CN103409369A

CN103409369A - 一种快速建立间质干细胞衰老模型的方法

Info

Publication number: CN103409369A
Application number: CN2013103302032A
Authority: CN
Inventors: 孙晓春; 朱伟; 孙敏
Original assignee: Jiangsu University
Current assignee: Jiangsu University
Priority date: 2013-07-31
Filing date: 2013-07-31
Publication date: 2013-11-27

Abstract

本发明涉及一种快速建立间质干细胞衰老模型的方法，该方法配制含600、800μmol/L浓度H₂O₂的无血清L-DMEM，处理第2-3代间质干细胞2h，去除培养液，PBS洗2-3次，换常规含10%胎牛L-DMEM，继续培养48小时。本发明方法可以缩短MSCs传代8-10代，也可显著地减小培养成本，加大对衰老细胞研究的便利。

Description

一种快速建立间质干细胞衰老模型的方法

技术领域

本发明属于研究间质干细胞方法（国际专利分类号C12N5/077···间充质细胞，例如骨细胞、软骨细胞、骨髓基质细胞、脂肪细胞或肌细胞），主要涉及间质干细胞的体外培养。

背景技术

间质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）的特点是在体外容易分离，可长期传代培养并具有多向分化能力,是组织工程和细胞工程的优良细胞，也是当前的热点干细胞之一。长期传代后，MSCs会出现宽大扁平，生长缓慢，老化并停止生长，可以用于衰老的机制研究。目前MSCs在体外培养自然衰老所需要的时间比较长，约100-150天；另外MSCs一般采用胎牛血清培养，所以培养成本较高。

发明内容

为了解决现有间质干细胞衰老模型培养时间长，成本高的问题，本发明通过采用特定浓度的H₂O₂处理间质干细胞，可促进间质干细胞快速衰老，节省了时间和成本。

一种快速建立MSCs衰老模型的方法，是：配制含600μmol/L浓度H₂O₂的无血清低糖达尔伯克(氏)必需基本培养基(L-DMEM)，处理第2-3代间质干细胞2h，去除刺激培养液，PBS洗2-3次，换常规含10%胎牛L-DMEM，继续培养48小时。此时MSCs的衰老细胞比例可显著增加,β-半乳糖苷酶染色显示达到50%以上的阳性率(绿色阳性代表细胞已经衰老)。一般情况下，传代15代以上的MSCs才可能出现50%以上的阳性率。

MSCs在体外培养所需要营养条件较高，通常采用含10%胎牛血清（比较昂贵）的L-DMEM进行培养，另外间质干细胞在一般种植密度下,体外都可以传代15代左右，所以MSCs体外培养自然老化时间比较长，培养成本非常高。本发明的应用，可以缩短MSCs传代8-10代（前期传代时间为3-5天，后期传代所需时间较长为15-25天)，也可显著地减小培养成本，加大对衰老细胞研究的便利。同时，可以探索氧化应激性因素启动细胞衰老的可能机制,为预防老年性疾病的发生提供细胞理论基础。

附图说明

图1：不同浓度H₂O₂处理MSCs后的β-半乳糖苷酶染色情况。图右下方数字为H₂O₂的浓度，单位为μmol/L。

图2：不同浓度H₂O₂处理MSCs后的衰老细胞比例情况。(注：*P<0.05,**P<0.01)

图3：不同浓度H₂O₂处理MSCs后的细胞核荧光染色情况。图右下方数字为H₂O₂的浓度，单位为μmol/L。

具体实施方式

实施例1：

1.接种P3代MSCs细胞至六孔板上，培养1-2天，细胞生长约进入对数期进行以下实验。

2.配制含H₂O₂浓度600μmol/L的无血清培养液。(H₂O₂应现用现配)

3.将P3-4代MSCs用含600-μmol/L H₂O₂的无血清培养液刺激2小时。

4.去除上述培养液并用ph7.4PBS清洗2-3次。注意：清洗力度要柔和。

5.加上含10%FBS L-DMEM培养液继续培养48小时。

6.衰老模型已经建立，采用β-半乳糖苷酶染色等方法鉴定衰老细胞比例。

实施例2：β-半乳糖苷酶染色是衡量细胞衰老的金标准之一；β-半乳糖苷酶染色具体步骤如下：

1.吸出细胞细胞培养液，用PBS洗涤一次，加入1毫升固定液，室温固定15分钟。

2.吸出细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次，每次3分钟。

3.吸出PBS,每孔加入1毫升染色工作液。使用聚丙烯容器，不能使用聚苯乙烯容器配制染色工作液。

染色工作液的配制方法如下：

β-半乳糖苷酶染色液A 10μl

β-半乳糖苷酶染色液B 10μl

β-半乳糖苷酶染色液C 930μl

X-Gal溶液 50μl

d.37℃孵育过夜，可以用保鲜膜封住6孔板防止蒸发。注意：37℃孵育不能在二氧化碳培养箱中进行。e.普通光学显微镜下观察。不同浓度H₂O₂处理MSCs后的β-半乳糖苷酶染色情况如图1，阳性细胞，即衰老细胞会呈绿色。计数200个细胞，计算阳性细胞比例，结果如图2。

实施例3：细胞荧光染色情况（Hoechst33342染细胞核）

1.吸出细胞细胞培养液，用PBS洗涤一次，加入1毫升4%的多聚甲醛室温固定20-30分钟。

2.吸出细胞固定液，用PBS洗涤细胞3次

3.配置Hoechst33342染色液5uL/mL（PBS配置），每孔加入1.5mL

4.荧光显微镜下观察拍照。不同浓度H₂O₂处理MSCs后的细胞核荧光染色情况如图3。其中400-800μmol/L浓度组细胞核肿涨致细胞核荧光染色不清。

Claims

1.一种快速建立MSCs衰老模型的方法，其特征是：新鲜配制含600μmol/L浓度H₂O₂ 的无血清低糖达尔伯克(氏)必需基本培养基L-DMEM，处理第2-3代间质干细胞2h，去除培养液，PBS洗2-3次，换常规含10%胎牛L-DMEM，继续培养48小时。