ES2927406T3 - Potenciación de las propiedades inmunomoduladoras de las MSC mediante treprostinil - Google Patents

Abstract

Se proporcionan métodos para tratar o prevenir la vasculopatía que comprenden administrar a un sujeto que lo necesite una composición de ca que comprende una célula madre mesenquimal (MSC) o una parte de un medio de cultivo que ha estado en contacto con la MSC y comprende uno o más componentes de el MSC, o un exosoma derivado del MSC. También se proporcionan composiciones farmacéuticas adecuadas para tal tratamiento. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Potenciación de las propiedades inmunomoduladoras de las MSC mediante treprostinil

Antecedentes

La presente solicitud se refiere a células madre mesenquimatosas con propiedades antiinflamatorias, a un método de preparación de tales células madre mesenquimatosas, a materiales obtenidos a partir de tales células madre mesenquimatosas, al uso de células madre mesenquimatosas y materiales obtenidos a partir de células madre mesenquimatosas en el tratamiento de vasculopatía. La vasculopatía incluye, pero no se limita a, hipertensión arterial pulmonar (HAP), otros tipos de hipertensión pulmonar, enfermedad vascular periférica (EVP), isquemia crítica de las extremidades (ICE), arteriopatía coronaria y vasculopatía diabética.

La hipertensión pulmonar es una enfermedad rara, progresiva y potencialmente mortal que afecta a la vasculatura pulmonar. Específicamente, la hipertensión pulmonar da como resultado una presión aumentada en la vasculatura pulmonar, lo que puede conducir, entre otros desenlaces, a insuficiencia cardiaca. Actualmente, la hipertensión pulmonar se clasifica en los siguientes grupos según el sistema de clasificación clínica de la Organización Mundial de la Salud (OMS) (Dana Point 2008):

Grupo 1: Hipertensión arterial pulmonar (HAP);

Grupo 1': Enfermedad venooclusiva pulmonar (EVOP) y/o hemangiomatosis capilar pulmonar (HCP);

Grupo 2: Hipertensión pulmonar debida a enfermedades del hemicardio izquierdo;

Grupo 3: Hipertensión pulmonar debida a enfermedades pulmonares y/o hipoxemia;

Grupo 4: Hipertensión pulmonar tromboembólica crónica (HPTEC); y

Grupo 5: HP con mecanismos multifactoriales poco claros.

La hipertensión arterial pulmonar es un tipo específico de hipertensión pulmonar y, si no se trata, conduce a la muerte en promedio en el plazo de 2,8 a 5 años después de su diagnóstico (Keily et al. (2013) BMJ 346:f2028). Una constricción en aumento de la circulación pulmonar conduce a un estrés aumentado en el hemicardio derecho, que puede convertirse en una insuficiencia del hemicardio derecho. Por definición, la presión arterial pulmonar media (PAPm) en un caso de hipertensión pulmonar crónica es >25 mmHg en reposo o >30 mmHg durante el esfuerzo (valor normal <20 mmHg). La fisiopatología de la hipertensión arterial pulmonar se caracteriza por la vasoconstricción y la remodelación de los vasos pulmonares. En la HAP crónica se produce una neomuscularización de los vasos pulmonares inicialmente no muscularizados, y los músculos vasculares de los vasos ya muscularizados aumentan su circunferencia. Este aumento resultante de las presiones arteriales pulmonares da como resultado un estrés progresivo en el hemicardio derecho, lo que conduce a una reducción del rendimiento del hemicardio derecho y finalmente termina en una insuficiencia del hemicardio derecho (M. Humbert et al., J. Am. Coll. Cardiol. 2004, 43, 13S-24S). La HAP es un trastorno raro, con una prevalencia de 1-2 por millón. La edad promedio de los pacientes se ha estimado en 36 años, y sólo el 10% de los pacientes tenía más de 60 años. Están afectadas claramente más mujeres que hombres (G. E. D'Alonzo et al., Ann. Intern. Med. 1991, 115, 343-349).

Las terapias convencionales disponibles en el mercado (por ejemplo, análogos de la prostaciclina, antagonistas de los receptores de endotelina, inhibidores de la fosfodiesterasa) son capaces de mejorar la calidad de vida y la tolerancia al ejercicio de los pacientes. Estos medicamentos pueden dar como resultado efectos secundarios graves y/o deben administrarse usando formas de administración complicadas. Es frecuente que los pacientes reciban una terapia de combinación, o bien al principio o bien después de un deterioro de la afección tras la monoterapia. A pesar de los avances en el tratamiento, la HAP no tiene cura.

Por tanto, existe la necesidad de desarrollar composiciones y métodos terapéuticos mejorados para tratar la vasculopatía, incluyendo la HAP.

Sumario

La invención es tal como se describe en las reivindicaciones.

En una realización, la invención proporciona una composición para su uso en un método de tratamiento o prevención de vasculopatía, que comprende

administrar a un sujeto que lo necesita una composición que comprende (i) un medio de cultivo que ha estado en contacto con una célula madre mesenquimatosa (MSC) y comprende un exosoma derivado de la MSC, o (ii) un exosoma aislado derivado de la MSC,

en la que la MSC se ha expuesto a de 0,3 |ig/ml a 83,3 |ig/ml de prostaciclina ex vivo, en la que la MSC se expone a la prostaciclina durante al menos 48 horas, y en la que la exposición a la prostaciclina aumenta la expresión de uno o más factores antiinflamatorios y/o reduce la expresión de uno o más factores proinflamatorios en la MSC, en comparación con una MSC de control no expuesta a la prostaciclina, en la que la vasculopatía es una hipertensión pulmonar.

En una realización preferida, la MSC se ha expuesto a de 0,3 |ig/ml a 10 |ig/ml de prostaciclina.

La invención proporciona además un método para preparar una composición que comprende (i) un medio de cultivo que ha estado en contacto con una célula madre mesenquimatosa (MSC) y comprende un exosoma derivado de la MSC, o (ii) un exosoma aislado derivado de la MSC, en el que el método comprende exponer la MSC a de 0,3 |ig/ml a 83,3 |ig/ml de una prostaciclina ex vivo, en el que la MSC se expone a la prostaciclina durante al menos 48 horas, y en el que la exposición con la prostaciclina aumenta la expresión de uno o más factores antiinflamatorios y/o reduce la expresión de uno o más factores proinflamatorios en la MSC, en comparación con una MSC de control no expuesta a la prostaciclina; y aislar el medio de cultivo que ha estado en contacto con la MSC, o el exosoma derivado de la MSC.

En una realización preferida, el método comprende exponer la MSC a de 0,3 |ig/ml a 50 |ig/ml o a de 0,3 |ig/ml a 10 |ig/ml de prostaciclina.

En algunas realizaciones de la invención, la prostaciclina es treprostinil, un derivado o una sal del mismo.

En otras realizaciones, la MSC se expone a la prostaciclina tras la expansión.

En algunas realizaciones, la MSC expuesta a la prostaciclina tiene un nivel de expresión reducido de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), en comparación con una MSC de control no expuesta a la prostaciclina. En otras realizaciones, la MSC expuesta a la prostaciclina tiene un nivel de expresión aumentado de uno o más factores antiinflamatorios seleccionados del grupo que consiste en IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA y TGFp, en comparación con una MSC de control no expuesta a la prostaciclina. En otras realizaciones, la MSC expuesta a la prostaciclina tiene un nivel de expresión de TNFa que es al menos un 50% menor que el de una MSC de control no expuesta a la prostaciclina. En otras realizaciones, la MSC expuesta a la prostaciclina tiene un nivel de expresión al menos uno de IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA y TGFp que es al menos un 50% mayor que el de una MSC de control no expuesta a la prostaciclina.

Una realización preferida comprende administrar a un sujeto que lo necesita una composición que comprende una MSC, en la que la MSC se ha expuesto ex vivo a treprostinil o a una sal del mismo a una concentración de 0,3 a 10 |ig/ml durante al menos 24 horas;

administrar al sujeto una composición que comprende una parte de un medio de cultivo que ha estado en contacto con la MSC y comprende uno o más componentes de la MSC, en la que la MSC se ha expuesto ex vivo a treprostinil o a una sal del mismo a una concentración de 0,3 a 10 |ig/ml durante al menos 24 horas, y en la que uno o más componentes de la MSC se seleccionan del grupo que consiste en un exosoma, una microvesícula, un microARN, un ARN mensajero, un ARN no codificante, una mitocondria, un factor de crecimiento y las combinaciones de los mismos; o administrar a un sujeto que lo necesita una composición que comprende un exosoma derivado de la MSC, en la que la MSC se ha expuesto ex vivo a treprostinil o a una sal del mismo a una concentración de 0,3 a 10 |ig/ml durante al menos 24 horas.

En una realización preferida, la MSC se expone a una composición que comprende treprostinil o una sal del mismo que tiene una concentración de 0,3 |ig/ml a 10 |ig/ml durante al menos 24 horas.

La invención proporciona además una composición que comprende el medio de cultivo aislado que ha estado en contacto con la MSC o el exosoma aislado obtenido mediante el método de la invención, que comprende preferiblemente además al menos un portador farmacéuticamente aceptable o al menos un agente terapéutico adicional para tratar o prevenir la hipertensión pulmonar.

En una realización preferida, la composición comprende el exosoma aislado derivado de la MSC.

Breve descripción de los dibujos

Se proporcionan como realizaciones de esta divulgación dibujos que ilustran por ejemplificación solamente, y no por limitación.

La figura 1 muestra los resultados del análisis del inmunofenotipo de una MSC derivada de médula ósea humana.

La figura 2 proporciona imágenes representativas de una MSC expuesta en cultivo a diferentes concentraciones de treprostinil durante 48 horas.

Las figuras 3A y 3B muestran los efectos de la exposición a treprostinil sobre la inflamación de la MSC. La figura 3(A) muestra que, bajo hipoxia crónica in vivo, los niveles circulantes de TNFa aumentaron un 48% en comparación con el control. La figura 3(B) muestra que la exposición a treprostinil in vitro a una dosificación entre 83,3 |ig/ml y 0,3 |ig/ml disminuyó la expresión de la citocina proinflamatoria TNFa en la MSC.

La figura 4 ilustra que la exposición a treprostinil aumentó los niveles de expresión de los factores antiinflamatorios IL10 e IL13.

La figura 5 ilustra que la exposición a treprostinil aumentó los niveles de expresión de los factores antiinflamatorios IDO1, iNOS, HLA y TGFp.

La figura 6 muestra un resumen del efecto inmunomodulador de la exposición a treprostinil de 9,3 |ig/ml.

La figura 7 muestra un posible modelo para el efecto inmunomodulador de la exposición a treprostinil sobre la MSC. En particular, la exposición a treprostinil disminuyó la expresión de citocinas proinflamatorias y aumentó la expresión de citocinas antiinflamatorias a través de la señalización intracelular (1) o nuclear (2, 3, 4).

Descripción detallada

La exposición de células madre mesenquimatosas (MSC) a concentraciones relativamente bajas de una prostaciclina, tal como treprostinil, confiere un fenotipo antiinflamatorio. Al exponer las MSC a bajas concentraciones de prostaciclina, el potencial terapéutico de las MSC se ve potenciado basándose en sus patrones únicos de expresión génica.

Las MSC expuestas a una alta concentración de treprostinil, por ejemplo, 250 |ig/ml, tienen expresión potenciada de factores que fomentan la angiogénesis en las MSC. Sin embargo, la exposición de las MSC a altas concentraciones de treprostinil también fomentó la expresión de factores proinflamatorios, lo que puede no ser deseable para el tratamiento de la HAP en algunos casos, y también impactó negativamente en la viabilidad celular. Los presentes inventores descubrieron inesperadamente que la exposición a prostaciclinas a baja concentración (por ejemplo, 10 |ig/ml de treprostinil), tal como se describe en el presente documento, disminuye la expresión de factores proinflamatorios y aumenta la expresión de factores antiinflamatorios en las MSC. Por ejemplo, la exposición de MSC a bajas concentraciones de treprostinil disminuyó significativamente la expresión de TNFa en MSC expuestas a treprostinil y aumentó significativamente la expresión de IL-10 e IL-13. La exposición de las MSC a bajas concentraciones de treprostinil también aumentó la expresión de otros factores antiinflamatorios, tales como IDO, iNOS, HLA y TGFp.

Las MSC expuestas a una prostaciclina tal como se describe en el presente documento y los productos de tales MSC pueden aplicarse como agentes terapéuticos. Por ejemplo, las MSC pueden sensibilizarse exponiéndolas a bajas concentraciones de prostaciclina para que se vuelvan antiinflamatorias antes de su administración a un paciente. Como otro ejemplo, los exosomas de las MSC tratadas con una concentración apropiada de una prostaciclina, tal como treprostinil, pueden administrarse para tratar una vasculopatía, tal como HAP.

A. Definición

A menos que se especifique lo contrario, “un/o” o “una” significa “uno o más”.

A menos que se defina específicamente lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tendrán el mismo significado que entiende habitualmente un experto en la técnica (por ejemplo, en biología de las células madre, cultivo celular, genética molecular, inmunología, inmunohistoquímica, química de las proteínas y bioquímica).

A menos que se indique lo contrario, la proteína recombinante, el cultivo celular y las técnicas inmunológicas utilizadas en la presente divulgación son procedimientos convencionales, bien conocidos por los expertos en la técnica. Tales técnicas se describen y explican a lo largo de la bibliografía en fuentes tales como J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984), J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989), T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, volúmenes 1 y 2, IRL Press (1991), D. M. Glover y B. D. Hames (editores), DNA Cloning: A Practical Approach, volúmenes 1-4, IRL Press (1995 y 1996), y F. M. Ausubel et al. (editores), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente), Ed Harlow and David Lane (editores) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988), y J. E. Coligan et al. (editores) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons (incluyendo todas las actualizaciones hasta el presente), y se incorporan al presente documento como referencia.

Tal como se usa en el presente documento, el término “sujeto” (también denominado en el presente documento “paciente”) incluye animales de sangre caliente, preferiblemente mamíferos, incluyendo humanos. En una realización preferida, el sujeto es un primate. En una realización incluso más preferida, el sujeto es un humano.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “que trata”, “tratar” o “tratamiento” incluyen la eliminación, la mejora, el alivio o la disminución de una enfermedad o afección o de uno o más síntomas de la misma, independientemente de que la enfermedad o afección se considere “curada” o “sanada” y de si se resuelven o no todos los síntomas. Los términos también incluyen la reducción o la prevención de la progresión de una enfermedad o afección o de uno o más síntomas de la misma, el impedimento o la prevención de un mecanismo subyacente de una enfermedad o afección o de uno o más síntomas de la misma, y el logro de cualquier beneficio terapéutico y/o profiláctico.

Tal como se usa en el presente documento, los términos “que previene”, “prevenir” o “prevención” incluyen la reducción de la aparición de una enfermedad o afección o de uno o más síntomas de la misma en relación con una muestra de control no tratada, o el retraso de la aparición de uno o más síntomas de la enfermedad o afección en relación con la muestra de control no tratada.

Tal como se usa en el presente documento, el término “factor proinflamatorio” se refiere a una molécula que generalmente fomenta los procesos inflamatorios o que se asocia de otro modo positivamente con los procesos inflamatorios. Los factores proinflamatorios incluyen, pero no se limitan a, citocinas proinflamatorias. Los factores proinflamatorios incluyen factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), interleucina 1 (IL-1), interleucina 6 (IL-6), interleucina 21 (IL-21), proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP1) y proteína quimioatrayente de monocitos 5 (MCP-5).

Tal como se usa en el presente documento, el término “factor antiinflamatorio” se refiere a una molécula que generalmente inhibe los procesos inflamatorios o que se asocia de otro modo positivamente con los procesos antiinflamatorios. Los factores antiinflamatorios incluyen, pero no se limitan a, citocinas antiinflamatorias. Los factores antiinflamatorios incluyen interleucina 10 (IL10), interleucina 13 (IL13), IDO, iNOS, HLA yTGFp.

B. Vasculopatía

La vasculopatía incluye, pero no se limita a, hipertensión pulmonar, incluyendo hipertensión arterial pulmonar (HAP), enfermedad vascular periférica (EVP), isquemia crítica de las extremidades (ICE), arteriopatía coronaria y vasculopatía diabética.

Aunque se han encontrado muchas causas y condiciones asociadas a la HAP, muchas de ellas tienen en común varias características fisiopatológicas fundamentales. Una característica importante entre estos procesos es la disfunción del endotelio, la capa celular interna de todas las paredes de los vasos, que normalmente es responsable de la producción y el metabolismo de una gran variedad de sustancias que regulan el tono y la reparación de los vasos e inhiben la formación de coágulos. En el contexto de la HAP, la disfunción endotelial puede conducir a una producción excesiva de sustancias perjudiciales y a una producción deficiente de sustancias protectoras. Aún se desconoce si este es el acontecimiento principal en el desarrollo de la HAP o si es parte de una cascada aguas abajo, pero en cualquier caso es un factor importante en la vasoconstricción progresiva y la proliferación vascular que caracterizan a la enfermedad.

El término enfermedad vascular periférica (EVP) se refiere al daño, a la disfunción o a la obstrucción en las arterias y venas periféricas. La arteriopatía periférica es la forma más habitual de la EVP. La enfermedad vascular periférica es la enfermedad más habitual de las arterias y es una afección muy frecuente en los Estados Unidos. Se da sobre todo en personas mayores de 50 años. La enfermedad vascular periférica es una de las principales causas de discapacidad entre las personas mayores de 50 años, así como en las personas con diabetes. Alrededor de 10 millones de personas en los Estados Unidos padecen enfermedad vascular periférica, lo que se traduce en aproximadamente un 5% de las personas mayores de 50 años. Se espera que el número de personas con esta enfermedad aumente a medida que la población envejece. Los hombres son ligeramente más propensos que las mujeres a padecer enfermedad vascular periférica.

La isquemia crítica de las extremidades (ICE), debida a una oclusión arterial periférica avanzada, se caracteriza por una reducción del flujo sanguíneo y del suministro de oxígeno en reposo, lo que provoca dolor muscular en reposo y úlceras cutáneas que no cicatrizan o gangrena (Rissanen et al., Eur. J. Clin. Invest. 31:651-666 (2001); Dormandy y Rutherford, J. Vasc. Surg. 31:S1-S296 (2000)). Se estima que la isquemia crítica de las extremidades se desarrolla en de 500 a 1000 por millón de individuos en un año (“Second European Consensus Document on Chronic Critical Leg Ischemia”, Circulation 84 (supl. 4) IV 1-26 (1991)). En los pacientes con isquemia crítica de las extremidades, la amputación, a pesar de su morbilidad, mortalidad e implicaciones funcionales asociadas, se recomienda a menudo como solución contra los síntomas incapacitantes (M. R. Tyrrell et al., Br. J. Surg. 80: 177-180 (1993); M. Eneroth et al., Int. Orthop. 16: 383-387 (1992)). No existe una terapia médica óptima para la isquemia crítica de las extremidades (Circulation 84 (supl. 4:) IV 1-26 (1991)).

La arteriopatía coronaria (ateroesclerosis) es una enfermedad progresiva en humanos en la que una o más arterias coronarias se ocluyen gradualmente por la acumulación de placa. Las arterias coronarias de los pacientes que padecen esta enfermedad suelen tratarse con angioplastia con globo o con la inserción de endoprótesis vasculares (stents) para mantener abiertas las arterias parcialmente ocluidas. En última instancia, estos pacientes deben someterse a una revascularización aortocoronaria con un gran coste y riesgo.

C. Células madre mesenquimatosas (MSC)

Las células madre mesenquimatosas (MSC) son células que se encuentran en la médula ósea, la sangre, las células de la pulpa dental, el tejido adiposo, la piel, el bazo, el páncreas, el cerebro, el riñón, el hígado, el corazón, la retina, el cerebro, los folículos pilosos, el intestino, el pulmón, los ganglios linfáticos, el timo, el hueso, el ligamento, el tendón, el músculo esquelético, la dermis y el periostio. Las MSC son capaces de diferenciarse en diferentes líneas germinales tales como el mesodermo, el endodermo y el ectodermo. Por tanto, las MSC son capaces de diferenciarse en un gran número de tipos de células que incluyen, pero no se limitan a, los tejidos adiposo, óseo, cartilaginoso, elástico, muscular y conjuntivo fibroso. El compromiso de linaje específico y la ruta de diferenciación en la que entran las MSC dependen de diversas influencias, incluyendo influencias mecánicas y/o factores bioactivos endógenos, tales como factores de crecimiento, citocinas, y/o condiciones microambientales locales establecidas por los tejidos del huésped. Las MSC son, por tanto, células progenitoras no hematopoyéticas que se dividen para dar lugar a células hijas que son o bien células madre o bien células precursoras que con el tiempo se diferenciarán irreversiblemente para dar lugar a una célula fenotípica. Los ejemplos de MSC incluyen células precursoras mesenquimatosas (MPC).

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula madre” se refiere a las células autorrenovables que son capaces de dar lugar a hijas fenotípica y genotípicamente idénticas, así como a al menos otro tipo de célula final (por ejemplo, células diferenciadas terminalmente). El término “células madre” incluye células totipotenciales, pluripotenciales y multipotenciales, así como células progenitoras y/o precursoras derivadas de la diferenciación de las mismas.

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula totipotente” o “célula totipotencial” se refiere a una célula que es capaz de formar un embrión completo (por ejemplo, un blastocisto).

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula pluripotente” o “célula pluripotencial” se refiere a una célula que tiene una completa versatilidad de diferenciación, es decir, la capacidad de convertirse en cualquiera de los aproximadamente 260 tipos de células del cuerpo de los mamíferos. Una célula pluripotente puede autorrenovarse y permanecer inactiva o quiescente dentro de un tejido.

El término “célula multipotencial” o “célula multipotente” se refiere a una célula que es capaz de dar lugar a cualquiera de varios tipos de células maduras. Tal como se usa en el presente documento, esta expresión engloba a las células madre adultas o embrionarias y a las células progenitoras, así como a la progenie multipotencial de estas células. A diferencia de una célula pluripotente, una célula multipotente no tiene la capacidad de formar todos los tipos de células.

Tal como se usa en el presente documento, el término “célula progenitora” o “célula precursora” se refiere a una célula que está comprometida a diferenciarse en un tipo específico de célula o a formar un tipo específico de tejido.

Los términos “enriquecido”, “enriquecimiento” y variaciones de los mismos se usan en el presente documento para describir una población de células en la que la proporción de un tipo de célula particular o la proporción de un número de tipos de células particulares aumenta en comparación con la población no tratada.

Las células usadas en la presente divulgación son, por ejemplo, TNAP+, STRO-1+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, CD45+, CD146+, 3G5+ o cualquier combinación de las mismas.

La referencia a una célula “positiva” (también “+”) para un marcador dado significa que puede ser o bien un expresador bajo (lo o dim) o alto (bright, bri) de ese marcador dependiendo del grado en que el marcador esté presente en la superficie celular, donde los términos se refieren a la intensidad de fluorescencia u otro color usado en el proceso de clasificación por colores de las células. La distinción de lo (o dim o dull) y bri se entenderá en el contexto del marcador usado en una población celular particular que esté clasificándose. La referencia a una célula como “negativa” (o “-”) para un marcador dado no significa que el marcador no se exprese en absoluto por esa célula. Significa que el marcador se expresa a un nivel relativamente muy bajo por esa célula, y que genera una señal muy baja cuando se marca de manera detectable. En algunos aspectos, “negativo” puede referirse a un marcador que no está presente o que está presente en cantidades reducidas en las células que se han tratado de alguna manera, tal como la exposición a una prostaciclina. En algunos aspectos, “negativo” se refiere a un marcador que está presente en cantidades reducidas en al menos un 50% en las células que se han expuesto a la prostaciclina en comparación con la muestra de control no expuesta.

Cuando se usa en el presente documento el término “TNAP” pretende abarcar todas las isoformas de la fosfatasa alcalina inespecífica de tejidos. Por ejemplo, el término abarca la isoforma hepática (LAP), la isoforma ósea (BAP) y la isoforma renal (KAP).

Las células madre útiles para los métodos pueden derivarse de un tejido adulto, un embrión, un tejido extraembrionario o un feto. El término “adulto” se usa en su sentido más amplio para incluir a un sujeto posnatal. El término “adulto”, tal como se usa en el presente documento, también puede incluir la sangre del cordón umbilical tomada de una mujer.

En algunos aspectos, las células madre pueden ser células de progenie (que también pueden denominarse células expandidas). Las células de progenie pueden producirse a partir del cultivo in vitro de las células madre descritas en el presente documento. Las células expandidas de la divulgación pueden tener una amplia variedad de fenotipos dependiendo de las condiciones de cultivo (incluyendo el número y/o tipo de factores estimulantes en el medio de cultivo), el número de pases, y similares. Por ejemplo, las células de progenie se obtienen después de aproximadamente 2, aproximadamente 3, aproximadamente 4, aproximadamente 5, aproximadamente 6, aproximadamente 7, aproximadamente 8, aproximadamente 9 o aproximadamente 10 pases de la población parental. Sin embargo, las células de progenie pueden obtenerse después de cualquier número de pases a partir de la población parental. Y las células de progenie pueden obtenerse cultivando en un medio de cultivo adecuado.

Por ejemplo, las células de progenie se obtienen aislando células TNAP+ de la médula ósea mediante el uso de perlas magnéticas marcadas con el anticuerpo STRO-3, y se siembran en a-MEM suplementado con suero bovino fetal al 20%, L-glutamina 2 mM y L-ascorbato-2-fosfato 100 |iM.

Por ejemplo, tales células expandidas (al menos después de 5 pases) pueden ser TNAP-, CC9+, HLA de clase I+, HLAde clase II-, CD14-, CD19-; CD3-, CD11a-c-, Cd 31-, CD86-y/o CD80-. Sin embargo, es posible que la expresión de los diferentes marcadores varíe dependiendo de las condiciones de cultivo. Además, aunque las células de estos fenotipos pueden predominar en la población de células expandidas, puede haber una proporción menor de células que no tengan este/estos fenotipo(s) (por ejemplo, un pequeño porcentaje de las células expandidas puede ser CC9-).

Por ejemplo, estas células estarán presentes en una cantidad que es del 30%, el 20%, el 15%, el 10%, el 5% o el 1% o menos del número total de células presentes en la población de células expandidas. Las células expandidas pueden tener la capacidad de diferenciarse en diferentes tipos de células.

Por ejemplo, una población de células expandidas comprende células en las que al menos el 25%, más preferiblemente al menos el 50%, de las células son CC9+.

Por ejemplo, una población de células expandidas usada en los métodos de la divulgación comprende células en las que al menos el 40%, más preferiblemente al menos el 45%, de las células son STRO-1+.

Por ejemplo, las células de progenie pueden expresar marcadores seleccionados del grupo que consiste en LFA-3, THY-1, VCAM-1, PECAM-1, P-selectina, L-selectina, 3G5, CD49a/CD49b/CD29, CD49c/CD29, CD49d/CD29, CD29, CD18, CD61, integrina beta, 6-19, trombomodulina, CD10, CD13, SCF, PDGF-R, EGF-R, IGF1-R, NGF-R, FGF-R, leptina-R, (STRO-2=leptina-R), RANKL, STRO-1bright, CD146 y cualquier combinación de estos marcadores.

Por ejemplo, las células de progenie son progenie de MSC expandidas multipotenciales (MEMP) tal como se describe en el documento WO 2006/032092. Los métodos para preparar poblaciones enriquecidas de MSC de las que puede derivarse la progenie se describen en el documento WO 01/04268 y el documento WO 2004/085630. En un contexto in vitro, las MSC rara vez estarán presentes como una preparación absolutamente pura y, generalmente, estarán presentes con otras células que son células comprometidas específicas del tejido (TSCC). El documento WO 01/04268 se refiere a la obtención de tales células a partir de la médula ósea con niveles de pureza de aproximadamente el 0,1% al 90%. La población que comprende las MSC de las que se deriva la progenie puede recogerse directamente a partir de una fuente tisular, o alternativamente puede ser una población que ya se haya expandido ex vivo.

Por ejemplo, la progenie puede obtenerse a partir de una población recogida, no expandida, de MSC sustancialmente purificadas, que comprende al menos aproximadamente el 0,1, el 1, el 5, el 10, el 20, el 30, el 40, el 50, el 60, el 70, el 80 o el 95% de las células totales de la población en la que están presentes. Este nivel puede lograrse, por ejemplo, seleccionando las células que son positivas para al menos un marcador seleccionado del grupo que consiste en TNAP, STRO-1bri, 3G5+, VCAM-1, THY-1, CD146 y STRO-2.

La población inicial de MSC puede derivarse de uno o más tipos de tejidos indicados en el documento WO 01/04268 o el documento WO 2004/085630, concretamente, la médula ósea, las células de la pulpa dental, el tejido adiposo y la piel, o tal vez más ampliamente del tejido adiposo, los dientes, la pulpa dental, la piel, el hígado, el riñón, el corazón, la retina, el cerebro, los folículos pilosos, el intestino, el pulmón, el bazo, el ganglio linfático, el timo, el páncreas, el hueso, el ligamento, la médula ósea, el tendón y el músculo esquelético.

Las MEMP pueden distinguirse de las MSC recién recogidas en que son positivas para el marcador STRO-1bri y negativas para el marcador fosfatasa alcalina (ALP). Por el contrario, las MSC recién aisladas son positivas tanto para STRO-1bri como para ALP. En una realización preferida de la presente divulgación, al menos el 15%, el 20%, el 30%, el 40%, el 50%, el 60%, el 70%, el 80%, el 90% o el 95% de las células administradas tienen el fenotipo STRO-1bri, ALP-. Por ejemplo, las MEMP son positivas para uno o más de los marcadores Ki67, CD44 y/o CD49c/CD29, VLA-3, a3p1. En aún otro ejemplo adicional, las MEMP no muestran actividad TERT y/o son negativas para el marcador CD18.

Por ejemplo, las células se toman de un paciente con vasculopatía, se cultivan in vitro usando técnicas convencionales, durante al menos una parte del periodo de cultivo las células se exponen a una prostaciclina tal como se describe en el presente documento, y se administran a un paciente como un trasplante autólogo o alogénico. En una alternativa, se usan células de una o más de las líneas celulares humanas establecidas, o se usan células de un animal no humano (o si el paciente no es un humano, de otra especie).

La presente tecnología puede ponerse en práctica usando células de cualquier especie animal no humana, incluyendo, pero sin limitarse a, células de primates no humanos, ungulados, caninos, felinos, lagomorfos, roedores, aves y peces. Las células de primates con las que puede realizarse la divulgación incluyen, pero no se limitan a, células de chimpancés, babuinos, macacos cangrejeros y cualquier otro mono del Nuevo o del Viejo Mundo. Las células de ungulados con las que puede realizarse la divulgación incluyen, pero no se limitan a, células de bovinos, porcinos, ovinos, caprinos, equinos, búfalos y bisontes. Las células de roedores con las que puede realizarse la divulgación incluyen, pero no se limitan a, células de ratón, rata, cobaya, hámster y jerbo. Los ejemplos de especies de lagomorfos con las que puede realizarse la divulgación incluyen conejos domésticos, conejos de campo, liebres, conejos de cola de algodón, liebres americanas y conejos de rocas (pikas). Los pollos (Gallus gallus) son un ejemplo de especie aviar con la que puede realizarse la divulgación.

Las células pueden almacenarse antes de su uso. Los métodos y protocolos para conservar y almacenar células eucariotas, y en particular células de mamíferos, se conocen bien en la técnica (véase, por ejemplo, Pollard, J. W. y Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, segunda edición, Humana Press, Totowa, N.J.; Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, cuarta edición, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.). Cualquier método que mantenga la actividad biológica de las células madre aisladas, tales como las células progenitoras/madre mesenquimatosas, o la progenie de las mismas, puede utilizarse junto con la presente divulgación. Por ejemplo, las células se mantienen y almacenan usando crioconservación.

Las células pueden obtenerse mediante diversas técnicas. Por ejemplo, pueden usarse varias técnicas de clasificación celular mediante las cuales las células se separan físicamente por referencia a una propiedad asociada al complejo célula-anticuerpo, o a un marcador unido al anticuerpo. Este marcador puede ser una partícula magnética o una molécula fluorescente. Los anticuerpos pueden estar reticulados de manera que formen agregados de múltiples células, que pueden separarse por su densidad. Alternativamente, los anticuerpos pueden estar unidos a una matriz estacionaria a la que se adhieren las células deseadas.

Por ejemplo, se usa un anticuerpo (u otro agente de unión) que se une a TNAP+, STRO-1+, VCAM-1+, THY-1+, STRO-2+, 3G5+, CD45+, CD146+ para aislar las células. Más preferiblemente, se usa un anticuerpo (u otro agente de unión) que se une a TNAP+ o STRO-1+ para aislar las células.

Se conocen diversos métodos para separar las células unidas a anticuerpos de las células no unidas. Por ejemplo, puede marcarse el anticuerpo unido a la célula (o un anticuerpo antiisotípico) y luego separarse las células mediante un clasificador celular mecánico que detecta la presencia del marcador. Los clasificadores celulares activados por fluorescencia se conocen bien en la técnica. En una realización, los anticuerpos anti-TNAP y/o los anticuerpos STRO-1 se unen a un soporte sólido. Diversos soportes sólidos son conocidos por los expertos en la técnica, incluyendo, pero sin limitarse a, perlas de agarosa, perlas de poliestireno, membranas de fibra hueca, polímeros y placas de Petri de plástico. Las células unidas por el anticuerpo pueden retirarse de la suspensión celular simplemente separando físicamente el soporte sólido de la suspensión celular.

Las micropartículas superparamagnéticas pueden usarse para la separación de células. Por ejemplo, las micropartículas pueden recubrirse con anticuerpos anti-TNAP y/o anticuerpos STRO-1. Luego, las micropartículas superparamagnéticas marcadas con anticuerpos pueden incubarse con una disolución que contiene las células de interés. Las micropartículas se unen a las superficies de las células madre deseadas, y luego pueden recogerse estas células en un campo magnético.

En otro ejemplo, se permite que la muestra de células entre en contacto físico, por ejemplo, con anticuerpos monoclonales anti-TNAP y/o anticuerpos monoclonales anti-STRO-1 unidos a una fase sólida. La unión a una fase sólida puede comprender, por ejemplo, la adsorción de los anticuerpos a una superficie de plástico, nitrocelulosa u otra superficie. Los anticuerpos también pueden adsorberse en las paredes de los poros grandes (suficientemente grandes para permitir que las células fluyan a su través) de una membrana de fibra hueca. Alternativamente, los anticuerpos pueden estar unidos covalentemente a una superficie o perla, tal como las macroperlas Sepharose 6 MB de Pharmacia. Las condiciones y la duración exactas de la incubación de los anticuerpos unidos a una fase sólida con la suspensión que contiene células madre dependerán de varios factores específicos del sistema empleado. Sin embargo, la selección de las condiciones apropiadas está dentro de la habilidad en la técnica.

Luego, las células no unidas se eluyen o eliminan por lavado con un tampón fisiológico después de permitir un tiempo suficiente para que las células madre se unan. Las células no unidas pueden recuperarse y usarse para otros fines o desecharse después de haber realizado las pruebas adecuadas para garantizar que se ha logrado la separación deseada. Luego se separan las células unidas de la fase sólida mediante cualquier método apropiado, dependiendo principalmente de la naturaleza de la fase sólida y del anticuerpo. Por ejemplo, las células unidas pueden eluirse a partir de una placa de Petri de plástico mediante agitación vigorosa. Alternativamente, las células unidas pueden eluirse “mellando” o digiriendo enzimáticamente una secuencia “espadadora” sensible a enzimas entre la fase sólida y el anticuerpo. Los espaciadores unidos a perlas de agarosa están disponibles comercialmente de, por ejemplo, Pharmacia.

Luego, la fracción eluida y enriquecida de células puede lavarse con un tampón mediante centrifugación y dicha fracción enriquecida puede crioconservarse en un estado viable para su uso posterior según la tecnología convencional, expandirse el cultivo y/o introducirse en el paciente.

D. Medios de cultivo

Un “medio de cultivo”, tal como se usa en el presente documento, abarca tanto (a) un medio de cultivo que contiene los componentes típicos usados para el cultivo de una MSC, tales como aminoácidos, glucosa y diversas sales, con o sin la MSC, como (b) una composición aislada del medio de cultivo, incluyendo una composición que comprende componentes liberados de la MSC durante el cultivo. El medio de cultivo puede contener componentes sólidos, líquidos, gaseosos o una mezcla de fases y materiales. Los componentes del medio de cultivo incluyen, pero no se limitan a, matrices de agar, agarosa, gelatina y colágeno. “Medio de cultivo” incluye el material destinado a ser usado en un cultivo celular, incluso si aún no se ha puesto en contacto con las células. Por ejemplo, un líquido rico en nutrientes preparado para cultivo bacteriano puede ser un medio de cultivo.

Un “medio de cultivo que ha estado en contacto con MSC” se refiere a un medio de cultivo que ha estado en contacto con una MSC (por ejemplo, con el fin de cultivar la MSC) y, por tanto, comprende componentes liberados de la MSC. Los ejemplos no limitativos de tales componentes liberados incluyen exosomas u otras microvesículas, que pueden comprender ARN mensajero, ARN no codificante, microARN, mitocondrias, factores de crecimiento u otros tipos de agentes bioactivos.

E. Microvesículas y exosomas

Las MSC pueden liberar compuestos y otros materiales en el entorno extracelular durante el crecimiento o la diferenciación. En algunos aspectos, tales materiales incluyen vesículas extracelulares. Las vesículas extracelulares comprenden fragmentos de la membrana plasmática derivados de varios tipos de células. Normalmente, las vesículas extracelulares tienen un diámetro (o la mayor dimensión cuando la partícula no es esferoide) de entre aproximadamente 10 nm y aproximadamente 5000 nm (por ejemplo, entre aproximadamente 50 nm y 1500 nm, entre aproximadamente 75 nm y 1500 nm, entre aproximadamente 75 nm y 1250 nm, entre aproximadamente 50 nm y 1250 nm, entre aproximadamente 30 nm y 1000 nm, entre aproximadamente 50 nm y 1000 nm, entre aproximadamente 100 nm y 1000 nm, entre aproximadamente 50 nm y 750 nm, etc.). Los nombres alternativos para las vesículas extracelulares incluyen, pero no se limitan a, microvesículas, exosomas, ectosomas, partículas de membrana, partículas similares a exosomas y vesículas apoptóticas. A menos que se especifique lo contrario, cualquier tipo particular de vesículas extracelulares o combinación de tipos de vesículas extracelulares puede usarse según esta divulgación. Por ejemplo, en lugar de un exosoma puede usarse un ectosoma, una partícula similar a un exosoma o una combinación de los mismos.

Los exosomas son vesículas derivadas de la ruta de clasificación de cuerpos multivesiculares. Estudios recientes demuestran que los exosomas son vesículas bioactivas útiles para la comunicación intercelular y la facilitación del proceso inmunorregulador. Los exosomas de las MSC pueden contener proteasomas 20S y numerosos ARN (ARN mensajero, ARN no codificante, microARN). Por ejemplo, los exosomas tienen entre 30 nm y 200 nm de diámetro o entre 20 nm y 50 nm de diámetro, los exosomas tienen una densidad en sacarosa de 1,10 a 1,19 g/ml, sedimentados a 100.000 g, o la membrana del exosoma puede comprender esfingomielina, ceramida, balsas lipídicas y fosfatidilserina expuesta.

Un aspecto de la presente invención proporciona una composición que comprende exosomas aislados de MSC que se han expuesto a una prostaciclina, tal como treprostinil. Tales exosomas son adecuados para el tratamiento de vasculopatía, incluyendo hipertensión pulmonar. En general, puede usarse cualquier método adecuado para purificar y/o enriquecer los exosomas, tal como métodos que comprenden partículas magnéticas, filtración, diálisis, ^{ultracentrifugación, ExoQuick™ (Systems Biosciences,} C^a, ^{EE.UU.) y/o cromatografía.}

Por ejemplo, los exosomas se aíslan por centrifugación y/o ultracentrifugación. El protocolo se describe, por ejemplo, en Thery et al. Current Protocols in Cell Biol. (2006) 3.22. Alternativamente, los exosomas se aíslan mediante una cromatografía de exclusión molecular de una sola etapa. El protocolo se describe, por ejemplo, en Boing et al. Journal of Extracellular Vesicles (2014) 3:23430.

Además de los exosomas, las MSC también liberan otras moléculas/vesículas bioactivas. Tales moléculas y vesículas incluyen, sin limitación, mitocondrias y factores de crecimiento. Los métodos de preparación de medios de cultivo que contienen tales moléculas y vesículas liberadas de las MSC y el posterior aislamiento de moléculas y vesículas particulares se conocen en la técnica. Véase Hu et al., Frontiers in Genetics, 2:56, 1-9 (2012).

F. Prostaciclina

El término “prostaciclina” usado en el presente documento comprende explícitamente cualquier prostaglandina I² (PGI²), cualquier análogo de prostaciclina y cualquier agonista del receptor de PGI². Los ejemplos no limitativos de prostaciclinas adecuadas para la presente tecnología incluyen epoprostenol, treprostinil, iloprost y selexipag, así como sales de los mismos, incluyendo treprostinil sódico. En un aspecto, la prostaciclina es treprostinil, un derivado, una sal farmacéuticamente aceptable o un éster del mismo.

G. Exposición de las MSC a prostaciclina

En algunas realizaciones, antes de la administración, una MSC o un medio de cultivo que ha estado en contacto con MSC puede exponerse a prostaciclina. Por consiguiente, también se proporciona, en algunas realizaciones, un método para preparar una MSC o un medio de cultivo que ha estado en contacto con MSC, o un exosoma derivado de la MSC, para su administración in vivo, que comprende poner en contacto la MSC o el medio de cultivo acondicionado con MSC con una prostaciclina. Aún otra realización proporciona una MSC o un medio de cultivo acondicionado con MSC obtenido mediante un método de este tipo.

La exposición de una célula o un medio con un compuesto químico abarca técnicas conocidas. En un aspecto, la prostaciclina puede añadirse a, y coincubarse con, un medio de cultivo que contiene una MSC. Opcionalmente, sin embargo, tal coincubación puede implicar además la adición de un factor de crecimiento (por ejemplo, VEGF y angiopoyetina 1 ó 2, factor de crecimiento derivado de plaquetas) y/o hipoxia.

Las MSC o un medio de cultivo que ha estado en contacto con las MSC pueden exponerse a prostaciclina de diversas maneras. Por ejemplo, las MSC pueden exponerse a prostaciclina ex vivo durante la expansión de las MSC. Las MSC también pueden exponerse a prostaciclina tras la expansión. Según una realización de la presente divulgación, las MSC pueden prepararse a partir de la propia sangre o médula ósea del sujeto. En ese caso, las MSC pueden exponerse a prostaciclina antes de aislarse del sujeto y/o las MSC pueden exponerse a prostaciclina después del aislamiento.

En algunas realizaciones, una MSC se expone a prostaciclina ex vivo durante al menos aproximadamente 48 horas, o al menos aproximadamente 54 horas.

En algunas realizaciones, una MSC se trata con prostaciclina a una concentración de aproximadamente 0,3 |ig/ml a aproximadamente 83,3 |ig/ml, o de aproximadamente 0,3 |ig/ml a aproximadamente 10 |ig/ml. En algunas realizaciones, una MSC se expone a prostaciclina a una concentración de aproximadamente 75 |ig/ml, 50 |ig/ml, 25 |ig/ml, 10 |ig/ml, 5 |ig/ml, 2,5 |ig/ml, 1 |ig/ml, 0,5 |ig/ml, 0,25 |ig/ml. La concentración de prostaciclina se refiere a la concentración de prostaciclina en el medio de cultivo de MSC.

En algunas realizaciones, la MSC expuesta a prostaciclina tiene un nivel de expresión de un factor proinflamatorio o de una citocina proinflamatoria que es al menos el 50%, al menos 1 vez, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces o al menos 5 veces menor que el nivel de expresión de una MSC de control no expuesta a la prostaciclina. En algunas realizaciones, el factor proinflamatorio es TNF-a. En algunas realizaciones, el nivel de expresión de más de un factor proinflamatorio disminuye por la exposición a prostaciclina.

En algunas realizaciones, la MSC expuesta a la prostaciclina tiene un nivel de expresión de un factor antiinflamatorio o de una citocina antiinflamatoria que es al menos el 50%, al menos 1 vez, al menos 1,5 veces, al menos 2 veces, al menos 3 veces, al menos 4 veces, al menos 5 veces, al menos 6 veces, al menos 7 veces, al menos 8 veces, al menos 9 veces o al menos 10 veces mayor que el nivel de expresión de una MSC de control no expuesta a la prostaciclina. En algunas realizaciones, el nivel de expresión de más de un factor antiinflamatorio aumenta por la exposición a prostaciclina. En algunas realizaciones, el factor antiinflamatorio se selecciona del grupo que consiste en IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA, TGFp y una combinación de los mismos.

En algunas realizaciones, la exposición de MSC a prostaciclina reduce simultáneamente el nivel de expresión de uno o más factores proinflamatorios y aumenta el nivel de expresión de uno o más factores antiinflamatorios. En algunas realizaciones, la exposición de MSC a prostaciclina reduce simultáneamente el nivel de expresión de TNF-a y/o IL-4 y aumenta el nivel de expresión de uno o más factores antiinflamatorios seleccionados del grupo que consiste en IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA y TGFp.

H. Composiciones farmacéuticas

En un aspecto, la presente divulgación proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad terapéuticamente eficaz de una MSC, o una parte de un medio de cultivo que ha estado en contacto con la MSC que comprende uno o más componentes de la MSC, o exosomas derivados de la MSC.

Por ejemplo, la composición farmacéutica comprende MSC que se han expuesto a treprostinil, tales como las descritas en el presente documento. En algunos ejemplos, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% o al menos el 99% de todas las MSC en la composición tienen un nivel de expresión de TNFa que es al menos un 50% menor que el de una MSC de control no expuesta a la prostaciclina. En algunos ejemplos, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80%, al menos el 90%, al menos el 95%, al menos el 98% o al menos el 99% de todas las MSC de la composición tienen un nivel de expresión de al menos uno de IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA y TGFp que es al menos un 50% mayor que el de una MSC de control no expuesta a la prostaciclina.

Por ejemplo, la composición farmacéutica comprende además al menos un portador farmacéuticamente aceptable. La expresión “farmacéuticamente aceptable” se refiere a aquellos compuestos, materiales, composiciones y/o formas de dosificación que son, dentro del ámbito del buen juicio médico, adecuados para su uso en contacto con los tejidos de seres humanos y animales sin excesiva toxicidad, irritación, respuesta alérgica u otro problema o complicación, en consonancia con una relación beneficio/riesgo razonable. La expresión “portador farmacéuticamente aceptable”, tal como se usa en el presente documento, significa un material, una composición o un vehículo farmacéuticamente aceptable, tal como una carga líquida o sólida, un diluyente, un excipiente o un material de encapsulación de disolventes.

Los portadores farmacéuticamente aceptables incluyen solución salina, disoluciones tampón acuosas, disolventes y/o medios de dispersión. El uso de tales portadores se conoce bien en la técnica. La disolución es preferiblemente estéril y fluida hasta el punto de que existe una fácil inyectabilidad. Preferiblemente, la disolución es estable en las condiciones de fabricación y almacenamiento y se conserva contra la acción contaminante de microorganismos tales como bacterias y hongos mediante el uso de, por ejemplo, parabenos, clorobutanol, fenol, ácido ascórbico, timerosal, y similares.

Algunos ejemplos de materiales y disoluciones que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables incluyen (1) azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; (2) almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; (3) celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa y acetato de celulosa; (4) tragacanto en polvo; (5) malta; (6) gelatina; (7) talco; (8) excipientes, tales como manteca de cacao y ceras para supositorios; (9) aceites, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de soja; (10) glicoles, tales como propilenglicol; (11) polioles, tales como glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; (12) ésteres, tales como oleato de etilo y laurato de etilo; (13) agar; (14) agentes de tamponamiento, tales como hidróxido de magnesio e hidróxido de aluminio; (15) ácido algínico; (16) agua libre de pirógenos; (17) solución salina isotónica; (18) solución de Ringer; (19) alcohol etílico; (20) disoluciones de pH tamponado; (21) poliésteres, policarbonatos y/o polianhídridos; y (22) otras sustancias compatibles no tóxicas empleadas en formulaciones farmacéuticas.

Las composiciones farmacéuticas útiles para los métodos de la divulgación pueden comprender un portador polimérico o una matriz extracelular.

Una variedad de materiales de matriz sólida biológicos o sintéticos (por ejemplo, matrices de soporte sólido, adhesivos o apósitos biológicos y andamiajes biológicos/médicos) son adecuados para su uso en esta divulgación. El material de matriz preferiblemente es médicamente aceptable para su uso en aplicaciones in vivo. Los ejemplos no limitativos de tales materiales médicamente aceptables y/o biológica o fisiológicamente aceptables o compatibles incluyen, pero no se limitan a, materiales de matriz sólidos que son absorbibles y/o no absorbibles, tales como la submucosa del intestino delgado (SIS), por ejemplo, de origen porcino (y otras fuentes de SIS); alginato reticulado o no reticulado, hidrocoloides, espumas, gel de colágeno, esponja de colágeno, malla de poli(ácido glicólico) (PGA), malla de poliglactina (PGL), vellones, apósitos de espuma, bioadhesivos (por ejemplo, pegamento de fibrina y gel de fibrina) y equivalentes de piel muerta desepidermizada en una o más capas

Los soportes poliméricos adecuados incluyen mallas o esponjas porosas formadas por polímeros sintéticos o naturales, así como disoluciones poliméricas. Una forma de matriz es una malla o esponja polimérica; la otra es un hidrogel polimérico. Los polímeros naturales que pueden usarse incluyen proteínas tales como colágeno, albúmina y fibrina; y polisacáridos tales como alginato y polímeros de ácido hialurónico. Los polímeros sintéticos incluyen tanto polímeros biodegradables como no biodegradables. Los ejemplos de polímeros biodegradables incluyen polímeros de hidroxiácidos tales como poli(ácido láctico) (PLA), poli(ácido glicólico) (PGA) y poli(ácido láctico-ácido glicólico) (PLGA), poliortoésteres, polianhídridos, polifosfacenos y combinaciones de los mismos. Los polímeros no biodegradables incluyen poliacrilatos, polimetacrilatos, acetato de etileno-vinilo y poli(alcoholes vinílicos).

Los polímeros que pueden formar hidrogeles iónicos o covalentemente reticulados que son maleables se usan para encapsular células. Un hidrogel es una sustancia formada cuando un polímero orgánico (natural o sintético) se reticula mediante enlaces covalentes, iónicos o de hidrógeno para crear una estructura tridimensional de red cristalina abierta que atrapa las moléculas de agua para formar un gel. Los ejemplos de materiales que pueden usarse para formar un hidrogel incluyen polisacáridos tales como alginato, polifosfacinas y poliacrilatos, que se reticulan iónicamente, o copolímeros de bloque tales como Pluronics.TM o Tetronics.TM., copolímeros de bloque de poli(óxido de etileno) polipropilenglicol que se reticulan por temperatura o pH, respectivamente. Otros materiales incluyen proteínas tales como fibrina, polímeros tales como polivinilpirrolidona, ácido hialurónico y colágeno.

En general, estos polímeros son al menos parcialmente solubles en disoluciones acuosas, tales como agua, soluciones salinas tamponadas o disoluciones acuosas de alcohol, que tienen grupos laterales cargados, o una sal iónica monovalente de los mismos. Ejemplos de polímeros con grupos laterales ácidos que pueden reaccionar con cationes son polifosfacenos, poli(ácidos acrílicos), poli(ácidos metacrílicos), copolímeros de ácido acrílico y ácido metacrílico, poli(acetato de vinilo) y polímeros sulfonados, tales como poliestireno sulfonado. También pueden usarse copolímeros con grupos laterales ácidos formados por reacción de monómeros o polímeros de ácido acrílico o metacrílico y vinil éter. Ejemplos de grupos ácidos son grupos ácido carboxílico, grupos ácido sulfónico, grupos alcohol halogenado (preferiblemente fluorado), grupos OH fenólicos y grupos OH ácidos. Ejemplos de polímeros con grupos laterales básicos que pueden reaccionar con aniones son polivinilaminas, polivinilpiridina, polivinilimidazol y algunos polifosfacenos sustituidos con imino. La sal de amonio o cuaternaria de los polímeros también puede formarse a partir de los nitrógenos de la estructura principal o de los grupos imino colgantes. Ejemplos de grupos laterales básicos son grupos amino e imino.

La composición farmacéutica puede comprender al menos un agente terapéutico adicional. Por ejemplo, la composición puede contener un analgésico para ayudar a tratar la inflamación o el dolor, o un agente antiinfeccioso para prevenir la infección del sitio tratado con la composición. Más específicamente, los ejemplos no limitativos de agentes terapéuticos útiles incluyen las siguientes categorías terapéuticas: analgésicos, tales como fármacos antiinflamatorios no esteroideos, agonistas opiáceos y salicilatos; agentes antiinfecciosos, tales como antihelmínticos, agentes antianaerobios, antibióticos, antibióticos aminoglicósidos, antibióticos antifúngicos, antibióticos de cefalosporinas, antibióticos de macrólidos, antibióticos p-lactámicos diversos, antibióticos de penicilinas, antibióticos de quinolonas, antibióticos de sulfonamidas, antibióticos de tetraciclinas, antimicobacterianos, antimicobacterianos antituberculosos, antiprotozoarios, antiprotozoarios antipalúdicos, agentes antivirales, agentes antirretrovirales, escabicidas, agentes antiinflamatorios, agentes antiinflamatorios corticosteroides, antipruriginosos/anestésicos locales, antiinfecciosos tópicos, antiinfecciosos tópicos antifúngicos, antiinfecciosos tópicos antivirales; agentes electrolíticos y renales, tales como agentes acidificantes, agentes alcalinizantes, diuréticos, diuréticos inhibidores de la anhidrasa carbónica, diuréticos del asa, diuréticos osmóticos, diuréticos ahorradores de potasio, diuréticos tiazídicos, sustitutos de electrolitos y agentes uricosúricos; enzimas, tales como enzimas pancreáticas y enzimas trombolíticas, agentes gastrointestinales, tales como antidiarreicos, agentes antiinflamatorios gastrointestinales, agentes antiulcerosos antiácidos, agentes antiulcerosos inhibidores de la bomba de ácido gástrico, agentes antiulcerosos de la mucosa gástrica, agentes antiulcerosos bloqueantes de H2, agentes colelitolíticos, digestores, eméticos, laxantes y ablandadores de heces, y agentes procinéticos; anestésicos generales, tales como anestésicos inhalatorios, anestésicos inhalatorios halogenados, anestésicos intravenosos, anestésicos intravenosos barbitúricos, anestésicos intravenosos benzodiacepínicos y anestésicos intravenosos agonistas opiáceos; hormonas y modificadores hormonales, tales como abortivos, agentes suprarrenales, agentes suprarrenales corticosteroides, andrógenos, antiandrógenos, agentes inmunobiológicos, tales como inmunoglobulinas, inmunosupresores, toxoides y vacunas; anestésicos locales, tales como anestésicos locales de amida y anestésicos locales de éster; agentes musculoesqueléticos, tales como agentes antiinflamatorios contra la gota, agentes antiinflamatorios corticosteroides, agentes antiinflamatorios con compuestos de oro, agentes antiinflamatorios inmunosupresores, agentes antiinflamatorios no esteroideos (AINE), agentes antiinflamatorios con salicilatos, minerales; y vitaminas, tales como vitamina A, vitamina B, vitamina C, vitamina D, vitamina E y vitamina K.

Las composiciones útiles para los métodos de la presente divulgación pueden incluir componentes de cultivo celular, por ejemplo, medios de cultivo que incluyen aminoácidos, metales, factores coenzimáticos, así como pequeñas poblaciones de otras células, por ejemplo, algunas de las cuales pueden surgir por diferenciación posterior de las células madre.

Las composiciones útiles para los métodos de la presente divulgación pueden prepararse, por ejemplo, sedimentando las células en cuestión a partir del medio de cultivo y resuspendiéndolas en la disolución o el material deseado. Las células pueden sedimentarse y/o cambiarse del medio de cultivo, por ejemplo, mediante centrifugación, filtración, ultrafiltración, etc.

I. Administración

Por ejemplo, la composición farmacéutica puede administrarse sola o coadministrarse junto con la prostaciclina. Por ejemplo, la composición farmacéutica y la prostaciclina se administran simultáneamente o la prostaciclina y la composición se administran por separado. Cuando se administran por separado, la prostaciclina puede administrarse antes o después de la administración de la composición de MSC.

El experto puede determinar fácilmente la cantidad de células y portador(es) opcional(es) en las composiciones y que van a administrarse en los métodos de la divulgación. Por ejemplo, cualquier aditivo (además de la(s) célula(s) activa(s)) está presente en una cantidad del 0,001 al 50% (peso) de disolución en solución salina tamponada con fosfato, y el principio activo está presente en el orden de microgramos a miligramos, tal como de aproximadamente el 0,0001 a aproximadamente el 5% en peso, preferiblemente de aproximadamente el 0,0001 a aproximadamente el 1% en peso, todavía más preferiblemente de aproximadamente el 0,0001 a aproximadamente el 0,05% en peso o de aproximadamente el 0,001 a aproximadamente el 20% en peso, preferiblemente de aproximadamente el 0,01 a aproximadamente el 10% en peso y todavía más preferiblemente de aproximadamente el 0,05 a aproximadamente el 5% en peso. Por supuesto, para cualquier composición que va a administrarse a un animal o humano, y para cualquier método particular de administración, se prefiere determinar, por tanto: la toxicidad, tal como, por ejemplo, determinando la dosis letal (DL) y la DL50 en un modelo animal adecuado, por ejemplo, un roedor tal como ratón; y la dosificación de la(s) composición/composiciones, la concentración de los componentes en la(s) misma(s) y el momento de administrar la(s) composición/composiciones que provocan una respuesta adecuada. Tales determinaciones no requieren una experimentación indebida a partir de los conocimientos del experto, la presente divulgación y los documentos citados en el presente documento. Además, el momento de las administraciones secuenciales puede determinarse sin experimentación indebida.

Las composiciones útiles para los métodos de la presente divulgación pueden administrarse mediante, entre otras cosas, inyección localizada, incluyendo administración por catéter, inyección sistémica, inyección localizada, inyección intravenosa, inyección intrauterina o administración parenteral. Cuando se administra una composición terapéutica descrita en el presente documento (por ejemplo, una composición farmacéutica), generalmente se formulará en una forma inyectable de dosificación unitaria (disolución, suspensión, emulsión).

Las composiciones pueden coadministrarse con al menos otro medicamento para la vasculopatía. Por ejemplo, las composiciones farmacéuticas pueden coadministrarse con una prostaglandina I² (PGI²), análogos de prostaciclina, inhibidor de la fosfodiesterasa 5 (PDE-5), antagonista del receptor de endotelina (ETRA), inhibidores de tirosina cinasas o estimulador de la guanilato ciclasa soluble.

El método para tratar la vasculopatía comprende además reducir la trombosis en las arterias pulmonares, reducir la inflamación en las arterias pulmonares, reducir la proliferación del músculo liso de la íntima en las arterias pulmonares, reducir la formación de lesiones plexiformes en las arterias pulmonares, aumentar la cantidad de óxido nítrico en las arterias pulmonares, aumentar la cantidad de PGI2 en las arterias pulmonares, reducir el nivel de endotelina 1 en las arterias pulmonares, reducir la cantidad de factores de crecimiento en las arterias pulmonares o fomentar una morfología endotelial adecuada en las arterias pulmonares.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos pretenden proporcionar, a los expertos en la técnica, una divulgación y descripción completas de cómo realizar y usar los métodos y las composiciones descritos en el presente documento, y no pretenden ser limitativos.

Ejemplo 1 - Estudios de fenotipo y morfología de MSC

Este ejemplo verifica el fenotipo de las células MSC expuestas a treprostinil y determina un intervalo de dosis óptimo para la exposición a treprostinil sin producir efectos citotóxicos sobre la célula MSC.

Se expandió un único vial de MSC derivadas de médula ósea humana y se sembró usando un medio de crecimiento convencional. A una confluencia del 95-99%, se lavaron las células a fondo con solución salina tamponada con fosfato (PBS) y se expusieron a medios que contenían treprostinil a dosis que oscilaban desde 250 |ig/ml hasta 0,004 |ig/ml. Después de 48 horas de cultivo, se fotografiaron las células y se evaluaron los cambios morfológicos inducidos por el tratamiento.

El análisis por citometría de flujo (figura 1) demostró que las MSC de médula ósea usadas en este estudio eran negativas o bajas para CD34, CD45 y HLA-DR y positivas para los marcadores de MSC CD73, CD105 y CD90. La definición de MSC la estableció la Sociedad Internacional de Terapia Celular (Dominici et al., Cytotherapy 8(4):315-7, 2006).

Las imágenes de las MSC expuestas a diferentes concentraciones de treprostinil (figura 2) mostraron que las MSC aparecen redondeadas y desprendidas a la dosis más alta de Tre (250 |ig/ml), lo que es indicativo de un efecto citotóxico del treprostinil sobre las MSC. Por otro lado, el treprostinil a dosis de 83,3 |ig/ml o inferiores no provocó cambios morfológicos asociados a la muerte celular.

Este ejemplo demuestra que las dosis altas de treprostinil afectan negativamente a la viabilidad de las células MSC, mientras que las dosis de treprostinil inferiores a 83,3 |ig/ml no provocaron este efecto citotóxico (figura 2). Los estudios posteriores incluyeron un intervalo de dosis bajas de treprostinil para evitar los efectos citotóxicos.

Ejemplo 2 - Efectos del treprostinil sobre las citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias

En este ejemplo se examinó el efecto del treprostinil sobre la producción de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias en las MSC.

Se recogieron las células expuestas a treprostinil que oscilaban desde 250 |ig/ml - 0,004 |ig/ml tal como se describió en el ejemplo 1. Se extrajo el ARN de las células y luego se analizó en busca de citocinas proinflamatorias y antiinflamatorias. Se ha identificado que las citocinas, o pequeñas proteínas implicadas en la señalización celular tanto interna como secretada, desempeñan un papel en la patogenia inflamatoria de la HAP (Groth et al., Respiratory Research, 15:47 (2014)).

Bajo hipoxia prolongada in vivo, los niveles circulantes de TNFa aumentaron un 48% en comparación con el control (figuras 3A y 3B). La exposición in vitro a treprostinil a dosis entre 83,3 y 0,3 |ig/ml disminuyó el nivel de expresión de la citocina proinflamatoria TNFa en las MSC.

La exposición de MSC a dosis crecientes de treprostinil reveló un aumento de la señalización de IL10 e IL13 con respecto al control (figura 4).

En los ratones con HAP inducida por hipoxia, se observó un aumento del 48% en los niveles circulantes de TNFa (figura 3A). Curiosamente, la exposición con treprostinil de 0,3 |ig/ml a 83,3 |ig/ml redujo la expresión de TNFa hasta 4,7 veces en comparación con el control (figura 3B). Otros análisis revelaron que el mismo intervalo de dosis de treprostinil aumentó el nivel de expresión de las citocinas antiinflamatorias IL10 e IL13. Específicamente, la expresión de IL10 en las MSC aumentó 5,4 veces cuando se expusieron a 9,3 |ig/ml de treprostinil. La expresión de IL13 en las MSC aumentó 8,8 veces cuando se expusieron a 27,8 |ig/ml de treprostinil (figura 4). Estos datos indican que el potencial antiinflamatorio de las MSC fue inducido por la exposición a bajas concentraciones de treprostinil.

Ejemplo 3 - Efectos del treprostinil sobre la producción de factores inmunosupresores

En este ejemplo se examinó el efecto del treprostinil sobre la producción de MSC de varios factores inmunosupresores.

Volvió a analizarse el ARN de las MSC expuestas a treprostinil de desde 250 |ig/ml hasta 0,004 |ig/ml para detectar otros factores antiinflamatorios. Se evaluaron los genes que han demostrado desempeñar un papel específico en las propiedades inmunosupresoras de las MSC, incluyendo IDO1, iNOS, HLA y TGFp (Hoogduijn et al., International Immunopharmacology, 1496-1500(2010)).

Las MSC expuestas a dosis crecientes de treprostinil revelaron un fuerte aumento de los factores antiinflamatorios IDO1, iNOS, HLA y TGFp con respecto al control (figura 5).

La exposición de las MSC a 9,3 |ig/ml de treprostinil disminuyó TNFa (citocina proinflamatoria) y aumentó IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA y TGFp (factores antiinflamatorios) con respecto al control no expuesto (figura 6).

Este ejemplo demuestra que las MSC expuestas a dosis crecientes de treprostinil revelaron un fuerte aumento de los factores antiinflamatorios IDO1, iNOS, HLA y TGFp con respecto al control (figura 5). Este perfil de expresión génica, junto con el perfil de citocinas del ejemplo 2, indican una alteración en el patrón de expresión génica de las MSC después de 48 horas de exposición a múltiples dosis de treprostinil in vitro. La exposición a 9,3 |ig/ml de treprostinil disminuyó la citocina proinflamatoria TNFa y aumentó varios factores antiinflamatorios, incluyendo IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA y TGFp (figura 6). Estos datos sugieren que las MSC expuestas a treprostinil pueden servir como factor inmunomodulador en el tratamiento de la enfermedad.

En la figura 7 se ilustra un modelo propuesto para el efecto inmunomodulador de la exposición a treprostinil. En particular, la exposición a treprostinil de las MSC disminuyó las citocinas proinflamatorias y aumentó las antiinflamatorias a través de la señalización intracelular (1) o nuclear (2, 3, 4). Un análisis adicional reveló la reprogramación genética de las MSC expuestas a treprostinil hacia un estado antiinflamatorio a través de la señalización nuclear (2) medida por los cambios en la expresión del ARN (3).

Claims (11)

REIVINDICACIONES

1. Composición para su uso en un método de tratamiento o prevención de vasculopatía, que comprende

administrar a un sujeto que lo necesita una composición que comprende (i) un medio de cultivo que ha estado en contacto con una célula madre mesenquimatosa (MSC) y comprende un exosoma derivado de la MSC, o (ii) un exosoma aislado derivado de la MSC,

en la que la MSC se ha expuesto a de 0,3 |ig/ml a 83,3 |ig/ml de prostaciclina ex vivo, en la que la MSC se expone a la prostaciclina durante al menos 48 horas, y en la que la exposición a la prostaciclina aumenta la expresión de uno o más factores antiinflamatorios y/o reduce la expresión de uno o más factores proinflamatorios en la MSC, en comparación con una MSC de control no expuesta a la prostaciclina, en la que la vasculopatía es una hipertensión pulmonar.

2. Composición para su uso según la reivindicación 1, en la que la MSC se ha expuesto a de 0,3 |ig/ml a 10 |ig/ml de prostaciclina.

3. Método para preparar una composición que comprende (i) un medio de cultivo que ha estado en contacto con una célula madre mesenquimatosa (MSC) y comprende un exosoma derivado de la MSC, o (ii) un exosoma aislado derivado de la MSC, en el que el método comprende exponer la MSC a de 0,3 |ig/ml a 83,3 |ig/ml de una prostaciclina ex vivo, en el que la MSC se expone a la prostaciclina durante al menos 48 horas, y en el que la exposición con la prostaciclina aumenta la expresión de uno o más factores antiinflamatorios y/o reduce la expresión de uno o más factores proinflamatorios en la MSC, en comparación con una MSC de control no expuesta a la prostaciclina; y aislar el medio de cultivo que ha estado en contacto con la MSC, o el exosoma derivado de la MSC.

4. Método según la reivindicación 3, que comprende exponer la MSC a de 0,3 |ig/ml a 50 |ig/ml o a de 0,3 |ig/ml a 10 |ig/ml de prostaciclina.

5. Composición para su uso según la reivindicación 1 o método según la reivindicación 3, en la que la prostaciclina es treprostinil, un derivado o una sal del mismo.

6. Composición para su uso según la reivindicación 1 o método según la reivindicación 3, en la que la MSC se expone a la prostaciclina tras la expansión.

7. Composición para su uso según la reivindicación 1 o método según la reivindicación 3, en la que la MSC expuesta a la prostaciclina tiene un nivel de expresión reducido de factor de necrosis tumoral alfa (TNFa), en comparación con una MSC de control no expuesta a la prostaciclina;

en la que la MSC expuesta a la prostaciclina tiene un nivel de expresión aumentado de uno o más factores antiinflamatorios seleccionados del grupo que consiste en IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA y TGFp, en comparación con una MSC de control no expuesta a la prostaciclina;

en la que la MSC expuesta a la prostaciclina tiene un nivel de expresión de TNFa que es al menos un 50% menor que el de una MSC de control no expuesta a la prostaciclina; o

en la que la MSC expuesta a la prostaciclina tiene un nivel de expresión al menos uno de IL10, IL13, IDO, iNOS, HLA y TGFp que es al menos un 50% mayor que el de una MSC de control no expuesta a la prostaciclina.

8. Composición para su uso según la reivindicación 1, que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una composición que comprende una MSC, en la que la MSC se ha expuesto ex vivo a treprostinil o a una sal del mismo a una concentración de 0,3 a 10 |ig/ml durante al menos 24 horas; que comprende administrar al sujeto una composición que comprende una parte de un medio de cultivo que ha estado en contacto con la MSC y comprende uno o más componentes de la MSC, en la que la MSC se ha expuesto ex vivo a treprostinil o a una sal del mismo a una concentración de 0,3 a 10 |ig/ml durante al menos 24 horas, y en la que el uno o más componentes de la MSC se seleccionan del grupo que consiste en un exosoma, una microvesícula, un microARN, un ARN mensajero, un ARN no codificante, una mitocondria, un factor de crecimiento y las combinaciones de los mismos; o

que comprende administrar a un sujeto que lo necesita una composición que comprende un exosoma derivado de la MSC, en la que la MSC se ha expuesto ex vivo a treprostinil o a una sal del mismo a una concentración de 0,3 a 10 |ig/ml durante al menos 24 horas.

9. Composición para su uso según la reivindicación 1 o método según la reivindicación 3, en la que la MSC se expone a una composición que comprende treprostinil o una sal del mismo que tiene una concentración de 0,3 |ig/ml a 10 |ig/ml durante al menos 24 horas.

10. Composición que comprende el medio de cultivo aislado que ha estado en contacto con la MSC o el exosoma aislado obtenido mediante el método según la reivindicación 3, que comprende preferiblemente además al menos un portador farmacéuticamente aceptable o al menos un agente terapéutico adicional para tratar o prevenir la hipertensión pulmonar.

11. Composición según la reivindicación 1 o método según la reivindicación 3, en la que la composición comprende el exosoma aislado derivado de la MSC.