给予雄激素以达到减缓或改善睾丸萎缩的目的。但外源性雄激素的不合理应用，可能会加重睾丸萎缩的发生，进而影响其正常生理功能。因此，尝试考虑使用外源性生长因子来激活自体细胞，使细胞重新恢复本职功能，进而达到治疗效果。近年来有多项研究发现，富血小板血浆(PRP)对男性生殖功能疾病有一定的改善作用，2019年Dehghani F等人通过体视学方法评估PRP对睾丸结构损伤模型大鼠功能的影响，结果显示，PRP能显著增加睾丸损伤模型大鼠的生精干细胞数量、精子数量、以及睾酮水平，表明PRP能改善大鼠睾丸结构和功能损伤。2020年Samy A等人研究发现，PRP能显著减轻扭转性退行性睾丸变性。2017年Sekerci CA等人研究发现，PRP通过抑制中性粒细胞浸润和氧化应激，对睾丸组织产生缺血/再灌注损伤有一定的保护作用。以上研究均表明，PRP对改善男性生殖功能障碍有所帮助。但是PRP对于睾丸萎缩的治疗效果并不显著。
发明内容
本发明是要解决现有富血小板血浆治疗睾丸萎缩的效果不佳的问题，提供一种用于治疗睾丸萎缩的组合物及其制备方法。
本发明用于治疗睾丸萎缩的组合物包括血小板裂解液(sPL)和BMSCs外泌体，血小板裂解液和BMSCs外泌体的体积比为1:1。其中血小板裂解液中EGF因子的浓度为631-674pg/mL，bFGF因子的浓度为86-107pg/mL，IGF-1因子的浓度为26-30ng/mL；BMSCs外泌体中外泌体蛋白的浓度为1μg/μL。
进一步的，所述血小板裂解液的制备方法具体为：
将采集的大鼠全血以150-500×g的速度离心15-20min，取上层血浆，再以900-1300×g的速度离心20-25min，取下层富血小板血浆(PRP)，保证下层体积是全血体积的1/10；
向制备的PRP中添加CaCl2和III型胶原，置于-80℃冻存8h后，于37℃解冻5min，然后反复冻融10次，将最后一次解冻的裂解液于3000×g离心15-20min，取上清，即为sPL。其中PRP中CaCl2的浓度为20-30mM，PRP中III型胶原的浓度为15-35μg/mL。
所述反复冻融的条件为每次于-80℃冷冻1h，再于37℃解冻5min。
进一步的，所述BMSCs外泌体的制备方法具体为：
取大鼠骨髓间充质干细胞，使用BMSCs条件培养基重悬后，接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中以37℃培养，每48-72h换液，待细胞贴壁至80％-90％时进行传代；
大鼠骨髓间充质干细胞培养至第三代时，且待细胞贴壁至50％-60％时，更换为无外泌体培养基，继续培养，待细胞生长至90-100％时，收取上清液，利用超速离心法提取外泌体。
进一步，所述BMSCs条件培养基中按体积百分比由92％MSCBM、5％sPL、2％精囊液、1％青霉素链霉素和2IU/mL肝素钠组成。
所述无外泌体培养基是由BMSCs条件培养基于4℃、100000×g超速离心16h后，收集上层2/3体积的培养基制得的。
进一步，所述超速离心法具体为：
一、将收集的上清液于4℃，以300×g的速度离心10min去除活细胞，取上清液进行下一步操作；
二、将步骤一得到的上清液于4℃，以2000×g的速度离心10min去除死细胞，取上清液进行下一步操作；
三、将步骤二得到的上清液于4℃，以10000×g的速度离心30min去除细胞碎片；
四、将上清液转移至超滤离心管中，离心收集浓缩液；
五、将浓缩液转移至超速离心管中，于4℃，以100000×g超速离心75min，保留管底沉淀；
六、然后加入PBS重悬沉淀，于4℃，以100000×g的速度离心75min，保留管底沉淀；
七、用预冷的PBS重悬沉淀，即为外泌体；其中每150μg外泌体加入150μL的PBS。
本发明的有益效果：
本发明将血小板裂解液sPL和BMSCs外泌体制成一种促进细胞再生的组合物，用于大鼠睾丸萎缩的改善与治疗。以激活恢复精原干细胞功能为切入点，寻找能使EGF、bFGF及IGF-1三种促精原干细胞增殖的生长因子分泌增多的sPL制备方法及高表达miR-486-5p外泌体的BMSCs培养方法，将此sPL与外泌体联合应用，以定向激活精原干细胞，使其增殖及自我更新，为人源BMSCs外泌体及sPL的睾丸萎缩临床研究提供技术支持与治疗思路。
1、本发明PRP的分离采用两步离心法进行，第一次为150-500×g速度离心，利用低转速将血浆和血细胞分开，保证血小板留在血浆内而不沉入血细胞中；收取第一步离心的全部血浆进行第二次离心，第二次为告诉离心，使血小板尽可能沉降于管底及底层血浆中，使上层血小板含量较低，增强血小板浓缩效率。
2、本发明中向高浓缩PRP进行添加不同种类及不同浓度的激活剂，并调整激活时间，进而使其中促精原干细胞增殖相关生长因子特异性释放，增加有效因子浓度，从而筛选出最佳sPL制备方案，进而可增强睾丸萎缩治疗效果。
本发明中，利用CaCl2、牛凝血酶、III型胶原等血小板激活剂进行血小板激活，通过不同种类组合及不同浓度调整进行更加有效实现激活的目的。CaCl2能够促进内源凝血酶的激活，进而激活血小板中的α颗粒，从而释放其中因子；III型胶原可以粘附血小板，适宜浓度的III型胶原可以使血小板聚集并有效激活，使α颗粒中生长与免疫调节因子充分释放。本发明中利用适当浓度的CaCl2进行内源性凝血酶激活，同时利用适宜浓度III型胶原进行血小板募集及激活，能够使α颗粒更为充分的释放所需因子。
3、本发明制备外泌体所使用的细胞为BMSCs，具有多向分化潜能和高增殖特性，组织相容性好，排斥反应较弱，且分离简单，其外泌体含有多种生长因子，且本研究中利用含有精囊液的特定条件培养基进行BMSCs培养，所获得的外泌体即含有更高的促精原干细胞增殖的相关成分，为治疗男性睾丸萎缩提供可能。
本发明BMSCs培养过程中在基础培养基中添加了sPL和精囊液，sPL中富含干细胞增殖所需的生长类因子，能够有效维持干细胞的增殖和分泌特性，同时精囊液内含高浓度果糖、前列腺素、蛋白质、抗坏血酸、肌醇、山梨醇等，可为细胞提供营养和能源，与此同时，其中水通道蛋白AQPs可以参与细胞增殖，迁移和凋亡，改变细胞内DNA转录谱，进而调节miRNA种类及表达量变化，因此，本发明中c组培养基提高了BMSCs的miR-486-5p表达，进而获得高miR-486-5p含量的外泌体。
4、本发明利用sPL中生长因子及营养成分较为丰富的特点，将其加入到BMSCs培养体系中，更有利于干细胞增殖及特性维持，并且解决异种及异源成分引入对治疗安全性产生的影响，避免了血清易致其发生分化及老化而改变其功能的问题。
sPL中具有较高浓度的促细胞增殖因子，并且含有一些免疫调节类因子，如EGF、bFGF、IGF-1及TGF-β等，可以调节炎症环境并促进其中的睾丸间质细胞、支持细胞及精原干细胞增殖，但其中缺乏促进精原干细胞分化的SCF、Plzf、Sohlh及一些miRNA等物质；而BMSCs外泌体含较少的生长类因子，在促增殖方面不具有较大优势，但经精囊液培养后，其外泌体中可含有较高含量可以调节增殖与分化平衡的内在蛋白及miRNA，这些物质能够通过调控信号通路来保持干细胞的平衡。在精原干细胞增殖较弱时，支持细胞分泌的因子(如GDNF)可以促进精原干细胞增殖，保证干细胞的数量维持，但在精原干细胞增殖较强时，Plzf可抑制Kit基因的转录，促进精原干细胞的分化作用，保持干细胞的平衡，进而保证生殖能力。因此，在sPL调节炎症环境及促睾丸间质细胞、支持细胞及精原干细胞增殖，修复及补充缺损细胞后，BMSCs外泌体进而再调节支持细胞分泌，以及其中miR-486-5p调节精原干细胞分化平衡，最终通过BMSCs外泌体与sPL二者协同作用进行睾丸萎缩修复。
5、本发明所制备的BMSCs经扩增纯化后进行超低温冷冻保存，应用时即可对其进行复苏，避免了患者应用时的时间限制。
本发明的组合物在睾丸萎缩治疗过程中可以提高治疗效果，为睾丸萎缩及生精障碍等临床研究提供新思路、新方法。
附图说明
图1为使用BMSCs常规培养基进行原代细胞培养5天的骨髓间充质干细胞生长状况；
图2为使用配方a的BMSCs条件培养基进行原代细胞培养5天的骨髓间充质干细胞生长状况；
图3为使用配方b的BMSCs条件培养基进行原代细胞培养5天的骨髓间充质干细胞生长状况；
图4为使用配方c的BMSCs条件培养基进行原代细胞培养5天的骨髓间充质干细胞生长状况；
图5为使用BMSCs常规培养基培养的P1代细胞；
图6为使用配方a的BMSCs条件培养基培养的P1代细胞；
图7为使用配方b的BMSCs条件培养基培养的P1代细胞；
图8为使用配方c的BMSCs条件培养基培养的P1代细胞；
图9为透射电镜下的外泌体形态图；
图10为外泌体表面标志物鉴定结果；
图11为外泌体中miR-486-5P的表达情况。
具体实施方式
本发明技术方案不局限于以下所列举具体实施方式，还包括各具体实施方式间的任意组合。
具体实施方式一：本实施方式用于治疗睾丸萎缩的组合物包括血小板裂解液(sPL)和BMSCs外泌体，血小板裂解液和BMSCs外泌体的体积比为1:1；其中血小板裂解液中EGF因子的浓度为631-674pg/mL，bFGF因子的浓度为86-107pg/mL，IGF-1因子的浓度为26-30ng/mL；BMSCs外泌体中外泌体蛋白的浓度为1μg/μL。
具体实施方式二：本实施方式是对具体实施方式一的进一步说明：所述血小板裂解液的制备方法具体为：
将采集的大鼠全血以150-500×g的速度离心15-20min，取上层血浆，再以900-1300×g的速度离心20-25min，取下层富血小板血浆(PRP)，保证下层体积是全血体积的1/10；
向制备的PRP中添加CaCl2和III型胶原，置于-80℃冻存8h后，于37℃解冻5min，然后反复冻融10次，将最后一次解冻的裂解液于3000×g离心15-20min，取上清，即为sPL。其中PRP中CaCl2的浓度为20-30mM，PRP中III型胶原的浓度为15-35μg/mL。其它与具体实施方式一相同。
本实施方式sPL的制备方法中，CaCl2能够促进内源凝血酶的激活，进而激活血小板中的α颗粒，从而释放其中因子；III型胶原可以粘附血小板，适宜浓度的III型胶原可以使血小板聚集并有效激活，使α颗粒中生长与免疫调节因子充分释放。本实施方式中利用适当浓度的CaCl2进行内源性凝血酶激活，同时利用适宜浓度III型胶原进行血小板募集及激活，能够使α颗粒更为充分的释放所需因子。冻融可以加速血小板的裂解，辅助激活剂进行α颗粒激活释放其中因子。
具体实施方式三：本实施方式是对具体实施方式二的进一步说明：所述反复冻融的条件为每次于-80℃冷冻1h，再于37℃解冻5min。其它与具体实施方式二相同。
具体实施方式四：本实施方式是对具体实施方式一或二的进一步说明：所述BMSCs外泌体的制备方法具体为：
取大鼠骨髓间充质干细胞，使用BMSCs条件培养基重悬后，接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中以37℃培养，每48-72h换液，待细胞贴壁至80％-90％时进行传代；
大鼠骨髓间充质干细胞培养至第三代时，且待细胞贴壁至50％-60％时，更换为无外泌体培养基，继续培养，待细胞生长至90-100％时，收取上清液，利用超速离心法提取外泌体。其它与具体实施方式一或二相同。
具体实施方式五：本实施方式是对具体实施方式四的进一步说明：所述BMSCs条件培养基中按体积百分比由92％MSCBM、5％sPL、2％精囊液、1％青霉素链霉素和2IU/mL肝素钠组成。其它与具体实施方式四相同。
本实施方式中，BMSCs培养过程中在基础培养基中添加了sPL和精囊液，sPL中富含干细胞增殖所需的生长类因子，能够有效维持干细胞的增殖和分泌特性，同时精囊液内含高浓度果糖、前列腺素、蛋白质、抗坏血酸、肌醇、山梨醇等，可为细胞提供营养和能源，与此同时，其中水通道蛋白AQPs可以参与细胞增殖，迁移和凋亡，改变细胞内DNA转录谱，进而调节miRNA种类及表达量变化，因此，本发明中c组培养基提高了BMSCs的miR-486-5p表达，进而获得高miR-486-5p含量的外泌体。
具体实施方式六：本实施方式是对具体实施方式四的进一步说明：所述无外泌体培养基是由BMSCs条件培养基于4℃、100000×g超速离心16h后，收集上层2/3体积的培养基制得的。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式七：本实施方式是对具体实施方式四的进一步说明：所述超速离心法具体为：
一、将收集的上清液于4℃，以300×g的速度离心10min去除活细胞，取上清液进行下一步操作；
二、将步骤一得到的上清液于4℃，以2000×g的速度离心10min去除死细胞，取上清液进行下一步操作；
三、将步骤二得到的上清液于4℃，以10000×g的速度离心30min去除细胞碎片；
四、将上清液转移至超滤离心管中，离心收集浓缩液；
五、将浓缩液转移至超速离心管中，于4℃，以100000×g超速离心75min，保留管底沉淀；
六、然后加入PBS重悬沉淀，于4℃，以100000×g的速度离心75min，保留管底沉淀；
七、用预冷的PBS重悬沉淀，即为外泌体；其中每150μg外泌体加入150μL的PBS。其它与具体实施方式四相同。
具体实施方式八：本实施方式是对具体实施方式四的进一步说明：将提取的外泌体于-80℃冷冻保存，使用时进行复苏。其它与具体实施方式四相同。
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
本实施例用于治疗睾丸萎缩的组合物的制备方法，包括以下步骤：
一、高浓度的PRP分离
(1)血液采集：将动物麻醉后，利用含有枸橼酸钠抗凝剂的采血管对大鼠进行全血采集；
(2)PRP分离：将采集的全血于2-8℃条件下转移至分离室，混匀后将全血以150-500×g的速度离心15min，取上层血浆，再以900-1 300×g的速度离心20min，去掉上层的乏血小板血浆(Platelet-poor plasma，PPP)，留取下层富血小板血浆(Platelet-richplasma，PRP)，保证下层体积是全血体积的1/10，利用移液器吹打底部充分悬起贴于离心管底部的血小板沉淀。
二、sPL的制备：采用如下四种方案，对sPL进行制备。
方案A：向上述PRP中加入CaCl2(终浓度为20-30mM)和III型胶原(终浓度为15-35μg/mL)，置于-80℃冻存8h后，37℃解冻5min，反复冻融5次或者10次，3000×g的速度离心15min；其中采用反复冻融5次的为方案A1，采用反复冻融10次的为方案A2。
方案B：向上述PRP中加入CaCl2(终浓度为20-30mM)和牛凝血酶(终浓度为75-105U/mL)，置于-80℃冻存8h后，37℃解冻5min，反复冻融5次或者10次，3000×g的速度离心15min；其中采用反复冻融5次的为方案B1，采用反复冻融10次的为方案B2。
方案C：向上述PRP中加入III型胶原(终浓度为15-35μg/mL)和牛凝血酶(终浓度为75-105U/mL)，置于-80℃冻存8h后，37℃解冻5min，反复冻融5次或者10次，3000×g的速度离心15min；其中采用反复冻融5次的为方案C1，采用反复冻融10次的为方案C2。
方案D：将上述PRP置于-80℃冻存8h后，37℃解冻5min，反复冻融5次或者10次，3000×g的速度离心15min。其中采用反复冻融5次的为方案D1，采用反复冻融10次的为方案D2。
上述四组方案中3000×g的速度离心15min后，取上清即为sPL，沉淀为细胞或者血小板的碎片；离心后获得的sPL不需要进行稀释，此即为含生长因子的血小板裂解液。
将上述四组方案获取的血小板裂解液进行ELISA检测，以评估EGF、bFGF及IGF-1等促睾丸支持细胞、间质细胞及精原干细胞增殖的生长因子含量并进行比较，结果如表1所示，A、B、C、D四组组内冻融次数比较显示，冻融10次生长因子含量较冻融5次明显增加；而组间比较结果显示，A、B、C三组添加激活剂的激活效果均优于D组单纯冻融处理激活组，其中A组添加CaCl2和III型胶原两种激活剂激活效果最好，基于以上结果，本发明选择可充分激活血小板且释放生长因子较多的A2方案，具体方法为向先前制备的PRP中添加CaCl2(终浓度为20-30mM)和III型胶原(终浓度为15-35μg/mL)，置于-80℃冻存8h后，37℃解冻5min，反复冻融10次，将最后一次溶解的裂解液于3000×g的速度离心15min，以获取富含特定生长因子的血小板裂解液。
表1不同冻融条件下促精原干细胞增殖相关因子含量(n＝8)
Figure BDA0003497294100000081
Figure BDA0003497294100000091
注：A、B、C、D四组各组内比较差异显著(P＜0.05)，A、B、C三组与D组比较，均差异显著(P＜0.05)；且在三组添加激活剂组中，A组与B、C两组组间比较均差异显著(P＜0.05)，B组与C组无统计学意义(P＞0.05)。
三、精囊腺及股骨取材
(1)精囊腺取材及精囊液制备：将大鼠处死后，置于手术台上，剪开腹腔皮肤，取出精囊腺，将精囊腺剪碎至约1mm3组织块，而后进行2000×g的速度离心10min，收取上清液，从而制备精囊液。
(2)股骨取材及细胞制备：将大鼠处死后，置于手术台上，剪开后腿皮肤，准确判断大腿关节，将后腿剥离其身体，并剪掉爪子，剔除皮肤和肌肉，取下两侧股骨，置于配有双抗的生理盐水中，封闭样本瓶口。
四、BMSCs分离、培养及冻存
(1)消毒、漂洗
将所取得大鼠股骨样本转移至75％的酒精中，完全浸泡5min，使其充分消毒，去除表面细菌。消毒完毕后，将股骨样本转移至含有1％双抗的生理盐水中，进行浸泡清洗，重复清洗3次。
(2)溶液的配制：
试剂：基础培养基MSCBM，血清(FBS)，肝素钠，青霉素链霉素，二甲基亚砜(DMSO)；
BMSCs常规培养基配制：89％MSCBM+10％FBS+1％青霉素链霉素(各组分含量为体积百分比)；
BMSCs条件培养基的配制：(各组分含量为体积百分比)
配方a：97％MSCBM+2％精囊液+1％青霉素链霉素，
配方b：94％MSCBM+5％sPL+2IU/mL肝素钠+1％青霉素链霉素，
配方c：92％MSCBM+5％sPL+2％精囊液+2IU/mL肝素钠+1％青霉素链霉素；
细胞冻存液的配制：85％MSCBM+5％sPL+10％DMSO(各组分含量为体积百分比)。
(3)细胞分离与培养：
用咬骨剪将股骨两端剪开，暴露骨髓腔，用培养基冲洗骨髓腔直至骨髓腔变白，将充满细胞的培养基转移至离心管中，以1800rpm离心5min，弃去上清，收集管底沉淀，分别用常规培养基及三种不同配方的BMSCs条件培养基进行重悬，混匀后接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中以37℃培养。
以上步骤均在生物安全柜中进行，所用器械均采用高压蒸汽灭菌消毒。
(4)细胞传代
原代细胞分离提取后，每三天进行换液处理，用生理盐水轻轻冲洗，去除死细胞及细胞碎片等杂质，更换为新的相应配方的BMSCs条件培养基，使用BMSCs常规培养基进行原代细胞培养5天的骨髓间充质干细胞生长状况如图1所示，使用配方a的BMSCs条件培养基进行原代细胞培养5天的骨髓间充质干细胞生长状况如图2所示，使用配方b的BMSCs条件培养基进行原代细胞培养5天的骨髓间充质干细胞生长状况如图3所示，使用配方c的BMSCs条件培养基进行原代细胞培养5天的骨髓间充质干细胞生长状况如图4所示。图1-图4可以说明：常规培养基与3种BMSCs条件培养基在原代培养过程中，细胞贴壁及形态无明显差别。
细胞置于CO2培养箱中继续培养，待细胞贴壁至80-90％时进行传代。传代过程：经500μL 0.3×TrypLE Express消化，待细胞变圆后，加入1mL培养基进行中和以终止消化，吹打培养瓶底壁使细胞消化完全，转移至离心管以1800rpm离心5min后，弃去上清液，用完全培养基重悬细胞沉淀，以1×105/mL接种至T75细胞培养瓶，置于CO2培养箱中进行培养。3天后观察P1代细胞生长状况如图5-8所示，其中图5为使用BMSCs常规培养基培养的P1代细胞，图6为使用配方a的BMSCs条件培养基培养的P1代细胞，图7为使用配方b的BMSCs条件培养基培养的P1代细胞，图8为使用配方c的BMSCs条件培养基培养的P1代细胞。图5-图8表明：常规培养基培养的细胞传代后生长速度较3种条件培养基慢，且形态未伸展为间充质特有的纤维状，同时3种条件培养基培养BMSCs后生长速度及形态未见显著差别，说明各个条件培养基对细胞生长有利且未影响细胞形态。将细胞继续传至P3代后，对P3代细胞进行消化处理，用流式细胞仪检测其表型，包括CD73，CD90，CD105及CD34、CD45检测，结果显示，细胞低表达或不表达CD34、CD45，但CD73、CD90、CD105表达量均高于98％。
(5)细胞冻存
细胞传代培养至P1代和P3代时，进行冻存处理，按照细胞冻存管数提前配置好冻存液，放置于4℃冰箱中预冷备用；将细胞消化离心后，用冻存液重悬沉淀，按1×106/mL进行冻存，放置于程序降温盒中于-80℃冰箱冷冻过夜，第二天转移至液氮中进行长期储存。
五、BMSCs外泌体的提取与鉴定
(1)外泌体的提取
大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs培养至第三代时，待细胞贴壁至50％-60％时换为相应的无外泌体培养基(四组培养基分别以4℃100000×g超速离心16h后，收集上层2/3体积的培养基，即为相应的无外泌体培养基)继续培养，待细胞生长至90％-100％时，分别收取四组培养上清液至50mL离心管中(上清液中细胞数量为3×107个)，利用超速离心法提取外泌体，具体步骤如下：
a、将收集后的上清液于4℃，300×g离心10min去除活细胞，取上清再进行下一步操作；
b、取上清液于4℃，2000×g离心10min去除死细胞，取上清再进行下一步操作；
c、于4℃，10000×g离心30min去除细胞碎片；
d、将上清液转移至100KD 50ml超滤离心管中，离心收集浓缩液；
e、将浓缩液转移至超速离心管中，于4℃，100000×g超速离心75min，保留管底沉淀；
f、然后加入PBS重悬沉淀，于4℃，100000×g离心75min，保留管底沉淀；
g、然后用150μL预冷的PBS重悬沉淀，即为外泌体，于-80℃备用。
(2)外泌体的形态学鉴定
利用透射电镜技术(TEM)观察外泌体形态：
a、用移液枪吸取20μL样本滴于铜网上，等待15min；
b、轻轻吸去多余液体，用醋酸双氧铀于25℃条件下负染10min；
c、吸干负染液，PBS小心冲洗一次，自然晾干；
d、将铜网放置在透射电镜下，80kv-120kv下观察外泌体形态并拍照。
结果见图9，可见囊泡样结构，呈典型的茶托状，与外泌体形态一致。
(3)Western Blot检测外泌体标志蛋白
a、将细胞及四组外泌体蛋白样本与5×buffer按4:1的比例混合均匀后，于90℃水浴8-10min；
b、参照SDS-PAGE凝胶制备试剂盒的说明书配胶；
c、待胶凝固后，将蛋白Marker和外泌体蛋白样本加入到点样孔中；
d、安装电泳槽，70V观察浓缩胶是否漏样，30min后调置120V，电泳60-90min左右结束；
e、切除浓缩胶及无用区域后取下凝胶；
f、准备一张与分离胶大小相等的PVDF膜，甲醇激活1min；
g、按顺序安装转印装置，从负极到正极依次为纤维垫、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、纤维垫，将转印装置放入转膜槽内，400mA工作30min；
h、取出PVDF膜用5％的脱脂乳在25℃条件下封闭2h，用TBST漂洗2次，每次5min；
i、用TSG101和CD9抗体4℃孵育过夜(约10h)，隔天用TBST充分漂洗5次，每次10min；
j、用对应的二抗室温孵育1h，TBST漂洗5次，每次10min；
k、用1:1的ECL发光显影液铺满PVDF膜，凝胶成像系统观察实验结果。
结果见图10，在四组外泌体样本中，表面标志蛋白TSG101和CD9均呈阳性，而在BMSCs中基本不表达，证明成功提取外泌体。
(4)miR-486-5P的表达情况检测
①BMSCs外泌体总RNA的提取
取适量外泌体于新的无RNA酶的EP管中，加入Trizol充分裂解外泌体；以12000rpm离心10min，取上清转移至新EP管；每个EP管内加入氯仿，剧烈振荡后室温静置10min；以12000rpm离心15min，将上层水相移至新EP管并与异丙醇充分混匀，静置沉淀10min；以12000rpm离心15min，弃管中残余液体后滴加适量DEPC水配制的75％乙醇溶液，轻轻翻转洗涤沉淀；以12000rpm离心5min后吸弃上清，待RNA无色透明时加适量去离子水，测定RNA样本浓度(以上步骤均在4℃条件下操作)。
②BMSCs外泌体总RNA的反转录
使用miRNA加尾法反转录试剂盒Mir-XTM miRNA First-Strand Synthesis Kit对miRNA进行反转录，根据试剂盒说明进行具体操作，反转录体系见表2：
表2 miRNA反转录体系
Figure BDA0003497294100000131
注：在水浴锅中，37℃孵育1h，85℃孵育5min；每个反应体系再次加入90μl DEPC水，置于-20℃环境中保存待用。
③荧光定量PCR(qRT-PCR)检测miR-486-5P的表达
以miRNA反转录试剂盒中U6为内参，检测两种条件培养基下间充质干细胞外泌体中目的miRNA的表达水平，并进行比较；由上海生工合成并纯化miR-486-5P的定量引物(F：GCAGTCCTGTACTGAGCTG，R：GTCCAGTTTTTTTTTTTTTTTTCTCG)；使用相对定量法计算miRNA的表达水平，所有样品均进行三次重复分析；荧光定量反应体系及程序如下表3、表4所示：
表3 miRNA荧光定量扩增体系
Figure BDA0003497294100000132
表4 miRNA荧光定量扩增程序
Figure BDA0003497294100000133
结果见图11，荧光定量PCR检测结果显示，与常规培养基组相比，三组条件培养基组间充质干细胞外泌体中miR-486-5p的表达量均显著升高，其中配方c的BMSCs条件培养基组(即sPL与精囊液联合培养组)间充质干细胞外泌体中miR-486-5p的表达量最高，与a、b组比较均差异显著(P＜0.05)。本发明选用配方c的BMSCs条件培养基来培养间充质干细胞，以促进精原干细胞分化。
microRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，它们在动植物中参与转录后基因表达调控。miR-486-5p是由脂肪干细胞、骨髓间充质干细胞、睾丸支持细胞、肿瘤细胞等表达，miR-486-5的过表达下调PTEN基因的表达，上调Stra8基因和联会复合体3(SYCP3)基因的表达，促进精原干细胞由有丝分裂转换为减数分裂，从而调节分化作用。本发明中，用含精囊液培养基进行骨髓间充质干细胞培养，通过进一步提高miR-486-5p表达，获得含miR-486-5p更高的外泌体，从而进行调节精原干细胞分化作用。
六、治疗睾丸萎缩的组合物制备
将上述获得的sPL与外泌体按体积比1:1混合，制成注射制剂，分装于1.5mL的EP管中于-80℃冰箱中冻存备用。
七、鼠睾丸萎缩模型的治疗效果观察
用质量浓度为1％的2，5-己二酮饮水饲喂大鼠35d，建立睾丸萎缩模型大鼠，将模型大鼠平均分为四组：第一组是不治疗的对照组，用生理盐水行睾丸注射进行假治疗；第二组用先前制备好的sPL行睾丸注射进行治疗；第三组用制备好的BMSCs外泌体行睾丸注射进行治疗；第四组用sPL与外泌体混合制剂(体积比1:1)行睾丸注射进行治疗。四组动物注射剂量及时间次数统一，每7天一次，治疗6次，设计为一个疗程，最后一次治疗后7天将大鼠处死进行全血采集和双侧睾丸取材。将采集的全血进行离心分离血清，以备ELISA检测血清睾酮和黄体生成素表达水平，对新鲜睾丸进行重量及长度测量，睾丸于-80℃冰箱中冷冻保存，以备核酸及蛋白检测，对比治疗效果。
治疗结果：
睾酮的合成与男子生殖功能及衰老相关，对精子发生和成熟也具有重要生理作用，是体内重要的雄激素，精子的产生在内分泌等许多因素下进行，过程较为复杂，如果睾丸受损，往往表现为睾酮的降低和促黄体生成素的升高。因此，血清性激素T和LH的水平可以反映精子的发生的情况。ELISA检测结果(表5)显示，三组治疗组血清睾酮均显著高于模型组，其中sPL与外泌体混合制剂治疗组最为显著，治疗后结果中睾酮水平升高，而促黄体生成素水平下降，则表明睾丸功能有所改善；睾丸重量及睾丸与体重比例见表6，可见治疗组睾丸与模型组相比睾丸湿重与指数均明显升高，其中sPL与外泌体混合制剂组最为显著，表明萎缩程度有所恢复且混合制剂组效果最好；荧光定量PCR检测C-kit mRNA的表达(表7)，可知三组治疗组较模型组表达量均显著升高，其中混合制剂组改善效果最显著。
表5血清T和LH表达情况(n＝8)
Figure BDA0003497294100000151
注：与模型组相比，三组治疗组血清T和LH水平均有所改善，且差异显著(P＜0.05)；其中血清T水平显示，单纯sPL治疗组与单纯外泌体治疗组相比无统计学意义，此两组分别和sPL与外泌体混合治疗组相比，差异显著(P＜0.05)，而血清LH水平显示三组治疗组相比均无统计学意义(P＞0.05)。
表6体重、睾丸湿重及睾丸指数比较(n＝8)
Figure BDA0003497294100000152
注：与模型组相比，三组治疗组睾丸湿重及睾丸指数均有明显升高，且差异显著(P＜0.01)；对三组治疗组的主要指标睾丸湿重进行比较显示，单纯sPL治疗组与单纯外泌体治疗组相比无统计学意义(P＞0.05)，此两组分别和sPL与外泌体混合治疗组相比，差异显著(P＜0.05)。
表7 C-kit相对表达量变化(n＝8)
Figure BDA0003497294100000153
Figure BDA0003497294100000161
注：三组治疗组与模型组相比差异均显著(P＜0.01)；单纯sPL治疗组与单纯外泌体治疗组相比无统计学意义(P＞0.05)，此两组分别和sPL与外泌体混合治疗组相比，差异显著(P＜0.05)。

Claims (8)

1.一种用于治疗睾丸萎缩的组合物，其特征在于该组合物包括血小板裂解液和BMSCs外泌体，血小板裂解液和BMSCs外泌体的体积比为1:1；其中血小板裂解液中EGF因子的浓度为631-674pg/mL，bFGF因子的浓度为86-107pg/mL，IGF-1因子的浓度为26-30ng/mL；BMSCs外泌体中外泌体蛋白的浓度为1μg/μL。
2.根据权利要求1所述的一种用于治疗睾丸萎缩的组合物，其特征在于所述血小板裂解液的制备方法具体为：
将采集的大鼠全血以150-500×g的速度离心15-20min，取上层血浆，再以900-1300×g的速度离心20-25min，取下层富血小板血浆(PRP)，保证下层体积是全血体积的1/10；
向制备的PRP中添加CaCl2和III型胶原，置于-80℃冻存8h后，于37℃解冻5min，然后反复冻融10次，将最后一次解冻的裂解液于3000×g离心15-20min，取上清，即为sPL。其中PRP中CaCl2的浓度为20-30mM，PRP中III型胶原的浓度为15-35μg/mL。
3.根据权利要求2所述的一种用于治疗睾丸萎缩的组合物，其特征在于所述反复冻融的条件为每次于-80℃冷冻1h，再于37℃解冻5min。
4.根据权利要求1、2或3所述的一种用于治疗睾丸萎缩的组合物，其特征在于
所述BMSCs外泌体的制备方法具体为：
取大鼠骨髓间充质干细胞，使用BMSCs条件培养基重悬后，接种于培养瓶中，置于CO2培养箱中以37℃培养，每48-72h换液，待细胞贴壁至80％-90％时进行传代；
大鼠骨髓间充质干细胞培养至第三代时，且待细胞贴壁至50％-60％时，更换为无外泌体培养基，继续培养，待细胞生长至90-100％时，收取上清液，利用超速离心法提取外泌体。
5.根据权利要求4所述的一种用于治疗睾丸萎缩的组合物，其特征在于所述BMSCs条件培养基中按体积百分比由92％MSCBM、5％sPL、2％精囊液、1％青霉素链霉素和2IU/mL肝素钠组成。
6.根据权利要求5所述的一种用于治疗睾丸萎缩的组合物，其特征在于所述无外泌体培养基是由BMSCs条件培养基于4℃、100000×g超速离心16h后，收集上层2/3体积的培养基制得的。
7.根据权利要求5所述的一种用于治疗睾丸萎缩的组合物，其特征在于所述超速离心法具体为：
一、将收集的上清液于4℃，以300×g的速度离心10min去除活细胞，取上清液进行下一步操作；
二、将步骤一得到的上清液于4℃，以2000×g的速度离心10min去除死细胞，取上清液进行下一步操作；
三、将步骤二得到的上清液于4℃，以10000×g的速度离心30min去除细胞碎片；
四、将上清液转移至超滤离心管中，离心收集浓缩液；
五、将浓缩液转移至超速离心管中，于4℃，以100000×g超速离心75min，保留管底沉淀；
六、然后加入PBS重悬沉淀，于4℃，以100000×g的速度离心75min，保留管底沉淀；
七、用预冷的PBS重悬沉淀，即为外泌体；其中每150μg外泌体加入150μL的PBS。
8.根据权利要求5、6或7所述的一种用于治疗睾丸萎缩的组合物，其特征在于将提取的外泌体于-80℃冷冻保存，使用时进行复苏。
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