KR20100122087A - 중간엽 줄기세포 입자 - Google Patents

중간엽 줄기세포 입자 Download PDF

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Abstract

본 발명자들은 중간엽 줄기세포에 의해 분비되고 하나 이상의 중간엽 줄기세포의 생물학적 특성을 포함하는 입자를 기재한다. 상기 생물학적 특성은 심장보호 또는 경색 크기의 감소와 같은 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC- CM)의 생물학적 활성을 포함한다. 상기 입자는 소포 또는 엑소솜을 포함한다.

Description

중간엽 줄기세포 입자{Mesenchymal stem cell particles}
본 발명은 발생, 세포생물학, 분자생물학 및 유전학 분야에 관한 것이다. 더욱 상세하게는 본 발명은 배아 줄기세포에서 중간엽 줄기세포를 유도하는 방법에 관한 것이다.
분화된 세포와는 달리 줄기세포는 분열능을 지니며 자가 갱신(self-renew) 또는 표현형 및 기능면에서 상이한 딸세포로의 분화능을 지닌다(Keller, Genes Dev. 2005;19:l 129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005;85:635-678; Wiles, Methods in Enzymology. 1993;225:900-918; Choi et al, Methods MoI Med. 2005;105:359-368).
중간엽 줄기세포(MSCs)는 근육골격 손상의 치료, 심장혈관계 질환에서 심장 기능의 개선 및 이식편대숙주질환(GVHD)의 중증도의 개선에 관한 치료 효과의 문헌에 의해 입증된 증거를 지니는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)이다(Le Blanc and Pittenger, 2005). 계통에 의해 한정되기는 하나, 중간엽세포 타입, 예를 들어 지방세포(adipocytes), 연골세포(chondrocytes) 및 골세포(osteocytes)를 분화시키는 강한 잠재성을 지니며, 기형종(teratoma) 형성의 위험성이 크지는 않다. 이식된 MSCs의 주 면역 거부는 자가 또는 동종이형 이식을 통해 일상적으로 회피된다. MSCs는 골수(BM), 지방조직(ad), 제대혈액을 포함하는 여러 개의 성체 조직으로부터 분리될 수 있으며, 생체 밖에서 증식될 수 있다.
중간엽 줄기세포는 근골격 조직 생체공학 및 심장질환을 포함한 광범한 질환을 치료하기 위해 임상적 및 전-임상적 적용에 사용되어 왔다. 임상적 및 전-임상적 적용에 대한 광범위한 질병 치료, 근골격 조직 생체공학 및 심장병[A5,A6]에 대한 광범위한 질병 [Al, A2] 예를 들면 GVHD [Al]를 치료하는 MSCs의 치료 능력은 많은 상이한 수복성 세포 타입을 분화시키는 잠재능력에 의한 것이다.
그러나 그의 분리를 위한 조직 유용성은 제한적이고 위험한 침습 절차를 필요로 하고, 유의적인 MSC의 생체 외 확장은 여전히 한정적이다. 그러나 손상된 조직 또는 기관 및 치료상의 관련된 수에서 기능적인 수복성 세포를 분화시키는 이식된 MSC의 효율은 적절하게 문서에 의해 입증되거나 증명되지는 않았다.
최근 보고는 이들 수복성 효과 일부가 MSC에 의해 분비되는 측분비(paracine) 인자에 의해 매개됨을 제안한 바 있다. 이들 인자는 측분비 메커니즘을 통해 동맥형성을 증진시키고, 창자 내 줄기세포 크립트(crypt)를 지지하고, 허혈성 신장, 심근 및 사지 조직 손상을 보호하고, 조혈을 지지 및 유지하고, 거대핵세포 및 전-혈소판 형성을 지지하는 것으로 간주된다.
우수한 품질 조절 및 일관성과 함께 적당한 비용 측면에서 "기성품" MSC-기반 치료 선택에 대한 부적당한 요구가 존재한다. 이는 급성 MI 환자의 재관류 손상과 같은 손상에 대한 시간 민감성 보호에 대한 필요조건이다.
요약
본 발명의 첫 번째 관점에 따라 본 발명자들은 중간엽 줄기세포에 의해 분비되고 중간엽 줄기세포의 하나 이상의 생물학적 특성을 포함하는 입자를 제공한다.
상기 생물학적 특성은 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)의 생물학적 활성을 포함한다. 상기 생물학적 활성은 심장보호를 포함한다. 상기 입자는 경색 크기를 감소시키는 것이 가능하다.
경색의 감소는 심근 허혈 및 재관류 손상의 마우스 또는 돼지 모델에서 분석된다.
상기 입자는 산화 스트레스를 감소시키는 것이 가능하다. 산화 스트레스의 감소는 과산화수소(H2O2)-유도 세포사멸의 시험관 내 분석으로 분석된다.
상기 입자는 소포를 포함한다. 상기 입자는 엑소솜을 포함한다.
상기 입자는 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM) 내에 70% 이상의 단백질을 포함한다. 상기 단백질은 표 D1에 나타난 목록에서 선택되거나 표 D2에 나타난 유전자의 유전자 산물이다.
상기 입자는 > 100 kDa 분자량의 복합체를 포함한다. 상기 > 100 kDa 분자량의 복합체는 < 100 kDa의 단백질을 포함한다. 상기 입자는 > 300 kDa 분자량의 복합체를 포함한다. 상기 > 300 kDa 분자량의 복합체는 < 300 kDa의 단백질을 포함한다.
상기 입자는 > 100 kDa 분자량의 복합체를 포함한다. 상기 입자는 2 nm 내지 200 nm의 크기를 지닌다. 상기 입자는 50 nm 내지 150 nm의 크기를 지닌다. 상기 입자는 50 nm 내지 100 nm의 크기를 지닌다.
상기 입자의 크기는 0.2 μM 필터에 대한 여과 및 10 kDa의 분자량 차단을 지닌 멤브레인에 대한 농축에 의해 측정된다. 상기 입자의 크기는 전자 현미경에 의해 측정된다.
상기 입자는 100 nm 이하의 유체역학 반경을 포함한다. 이는 약 30 nm 내지 약 70 nm의 유체역학 반경을 포함한다. 이는 약 45 nm 내지 약 55 nm와 같이 약 40 nm 내지 약 60 nm의 유체역학 반경을 포함한다. 상기 중간엽 줄기세포 입자는 약 50 nm의 유체역학 반경을 포함한다. 상기 유체역학 반경은 레이저 회절 또는 역동적 광 산란에 의해 측정된다.
상기 입자는 인지질, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 콜린, 신고마이엘린, 세라마이드, 당지질, 세레브로사이드, 스테로이드, 콜레스테롤로 구성된 군에서 선택된 지질을 포함한다. 콜레스테롤-인지질 비율은 0.3∼0.4(몰/몰) 이상이다. 상기 입자는 지질 뗏목(lipid raft)을 포함한다.
상기 입자는 비-이온성 세정제, 바람직하게는 Triton-X100 내에서 불용성이다. 상기 입자는 입자가 비-이온성 세정제로 처리시 명기된 분자량의 단백질이 명기된 분자량의 복합체 내에 실질적으로 잔존한다.
상기 입자는 사이클로덱스트린, 바람직하게는 20 mM 사이클로덱스트린에 민감성이다. 상기 입자는 사이클로덱스트린으로의 처리가 명기된 복합체의 실질적인 용해를 유발한다.
상기 입자는 리보핵산(RNA)을 포함한다. 상기 입자는 1.9의 흡광 비율(260:280 nm)을 지닌다. 상기 입자는 CD9, CD109 및 thy-1로 구성된 군에서 선택된 표면 항원을 포함한다.
본 발명의 두 번째 관점에 따라 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)에서 입자를 분리하는 단계를 포함한 입자의 생성 방법이 제공된다.
상기 방법은 분자량, 크기, 형태, 조성 또는 생물학적 활성을 기반으로 다른 구성성분에서 상기 입자를 분리하는 단계를 포함한다.
중량은 상기 나타난 중량에서 선택된다. 크기는 상기 나타난 크기에서 선택된다. 조성은 상기 나타난 조성에서 선택된다. 생물학적 활성은 상기 나타난 생물학적 활성에서 선택된다.
본 발명의 세 번째 관점에 따라 본 발명자들은 상기 기재된 바에 따른 입자를 생성하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)를 수득하는 단계를 포함한다. 이는 중간엽 줄기세포 조절 배지를 농축하는 단계를 포함한다. 상기 중간엽 줄기세포 조절 배지는 > 1000 kDa 멤브레인에 대한 초미세여과법에 의해 농축된다. 상기 방법은 농축된 중간엽 줄기세포 조절 배지를 크기 배제 크로마토그래피 수행하는 단계를 포함한다. TSK Guard 컬럼 SWXL, 6 x 40 nm 또는 TSK 겔 G4000 SWXL, 7.8 x 300 nm 컬림이 이용된다. 상기 방법은 예를 들어 역동적 광 산란을 나타내는 220 nm에서 UV 흡광 분획을 선택하는 단계를 포함한다. 역동적 광 산란은 준-탄성 광 산란(QELS) 검출기에 의해 검출된다. 상기 방법은 12분과 같은 11∼13분의 정체 시간으로 용출되는 분획을 수집하는 단계를 포함한다.
본 발명의 네 번째 관점에 따라 본 발명자들은 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 상기 기재된 입자를 포함한 약제학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 네 번째 관점으로 질환을 치료하는 방법에 사용되는 입자 또는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명의 다섯 번째 관점에 따라 본 발명자들은 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조를 위한 입자의 용도를 제공한다.
여섯 번째 관점에서 본 발명은 개체 내 질환 치료 방법에 있어서 입자의 용도를 제공한다.
상기 질환은 심부전, 골수 질환, 피부 질환, 화상 및 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨스병과 같은 퇴행성 질환 및 암으로 구성된 군에서 선택된다.
상기 질환은 심근경색증, 피부 상처, 피부병, 피부 병변, 피부염, 건선, 콘딜로마, 사마귀, 혈관종, 흉터종, 피부암, 아토피 피부염, 베체트병, 만성 육아종병, 피부 T 세포 림프종, 궤양, 섬유증 및 기능 상실, 신장 허혈성 손상, 결정성 섬유증, 동염 및 비염을 포함한 만성 조직 개편을 유발하는 염증 및 면역 조절곤란을 유도하는 초기 손상을 특징으로 하는 병리학적 이상 또는 정형외과 질환으로 구성된 군에서 선택된다.
상기 입자는 개체 내 상처 치유, 흉터 감소, 골형성, 골이식 또는 골수 이식을 원조하는데 사용된다.
상기 입자는 (ⅰ) 하기 중 하나 이상에서 선택된 경로의 조절: Rho GTPase에 의한 세포골격 조절, 세포주기, 인테그린 신호전달 경로, 케모카인 & 사이토카인 신호전달 경로에 의해 매개되는 염증, FGF 신호전달 경로, EGF 수용체 신호전달, 경로 혈관형성, 플라스미노겐 활성화 연쇄반응, 혈액 응고, 해당작용, 유비퀴틴 프로테아솜 경로, 드 노보 퓨린 생합성, TCA 사이클, 페닐알라닌 생합성, 헴 생합성; (ⅱ) 하기 중 하나 이상을 포함하는 과정의 조절: 세포 구조 및 운동성, 세포 구조, 세포 커뮤니케이션, 세포 운동성, 세포 부착, 세포내이입, 유사분열, 세포외배출, 세포질분열, 세포주기, 면역 및 방어, 사이토카인/케모카인 매개 면역, 대식세포-매개 면역, 과립구-매개 면역, 리간드-매개 신호전달, 사이토카인 및 케모카인 매개 신호전달 경로, 신호 전달, 세포외 매트릭스 단백질-매개 신호전달, 성장 인자 항상성, 수용체 단백질 티로신 키나제 신호전달 경로, 세포 부착-매개 신호전달, 세포 표면 수용체 매개 신호 전달, JAK-STAT 연쇄반응, 항산화 및 유리 라디칼 제거, 항상성, 스트레스 반응, 혈액 응고, 발생 과정, 중배엽 발달, 골격 발달, 혈관형성, 근육 발달, 근육 수축, 단백질 대사 및 변형, 단백질분해, 단백질 접힘, 단백질 복합체 조립, 아미노산 활성화, 세포내 단백질 통행, 다른 단백질 타겟팅 및 국소화, 아미노산 대사, 단백질 생합성, 단백질 이황화물-이소머라제 반응, 탄수화물 대자, 해당작용, 펜토스-인산염 션트(shunt), 다른 다당류 대사, 퓨린 대사, 인산염 대사 조절, 비타민 대사, 아미노산 생합성, 전-mRNA 처리, 번역 조절, mRNA 스플라이싱; 또는 (ⅲ) 하기 중 하나 이상을 포함한 기능 공급: 신호전달 분자, 케모카인, 성장인자, 사이토카인, 인터류킨, 또다른 사이토카인, 세포외 매트릭스, 세포외 매트릭스 구조 단백질, 또다른 세포외 매트릭스, 세포외 매트릭스 당단백질, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 또다른 프로테아제, 프로테아제 저해제, 메탈로프로테아제 저해제, 세린 프로테아제 저해제, 산화환원효소, 탈수소효소, 과산화효소, 샤페론, 샤페로닌, Hsp 70 패밀리 샤페론, 또다른 샤페론, 합성효소, 신타제 및 신테타제, 선택 칼슘 결합 단백질, 아미노아실-tRNA 신테타제, 분해효소, 이소머라제, 또다른 이소머라제, ATP 신타제, 수화효소, 아미노전이효소, 또다른 분해효소, 또다른 효소 조절제, 선택 조절 분자, 액틴 결합 세포골격 단백질, 세포골격 단백질, 비-종양 액틴 결합 단백질, 액틴 및 액틴 관련 단백질, 아넥신, 튜불린, 세포 부착 분자, 액틴 결합 모터 단백질, 중간 필라멘트, 리보핵산단백질, 리보솜 단백질, 번역 인자, 또다른 RNA-결합 단백질, 히스톤, 칼모듈린 관련 단백질, 소포 외피 단백질에 사용된다.
본 발명의 일곱 번째 관점에서 상기 입자를 타겟에 전달하도록 실시 가능한 디스펜서와 함께 입자 공급원을 포함하는 입자의 전달을 위한 전달 시스템이 제공된다.
본 발명의 여덟 번째 관점에 따라 본 발명자들은 입자를 타겟에 전달하는 방법에 있어서 이러한 전달 시스템의 용도를 제공한다.
본 발명의 입자는 나타내지 않는 한 통상의 화학, 분자생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학 기술을 이용할 것이고, 이는 당업자의 능력 내에 존재한다. 이러한 기술은 문헌에 설명되어 있다. 예를 들어 J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IrI Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods ofEnzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855; and Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratory, ISBN 0-87969-630-3 참조. 이들 문헌 각각은 본원에 참고문헌으로 포함되어 있다.
도 1. 심근 경색 크기. 비-CM(A), CM(B) 또는 식염수(C)로 처리된 돼지 심장의 Evans blue(청색) 및 TTC(적색) 염색의 대표적 사진. 좌심실(LV) 및 위험 영역(AAR)의 비율로서 심근 경색 크기 정량화는 각각 도 D 및 E에 나타나 있다. 비-CM, n=9; CM, n=9; 식염수, n=8.
도 2. 국부 및 전신 수축 기능. (A) 비-CM, CM 또는 식염수로 처리된 돼지 내 경색 영역의 심장초음파검사로 평가된 국부 수축 벽 비대. 전신 수축 기능, 심장초음파검사 단편 영역 단축(FAS)는 도 B에 나타나 있다. 비-CM, n=9; CM, n=9; 식염수, n=8. * p < 0.05 대비 비-CM 및 식염수.
도 3. 산화 스트레스. CM 또는 비-CM 내 H2O2로 처리된 CEM 세포의 생존능. (* p<0.05, A). 조절 배지는 H2O2에 의해 유도된 사멸에서 세포를 보호한다. 생체 내 산화 스트레스를 평가하기 위해 비-CM(B), CM(C) 또는 식염수(D)로 처리된 돼지 유래의 경색 영역 절편이 세포핵 산화 스트레스 산물인 8-OHdG로 염색되었다. 8-OHdG 양성 세포핵의 정량은 200x 배율로 평가되었고 도 E에 나타나 있다. 또한 생체 내에서 CM은 산화 스트레스를 감소시킨다. 비-CM, n=9; CM, n=9; 식염수, n=8.
도 4. TGF-β 신호전달 및 아폽토시스. 비-CM, CM 또는 식염수로 처리된 돼지의 인산화 SMAD 2(A, B) 및 활성 카스파제 3(C, D)에 대한 웨스턴 블럿. 베타-튜불린은 적가 대조군으로 평가되었고, 그룹간에 베타-튜불린 발현의 차이점은 발견되지 않았다(E). 비-CM, n=9; CM, n=9; 식염수, n=8.
도 5. CM 분획의 심장보호 특성. 식염수로 처리된 마우스 내 심근 경색 크기 정량화, CM 또는 비분획화 CM의 < 1000 kD 분획. 비분획화 조절 배지는 식염수 처리 동물과 비교시 심근 경색 크기를 유의적으로 감소시킨다. 그러나 < 1000 kDa 분획은 그렇지 않았고, 이는 심장보호 인자(들)는 1000 kDa 이상이다. 식염수, n=10; <1000 kD, n=8; 비분획화, n=12. * p < 0.01 대비 식염수.
도 6. 3일간 hESC-MSC HuES9.E1 세포에 의해 조절된 화학적으로 한정된 배지는 0.22 μ 필터를 통해 여과되었다. 조절 배지(CM)는 10 kD MW 차단을 지닌 멤브레인을 통해 여과함으로서 25배 농축되었다. 이후 농축된 CM은 100 kDa 또는 300 kDa MW 차단을 지닌 멤브레인을 통해 원심분리되어 4:1(vol:vol)의 여과물 대 잔류물 비율을 야기한다. 비분획화 CM, 여과물 및 잔류물 표본은 5:4:1의 부피 비율로 적가되었다.
도 7. 100 kDa MW 차단을 지닌 멤브레인을 통한 여과 후 여과물 내 구성성분의 확인. a) 비-조절 배지(NCM) 내 단백질 성분 대비 여과물 내 단백질 성분의 비교. 조절 배지(CM), CM이 100 kDa MW 차단을 지닌 멤브레인을 통해 여과된 후 여과물(100 kDa 여과물) 및 NCM은 SDS-PAGE 상에서 분리되었다. 겔은 단백질 밴드를 시각화하기 위해 은으로 염색되었다; b) CM은 100 kDa MW 차단 멤브레인을 통해 여과되어 4:1의 잔류물 대 여과물 부피 비율을 생성하였다. 잔류물, 여과물 및 화학적으로 한정된 배지 내 상이한 단백질 보충물 즉 인슐린-트랜스페린-셀렌단백질, FGF2, EGF 및 PDGF AB는 SDS-PAGE 상에서 분리되었다. 잔류물 및 여과물은 4:1의 부피 비율로 적가되었다.
도 8. 멤브레인 내 생물학적 물질 및 세공 크기의 상대 크기. Spectrum Laboratory에서 재판.
도 9. 허혈/재관류 후 마우스 내 상대 AAR. 심근 경색은 30분간 봉합선 결찰에 의해 좌관상동맥(LCA) 폐색에 의해 유도되었고, 재관류는 봉합선의 제거에 의해 유발되었다. 재관류 5분전 마우스는 20 ㎕ 비분획화 MSC-CM(10∼220 nm), 20 ㎕의 < 100 또는 1,000 kD 분획, 4 ㎕의 > 1000 kD 잔류물 또는 식염수의 꼬리 정맥 주사 처리되었다. 24시간 후 심장이 절제되었다. 절제 전 위험 영역(AAR)은 LCA을 재결찰한 후 대동맥을 통해 Evans blue를 주입함으로서 측정되었다. AAR은 염료로 염색되지 않은 영역으로 한정되었고 좌심실벽 영역의 비율로서 표기되었다.
도 10. 허혈/재관류 후 마우스의 상대 경색 크기 상의 조절 배지 및 분획화 조절 배지의 효과. 심장 절제 후 경색 크기는 TTC를 이용하여 24시간 후 평가되었고 AAR의 비율로 표기되었다.
도 11. 50∼100 nm 지름의 물리적 실재가 전자현미경을 이용하여 관찰되었다.
도 12. Triton X-100으로 처리 후 CM의 크기 분류. CM은 30분간 최종 0.5 또는 1.0%(v/v) Triton X-100으로 처리된 후 100 kDa의 MW 차단을 지닌 멤브레인을 통한 여과에 의해 분류되어 4:1의 여과물:잔류물 부피 비율을 생성하였다.
도 13. 상이한 세포 형태 유래의 엑소솜에서 공통적인 MS/MS 분석에서 발견된 단백질.
도 14. CM 분획의 심장보호 특성. 식염수, HEK293 조절 배지, 비분획화 hESC-CM, 100 kDa, 300 kDa, 500 kDa 및 1000 kDa의 MWCO로 여과된 CM 또는 CM의 100 kDa의 MWCO를 지닌 멤브레인에 대해 50배 농축된 CM 또는 비분획화 CM으로 처리된 마우스의 심근 경색 크기 정량.
도 15. 면역침전. CM은 항-CD81 또는 음성 대조군으로서 마우스 IgG로 면역침전되었다. 면역침전물 및 상청액은 CD9, AHx, Tsp-1, 피루브산 키나제 및 SODl에 대한 항체를 이용한 웨스턴 블럿 혼성화에 의해 분석되었다.
도 16. CM의 초원심분리. CM은 500 kDa의 MWCO를 지닌 멤브레인을 통한 여과에 의해 5배 농축되었다. 잔류물 및 비여과 CM은 2시간 동안 200,000g에서 초원심분리되었다. 상청액 및 펠렛은 CD9의 존재에 대해 웨스턴 블럿팅에 의해 분석되었다. 레인 1∼3: CM의 상이한 단백질 농도. 레인 4 및 5: 비여과 CM의 초원심분리 후 펠렛(P) 및 상청액(S). 레인 6: 500 kDa의 MWCO를 지닌 멤브레인을 통한 CM의 여과 후 잔류물. 레인 7∼8: 잔류물의 초원심분리 후 펠렛(P) 및 상청액(S). 레인 9: 500 kDa의 MWCO를 지닌 멤브레인을 통한 CM의 여과 후 여과물.
도 17. 슈크로스 구배 밀도 상의 분획화. 슈크로스 밀도 구배는 초원심분리관의 하단에서 가장 농축된 용액으로 SW60Ti 원심분리관 내에 22.8∼60%(w/v)의 14개 슈크로스 용액 농도를 층을 형성함으로서 제조되었다. 표본은 구배의 상단 상에 적가되고 SW60Ti 로터(Beckman Coulter Inc.) 내에서 4℃ 200,000g에서 16.5시간 동안 초원심분리되었다. 13개 분획이 슈크로스 구배의 상단에서 하단까지 수집되었다. 각각의 분획의 밀도는 각 분획의 고정 부피를 측량함으로서 계산되었다. 이후 분획은 웨스턴 블럿 분석에 의해 분석되고 피루브산 키나제, CD0, CD81 및 SOD1에 대해 프로브되었다. 단백질 표준 분자량 마커는 유사한 구배 상에서 분획화되었고 슈크로스 구배의 상이한 분획 내 마커의 분포는 도면의 하단에 표시되었다. a) CM은 분획화되었고, b) CM은 슈크로스 구배 상에서 분획화되기 전에 세포용해 완충액으로 처리되었다.
도 18. CM의 트립신처리. CM은 0, 0.5, 2, 10 및 20분간 분해되었다. 부분적으로 분해된 CM은 CD9 및 SOD1의 존재에 대해 분석되었다.
도 19. CM 내 RNA의 분석. (a, b) RNA는 MSC 및 MSC-CM에서 추출되었다. 정제된 RNA는 변성되었고 각각 글리옥살 아가로스 겔 및 요소-PAGE 상에서 분리되었다. (c) 동일한 부피의 CM은 RNA에 대해 추출되었다. RNA는 요소-PAGE 상에서 분리되었다. (d) CM 유래 RNA는 RNAse Ⅲ으로 처리되었고 처리된 RNA는 요소-PAGE 상에서 비처리 RNA와 동시에 분리되었다. 겔 내 RNA는 에티듐 브로마이드로의 염색에 의해 시각화되었다.
도 20. CM 내 RNA의 밀도. 도 4에 기재된 바와 같이 슈크로스 밀도 구배 평행 원심분리 상에서 CM, 세포용해 완충액으로 전처리된 CM 및 RNA MW 표준물질의 분획화 후 각각의 분획은 RNA에 대해 추출되었다. a) 각 표본 내 각 분획에 대한 상대 RNA 수율은 분획 수에 대해 도면 작성되었다. 상대 농도는 100%로 임의로 조정된 각 구배 내 최대 RNA 농도에 대해 표준화되었다. b) 각 분획에서 추출된 RNA는 요소-PAGE 상에서 분리되었다.
도 21. RNA는 CD81+ 엑소솜 내에는 존재하지 않았다. CD9도 침전시키는 CD81 면역침전이 도 2에 기재된 바와 같이 수행되었다. 면역침전물 및 상청액이 RNA에 대해 추출되었고 추출물은 요소-PAGE 상에서 분리되었고 에티듐 브로마이드 염색에 의해 시각화되었다.
도 22. CM 내 miRNA의 마이크로어레이 분석. MSC 및 CM 유래 RNA 표본은 Sanger miRBase Release 10.1에 기입된 miRNA 전사체에 대한 프로브를 포함한 마이크로어레이 칩에 혼성화되었다. 혼성화는 각각의 RNA 표본의 2개의 생물학적 복제물을 이용하여 수행되었다. a) 149개 miRNA는 MSC 내에서 검출되었고 63개는 CM 내에서 검출되었다. 이들 중 47개는 MSC와 CM 모두에서 유사한 수치로 발현되었다. 16개는 MSC가 아닌 CM에서 검출 가능한 수치로 발현된 반면 47개는 CM이 아닌 MSC 내에서 검출되었다. b) 마이크로어레이 칩 상의 혼성화 신호를 기반으로 한 유도 miRNA의 그의 항-유도 miRNA에 대한 상대 발현 수치.
도 23. CM 및 NCM의 HPLC 분류. CM 및 NCM은 BioSep S4000, 7.8 mm x 30 cm 컬럼을 이용한 HPLC 상에서 분류되었다. CM 또는 NCM 내 구성성분은 pH 7.2에서 150 mM의 NaCl을 지닌 20 mM 인산염 완충액으로 용출되었다. 용출 방법은 동용매성이고 실행 시간은 40분이었다. 용출액은 220 nm로 조정된 UV-가시성 검출기로 모니터되었다. 각각의 피크 하의 요소 %는 UV-가시성 검출기로부터 통합되었다.
본 발명은 인간 ESC-유래 중간엽 줄기세포(MSC)가 ∼50-100 nm 지름의 거대 분비 복합체를 통해 심장보호 효과를 매개한다는 증거를 기반으로 한다. 따라서 이러한 복합체 또는 입자는 세포 그 자체를 대신하여 심장보호를 포함한 치료 수단에 이용된다.
실시예는 이들 복합체의 단백질체 분석을 기재하고 있고, 이는 예를 들어 동시-면역침전되는 CD81, CD9 및 Alix와 같은 엑소솜-관련 단백질 및 각각 멤브레인-결합 및 멤브레인-피막화 단백질과 일치하는 세정제-민감성 단백질분해를 나타내는 세포막 및 세포질 단백질의 존재를 나타낸다.
또한 실시예는 이들 입자 또는 복합체의 또다른 특성을 입증하고 있다. 본 발명자들은 이러한 입자 또는 복합체의 단백질이 세포막 용해 완충액으로 처리시 MW-의존적 밀도로 복귀하는 1.016∼1.215 g/ml의 MW-독립적 침강 밀도를 지님을 나타낸다. 또한 분비물은 콜레스테롤-풍부 지질 소포 내에서 RNA(<300 nts)를 포함한다. 또한 HPLC 분획화 및 역동적 광 산란 조사는 1∼1000 nm의 유체역학 반경(rh) 범위 내 분비물 내 검출 가능한 입자만이 45∼55 nm의 rh를 지님을 나타낸다.
이들 관찰은 세포막 지질 예를 들어 콜레스테롤 스핑고마이엘린 및 포스파티딜콜린의 존재와 함께 분비물 내 심장보호 복합체가 엑소솜 또는 분비된 지질 소포임을 입증한다.
이들 중간엽 줄기세포 입자, 복합체 또는 엑소솜은 허혈, 심장 염증 또는 심부전과 같은 심장 질환의 치료 또는 예방과 같은 다양한 목적에 사용된다. 또한 이들은 관류 손상 후 복구에 사용된다.
입자
본 발명자들은 중간엽 줄기세포(MSC)에서 유래 가능한 입자를 기재하고 있다.
상기 입자는 예를 들어 MSC 유래의 분비, 출아 또는 분산과 같은 어떠한 수단에 의해서도 MSC에서 유래 가능하다. 예를 들어 상기 입자는 MSC로부터 생성되거나 삼출되거나 방사되거나 발산된다. MSC가 세포 배양액 내에 존재하는 경우 입자는 세포 배양 배지 내로 분비된다.
상기 입자는 특히 소포를 포함한다. 상기 입자는 엑소솜을 포함한다. 본원에 기재된 입자는 본원에 기재된 엑소솜 특성 중 하나 이상을 포함한다.
상기 입자는 지질 이중층에 의해 제한된 소포 또는 평평화 구체를 포함한다. 상기 입자는 40∼100 nm의 지름을 포함한다. 상기 입자는 엔도솜 멤브레인의 내부 출아에 의해 형성된다. 상기 입자는 ∼1.13 - 1.19 g/ml의 밀도를 지니고 슈크로스 구배 상에서 부유된다. 상기 입자는 콜레스테롤 및 스핑고마이엘린 및 GM1, GM3, 플로틸린과 같은 지질 뗏목 마커 및 src 단백질 키나제 Lyn이 풍부하다. 상기 입자는 MSC 또는 MSC-CM에 특징적이거나 특이적인 단백질과 같은 중간엽 줄기세포 또는 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM) 내에 존재하는 하나 이상의 단백질을 포함한다. 이들은 예를 들어 miRNA와 같은 RNA를 포함한다.
본 발명자들은 MSC 또는 MSC의 배양에 의해 조절되는 배지 내에서 발견되는 하나 이상의 유전자 또는 유전자 산물을 포함하는 입자를 제공한다. 상기 입자는 MSC에 의해 분비되는 분자를 포함한다. 이러한 입자 및 특정 단백질 또는 폴리펩타이드를 포함한 이에 포함되는 분자의 어떠한 조합도 예를 들어 질환을 치료하거나 예방하는 목적으로 MSC 또는 MSC에 의해 조절되는 배지의 활성을 보충하거나 그 대신에 사용된다.
상기 입자는 세포골격 예를 들어 튜불린에서 발견되는 세포질 단백질, 액틴 및 액틴-결합 단백질, 세포내 막 융합 및 운반 예를 들어 아넥신 및 rab 단백질, 신호 전달 단백질 예를 들어 단백질 키나제, 14-3-3 및 이종삼합체 G 단백질, 대사 효소 예를 들어 과산화효소, 피루브산 및 지질 키나제 및 에놀라제-1 및 테트라스패닌(tetraspanin) 패밀리 예를 들어 CD9, CD63, CD81 및 CD82를 포함한다. 특히 상기 입자는 하나 이상의 테트라스패닌을 포함한다. 상기 입자는 mRNA 및/또는 마이크로RNA를 포함한다.
본원에 사용된 용어 "입자"는 별개의 실재를 의미한다. 상기 입자는 중간엽 줄기세포(MSC) 또는 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)에서 분리 가능한 어떤 것이다. 상기 입자는 MSC 또는 MSC-CM의 실질적인 대부분의 또는 전부의 기능의 원인이 되고 이를 수행한다. 예를 들어 상기 입자는 MSC 또는 MSC-CM에 대한 대용물(또는 생물학적 대용물)이다.
상기 입자는 MSC 또는 MSC-CM이 사용되는 어떠한 치료 목적에도 사용된다.
바람직하게는 상기 입자는 하나 이상의 중간엽 줄기세포 특성을 지닌다. 상기 입자는 생물학적 활성과 같은 생물학적 특성을 지닌다. 상기 입자는 MSC의 어떠한 생물학적 활성도 지닌다. 상기 입자는 예를 들어 MSC의 치료 또는 회복 활성을 지닌다.
실시예는 MSC에 의해 조절되는 배지(하기 기재된 바와 같은 중간엽 줄기세포 조절 배지 또는 MSC-CM과 같은)가 MSC의 생물학적 활성을 포함하고 MSC 자체를 대체할 수 있음을 나타낸다. 따라서 MSC의 생물학적 특성 또는 생물학적 활성은 중간엽 줄기세포 조절 배지의 생물학적 특성 또는 활성에 해당된다. 따라서 상기 입자는 하나 이상의 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)의 생물학적 특성 또는 활성을 포함한다.
중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)
중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)과 같은 조절 세포 배양 배지는 중간엽 줄기세포(MSC), 그의 파생물 또는 세포 배양 배지에서 유래된 세포주를 배양하고; 상기 세포 배양 배지를 분리함으로서 수득된다. 상기 중간엽 줄기세포는 배아 줄기세포(ES) 콜로니를 분산시킴으로서 세포를 수득하는 단계를 포함한 방법에 의해 제조된다. 세포 또는 그의 파생물은 FGF2를 포함한 무혈청 배지 내의 공동-배양의 부재 하에 증식된다.
중간엽 줄기세포 입자
입자는 여러 방법으로 제조되거나 분리된다. 이러한 방법은 중간엽 줄기세포(MSC)에서 입자를 분리하는 단계를 포함한다. 이러한 방법은 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)에서 입자를 분리하는 단계를 포함한다.
입자는 예를 들어 입자의 어떠한 특성을 기반으로 비-관련 구성성분에서 분리됨으로서 분리된다. 예를 들어 입자는 분자량, 크기, 형태, 조성 또는 생물학적 활성을 기반으로 분리된다.
조절 배지는 분리 동안, 그 전 또는 그 후 여과되거나 농축된다. 예를 들어 이는 크기 또는 분자량 차단을 지닌 멤브레인을 통해 여과된다. 이는 접선력 여과 또는 초미세여과가 수행된다.
예를 들어 본원 내의 분자량 분석에서 기재된 바와 같은 적당한 분자량 또는 크기 차단의 멤브레인으로의 여과가 이용된다.
선택적으로는 여과되거나 농축되거나 이 둘 모두가 수행된 조절 배지는 컬럼 크로마토그래피와 같은 추가 분리 수단이 수행된다. 예를 들어 다양한 컬럼으로의 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)가 이용된다. 컬럼은 크기 배제 컬럼 또는 결합 컬럼이다.
입자의 하나 이상의 생물학적 특성 또는 생물학적 활성은 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)의 분획화 동안 그의 활성을 추적하는데 이용된다. 예로서 광 산란, 굴절률, 역동적 광 산란 또는 UV-가시성 검출기가 입자를 추적하는데 이용된다. 예를 들어 심장보호 활성과 같은 치료 활성이 분획화 동안 활성을 추적하는데 이용된다.
하기 단락은 어떻게 엑소솜과 같은 중간엽 줄기세포 입자가 수득되는지의 특정한 예시를 제공한다.
중간엽 줄기세포 입자는 이를 조절하기 위해 중간엽 줄기세포를 배지 내에서 배양함으로서 생성된다. 중간엽 줄기세포는 HuES9.El 세포를 포함한다. 배지는 DMEM을 포함한다. DMEM은 페놀 레드를 포함하지 않는다. 배지는 인슐린, 트랜스페린 또는 셀렌단백질(ITS) 또는 그의 어떠한 조합으로도 보충된다. 이는 FGF2를 포함한다. 이는 PDGF AB를 포함한다. FGF2의 농도는 약 5 ng/ml FGF2이다. PDGF AB의 농도는 약 5 ng/ml이다. 배지는 글루타민-페니실린-스트렙토마이신 또는 b-머캅토에탄올 또는 그의 어떠한 조합도 포함한다.
세포는 약 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10일 이상 동안 예를 들어 3일간 배양된다. 조절 배지는 배지에서 세포를 분리함으로서 수득된다. 조절 배지는 예를 들어 500 g에서 원심분리된다. 이는 멤브레인을 통한 여과에 의해 농축된다. 멤브레인은 > 1000 kDa 멤브레인을 포함한다. 조절 배지는 약 50배 이상 농축된다.
조절 배지는 HPLC와 같은 액체 크로마토그래피가 수행된다. 조절 배지는 크기 배제에 의해 분리된다. Sepharose와 같은 어떠한 크기 배제 매트릭스도 사용된다. 예를 들어 TSK Guard 컬럼 SWXL, 6 x 40 mm 또는 TSK 겔 G4000 SWXL, 7.8 x 300 mm이 이용된다. 용출 완충액은 식염수와 같은 어떠한 생리 배지도 포함한다. 이는 pH 7.2에서 150 mM의 NaCL을 지닌 20 mM 인산염 완충액을 포함한다. 크로마토그래피 시스템은 0.5 ml/분의 유속으로 평형화된다. 용출 방식은 동용매성이다. 220 nm에서의 UV 흡광도가 용출 진행을 추적하는데 이용된다. 분획은 준-탄성 광 산란(QELS) 검출기를 이용하여 역동적 광 산란(DLS)에 대해 조사된다.
역동적 광 산란을 나타내는 것으로 발견된 분획이 보유된다. 예를 들어 상기 기재된 일반적인 방법에 의해 생성되고, 12분과 같이 11∼13분의 정체 시간으로 용출된 분획은 역동적 광 산란을 나타내는 것으로 발견된다. 이러한 피크 내 입자의 rh는 약 45∼55 nm이다. 이러한 분획은 엑소솜과 같은 중간엽 줄기세포 입자를 포함한다.
입자 특성
중간엽 줄기세포의 특성은 중간엽 줄기세포에 의해 조절된 배지(MSC-CM)의 특성을 포함한다. 이러한 중간엽 줄기세포 조절 배지를 제조하는 방법은 본원에 기재되어 있고 하기 실시예에 나타나 있다.
상기 특성은 생물학적 활성과 같은 생물학적 특성을 포함한다. 생물학적 활성의 예는 심장보호, 산화 스트레스 감소 및 경색 크기 감소를 포함한다.
심장보호
입자는 심장보호를 포함한 중간엽 줄기세포 및/또는 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)의 특성을 지닌다. 심장보호는 허혈 및/또는 재관류 동안 심장 기능의 회복 또는 유지를 포함한다.
심장보호의 분석
심장보호는 예를 들어 실시예 5, 10, 14 및 20에 기재된 방법 중 하나 이상을 이용하여 분석된다.
산화 스트레스
입자는 산화 스트레스를 감소시키는 능력(또는 세포보호)을 포함한 중간엽 줄기세포 및/또는 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)의 특성을 지닌다.
산화 스트레스 분석
산화 스트레스 감소는 예를 들어 과산화수소(H2O2)-유도 세포 사멸의 시험관 내 분석을 이용하여 분석된다. 요약적으로 과산화수소(H2O2)-매개 산화 스트레스는 인간 백혈병 CEM 세포 내에서 유도되고 세포 생존능은 트리판 블루-배제에 의해 모니터된다. 인간 백혈병 CEM 세포는 입자, 조절 배지 또는 중간엽 줄기세포(대조군으로서 식염수와 함께)와 함께 인큐베이트되고 50 μM H2O2로 처리되어 산화 스트레스를 유도한다. 세포 생존능은 H2O2 처리 12, 24, 36 및 48시간 후 트리판 블루 배제를 이용하여 평가된다.
산화 스트레스 감소는 DNA 산화의 생체 내 분석을 이용하여 더욱 분석된다. 또한 생체 내 산화 스트레스는 하기와 같이 분석된다. 돼지는 상기 입자, 조절 배지 또는 중간엽 줄기세포(대조군으로 식염수와 함께)로 처리된다. 돼지 심장의 조직 절편이 수득된다. 처리 및 비처리 돼지의 조직 절편 내 세포핵 산화 스트레스는 산화 DNA에 대해 8-OHdG 면역염색에 의해 정량된다. 조직 절편은 DNA 산화 및 산화 스트레스를 나타내는 세포핵 염색에 대해 분석된다.
경색 크기
입자는 경색 크기를 감소시키는 능력을 포함한 중간엽 줄기세포 및/또는 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)의 특성을 지닌다.
경색 크기 분석
경색 크기는 예를 들어 실시예 6 및 13에 기재된 방법 중 하나 이상을 이용하여 분석된다.
입자 분자량
입자는 100 kDa 이상의 분자량을 지닌다. 이는 500 kDa 이상의 분자량을 지닌다. 예를 들어 이는 1000 kDa 이상의 분자량을 지닌다.
분자량은 다양한 방법에 의해 측정된다. 대체로 분자량은 크기 분류 및 적절한 분자량 차단을 지닌 멤브레인을 통한 여과에 의해 측정된다. 이후 입자 크기는 SDS-PAGE로 구성성분 단백질의 분리를 추적하거나 생물학적 분석에 의해 측정된다.
SDS-PAGE에 의한 분자량 분석
입자는 100 kDa 이상의 분자량을 지닌다. 예를 들어 입자는 여과 수행시 100 kDa 이하의 분자량을 지닌 입자의 대부분의 단백질이 100 kDa 이상의 분자량 잔류물 분획 내로 분리된다. 유사하게 500 kDa 차단을 지닌 멤브레인으로의 여과 수행시 500 kDa 이하의 분자량을 지닌 입자의 대부분의 단백질은 500 kDa 이상의 분자량 잔류물 분획 내로 분리된다. 이는 입자가 500 kDa 이상의 분자량을 지님을 나타낸다.
생물학적 활성에 의한 분자량 분석
입자는 1000 kDa 이상의 분자량을 지닌다. 예를 들어 입자는 1000 kDa의 분자량 차단을 지닌 멤브레인으로의 여과가 수행되고, 관련된 생물학적 활성은 잔류물 분획 내에 실질적으로 또는 주로 잔존한다. 대안으로 또는 더욱이 생물학적 활성은 여과물 분획 내에는 결여되어 있다. 생물학적 활성은 본원에 기재된 입자의 어떠한 생물학적 활성도 포함한다.
경색 크기에 의한 분자량 분석
예를 들어 어떠한 적당한 심근 허혈 및 재관류 손상 모델 내에서 분석시 생물학적 활성은 경색 크기 감소를 포함한다. 예를 들어 생물학적 활성은 실시예에 기재된 바와 같이 마우스 또는 돼지 모델에서 분석된다.
요약적으로 심근 허혈은 봉합선 결찰에 의한 30분간 좌관상동맥(LCA) 폐색에 의해 유도되고, 재관류는 봉합선의 제거에 의해 유발된다. 마우스는 재관류 5분 전 꼬리 정맥을 통해 정맥 내로 입자(비분획화 MSC-CM), 여과물(< 100 또는 1,000 kDa 분획과 같은), 잔류물(> 1000 kDa 잔류물과 같은) 또는 식염수를 포함한 액체로 처리된다. 24시간 후 심장이 절제된다. 절제 전 위험 영역(Area At Risk, AAR)은 LC를 재결찰하고 대동맥을 통해 Evans blue를 주입함으로서 측정된다.
AAR은 염료에 의해 염색되지 않은 영역으로 정의되고 좌심실 벽 영역의 비율로 표기된다. 경색 크기는 Evans blue 및 TTC를 이용하여 24시간 후 평가된다. 상대 경색 크기가 식염수와 비교시 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM) 및 잔류물(> 1000 kD과 같은) 분획으로 처리된 동물에서 유의적으로 감소된 경우 이는 입자가 멤브레인의 적절한 차단보다 더 높은 분자량(예를 들어 1000 kDa 이상)을 지님을 나타낸다.
입자 크기
입자는 2 nm 이상의 크기를 지닌다. 입자는 5 nm, 10 nm, 20 nm, 30 nm, 40 nm 또는 50 nm 이상의 크기를 지닌다. 입자는 150 nm 이상과 같은 100 nm 이상의 크기를 지닌다. 입자는 실질적으로 200 nm 이상의 크기를 지닌다.
입자 또는 입자들은 2 nm 내지 20 nm, 2 nm 내지 50 nm, 2 nm 내지 100 nm, 2 nm 내지 150 nm 또는 2 nm 내지 200 nm와 같은 크기 범위를 지닌다. 입자 또는 입자들은 20 nm 내지 50 nm, 20 nm 내지 100 nm, 20 nm 내지 150 nm 또는 20 nm 내지 200 nm의 크기를 지닌다. 입자 또는 입자들은 50 nm 내지 lOO nm, 50 nm 내지150 nm 또는 50 nm 내지 200 nm의 크기를 지닌다. 입자 또는 입자들은 100 nm 내지 150 nm 또는 100 nm 내지 200 nm의 크기를 지닌다. 입자 또는 입자들은 150 nm 내지 200 nm의 크기를 지닌다.
크기는 다양한 방법으로 측정된다. 대체로 크기는 크기 분류 및 적절한 크기 차단을 지닌 멤브레인을 통한 여과에 의해 측정된다. 이후 입자 크기는 SDS-PAGE로의 구성성분 단백질의 분리를 추적하거나 생물학적 분석에 의해 측정된다.
또한 크기는 실시예 21에 기재된 바와 같이 전자 현미경에 의해 측정된다.
크기는 유체역학 반경을 포함한다. 입자의 유체역학 반경은 100 nm 이하이다. 이는 약 30 nm 및 약 70 nm 사이이다. 유체역학 반경은 약 45 nm 및 약 55 nm 사이와 같이 약 40 nm 및 약 60 nm 사이이다. 유체역학 반경은 약 50 nm이다.
입자의 유체역학 반경은 적당한 방법, 예를 들어 레이저 회절 또는 역동적 광 산란에 의해 측정된다. 유체역학 반경을 측정하는 역동적 광 산란 방법의 예는 하기 실시예 33에 나타나 있다.
조성
입자는 중간엽 줄기세포에 의해 분비되는 하나 이상의 단백질을 포함한다. 입자는 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM) 내에 존재하는 하나 이상의 단백질을 포함한다.
예를 들어 입자는 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상 또는 70% 이상의 이들 단백질을 포함한다. 입자는 실질적으로 약 75%의 이들 단백질을 포함한다. 상기 단백질은 단백질 목록 또는 유전자 목록의 유전자 산물을 참조하여 한정된다.
단백질
단백질은 하기 표 D1에 나타난 것에서 선택된다. 표 D1은 하기 단락 내에 1 내지 250으로 번호 부여된 하기 단백질뿐만 아니라 "미확인 기능을 지닌 단백질"을 포함한다:
1. 1. IPI00021428 액틴, 알파 골격근; 2. IPI00414057 액틴 알파 1 골격근 단백질; 3. IPI00008603 액틴, 대동맥 평활근; 4. IPI00021439 액틴, 세포질 1; 5. IPI00023006 액틴, α 심장; 6. IPI00021440 액틴, 세포질 2; 7. IPI00025416 액틴, γ-창자 평활근; 8. IPI00479925 아그린; 9. IPI00015102 CD166 항원 전구체; 10. IPI00007423 산성 류신-풍부 핵 인단백질 32 패밀리 멤버 B; 11. IPI00413331 36 kDa 단백질; 12. IPI00412577 34 kDa 단백질; 13. IPI00413506 33 kDa 단백질; 14. IPI00418169 가상 단백질 DKFZp686P03159; 15. IPI00003815 Rho GDP-해리 저해제 1; 16. IPI00004656 β-2-마이크로글로불린 전구체; 17. IPI00218042 골 형성 단백질 1 전구체의 스플라이스 아이소형 BMP1-5; 18. IPI00009054 골 형성 단백질 1 전구체의 스플라이스 아이소형 BMP1-3; 19. IPI00014021 골 형성 단백질 1 전구체의 스플라이스 아이소형 BMPl-I; 20. IPI00218040 골 형성 단백질 1 전구체의 스플라이스 아이소형 BMP 1-4; 21. IPI00006980 단백질 C14orfl66; 22. IPI00296165 보체 CIr 서브컴포넌트 전구체; 23. IPI00152540 OTTHUMPOOOOOO 16748; 24. IPI00305064 CD44 항원 전구체 스플라이스 아이소형 CD44; 25. IPI00297160 가상 단백질 DKFZp451K1918; 26. IPI00293539 카드헤린-11 전구체의 스플라이스 아이소형 2; 27. IPI00304227 카드헤린-11 전구체의 스플라이스 아이소형 1; 28. IPI00386476 카드헤린 11, 타입 2, 아이소형 1 프레프로단백질; 29. IPI00024046 카드헤린-13 전구체;
30. IPI00290085 신경-카드헤린 전구체; 31. IPI00029739 보체 인자 H 전구체의 스플라이스 아이소형 1; 32. IPI00012011 코피린(Cofilin), 비-근육 아이소형; 33. IPI00007257 칼신테닌(calsyntenin) 1 아이소형 2; 34. IPI00218539 콜라겐 α-l(XI) 사슬 전구체의 스플라이스 아이소형 B; 35. IPI00477350 콜라겐, 타입 XI, α 1; 36. IPI00329573 콜라겐 α-1(XII) 사슬 전구체의 스플라이스 아이소형 롱(Splice Isoform Long); 37. IPI00221384 콜라겐 α-1(XII) 사슬 전구체의 스플라이스 아이소형 쇼트(Splice Isoform Short); 38. IPI00400935 콜라겐 α-l(XVI) 사슬 전구체; 39. IPI00297646 콜라겐 α-1(1) 사슬 전구체; 40. IPI00164755 프레프로-α2(I) 콜라겐 전구체; 41. IPI00304962 콜라겐 α-2(I) 사슬 전구체; 42. IPI00021033 콜라겐 α-l(III) 사슬 전구체; 43. IPI00167087 COL3A1 단백질; 44. IPI00021034 콜라겐 α-l(IV) 사슬 전구체; 45. IPI00479324 α 2 타입 IV 콜라겐 프레프로단백질; 46. IPI00306322 콜라겐 α-2(IV) 사슬 전구체; 47. IPI00303313 콜라겐 α-l(V) 사슬 전구체; 48. IPI00477611 184 kDa 단백질; 49. IPI00293881 COL5A2 단백질; 50. IPI00018279 콜라겐 α-3(V) 사슬 전구체; 51. IPI00291136 콜라겐 α-1(VI) 사슬 전구체; 52. IPI00304840 콜라겐 α-2(VI) 사슬 전구체의 스플라이스 아이소형 2C2; 53. IPI00220613 콜라겐 α-2(VI) 사슬 전구체의 스플라이스 아이소형 2C2A; 54. IPI00022200 α 3 타입 VI 콜라겐 아이소형 1 전구체; 55. IPI00072918 α 3 타입 VI 콜라겐 아이소형 4 전구체; 56. IPI00220701 콜라겐 α-3(VI) 사슬 전구체의 스플라이스 아이소형 2; 57. IPI00072917 α 3 타입 VI 콜라겐 아이소형 3 전구체; 58. IPI00021828 시스타틴 B; 59. IPI00007778 Di-N-아세틸키토비아제(acetylchitobiase) 전구체; 60. IPI00295741 카텝신 B 전구체;
61. IPI00299219 단백질 CYR61 전구체; 62. IPI00514900 42 kDa 단백질; 63. IPI00333770 세포질분열 단백질 10의 데디케이터와 유사; 64. IPI00478332 세포질분열 단백질 9의 데디케이터와 유사; 65. IPI00000875 연장 인자 1-γ; 66. IPI00465248 α-에놀라제; 67. IPI00013769 α-에놀라제, 폐 특이적; 68. IPI00216171 γ-에놀라제; 69. IPI00218803 피불린-1 전구체의 스플라이스 아이소형 B; 70. IPI00296537 피불린-1 전구체의 스플라이스 아이소형 C; 71. IPI00328113 피불린-1 전구체; 72. IPI00019439 피불린 2 전구체; 73. IPI00385645 섬유모세포 성장인자 17 전구체의 스플라이스 아이소형 2; 74. IPI00216602 섬유모세포 성장인자 수용체 2 전구체의 스플라이스 아이소형 5; 75. IPI00216604 S섬유모세포 성장인자 수용체 2 전구체의 스플라이스 아이소형 8; 76. IPI00034099 가상 단백질 FLJ21918; 77. IPI00333541 필라민-A; 78. IPI00302592 필라민 A, α; 79. IPI00339227 가상 단백질 DKFZp68601166; 80. IPI00414283 섬유결합소 전구체(FN) (냉-불용성 글로불린)(CIG). 스플라이스 아이소형 3; 81. IPI00339225 섬유결합소 전구체의 스플라이스 아이소형 5 ; 82. IPI00339319 섬유결합소 전구체의 스플라이스 아이소형 11 ; 83. IPI00556632 섬유결합소 전구체의 스플라이스 아이소형 12; 84. IPI00411462 가상 단백질 DKFZp686B 18150; 85. IPI00029723 폴리스타틴-연관 단백질 1 전구체; 86. IPI00005401 폴리펩타이드 N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제 5; 87. IPI00219025 글루타리독신-1; 88. IPI00171411 골지 인단백질 2; 89. IPI00026314 젤솔린 전구체;
90. IPI00219757 글루타티온 S-트랜스퍼라제 P; 91. IPI00027569 비상동 핵 리보핵산단백 C-유사 1; 92. IPI00003881 HNRPF 단백질; 93. IPI00442294 스플라이스 아이소형 1 of 뉴트로트리민 전구체; 94. IPI00003865 열 충격 인지체 71 kDa 단백질의 스플라이스 아이소형 1; 95. IPI00037070 열 충격 인지체 71 kDa 단백질의 스플라이스 아이소형 2; 96. IPI00220362 10 kDa 열 충격 단백질, 미토콘드리아; 97. IPI00024284 기저막-특이적 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 핵심 단백질 전구체; 98. IPI00297284 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 2 전구체; 99. IPI00297284 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 2 전구체; 100. IPI00029236 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 5 전구체; 101. IPI00029236 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 5 전구체; 102. IPI00029235 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 6 전구체; 103. IPI00029235 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 6 전구체; 104. IPIOOO16915 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 7 전구체; 105. IPIOOO 16915 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 7 전구체; 106. IPI00328163 K-α-I 단백질; 107. IPI00021396 혈관내피 성장인자 수용체 2 전구체; 108. IPI00298281 라미닌 γ-1 사슬 전구체; 109. IPI00219219 갈렉틴-1; 110. IPI00023673 갈렉틴-3 결합 단백질 전구체; 111. IPI00021405 라민-A/C의 스플라이스 아이소형 A ; 112. IPI00216953 라민-A/C의 스플라이스 아이소형 ADeltalO; 113. IPI00180173 PREDICTED: 트로포마이오신 4와 유사; 114. IPI00401614 PREDICTED: FKSG30와 유사; 115. IPI00374397 예측: 트로포마이오신 4와 유사; 116. IPI00374732 PREDICTED: PPIA 단백질과 유사; 117. IPI00402104 PREDICTED: 펩티딜프로필 이성질화효소 A 아이소형 1과 유사; 사이클로필린 A; 펩티딜-프로; 118. IPI00455415 PREDICTED: 비상동성 핵 리보핵산단백 C-유사 dJ845O24.4와 유사; 119. IPI00454722 예측: 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질과 유사; 120. IPI00454852 PREDICTED: 기형암종(Teratocarcinoma)-유래 성장인자 1과 유사;
121. IPI00002802 단백질-라이신 6-옥시다제 전구체; 122. IPI00410152 잠복 형질전환 성장인자 β 결합 단백질 1 아이소형 LTBP-IL; 123. IPI00220249 잠복 형질전환 성장인자 β-결합 단백질, 아이소형 IL 전구체; 124. IPI00220249 잠복 형질전환 성장인자 β-결합 단백질, 아이소형 IL 전구체"; 125. IPI00410152 잠복 형질전환 성장인자 β 결합 단백질 1 아이소형 LTBP-IL ; 126. IPI00020986 루미칸 전구체; 127. IPI00291006 말레이트 탈수소효소, 미토콘드리아 전구체; 128. IPI00005707 포식세포 만노스 수용체 2 전구체; 129. IPI00020501 마이오신-11; 130. IPIOOO 19502 마이오신-9; 131. IPI00604620 누클리올린; 132. IPI00220740 뉴클레오포스민의 스플라이스 아이소형 2; 133. IPI00219446 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질; 134. IPI00299738 프로콜라겐 C-엔도펩티다아제 인핸서 1 전구체; 135. IPI00015902 β 혈소판-유래 성장인자 수용체 전구체; 136. IPI00216691 프로필린-1; 137. IPI00169383 포스포글리세레이트키나제 1; 138. IPI00219568 포스포글리세레이트키나제, 고환 특이적; 139. IPI00296180 우로키나제-타입 플라스미노겐 활성제 전구체; 140. IPI00215943 플렉틴 1의 스플라이스 아이소형 3; 141. IPI00215942 플렉틴 1의 스플라이스 아이소형 2; 142. IPI00014898 플렉틴 1의 스플라이스 아이소형 1; 143. IPI00398777 플렉틴 1 아이소형 8; 144. IPI00398776 플렉틴 1 아이소형 7; 145. IPI00186711 플렉틴 1 아이소형 6; 146. IPI00420096 플렉틴 1 아이소형 3; 147. IPI00398779 플렉틴 1 아이소형 11; 148. IPI00398778 플렉틴 1 아이소형 10; 149. IPI00398002 플렉틴 1 아이소형 1; 150. IPI00419585 펩티딜-프로필 cis-트랜스 이성질화효소 A;
151. IPI00472718 펩티딜프로필 이성질화효소 A 아이소형 2; 152. IPI00000874 페록시리독신(Peroxiredoxin)-1; 153. IPI00024915 페록시리독신-5, 미토콘드리아 전구체; 154. IPI00375306 페록시리독신 5 전구체, 아이소형 b; 155. IPI00012503 전활성체 폴리펩타이드 전구체의 스플라이스 아이소형 Sap- mu-0; 156. IPI00374179 프로테아솜 활성제 서브유닛 1 아이소형 2; 157. IPI00030154 프로테아솜 활성제 복합 서브유닛 1; 158. IPI00168812 PTK7 단백질 티로신 키나제 7 아이소형 d 전구체; 159. IPI00419941 PTK7 단백질 티로신 키나제 7 아이소형 a 전구체; 160. IPI00003590 퀘이에스신(Quiescin) Q6, 아이소형 a; 161. IPIOOO 15916 골-유래 성장인자(단편); 162. IPIOOO 15916 골-유래 성장인자; 163. IPI00298289 레티쿨론(Reticulon)-4의 스플라이스 아이소형; 164. IPI00021766 레티쿨론(Reticulon)-4의 스플라이스 아이소형 1; 165. IPI00013895 칼지자린(Calgizzarin); 166. IPI00010402 가상 단백질; 167. IPI00218733 과산화물 디스무타제; 168. IPI00014572 SPARC 전구체; 169. IPI00005614 스펙트린 β 사슬의 스플라이스 아이소형 롱, 뇌 1; 170. IPI00008780 스태니오칼신(Stanniocalcin)-2 전구체; 171. IPI00301288 SEL-OB 단백질; 172. IPI00216138 트랜스젤린(Transgelin); 173. IPIOOO 18219 형질전환 성장인자-β-유도 단백질 ig-h3 전구체; 174. IPI00304865 형질전환 성장인자, β 수용체 III "; 175. IPI00296099 트롬보스폰딘(Thrombospondin)-1 전구체; 176. IPI00032292 금속단백분해효소 저해제 1 전구체; 177. IPI00027166 금속단백분해효소 저해제 2 전구체; 178. IPI00220828 타이모신 β-4; 179. IPI00180240 타이모신-유사 3;
180. IPI00299633 OTTHUMP00000031270(단편); 181. IPI00465028 트라이오스포스페이트 이성질화효소 1 변이(단편); 182. IPI00451401 트라이오스포스페이트 이성질화효소의 스플라이스 아이소형 2; 183. IPI00010779 트로포마이오신 4; 184. IPI00216975 트로포마이오신 α-4 사슬의 스플라이스 아이소형 2; 185. IPI00180675 튜불린α-3 사슬; 186. IPI00218343 튜불린 α-6 사슬; 187. IPI00216298 타이오레독신; 188. IPI00472175 CDNA FLJ46672 fis, 클론 TRACH3009008, 타이오레독신 환원효소와 매우 유사; 189. IPI00450472 유비퀴틴-컨쥬게이팅 효소 E2I; 190. IPIOOOl 8352 유비퀴틴 카르복실-터미널 하이드롤레이스 아이소자임 Ll; 191. IPIOOO 10207 유비퀴틴-접힌 조절제 1 전구체; 192. IPI00260630 URB; 193. IPI00021263 14-3-3 단백질 ζ/δ; 194. IPI00642991 가상 단백질 DKFZp686Fl 0164; 195. IPI00470919 가상 단백질 DKFZp686K08164; 196. IPI00719088 콜라겐, 타입 VI, α 1 전구체; 197. IPI00654685 SPARC 전구체와 유사; 198. IPI00641961 콜라겐, 타입 XII, α 1; 199. IPI00645849 세포외 기질 단백질 1; 200. IPI00554786 타이오레독신 환원효소 1; 201. IPI00645018 플라미스노겐 활성제, 우로키나제; 202. IPI00552339 금속단백분해효소 1의 조직 저해제; 203. IPI00642997 액틴, 세포질 2; 204. IPI00719778 아넥신 A2와 유사; 205. IPI00647915 트랜스젤린(Transgelin) 2; 206. IPI00552815 콜라겐, 타입 V, α 1; 207. IPI00552981 CDNA PSEC0266 fis, 클론 NT2RP3003649, 호모사피엔스 피불린-lD mRNA와 매우 유사; 208. IPI00180776 29 kDa 단백질; 209. IPI00552416 필라민 A, α; 210. IPI00640698 액틴 γ-창자 평활근; 211. IPI00514530 액틴, α 1, 골격근; 212. IPI00556442 인슐린-유사 성장인자-결합 단백질 2 변이(단편); 213. IPI00513782 겔솔린(Gelsolin); 214. IPI00478731 29 kDa 단백질; 215. IPI00396479 24 kDa 단백질; 216. IPI00334627 39 kDa 단백질; 217. IPI00555762 PTK7 단백질 티로신 키나제 7 아이소형 변이(단편); 218. IPI00658202 97 kDa 단백질; 219. IPI00006273 CYR61 단백질; 220. IPI00719405 TMSL6 단백질; 221. IPI00658096 타이모신 β-4; 222. IPI00376163 5 kDa 단백질; 223. IPI00556217 피브릴린 1 변이(단편); 224. IPI00514817 라민 A/C와 유사; 225. IPI00644087 프로게린; 226. IPI00655812 횡문근육종 항원 MU-RMS-40.12; 227. IPI00604517 누클리올린과 유사; 228. IPI00444262 CDNA FLJ45706 fis, 클론 FEBRA2028457, 누클리올린과 매우 유사; 229. IPI00412473 단백질; 230. IPI00414489 단백질; 231. IPI00411463 단백질; 232. IPI00556415 트랜스젤린(Transgelin) 변이(단편); 233. IPI00718825 칼모듈린; 234. IPI00478156 17 kDa 단백질; 235. IPI00386621 CALM3 단백질; 236. IPI00647001 산성; 237. IPI00642650 스타니오칼신 2 전구체와 유사; 238. IPI00641471 콜라겐-유사 단백질; 239. IPI00514669 SH3 도메인 결합 글루탐산-풍부 단백질 유사 3; 240. IPI00719422 트라이오스포스페이트 이성질화효소 (단편); 241. IPI00003734 추정 SlOO 칼슘-결합 단백질 H_NHO456N16.1; 242. IPI00029574 11 kDa 단백질; 243. IPI00641047 겔솔린(Gelsolin); 244. EPI00647556 겔솔린(Gelsolin); 245. IPI00654821 가상 단백질 LOC54845 아이소형 1; 246. IPI00647572 Dickkopf 연관 단백질-3 전구체; 247. IPI00639879 세포질분열 단백질 sepA와 유사; 248. IPI00657746 세포질분열 단백질 8의 데디케이터와 유사 ; 249. IPI00555993 혈관내피 성장인자 수용체 3 변이; 250. IPI00552545 세포질분열 단백질 8의 데디케이터.
미확인 기능을 지닌 단백질: IPI00642991 가상 단백질 DKFZp686F10164; IPI00470919 가상 단백질 DKFZp686K08164; IPI00654685 SPARC 전구체와 유사; IPI00719778 아넥신 A2와 유사; IPI00552981 CDNA PSEC0266 fis, clone NT2RP3003649, 호모 사피엔스 피불린-lD mRNA와 매우 유사; IPIOO 180776 29 kDa 단백질; IPI00478731 29 kDa 단백질; IPI00396479 24 kDa 단백질; IPI00334627 39 kDa 단백질; IPI00658202 97 kDa 단백질; IPI00376163 5 kDa 단백질; IPI00514817 라민 A/C와 유사; IPI00644087 프로게린; IPI00655812 횡문근육 종항원 MU-RMS-40.12; IPI00604517 누클리올린과 유사; IPI00444262 CDNA FLJ45706 fis, 클론 FEBRA2028457, 누클리올린과 매우 유사; IPI00412473 단백질; IPI00414489 단백질; IPI00411463 단백질; IPI00478156 17 kDa 단백질; IPI00386621 CALM3 단백질; IPI00647001 산성; IPI00642650 스타니오칼신 2 전구체와 유사; IPI00641471 콜라겐-유사 단백질; IPI00514669 SH3 도메인 결합 글루탐산-풍부한 단백질 유사 3; IPI00003734 추정 SlOO 칼슘-결합 단백질 H_NHO456N16.1; IPI00029574 11 kDa 단백질; IPI00654821 가상 단백질 LOC54845 아이소형 1; IPI00647572 Dickkopf 연관 단백질-3 전구체; IPI00639879 세포질분열 단백질 sepA와 유사; IPI00657746 세포질분열 단백질 8의 데디케이터와 유사; IPI00555993 혈관내피 성장인자 수용체 3 변이.
유전자 산물
단백질은 하기 표 D2에 나타난 유전자의 유전자 산물에서 선택된다. 표 D2는 하기 단락 내 하기 유전자를 포함한다:
ACTAl; COL5A2; HSPA8; PSAP; ACTA2; COL5A3; HSPEl; PSMEl; ACTB; COL6A1; HSPG2; PTK7; ACTC; COL6A2; IGFBP2; QSCN6; ACTGl; COL6A3; IGFBP5; RTN4; ACTG2; CSTB; IGFBP6; SlOOAl 1; AGRN; CTBS; IGFBP7; SH3BGRL3; ALCAM; CTSB; K-ALPHA-I; SODl; ANP32B; CYR61; KDR; SPARC; ANXA2; DOCKlO; LAMCl; SPTBNl; ARHGDIA; DOCK8; LGALSl; STC2; B2M; ECMl; LGALS3BP; SVEPl; BMPl; EEFlG; LMNA; TAGLN; C14orfl66; ENOl; LOX; TAGLN2; ClR; ENOlB; LTBPl; TGFBI; CALMl; ENO2; LUM; TGFBR3; CD109; FBLNl; MDH2; THBSl; CD44; FBNl; MRC2; TIMPl; CDHI l; FBN2; MYHl 1; TIMP2; CDH13; FGF 17; MYH9; TMSB4X; CDH2; FGFR2; NCL; TMSL3; CFH/HF1; FLJ21918; NPMl; TMSL6; CFLl; FLNA; PBP; TPIl; CLSTNl; FNl; PCOLCE; TPM4; COLI lAl; FSTLl; PDGFRB; TUBA3; COL12A1; GALNT5; PFNl; TUBA6; C0L16A1; GLRX; PGKl; TXN; COLlAl; GOLPH2; PGK2; TXNRDl; COL 1A2; GSN; PLAU; UBE2I; COL3A1; GSTPl; PLECl; UCHLl; C0L4A1; HNRPCLl; PPIA; UFMl; COL4A2; HNRPF; PRDXl; URB; C0L5A1; HNT; PRDX5; YWHAZ.
58개 생물학적 과정 내 201개 유전자
상기 입자는 하기 표 D3에 기입된 201개 유전자의 어떠한 유전자 산물도 추가로 또는 대안으로 포함한다. 이들 유전자는 유전자가 관련된 생물학적 과정에 따라 특성화된다.
따라서 입자는 이들 어떠한 58개 생물학적 과정에도 영향을 미치거나 제어하거나 조절하는데 이용된다.
표 D3. 58개 생물학적 과정 각각의 201개 유전자 목록(중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)의 유전자)
Figure pct00001
Figure pct00002
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
30개 경로 내 201개 유전자
상기 입자는 하기 표 D4에 기입된 201개 유전자의 어떠한 유전자 산물도 추가로 또는 대안으로 포함한다. 이들 유전자는 상기 유전자가 관련된 경로에 따라 특성화된다.
따라서 입자는 이들 30개 경로에 영향을 미치거나 이를 제어하거나 조절하는데 이용된다.
표 D4. 30개 갱로 각각의 201개 목록(중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)의 유전자)
Figure pct00012
Figure pct00013

Figure pct00014

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Figure pct00016

Figure pct00017

Figure pct00018
593개 유전자 및 794개 유전자 산물
상기 입자는 하기 표 D5에 기입된 593개 유전자 및/또는 794개 유전자 산물의 어떠한 유전자 산물도 추가로 또는 대안으로 포함한다.
따라서 입자는 유전자 또는 유전자 산물이 관련된 어떠한 생물학적 과정 또는 경로에도 영향을 미치거나 이를 제어하거나 조절하는데 이용된다.
표 D5. 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM) 내 593개 추가 단백질
Figure pct00019

Figure pct00020
엑소솜
상기 입자는 특히 소포를 포함한다. 상기 입자는 엑소솜을 포함한다.
실시예는 재관류 손상에 대한 심장보호를 제공하는 분비물 내 활성 성분의 분리를 기재하고 있다. 상기 활성 성분은 중간엽 줄기세포(MSC)에 의해 분비되는 엑소솜을 포함한다.
엑소솜은 1983년 망상적혈구에 의해 분비되는 것으로 최초로 기재되고 이후 다양한 조혈세포, 조혈성 또는 비-조혈성 기원 및 상피 세포의 종양을 포함한 많은 세포 형태에 의해 분비되는 것으로 발견된 후기 세포내이입 구획(다소포체) 내에서 형성된 작은 막소포이다. 이들은 더욱 최근 기재된 '리보뉴클레아제 복합체'와 구분된 실재이고 엑소솜으로 명명된다.
엑소솜은 형태 및 생화학 파라미터(논문 참조)에 의해 한정된다. 따라서 본원에 기재된 입자는 하나 이상의 이들 형태 또는 생화학 파라미터를 포함한다.
엑소솜은 40∼100 nm의 지름을 지닌 지질 이중층에 의해 한정된 "받침-유사" 소포 또는 평평 구체로 통상적으로 한정되고 엔도솜막의 내부 출아에 의해 형성된다. 아폽토시스 세포에 의해 분비되는 모든 지질 소포와 유사하고 단백질 응집체 또는 뉴클레오솜 단편과 달리 엑소솜은 ∼1.13-1.19 g/ml의 밀도를 지니고 슈크로스 구배 상에 부유된다. 엑소솜은 콜레스테롤 및 스핑고마이엘린 및 GM1, GM3, 플로틸린과 같은 지질 뗏목 및 src 단백질 키나제 Lyn 내에 풍부하고, 이는 이들의 세포막이 지질 뗏목 내에 풍부함을 나타낸다.
상이한 세포 형태 및 상이한 종 유래의 엑소솜의 분자 조성이 평가되었다. 일반적으로 엑소솜은 세포-형태 특이적인 모든 엑소솜 및 단백질에 공통적인 것으로 판명된 편재하는 단백질을 포함한다. 또한 동일한 세포-형태이나 상이한 종 유래의 엑소솜 내 단백질은 매우 보존되어 있다. 편재하는 엑소솜-관련 단백질은 세포골격 예를 들어 튜불린, 액틴과 액틴 결합-단백질, 세포내 세포막 융합 및 운송 예를 들어 아넥신 및 rab 단백질, 신호 전달 단백질 예를 들어 단백질 키나제, 14-3-3 및 이형삼량체 G 단백질, 대사 효소 예를 들어 과산화효소, 피루브산 및 지질 키나제 및 에놀라제-1 및 테트라스패닌 패밀리 예를 들어 CD9, CD63, CD81 및 CD82를 포함한다. 상기 테트라스패닌은 엑소솜 내에 매우 풍부하고 거대 분자 복합체 및 세포막 서브도메인의 조직화와 관련된 것으로 알려져 있다.
엑소솜 내 세포-형태 특이적 단백질의 예는 MHC 클래스 Ⅱ-발현 세포 유래의 엑소솜 내 MHC 클래스 Ⅱ 분자, 수지상 세포-유래 엑소솜 내 CD86, T-세포-유래 엑소솜 상의 T-세포 수용체 등이다. 특히 엑소솜은 세포핵, 미토콘드리아, 소포체 또는 골지체 기원의 단백질을 포함하지 않는다. 또한 매우 풍부한 형질막 단백질은 엑소솜 내에 결여되어 있고, 이는 이들이 단순한 형질막의 단편이 아님을 나타낸다. 또한 보고된 편재하는 엑소솜-관련 단백질의 대다수는 hESC-MSC 분비물의 단백질 프로파일 내에 존재한다.
또한 엑소솜은 mRNA 및 마이크로RNA를 포함하는 것으로 알려져 있고, 이는 또다른 세포로 전달될 수 있고, 이러한 새로운 위치 내에서 기능적일 수 있다. 엑소솜의 생리적 기능은 불충분하게 정의되어 있다. 퇴화한 단백질을 박멸하고, 단백질을 재활용하고, 프리온 및 바이러스와 같은 감염성 입자의 전파를 매개하고, 보체 내성을 유도하고, 면역 세포-세포 커뮤니케이션을 촉진시키고 세포 신호전달을 전송하는데 도움을 주는 것으로 판단된다. 엑소솜은 암 치료를 위한 면역치료법에 이용된다.
중간엽 줄기세포 유래의 입자의 용도
상기 입자는 상기 기재된 바와 같이 MSC 또는 MSC-CM의 대용물로 사용된다. 특히 상기 입자는 MSC 또는 MSC-CM이 현재 사용되고 있고 미래에 사용되는 어떠한 치료 목적에도 사용된다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 중간엽 줄기세포 유래의 입자의 제조를 가능하게 함이 명백할 것이다. 따라서 중간엽 줄기세포의 어떠한 용도도 중간엽 줄기세포 유래의 입자에 동일하게 부여될 것이다.
본원에서 기재된 방법 및 조성물에 의해 생성된 중간엽 줄기세포 및 분화 세포는 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물을 위해 또는 이의 제조를 위해 사용된다. 이러한 질환은 심부전, 골수 질환, 피부 질환, 화상, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨스병 등과 같은 퇴행성 질환 및 암을 포함한 재생 치료에 의해 치료 가능한 질환을 포함한다. 따라서 MSC 유래 입자는 이러한 질환을 치료하는데 사용된다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제조된 바와 같은 중간엽 줄기세포 유래 입자는 다양한 상업적으로 중요한 연구, 진단 및 치료 목적에 사용된다.
중간엽 줄기세포 유래 입자는 특히 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조에 사용된다. 이러한 질환은 심부전, 골수 질환, 피부 질환, 화상, 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨스병 등과 같은 퇴행성 질환 및 암을 포함한 재생 치료에 의해 치료 가능한 질환을 포함한다.
본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 제조된 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSC)와 유사하거나 동일한 특성을 지닌다. 따라서 중간엽 줄기세포 및 이들에서 제조된 어떠한 분화 세포뿐만 아니라 이로부터 유래한 입자는 BM-MSC가 사용되는 것으로 알려지거나 이들이 사용되는 것이 가능한 어떠한 응용에도 사용된다.
중간엽 줄기세포 유래 입자에 의한 질환 치료법
MSC의 프로테오솜 분석은 발현된 단백질이 3가지 생물학적 과정에 관련됨을 나타낸다: 대사, 방어 반응 및 혈관화, 조혈 및 골격 발달을 포함한 조직 분화. 따라서 본원에 기재된 MSC 유래 입자는 이들 기능이 역할을 지니거나 그의 복구 또는 치료가 하나 이상의 이들 생물학적 과정을 포함하는 질환을 치료하는데 사용된다. 유사하게 MSC에 의해 발현된 단백질은 단독으로 또는 조합하여, 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 입자 형태로 예를 들어 이러한 질환을 치료하거나 예방하는 목적으로 MSC 또는 MSC에 의해 조절된 배지의 활성을 보충하거나 그 대신에 사용된다.
MSC에 의해 발현된 201개 유전자 산물은 Jak-STAT, MAPK, Toll-유사 수용체와 같은 중요한 심혈관 생물학, 골 발달 및 조혈의 신호전달 경로, TGF-베타 신호전달 및 mTOR 신호전달 경로를 활성화하는 것으로 나타난다. 따라서 MSC 유래 입자는 이들 신호전달 경로가 관련되거나 그의 병인학이 이들 신호전달 경로 중 하나 이상 내의 하나 이상의 결손을 포함하는 질환을 예방하거나 치료하는데 사용된다.
따라서 이러한 입자는 심부전, 골수 질환, 피부 질환, 화상 및 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨스병과 같은 퇴행성 질환 및 암을 치료하는데 사용된다.
또한 이러한 입자는 심근경색증, 피부 상처, 피부병, 피부 병변, 피부염, 건선, 콘딜로마, 사마귀, 혈관종, 흉터종, 피부암, 아토피 피부염, 베체트병, 만성 육아종병, 피부 T 세포 림프종, 궤양, 섬유증 및 기능 상실, 신장 허혈성 손상, 결정성 섬유증, 동염 및 비염을 포함한 만성 조직 개편을 유발하는 염증 및 면역 조절곤란을 유도하는 초기 손상을 특징으로 하는 병리학적 이상 또는 정형외과 질환을 치료하는데 사용된다.
상기 입자는 개체 내 상처 치유, 흉터 감소, 골형성, 골이식 또는 골수 이식을 원조하는데 사용된다.
특별히 나타내지 않는 한 용어 "조절 배지"는 MSC 뿐만 아니라 조절 배지 내에 존재하는 하나 이상, 바람직하게는 실질적으로 모든 폴리펩타이드를 포함하는 이러한 조성물에 노출된 세포 배양 배지를 포함한다.
또한 상기 입자는 MSC에 의해 분비되거나 발현되는 어떠한 단백질의 공급원으로도 사용된다. 따라서 본 발명자들은 본원에 기재된 입자를 수득하고 상기 입자에서 폴리펩타이드를 분리하는 단계를 포함한, 표 D1 내지 D5에 나타난 폴리펩타이드의 생성 방법을 제공한다.
심장 질환
본원에 기재된 중간엽 줄기세포 입자 방법 및 조성물은 심장 질환의 치료 또는 예방에 사용된다.
심장 질환은 심장에 영향을 미치는 다양한 다른 질환에 대한 포괄적인 용어이다. 2007년 현재 미국, 영국, 캐나다 및 웨일스에서 주용한 사망 원인이고 미국에서만 34초당 1명을 사망하게 한다. 심장 질환은 하기를 포함한다.
관상동맥 심장 질환
관상 동맥 질환은 심근에 공급되는 동맥 벽 내의 죽상판의 축적에 의해 유발되는 동맥 질환이다. 협심증(흉통) 및 심근경색(심장마비)은 관상동맥 심장 질환에 의해 유발되는 증상 및 이상이다. 매년 459,000명 이상의 미국인이 심장 질환으로 사망한다. 영국에서는 연간 101,000건의 사망이 관상동맥 심장 질환에 의한 것이다.
심근증
심근증은 어떠한 원인에 의한 심근(즉 실질적인 심장 근육)의 기능 저하이다. 심근증 환자는 종종 부정맥 및/또는 급성 심장사의 위험이 있다. 외인성 심근증 - 근본적인 병리가 심근 자체 외부에 존재하는 심근증이 대부분의 심근증을 포함한다. 현재 가장 흔한 심근증 원인은 허혈이다.
세계 보건 기구는 특정한 심근증을 포함한다: 알코올성 심근증, 관상 동맥 질환, 선천성 심장 질환, 심장에 영향을 미치는 영양성 질환, 허혈성 심즌증, 고혈압성 심증증, 판막성 심근증, 염증성 심근증.
또한 하기를 포함한다:
전신성 대사 질환에 이차적인 심근증
내인성 심근증(확인 가능한 외부 원인에 의한 것이 아닌 심장 근육의 쇠약)
확장형 심근증(DCM, 가장 흔한 형태 및 심장 이식을 위한 주요한 표시 중 하나, DCM의 경우 심장(특히 좌심실)이 확대되고 펌핑 기능이 감소됨)
비대성 심근증(HCM 또는 HOCM, 근섬유분절 단백질을 암호화하는 유전자 내 다양한 돌연변이에 의해 유발되는 유전자 장애. HCM의 경우 심장 근육이 두꺼워지고 이는 혈류를 방해하고 심장이 적당하게 기능하는 것을 방지함)
부정맥유발성 우심실 심근증(ARVC, 심장 근육이 섬유 흉터 조직으로 대체된 심장의 전기적 교란에서 유발됨. 우심실이 일반적으로 가장 영향 받음)
제한성 심근증(RCM, 가장 흔치 않은 심근증임. 심실벽이 경직되나 두껍지 않고, 심장을 혈액으로 정상적으로 채우는 것을 저지함)
비압축 심근증 - 좌심실벽이 출생 후 적당하게 성장하지 못하여 심초음파상 동안 관찰시 해면 외형을 지님.
심혈관 질환
심혈관 질환은 심장 자체 및/또는 혈관계, 특히 심장에 이르거나 이로부터 유도되는 정맥 및 동맥에 영향을 미치는 많은 특정 질환이다. 질환 이형성 연구는 심혈관 질환을 지닌 여성이 일반적으로 혈관에 영향을 미치는 형태인 반면 남성은 심장 근육 자체에 영향을 미치는 형태임을 나타낸다. 심혈관 질환의 알려지거나 관련된 원인은 당뇨병, 고혈압, 고호모시스테인혈증 및 고콜레스테롤혈증을 포함한다.
심혈관 질환의 형태는 죽상동맥경화증을 포함한다.
허혈성 심장병
허혈성 심장병은 기관으로의 감소된 혈관 공급을 특징으로 하는 심장 자체의 질환이다. 이는 산소 및 영양분을 공급하는 동맥이 정지되는 경우 심장이 충분한 산소와 영양분을 제공받지 못하여 결국 박동이 정지될 때 발생한다.
심부전
울혈성 심부전(또는 CHF) 및 울혈성 심장 심장 기능상실(CCF)로도 명명되는 심부전은 심장이 충분한 양의 혈액으로 채워지거나 신체로 이를 펌프할 수 있는 능력이 손상된 어떠한 구조적 또는 기능적 심장 장애를 유발할 수 있는 이상이다. 폐심장증은 심장의 우측면의 기능상실이다.
고혈압성 심장병
고혈압성 심장병은 고혈압, 특히 국소 고혈압에 의해 유발되는 심장병이다. 고혈압성 심장병에 의해 유발되는 이상은 하기를 포함한다: 좌심실 비대증, 관상동맥 심장병, (울혈성) 심부전, 고혈압성 심근증, 심장 부정맥, 염증성 심장병 등.
염증성 심장병은 심장 근육 및/또는 그 주변 조직의 염증을 포함한다. 심내막염은 심장의 내부층, 심내막의 염증을 포함한다. 관련된 가장 흔한 구조는 심장 판막이다. 염증성 심장비대증. 심근염은 심장의 근육 부분인 심근의 염증을 포함한다.
판막성 심장병
판막성 심장병은 심장의 하나 이상의 판막에 영향을 미치는 질환 진행이다. 심장의 우측면의 판막은 삼첨 판막 및 폐동맥 판막이다. 심장의 좌측면의 판막은 승모 판막 및 대동맥 판막이다. 대동맥 판막 협착증, 승모 판막 탈출증 및 판막성 심근증이 포함된다.
[상기 본문은 Heart disease(2009, February 3). In Wikipedia, The Free Encyclopedia. Retrieved 06:33, February 20, 2009, from http://en.wikipedia.org/w/index.php?title=Heart_disease&oldid=268290924에서 채택됨]
입자의 전달
본원에 기재된 입자는 적당한 수단에 의해 인간 또는 동물 신체에 전달된다.
따라서 본 발명자들은 본원에 기재된 입자를 타겟 세포, 조직, 기관, 동물 신체 또는 인간 신체에 전달하기 위한 전달 시스템 및 상기 입자를 타겟에 전달하는 상기 전달 시스템을 이용하는 방법을 기재하고 있다.
상기 전달 시스템은 입자를 포함하는 용기와 같은 입자 공급원을 포함한다. 상기 전달 시스템은 입자를 타겟에 분배하기 위한 디스펜서를 포함한다.
따라서 본 발명자들은 입자를 타겟에 전달하도록 실시 가능한 디스펜서와 함께 본원에 기재된 입자의 공급원을 포함한, 입자를 전달하기 위한 전달 시스템을 제공한다.
또한 본 발명자들은 입자를 타겟에 전달하는 방법에 있어서 이러한 전달 시스템의 용도를 제공한다.
유체를 신체에 전달하기 위한 전달 시스템은 당분야에 알려져 있고, 주사, 외과 점적 주입, 미국 특허 제6,139,524호에 기재된 바와 같은 카테터(관류 카테터 포함), 미국 특허 제7,122,019호에 기재된 바와 같은 약물 전달 카테터를 포함한다.
비강내 전달을 포함한 폐 또는 비강 통로로의 전달은 예를 들어 당분야에 알려진 비강 스프레이, 퍼퍼(puffer), 흡입기 등(예를 들어 미국 디자인 특허 D544,957에 나타난 바와 같이)을 이용하여 달성된다.
신장으로의 전달은 미국 특허 제7,241,273호에 기재된 바와 같은 대동맥내 신장 전달 카테터를 이용하여 달성된다.
특정 전달은 최적 치료를 달성하기 위해 적당한 간격으로 필요한 양의 입자를 전달하도록 형성 가능하여야 함이 명백할 것이다.
예를 들어 입자는 죽상동맥경화증의 치료 또는 예방을 위해 사용된다. 본원에서 입자의 관류는 죽상경화판을 안정화시키거나 상기 판 내 염증을 감소시키기 위해 정맥내로 수행된다. 상기 입자는 정맥내 관류에 의한 패혈성 쇼크의 치료 또는 예방에 사용된다.
상기 입자는 심부전의 치료 또는 예방에 사용된다. 이는 재건을 지체시키거나 심부전을 지체시키기 위해 입자의 만성 관상동맥내 또는 심근내 관류에 의해 달성된다. 상기 입자는 비강내 전달에 의한 폐 염증의 치료 또는 예방에 사용된다.
상기 입자는 피부 이상 예를 들어 건선의 치료 또는 예방에 사용된다. 입자의 장기간 전달은 상기 이상이 해결될 때까지 경피 미세주사 바늘을 사용하여 이용된다.
상기 전달 방법은 입자가 전달되는 특정 기관에 따라 달라지고, 따라서 당업자는 이용하는 수단을 결정할 수 있음이 명백할 것이다.
예로서 심장 염증 치료시 상기 입자는 예를 들어 흉벽을 통한 직접적인 관상동맥내 주사에 의해 또는 심근과 같은 조직 내 직접 주사를 위한 투시 유도 하의 표준 경피 카테터 기반 방법 또는 신체 관강 내로 삽입되는 스텐트 또는 카테터로부터 저해제의 주입에 의해 심장 조직(즉 심근, 심막 또는 심내막)으로 전달된다.
어떠한 다양한 관상동맥 카테터 또는 관류 카테터도 화합물을 투여하는데 사용된다. 또한 상기 입자는 관상동맥 혈관 내에 위치하는 스텐트 상에 코팅되거나 함침된다.
조직 재생
본원에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 및 분화 세포 및 그로부터 유래한 입자도 필요한 인간 환자의 조직 재구성 또는 재생에 사용된다. 상기 세포는 의도된 조직 부위에 이식 가능하게 하고 기능적으로 결손 영역을 재구성하거나 재생시키는 방식으로 투여된다.
예를 들어 본원에 기재된 방법 및 조성물은 줄기세포 분화를 조절하는데 사용된다. 중간엽 줄기세포 및 분화 세포 및 그로부터 유래한 입자는 피부 이식편의 성장시키기 위함과 같이 조직 설계에 사용된다. 줄기세포 분화의 조절은 인공 기관 또는 조직의 생체공학 또는 스텐트와 같은 보형물에 사용된다.
암
본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 제조된 중간엽 줄기세포 및 분화 세포 및 그로부터 유래한 입자는 암의 치료에 사용된다.
용어 "암" 및 "암성"은 일반적으로 비조절된 세포 성장을 특징으로 하는 포유류 내 생리적 이상을 나타내거나 설명한다. 암의 예는 암종, 림프종, 모세포종, 육종 및 백혈병을 포함하나 이에 한정적인 것은 아니다.
이러한 암의 더욱 특정한 예는 편평세포암, 소세포 폐암, 비-소세포 폐암, 위암, 췌장암, 아교모세포종 및 신경섬유종증과 같은 아교세포 종양, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막암종, 침샘암종, 신장암, 신암, 전립선암, 외음암, 갑상선암, 감암종 및 다양한 형태의 두경부암을 포함한다. 추가적인 예는 결장암, 유방암, 폐암 및 전립선암을 포함한 고형 종양 암, 백혈병 및 림프종을 포함하는 조혈암, 호지킨병, 재생불량 빈혈, 피부암 및 가족성 대장폴립증을 포함한다. 추가적인 예는 뇌종양, 결장직장 종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 안구 종양, 간 종양, 폐 종양, 췌장 종양, 난소 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 고환 종양, 종양, 골 종양, 영양막 종양, 난관 종양, 직장 종양, 결장 종양, 신장 종양, 위 종양 및 부갑상선 종양을 포함한다. 또한 유방암, 전립선암, 췌장암, 대장암, 폐암, 악성 흑생종, 백혈병, 림프종, 난소암, 자궁경부암 및 쓸개 암종이 포함된다.
또한 본원에 기재된 방법 및 조성물에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 및 분화 세포는 엔도스타틴 및 혈관생성억제인자 또는 세포독성제 또는 화학요법제와 같은 항암제와 병용하여 사용된다. 예를 들어 아드리아마이신, 다우노마이신, 시스-플래티넘, 에포토사이드, 택솔, 택소티어 및 빈크리스틴과 같은 알칼로이드 및 메토트렉세이트와 같은 항대사물질과 같은 약제이다. 본원에서 사용된 용어 "세포독성제"는 세포의 기능을 저해 또는 방지 및/또는 세포의 파괴를 야기시키는 물질을 나타낸다. 상기 용어는 방사성동위원소(예를 들어 I, Y, Pr), 화학요법제 및 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원 또는 그의 단편의 효소적 활성 독소와 같은 독소를 포함하는 것을 의미한다.
또한 상기 용어는 WO 94/22867에 개시된 이중고리 안사마이신; EP 600832에 개시된 l,2-비스(아릴아미노) 벤조산 유도체; EP 600831에 개시된 6,7-디아미노-프탈라진-1-온 유도체; EP 516598에 개시된 것과 같은 4,5-비스(아릴아미노)-프탈이미드 유도체; 또는 SH2-함유 기질 단백질에 티로신 키나제의 결합을 저해하는 펩타이드(예를 들어 WO 94/07913 참조)와 같은 종양유전자 생성물/티로신 키나아제 저해제를 포함한다. "화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학적 화합물이다. 화학요법제의 예는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실(5-FU), 사이토신 아라비노시드(Ara-C), 시클로포스파미드, 타이오테파(Thiotepa), 부설판, 사이토신, 택솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포사이드, 이포스파마이드, 미토마이신 C, 미톡산트론(Mitoxantrone), 빈크리스틴, VP-16m, 비노렐빈, 카보플라틴, 테니포사이드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 마이토마이신, 니코틴아미드, 에스페라미신(미국 특허 제4,675,187호 참조), 멜팔란 및 그 밖의 관련된 니트로젠 머스타드 및 내분비샘 치료제(디에틸스틸베스토롤(DES), 타목시펜, LHRH 중화제, 프로제스틴, 항-프로제스틴 등)를 포함한다.
중간엽 줄기세포(MSC)의 수득
본원에 기재된 입자는 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)로부터 분리되거나 제조된다. 조절 배지의 제조시 사용에 대해 적당한 MSC는 당분야에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 제조된다.
특히 MSC는 FGF2를 포함하는 무혈청 배지에서 공동-배양의 부재 하에 배아줄기(ES)세포 콜로니 또는 그의 파생물의 분산에 의해 수득된 세포를 증식시킴으로써 제조된다. 이는 하기 섹션에 상세히 기재되어 있다.
hESC에서 중간엽 줄기세포(MSC) 또는 MSC-유사 세포를 수득하는 선행 방법은 분화하는 hESC 내로 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT) 유전자의 트랜스펙션(Xu et al, 2004) 또는 마우스 OP9 세포주와 공동-배양(Barberi et al., 2005)을 포함한다. 이들 유도 프로토콜에서 외인성 유전 물질 및 마우스 세포의 사용은 종양면역원의 허용 가능하지 않은 위험 또는 제노주틱 감염 약제의 감염을 도입한다.
따라서 상기 입자는 분화하는 hESC에서 유사하거나 동일한(바람직하게는 상동성을 지닌) MSC 모집단을 분리하기 위한 임상적으로 적절하고 재현 가능한 프로토콜을 이용함으로서 유도된 MSC에서 제조된다. 일반적으로 본 방법은 세포 내로 배아줄기(ES) 세포 콜로니를 분산시키는 것을 포함한다. 이후 상기 세포는 도말 증식된다. 상기 세포는 중간엽 줄기세포(MSC)를 수득하기 위해 섬유모세포 성장인자 2(FGF2)를 포함하는 무혈청 배지에서 공동-배양의 결핍시 증식된다.
따라서 상기 프로토콜은 혈청, 마우스 세포의 사용 또는 유전자 조작을 필요로 하지 않으며 적은 조작 및 시간을 필요로 하고, 따라서 이것은 매우 확장 적용 가능하다. 상기 프로토콜은 2개의 상이한 hESC 라인, HuES9 및 H-1 및 세 번째, Hes-3으로부터 MSC의 분리에 이용된다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에 의해 수득된 인간 ES 세포 유래 MSC(hESC-MSC)는 골수 유래 MSC(BMMSC)와 매우 유사하다.
상기 배아줄기세포 배양은 인간 배아줄기세포(hESC) 배양을 포함한다.
하나의 실시태양에서 중간엽 줄기세포(MSC)를 생성하는 방법은 CD105+CD24-세포를 분류하기 전에 FGF2 및 선택적으로 PDGF AB로 보충된 배지 내에서 영양 지원 없이 hESC를 트립신화하고 증식시키는 것을 포함한다.
상기 방법은 CDl05+를 분류하는 것을 포함하고, FGF2 및 선택적으로 PDGF AB로 보충된 배지 내에서 무영양 증식 일주일 후 트립신화된 hESC 유래의 CD24-세포는 세포의 적어도 일부, 실질적으로 전부 또는 전부가 서로 유사하거나 동일한(상동적) hESC-MSC 세포 배양액을 생성할 것이다.
이러한 방법에 의해 생성된 MSC는 입자가 분리되는 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)를 생성하는데 사용된다.
배아줄기세포 콜로니 분해
중간엽 줄기세포를 제조하는 하나의 방법은 세포 내로 배아줄기세포 콜로니를 분산 또는 분해시키는 것을 포함한다.
배아줄기세포 콜로니는 huES9 콜로니(Cowan CA, Klimanskaya I, McMahon J, Atienza J, Witmyer J, et al. (2004) Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med 350: 1353-1356) 또는 Hl ESC 콜로니(Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, et al. (1998) Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 282: 1145- 1147.)를 포함한다.
콜로니 내에서 상기 세포는 분해되거나 상당한 크기로 즉 적어도 클럼프(clump)로 분산된다. 상기 콜로니는 콜로니 내 모든 세포가 단독으로 즉 상기 콜로니가 완전히 분해되는 정도로까지 분해되거나 분산된다.
상기 분해는 분산제로 달성된다.
상기 분산제는 콜로니 내 적어도 일부의 배아줄기세포를 서로 분리 가능한 것이다. 상기 분산제는 콜로니 내 세포들 사이 세포와 기질 사이 또는 둘 모두의 부착을 분열시키는 시약을 포함한다. 상기 분산제는 프로테아제를 포함한다.
상기 분산제는 트립신을 포함한다. 트립신 처리는 예를 들어 3분간 또는 37℃ 부근에서 지속된다. 이후 상기 세포는 중화되고 원심분리되고 도말되기 전에 배지 내에 재현탁된다.
상기 방법은 트립신과 함께 인간 배아줄기세포의 융합성 플레이트를 분산시키고, 세포를 도말하는 것을 포함한다.
상기 분해는 하기의 단계 순서의 적어도 일부를 포함한다: 흡인, 세척, 트립신화, 인큐베이션, 탈착, 급냉, 재분주 및 분취. 하기의 프로토콜은 Hedrick Lab, UC San Diego(http://hedricldab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html)로부터 변형되었다.
흡인 단계에서 상기 배지는 플라스크와 같은 용기로부터 일반적으로 흡인되거나 제거된다. 세척 단계에서 상기 세포는 Ca2+ 및 Mg2+이 부재한 5∼10 ml 정도의 완충 배지 부피로 세척된다. 예를 들어 칼슘 및 마그네슘 부재 PBS로 세척된다. 트립신화 단계에서 완충액 내 일정량의 분산제가 용기에 첨가되고, 상기 용기는 분산제 용액으로 성장 표면을 코팅하도록 회전된다. 에를 들어 Hank's BSS에서 트립신 1 ml가 플라스크에 첨가된다.
인큐베이션 단계에서 상기 세포는 유지된 온도에서 얼마동안 정치된다. 예를 들어 상기 세포는 몇 분간 동안 37℃에 정치된다(예를 들면 2 내지 5분). 탈착 단계에서 상기 세포는 기계적 작동에 의해 탈착되고, 예를 들어 찰과되거나 손으로 용기면을 강타함으로서 탈착된다. 상기 세포는 시트에 떨어지고, 표면을 미끄러져 내려간다.
급냉 단계에서 일정 부피의 배지가 플라스크에 첨가된다. 상기 배지는 분산제의 작용을 중단시키는 중화제를 포함한다. 예를 들어 분산제가 트립신과 같은 프로테아제인 경우 상기 배지는 혈청 단백질과 같은 단백질을 포함하고, 이는 프로테아제의 활성을 중단시킬 것이다. 특별한 예로서 세포 배양 배지를 포함하는 혈청 3 ml가 플라스크에 첨가되어 총 4 ml를 생성한다. 상기 세포는 세포를 제거 또는 분산시키기 위해 피펫으로 옮겨진다.
재분주 단계에서 상기 세포는 신선한 배양 용기 및 첨가된 신선한 배지 내로 재분주된다. 많은 재분주는 상이한 분열 비율로 이루어진다. 예를 들어 상기 세포는 1/15 희석 및 1/5 희석으로 재분주된다. 특정 예로서 상기 세포는 25 ㎠ 플라스크 내에 1방울의 세포를 첨가하고 또다른 곳으로 3방울을 첨가함으로써 재분주되어 배야을 재분주한 후 7∼8 ml 배지가 각각에 첨가되어 예를 들어 75 ㎠ 플라스크로부터 각각 1/15 희석 및 1/5 희석을 제공하게 된다. 분취 단계에서 상기 세포는 새로운 접시 또는 바람직한 분배 비율로 분취되고, 배지가 첨가된다.
특정 실시태양에서 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 먼저 인간 ES 세포는 비-부착성 방식으로 성장 현탁되어 배아체(EB)를 형성한다. 이후 5∼10일령 EB는 젤라틴 코팅된 조직 배양 플레이트 상에 부착 세포로서 평판배양하기 전 트립신화된다.
세포 배양액으로서 유지
상기 분해된 세포는 평판배양되고 세포 배양액으로 유지된다.
상기 세포는 배양 용기 또는 젤라틴화 플레이트와 같은 기질 상에 평판배양된다. 결정적으로 상기 세포는 공동-배양의 존재 없이 예를 들어 영양 세포의 부재 하에 성장되고 증식된다.
세포 배양액 내 상기 세포는 예를 들어 5 ng/ml의 에섬유아세포 성장 인자 2(FGF2) 및 선택적으로 혈소판-유래 성장 인자 AB(PDGF AB)와 같은 하나 이상의 성장 인자에 의해 보충된 무혈청 배지 내에서 성장된다. 세포 배양액 내 상기 세포는 트립신 처리, 세척 및 재평판배양에 의해 융합시 1:4로 분열되거나 계대배양된다.
공동-배양의 부재
상기 세포는 공동-배양의 부재 하에 배양된다. 용어 "공동-배양"은 예를 들어 기질 영양 세포와 같은 함께 성장하는 2 이상의 상이한 종류의 세포의 혼합물을 나타낸다.
따라서 전형적인 ES 세포 배양시 배양 접시의 내부 표면은 일반적으로 처리되어 분할되지 않을 마우스 배아 피부 세포의 영양층으로 코팅된다. 상기 영양층은 ES 세포가 부착되고 성장할 수 있는 부착 표면을 제공한다. 더욱이 상기 영양 세포는 ES 세포 성장에 필요한 배양 배지 내로 영양소를 방출시킨다. 본원에 기재된 방법 및 조성물에서 ES 및 MSC 세포는 이러한 공동-배양의 부재 하에 배양된다.
상기 세포는 단층으로서 또는 영양 세포의 부재 하에 배양된다. 상기 배아줄기세포는 영양 세포의 부재 하에 배양되어 중간엽 줄기세포(MSC)를 수립하게 된다.
해리 또는 분해된 배아줄기세포는 배양 기질 상에 직접 평편배양된다. 상기 배양 기질은 페트리 접시와 같은 조직 배양 용기를 포함한다. 상기 용기는 전-처리된다. 상기 세포는 젤라틴화된 조직 배양 플레이트 상에 평편배양되고, 성장된다.
접시의 젤라틴 코팅에 관한 프로토콜의 예는 하기를 따른다. 증류수 내 0.1% 젤라틴의 용액이 제조되고, 가압증기멸균된다. 이는 실온에서 보관된다. 조직 배양 접시의 바닥은 젤라틴 용액으로 도포되고 5∼15분간 인큐베이트된다. 젤라틴이 제거되고 플레이트는 사용을 위해 준비된다. 배지는 저장성 세포용해를 방지하기 위한 세포를 첨가하기 전에 첨가된다.
무혈청 배지
해리 또는 분해된 배아줄기세포는 무혈청 배지를 포함한 배지 내에서 배양된다.
용어 "무혈청 배지"는 예를 들어 우태아 혈청과 같은 혈청 단백질이 부재한 세포 배양 배지를 포함한다. 무혈청 배지는 당분야에 잘 알려져 있고, 예를 들어 미국 특허 제5,631,159호 및 제5,661,034호에 기재되어 있다. 무혈청 배지는 예를 들어 Gibco-BRL(Invitrogen)과 같이 상업적으로 이용 가능하다.
무혈청 배지는 단백질이 부재하고, 즉 단백질, 가수분해물 및 알려지지 않은 조성물의 성분이 결여되어 있다. 상기 무혈청-배지는 모든 성분이 알려진 화학 구조를 지닌 화학적으로-한정된 배지를 포함한다. 화학적으로 한정된 무혈청 배지는 개선된 재현성 및 더욱 일관된 성능을 가능하게 하는 변이성을 제거하고, 우발성 작용제에 의한 오염 가능성을 감소시킨 완전하게 한정된 시스템을 제공하기 때문에 유리하다.
상기 무혈청 배지는 Knockout DMEM 배지(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)를 포함한다.
상기 무혈청 배지는 예를 들어 5%, 10%, 15%, 등의 농도에서 혈청 대체 배지와 같은 하나 이상의 성분으로 보충된다. 상기 무혈청 배지는 Invitrogen- Gibco(Grand Island, New York)의 10% 혈청 대체 배지를 포함하거나 이로 보충된다.
성장 인자
해리 또는 분해된 배아줄기세가 배양된 무혈청 배지는 하나 이상의 성장 인자를 포함한다. PDGF, EGF, TGF-a, FGF, NGF, 에리트로포이에틴, TGF-b, IGF-I 및 IGF-Ⅱ를 포함하는 많은 성장 인자는 당분야에 알려져 있다.
상기 성장 인자는 섬유아세포 성장 인자 2(FGF2)를 포함한다. 또한 상기 배지는 혈소판-유래 성장 인자 AB(PDGF AB)와 같은 또다른 성장 인자를 포함한다. 이들 성장 인자 모두는 당분야에 알려져 있다. 상기 방법은 FGF2 및 PDGF AB 모두를 포함하는 배지 내에서 세포를 배양하는 것을 포함한다.
또한 또는 이외에 상기 배지는 표피 성장 인자(EGF)를 포함하거나 더욱 포함한다. EGF의 사용은 MSC의 성장을 증진시킨다. EGF는 예를 들어 5∼10 ng/ml와 같은 어떠한 적절한 농도로도 사용된다. EGF는 PDGF 대신에 사용된다. EGF는 당분야에 잘 알려진 단백질이고, 심볼 EGF, Alt. Symbols URG, Entrez 1950, HUGO 3229, OMIM 131530, RefSeq NM_01963, UniProt P01133에 나타나 있다.
따라서 본 발명자들은 (i) FGF2, (ⅱ) FGF2와 PDGF 및 (ⅲ) FGF2와 EGF 및 또다른 조합을 포함하는 배지의 사용을 개시한다.
FGF2는 많은 조직 및 세포 타입에서 낮은 농도로 발현되고 뇌 및 뇌하수체에서 높은 농도에 도달하는 광범위한 분열촉진성, 혈관형성 및 향신경성 인자이다. FGF2는 사지 발달, 혈관형성, 상처 치유 및 종양 성장을 포함하는 수많은 생리적 및 병리학적 과정에 관련된다. FGF2는 예를 들어 Invitrogen- Gibco(Grand Island, New York)와 같이 상업적으로 수득된다.
혈소판 유래 성장 인자(PDGF)는 섬유아세포, 평활근 및 결합 조직을 포함하는 광범한 세포 타입에 대한 강력한 분열촉진물이다. A 사슬 및 B 사슬이라고 명명된 2개 사슬의 이합체로 구성된 PDGF는 AA 또는 BB 동종이합체로서 또는 AB 이종이합체로서 존재한다. 인간 PDGF-AB는 13.3 kDa A 사슬 및 12.2 B 사슬로 구성된 25.5 kDa 동종이합체 단백질이다. PDGF AB는 예를 들면 Peprotech (Rocky Hill, New Jersey)와 같이 상업적으로 수득된다.
FGF2 및 선택적으로는 PDGF AB와 같은 성장 인자는 약 500 ng/ml와 같이, 약 l ng/ml와 같이, 약 2 ng/ml와 같이, 약 3 ng/ml와 같이, 약 4 ng/ml와 같이 약 5 ng/ml와 같이 약 100 pg/ml의 농도로 배지 내에 존재한다. 일부 실시태양에서 상기 배지는 약 5 ng/ml의 FGF2를 포함한다. 또한 상기 배지는 약 5 ng/ml와 같은 PDGF AB를 포함한다.
세포 분할
접촉 저해가 세포 분열 및 성장의 중지를 유발하는 경우 배양액 내 세포는 일반적으로 융합할 때까지 성장을 지속할 것이다. 이후 이러한 세포는 기질 또는 플라스크로부터 해리되고, 조직 배양 배지 내로 희석 및 재평편배양에 의해 "분할", 계대배양 또는 계대접종된다.
본원에 기재된 방법 및 조성물은 배양 동안 계대접종 또는 분할을 포함한다. 세포 배양액 내 상기 세포는 1:3, 1:4, 1:5 그 이상과 같이 1:2 이상의 비율로 분할된다. 용어 "계대접종"은 세포주 융합성 배양의 분취, 신선한 배지로의 접종 및 융합 또는 포화가 수득될 때가지 상기 라인의 배양으로 구성된 과정을 나타낸다.
선택, 선별 또는 분류 단계
상기 방법은 중간엽 줄기세포를 더욱 분리하거나 선택하기 위해 선택 또는 분류 단계를 더욱 포함한다.
상기 선택 또는 분류 단계는 하나 이상의 표면 항원 마커 수단에 의해 세포 배양액에서 중간엽 줄기세포(MSC)를 선택하는 것을 포함한다. 선택 또는 분류 단계의 이용은 MSC에 관한 분류 엄격성 및 선택 특이성을 더욱 증진시키고, 더욱이 시작 물질 유래의 hESCs 및 또다른 hESC-유도체와 같은 배아줄기세포로부터의 가능한 오염을 잠재적으로 감소시킨다. 또한 이는 기형종 형성의 위험성을 더욱 감소시키고 본 발명자들이 기재한 프로토콜의 임상적 관련성을 더욱 증가시킨다.
항원 발현을 기반으로 한 선택 또는 분류에 관한 많은 방법이 알려져 있고, 이들 방법 중 어떠한 것도 본원에 기재된 선택 또는 분류 단계에 사용된다. 상기 선택 또는 분류는 형광 활성 세포 분류(FACS) 방법에 의해 달성된다. 따라서 당분야에 알려진 바와 같이 FACS는 세포에 의해 발현된 항원에 결합되고 이를 표지하는 표지된 항체와 같은 리포터에 세포를 노출하는 것을 포함한다. 리포터를 형성하는 항체의 생성 및 그의 표지 방법은 당분야에 공지되어 있고, 예를 들어 Harlow and Lane에 기재되어 있다. 이후 세포는 표지를 기반으로 세포를 서로 분류하는 FACS 기계를 통과하게 된다. 또한 또는 이외에 자성 세포 분리(MACS)가 세포를 분류하기 위해 사용된다.
본 발명자들은 많은 후보 표면 항원이 MSC 예를 들어 CD105, CD73, ANPEP, ITGA4(CD49d), PDGFR과 결합하는 것으로 알려진 반면 일부 MSC 결합 표면 항원 예를 들어 CD29 및 CD49e는 hESCs와 같은 ES 세포에서 높게 발현되고, 그의 발현이 FACS 분석에 의해 검증됨을 인식하였다. 표면 항원과 MSC와의 결합은 hESC와 같은 ES 세포 유래의 MSC를 분리하기 위한 선별용 마커로서 항원을 한정하는데 충분하지 않다. 따라서 상기 선택 또는 분류 단계는 MSC와 ES 세포 사이에서 차별적으로 발현되는 항원을 이용한다.
본 방법의 선택 또는 분류 단계는 항원 발현을 기반으로 중간엽 줄기세포를 양성적으로 선택한다. 이러한 항원은 예를 들어 hESC 및 hESCMSC의 유전자 발현 프로파일을 비교함으로서 확인된다. 특정 실시태양에서 선택 또는 분류는 특히 하기 표 ElA 및 ElB에 나타난 항원을 사용한다.
본 방법의 선택 또는 분류 단계는 MSC 상에서 발현되나 hESC와 같은 ES 세포 상에서는 발현되지 않는 것으로 확인된 항원의 발현을 기반으로 중간엽 줄기세포를 양성적으로 선택한다.
CD73은 MSC 상에서 높게 발현되는 반면 hESC 상에서는 높게 발현되지 않는 다. CD73 및 CD105 모두는 MSC 내에서 높게 발현되는 표면 항원이고, hESC 대비 hESC-MSC 내에서 높게 발현되는 표면 항원 상위 20 중에 하나이고, 추정 MSC용 선별용 마커로서 CD73 또는 CD105(또는 둘 모두)의 사용은 hESC를 분화함으로서 생성된 추정 MSC에 대한 분류를 동일하게 효과적이게 할 것이다.
또한 또는 이외에 선택 또는 분류 단계는 예를 들어 hESC-MSC와 같은 중간엽 줄기세포가 아닌 hESC와 같은 배아줄기세포(ES 세포) 상에서 표면 항원으로서 높게 발현되는 표면 항원을 기반으로 항원에 대해 음성적으로 선택한다. 선택 또는 분류는 MIBP, ITGB 1BP3 및 PODXL 및 CD24와 같은 공지되거나 종전 확인된 hESC-특이적 표면 항원을 기반으로 한다.
FACS 분석은 hESC-MSC가 아닌 hESC 상에서 CD24의 발현을 확인한다. 따라서 CD24는 단독으로 음성적 선택 또는 분류 마커로서 또는 분화하는 hESC 배양액 유래의 추정 MSC를 분리하기 위한 양성적 선별용 마커로서 CD105와의 함께 사용된다.
실시예
성체 골수 유래의 중간엽 줄기세포(MSC)는 심혈관 질환을 치료하기 위한 가장 유망한 줄기세포 형태 중 하나로 판명되었다(Pittenger and Martin, 2004). 자가 MSC의 치료 효과가 심근세포, 내피세포 및 혈관 평활근 세포와 같은 많은 상이한 회복 또는 대체 세포 타입으로 분화하는 그의 가능성의 원인이나(Minguell and Erices, 2006; Zimmet and Hare, 2005) 손상 조직 내 치료적으로 관련된 많은 기능적 회복 세포 내로 이식된 분화 효율은 수립되어야 한다.
최근의 보고는 이들 회복 효과 일부는 MSC에 의해 분비되는 측분비 인자에 의해 매개됨을 나타낸다Caplan and Dennis, 2006a; Gnecchi et al., 2005; Gnecchi et al., 2006; Schafer and Northoff, 2008). 이러한 측분비 가설은 재생 약물 내 줄기세포 특히 MSC의 사용에 급진적인 상이한 차원을 도입시킨다. MSC 측분비 작용의 잠재적인 메커니즘은 내인성 재생 능력, 혈관형성 및 동맥형성, 재형성 약화 및 아폽토시스 감소를 포함한다. MSC의 치료 효과가 그의 분비물에 의해 부분적으로 매개되는 경우 줄기세포-기반 치료법의 레퍼토리는 그의 분비 인자의 응용에 의해 확장될 수 있다. 이러한 접근법은 "규격품" MSC-기반 치료 선택권을 잠재적으로 제공할 수 있고, 이는 적당한 비용 및 우수한 품질 제어 및 일관성으로 급성 MI 환자의 재관류 손상에 대한 시간-민감성 보호의 필요조건이다.
이러한 측분비 가설의 지지에 있어서, 많은 연구는 주로 심장 및 혈관 조직 성장 및 재생을 통한 손상된 심장 조직을 잠재적으로 복구할 수 있는 사이토카인, 케모카인 및 성장 인자의 존재를 확인하였다(Caplan and Dennis, 2006b; Liu and Hwang, 2005). 본 발명자들은 MSC 측분비 분비물의 최초의 면밀한 단백질체 분석을 수행함으로서 이러한 가설을 더욱 지지하였다. 이는 인간 ESC로부터 높게 확장 가능하고 동일한 MSC의 유도 및 세포를 배양하고 조절 배지(CM)를 통해 분비물을 채취하기 위한 화학적으로 한정된 배지의 이용에 의해 용이하게 되었다. 또한 많은 분비된 단백질은 세포내 단백질이고 형질막을 통해 분비되거나 운송되는 것으로 알려지지 않았다. 분비체의 컴퓨터 분석은 총괄적으로 분비체가 심근 허혈/재관류(MI/R) 손상과 같은 손상된 조직을 복구하는 가능성을 지님을 예측하였다(Sze et al., 2007).
컴퓨터 예측을 시험하기 위해 CM 형태의 분비물은 MI/R 손상의 돼지 모델에 투여되었다(Timmers et al., 2008). 관상 동맥 폐색에 의해 유발된 심근 허혈 동안 재관류 치료법은 현재 가장 효과적인 치료 양식이다. 그러나 혈류 또는 재관류를 복구하기 위한 폐색된 동맥의 개방을 포함하는 재관류도 새로이 관류된 허혈성 조직에 손상을 유도한다(Saraste et al., 1997). 따라서 재관류 치료법의 유효성은 재관류 손상이 재관류 시점에 즉시 무효화되는 경우 크게 개선될 수 있다. CM이 재관류 직후 MI/R 손상 돼지 모델에 관상동맥 내로 전달되면 재관류 4시간 후 심근 경색의 60% 감소, 심장 기능 보호 및 감소된 산화 스트레스가 존재하였다. 이는 MSC의 측분비 분비물이 임상적으로 관련된 동물 모델 내 MI/R 손상을 개선시킬 수 있음을 확인시켰다(Timmers et al., 2008).
그러나 분비물이 MI/R 손상 상의 즉각적인 효과를 매개하는 메커니즘은 명백하지 않다. 이러한 보호 효과의 즉시성은 메커니즘의 일부로서 매우 오랜 조직 재생 과정을 방지한다. 또한 많은 분비 단백질은 세포내 단백질이고 형질막을 용이하게 횡단하는 것으로 알려져 있지 않다. MSC의 측분비 효과를 더욱 잘 이해하기 위해 본 발명자들은 활성 분획의 조성을 확인하고 윤곽화하기 위해 상이한 분자량 차단(MWCO)을 지닌 멤브레인을 이용하여 CM을 체계적으로 분획화하였다. 본 발명자들은 종전 1000 kDa MWCO가 아닌 0.2 μM 멤브레인을 통과하는 CM이 심장보호성임을 나타내었다(Timmers et al., 2008). 그러나 1000 kDa MWCO을 지닌 멤브레인에 대해 부분적으로 농축된 CM은 심장보호성이었다. 이는 심장보호 효과가 50∼100 nm 직경의 거대 복합체에 의해 매개됨을 나타내었다.
본원에서 본 발명자들은 분비물 내 종전 보고된 단백질 목록을 >700 단백질까지 확장하였고 이는 엑소솜에서 일반적으로 발견되는 많은 단백질을 포함한다. 또한 본 발명자들은 분비물 내 RNA(<300 nts)의 존재를 확인하였다. 더욱이 단백질 및 RNA는 인지질 소포 내에 피막화되었고 1∼1000 nm의 유체역학 반경(rh) 범위 내의 분비물 내 검출 가능한 입자는 rh = 45∼55 nm이었다. 이들 입자는 HPLC 분류시 단일 피크로서 용출되었다. 동시에 이들 연구는 분비물 내 거대 심장보호 복합체가 엑소솜의 많은 차별적 특징을 지님을 입증하고, 이는 분비물 내 활성적인 심장보호 성분이 엑소솜이라는 본 발명자들의 가설을 유도하였다.
실시예 1. 재료 및 방법: MSC-CM 제조
MSC 생성 및 CM 제조를 위한 프로토콜은 종전 기재되었다.
간단하게는 화학적으로 한정된 무혈청 배양 배지는 임상적으로 순응하는 프로토콜을 이용하여 인간 배아줄기세포(hESC)에서 유래한 MSC에 의해 조절된다. 다능성-관련 마커를 발현하지 않으나 MSC-유사 표면 항원 (CD29+, CD44+, CD49a+/e+, CDl05+, CDl 66+, CD34-, CD45-) 및 유전자 발현 프로파일을 표시하지 않는 3개의 폴리클론의 핵형적으로 안정하고 표현형적으로 MSC-유사한 배양액은 무영양세포 및 무혈청 선택 배지 내에서 HuES9 hESC 라인 또는 H1 hESC 라인 유래의 hESC의 트립신화 및 증식에 의해 생성된다.
이들 배양액 중 하나인 HuES0.E1은 80개 이상의 집단 배가로 안정하게 확장될 수 있다. MSC 분비물을 채취하기 위해 hESC-유래 MSC 배양액은 MSC 분비물을 함유한 배지가 수집되기 전 3일간 배지를 조절하기 위해 화학적으로 한정된 무혈청 배양 배지로 이동되고, 원심분리에 의해 정화되고, 10 kDa MW 차단 초미세여과 멤브레인을 이용하여 25배 농축되고 220 nm 필터를 통한 여과에 의해 멸균되었다.
분비 단백질체는 다원 단백질 확인 기술(MuDPIT) 및 사이토카인 항체 어레이 분석에 의해 분석되고, 201개 특정 유전자 산물의 존재가 판명되었다. 컴퓨터 분석은 이러한 CM이 잠재적인 심장보호 특성을 보유함을 개시하였다.
실시예 2. 재료 및 방법: 동물
모든 실험은 Institute of Laboratory Animal Resources에 의해 작성된 "Guide for the Care and Use of Laboratory Pigs" 및 네덜란드 위트레흐트대학교의학학부의 Animal Experimentation Committee에 의한 승인에 따라 수행된다.
실시예 3. 재료 및 방법: 연구 디자인
모두는 클로파도그렐 75 mg/일로 3일간, 아미오다론 400 mg/일로 10일간 전처리된 30마리 수컷 Dalland Landrace 돼지(60-70 kg; IDDLO, Lelystad, 네덜란드)는 MSC-CM, 비-CM 또는 식염수 처리로 무작위로 할당된다.
식염수 그룹은 신선한 비-조절 배양 배지의 잠재 효과를 평가하기 위해 첨가된다. 모든 돼지에서 MI는 75분의 기부 좌회선 관상 동맥(LCxCA) 결찰 및 4시간의 후속 재관류에 의해 유도된다. 완전한 경피 심근 경색을 유도하지 않고 중증 심근 손상을 가하기 위해 75분의 허혈 기간이 선택된다. TTC 염색을 이용한 경색 크기 측정이 3시간의 재관류 후 가장 확실하기 때문에 4시간 재관류 기간이 이용된다. 더 긴 재관류 기간 후 산화 스트레스 및 아폽토시스 메커니즘을 평가하는 것이 더욱 어려워진다.
처리는 MSC-CM, 비-CM 또는 식염수의 정맥내 주입(1.0 ml, 2.0 mg 단백질)에 의한 재관류 착수 5분 전에 개시된다. 재관류 직후 추가적인 관상동맥내 덩어리 MSC-CM(4.0 ml, 8.0 mg 단백질), 비-CM 또는 식염수가 제공된다. 심근 경색 크기 및 기능은 재관류 4시간 후 평가된다.
실시예 4. 재료 및 방법: MI 및 실시 절차
전체 실시 동안 EGG, 전신 동맥압 및 호기말이산화탄소측정도가 지속적으로 모니터된다. 종전 기재된 일반적인 마취 하에 정중 흉골절개가 수행되고 2개의 도입 시트가 6 Fr 유도 카테터 및 8 Fr 전도 카테터(CD Leycom, Zoetermeer, the Netherlands)에 대해 경동맥 내로 삽입된다.
Swan Ganz 카테터의 말단 끝이 내부 경정맥을 통해 폐동맥 내에 위치한다. 심장 출력 및 관상동맥 유동을 측정하기 위해 음향통과 유동 프로브(Transonic Systems Inc, Ithaca, NY)가 기부 대동맥 및 LCxCA 주변이 위치하고, PV 루프를 위한 다양한 부하 조건 하에 기능적 측정을 가능하게 하기 위해 전선은 하부 대정맥 주변이 위치한다.
기능 측정 후 10.000 IU의 헤파린이 정맥내로 투여되고 봉합선이 죄여 기부 LCxCA가 폐색된다. 심실 세동이 발생하면 50 J로의 내부 세동제거가 이용된다. 75분의 허혈 후 LCxCA는 봉합선의 해제에 의해 재개방된다. 재관류 직후 니트로글리세린(무-재유동을 방지하기 위한 0.1 mg)이 유도 카테터를 통해 LCxCA로 주입된 후 MSC-CM, 비-CM 또는 식염수로 관상동맥내 처리된다. 재관류 4시간 후 최종 기능 측정이 수행되고 심장은 경색 크기 분석을 위해 체외외식된다.
실시예 5. 재료 및 방법: 기능 측정
좌심실(LV) 압력 및 부피는 종전 기재된 바와 같이 전도 카테터 방법을 이용하여 측정된다. 전도 카테터에서 유래한 LV 압력 및 부피 신호가 표시되고 Leycom CFL-512(CD Leycom)로 250-Hz 표본추출 속도로 획득된다.
자료는 항정 상태 동안 및 일시적 대정맥 폐색 동안 획득되고, 호흡기를 지닌 모두는 최종 호기에 꺼졌다. 압력-부피 루프 분석은 종전 기재된 바와 같이 주문제작 소프트웨어로 수행된다. 더욱이 유두중간 근육 수준에서 단축(short-axis) 심외막 초음파 영상(Prosound SSD-5000, 5-MHz probe UST-5280-5, Aloka Holding Europe AG, Zug, Switzerland)이 수득된다. 경색 영역, 먼 영역(중격) 및 LV 내부 영역(LVia)의 벽 두께(WT)가 확장기말(ED) 및 수축기말(ES)에서 측정된다. 수축기 벽 비후(SWT)는 [(WT(ES)-WT(ED))/WT(ED)]*100%로, 분획 영역 단축(FAS)은 [(LVia(ES)-LVia(ED))/LVia(ED)]*100%로, 좌심실 박출 분획(LVEF)은 [(EDV-ES V)/EDV] * 100%로 계산된다.
확장기말 챔버 경직도는 확장기말 압력-부피 관계의 선형 회귀 방법으로 정량된다. 심장초음파검사 및 PV 루프는 MI 전, 허혈 1시간 후 및 재관류 4시간 후에 측정된다. 기절 심근을 설명하기 위해 추가적인 측정이 정맥내 도부타민 주입(2.5 ㎍/kg/분 및 5.0 ㎍/kg/분)에 의한 약제학적으로 유도된 스트레스 동안 수행된다.
실시예 6. 재료 및 방법: 경색 크기
심장 절제 직전에 LCxCA(돼지) 또는 LCA(마우스)는 MI의 유도 동안 동일한 지점에서 정확하게 재결찰된다. Evans blue 염료가 관상동맥 시스템을 통해 주입되어 위험 영역(AAR)을 윤곽화한다.
이후 심장은 절제되고, LV가 분리되고 정점에서 기부까지 5개 절편으로 절단된다. 절편은 15분간 37℃ Sorensen 완충액(13.6 g/L KH2PO4 + 17.8 g/L Na2HPO4·2H2O, pH 7.4) 내의 1% 염화트리페닐테트라졸륨(TTC, Sigma-Aldrich Chemicals, Zwijndrecht, the Netherlands) 내에서 인큐베이트되어 경색 조직을 생존 가능 심근과 구별하게 한다.
모든 절편은 양면 및 각각의 슬라이드 내에서 스캔되고, 경색 영역은 디지털 면적측정 소프트웨어(Image J)를 이용하여 위험 영역 및 전체 영역과 비교된다. 절편 중량에 대한 보정 후 경색 크기는 AAR 및 LV의 비율로 계산된다.
실시예 7. 재료 및 방법: 산화 유도 세포 사멸 분석
인간 백혈병 CEM 세포는 CM 또는 비-CM 내에서 인큐베이트되고, 50 μM H2O2로 처리되어 산화 스트레스가 유도된다. 세포 생존능은 H2O2 처리 12, 24, 36 및 48시간 후 트리판 블루 배제를 이용하여 평가된다.
실시예 8. 재료 및 방법: 면역염색
허혈 및 재관류 영역 내 세포핵 산화 스트레스는 DNA에 대한 산화 스트레스 산물인 8-하이드록시-2'-데옥시구아노신(8-OHdG)의 면역염색에 의해 평가된다. 조직 표본은 파라핀 내에 포매 전 4% 포르말린 내에서 고정된다.
10 mM 구연산 내 항원 회복 후 조직 절편은 밤새 4℃에서 30분간 0.1% PBSA 내의 10% 정상 말 혈청 마우스-항-8-OHdG(OXIS international, Foster City, CA, USA) 1:20으로, 1시간 동안 비오틴 표지 말-항-마우스(Vector laboratories, Burlingame, CA, USA) 1 :500으로, 1시간 동안 스트렙트아비딘-HRPO 1:1000으로 인큐베이트된다.
최종적으로 절편은 H2O2-디아미노벤지딘과 10분간 인큐베이트된다. 8-OHdG 양성 세포핵의 양은 200x 배율에서 디지털 영상 현미경 소프트웨어 분석(Olympus, Munster, Germany)으로 절편 당 4개의 무작위 채취된 필드 내에서 정량된다.
실시예 9. 재료 및 방법: 웨스턴 블럿팅
단백질은 제조사의 프로토콜에 따라 1 ml Tripure 분리 시약(Boehringer, Mannheim, Germany)을 이용하여 돼지의 허혈/재관류 영역에서 채취된 동결 조직 표본에서 분리된다. 웨스턴 블럿팅을 위해 8 ㎍ 전체 단백질이 10% SDS-PAGE 겔 상에서 분리되고, 니트로셀루롤스 C 멤브레인(Amersham, Buckinghamshire, UK) 상에 이동되고 인산염 완충 식염수(PBS)-0.1% Tween-5% Protifar(Nutricia, Netherlands)를 이용하여 차단된다.
멤브레인은 인SMAD2 1:1000(Cell Signalling Technology), 활성 카스파제 3 1:100(Chemicon, Germany) 또는 베타-튜불린 1:5000(Abeam, Cambridge, UK)에 대해 토끼 항체와 인큐베이트된 후 염소-항-토끼 HRP 1:2000(DAKO, Glostrup, Denmark)와 인큐베이트된다. 화학발광 기질(NENk Life Science Products)이 검출을 위해 사용된다; 밴드는 Gel Doc 1000 시스템(Biorad, Veenendaal, Netherlands)을 이용하여 분석된다.
실시예 10. 재료 및 방법: MSC-CM 분획화
MSC-CM은 220 nm 필터를 통한 멸균 여과에 의해 준비되고 10 nm 필터를 통해 농축되고, 따라서 10∼220 nm의 성분을 함유한다. 이후 <1000 kDa 분획은 100 nm 일반 세공 크기를 지닌 1000 kDa MW 차단 멤브레인(Pall Corporation, Singapore),을 통해 MSC-CM을 여과하고 10∼100 nm의 생성물을 함유한 분획을 생성함으로서 준비된다.
심장보호를 부여하는 배지 내 인자(들)(10∼100 nm 또는 100∼220 nm)를 함유한 분획을 확인하기 위해 허혈 및 재관류 손상 마우스 또는 돼지 모델이 이용된다. MI는 30분 좌측 관상 동맥(LCA) 폐색 후 재관류에 의해 유도된다. 마우스는 재관류 전 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 20 ㎕ 비분획화 MSC-CM(10∼220 nm), < 1000 kDa 분획(10∼100 nm) 또는 식염수로 5분간 처리된다. 경색 크기는 종전 기재된 바와 같이 24시간 후 Evans blue 및 TTC를 이용하여 평가된다.
실시예 11. 재료 및 방법: 데이터 분석
데이터는 평균 ± SEM으로 표기된다. 수치는 무계획적 방식으로 수집되고 SPSS 1 1.5 내 post hoc bonferroni test로 일원 ANOVA를 이용하여 비교된다. P-수치 < 0.05는 유의적인 것으로 간주된다.
실시예 12. 결과: 사망률
4마리 돼지가 처리 전 허혈 동안 불응성 심실 세동으로 인해 사멸하였고, 따라서 조사에서 배제된다. CM(n=9), 비-CM(n=9) 또는 식염수(n=8)로처리된 모든 돼지는 추적 조사 기간 동안 생존하였다.
실시예 13. 결과: 경색 크기
위험 영역(AAR)뿐만 아니라 LV와 비교시 경색 크기는 비-CM 및 식염수 처리된 것과 비교시 MSC-CM 처리된 돼지에서 현저하게 감소된다(도 1). MSC-CM 처리는 약 60% 경색 크기 감소를 유발하였다. 중요하게는 AAR은 모든 돼지에서 유사하고, 이는 최초 허혈 손상이 모든 돼지에서 유사함을 나타낸다(하기 표 E1).
표 E1. 혈류역학 및 기능 파라미터. 심장초음파검사 및 전도 카테터 기반 LV 압력 및 부피 측정으로 측정된 비-CM, CM 또는 식염수 처리된 기준선 수치 및 심근 경색 수치. AAR, 위험영역; IS, 경색 크기; LV, 좌심실; HR, 심박수, QLCx, 좌회선 관상 동맥 유동; CO, 심박출량; WT, 벽 두께; SWT, 수축기벽 비후; FAS, 분획 영역 단축; EDV, 확장기말 부피; ESV, 수축기말 부피; SV, 일회박출량; EF, 박출률; Ees, 수축기말 탄력을 나타냄. 비-CM, n=9; 식염수, n=8. * p<0.05 대비 기준선;
Figure pct00021
p<0.05 대비 비-CM; p<0.05 대비 식염수.
Figure pct00023
Figure pct00024
실시예 14. 결과: 심장 기능
기준선 파라미터는 모든 그룹에서 유사하다(상기 표 E1). 수측기 벽 농밀화(SWT, 도 2A)의 음성적 수치에 의해 관찰된 바와 같이 허혈 동안 심장초음파검사 후측벽은 모든 그룹에서 완전하게 운동 이상이 되었다. 재관류 4시간 후 비-CM 및 식염수 대조군 모두의 재관류된 후측벽은 여전히 운동 이상이다. 그러나 MSC-CM 처리된 돼지의 경우 SWT는 부분적으로 회복되었다(도 2A).
β1-아드레날린 수용체 작용제 도부타민의 정맥내 주입은 MSC-CM 처리 돼지에서 수축기벽 비후를 더욱 증가시킨 반면 대조군에서는 어떠한 개선도 나타나지 않는다. 또한 전체 좌심실 수축 기능은 허혈로 인해 감소되었다(도 2B). CM으로 처리된 돼지의 경우 분획 영역 단축은 재관류 후 증가되었고, 기준선 수치로 거의 복귀되었고, 도부타민 주입 동안 상기 기준선 수치를 증가시켰다.
대조군 돼지의 경우 전체 수축 기능은 손상 유지되었다. 개선된 심장 기능도 PV-루프 유래 지표로부터 명백하게 되었다(표 E1). 좌심실 EF 및 일회 박출량은 CM 처리 돼지에서 유의적으로 높다. 이는 심장박출량, 평균 동맥압 및 심박수와 같은 개선된 혈류역학 파라미터로 해석되었다.
증가된 확장기말 심근 경직도에 의해 관찰된 바와 같이 확장 기능은 허혈 및 재관류 손상 후 대조군에서 감소되었다. 그러나 CM 처리 돼지의 경우 확장 기능은 손상되지 않는다.
실시예 15. 결과: 산화 스트레스
경색 크기의 감소 및 기능 개선을 입증 후 본 발명자들은 허혈 재관류 손상의 주요 원인인 산화 스트레스 상의 CM 및 비-CM 효과를 측정하기 위해 과산화수소(H2O2)-유도 세포 사멸의 시험관 내 분석을 이용하였다.
본 발명자들은 CM 또는 비-CM의 존재 하에 인간 백혈병 CEM 내에서 과산화수소(H2O2)-매개 산화 스트레스를 유도하고 트립판 블루-배제에 의해 세포 생존능을 모니터하였다. 그 결과는 비-CM과 비교시 CM이 세포 생존능의 (H2O2)-유도 소실을 유의적으로 보호함을 나타내었다(p<0.05)(도 3A).
CM이 CM-처리 돼지의 심장 내 산화 스트레스도 감소시키는 여부를 측정하기 위해 CM, 비-CM 또는 식염수 처리 돼지의 조직 절편 내 세포핵 산화 스트레스가 산화 DNA에 대한 8-OHdG 면역염새겡 의해 정량된다. DNA 산화를 표시하는 강한 세포핵 염색은 CM-처리 돼지와 비교시 비-CM 또는 식염수-처리 돼지의 절편에서 관찰된다(도 3B-D). 더욱이 비-CM 또는 식염수-처리 돼지 내에 유의적으로 더욱 양성적인 세포핵이 존재한다(도 3E).
따라서 CM은 시험관 내 및 생체 내 산화 스트레스에 대한 심장보호를 부여할 수 있다.
실시예 16. 결과: TGF-β 신호전달
많은 단백질을 함유한 MSC의 분비물은 TGF-β 신호전달에 관련된다. 생체 내 TGF-β 신호전달 상의 CM 처리의 영향을 평가하기 위해 본 발명자들은 웨스턴 블럿팅에 의해 CM 처리 돼지 및 대조군 돼지의 심근 조직 표본 내 인산화 SMAD-2를 정량하였다. CM 처리는 감소된 pSMAD2 발현을 유발하였고, 이는 ALK-5를 통한 TGF-β 신호전달이 감소됨을 나타낸다(도 4A, B).
실시예 17. 결과: 아폽토시스
재관류 손상은 괴사보다는 아폽토시스를 통해 세포 사멸을 유발한다. CM 처리가 재관류 동안 아폽토시스를 감소시키는지 여부를 검증하기 위해 본 발명자들은 웨스턴 블럿팅에 의해 아폽토시스의 주요 매개자인 활성 카스파제 3의 수치를 정량하였다. MSC-CM으로 처리된 돼지의 경우 활성 카스파제-3 수치는 비-CM 대조군 및 식염수 대조군과 비교시 더 낮았고, 이는 CM이 생체 내 아폽토시스를 저해함을 나타낸다(도 4C, D).
실시예 18. MSC-CM 분획화
비분획화 MSC-CM은 10∼220 nm의 생성물을 함유한다. MSC-CM 내 심장보호 인자(들)를 확인하기 10∼100 nm 크기 범위의 생성물을 함유한 <1000 kDa 분획이 생성되었다. 비분획화 MSC-CM은 심장보호를 부여한 반면 <1000 kDa 분획은 그렇지 않았고(도 5), 이는 심장보호 인자(들)가 100∼220 nm 범위 크기를 지닌 >1000 kDa 분획 내에 존재함을 나타낸다.
실시예 19. 결과: 크기 분획화는 분자량에 따라 분비된 단백질을 분리하지 않았음
조절 배지 내 활성 성분을 확인하기 위해 본 발명자들은 상이한 MW 차단을 지닌 멤브레인을 통해 조절 배지를 여과함으로서 조절 배지를 별개의 MW 분획으로 분획화하고자 하였다.
조절 배지가 4:1의 잔류물 대비 여과물 부피 비율을 생성하도록 100 kDa의 MW 차단의 멤브레인을 통해 여과되는 경우 대부분의 <100 kDa 단백질은 예측된 <100 kDa 분획이 아닌 >100 kDa 분획 내로 분리되었다(도 6). 비분획화 조절 배지 및 >100 kDa 분획 모두의 개별적 단백질 밴드 비율은 유사하다.
또한 MW <300 kDa를 지닌 대부분의 단백질은 300 kDa의 MW 차단을 지닌 멤브레인을 통해 여과되지 않았다(도 6). 여과물 내 주요 단백질 밴드 일부의 MW 크기는 비-조절 배지(NCM), 배양 배지 내 외부 추가된 단백질 보충물과 유사하다: 인슐린-트랜스페린 보충물(ITS), FGF2, EGF 및 PDGF AB(도 7).
이들 관찰은 세포에 의해 분비된 단백질이 복합체 내에 존재하고, 이들 분비물 복합체는 보충물로서 배양 배지에 외부 추가되고 100 kDa의 MW 차단을 지닌 멤브레인을 통해 용이하게 여과된 100 kD 이하인 100 kDa 단백질보다 더 크다.
실시예 20. MW>1,000 kDa 또는 50∼150 nm의 직경을 지닌 크기-분획화 조절 배지 내 생물학적 활성
추정 분비물 복합체의 상위 및 하위 크기 한계를 측정하기 위해 본 발명자들은 조절 배지의 크기 분획화를 수행하였고 허혈 재관류 손상의 마우스 내 생물학적 활성을 시험하였다. 조절 배지는 0.2 μM 필터를 통해 여과되고 10 kDa의 MW 차단을 지닌 멤브레인에 대해 농축되기 때문에 이는 2∼200 nm 크기 범위의 추정 분비물 복합체를 효과적으로 배치하였다(도 8).
이러한 크기 범위를 더욱 국한하기 위해 본 발명자들은 100 kDa 또는 1000 kDa의 MW 차단을 지닌 멤브레인을 통해 완전하게 조절 배지를 여과시킨 여과물, 1000 kDa의 MW 차단을 지닌 멤브레인을 통해 조절 배지를 여과시킨 잔류물 내 생물학적 활성이 존재하는지 여부를 측정하였다. 잔류물의 부피는 입력 부피의 1/5이다. 분획은 심근 허혈(MI) 및 재관류 손상의 마우스 또는 돼지 모델 상에서 시험된다.
이러한 모델에서 MI는 봉합선 결찰에 의해 30분 좌측 관상 동맥(LCA) 폐색에 의해 유도되고 재관류는 봉합선 제거에 의해 시작된다. 마우스는 재관류 5분전 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 20 ㎕ 비분획화 MSC-CM(10∼220 nm), 20 ㎕의 <100 또는 1,000 kDa 분획, 4 ㎕의 >1000 kDa 잔류물 또는 식염수로 처리된다. 24시간 후 심장이 절제된다. 절제 전 위험 영역(AAR)은 LCA를 재결찰한 후 동맥을 통해 Evans blue를 관류함으로서 측정된다. AAR은 염료에 의해 염색되지 않은 영역으로 정의되고 좌심실벽 영역 비율로 표기된다. 경색 크기는 종전 기재된 바와 같이 Evans blue 및 TTC를 이용하여 24시간 후 평가된다.
모든 동물 내 상대 AAR은 유의적으로 상이하지 않다(도 9). 그러나 상대 경색 크기는 식염수와 비교시 조절 배지 및 >1000 kDa 분획으로 처리된 동물에서 유의적으로 감소된다(각각 p=0.01 및 0.05). <100 및 <1000 kDa 분획은 생물학적으로 활성적이지 않고, 이는 추정 활성 복합체가 >1000 kDa임을 나타낸다. 그러나 복합체가 <1000 kDa이고 필터를 통해 조절 배지를 통과시키는 것이 복합체를 불활성화시킨다는 것도 여전히 가능하다.
실시예 21. 결과: 조절 배지의 전자 현미경 검사는 50 내지 200 nm 입자의 존재를 나타내었음
조절 배지의 전자 현미경 분석은 표준 방법을 이용하여 수행된다. 간단하게는 PBS 내 조절 배지는 formward 탄소 코팅된 그리드(Ted Pella Inc, Redding, CA, USA cat no 01800N-F) 상에 적가되고, 2.5% 글루타르알데하이드 내에 고정되고, 세척되고 2% 우라닐 아세테이트 내에서 대조되고, 우라닐 아세테이트(0.8%) 및 메틸 셀룰로스(0.13%) 혼합물 내에 포매되고, 전자 현미경 하에서 조사된다. 상기 크기 분획화 조사와 일치하게 본 발명자들은 ∼50-150 nm의 많은 소포 비율을 관찰하였고, 이는 이들 소포가 분비물 내 추정 활성 복합체임을 나타낸다(도 11).
상기 가설은 조절 배지가 1시간 동안 200,000xg로 초원심분리시 종전 기재된 바와 같이 LC/LC-MS에 의해 분석된 펠렛이 분비물 내에서 발견된 단백질의 70% 이상을 포함한다는 관찰에 의해 지지된다.
실시예 22. 결과: 조절 배지의 지질 조성물
조절 배지의 지질 조성물을 분석하기 위해 조절 배지 및 NCM의 소수성 지질/스테로이드 성분이 Folch 절차에 의해 추출된다. 간단하게는 50 ml의 조절 배지 또는 NCM이 5 ml의 클로로포름 및 2 ml의 메탄올과 강하게 혼합된다. 유기상 및 수성상이 분리된다. 하단 클로로포름층이 제거되고 speedvac에 의해 증발 건조된다.
잔기는 LC-MS/MS 분석을 위해 메탄올 내에 재구성된다. 이후 표본은 디클로로메탄/메탄올/물/에틸아민 이동상을 지닌 일반-상(실리카상) HPLC 컬럼으로 주입된다. 이후 용출액은 나노스프레이에 의해 LTQ-FTMS/Orbitrap으로 이온화된다. LTQ-FTMS/Orbitrap은 상이한 화학 특성을 지닌 지질/스테로이드의 검출을 위해 교대 양성 및 음석 양식으로 작동된다. 각각의 MS 스캔의 상위 5개 전구체 이온은 MS/MS 스캔에 의해 더욱 분석된다.
따라서 분자는 FTMS 및 LTQ의 결합을 특징으로 한다. 각각의 일렬 질량 스펙트럼의 전구체 질량은 먼저 지질 및 대사물질 데이터베이스 내 후보물질에 매치된다. 이후 데이터베이스 내 분자에 대해 <5 pmm 질량 오류를 지닌 이온의 MS/MS 스펙트럼은 알려진 표준 스펙트럼 또는 Mass Frontier 프로그램에 의해 예측된 스펙트럼과 비교된다.
조절 배지 유래의 클로로포름 추출물의 질량 분광측정 분석은 형질막 및 엑소솜에서 흔하게 발견되는 지질 즉 인지질, 당지질 및 스테로이드의 존재를 나타내었다. 인지질은 포스파티딜 세린 및 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 콜린, 신고마이엘린, 세라마이드를 포함하고; 당지질은 세레브로시드를, 스테로이드는 콜레스테롤을 포함한다.
엑소솜은 그의 지질막 내 지질 뗏목으로 알려진 마이크로도메인을 지니는 것으로 관찰된 바 있다. 엑소솜은 콜레스테롤이 풍부하고, 그의 콜레스테롤-인지질 비율은 일반적으로 형질막에서 발견되는 0.3∼0.4(몰/몰)의 비율을 초과한다. 이들 뗏목은 저온에서 Triton X-100 또는 Brij-98와 같은 비-이온성 세정제에 의한 용해에 대한 내성 및 콜레스테롤에 결합하는 사이클로덱스트린에 대한 민감성을 특징으로 한다. Triton X-100과 같은 세정제 내에서 일반적인 불용성인 세정제 불용성은 지질 뗏목 존재를 확인하는데 종종 이용된다.
조절 배지가 Triton X-100로 처리되는 경우 분비 단백질은 멤브레인 여과를 이용하여 크기 분획화 실험과는 관계없이 복합체로서 분리를 지속하게 되고, 이는 추정 복합체가 지질 뗏목의 존재와 일치하게 Triton X-100에 의한 용해에 대해 내성적임을 나타낸다.
본 발명자들은 상기 복합체가 20 mM 사이클로덱스트린의 존재하에 용해에 민감한지 여부를 측정한다. 추정 복합체가 세포막 내 지질 뗏목을 지닌 경우 사이클로덱스트린에 의한 콜레스테롤의 추출은 용해를 유발하고 그의 분자 크기에 따라 크기 분획화될 수 있는 단백질을 유리시켰다. 추정 복합체 내 지질의 상대 정량적 조성은 종전 약술된 바와 같이 크로마토그래피 및 질량 분광측정 기술을 이용하여 평가된다. 이는 지질 조성물이 지질 뗏목의 존재를 지지할 수 있는지 여부를 측정한다.
실시예 23. 결과: 조절 배지의 RNA 조성물
조절 배지의 트리졸 추출 후 세포 유래 RNA 추출에 일반적으로 사용되는 이소프로판올 침전은 1.9의 260:280 nm 흡광도 비율을 지닌 수중 펠렛을 생성하고, 이는 RNA임을 나타낸다.
이는 엑소솜이 mRNA 및 마이크로RNA를 포함한다는 종전 보고와 일치한다. 이러한 펠렛은 RNase 활성에 대한 민감도에 대해 분석된다. 또한 조절 배지는 트리졸로의 추출 전 RNase로 처리될 것이다. 이들 분석은 상기 펠렛이 RNA인지 및 상기 RNA가 엑소솜과 같은 지질 소포 내에 격리되어 있는지 여부를 측정한다.
그러한 경우 RNA는 RNA의 조성 및 기능을 측정하기 위해 마이크로어레이, 서열분석, RT-PCR 및 시험관 내 번역 분석과 같은 유전자 발현 분석에 의해 분석된다. RNA는 15N-류신의 존재 및 부재 하에 표준 상업적으로 이용 가능한 망상적혈구 용해질 시스템을 이용하여 시험관 내에서 번역된다. 번역된 단백질 산물은 질량 분광측정법에 의해 확인된다.
실시예 24. 결과: 단백질체 프로파일
분비물 내에 존재하는 것으로 기재된 ∼700개 단백질(미국 가출원 번호 60/878,222 및 국제 출원 PCT/SG2006/000232. 중간엽 줄기세포 조절 배지) 중 또다른 엑소솜의 단백질체 내에 일반적으로 존재하는 것으로 발견된 많은 단백질이 존재한다(도 13). 또한 엑소솜 내에 존재하는 것으로 기재되지 않은 ∼700개 단백질의 목록 내에 많은 단백질이 존재한다. 일부 두드러지나 규명되지 않은 예는 Thyl, Wnt 5a, Wnt 5b, 인히빈 A(또는 액티빈 A)이다.
실시예 25. 결과: 표면 항원 프로파일
또한 조절 배지의 단백질체 프로파일은 세포막-결합된 것으로 알려진 단백질의 존재를 설명한다. 일부 두드러지나 규명되지 않은 예는 CD9, CD109, thy-1이다. 소변에서 분비된 엑소솜 표면 상에서 발견되는 CD24와 같은 엑소솜의 또다른 알려진 표면 항원은 MSC 또는 그의 분비물 내에서 발현되지 않는다.
더욱이 이들 표면 항원 대다수는 세포-형태 특이적 방식으로 발현된다. 동시에 이들 관찰은 표면 항원 프로파일이 상이한 세포 공급원 유래 엑소솜을 한정하고 구별할 것임을 나타낸다. 이들 추정 분비물 복합체의 표면 항원 프로파일을 특성화하기 위해 조절 배지는 표준 상업적으로 이용 가능한 비오틴화 키트를 이용하여 비오틴화된다. 단백질은 웨스턴 블럿 분석시 표준 프로토콜을 이용하여 표준 SDS-PAGE 상에서 분리되고, 나일론 또는 니트로셀룰로스 상에 이동되고, 아비딘-과산화효소로 프로브된다. 이러한 프로토콜에서 복합체의 표면 상에 존재하고 비오틴에 물리적으로 접근 가능한 단백질만이 비오틴화된다. 복합체 내에 존재하고 따라서 물리적으로 접근 가능하지 않은 모든 단백질이 비오틴화된다. 또한 비오틴화 단백질은 아비딘-친화성 크로마토그래피를 이용하여 분리되고 LC/MS를 이용하여 확인된다. 이들 단백질 확인은 웨스턴 블럿 분석, 면역전자 현미경검사 및 MSC의 유전자 발현에 의해 확인된다.
실시예 26. 엑소솜
상기 관찰을 기반으로 하여 본 발명자들은 조절 배지 내 최소 활성 심장보호 유니트는 엑소솜이라고 가정한다.
이러한 가설을 입증하기 위해 본 발명자들은 100 kDa의 MW 차단의 멤브레인으로의 멤브레인 여과 기술을 이용하여 조절 배지를 농축한다. 이후 농축된 조절 배지는 ∼150-200,000 g에서 1∼2시간 동안 초원심분리된다. 펠렛은 PBS 내에 재현탁되고, 50∼150 nm의 크기 범위를 지닌 입자의 존재를 확인하기 위해 전자 현미경으로 분석되고, 그의 단백질, 지질 및 RNA 함량이 분석된다.
현탁액은 조절 배지에 대해 컴퓨터로 예측된 생물학적 활성에 대해 분석되고, 각각 상기 또는 하기에 기재된 바와 같이 마우스 및 돼지 모델 내에서 심장보호 효과에 대해 시험된다.
실시예 27. 돼지 조사를 위한 조사 디자인
모두 3일간 클로피도그렐 75 mg/일 및 10일간 아미오다론 400 mg/일로 전처리된 30마리 암컷 Dalland Landrace 돼지(60-70 kg; IDDLO, Lelystad, The Netherlands)는 MSC-CM, 비-CM 또는 식염수 처리를 위해 무작위로 할당된다.
식염수 그룹은 신선한 비-조절 배양 배지의 잠재 효과를 평가하기 위해 추가된다. 모든 돼지에서 MI는 75분의 기부 좌회선 관상 동맥(LCxCA) 결찰 후 4시간의 재관류에 의해 유도된다. 74분의 허혈 기간은 완전한 전층 경색증을 유도하지 않고 중증 심근 손상을 가하기 위해 선택된다. TTC 염색을 이용한 경색 크기 측정이 3시간의 재관류 후 가장 확실하기 때문에 4시간 재관류 기간이 이용된다.
더 긴 재관류 기간 후 산화 스트레스 상태 및 아폽토시스 메커니즘을 평가하는 것이 더욱 어려워진다. 처리는 MSC-CM(1.0 ml, 2.0 mg 단백질), 비-CM 또는 식염수의 정맥내 주입에 의해 재관류 착수 5분전에 개시된다. 재관류 직후 추가적인 관상동맥내 덩어리 MSC-CM(4.0 ml, 8.0 mg 단백질), 비-CM 또는 식염수가 제공된다. 심근 경색 크기 및 기능은 재관류 4시간 후 평가된다.
심장보호를 부여하는 배지 내 인자(들)을 확인하기 위해 본 발명자들은 허혈 및 재관류 손상 마우스 또는 돼지 모델을 이용하였다. MI는 30분 좌측 관상 동맥(LCA) 폐색 후 재관류에 의해 유도된다. 마우스는 재관류 5분 전 꼬리 정맥을 통해 정맥내로 비분획회 조절 배지, <1000 kD 분획, <500 kD 분획, <300 kDa 분획, <100 kD 분획 또는 식염수로 처리된다. 경색 크기는 익일(재관류 24시간 후) 평가된다.
실시예 28. MI 및 실시 절차
전체 실시 동안 EGG, 전신 동맥압 및 호기말이산화탄소측정도가 지속적으로 모니터된다. 종전 기재된 일반적인 마취 하에 정중 흉골절개가 수행되고 2개의 도입 시트가 6 Fr 유도 카테터 및 8 Fr 전도 카테터(CD Leycom, Zoetermeer, the Netherlands)에 대해 경동맥 내로 삽입된다.
Swan Ganz 카테터의 말단 끝이 내부 경정맥을 통해 폐동맥 내에 위치한다. 심장 출력 및 관상동맥 유동을 측정하기 위해 음향통과 유동 프로브(Transonic Systems Inc, Ithaca, NY)가 기부 대동맥 및 LCxCA 주변이 위치하고, PV 루프를 위한 다양한 부하 조건 하에 기능적 측정을 가능하게 하기 위해 전선은 하부 대정맥 주변이 위치한다. 기능 측정 후 10.000 IU의 헤파린이 정맥내로 투여되고 봉합선이 죄여 기부 LCxCA가 폐색된다. 심실 세동이 발생하면 50 J로의 내부 세동제거가 이용된다. 75분의 허혈 후 LCxCA는 봉합선의 해제에 의해 재개방된다. 재관류 직후 니트로글리세린(무-재유동을 방지하기 위한 0.1 mg)이 유도 카테터를 통해 LCxCA로 주입된 후 MSC-CM, 비-CM 또는 식염수로 관상동맥내 처리된다. 재관류 4시간 후 최종 기능 측정이 수행되고 심장은 경색 크기 분석을 위해 체외외식된다.
마우스는 펜타닐(0.05 mg/kg), 도미컴(5 mg/kg) 및 도미터(0.5 mg/kg)로 마취되고 무딘 말단을 지닌 24-게이지 정맥내 카테터를 이용하여 관이 삽입된다. 마우스는 이소푸란(2.5∼3.0% vol/vol)이 첨가된 O2와 N2O(1:2 vol/vol)의 혼합물로 설치류 환기기를 이용하여 105 박동/분의 속도로 인공으로 환기된다. 마우스는 체온을 37℃로 유지하기 위해 전기 패드에 위치한다. 흉부가 세 번째 늑간강 내에서 개방되고 8-0 프롤렌(prolene) 봉합선이 좌측 관상 동맥(LCA)을 30분간 폐색시키는데 사용된다. 흉부는 폐쇄되고 익일(24시간 후) 심장이 경색 크기 분석을 위해 체외이식된다.
실시예 29. 기능 측정
EGG, 동맥압 및 심장 박출량은 250 Hz의 표본추출 속도로 디지털화되고 오프라인 분석을 위해 저장된다(Leycom CFL-512, CD Leycom). 좌심실(LV) 압력 및 부피는 종전 기재된 바와 같이 전도 카테터 방법을 이용하여 측정된다. 전도 카테터에서 유래한 LV 압력 및 부피 신호가 표시되고 Leycom CFL-512(CD Leycom)로 250-Hz 표본추출 속도로 획득된다.
자료는 항정 상태 동안 및 일시적 대정맥 폐색 동안 획득되고, 호흡기를 지닌 모두는 최종 호기에 꺼졌다. 압력-부피 루프 분석은 종전 기재된 바와 같이 주문제작 소프트웨어로 수행된다. 더욱이 유두중간 근육 수준에서 단축(short-axis) 심외막 초음파 영상(Prosound SSD-5000, 5-MHz probe UST-5280-5, Aloka Holding Europe AG, Zug, Switzerland)이 수득된다. 경색 영역, 먼 영역(중격) 및 LV 내부 영역(LVia)의 벽 두께(WT)가 확장기말(ED) 및 수축기말(ES)에서 측정된다. 수축기 벽 비후(SWT)는 [(WT(ES)-WT(ED))/WT(ED)]*100%로, 분획 영역 단축(FAS)은 [(LVia(ES)-LVia(ED))/LVia(ED)]*100%로, 좌심실 박출 분획(LVEF)은 [(EDV-ES V)/EDV] * 100%로 계산된다. 확장기말 챔버 경직도는 확장기말 압력-부피 관계의 선형 회귀 방법으로 정량된다. 심장초음파검사 및 PV 루프는 MI 전, 허혈 1시간 후 및 재관류 4시간 후에 측정된다. 기절 심근을 설명하기 위해 추가적인 측정이 정맥내 도부타민 주입(2.5 ㎍/kg/분 및 5.0 ㎍/kg/분)에 의한 약제학적으로 유도된 스트레스 동안 수행된다.
실시예 30. 경색 크기
심장 절제 직전 LCxCA(돼지) 또는 LCA(마우스)는 MI 유도와 동일한 지점에서 정확하게 재결찰된다. 위험 영역(AAR)을 윤곽화하기 위해 Evans blue가 관상 시스템을 통해 주입된다. 이후 심장이 절제되고, LV가 분리되고 정점에서 기부까지 5개 절편으로 절단된다.
절편은 15분간 37℃ Sorensen 완충액(13.6 g/L KH2PO4 + 17.8 g/L Na2HPO4·2H2O, pH 7.4) 내의 1% 염화트리페닐테트라졸륨(TTC, Sigma-Aldrich Chemicals, Zwijndrecht, the Netherlands) 내에서 인큐베이트되어 경색 조직을 생존 가능 심근과 구별하게 한다.
모든 절편은 양면 및 각각의 슬라이드 내에서 스캔되고, 경색 영역은 디지털 면적측정 소프트웨어(Image J)를 이용하여 위험 영역 및 전체 영역과 비교된다. 절편 중량에 대한 보정 후 경색 크기는 AAR 및 LV의 비율로 계산된다.
실시예 31. 재료 및 방법: 조절 배지의 제조
HuES9.E1 세포는 종전 기재된 바와 같이 배양된다(Lian et al., 2007; Sze et al., 2007).
간단하게는 80% 융합성 HuES9.El 세포 배양액이 PBS로 3회 세척되고, 페놀 레드(카탈로그 번호 31053; Invitrogen)가 없고 ITS(Invitrogen), 5 ng/ml FGF2 (Invitrogen), 5 ng/ml PDGF AB(Peprotech, Rocky Hill, NJ) 글루타민-페니실린-스트렙토마이신 및 b-머캅토에탄올로 보충된 DMEM으로 구성된 화학적 한정 배지 내에 밤새 배양되었다. 이후 배양액은 PBS로 3회 세척된 후 신선한 한정 배지가 첨가되었다.
3일 후 상기 배지가 채취되고, 500xg에서 원심분리되고, 농축된다. >100 kDa CM 표본은 100 kDa MWCO 접선력 여과(TFF)를 이용하여 CM 50x를 농축함으로서 제조된다. 모든 다른 농도는 초미세여과막을 이용하여 수행된다. 모든 CM 및 다른 차별적으로 처리된 CM은 모든 절차 후 및 보관 또는 사용 전 0.2 마이크론 여과된다.
실시예 32. 재료 및 방법: LC MS/MS 분석
2 ml의 투석된 조절(CM) 또는 비-조절 배지(NCM) 내 단백질은 종전 기재된 바(Sze et al., 2007)와 같이 환원되고, 알킬화되고, 트립신 분해된다. 이후 표본은 조절된 Sep-Pak C-18 SPE 카트리지(Waters, Milford, MA, USA)를 통해 분해된 혼합물을 통과시킴으로서 탈염되고, 3% 아세토니트릴(ACN)(JT Baker, Phillipsburg, NJ) 및 0.1% 포름산(FA) 완충액으로 2회 세척되고, 70% ACN 및 0.1% FA 완충액으로 용출된다. 이후 용출 표본은 진공 카트리지 내 유기 용매를 제거함으로서 초기 부피의 약 10%로 건조된다.
표본 복잡성을 감소시키기 위해 오프라인 펩타이드 분획화가 폴리설포에틸 SCX 컬럼(200 mm x 4.6 mm)(PoIyLC, USA)을 통해 HPLC 시스템(Shimadzu, Japan)으로 수행된다. 1 ml/분의 이동상 A(5 mM KH4PO4 + 30% 아세토니트릴) 및 이동상 B B (5 mM KH4PO4 + 30% 아세토니트릴 + 35O mM KCl). 8개 분획이 수집되고 진공 카트리지로 건조된다. 분획화 표본은 나노-스프레이 공급원과 일치된 LTQ-FT 초선형(ultra linear) 이온 포착 질량 분광계(Thermo Electron, San Jose, CA)에 온라인으로 결합된 Shimadzu DGU-20A3 Cl8 역상 HPLC 시스템의 오토샘플러 내에 적가된다. 주입된 펩타이드는 Zorvax 300SB-C18 농축 컬럼(5 mm x 0.3 mm, Agilent Technologies, Germany) 내에 포착되고 nano-bored Cl8 충전 컬럼(75 ㎛ x 100Å, Michrom Bioresources, Auburn, CA) 내로 용출된다.
200 nl/분 유속의 90분 구배가 질량 분광계 내로 상기 펩타이드를 용출시키는데 사용된다. LTQ는 FTMS 내 각각의 MS 스캔 유래의 8개의 가장 강한 피크에 대해 MS/MS 스캔을 수행함으로서 데이터-의존적 양식으로 실시된다. 각 실험에 있어서 8개의 SCX 분획의 MS/MS(dta) 스펙트럼은 홈-리튼(home-written) 프로그램에 의한 단일 마스코트 일반 파일 내로 결합된다. 단백질 확인은 인-하우스(in-house) 마스코트 서버(Version 2.2, Matrix Science, UK)를 통해 IPI 인간 단백질 데이터베이스(버전 3.34; 67,758개 서열)에 대해 결합된 데이터를 검색함으로서 달성된다. 검색 파라미터는 트립신을 이용한 2개의 놓친 분할의 최대이고; 고정 변형은 시스테인의 카바미노메틸화이고, 변이 가능 변형은 메티오닌의 산화이다. 질량 내성은 펩타이드 전구체 및 단편 이온 각각에 대해 20 ppm 및 0.8 Da로 조정된다. 단백질 확인은 2개의 상이한 펩타이드가 상동성 득점보다 더 높은 득점을 지닌 것으로 판명되는 경우 실제로 양성인 것으로 승인된다.
실시예 33. 재료 및 방법: HPLC 분획화 및 준-탄성 광 산란(QELS) 검출기를 이용한 역동적 광 산란
기기 구조는 이원 펌프를 지닌 액체 크로마토그래피 시스템, 자동 주입기, 온도조절된 컬럼 오븐 및 Shimadzu Corporation(Kyoto, Japan)의 Class VP 소프트웨어에 의해 작동되는 UV-가시성 검출기로 구성되었다. 사용된 크로마토그래피 컬럼은 Tosoh Corporation(Tokyo, Japan)의 TSK Guard 컬럼 SWXL, 6 x 40 mm 및 TSK 겔 G4000 SWXL, 7.8 x 300 mm이다. 하기 검출기 Dawn 8(광 산란), Optilab(굴절률) 및 QELS(역동적 광 산란)는 UV-가시성 검출기에 이어서 시리즈로 연결된다. 후자 검출기는 Wyatt Technology Corporation(California, USA) 제품이고 ASTRA 소프트웨어에 의해 작동된다.
표본의 구성성분은 크기 배제에 의해 분리된다 즉 큰 분자는 작은 분자 전에 용출될 것이다. 사용되는 용출 완충액은 pH 7.2에서 150 mM의 NaCl을 지닌 20 mM 인산염 완충액이다. 이러한 완충액은 0.1 ㎛의 세공 크기를 통해 여과되고 사용전 15분간 탈기된다. 크로마토그래피 시스템은 Dawn 8 내의 신호가 약 0.3 검출기 전압 유니트에서 안정화될 때까지 0.5 ml/분의 유속으로 평형화된다. UV-가시성 검출기는 220 nm에 조정되고 컬럼은 25℃로 오븐 평형화된??. 용출 양식은 동용매성이고 작동 시간은 40분이다. 주입되는 표본의 부피는 50 내지 100 ㎕ 범위이다. 엑소솜 피크 대비 다른 모든 피크의 % 면적은 UV-가시성 검출기로부터 통계처리된다. 유체역학 반경, Rh는 QELS 및 Dawn 8 검출기에 의해 컴퓨터 계산된다. 피크 정점에서의 최대 계측 속도(Hz)가 Rh로 취해진다.
220 nm에서 가시화된 분리된 구성성분의 피크는 또다른 특성 조사를 위해 분획으로 수집된다.
실시예 34. 재료 및 방법: 구배 밀도 평형 원심분리
슈크로스 구배 밀도 평형 원심분리를 위해 22.8∼60%(w/v) 농도의 14개 슈크로스 용액이 제조된다. 최대 농축 용액이 SW60Ti 초미세여과 튜브(Beckman Coulter Inc., Fullerton CA, USA)의 하단에 층을 형성하고 다음의 최대 슈크로스 농도가 이어진다. CM은 4℃에서 SW60Ti 로터(Beckman Coulter Inc.) 내에서 200,000X g로 16.5시간 동안 초원심분리 전 상단에 조심스럽게 적가된다. 16개 분획이 슈크로스 구배의 상단에서 하단까지 수집된다. 모든 슈크로스 분획의 밀도는 마이크로밸런스를 이용하여 계산되고, 13개 분획으로 통합된다. 일부 CM의 경우 CM은 슈크로스 구배 밀도 평형 원심분리 상에 적가되지 전 세포 용해 완충액 (Cell Extraction Buffer, Biovision, www.BioVision.com)으로 전처리된다. 용해 완충액은 프로테아제 저해제(Halt Protease Inhibitor Cocktail, EDTA-Free, Thermo Scientific , www.thermofisher.com ) 칵테일의 1:1 부피비로 CM에 첨가된다. 혼합물은 약한 진탕으로 실온에서 30분간 인큐베이트된다.
실시예 35. 재료 및 방법: 단백질 정량
CM의 단백질 농도는 제조사의 지침에 따라 NanoOrange 단백질 정량 키트(Invitroge)를 이용하여 정량된다.
실시예 36. 재료 및 방법: SDS-PAGE 및 웨스턴 블럿 분석
CM의 전체 댄백질은 니트로셀룰로스 멤브레인(Amersham Biosciences, Uppsala, Sweden)으로 이동되기 전 폴리아크릴아마이드 겔 상에서 분리된다. 멤브레인은 차단되고, 인간 CD9, CD81, SOD-1, 피루브산 키나제, Alix, Tsp-1에 대한 마우스 항체와 인큐베이트된 후 마우스 1차 항체에 대한 당근 과산화효소-결합 2차 항체와 인큐베이트된다. 이후 블럿은 결합된 1차 항체 즉 항원의 존재를 검출하기 위해 화학발광 HRP 기질과 인큐베이트된다.
실시예 37. 재료 및 방법: 스핑고마이엘린, 포스파티딜콜린 및 콜레스테롤 분석
4℃에서 100,000xg로 2시간 동안의 초원심분리에 의한 CM 및 펠렛의 2개의 독립적인 제제 내 콜레스테롤, 스핑고마이엘린 및 포스파티딜콜린 농도는 상업적으로 이용 가능한 분석 키트를 이용하여 측정된다. 콜레스테롤은 Amplex Red Cholesterol Assay Kit(Molecular Probes, USA)를, 스핑고마이엘린은 Sphingomyelin Assay Kit(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA)를, 포스파티딜콜린은 Phosphatidylcholine Assay Kit(Cayman Chemical Company, Ann Arbor, MI, USA)를 이용하여 분석된다.
실시예 38. 재료 및 방법: 조절 배지의 제한적 트립신 처리
CM은 약한 진탕으로 4℃에서 30분간 Triton X 또는 세포용해 완충액 존재/부재 하에 처리된다. 단백질 분해는 약한 진탕으로 실온에서 3초 내지 20분간 처리된 CM에 트립신을 첨가함으로서 수행된다.
실시예 39. 재료 및 방법: miRNA 마이크로어레이 분석
MSC 유래의 전체 세포 RNA의 2개의 생물학적 복사체 및 CM 유래의 선택된 RNA의 2개의 생물학적 복사체는 miRNA 마이크로어레이에 의해 분석된다. 혼성화 및 데이터 분석은 LC Sciences, LLC(www.LCsciences.com)에 외부 위탁된다. 칩은 Sanger miRBase Release 10.1(http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/)에 기입된 miRNA 전사체에 대한 프로브를 포함하였다.
실시예 40. 결과: 심장보호 분비물은 다중단백질 복합체를 형성하는 엑소솜-관련 단백질을 포함함
활성 성분을 확인하기 위해 본 발명자들은 종전 상이한 MWCO를 지닌 멤브레인을 통한 초미세여과에 의해 CM을 분획화하였다. CM이 1000 kDa의 MWCO를 지닌 멤브레인을 통해 여과되는 경우 여과물은 보호성이 아닌 것으로 나타난다. 그러나 유사한 멤브레인에 대해 ∼125배까지 농축된 CM은 허혈/재관류 손상 마우스 모델 내에서 심장보호성이다. 요약적으로 100 kDa, 300 kDa, 500 kDa 또는 1000 kDa과 같이 0.2 ㎛보다 작은 MWCO를 지닌 필터를 통한 여과는 심장보호성이 아니나(도 14) 1000 kDa(Timmers et al., 2008) 또는 100 kDa 멤브레인에 대해 농축된 CM은 심장보호성이다(도 14). 이들 관찰은 활성 분획이 > 1000 kDa 또는 50∼100 nm의 직경을 지닌 거대 복합체로 구성됨을 나타내었다. 입자 크기 범위를 기반으로 본 발명자들은 CM 내 입자가 엑소솜임을 가정하였다. 엑소솜은 많은 세포 형태에 의해 분비되고 이들 엑소솜의 단백질 조성은 세포 특이적인 것으로 간주된다. 그러나 CD9, 피루브산 키나제 및 alix와 같은 일부 단백질은 엑소솜 내에서 일반적으로 발현되는 것으로 간주된다(Sze et al., 2007). 본 발명자들은 종전 분비불 내 약 201개 단백질을 확인한 바 있다(Sze et al., 2007).
본원에서 본 발명자들은 재료 및 방법에 상세하게 설명된 본 발명의 단백질체 분석시 종전 기재된 방법을 변형하여 상기 목록을 793개 단백질로 확대하였다(표 E2). 793개는 CD9, CD81, Alix, TSP-I, SOD-1 및 피루브산 키나제(Olver and Vidal, 2007)와 같은 많은 엑소솜-관련 단백질을 포함하였다. 본 발명자들은 웨스턴 블럿 분석에 의해 분비물 내 이들 단백질의 존재를 확인하였다(Lanel, Figure 15). CD81, CD9 및 Alix의 동시-면역침전은 엑소솜과의 연관성 및 분비물 내 엑소솜의 존재를 지지하였다. TSP-1, SOD-1 및 피루브산 키나제는 CD81과 동시-면역침전되지 않았고, 이는 이들 단백질이 CD81+ 엑소솜 내에 존재하지 않거나 엑소솜 내에 전혀 존재하지 않음을 나타낸다(도 15).
표 E2(하기). LC-MS/MS 및 항체 어레이에 의해 확인된 793개 특정 유전자 산물의 알파벳 목록
Figure pct00025
Figure pct00026
Figure pct00027
표 E2. LC MS/MS 및 항체 어레이에 의해 측정된 CM의 단백질체 프로파일. 4개의 독립적 표본이 분석되었다. 표 내 각각의 단백질은 4개 표본 중 3개 이상에서 검출되었다.
표 E2의 상기 단백질 중 TIMPl, TIMP2, TNFRSFl IB, LGALS3, ALCAM, DCN, SFRPl, GDF15, PDGFC, PTX3, LTBPl, IGFBP2, GREMl, IGFBP7, MIF, MMPl, PLAU, INHBA 및 THBSl은 LC MS/MS 및 항체 어레이에 의해 확인되었다. PPIA, HISTl H4, PPIB, HISTl H4A, HISTl H4B, HISTl H4C, HIST1H4D, HIST1H4E, HIST1H4F, HIST1H4H, HIST1H4I, HIST1 H4J, HIST1H4K, HIST1H4L, HIST2H2AA3, HIST2H2AA4, HIST2H4A, HIST2H4B, HIST4H4, HLA-A, HLA-B, SDCBP, TUBAlA, TUBA6, TUBA8, GAPDH, TUBB, TUBB2C, TUBB3, TUBB4, TUBB6, TUBB8, HSP90AB1, ANXA1, HSP90B1, ANXA2, ANXA5, ANXA6, PDCD6IP, CD9, CFLl, CLTC, ENOl, PKM2, MSN 및 YWHAG은 LC MS/MS 및 배양 세포에 의해 분비된 엑소솜 상의 4개 이상의 조사에 의해 분석된다. FGF16, FGFRLl, TNFRSF12A, TNFSF12, CXCL1 , CCL18, CXCL12, CCL2, CXCL16, CCL7, CXCL2, CCN4, CXCL9, CCR4, CCR5, ANGPT4, GDFl, GDFl1, SFRP4, GDF3, GDF5, GDF8, DKKl, LTA, PDGFA, LTB, MADH4, IFNG..., GPC5, IGF2R, CHRDLl, GRN, VEGFC, IL13, ILl5, EML2, IL15RA, ILlRAP, MMPlO, IL2, GZMA, IL21R, IL3, IL6, IL6ST, IL8, HGF 및 THBS는 항체 어레이에 의해 확인된다. 나머지 단백질은 LC MS/MS에 의해 확인된다.
실시예 41. 결과: 엑소솜-관련 단백질은 인지질 소포 내에 위치함
CM 내 엑소솜의 존재를 검증하기 위해 CM은 2시간 동안 200,000g에서 초원심분리된다. 상청액 내 검출 불가능한 수치의 CD9를 지닌 펠렛 내 엑소솜-관련 단백질인 CD9의 >200배 농축이 존재한다(도 16). 1시간 동안 100,000g의 초원심분리는 모든 CD9를 침전시키는데 충분하지 않다(도 16). 500 kDa의 MWCO를 지닌 필터를 통한 CM의 여과 후 200,000g에서 2시간 동안 여과물 또는 잔류물의 원심분리는 잔류물 분획 내에 펠렛을 생성하였다(도 16). 각각 19 kDa의 MW를 지닌 CD9는 이러한 펠렛 내에 매우 풍부하다. 그러나 이러한 펠렛은 허혈/재관류 손상 마우스 모델 내 어떠한 심장보호도 부여하지 않았고, 본 발명자들은 이는 펠렛을 재현탁시키기 위한 강한 혼합 및 피펫팅의 요구에 기인한다고 가정하였다. 본 발명자들은 CD9 분획만이 1시간 동안의 100,000 g 및 200,000 g에서 침전되고 대부분은 2시간 동안의 200,000 g에서 침전됨을 관찰하였다. 적은 분획은 4시간 동안의 200,000 g에서 침전되었다. 동시에 이들 관찰은 활성 성분이 초원심분리에 의해 침전될 수 있는 매우 거대한 복합체라는 본 발명자들의 가설을 지지한다.
엑소솜-관련 단백질이 실제로 엑소솜 즉 인지질 소포 내에 존재하는지 확인하기 위해 CM이 평형 초원심분리에 의해 슈크로스 밀도 구배 상에서 분획화된다. 지질 소포와 유사하게 엑소솜의 밀도는 1.13 g ml-1 내지 1.19 g ml-1 범위이고 슈크로스 구배 상에서 부유한다. 슈크로스 구배 상의 부유는 단백질 응집체 또는 뉴클레오솜 단편과 같은 오염 물질로부터 엑소솜을 용이하게 분리한다(Thery et al., 2002). 이후 슈크로스 구배 유래 분획은 구배에 따라 CD9, CD81, Tspl, SOD-1 및 피루브산 키나제에 대해 분석된다(도 17A). 두드러진 특징은 단백질이 그의 분자량과 상호관련된 단백질의 예측된 밀도로 침전되지 않았다는 점이다. 이들 명백한 밀도가 지질 소포 내에 포함된 단백질에 의한 것인지 여부를 측정하기 위해 CM은 슈크로스 밀도 구배 상에서 분류되기 전에 세포 용해 완충액으로 처리된다(도 17B). 이러한 형질막 용해화 시약으로의 전처리는 각각의 명백한 밀도를 그의 분자량과 상호관련된 단백질의 예측 밀도로 복원하였다. 따라서 엑소솜-관련 단백질은 본 발명자들의 엑소솜 가설과 일치하게 지질 소포 내에 위치한다.
CM 내에 지질 소포가 존재하는지 확인하기 위해 형질막의 주요 인지질인 스핑고마이엘린과 포스파티딜콜린 및 콜레스테롤의 농도가 측정된다(도 17C). 예측된 바와 같이 단백질 ㎍ 당 이들 지질의 상대 농도는 비-조절 배지에 비해 CM에서 더 높다. 더욱이 2시간 동안의 200,000 g에서의 CM 초원심분리는 지질의 농도를 유의적으로 증가시켰다(도 17C).
실시예 42. 결과: 엑소솜 단백질은 막 결합되거나 피막화됨
엑소솜-관련 단백질은 CD9과 같은 많은 알려진 막단백질 및 SOD1과 같은 세포질 단백질을 포함하기 때문에 본 발명자들은 이들 단백질이 지질막 및 소포의 관강 상에 유사하게 위치하는지 여부를 측정하였다. CM은 시간 경과에 따른 제한적 트립신 처리된다(도 18A). SOD1과 유사한 MW를 지닌 CD9는 SOD1보다 비교적 더욱 민감하게 트립신 분해된다. SOD1의 분해는 CD9의 50%가 분해된 후에만 관찰된다(도 18A). 검출 가능한 중간물을 생성하지 않는 SOD1의 트립신 분해와 상이하게 CD9의 트립신 분해는 3가지 트립신 펩타이드 중간물을 생성하였고, 이는 CD9가 상이한 트립신-민감도를 지닌 도메인을 지님을 나타낸다. 펩타이드 중간물의 길이 및 CD9의 알려진 트립신 부위를 기반으로 3개의 민감성 트립신 펩타이드 중간물은 막횡단 및 세포질 도메인으로 지도화된다. 이는 세포성 CD9의 알려진 세포질-외 도메인이 분비된 CD9 상에 유사하게 노출되고, 따라서 트립신-민감성인 반면 막횡단 및 세포질 도메인은 노출되지 않고, 따라서 트립신 분해에 비교적 내성적이다. 동시에 이들 관찰은 알려진 막단백질인 CD9도 엑소솜 내에 막-결합되고 형질막 내 CD9와 같이 동일한 방향으로 향하는 반면 세포질 SOD-1은 관강 내에 위치하고 막의 완전성이 막단백질의 분해에 의해 손상되는 경우에만 분해될 수 있다.
실시예 43. 결과: 지질 소포의 존재는 MSC의 분비물 내 RNA를 피막화함
RNA가 엑소솜 내 세포에 의해 분비됨은 종전 보고된 바 있다(Smalheiser, 2007; Taylor and Gercel-Taylor, 2008; Valadi et al., 2007). RNA가 심장보호성 분비물 내에 존재하는 여부를 측정하기 위해 CM은 트리졸에 의해 RNA 추출되어 단백질 mg 당 5∼6 ug의 RNA를 생성하였다. 글리옥살-아가로스 겔(도 19A) 또는 요소-PAGE(도 19B) 상에서 분리된 경우 RNA는 대부분 <300 nt인 검출 불가능한 수치의 18S 및 28S 리보솜 RNA를 포함하였다. 단백질에 대해서 관찰된 바와 같이 분비물 내 RNA의 안정성이 인지질 소포 내의 그의 피막화에 기인하는 것인지 여부를 측정하기 위해 CM은 RNA 추출 전 RNase로 처리된다. RNA 수율 및 크기 분포는 비처리 CM과 유사하고(도 19C), 이는 분비된 RNA가 RNase 분해로부터 보호됨을 나타낸다. 이후 본 발명자들은 CM을 SDS-기반 세포 용해 완충액, 사이클로덱스트린 또는 포스포리파제 A2로 처리함으로서 RNA가 세포막과 유사한 지질막에 의해 보호된다는 가능성을 시험하였다. 4개의 시약 중 하나로 처리 후 CM은 RNAse에 노출된 후 RNA 추출된다. SDS-기반 세포 용해 완충액으로의 전처리는 RNA의 완전한 소실을 유발한 반면 사이클로덱스트린 또는 포스포리파제 A2로의 처리는 RNA의 부분적 분해 및 소실을 유발하였다. 이들 관찰은 RNA가 콜레스테롤-풍부 인지질막에 의해 RNAse 활성으로부터 보호되어 막이 SDS-기반 세포 용해 완충액, 지질을 용해하는 TritonX-100와 같은 세정제, 콜레스테롤을 킬레이트하거나 추출하는 사이클로덱스트린 또는 포스포리파제 D에 의한 분해에 의해 용이하게 용해되거나 손상되게 된다. 또한 본 발명자들은 ∼70-100 nt의 RNA가 유사한 MW의 것보다 RNAse Ⅲ 활성에 더욱 민감함을 관찰하였고, 이는 더 큰 RNA가 이중 나선임을 나타낸다(도 19D).
실시예 44. 결과: 분비된 RNA는 소포 내에 격리됨
RNA가 지질 소포 내에 존재하는 것으로 나타났기 때문에 본 발명자들은 슈크로스 구배 평형 초원심분리를 이용하여 이들 소포의 부력 밀도를 측정하였다. CM, 세포용해 완충액으로 전처리된 CM 또는 RNA MW 마커 세트는 도 4a, b에 기재된 바와 같이 슈크로스 밀도 구배 상에 적가되고 초원심분리된다. 이후 구배는 13개 분획으로 이동된 후 각각의 분획은 RNA 추출된다. 분비된 RNA는 1.074∼1.1 170 g/ml의 밀도에서 평형되었다(도 20). 이와 대조적으로 RNA MW 마커는 1.115∼1.1 170 g/ml의 부력 밀도를 나타내었고, 원심분리 전 세포용해 완충액으로의 CM 전처리는 RNA MW 마커 대비 분비된 RNA 밀도의 증가 즉 1.115∼1.145 g/ml을 유발하였다(도 20C). 따라서 이들 관찰은 지질 소포 내에서 피막화되는 RNA와 일치하여 용해성 RNA보다 더욱 더 낮은 명백한 밀도를 지녔다. 세포용해 완충액으로의 CM 전처리는 RNA를 방출하였고 RNA 마커 밀도에서의 RNA 침전을 유발하였다.
실시예 45. 결과: RNA-포함 소포는 CD81 포함 엑소솜 내에 존재하지 않음
상기 나타난 바와 같이 CD9, CD81 및 Alix는 항 CD81 항체에 의해 동시-면역침전된다. 본원에서 본 발명자들은 RNA도 CD81로 면역침전되는지 여부를 시험하였다. 면역침전 후 RNA는 침전물 내에 존재하지 않고 상청액 내에 잔존하였다(도 21). 따라서 분비된 RNA는 CD81+, CD81+ CD9+ 또는 CD81+ CD9+ Alix+ 소포 내에 격리되지 않는다.
실시예 46. 결과: 분비된 RNA는 pre-miRNA를 포함하는 마이크로RNA를 포함함
엑소솜이 마이크로RNA를 포함하고(Smalheiser, 2007; Taylor and Gercel-Taylor, 2008; Valadi et al., 2007), CM 내 대부분의 RNA는 300 n 보다 작다는 것은 보고된 바 있고, 본 발명자들은 마이크로어레이 혼성화를 수행함으로서 마이크로RNA(miRNA)의 존재에 대해 MSC 및 그의 CM 유래 RNA를 시험하였다. 149개 miRNA가 MSC 내에서 검출되고 CM 내에서는 63개가 검출된다(도 22A, 하기 표 E3).
표 E3. 마이크로어레이 혼성화에 의해 측정된 MSC 및 CM 내 miRNA의 목록
Figure pct00028

Figure pct00029
47개 miRNA는 MSC 및 CM 모두에 존재한다. 이들은 hsa-let-7a, hsa-miR- 149*, hsa-miR-214, hsa-let-7b, hsa-miR-221, hsa-let-7c, hsa-miR-26a, hsa-miR-151-5p, hsa-miR-222, hsa-let-7d, hsa-miR-100, hsa-miR-320, hsa-let-7e, hsa-miR-103, hsa-let-7f, hsa-miR-181a, hsa-miR-574-3p, hsa-miR-574-5p, hsa-let-7i, hsa-miR-107, hsa-miR-575, hsa-miR-125a-5p, hsa-miR-125b, hsa-miR-361-5p, hsa-miR-638, hsa-miR-663, hsa-miR-191, hsa-miR-671-5p, hsa-miR-132, hsa-miR-191*, hsa-miR-193a-5p, hsa-miR-423-5p, hsa-miR-21, hsa-miR-31, hsa-miR-143, hsa-miR-22, hsa-miR-145, hsa-miR-23a, hsa-miR-146a, hsa-miR-425*, hsa-miR-92a, hsa-miR-923, hsa-miR-23b, hsa-miR-940, hsa- miR-24, hsa-miR-149 및 hsa-miR-483-5p이다.
16개 miRNA는 CM에서는 검출 가능하나 MSC 내에서는 낮은 검출 수치로 존재한다. 이들은 hsa-let-7b*, hsa-miR-124, hsa-miR-296-5p, hsa-miR-765, hsa-miR- 1228, hsa-miR-1238, hsa-let-7d*, hsa-miR-150*, hsa-miR-493*, hsa-miR-933, hsa-miR-1234, hsa-miR-122, hsa-miR-198, hsa-miR-572, hsa-miR-1224-5p an dhsa-miR-1237이다.
하기 miRNA는 MSC에만 존재한다: hsa-miR-24-2*, hsa-miR-98, hsa-miR-484, hsa-miR-25, hsa-miR-99a, hsa-miR-151-3p, hsa-miR-491-5p, hsa-miR-99b, hsa-miR-503, hsa-miR-26b, hsa-miR-152, hsa-miR-505*, hsa-miR-27a, hsa-miR-155, hsa-miR-324-5p, hsa-miR-532-5p, hsa-miR-27b, hsa-miR-106a, hsa-miR-328, hsa-let-7g, hsa-miR-27b*, hsa-miR-106b, hsa-miR-181a*, hsa-miR-330-3p, hsa-miR-28-3p, hsa- miR-181a-2*, hsa-miR-331-3p, hsa-miR-lOa, hsa-miR-28-5p, hsa-miR-125a-3p, hsa-miR- 181b, hsa-miR-335, hsa-miR-584, hsa-miR-15a, hsa-miR-29a, hsa-miR-181c, hsa-miR- 342-3p, hsa-miR-612, hsa-miR-15b, hsa-miR-29c, hsa-miR-181d, hsa-miR-345, hsa-miR-625, hsa-miR-16, hsa-miR-30a, hsa-miR-126, hsa-miR-185, hsa-miR-629, hsa-miR-17, hsa-miR-30a*, hsa-miR-128, hsa-miR-186, hsa-miR-362-3p, hsa-miR-18a, hsa-miR-30b, hsa-miR-130a, hsa-miR-187*, hsa-miR-362-5p, hsa-miR-18b, hsa-miR-30c, hsa-miR-130b, hsa-miR-365, hsa-miR-19b, hsa-miR-30d, hsa-miR-374b, hsa-miR-708, hsa-miR-20a, hsa-miR-30e, hsa-miR-137, hsa-miR-192, hsa-miR-421, hsa-miR-744, hsa-miR-20b, hsa-miR-30e*, hsa-miR-140-3p, hsa-miR-766, hsa-miR-195, hsa-miR-424, hsa-miR-768-3p, hsa-miR-31*, hsa-miR-197, hsa-miR-424*, hsa-miR-768-5p, hsa-miR-22*, hsa-miR-34a, hsa-miR-145*, hsa-miR-199a-3p, hsa-miR-425, hsa-miR-769-5p, hsa-miR-34a*, hsa- miR-199a-5p, hsa-miR-877, hsa-miR-23a*, hsa-miR-146b-5p, hsa-miR-199b-5p, hsa- miR-454, hsa-miR-92b, hsa-miR-148b, hsa-miR-210, hsa-miR-455-3p, hsa-miR-93, hsa- miR-212.
또한 마이크로어레이 분석은 CM이 유의적인 수치의 항-유도 miRNA(별표로 표시)를 포함함을 나타내었다. 예를 들어 CM 내 let7b*에 대한 let7b 및 miR-191*에 대한 miR-191의 상대 비율은 MSC와 비교시 더욱 감소된다(도 22B). 세포에서 줄기-루프 pre-miRNA의 절단은 성숙 유도 miRNA 및 항-유도 miRNA를 생성한다. 후자는 일반적으로 세포 내에서 분해된다. 항-유도 miRNA 대비 유도 miRNA의 낮은 비율에 대한 가능한 설명은 분비물 내 마이크로RNA가 성숙 RNA가 아닌 pre-miRNA라는 것이다. 상기 가능성과 일치하게 본 발명자들의 관찰은 70∼100 nt RNA가 이중-나선이라는 점이다(도 19D). 이러한 발견을 확인하기 위해 역전사 RNA의 실시간 PCR 분석이 RNAse Ⅲ로의 전처리 존재 또는 부재 하에 유도 mRNA 및 pre-miRNA에 특이적인 프라이머를 이용하여 수행된다. RNAse Ⅲ 처리는 pre-miRNA를 분해함으로서 pre-miRNA의 존재를 확인시키고 RT-PCR에 의해 검출 불가능하게 할 것이다.
실시예 47. 결과: 심장보호 분비물은 1∼1000 nm의 검출 가능한 범위의 45∼55 nm의 유체역학 반경을 지닌 입자만을 포함함
분비물이 거대 복합체를 포함하는지 확인하기 위해 CM 및 NCM은 먼저 HPLC 상에서 크기 배제에 의해 분리된 후 220 nm에서의 흡광도에 의해 측정된 각각의 용출 피크는 준-탄성 광 산란(QELS) 검출기를 이용하여 역동적 광 산란(DLS)에 대해 조사된다.
11∼13분의 정체 시간을 지닌 용출 피크만이 역동적 광 산란을 나타내었고 이러한 피크 내 입자의 rh는 약 45∼55 nm이다. 13∼16 및 17∼19분 정체 시간을 지닌 또다른 용출 피크는 역동적 광 산란을 나타내지 않았다. DLS의 rh 검출 범위가 1 내지 1000 nm이고 DNA 알파 헬릭스의 직경이 2 nm이기 때문에 전체 단백질은 1∼10 nm이고, 핵공(50 nm), 거대 바이러스(100 nm) 및 미토콘드리아는 3 ㎛이고, 따라서 DLS는 가장 많은 생물학적 입자를 검출 가능하다.
심장보호가 >1000 kDa의 MW를 지닌 분획과 관련된다는 본 발명자들의 관찰을 기반으로 본 발명자들은 12분의 정체 시간을 지닌 용출 피크가 활성 성분이라고 가정한다.
이를 확인하기 위해 이러한 용출 피크가 채취되고 상기 및 종전 기재된 바와 같이(Timmers et al., 2008) 심근 허혈/재관류 손상 마우스 모델에서 시험된다.
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본원에서 언급된 출원 및 특허 각각 및 각각의 출원 및 특허의 실행 동안을 포함한 상기 출원 및 특허 각각 내의 인용되거나 참조된 각각의 문헌 및 출원 및 특허 각각 및 출원 인용 문헌에서 인용되거나 언급된 제품의 제조사 지침 또는 카탈로그는 본원에 참고문헌으로 포함된다. 더욱이 이러한 문헌에서 인용된 모든 문헌 및 이러한 문헌에서 인용된 문헌 내에서 인용되거나 참조된 모든 문헌 및 이러한 문헌에서 인용되거나 언급된 제품의 제조사 지침 또는 카탈로그는 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본 발명의 기재된 방법 및 시스템의 다양한 변형 및 변경은 본 발명의 범위 및 정신에서 위배되지 않고 당업자에게 명백할 것이다. 본 발명이 특정한 바람직한 실시태양과 함께 기재되었으나 청구된 본 발명은 이러한 특정 실시태양에 부당하게 한정되지 않아야 하고 이에 대한 많은 변형 및 첨가가 본 발명의 범위 내에서 이루어짐이 이해되어야 한다. 실제로 분자생물학 또는 관련 분야의 업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위한 기재된 방법의 다양한 변형은 청구항의 범위 내에 존재한다. 더욱이 하기 종속항의 특징의 다양한 결합은 본 발명의 범위에 위배되지 않고 독립항의 특징으로 이루어질 수 있다.

Claims (17)

  1. 중간엽 줄기세포에 의해 분비되고 전자 현미경으로 측정시 50 nm 내지 100 nm의 크기를 지니고, 예를 들어 심장보호와 같은 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)의 생물학적 활성과 같은 중간엽 줄기세포의 하나 이상의 생물학적 특성을 포함하는 엑소솜
  2. 제 1항에 있어서, 예를 들어 심근 허혈 및 재관류 손상 마우스 또는 돼지 모델에서 분석시 경색 크기를 감소시킬 수 있거나, 예를 들어 과산화수소(H2O2)-유도 세포 사멸의 시험관 내 분석시 산화 스트레스를 감소시킬 수 있음을 특징으로 하는 엑소솜
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 엑소솜은 표 D1 또는 E2에 나타난 목록에서 선택되거나 표 D2에 나타난 유전자의 유전자 산물과 같은 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM) 내의 70% 이상의 단백질을 포함하거나 표 E3에 나타난 하나 이상의 miRNA를 포함함을 특징으로 하는 엑소솜
  4. 제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 엑소솜은 (a) 예를 들어 <100 kDa의 단백질을 포함하는 바와 같은 >100 kDa 분자량의 복합체; (b) 예를 들어 <300 kDa의 단백질을 포함하는 바와 같은 >300 kDa 분자량의 복합체; 또는 (c) >1000 kDa 분자량의 복합체를 포함함을 특징으로 하는 엑소솜
  5. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소솜은 예를 들어 0.2 μM 필터에 대한 여과 및 10 kDa의 분자량 차단을 지닌 멤브레인에 대한 농축에 의해 측정시 50 nm 내지 150 nm의 크기 또는 50 nm 내지 100 nm의 크기와 같은 2 nm 내지 200 nm의 크기, 또는 예를 들어 레이저 회절 또는 역동적 광 산란에 의해 측정시 약 30 nm 내지 약 70 nm와 같은 100 nm 이하, 약 50 nm와 같은 약 45 nm 내지 약 55 nm와 같은 약 40 nm 내지 약 60 nm의 유체역학 반경을 지님을 특징으로 하는 엑소솜
  6. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소솜은 인지질, 포스파티딜 세린, 포스파티딜 이노시톨, 포스파티딜 콜린, 신고마이엘린, 세라마이드, 당지질, 세레브로사이드, 스테로이드, 콜레스테롤로 구성된 군에서 선택된 지질을 포함하고, 콜레스테롤-인지질 비율은 0.3∼0.4(몰/몰) 이상임을 특징으로 하는 엑소솜
  7. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소솜은 지질 뗏목(lipid raft)을 포함하거나, 상기 엑소솜은 비-이온성 세정제, 바람직하게는 Triton-X 100 내에서 불용성이거나, 상기 엑소솜은 엑소솜이 비-이온성 세정제로 처리시 제 4항에 명기된 분자량의 단백질이 상기 항에 명기된 분자량의 복합체 내에 실질적으로 잔존하거나, 상기 엑소솜은 사이클로덱스트린, 바람직하게는 20 mM 사이클로덱스트린에 민감성이어서 사이클로덱스트린으로의 처리가 제 4항에 명기된 복합체의 실질적인 용해를 유발함을 특징으로 하는 엑소솜
  8. 상기 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소솜은 리보핵산(RNA)을 포함하고, 바람직하게는 상기 엑소솜은 1.9의 흡광 비율(260:280 nm)을 지니거나 상기 엑소솜은 CD9, CD109 및 thy-1로 구성된 군에서 선택된 표면 항원을 포함함을 특징으로 하는 엑소솜
  9. 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)에서 엑소솜을 분리하는 단계를 포함하고, 분자량, 크기, 형태, 조성물 또는 생물학적 활성을 기반으로 다른 구성성분에서 엑소솜을 분리하는 단계를 선택적으로 포함하는 상기 항 중 어느 한 항에 따른 엑소솜의 생성 방법에 있어서, 상기 중량은 제 4항에 나타난 중량에서 선택되거나 상기 크기는 제 5항에 나타난 크기에서 선택되거나 상기 조성물은 제 6항에 상기 나타난 조성물에서 선택되거나 상기 생물학적 활성은 제 1항 또는 제 2항에 나타난 생물학적 활성에서 선택됨을 특징으로 하는 엑소솜의 생성 방법
  10. (a) 중간엽 줄기세포 조절 배지(MSC-CM)를 수득하는 단계;
    (b) 예를 들어 > 1000 kDa 멤브레인에 대한 초미세여과법에 의해 상기 중간엽 줄기세포 조절 배지를 농축하는 단계;
    (c) TSK Guard 컬럼 SWXL, 6 x 40 nm 또는 TSK 겔 G4000 SWXL, 7.8 x 300 nm 컬림이 이용하여 상기 농축된 중간엽 줄기세포 조절 배지를 크기 배제 크로마토그래피 수행하는 단계; 및
    (d) 예를 들어 준-탄성 광 산란(QELS) 검출기에 의해 검출된 역동적 광 산란을 나타내는 220 nm에서의 UV 흡광 분획을 선택하는 단계를 포함하는
    제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 따른 엑소솜의 생성 방법에 있어서,
    상기 단계 (d)는 12분과 같은 11∼13분의 정체 시간으로 용출되는 분획을 수집하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 엑소솜의 생성 방법
  11. 약제학적으로 허용 가능한 부형제, 희석제 또는 담체와 함께 상기 항 중 어는 한 항에 따른 엑소솜을 포함한 약제학적 조성물
  12. 질환의 치료 방법에 사용하기 위한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 엑소솜 또는 제 11항에 따른 약제학적 조성물
  13. 질환의 치료를 위한 약제학적 조성물의 제조 또는 개체 내 질환의 치료 방법을 위한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 엑소솜의 용도
  14. 제 12항 또는 제 13에 있어서, 상기 질환은 심부전, 골수 질환, 피부 질환, 화상 및 당뇨병, 알츠하이머병, 파킨스병과 같은 퇴행성 질환 및 암, 심근경색증, 피부 상처, 피부병, 피부 병변, 피부염, 건선, 콘딜로마, 사마귀, 혈관종, 흉터종, 피부암, 아토피 피부염, 베체트병, 만성 육아종병, 피부 T 세포 림프종, 궤양, 섬유증 및 기능 상실, 신장 허혈성 손상, 결정성 섬유증, 동염 및 비염을 포함한 만성 조직 개편을 유발하는 염증 및 면역 조절곤란을 유도하는 초기 손상을 특징으로 하는 병리학적 이상 또는 정형외과 질환으로 구성된 군에서 선택됨을 특징으로 하는 엑소솜 또는 용도
  15. 개체 내 상처 치유, 흉터 감소, 골형성, 골이식 또는 골수 이식의 원조 또는(ⅰ) 하기 중 하나 이상에서 선택된 경로의 조절: Rho GTPase에 의한 세포골격 조절, 세포주기, 인테그린 신호전달 경로, 케모카인 & 사이토카인 신호전달 경로에 의해 매개되는 염증, FGF 신호전달 경로, EGF 수용체 신호전달, 경로 혈관형성, 플라스미노겐 활성화 연쇄반응, 혈액 응고, 해당작용, 유비퀴틴 프로테아솜 경로, 드 노보 퓨린 생합성, TCA 사이클, 페닐알라닌 생합성, 헴 생합성; (ⅱ) 하기 중 하나 이상을 포함하는 과정의 조절: 세포 구조 및 운동성, 세포 구조, 세포 커뮤니케이션, 세포 운동성, 세포 부착, 세포내이입, 유사분열, 세포외배출, 세포질분열, 세포주기, 면역 및 방어, 사이토카인/케모카인 매개 면역, 대식세포-매개 면역, 과립구-매개 면역, 리간드-매개 신호전달, 사이토카인 및 케모카인 매개 신호전달 경로, 신호 전달, 세포외 매트릭스 단백질-매개 신호전달, 성장 인자 항상성, 수용체 단백질 티로신 키나제 신호전달 경로, 세포 부착-매개 신호전달, 세포 표면 수용체 매개 신호 전달, JAK-STAT 연쇄반응, 항산화 및 유리 라디칼 제거, 항상성, 스트레스 반응, 혈액 응고, 발생 과정, 중배엽 발달, 골격 발달, 혈관형성, 근육 발달, 근육 수축, 단백질 대사 및 변형, 단백질분해, 단백질 접힘, 단백질 복합체 조립, 아미노산 활성화, 세포내 단백질 통행, 다른 단백질 타겟팅 및 국소화, 아미노산 대사, 단백질 생합성, 단백질 이황화물-이소머라제 반응, 탄수화물 대자, 해당작용, 펜토스-인산염 션트(shunt), 다른 다당류 대사, 퓨린 대사, 인산염 대사 조절, 비타민 대사, 아미노산 생합성, 전-mRNA 처리, 번역 조절, mRNA 스플라이싱; 또는 (ⅲ) 하기 중 하나 이상을 포함한 기능 공급: 신호전달 분자, 케모카인, 성장인자, 사이토카인, 인터류킨, 또다른 사이토카인, 세포외 매트릭스, 세포외 매트릭스 구조 단백질, 또다른 세포외 매트릭스, 세포외 매트릭스 당단백질, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 또다른 프로테아제, 프로테아제 저해제, 메탈로프로테아제 저해제, 세린 프로테아제 저해제, 산화환원효소, 탈수소효소, 과산화효소, 샤페론, 샤페로닌, Hsp 70 패밀리 샤페론, 또다른 샤페론, 합성효소, 신타제 및 신테타제, 선택 칼슘 결합 단백질, 아미노아실-tRNA 신테타제, 분해효소, 이소머라제, 또다른 이소머라제, ATP 신타제, 수화효소, 아미노전이효소, 또다른 분해효소, 또다른 효소 조절제, 선택 조절 분자, 액틴 결합 세포골격 단백질, 세포골격 단백질, 비-종양 액틴 결합 단백질, 액틴 및 액틴 관련 단백질, 아넥신, 튜불린, 세포 부착 분자, 액틴 결합 모터 단백질, 중간 필라멘트, 리보핵산단백질, 리보솜 단백질, 번역 인자, 또다른 RNA-결합 단백질, 히스톤, 칼모듈린 관련 단백질, 소포 외피 단백질
    을 위한 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 엑소솜의 용도
  16. 엑소솜을 타겟에 전달하도록 실시 가능한 디스펜서와 함께 엑소솜 공급원을 포함하는 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 따른 엑소솜의 전달을 위한 전달 시스템
  17. 엑소솜을 타겟에 전달하는 방법에 있어서 제 16항에 따른 전달 시스템의 용도
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