KR102606101B1 - 트레프로스티닐에 의한 msc 면역조절 특성의 향상 - Google Patents

트레프로스티닐에 의한 msc 면역조절 특성의 향상 Download PDF

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Abstract

중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)(MSC), 또는 MSC와 접촉되었으며 MSC의 1 이상의 성분을 포함하는 배양 배지의 일부, 또는 MSC로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 조성물을, 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는, 혈관병증을 치료 또는 예방하는 방법이 제공된다. 이러한 치료를 위해 적합한 약학 조성물이 또한 제공된다.

Description

트레프로스티닐에 의한 MSC 면역조절 특성의 향상
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함되는 2016년 10월 24일자로 출원된 미국 가특허출원 제62/411,950호를 우선권으로 주장한다.
배경
본 출원은 항-염증 특성을 갖는 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell), 이러한 중간엽 줄기 세포를 제조하는 방법, 이러한 중간엽 줄기 세포로부터 얻어진 물질, 혈관병증의 치료에서 중간엽 줄기 세포 및 중간엽 줄기 세포로부터 얻어진 물질의 용도에 관한 것이다. 혈관병증은, 비제한적으로, 폐동맥 고혈압(pulmonary arterial hypertension)(PAH), 다른 유형의 폐고혈압, 말초 혈관 질환(peripheral vascular disease)(PVD), 중증 하지 허혈(critical limb ischemia)(CLI), 관상 동맥 질환, 및 당뇨병성 혈관병증을 포함한다.
폐고혈압은 폐 혈관에 영향을 미치는 희귀하고, 진행성이며, 생명을 위협하는 질환이다. 구체적으로, 폐고혈압(PH)은 폐 혈관에서의 압력 증가를 야기하며, 이는 다른 결과들 중 심부전을 초래할 수 있다. 현재, 폐고혈압은 세계 보건 기구(World Health Organization)(WHO) 임상 분류 시스템(Dana Point 2008) 하에서 다음 그룹으로 분류된다:
그룹 1: 폐동맥 고혈압(PAH);
그룹 1': 폐 정맥폐색성 질환(Pulmonary veno-occlusive disease)(PVOD) 및/또는 폐 모세혈관 혈관종증(pulmonary capillary haemangiomatosis)(PCH)
그룹 2: 좌심 질환으로 인한 폐고혈압;
그룹 3: 폐질환 및/또는 저산소증으로 인한 폐고혈압;
그룹 4: 만성 혈전색전성 폐고혈압(Chronic thromboembolic pulmonary hypertension)(CTEPH); 및
그룹 5: 불확실한 다인성 메커니즘을 갖는 PH.
폐동맥 고혈압은 특정 유형의 폐고혈압이며, 미치료시, 진단 후 평균적으로 2.8 내지 5 년 이내에 사망을 야기한다(Keily et al. (2013) BMJ 346:f2028). 폐순환의 협착 증가는 우심에 대한 스트레스 증가를 야기하며, 이는 우심부전으로 될 수 있다. 정의상, 만성 폐고혈압의 경우에 평균 폐동맥압(mean pulmonary arterial pressure)(mPAP)은 휴식시 >25 mmHg 또는 운동 중 >30 mmHg(정상 값 <20 mmHg)이다. 폐동맥 고혈압의 병태생리는 혈관수축 및 폐 혈관의 재구축을 특징으로 한다. 만성 PAH에서는, 초기에 근육이 형성되지 않은 폐 혈관의 신근육형성(neomuscularization)이 있으며, 이미 근육이 형성된 혈관의 혈관 근육은 원주가 증가한다. 폐동맥압에서의 이러한 증가는 우심에 대한 점진적 스트레스를 야기하고, 이는 우심으로부터의 박출 감소를 초래하며, 결국 우심부전으로 종결된다(M. Humbert et al., J. Am. Coll. Cardiol. 2004, 43, 13S-24S). PAH는 100만명 당 1-2명의 유병률을 갖는 희귀성 장애이다. 환자의 평균 연령은 36 세인 것으로 추산되었으며, 환자 중 10%만이 60 세의 연령을 초과하였다. 남성에 비해 여성이 분명히 많이 영향을 받는다(G. E. D'Alonzo et al., Ann. Intern. Med. 1991, 115, 343-349).
시중에서 이용가능한 표준 요법(예를 들어, 프로스타사이클린 유사체, 엔도텔린 수용체 길항제, 포스포디에스테라제 억제제)은 환자의 삶의 질 및 운동 부하를 개선할 수 있다. 이들 의약은 심각한 부작용을 야기할 수 있고/있거나 복잡한 유형의 투여법을 사용하여 전달되어야 한다. 환자는 흔히 처음부터 또는 단일요법 후 병태에서의 악화 이후에 병용 요법을 받는다. 치료에서의 진전에도 불구하고, PAH에 대한 치유는 없다.
따라서, PAH를 포함하여 혈관병증을 치료하기 위한 개선된 치료 조성물 및 방법을 개발할 필요성이 존재한다.
요약
일 양태에서, 본 발명은 (i) 중간엽 줄기 세포(MSC), 또는 (ii) MSC와 접촉되었으며 MSC의 1 이상의 성분을 포함하는 배양 배지의 일부, 또는 (iii) MSC로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, MSC가 생체외(ex vivo)에서 프로스타사이클린에 노출되었으며, 프로스타사이클린에 대한 노출이 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC와 비교하여, MSC에서 1 이상의 항-염증성 인자의 발현을 증가시키고/시키거나 1 이상의 전-염증성 인자의 발현을 감소시키는, 혈관병증을 치료 또는 예방하는 방법을 제공한다.
일부 실시양태에서, 투여 전에, MSC는 0.3 ㎍/mL 내지 83.3 ㎍/mL의 프로스타사이클린에 노출된다. 다른 실시양태에서, 투여 전에, MSC는 0.3 ㎍/mL 내지 10 ㎍/mL의 프로스타사이클린에 노출된다.
일부 실시양태에서, 프로스타사이클린은 트레프로스티닐, 이의 유도체 또는 약학적 허용 염이다.
일부 실시양태에서, MSC는 프로스타사이클린에 적어도 24 시간 동안 노출된다. 다른 실시양태에서, MSC는 프로스타사이클린에 적어도 48 시간 동안 노출된다.
일부 실시양태에서, 치료되는 혈관병증은 폐동맥 고혈압(PAH), 말초 혈관 질환(PVD), 중증 하지 허혈(CLI), 관상 동맥 질환 및 당뇨병성 혈관병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, MSC는 증식 후 프로스타사이클린에 노출된다.
일부 실시양태에서, 프로스타사이클린에 노출된 MSC는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC와 비교하여, 종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis factor alpha)(TNFα)의 감소된 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 프로스타사이클린에 노출된 MSC는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC와 비교하여, 인터류킨-4(IL-4)의 감소된 발현 수준을 갖는다.
다른 실시양태에서, 프로스타사이클린에 노출된 MSC는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC와 비교하여, IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA 및 TGFβ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 항-염증성 인자의 증가된 발현 수준을 갖는다.
일부 실시양태에서, 프로스타사이클린에 노출된 MSC는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC에 비해 적어도 50% 낮은 TNFα의 발현 수준을 갖는다. 다른 실시양태에서, 프로스타사이클린에 노출된 MSC는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC에 비해 적어도 50% 높은 IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA 및 TGFβ 중 적어도 하나의 발현 수준을 갖는다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 MSC를 포함하는 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, MSC는 생체외에서 0.3 내지 10 ㎍/mL 농도의 트레프로스티닐 또는 이의 약학적 허용 염에 적어도 24 시간 동안 노출되었다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 MSC와 접촉되었으며, MSC의 1 이상의 성분을 포함하는 배양 배지의 일부를 포함하는 조성물을 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, MSC는 생체외에서 0.3 내지 10 ㎍/mL 농도의 트레프로스티닐 또는 이의 약학적 허용 염에 적어도 24 시간 동안 노출되었고, MSC의 적어도 1 이상의 성분은 엑소좀, 미세소포(microvesicle), 마이크로RNA, 메신저 RNA, 비-코딩(non-coding) RNA, 미토콘드리아, 성장 인자, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 본 발명의 방법은 MSC로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 조성물을 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하되, MSC는 생체외에서 0.3 내지 10 ㎍/mL 농도의 트레프로스티닐 또는 이의 약학적 허용 염에 적어도 24 시간 동안 노출되었다.
일부 실시양태에서, MSC는 0.3 ㎍/mL 내지 10 ㎍/mL의 농도를 갖는 트레프로스티닐 또는 이의 약학적 허용 염에 적어도 24 시간 동안 노출된다.
또한, MSC를 생체외에서 프로스타사이클린에 노출시키되, 프로스타사이클린에 대한 노출이 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC와 비교하여, MSC에서 1 이상의 항-염증성 인자의 발현을 증가시키고/시키거나 1 이상의 전-염증성 인자의 발현을 감소시키는 것; 및 MSC 또는 배양 배지 또는 MSC의 1 이상의 성분을 단리시키는 것을 포함하는, 중간엽 줄기 세포(MSC), 또는 MSC와 접촉되었으며 MSC의 1 이상의 성분을 포함하는 배양 배지를 포함하는 조성물을 제조하기 위한 방법이 제공된다.
일부 실시양태에서, 상기 방법은 MSC를 0.3 ㎍/mL 내지 50 ㎍/mL의 프로스타사이클린으로 처치하는 것을 포함한다. 다른 실시양태에서, 상기 방법은 MSC를 0.3 ㎍/mL 내지 10 ㎍/mL의 프로스타사이클린에 노출시키는 것을 포함한다.
일부 실시양태에서, 프로스타사이클린은 트레프로스티닐, 이의 유도체 또는 염이다. 일부 실시양태에서, MSC는 프로스타사이클린에 적어도 24 시간 동안 노출된다. 다른 실시양태에서, MSC는 프로스타사이클린에 적어도 48 시간 동안 노출된다.
일부 실시양태에서, MSC는 증식 후 프로스타사이클린에 노출된다.
일부 실시양태에서, 프로스타사이클린에 노출된 MSC는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC와 비교하여, TNFα의 감소된 발현 수준을 갖는다. 다른 실시양태에서, 프로스타사이클린에 노출된 MSC는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC와 비교하여, IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA 및 TGFβ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 항-염증성 인자의 증가된 발현 수준을 갖는다.
일부 실시양태에서, 프로스타사이클린에 노출된 MSC는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC에 비해 적어도 50% 낮은 TNFα의 발현 수준을 갖는다. 다른 실시양태에서, 프로스타사이클린에 노출된 MSC는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC에 비해 적어도 50% 높은 IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA 및 TGFβ 중 적어도 하나의 발현 수준을 갖는다.
일부 실시양태에서, MSC의 1 이상의 성분은 엑소좀, 미세소포, 마이크로RNA, 메신저 RNA, 비-코딩 RNA, 미토콘드리아, 성장 인자, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, MSC는 0.3 ㎍/mL 내지 10 ㎍/mL의 농도를 갖는 트레프로스티닐 또는 이의 염에 적어도 24 시간 동안 노출된다.
일부 실시양태에서, 방법은 배양 배지로부터 엑소좀을 단리시키는 것을 추가로 포함한다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 트레프로스티닐에 노출된 MSC를 포함하는 조성물이 제공된다. 일부 실시양태에서, 조성물에서 적어도 50%의 MSC는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC에 비해 적어도 50% 낮은 TGFα의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물에서 적어도 50%의 MSC는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC에 비해 적어도 50% 높은 IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA 및 TGFβ 중 적어도 하나의 발현 수준을 갖는다.
또한, 본 발명의 방법에 의해 얻어진 단리된 엑소좀을 포함하는 조성물이 제공된다.
일부 실시양태에서, 조성물은 적어도 하나의 약학적 허용 담체를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 이러한 조성물은 혈관병증을 치료 또는 예방하기 위한 적어도 하나의 추가 치료제를 추가로 포함한다. 일부 실시양태에서, 추가 치료제는 NO 자극제(예를 들어, PDE5 억제제, 예컨대 타다라필(Adcirca) 및 가용성 구아닐산 고리화효소 자극제(Soluble guanylate cyclase stimulator)(Pro-SGC)), 엔도텔린 수용체 길항제, 및 다른 프로스타사이클린으로 이루어진 그룹으로부터 선택될 수 있다.
예시를 나타낼 뿐이며 제한이 아닌 도면이 본 발명의 실시양태로서 제공된다.
도 1은 인간 골수-유래된 MSC의 면역표현형 분석의 결과를 나타낸다.
도 2는 배양 중 상이한 농도의 트레프로스티닐에 48 시간 동안 노출된 MSC의 대표적 영상을 제공한다.
도 3a 및 3b는 트레프로스티닐의 MSC 염증에 대한 노출 효과를 나타낸다. 도 3(a)는 생체내(in vivo) 만성 저산소증 하에서, TNFα의 순환 수준이 대조군과 비교하여 48% 증가하였음을 나타낸다. 도 3(b)는 시험관내(in vitro)에서 83.3 ㎍/mL 내지 0.3 ㎍/mL 투여량의 트레프로스티닐 노출이 MSC에서 전-염증성 사이토카인 TNFα의 발현을 감소시켰음을 나타낸다.
도 4는 트레프로스티닐 노출이 항-염증성 인자 IL 10 및 IL 13의 발현 수준을 증가시켰음을 나타낸다.
도 5는 트레프로스티닐 노출이 항-염증성 인자 IDO1, iNOS, HLA, 및 TGFβ의 발현 수준을 증가시켰음을 나타낸다.
도 6은 9.3 ㎍/mL의 트레프로스티닐에 대한 노출의 면역조절 효과의 요약을 나타낸다.
도 7은 MSC 상 트레프로스티닐 노출의 MSC에 대한 면역조절 효과에 대한 잠재적 모델을 나타낸다. 특히, 트레프로스티닐 노출은 세포내(1) 또는 핵 시그널링(2, 3, 4)을 통해 전-염증성 사이토카인 발현을 감소시켰으며, 항-염증성 사이토카인 발현을 증가시켰다.
상세한 설명
중간엽 줄기 세포(MSC)를 비교적 저농도의 프로스타사이클린, 예컨대 트레프로스티닐에 노출시키는 것은 항-염증성 표현형을 부여한다. MSC를 저농도의 프로스타사이클린에 노출시키는 것에 의해, MSC의 치료능이 이들의 고유한 유전자 발현 패턴을 기본으로 하여 향상된다.
고농도의 트레프로스티닐, 예를 들어 250 ㎍/mL에 노출된 MSC는 MSC에서 혈관신생을 촉진하는 인자의 발현을 향상시켰다. 그러나, 고농도의 트레프로스티닐에 MSC를 노출시키는 것은 또한 전-염증성 인자의 발현을 촉진시켰으며, 이는 일부 경우에 PAH 치료에 바람직하지 않을 수 있고, 또한 세포 생존력에 악영향을 미칠 수 있다. 본 발명자들은 저농도 프로스타사이클린 노출(예를 들어, 10 ㎍/mL의 트레프로스티닐)이 본원에 기재된 바와 같이 MSC에서 전-염증성 인자의 발현을 감소시키고 항-염증성 인자의 발현을 증가시킨다는 것을 예기치 않게 발견하였다. 예를 들어, MSC를 저농도의 트레프로스티닐에 노출시키는 것은 트레프로스티닐에 노출된 MSC에서 TNFα의 발현을 상당히 감소시켰으며 IL-10 및 IL-13의 발현을 상당히 증가시켰다. MSC를 저농도의 트레프로스티닐에 노출시키는 것은 또한 다른 항-염증성 인자, 예컨대 IDO, iNOS, HLA, 및 TGFβ의 발현을 증가시켰다.
본원에 기재된 바와 같은 프로스타사이클린에 노출된 MSC 및 이러한 MSC의 산물은 치료제로서 적용될 수 있다. 예를 들어, MSC는 환자에 투여되기 전에 저농도의 프로스타사이클린에 노출시키는 것에 의해 항-염증성이 되도록 프라이밍(primed)될 수 있다. 다른 예로서, 적절한 농도의 프로스타사이클린, 예컨대 트레프로스티닐로 처치된 MSC로부터의 엑소좀은 혈관병증, 예컨대 PAH를 치료하기 위해 투여될 수 있다. 본 발명은 MSC-분비된 시그널, 예컨대 치료제로서 사용될 수 있는 펩티드 및 소포를 변경시키거나 향상시키는 바이오프로세스(bioprocess) 단계에서 사용될 수 있다는 것이 추가로 고려된다.
A. 정의
달리 명시되지 않는 경우, "하나" 또는 "한"은 "1 이상"을 의미한다.
구체적으로 달리 정의되지 않는 경우, 본원에 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 당업자(예를 들어, 줄기 세포 생물학, 세포 배양, 분자 유전학, 면역학, 면역조직화학, 단백질 화학, 및 생화학에서)에 의해 일반적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는 것으로 받아들여진다.
달리 나타내지 않는 한, 본 발명에서 사용된 재조합 단백질, 세포 배양, 및 면역학적 기술은 당업자에게 잘 알려진 표준 절차이다. 이러한 기술은 J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991), D. M. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 및 1996), 및 F. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, 현재까지 모든 업데이트를 포함함), Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), 및 J. E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (현재까지 모든 업데이트를 포함함)와 같은 자료에서의 문헌에 걸쳐 기재 및 설명되어 있으며, 이들은 본원에 참고문헌으로 포함된다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "대상체"(본원에서 "환자"로서도 지칭됨)는 온혈 동물, 바람직하게는 인간을 비롯한 포유동물을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 대상체는 영장류이다. 더욱 더 바람직한 실시양태에서, 대상체는 인간이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는", "치료하다" 또는 "치료"는, 질환 또는 병태가 "치유" 되거나 "고쳐지는" 것으로 고려되건 아니건, 및 모든 증상이 해결되건 아니건, 질환 또는 병태 또는 이의 1 이상의 증상을 제거, 개선, 완화, 또는 약화시키는 것을 포함한다. 상기 용어는 또한 질환 또는 병태 또는 이의 1 이상의 증상의 진행을 감소 또는 예방하는 것, 질환 또는 병태 또는 이의 1 이상의 증상의 기본 메커니즘을 지연 또는 예방하는 것, 및 임의의 치료적 및/또는 예방적 이득을 달성하는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "예방하는", "예방하다" 또는 "예방"은 미처치된 대조군 샘플에 비해 질환 또는 병태 또는 이의 1 이상의 증상의 발생을 감소시키는 것, 또는 미처치된 대조군 샘플에 비해 질환 또는 병태의 1 이상의 증상의 개시를 지연시키는 것을 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전-염증성 인자"는 일반적으로 염증 과정을 촉진시키거나 이와 달리 염증 과정과 양성적으로 연관된 분자를 지칭한다. 전-염증성 인자는, 비제한적으로, 전-염증성 사이토카인을 포함한다. 전-염증성 인자는 종양 괴사 인자 알파(TNFα), 인터류킨 1(IL-1), 인터류킨 6(IL-6), 인터류킨 21(IL-21), 단핵구 화학주성인자 단백질(Monocyte Chemoattractant Protein)-1(MCP1), 및 단핵구 화학주성인자 단백질-5(MCP-5)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항-염증성 인자"는 일반적으로 염증 과정을 억제하거나 이와 달리 항-염증 과정과 양성적으로 연관된 분자를 지칭한다. 항-염증성 인자는, 비제한적으로, 항-염증성 사이토카인을 포함한다. 항-염증성 인자는 인터류킨 10(IL 10), 인터류킨 13(IL13), IDO, iNOS, HLA, 및 TGFβ를 포함한다.
B. 혈관병증
혈관병증은, 비제한적으로, 폐동맥 고혈압(PAH)을 포함한 폐고혈압, 말초 혈관 질환(PVD), 중증 하지 허혈(CLI), 관상 동맥 질환, 및 당뇨병성 혈관병증을 포함한다.
많은 원인 및 조건이 PAH와 연관된 것으로 밝혀졌으나, 이들 중 다수는 일반적으로 몇몇 근본적인 병태생리학적 특징을 공유한다. 이들 과정 중에서 하나의 중요한 특징은 혈관 탄력을 조절하고 혈병 형성을 보수 및 억제하는 다수의 물질의 생산 및 물질대사를 일반적으로 담당하는 모든 혈관 벽의 내피, 내부 세포층의 기능장애이다. PAH의 환경에서, 내피 기능장애는 유해한 물질의 과잉 생산 및 보호 물질의 생산 손상을 야기할 수 있다. 이것이 PAH의 발달에서 주된 사건이거나 후속 캐스캐이드의 일부가 알려지지 않은채 남아있던지 간에, 어느 경우에도 이는 질환을 특징짓는 진행성 혈관수축 및 혈관 증식에서 중요한 인자이다.
용어 말초 혈관 질환(PVD)은 말초 동맥 및 정맥 내의 손상, 기능장애 또는 방해를 지칭한다. 말초 동맥 질환은 PVD의 가장 일반적인 형태이다. 말초 혈관 질환은 동맥의 가장 일반적인 질환이며 미국에서 매우 일반적인 병태이다. 이는 대부분 50 세를 초과하는 사람들에서 발생한다. 말초 혈관 질환은 50 세를 초과하는 사람들뿐 아니라, 당뇨병이 있는 사람들에서 장애의 주요 원인이다. 미국에서 약 1000만명의 사람들이 말초 혈관 질환을 갖고 있으며, 이는 50 세를 초과하는 사람들의 약 5%로 해석된다. 상기 병태가 있는 사람들의 수는 인구 노화에 따라 증가할 것으로 예상된다. 남성은 여성에 비해 약간 더 말초 혈관 질환을 가질 수 있다.
후기 말초 동맥 폐색으로 인한 중증 하지 허혈(CLI)은 휴식시 혈류 및 산소 전달 감소가 특징이며, 휴식시 근육통 및 미-치유성 피부 궤양 또는 괴저를 야기한다(Rissanen et al., Eur. J. Clin. Invest. 31:651-666 (2001); Dormandy and Rutherford, J. Vasc. Surg. 31:S1-S296 (2000)). 중증 하지 허혈은 1 년에 100만명 당 500 내지 1000명 발생하는 것으로 추산된다("Second European Consensus Document on Chronic Critical Leg Ischemia", Circulation 84(4 Suppl.) IV 1-26 (1991)). 중증 하지 허혈이 있는 환자에서, 절단은 이의 연관 이환율, 사망률 및 기능적 영향에도 불구하고, 보통 장애 증상에 대한 해결책으로서 권고된다(M. R. Tyrrell et al., Br. J. Surg. 80: 177-180 (1993); M. Eneroth et al., Int. Orthop. 16: 383-387 (1992)). 중증 하지 허혈에 대한 최적의 의학 요법은 존재하지 않는다(Circulation 84(4 Suppl.): IV 1-26 (1991)).
관상 동맥 질환(죽상동맥경화증)은 1 이상의 관상 동맥이 경화반의 생성을 통해 점차 폐색되는 인간에서의 진행성 질환이다. 이 질환을 갖는 환자의 관상 동맥은 보통 풍선 혈관성형 또는 스텐트의 삽입에 의해 치료되어, 부분적으로 폐색된 동맥을 개방한다. 궁극적으로, 이들 환자는 큰 비용 및 위험의 관상 동맥 우회로 수술을 받을 필요가 있다.
C. 중간엽 줄기 세포(MSC)
중간엽 줄기 세포(MSC)는 골수, 혈액, 치수(dental pulp) 세포, 지방 조직, 피부, 비장, 췌장, 뇌, 신장, 간, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 창자, 폐, 림프절, 흉선, 뼈, 인대, 힘줄, 골격근, 피부, 및 뼈막에서 발견되는 세포이다. MSC는 상이한 생식 계열, 예컨대 중배엽, 내배엽, 및 외배엽으로 분화할 수 있다. 따라서, MSC는, 비제한적으로, 지방, 뼈, 연골, 탄성, 근육, 및 섬유 결합 조직을 포함한 다수의 세포 유형으로 분화할 수 있다. MSC에 의해 도입된 특정 계통-결정 및 분화 경로는 기계적 영향 및/또는 내인성 생활성(bioactive) 인자, 예컨대 성장 인자, 사이토카인, 및/또는 숙주 조직에 의해 수립된 국소 미세환경 조건을 포함한 다양한 영향에 의존한다. 따라서, MSC는 분화하여 결국 비가역적으로 분화하여 표현형 세포를 생산할 줄기 세포 또는 전구 세포인 딸 세포를 생산하는 비-조혈 기원세포이다. MSC의 예는 중간엽 전구 세포(mesenchymal precursor cell)(MPC)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "줄기 세포"는 표현형으로 및 유전자형으로 동일한 딸 세포뿐 아니라 적어도 하나의 다른 최종 세포 유형(예를 들어, 말단 분화된 세포)를 발생시킬 수 있는 자가-재생 세포를 지칭한다. 용어 "줄기 세포"는 전능성, 다능성(pluripotential), 다분화성(multipotential) 세포뿐 아니라, 이의 분화로 유래된 기원세포(progenitor cell) 및/또는 전구 세포(precursor cell)를 포함한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "전능 세포" 또는 "전능성 세포"는 완전 배아(예를 들어, 배반포)를 형성할 수 있는 세포를 지칭한다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다능 세포" 또는 "다능성 세포"는 완전 분화 다재성, 즉 임의의 포유동물 신체의 대략 260 개 세포 유형으로 성장하는 능력을 갖는 세포를 지칭한다. 다능 세포는 자가-재생할 수 있으며, 조직 내에서 휴면기 또는 휴지기를 유지할 수 있다.
용어 "다분화성 세포" 또는 "다분화 세포"는 임의의 몇몇 성숙한 세포 유형을 발생시킬 수 있는 세포를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 이 단계는 성체 또는 배아 줄기 세포 및 기원세포, 및 이들 세포의 다분화성 자손을 포함한다. 다능 세포와 달리, 다분화 세포는 모든 세포 유형을 형성하는 능력을 갖지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "기원세포" 또는 "전구 세포"는 특정 유형의 세포로 분화하거나 특정 유형의 조직을 형성하도록 결정된 세포를 지칭한다.
일 실시양태에서, 세포는 대상체로부터 얻어진 샘플로부터 농축된다. 용어 "농축된", "농축", 및 이의 변형은 본원에서 하나의 특별한 세포 유형의 비율 또는 다수의 특별한 세포 유형의 비율이 미처치 집단과 비교하였을 때 증가된 세포의 집단을 기재하기 위해 사용된다.
일 실시양태에서, 본 발명에서 사용된 세포는 TNAP+, STRO-1+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ 또는 이의 임의의 조합이다.
주어진 마커에 대한 세포 "양성"(또한 "+")에 대한 참조는 마커가 세포 표면 상에 존재하는 정도에 따른 상기 마커의 낮거나(lo 또는 dim) 높은(bright, bri) 발현인자일 수 있음을 의미하되, 상기 용어는 세포의 색 분류 과정에 사용된 형광 또는 다른 색의 강도와 관련된다. lo(또는 dim 또는 dull) 및 bri의 구별은 분류되는 특별한 세포 집단에 대해 사용된 마커의 맥락에서 이해될 것이다. 주어진 마커에 대해 "음성"(또는 "-")인 것으로서의 세포에 대한 참조는 마커가 상기 세포에 의해 전혀 발현되지 않았음을 의미하는 것은 아니다. 이는 마커가 상기 세포에 의해 상대적으로 매우 낮은 수준으로 발현되고, 이는 검출가능하게 표지될 때 매우 낮은 신호를 생성함을 의미한다. 일부 실시양태에서, "음성"은 일부 방식, 예컨대 프로스타사이클린에 대한 노출로 처치되었던 세포에서 존재하지 않거나 감소된 양으로 존재하는 마커를 지칭할 수 있다. 일부 실시양태에서, "음성"은 비노출 대조군 샘플과 비교하였을 때 프로스타사이클린에 노출되었던 세포에서 적어도 50% 감소된 양으로 존재하는 마커를 지칭한다.
본원에서 사용될 때, 용어 "TNAP"는 조직 비-특이적 알칼리성 포스파타아제의 모든 이소형(isoform)을 포함하는 것으로 의도된다. 예를 들어, 상기 용어는 간 이소형(LAP), 뼈 이소형(BAP) 및 신장 이소형(KAP)을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, TNAP는 BAP이다. 특히 바람직한 실시양태에서, 본원에 사용된 바와 같은 TNAP는 부다페스트 조약(Budapest Treaty)의 규정 하에 수탁 번호 PTA-7282로 2005년 12월 19일에 ATCC에 기탁된 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 STRO-3 항체에 결합할 수 있는 분자를 지칭한다.
상기 방법에 유용한 줄기 세포는 성체 조직, 배아, 배아외 조직, 또는 태아로부터 유래될 수 있다. 용어 "성체"는 이의 광의적으로 사용되어, 출생후 대상체를 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 용어 "성체"는 사춘기 이후인 대상체를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "성체"는 또한 여성으로부터 얻은 제대혈을 포함할 수 있다.
일부 양태에서, 줄기 세포는 자손 세포(증식된 세포로 지칭될 수도 있음)일 수 있다. 자손 세포는 본원에 기재된 줄기 세포의 시험관내 배양으로부터 생산될 수 있다. 본 발명의 증식된 세포는 배양 조건(배양 배지 내의 자극 인자의 수 및/또는 유형을 포함함), 계대배양의 수 등에 따라 광범위한 표현형을 가질 수 있다. 특정 실시양태에서, 자손 세포는 부모 집단으로부터 약 2, 약 3, 약 4, 약 5, 약 6, 약 7, 약 8, 약 9, 또는 약 10 회 계대배양 후 얻어진다. 그러나, 자손 세포는 부모 집단으로부터 임의의 수의 계대배양 후에 얻어질 수 있다. 또한, 자손 세포는 적합한 배양 배지에서 배양하는 것에 의해 얻어질 수 있다.
일 실시양태에서, 자손 세포는 STRO-3 항체로 표지된 자성 비드를 사용하여 골수로부터 TNAP+ 세포를 단리시키는 것에 의해 얻어지며, 20% 소태아혈청, 2 mM L-글루타민 및 100 μm L-아스코르베이트-2-포스페이트가 보충된 α-MEM에 플레이팅된다(plated).
일 실시양태에서, 이러한 증식된 세포(적어도 5 회 계대배양 후)는 TNAP-, CC9+, HLA 클래스 I+, HLA 클래스 II-, CD14-, CD19-; CD3-, CD11a-c-, CD31-, CD86- 및/또는 CD80-일 수 있다. 그러나, 상이한 마커의 발현은 배양 조건에 따라 달라질 가능성이 있다. 또한, 이들 표현형의 세포는 증식된 세포 집단에서 우세할 수 있는 한편, 이들 표현형(들)을 갖지 않는 작은 비율의 세포(예를 들어, 적은 퍼센트의 증식된 세포는 CC9-일 수 있음)가 존재할 수 있다. 일부 실시양태에서, 이들 세포는 증식된 세포 집단에 존재하는 세포의 총 수의 30%, 20%, 15%, 10%, 5%, 또는 1% 이하인 양으로 존재할 것이다. 하나의 바람직한 실시양태에서, 증식된 세포는 상이한 세포 유형으로 분화하는 능력을 갖는다.
일 실시양태에서, 증식된 세포 집단은 적어도 25%, 더욱 바람직하게는 적어도 50%의 세포가 CC9+인 세포를 포함한다.
다른 실시양태에서, 본 발명의 방법에서 사용된 증식된 세포 집단은 적어도 40%, 더욱 바람직하게는 적어도 45%의 세포가 STRO-1+인 세포를 포함한다.
추가 실시양태에서, 자손 세포는 LFA-3, THY-1, VCAM-1, PECAM-1, P-셀렉틴, L-셀렉틴, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD29, CD18, CD61, 인테그린 베타, 6-19, 트롬보모듈린, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, 렙틴-R, (STRO-2=렙틴-R), RANKL, STRO-1bright, CD146, 및 이들 마커의 임의의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 마커를 발현할 수 있다.
일 실시양태에서, 자손 세포는 WO 2006/032092호에 기재된 바와 같은 다분화성 증식된 MSC 자손 세포(MEMP)이다. 자손이 유래될 수 있는 MSC의 농축된 집단을 제조하기 위한 방법은 WO 01/04268호 및 WO 2004/085630호에 기재되어 있다. 시험관내 맥락에서, MSC는 절대 순수한 제제로서 드물게 존재할 것이며, 일반적으로 조직 특이적 분화학적 세포(tissue specific committed cell)(TSCC)인 다른 세포와 함께 존재할 것이다. WO 01/04268호는 골수로부터 이러한 세포를 약 0.1% 내지 90%의 순도 수준으로 수집하는 것을 언급한다. 자손이 유래되는 MSC를 포함하는 집단은 조직 공급원으로부터 직접 수집될 수 있거나, 대안적으로 이미 생체외(ex vivo)에서 증식된 집단일 수 있다.
예를 들어, 자손은 상당히 정제된 MSC의 수집되고, 비증식된 집단으로부터 얻을 수 있으며, 이들이 존재하는 집단의 총 세포 중 적어도 약 0.1, 1, 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 95%를 포함한다. 이 수준은 예를 들어, TNAP, STRO-1 bri, 3G5+, VCAM-1, THY-1, CD146 및 STRO-2로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 적어도 하나의 마커에 대해 양성인 세포를 선택하는 것에 의해 달성될 수 있다.
MSC 출발 집단은 WO 01/04268호 또는 WO 2004/085630호에 기재된 임의의 1 이상의 조직 유형, 소위 골수, 치수 세포, 지방 조직 및 피부로부터, 또는 아마도 더욱 광범위하게는 지방 조직, 치아, 치수, 피부, 간, 신장, 심장, 망막, 뇌, 모낭, 창자, 폐, 비장, 림프절, 흉선, 췌장, 뼈, 인대, 골수, 힘줄, 및 골격근으로부터 유래될 수 있다.
MEMP는 이들이 마커 STRO-1bri에 대해 양성이고 마커 알칼리성 포스파타아제(ALP)에 대해 음성인 점에서 새로 수집된 MSC와 구별될 수 있다. 반대로, 새로 단리된 MSC는 STRO-1bri 및 ALP 둘 다에 대해 양성이다. 본 발명의 바람직한 실시양태에서, 투여된 세포 중 적어도 15%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 95%는 표현형 STRO-1bri, ALP-를 갖는다. 추가 바람직한 실시양태에서, MEMP는 마커 Ki67, CD44 및/또는 CD49c/CD29, VLA-3, α3β1 중 1 이상에 대해 양성이다. 또 추가 바람직한 실시양태에서, MEMP는 TERT 활성을 나타내지 않고/않거나 마커 CD18에 대해 음성이다.
일 실시양태에서, 세포는 혈관병증이 있는 환자로부터 얻고, 배양 기간의 적어도 일부 동안 세포가 본원에 기재된 바와 같이 프로스타사이클린에 노출되는 표준 기술을 시용하여 시험관내에서 배양되며, 자가이식 또는 동종이계 이식으로서 환자에게 투여된다. 대안적 실시양태에서, 수립된 인간 세포주 중 1 이상의 세포가 사용된다. 본 발명의 다른 유용한 실시양태에서, 비-인간 동물(또는 환자가 인간이 아닌 경우, 다른 종으로부터)의 세포가 사용된다.
본 기술은, 비제한적으로, 비-인간 영장류 세포, 유제류, 개, 고양이, 토끼목, 설치류, 새, 및 어류 세포를 포함하여, 임의의 비-인간 동물 종으로부터의 세포를 사용하여 실시될 수 있다. 본 발명이 수행될 수 있는 영장류 세포는, 비제한적으로, 침팬지, 개코원숭이, 시노몰거스 원숭이, 및 임의의 다른 신세계 또는 구세계 원숭이의 세포를 포함한다. 본 발명이 수행될 수 있는 유제류 세포는, 비제한적으로, 소, 돼지, 양, 염소, 말, 버팔로 및 들소의 세포를 포함한다. 본 발명이 수행될 수 있는 설치류 세포는, 비제한적으로, 마우스, 래트, 기니피그, 햄스터 및 저빌(gerbil) 세포를 포함한다. 본 발명이 수행될 수 있는 토끼목 종의 예는 가축 토끼, 산토끼(jack rabbit), 야생토끼(hare), 솜꼬리토끼, 눈덧신 토끼, 및 새앙토끼를 포함한다. 닭(갈루스 갈루스(Gallus gallus))은 본 발명이 수행될 수 있는 조류 종의 예이다.
세포는 사용 전에 저장될 수 있다. 진핵 세포, 특히 포유동물 세포의 보존 및 저장을 위한 방법 및 프로토콜은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.). 단리된 줄기 세포, 예컨대 중간엽 줄기/기원세포, 또는 이의 자손의 생물학적 활성을 유지하는 임의의 방법이 본 발명과 관련되어 사용될 수 있다. 바람직한 일 실시양태에서, 세포는 냉동-보존을 사용하는 것에 의해 유지 및 저장된다.
세포는 다양한 기술을 사용하여 얻어질 수 있다. 예를 들어, 세포-항체 복합체와 연관된 특성을 참조하거나, 또는 항체에 부착된 표지에 의해 세포가 물리적으로 분리되는 다수의 세포-분류 기술이 사용될 수 있다. 이 표지는 자성 입자 또는 형광 분자일 수 있다. 항체는 가교되어, 그것들의 밀도에 의해 분리가능한 다수 세포의 응집체를 형성할 수 있다. 대안적으로, 항체는 소망하는 세포가 부착되는 고정 매트릭스에 부착될 수 있다.
바람직한 실시양태에서, TNAP+, STRO-1+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, 3G5+, CD45+, CD146+에 결합하는 항체(또는 다른 결합제)가 사용되어 세포를 단리시킬 수 있다. 더욱 바람직하게는, TNAP+ 또는 STRO-1+에 결합하는 항체(또는 다른 결합제)가 사용되어 세포를 단리시킬 수 있다.
미결합 세포로부터 항체-결합된 세포를 분리하는 다양한 방법이 알려져 있다. 예를 들어, 세포에 결합된 항체(또는 항-아이소타입(isotype) 항체)가 표지된 다음, 표지의 존재를 검출하는 기계적 세포 분류기에 의해 세포가 분리될 수 있다. 형광-활성화된 세포 분류기는 당업계에 잘 알려져 있다. 일 실시양태에서, 항-TNAP 항체 및/또는 STRO-1 항체는 고체 지지체에 부착된다. 비제한적으로, 아가로스 비드, 폴리스티렌 비드, 중공 섬유막, 중합체, 및 플라스틱 페트리 접시를 포함한 다양한 고체 지지체가 당업자에게 알려져 있다. 항체에 의해 결합되는 세포는 세포 현탁액으로부터 고체 지지체를 단순히 물리적으로 분리하는 것에 의해 세포 현탁액으로부터 제거될 수 있다.
초상자성 마이크로입자가 세포 분리를 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 마이크로입자는 항-TNAP 항체 및/또는 STRO-1 항체로 코팅될 수 있다. 항체-태그된, 초상자성 마이크로입자는 이어서 관심 세포를 함유하는 용액과 함께 항온처리될 수 있다. 마이크로입자는 소망하는 줄기 세포의 표면에 결합하고, 이들 세포는 이어서 자기장 내에서 수집될 수 있다.
다른 실시예에서, 세포 샘플은 예를 들어, 고상-결합된 항-TNAP 단클론 항체 및/또는 항-STRO-1 단클론 항체에 물리적으로 접촉하게 된다. 고상 결합은 예를 들어, 항체를 플라스틱, 니트로셀룰로오스, 또는 다른 표면에 흡착하는 것을 포함할 수 있다. 항체는 또한 중공 섬유막의 큰 기공(세포의 통과를 허용하도록 충분히 큼)의 벽에 흡착될 수 있다. 대안적으로, 항체는 표면 또는 비드, 예컨대 파마시아 세파로스(Pharmacia Sepharose) 6 MB 마크로비드(macrobead)에 공유 결합될 수 있다. 고상-결합된 항체와 줄기 세포 함유 현탁액에 대한 항온처리의 정확한 조건 및 기간은 사용되는 시스템에 대해 특이적인 몇몇 인자에 의존할 것이다. 그러나, 적절한 조건의 선택은 당업계에 잘 알려져 있다.
미결합 세포는 이어서 줄기 세포가 결합될 충분한 시간을 허용한 후에 생리학적 완충액으로 용출 또는 세척된다. 미결합 세포는 다른 목적을 위해 회수 및 사용되거나 소망하는 분리가 달성되었음을 보장하기 위해 적절한 시험이 수행된 후에 폐기될 수 있다. 결합된 세포는 이어서 주로 고상 및 항체의 특성에 따라 임의의 적절한 방법에 의해 고상으로부터 분리된다. 예를 들어, 결합된 세포는 강한 교반에 의해 플라스틱 페트리 접시로부터 용출될 수 있다. 대안적으로, 결합된 세포는 효소적으로 "니킹(nicking)"하는 것 또는 고상과 항체 사이의 효소-민감성 "스페이서" 서열을 분해시키는 것에 의해 용출될 수 있다. 아가로스 비드에 결합된 스페이서는 예를 들어, 파마시아(Pharmacia)로부터 상업적으로 이용가능하다.
세포의 용출되고, 농축된 분획은 이어서 원심분리에 의해 완충액으로 세척될 수 있고, 상기 농축된 분획은 추후 사용을 위해 통상의 기술에 따라 생존 가능한 상태로 동결보존되거나, 배양 증식되고/되거나 환자에 도입될 수 있다.
D. 배양 배지
본원에 사용된 바와 같은 "배양 배지"는 (a) MSC가 있거나 없이, MSC를 배양하기 위해 사용되는 전형적인 성분, 예컨대 아미노산, 글루코오스, 및 다양한 염을 함유하는 배양 배지, 및 (b) 배양 동안 MSC로부터 배출된 성분을 포함하는 조성물을 포함한, 배양 배지로부터 단리된 조성물 둘 다를 포함한다. 배양 배지는 고체, 액체, 기체 또는 상 및 물질의 혼합물인 성분을 함유할 수 있다. 배양 배지 성분은, 비제한적으로, 한천, 아가로스, 젤라틴 및 콜라겐 매트릭스를 포함한다. "배양 배지"는 그것이 세포와 아직 접촉되지 않은 경우라도, 세포 배양에서 사용하기 위해 의도된 물질을 포함한다. 예를 들어, 세균 배양을 위해 제조된 영양소 풍부액이 배양 배지일 수 있다.
"MSC와 접촉되었던 배양 배지"는 MSC와 접촉되어 있었으므로(예를 들어, MSC를 배양할 목적으로), MSC로부터 배출된 성분을 포함하는 배양 배지를 지칭한다. 이러한 배출된 성분의 비제한적 예는 엑소좀 또는 메신저 RNA, 비-코딩 RNA, 마이크로RNA, 미토콘드리아, 성장 인자, 또는 다른 유형의 생활성제를 포함할 수 있는 다른 미세소포를 포함한다.
E. 미세소포 및 엑소좀
MSC는 성장 또는 분화하는 동안 세포외 환경으로 화합물 및 다른 물질을 배출할 수 있다. 일부 양태에서, 이러한 물질은 세포외 소포를 포함한다. 세포외 소포는 다양한 세포 유형으로부터 유래된 원형질막의 단편을 포함한다. 전형적으로, 세포외 소포는 약 10 nm 내지 약 5000 nm(예를 들어, 약 50 nm 내지 1500 nm, 약 75 nm 내지 1500 nm, 약 75 nm 내지 1250 nm, 약 50 nm 내지 1250 nm, 약 30 nm 내지 1000 nm, 약 50 nm 내지 1000 nm, 약 100 nm 내지 1000 nm, 약 50 nm 내지 750 nm 등)의 직경(또는 입자가 스페로이드가 아닌 경우 최대 치수)을 갖는다. 세포외 소포에 대한 대안적 명칭은, 비제한적으로, 미세소포, 엑소좀, 엑토좀, 막 입자, 엑소좀-유사 입자, 및 세포사멸적 소포를 포함한다. 달리 명시되지 않는 경우, 세포외 소포의 임의의 특별한 유형 또는 세포외 소포의 유형의 조합이 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 예를 들어, 엑토좀, 엑소좀-유사 입자, 또는 이의 조합이 엑소좀 대신 사용될 수 있다.
엑소좀은 다소포체 분류 경로로부터 유래된 소포이다. 최근 연구는 엑소좀이 세포간 소통 및 면역조절 과정의 촉진을 위해 유용한 생활성 소포임을 보여준다. MSC 엑소좀은 20S 프로테아좀 및 다수의 RNA(메신저 RNA, 비-코딩 RNA, 마이크로RNA)를 함유할 수 있다. 일부 실시양태에서, 엑소좀은 직경이 30 nm 내지 200 nm이거나 직경이 20 nm 내지 50 nm이다. 일부 실시양태에서, 엑소좀은 수크로오스에서 1.10 내지 1.19 g/mL의 밀도를 가지며, 100,000 g에서 침강된다. 일부 실시양태에서, 엑소좀의 막은 스핑고미엘린, 세라마이드, 지질 라프트(lipid raft), 및 노출된 포스파티딜세린을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 양태는 프로스타사이클린, 예컨대 트레프로스티닐에 노출되었던 MSC로부터 단리된 엑소좀을 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 엑소좀은 폐고혈압을 포함한 혈관병증의 치료를 위해 적합하다. 일반적으로, 엑소좀을 정제 및/또는 농축하기 위한 임의의 적합한 방법, 예컨대 자성 입자, 여과, 투석, 초원심분리, ExoQuickTM(Systems Biosciences, CA, USA), 및/또는 크로마토그래피를 포함하는 방법이 사용될 수 있다.
일부 실시양태에서, 엑소좀은 원심분리 및/또는 초원심분리에 의해 단리된다. 프로토콜은 예를 들어, Thery et al. Current Protocols in Cell Biol. (2006) 3.22에 기재되어 있다. 일부 실시양태에서, 엑소좀은 단일 단계 크기 배제 크로마토그래피에 의해 단리된다. 프로토콜은 예를 들어, Boing et al. Journal of Extracellular Vesicles (2014) 3:23430에 기재되어 있다.
엑소좀과 함께, MSC는 또한 다른 생활성 분자/소포를 배출한다. 이러한 분자 및 소포는, 비제한적으로, 미토콘드리아 및 성장 인자를 포함한다. MSC로부터 배출된 이러한 분자 및 소포를 함유하는 배양 배지를 제조하고 특별한 분자 및 소포를 추가로 단리시키는 방법이 당업계에 알려져 있다. Hu et al., Frontiers in Genetics, 2:56, 1-9 (2012)를 참조한다.
F. 프로스타사이클린
본원에 사용된 용어 "프로스타사이클린"은 임의의 프로스타글란딘 I2(PGI2), 임의의 프로스타사이클린 유사체, 및 임의의 PGI2 수용체 작용제를 명확하게 포함한다. 본 기술에 적합한 프로스타사이클린의 비제한적 예는 에포프로스테놀, 트레프로스티닐, 일로프로스트, 및 셀렉시팍뿐 아니라, 트레프로스티닐 소듐을 포함한 이의 임의의 염을 포함한다. 일 양태에서, 프로스타사이클린은 트레프로스티닐, 이의 유도체, 약학적 허용 염, 또는 에스터이다.
G. 프로스타사이클린에 대한 MSC 노출
일부 실시양태에서, 투여 전에, MSC 또는 MSC와 접촉되었던 배양 배지는 프로스타사이클린에 노출될 수 있다. 따라서, 일부 실시양태에서, MSC 또는 MSC-조절된 배양 배지를 프로스타사이클린과 접촉시키는 것을 포함하는, MSC 또는 MSC와, 또는 생체내 전달을 위해 MSC로부터 유래된 엑소좀과 접촉되었던 배양 배지를 제조하는 방법이 제공된다. 또 다른 실시양태는 이러한 방법에 의해 얻어진 MSC 또는 MSC-조절된 배양 배지를 제공한다.
화학적 화합물을 이용한 세포 또는 배지의 노출은 알려진 기술을 포함한다. 일 양태에서, 프로스타사이클린은 MSC를 함유하는 배양 배지에 첨가되고 함께 공동-항온처리될 수 있다. 그러나, 선택적으로, 이러한 공동-항온처리는 성장 인자(예를 들어, VEGF 및 안지오포이에틴-1 또는 -2, 혈소판-유래된 성장 인자) 및/또는 저산소증의 첨가를 추가로 포함할 수 있다.
MSC 또는 MSC와 접촉되었던 배양 배지는 다양한 방식으로 프로스타사이클린에 노출될 수 있다. 예를 들어, MSC는 MSC의 증식 동안 생체외에서 프로스타사이클린에 노출될 수 있다. MSC는 또한 증식 후 프로스타사이클린에 노출될 수 있다. 본 발명의 일 실시양태에 따르면, MSC는 대상체 자신의 혈액 또는 골수로부터 제조될 수 있다. 이러한 경우에, MSC는 이들이 대상체로부터 단리되기 전에 프로스타사이클린에 노출될 수 있고/있거나 MSC는 단리 후 프로스타사이클린에 노출될 수 있다.
일부 실시양태에서, MSC는 생체외에서 프로스타사이클린에 적어도 약 12 시간, 적어도 약 18 시간, 적어도 약 24 시간, 적어도 약 30 시간, 적어도 약 36 시간, 약 42 시간, 적어도 약 48 시간, 또는 적어도 약 54 시간 동안 노출된다.
일부 실시양태에서, MSC는 생체외에서 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 100 ㎍/mL, 약 0.001 ㎍/mL 내지 약 50 ㎍/mL, 약 0.01 ㎍/mL 내지 약 20 ㎍/mL, 약 0.1 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL, 또는 약 1 ㎍/mL 내지 약 5 ㎍/mL 농도의 프로스타사이클린에 노출된다. 일부 실시양태에서, MSC는 약 0.3 ㎍/mL 내지 약 83.3 ㎍/mL, 또는 약 0.3 ㎍/mL 내지 약 10 ㎍/mL 농도의 프로스타사이클린으로 처치된다. 일부 실시양태에서, MSC는 약 100 ㎍/mL, 75 ㎍/mL, 50 ㎍/mL, 25 ㎍/mL, 10 ㎍/mL, 5 ㎍/mL, 2.5 ㎍/mL, 1 ㎍/mL, 0.5 ㎍/mL, 0.25 ㎍/mL, 0.1 ㎍/mL, 0.05 ㎍/mL, 또는 약 0.01 ㎍/mL 농도의 프로스타사이클린에 노출된다. 프로스타사이클린의 농도는 MSC 배양 배지 내의 프로스타사이클린의 농도를 지칭한다.
일부 실시양태에서, 프로스타사이클린에 노출된 MSC는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC의 발현 수준에 비해 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 1 배, 적어도 1.5 배, 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 또는 적어도 5 배 낮은 전-염증성 인자 또는 전-염증성 사이토카인의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 전-염증성 인자는 TNF-α이다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 전-염증성 인자의 발현 수준은 프로스타사이클린 노출에 의해 감소된다.
일부 실시양태에서, 프로스타사이클린에 노출된 MSC는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC의 발현 수준에 비해 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 1 배, 적어도 1.5 배, 적어도 2 배, 적어도 3 배, 적어도 4 배, 또는 적어도 5 배, 적어도 6 배, 적어도 7 배, 적어도 8 배, 적어도 9 배, 또는 적어도 10 배 높은 항-염증성 인자 또는 항-염증성 사이토카인의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 1 이상의 항-염증성 인자의 발현 수준은 프로스타사이클린 노출에 의해 증가된다. 일부 실시양태에서, 항-염증성 인자는 IL 10, IL13, IDO, iNOS, HLA, TGFβ, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
일부 실시양태에서, 프로스타사이클린에 대한 MSC의 노출은 1 이상의 전-염증성 인자의 발현 수준을 감소시키는 동시에, 1 이상의 항-염증성 인자의 발현 수준을 증가시킨다. 일부 실시양태에서, 프로스타사이클린에 대한 MSC의 노출은 TNF-α 및/또는 IL-4의 발현 수준을 감소시키는 동시에, IL 10, IL13, IDO, iNOS, HLA, 및 TGFβ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 항-염증성 인자의 발현 수준을 증가시킨다.
H. 약학 조성물
일 양태에서, 본 발명은 치료적 유효량의 MSC, 또는 MSC의 1 이상의 성분, 또는 MSC로부터 유래된 엑소좀을 포함하는 MSC와 접촉되었던 배양 배지의 일부를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 본원에 기재된 것과 같은 트레프로스티닐에 노출되었던 MSC를 포함한다. 일부 실시양태에서, 조성물 내의 모든 MSC 중 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC에 비해 적어도 50% 낮은 TNFα의 발현 수준을 갖는다. 일부 실시양태에서, 조성물 내의 모든 MSC 중 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 또는 적어도 99%는 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC에 비해 적어도 50% 높은 IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA 및 TNFβ 중 적어도 하나의 발현 수준을 갖는다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 적어도 하나의 약학적-허용 담체를 추가로 포함한다. 어구 "약학적 허용"은 건전한 의학적 판단의 범위 내에서 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증 없이, 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합하고 합리적인 이익/위험 비에 상응하는 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같은 어구 "약학적-허용 담체"는 약학적-허용 물질, 조성물 또는 비히클, 예컨대 액체 또는 고체 필러, 희석제, 부형제, 또는 용매 캡슐화 물질을 의미한다.
약학적 허용 담체는 식염수, 수성 완충 용액, 용매 및/또는 분산매를 포함한다. 이러한 담체의 사용은 당업계에 잘 알려져 있다. 완충 용액은 바람직하게는 멸균성이며 용이한 주사능이 존재하는 정도까지 유체이다. 바람직하게는, 용액은 제조 및 저장 조건 하에서 안정적이며 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀, 아스코르브산, 티메로살 등의 사용을 통하여 미생물, 예컨대 세균 및 진균의 오염 작용으로부터 보호된다.
약학적-허용 담체로서 제공될 수 있는 물질 및 용액의 일부 예는 (1) 당, 예컨대 락토오스, 글루코오스 및 수크로오스; (2) 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; (3) 셀룰로오스, 및 이의 유도체, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; (4) 분말 트라가칸트; (5) 맥아; (6) 젤라틴; (7) 탈크; (8) 부형제, 예컨대 코코아 버터 및 좌약 왁스; (9) 오일, 예컨대 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; (10) 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; (11) 폴리올, 예컨대 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; (12) 에스터, 예컨대 에틸 올리에이트 및 에틸 라우레이트; (13) 한천; (14) 완충제, 예컨대 수산화 마그네슘 및 수산화 알루미늄; (15) 알긴산; (16) 무-발열원 물; (17) 등장성 식염수; (18) 링거액(Ringer's solution); (19) 에틸 알코올; (20) pH 완충 용액; (21) 폴리에스터, 폴리카보네이트 및/또는 폴리안하이드라이드; 및 (22) 약학 제형에 사용되는 다른 비-독성 상용성(compatible) 물질을 포함한다.
본 발명의 방법을 위해 유용한 약학 조성물은 중합체 담체 또는 세포외 매트릭스를 포함할 수 있다.
다양한 생물학적 또는 합성 고체 매트릭스 물질(예를 들어, 고체 지지 매트릭스, 생물학적 접착제 또는 드레싱, 및 생물학적/의학적 스캐폴드)이 본 발명에서의 사용을 위해 적합하다. 매트릭스 물질은 바람직하게는 생체내 적용으로의 사용을 위해 의학적으로 허용가능하다. 이러한 의학적 허용 및/또는 생물학적 또는 생리학적 허용 또는 상용성 물질의 비제한적 예는 흡수성 및/또는 비-흡수성인 고체 매트릭스 물질, 예컨대 소장 점막하조직(small intestine submucosa)(SIS), 예를 들어 돼지-유래(및 다른 SIS 공급원); 가교 또는 비-가교 알지네이트, 하이드로콜로이드, 폼, 콜라겐 겔, 콜라겐 스펀지, 폴리글리콜산(PGA) 메쉬, 폴리글락틴(polyglactin)(PGL) 메쉬, 플리스, 폼 드레싱, 생접착제(예를 들어, 피브린 글루 및 피브린 겔) 및 1 이상의 층에서 사멸된 탈-표피화된 피부 등가물을 포함하며, 이들에 한정되지 않는다.
적합한 중합체 담체는 합성 또는 천연 중합체뿐 아니라, 중합체 용액으로 형성된 다공성 메쉬 또는 스펀지를 포함한다. 매트릭스의 일 형태는 중합성 메쉬 또는 스펀지이고; 나머지는 중합체 하이드로겔이다. 사용될 수 있는 천연 중합체는 단백질, 예컨대 콜라겐, 알부민, 및 피브린; 및 폴리사카라이드, 예컨대 알지네이트 및 히알루론산의 중합체를 포함한다. 합성 중합체는 생분해성 및 비-생분해성 중합체 둘 다를 포함한다. 생분해성 중합체의 예는 하이드록시산의 중합체, 예컨대 폴리락트산(PLA), 폴리글리콜산(PGA), 및 폴리락트산-글리콜산(PLGA), 폴리오르토에스터, 폴리안하이드라이드, 폴리포스파젠(polyphosphazene), 및 이의 조합을 포함한다. 비-생분해성 중합체는 폴리아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트, 에틸렌 비닐 아세테이트, 및 폴리비닐 알코올을 포함한다.
가단성(malleable)인 이온 또는 공유 가교된 하이드로겔을 형성할 수 있는 중합체가 세포를 캡슐화하기 위해 사용된다. 하이드로겔은 유기 중합체(천연 또는 합성)가 공유, 이온, 또는 수소 결합을 통하여 가교되어 물 분자를 가두는 3 차원 개방-라티스 구조를 형성하여 겔을 형성할 때 형성되는 물질이다. 하이드로겔을 형성하기 위해 사용될 수 있는 물질의 예는 폴리사카라이드, 예컨대 이온성으로 가교되는 알지네이트, 폴리포스파진(polyphosphazine), 및 폴리아크릴레이트, 또는 블록 공중합체, 예컨대 각각 온도 또는 pH에 의해 가교되는 Pluronics.TM. 또는 Tetronics.TM., 폴리에틸렌 옥사이드-폴리프로필렌 글리콜 블록 공중합체를 포함한다. 다른 물질은 단백질, 예컨대 피브린, 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈, 히알루론산 및 콜라겐을 포함한다.
일반적으로, 이들 중합체는 하전된 측기를 갖는 수용액, 예컨대 물, 완충 염 용액, 또는 수성 알코올 용액, 또는 이의 1가 이온성 염에서 적어도 부분적으로 가용성이다. 양이온과 반응될 수 있는 산성 측기를 갖는 중합체의 예는 폴리(포스파젠), 폴리(아크릴산), 폴리(메타크릴산), 아크릴산 및 메타크릴산의 공중합체, 폴리(비닐 아세테이트), 및 술폰화 중합체, 예컨대 술폰화 폴리스티렌이다. 아크릴산 또는 메타크릴산 및 비닐 에터 단량체 또는 중합체의 반응에 의해 형성되는 산성 측기를 갖는 공중합체가 또한 사용될 수 있다. 산성기의 예는 카복시산기, 술폰산기, 할로겐화(바람직하게는 플루오르화) 알코올기, 페놀성 OH기, 및 산성 OH기이다. 음이온과 반응될 수 있는 염기성 측기를 갖는 중합체의 예는 폴리(비닐 아민), 폴리(비닐 피리딘), 폴리(비닐 이미다졸), 및 일부 이미노 치환된 폴리포스파젠이다. 중합체의 암모늄 또는 4급 염이 또한 백본 질소 또는 펜던트 이미노기로부터 형성될 수 있다. 염기성 측기의 예는 아미노기 및 이미노기이다.
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 적어도 하나의 추가 치료제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 조성물은 염증 또는 통증을 치료하는데 도움을 주기 위한 진통제, 또는 조성물을 이용하여 치료되는 부위의 감염을 예방하기 위한 항-감염제를 함유할 수 있다. 더욱 구체적으로, 유용한 치료제의 비제한적 예는 다음 치료제 범주를 포함한다: 진통제, 예컨대 비스테로이드 항-염증 약물, 아편 작용제 및 살리실레이트; 항-감염제, 예컨대 구충제, 항혐기성제(antianaerobic), 항생제, 아미노글리코시드 항생제, 항진균성 항생제, 세팔로스포린 항생제, 마크롤라이드 항생제, 여러가지 β-락탐 항생제, 페니실린 항생제, 퀴놀론 항생제, 술폰아마이드 항생제, 테트라사이클린 항생제, 항마이코박테리아제, 항결핵 항마이코박테리아제, 항원충제, 항말라리아 항원충제, 항바이러스제, 항-레트로바이러스제, 살개선제, 항-염증제, 코르티코스테로이드 항-염증제, 항소양제/국소 마취제, 국소 항-감염제, 항진균성 국소 항-감염제, 항바이러스성 국소 항-감염제; 전해질 및 신장제, 예컨대 산성화제, 알칼리화제, 이뇨제, 탄산 탈수효소 억제제 이뇨제, 루프 이뇨제, 삼투성 이뇨제, 칼륨-보존 이뇨제, 티아지드 이뇨제, 전해질 대체제, 및 요산배설촉진제; 효소, 예컨대 췌장 효소 및 혈전 효소; 위장약, 예컨대 지사제, 위장 항-염증제, 위장 항-염증제, 제산제 항-궤양제, 위산-펌프 억제제 항-궤양제, 위점막 항-궤양제, H2-차단제 항-궤양제, 담석제거제, 소화제, 구토제, 완하제 및 대변 유연제, 및 위장운동촉진제; 전신 마취제, 예컨대 흡입 마취제, 할로겐화 흡입 마취제, 정맥내 마취제, 바르비튜레이트 정맥내 마취제, 벤조디아제핀 정맥내 마취제, 및 아편 작용제 정맥내 마취제; 호르몬 및 호르몬 조절제, 예컨대 낙태제, 부신제, 코르티코스테로이드 부신제, 안드로겐, 항-안드로겐, 면역생물학제, 예컨대 면역글로불린, 면역억제제, 독소, 및 백신; 국소 마취제, 예컨대 아마이드 국소 마취제 및 에스터 국소 마취제; 근골격제, 예컨대 항-통풍 항-염증제, 코르티코스테로이드 항-염증제, 금 화합물 항-염증제, 면역억제성 항-염증제, 비스테로이드 항-염증 약물(nonsteroidal anti-inflammatory drug)(NSAID), 살리실레이트 항-염증제, 미네랄; 및 비타민, 예컨대 비타민 A, 비타민 B, 비타민 C, 비타민 D, 비타민 E, 및 비타민 K.
본 발명의 방법을 위해 유용한 조성물은 세포 배양 성분, 예를 들어 아미노산, 금속, 보조효소 인자뿐 아니라, 다른 세포의 소집단, 예를 들어 줄기 세포의 후속 분화에 의해 발생할 수 있는 것 중 일부를 포함할 수 있다.
본 발명의 방법을 위해 유용한 조성물은 예를 들어, 배양 배지로부터 대상 세포를 침강시키는 것 및 이들을 소망하는 용액 또는 물질에서 재-현탁하는 것에 의해 제조될 수 있다. 세포는 예를 들어, 원심분리, 여과, 한외여과 등에 의해 배양 배지에서 침강 및/또는 변화될 수 있다.
I. 투여
일부 실시양태에서, 약학 조성물은 단독으로 투여되거나 프로스타사이클린과 공동-투여될 수 있다. 일부 실시양태에서, 약학 조성물 및 프로스타사이클린은 동시에 투여된다. 다른 실시양태에서, 프로스타사이클린 및 조성물은 별도로 투여된다. 별도로 투여될 때, 프로스타사이클린은 MSC 조성물의 투여 전, 또는 후에 투여될 수 있다.
당업자는 본 발명의 방법에서 투여될 조성물의 세포 및 선택적 담체(들)의 양을 용이하게 결정할 수 있다. 실시양태에서, 임의의 첨가제(활성 세포(들)와 함께)는 인산염 완충 식염수 내에 0.001 내지 50%(중량) 용액의 양으로 존재하며, 활성 성분은 마이크로그램 내지 밀리그램의 단위로, 예컨대 약 0.0001 내지 약 5 중량 %, 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 1 중량 %, 더욱 더 바람직하게는 약 0.0001 내지 약 0.05 중량 % 또는 약 0.001 내지 약 20 중량 %, 바람직하게는 약 0.01 내지 약 10 중량 %, 및 더욱 더 바람직하게는 약 0.05 내지 약 5 중량 %로 존재한다. 물론, 동물 또는 인간에게 투여될 임의의 조성물의 경우, 및 임의의 특별한 투여 방법의 경우, 따라서 적합한 동물 모델, 예를 들어 설치류, 예컨대 마우스에서 치사량(lethal dose)(LD) 및 LD50을 결정하는 것에 의한 독성; 및 적합한 반응을 유도하는 조성물(들)의 투여량, 이의 성분의 농도 및 조성물(들)을 투여하는 타이밍을 결정하는 것이 바람직하다. 이러한 결정은 당업자, 본 발명 및 본원에 인용된 문헌의 지식으로부터 과도한 실험을 요구하지 않는다. 또한, 연속 투여를 위한 시간은 과도한 실험 없이 확정될 수 있다.
본 발명의 방법을 위해 유용한 조성물은 카테터 투여, 전신 투여, 국소 주사, 정맥내 주사, 자궁내 주사 또는 장관외 투여를 포함하여, 그 중에서도 국소 주사를 통해 투여될 수 있다. 본원에 기재된 치료 조성물(예를 들어, 약학 조성물)을 투여할 때, 일반적으로 단위 투여량 주사가능 형태(용액, 현탁액, 에멀전)로 제형화될 것이다.
본 발명의 일 실시양태에 따르면, 조성물은 혈관병증에 대한 적어도 하나의 다른 의약과 함께 공동-투여될 수 있다. 예를 들어, 약학 조성물은 프로스타글란딘 I2(PGI2), 프로스타사이클린 유사체, 포스포디에스테라제-5(PDE-5) 억제제, 엔도텔린 수용체 길항제(ETRA), 티로신 키나아제 억제제, 또는 가용성 구아닐산 고리화효소 자극제와 함께 공동-투여될 수 있다.
일 실시양태에 따르면, 혈관병증을 치료하기 위한 방법은 폐동맥에서의 혈전증 감소, 폐동맥에서의 염증 감소, 폐동맥에서의 내막 평활근 증식 감소, 폐동맥에서의 얼기모양 병소 형성 감소, 폐동맥에서의 산화질소의 양 증가, 폐동맥에서의 PGI2의 양 증가, 폐동맥에서의 엔도텔린-1의 수준 감소, 폐동맥에서의 성장 인자의 양 감소, 또는 폐동맥에서의 적절한 내피 형태학 촉진을 추가로 포함한다.
상술한 것들은 특정 바람직한 실시양태를 지칭하지만, 본 발명이 이에 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 개시된 실시양태에 대해 다양한 변형이 이루어질 수 있으며 이러한 변형은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다는 것이 당업자에게 자명할 것이다.
본 명세서에서 인용된 모든 간행물, 특허 출원 및 특허는 그 전체가 본원에 참고문헌으로 포함된다. 이들 간행물, 특허 출원 및 특허가 본원에서 제공된 정의와 상이한 정의를 포함하거나 상이한 방식으로 용어 또는 어구를 사용하는 경우, 본 명세서에서의 정의 및 용도가 우선한다.
실시예
다음 실시예는 본원에 기재된 방법 및 조성물이 어떻게 이루어지고 사용되는지에 대한 완전한 개시 및 기재를 당업자에게 제공하는 것으로 의도되며, 제한하는 것으로 의도되지 않는다.
실시예 1 - MSC 표현형 및 형태학 연구
본 실시예는 트레프로스티닐에 노출된 MSC 세포의 표현형을 확인하고 MSC 세포에 대한 세포독성 효과 생성 없이 트레프로스티닐 노출을 위한 최적의 용량 범위를 결정한다.
단일 바이얼의 인간 골수-유래된 MSC를 증식시켰으며 표준 성장 배지를 사용하여 접종하였다. 95-99% 콘플루언시(confluency)에서, 세포를 인산염-완충 식염수(PBS)로 완전히 세척하고 250 ㎍/mL 내지 0.004 ㎍/mL 범위 용량의 트레프로스티닐을 함유한 배지에 노출시켰다. 배양 48 시간 후에, 세포를 사진 촬영하고 형태학에서의 처치-유도된 변화에 대해 평가하였다.
유세포분석(도 1)은 본 연구에서 사용된 골수 MSC가 CD34, CD45, 및 HLA-DR에 대해 음성이거나 낮았고 MSC 마커 CD73, CD105, 및 CD90에 대해 양성이었음을 나타내었다. MSC의 정의는 국제 세포 치료 학회(International Society for Cellular Therapy)에 의해 수립되었다(Dominici et al., Cytotherapy 8(4):315-7, 2006).
상이한 농도의 트레프로스티닐에 노출된 MSC의 영상(도 2)은 최고 Tre 용량(250 ㎍/mL)에서 MSC가 둥글게 되어 분리되는 것으로 나타났으며, 이는 MSC에 대한 트레프로스티닐의 세포독성 효과를 가리킨다. 반면에, 83.3 ㎍/mL 이하의 용량의 트레프로스티닐은 세포 사멸과 연관된 형태학적 변화를 야기하지 않았다.
본 실시예는 최고 용량의 트레프로스티닐이 MSC 세포 생존력에 음성적으로 영향을 미치는 한편, 83.3 ㎍/mL 미만의 트레프로스티닐 용량은 이러한 세포독성 효과를 야기하지 않았음을 나타낸다(도 2). 후속 연구는 세포독성 효과를 회피하기 위해 낮은 트레프로스티닐 용량 범위를 포함하였다.
실시예 2 - 전- 및 항-염증성 사이토카인에 대한 트레프로스티닐 효과
본 실시예는 MSC에서 전- 및 항-염증성 사이토카인의 생산에 대한 트레프로스티닐의 효과를 시험하였다.
실시예 1에 기재된 바와 같이 250 ㎍/mL - 0.004 ㎍/mL 범위의 트레프로스티닐에 노출된 세포를 수집하였다. 세포의 RNA를 추출한 다음에 전- 및 항-염증성 사이토카인에 대해 분석하였다. 내부 및 분비된 세포 시그널링 둘 다에 포함되는 사이토카인, 또는 소단백질은 PAH의 염증성 발병에서 역할을 수행한다는 것이 확인되었다(Groth et al., Respiratory Research, 15:47 (2014)).
생체내 만성 저산소증 하에서, TNFα의 순환 수준은 대조군과 비교하여 48% 증가하였다(도 3a 및 3b). 시험관내에서 83.3 내지 0.3 ㎍/mL 용량의 트레프로스티닐 노출은 MSC 내의 전-염증성 사이토카인 TNFα의 발현 수준을 감소시켰다.
증가된 용량의 트레프로스티닐에 대한 MSC의 노출은 대조군에 비해 IL10 및 IL13 시그널링에서 증가를 드러내었다(도 4).
저산소증-유도된 PAH 마우스에서, TNFα의 순환 수준에서의 48% 증가가 관찰되었다(도 3a). 흥미롭게도, 0.3 ㎍/mL 내지 83.3 ㎍/mL의 트레프로스티닐을 이용한 노출은 TNFα의 발현을 대조군과 비교하여 최대 4.7 배 감소시켰다(도 3b). 추가 분석은 동일한 트레프로스티닐 용량 범위가 항-염증성 사이토카인 IL10 및 IL13의 발현 수준을 증가시켰음을 드러내었다. 구체적으로, MSC에서 IL10의 발현은 9.3 ㎍/mL 트레프로스티닐에 노출되었을 때, 5.4 배 증가하였다. MSC에서 IL13의 발현은 27.8 ㎍/mL 트레프로스티닐에 노출되었을 때, 8.8 배 증가하였다(도 4). 이들 데이터는 MSC의 항-염증성 가능성이 저-농도 트레프로스티닐 노출에 의해 유도되었음을 나타낸다.
실시예 3 - 면역억제 인자의 생산에 대한 트레프로스티닐 효과
본 실시예는 몇몇 면역억제 인자의 MSC 생산에 대한 트레프로스티닐의 효과를 시험하였다.
250 ㎍/mL 내지 0.004 ㎍/mL의 트레프로스티닐에 노출된 MSC로부터의 RNA를 몇몇 다른 항-염증성 인자에 대해 재-분석하였다. IDO1, iNOS, HLA 및 TGFβ를 포함하는 MSC의 면역억제 특성에서의 특정 역할을 수행하는 것으로 보였던 유전자를 평가하였다(Hoogduijn et al., International Immunopharmacology , 1496-1500(2010)).
증가된 용량의 트레프로스티닐에 노출된 MSC는 대조군에 비해 항-염증성 인자 IDO1, iNOS, HLA 및 TGFβ에서의 왕성한 증가를 드러내었다(도 5).
9.3 ㎍/mL 트레프로스티닐에 대한 MSC의 노출은 미노출된 대조군에 비해 TNFα(전-염증성 사이토카인)를 감소시키고 IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA 및 TGFβ(항-염증성 인자)를 증가시켰다(도 6).
본 실시예는 증가된 용량의 트레프로스티닐에 노출된 MSC가 대조군에 비해 항-염증성 인자 IDO1, iNOS, HLA 및 TGFβ에서의 왕성한 증가를 드러내었음을 나타낸다(도 5). 이 유전자 발현 프로파일은 실시예 2에서의 사이토카인 프로파일과 결합하여, 시험관내에서 다중 용량의 트레프로스티닐에 대한 노출 48 시간 후 MSC 유전자 발현 패턴에서의 변화를 나타낸다. 9.3 ㎍/mL 트레프로스티닐에 대한 노출은 전-염증성 사이토카인 TNFα를 감소시켰고, IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA 및 TGFβ를 포함한 몇몇 항-염증성 인자를 증가시켰다(도 6). 이들 데이터는 트레프로스티닐-노출된 MSC가 질환의 치료에서 면역조절 인자로서 제공될 수 있음을 제시한다.
트레프로스티닐 노출의 면역조절 효과에 대해 제안된 모델을 도 7에 나타내었다. 특히, MSC의 트레프로스티닐 노출은 세포내(1) 또는 핵 시그널링(2, 3, 4)을 통하여 전-염증성 사이토카인을 감소시키고, 항-염증성 사이토카인을 증가시켰다. 추가 분석은 RNA 발현(3)에서의 변화에 의해 측정된 핵 시그널링(2)을 통하여, 트레프로스티닐-노출된 MSC의 항-염증성 상태로의 유전자 재프로그래밍을 밝혀내었다.

Claims (38)

  1. 중간엽 줄기 세포(mesenchymal stem cell)(MSC)를 포함하는 약학 조성물로서,
    혈관병증의 치료 또는 예방을 필요로 하는 대상체에게 상기 약학 조성물을 투여하는 것을 포함하는 혈관병증의 치료 방법 또는 예방 방법에 사용되며,
    MSC가 생체외(ex vivo)에서 0.3 ㎍/mL 내지 83.3 ㎍/mL의 프로스타사이클린에 적어도 48 시간 동안 노출되었으며, 프로스타사이클린에 대한 노출이, 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC와 비교하여, MSC에서 1 이상의 항-염증성 인자의 발현을 증가시키고/시키거나 1 이상의 전-염증성 인자의 발현을 감소시키고,
    혈관병증이 폐동맥 고혈압(PAH), 말초 혈관 질환(PVD), 중증 하지 허혈(CLI), 관상 동맥 질환 및 당뇨병성 혈관병증으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는,
    약학 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    MSC가 0.3 ㎍/mL 내지 10 ㎍/mL의 프로스타사이클린에 노출되었던, 약학 조성물.
  3. MSC를 생체외에서 0.3 ㎍/mL 내지 83.3 ㎍/mL의 프로스타사이클린에 적어도 48 시간 동안 노출시키는 단계로서, 프로스타사이클린에 대한 노출이, 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC와 비교하여, MSC에서 1 이상의 항-염증성 인자의 발현을 증가시키고/시키거나 1 이상의 전-염증성 인자의 발현을 감소시키는 것인, 단계; 및
    엑소좀을 포함하는 배양 배지를 단리시키는 단계
    를 포함하는, MSC와 접촉되었으며 MSC의 1 이상의 성분을 포함하는 배양 배지를 포함하는 조성물을 제조하는 방법.
  4. 제1항에 있어서,
    프로스타사이클린이 트레프로스티닐 또는 이의 염인, 약학 조성물.
  5. 삭제
  6. 제1항에 있어서,
    MSC가 증식 후 프로스타사이클린에 노출되는, 약학 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    프로스타사이클린에 노출된 MSC가 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC와 비교하여, 종양 괴사 인자 알파(tumor necrosis factor alpha)(TNFα)의 감소된 발현 수준을 갖고,
    프로스타사이클린에 노출된 MSC가 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC와 비교하여, IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA 및 TGFβ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 항-염증성 인자의 증가된 발현 수준을 갖고,
    프로스타사이클린에 노출된 MSC가 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC에 비해 적어도 50% 낮은 TNFα의 발현 수준을 갖고,
    프로스타사이클린에 노출된 MSC가 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC에 비해 적어도 50% 높은 IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA 및 TGFβ 중 적어도 하나의 발현 수준을 갖는, 약학 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    MSC가 0.3 ㎍/mL 내지 10 ㎍/mL의 농도를 갖는 트레프로스티닐 또는 이의 염에 적어도 48 시간 동안 노출되는, 약학 조성물.
  9. 제3항에 있어서,
    MSC의 1 이상의 성분이 엑소좀, 미세소포, 마이크로RNA, 메신저 RNA, 비-코딩 RNA, 미토콘드리아, 성장 인자, 및 이의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 방법.
  10. 제3항에 있어서,
    배양 배지로부터 엑소좀을 단리시키는 것을 추가로 포함하는, 방법.
  11. 제1항에 있어서,
    적어도 하나의 약학적 허용 담체를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    혈관병증을 치료 또는 예방하기 위한 적어도 하나의 추가 치료제를 추가로 포함하는, 약학 조성물.
  13. 제3항에 있어서,
    프로스타사이클린이 트레프로스티닐 또는 이의 염인, 방법.
  14. 삭제
  15. 제3항에 있어서,
    MSC가 증식 후 프로스타사이클린에 노출되는 것인, 방법.
  16. 제3항에 있어서,
    프로스타사이클린에 노출된 MSC가 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC와 비교하여, 종양 괴사 인자 알파(TNFα)의 감소된 발현 수준을 갖고,
    프로스타사이클린에 노출된 MSC가 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC와 비교하여, IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA 및 TGFβ로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 1 이상의 항-염증성 인자의 증가된 발현 수준을 갖고,
    프로스타사이클린에 노출된 MSC가 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC에 비해 적어도 50% 낮은 TNFα의 발현 수준을 갖고,
    프로스타사이클린에 노출된 MSC가 프로스타사이클린에 노출되지 않은 대조군 MSC에 비해 적어도 50% 높은 IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA 및 TGFβ 중 적어도 하나의 발현 수준을 갖는 것인, 방법.
  17. 제3항에 있어서,
    MSC가 0.3 ㎍/mL 내지 10 ㎍/mL의 농도를 갖는 트레프로스티닐 또는 이의 염에 적어도 48 시간 동안 노출되는 것인, 방법.
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