JP7179723B2 - トレプロスチニルによるｍｓｃの免疫調節特性の増強 - Google Patents

Description

関連出願の相互参照
本出願は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている２０１６年１０月２４日に出願された米国特許仮出願第６２／４１１，９５０号の優先権を主張するものである。

本出願は、抗炎症特性を有する間葉系幹細胞、このような間葉系幹細胞を生成する方法、このような間葉系幹細胞から得られた物質、血管症の治療における間葉系幹細胞および間葉系幹細胞から得られた物質の使用に関する。血管症には、以下に限定されないが、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）、他の種類の肺高血圧症、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症虚血肢（ＣＬＩ）、冠動脈疾患、および糖尿病性血管症が含まれる。

肺高血圧症は、肺血管系に影響を及ぼす、稀で進行性の生命を脅かす疾患である。具体的には、肺高血圧症では、肺血管系における圧力が上昇し、これはいくつかある転帰の中で心不全を招く可能性がある。現在、肺高血圧症は、世界保健機関（ＷＨＯ）の臨床分類システム（２００８年のＤａｎａ Ｐｏｉｎｔ）に従って下記の群に分類される：
第１群：肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）、
第１’群：肺静脈閉塞性疾患（ＰＶＯＤ）および／または肺毛細血管腫症（ＰＣＨ）、
第２群：左心性心疾患に伴う肺高血圧症、
第３群：肺疾患および／または低酸素血症に伴う肺高血圧症、
第４群：慢性血栓塞栓性肺高血圧症（ＣＴＥＰＨ）、および
第５群：詳細不明な多因子のメカニズムを伴うＰＨ。

肺動脈性肺高血圧症は、特定の種類の肺高血圧症であり、治療しない場合、平均して診断後２．８～５年以内に死に至る（Keily et al. (2013) BMJ 346:f2028）。肺循環の収縮が増大すると、右心への負荷が増加し、これによって右心不全を発症する場合がある。定義上、慢性肺高血圧症の症例における平均肺動脈圧（ｍＰＡＰ）は、安静時に＞２５ｍｍＨｇまたは労作時に＞３０ｍｍＨｇである（正常値＜２０ｍｍＨｇ）。肺動脈性肺高血圧症の病態生理は、肺血管の血管収縮およびリモデリングを特徴とする。慢性ＰＡＨでは、初期には筋化していない（unmuscularized）肺血管の筋肉新生（neomuscularization）が生じ、既に筋化した（muscularized）血管の血管筋が周囲で増加する。この結果生じた肺動脈圧の上昇によって右心への負荷が累積し、これは右心からの拍出量の減少を招き、最終的に右心不全をもたらす（M. Humbert et al., J. Am. Coll. Cardiol. 2004, 43, 13S-24S）。ＰＡＨは、稀な障害であり、百万人あたり１～２人の有病率である。患者の平均年齢は３６歳と推定されており、患者の１０％のみが６０歳を超えていた。明らかに、男性より多くの女性が罹患している（G. E. D'Alonzo et al., Ann. Intern. Med. 1991, 115, 343-349）。

市場で入手可能な標準的治療法（例えば、プロスタサイクリンアナログ、エンドセリン受容体拮抗薬、ホスホジエステラーゼ阻害剤）は、患者の生活の質および運動耐容能を改善することができる。これらの医薬品は、重篤な副作用をもたらす可能性があり、かつ／または複雑な投与形態を用いて送達しなければならない。患者は、単独療法後に状態が悪化した際または悪化した後のいずれかにおいて、組合せ療法を受けることが多い。治療の進歩にもかかわらず、ＰＡＨが治癒する方法はない。

したがって、ＰＡＨを含む血管症を治療するための、改善された治療用組成物および治療法を開発する必要性がある。

一態様において、本開示は、血管症を治療または予防する方法であって、（ｉ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物、または（ｉｉ）ＭＳＣと接触させた、ＭＳＣの１種または複数の成分を含む培養培地の一部を含む組成物、または（ｉｉｉ）ＭＳＣ由来のエクソソームを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、ＭＳＣは、ｅｘ ｖｉｖｏでプロスタサイクリンに曝露されており、プロスタサイクリンへの曝露が、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、ＭＳＣにおける１種または複数の抗炎症性因子の発現を増加させ、かつ／または１種または複数の炎症誘発性因子の発現を減少させる、方法を提供する。

いくつかの実施形態において、投与前に、ＭＳＣは、０．３μｇ／ｍＬ～８３．３μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンに曝露される。他の実施形態において、投与前に、ＭＳＣは、０．３μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンに曝露される。

いくつかの実施形態において、プロスタサイクリンは、トレプロスチニル、その誘導体または薬学的に許容される塩である。

いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、プロスタサイクリンに少なくとも２４時間曝露される。他の実施形態において、ＭＳＣは、プロスタサイクリンに少なくとも４８時間曝露される。

いくつかの実施形態において、治療される血管症は、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症虚血肢（ＣＬＩ）、冠動脈疾患、および糖尿病性血管症からなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、増殖後にプロスタサイクリンに曝露される。

いくつかの実施形態において、プロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣは、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の発現レベルを減少させている。いくつかの実施形態において、プロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣは、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、インターロイキン－４（ＩＬ－４）の発現レベルを減少させている。

他の実施形態において、プロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣは、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβからなる群から選択される１種または複数の抗炎症性因子の発現レベルを増加させている。

いくつかの実施形態において、プロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣは、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％低いＴＮＦαの発現レベルを有する。他の実施形態において、プロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣは、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％高いＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβのうちの少なくとも１種の発現レベルを有する。

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＭＳＣを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、ＭＳＣは、ｅｘ ｖｉｖｏで、濃度が０．３～１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルまたは薬学的に許容されるその塩に、少なくとも２４時間曝露されている。

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＭＳＣと接触させた、ＭＳＣの１種または複数の成分を含む培養培地の一部を含む組成物を、対象に投与することを含み、ＭＳＣは、ｅｘ ｖｉｖｏで、濃度が０．３～１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルまたはその薬学的に許容される塩に、少なくとも２４時間曝露されており、ＭＳＣの１種または複数の成分は、エクソソーム、微小胞、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖因子、およびその組合せからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、本発明の方法は、ＭＳＣ由来のエクソソームを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、ＭＳＣは、ｅｘ ｖｉｖｏで、濃度が０．３～１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルまたはその薬学的に許容される塩に、少なくとも２４時間曝露されている。

いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、濃度が０．３μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルまたはその薬学的に許容される塩に、少なくとも２４時間曝露される。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物、またはＭＳＣと接触させた、ＭＳＣの１種または複数の成分を含む培養培地を含む組成物を調製する方法であって、ＭＳＣをｅｘ ｖｉｖｏでプロスタサイクリンに曝露させるステップであって、プロスタサイクリンへの曝露が、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、ＭＳＣにおける１種または複数の抗炎症性因子の発現を増加させ、かつ／または１種または複数の炎症誘発性因子の発現を減少させる、ステップ、およびＭＳＣまたはＭＳＣの培養培地もしくはＭＳＣの１種または複数の成分を分離するステップを含む方法も提供される。

いくつかの実施形態において、本方法は、０．３μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンでＭＳＣを処理することを含む。他の実施形態において、本方法は、０．３μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンにＭＳＣを曝露させることを含む。

いくつかの実施形態において、プロスタサイクリンは、トレプロスチニル、その誘導体または塩である。いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、プロスタサイクリンに少なくとも２４時間曝露される。他の実施形態において、ＭＳＣは、プロスタサイクリンに少なくとも４８時間曝露される。

いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、増殖後にプロスタサイクリンに曝露される。

いくつかの実施形態において、プロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣは、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、ＴＮＦαの発現レベルを減少させている。他の実施形態において、プロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣは、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβからなる群から選択される１種または複数の抗炎症性因子の発現レベルを増加させている。

いくつかの実施形態において、プロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣは、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％低いＴＮＦαの発現レベルを有する。他の実施形態において、プロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣは、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％高いＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβのうちの少なくとも１種の発現レベルを有する。

いくつかの実施形態において、ＭＳＣの１種または複数の成分は、エクソソーム、微小胞、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖因子、およびその組合せからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、濃度が０．３μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルまたはその塩に、少なくとも２４時間曝露される。

いくつかの実施形態において、本方法は、培養培地からエクソソームを分離することをさらに含む。

本発明の方法によって得られた、トレプロスチニルに曝露されたＭＳＣを含む組成物も提供される。いくつかの実施形態において、組成物中のＭＳＣの少なくとも５０％は、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％低いＴＮＦαの発現レベルを有する。いくつかの実施形態において、組成物中のＭＳＣの少なくとも５０％は、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％高いＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβのうちの少なくとも１種の発現レベルを有する。

本発明の方法によって得られた分離されたエクソソームを含む組成物も提供される。

いくつかの実施形態において、組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施形態において、このような組成物は、血管症を治療または予防するための少なくとも１種の追加の治療剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は、ＮＯ刺激薬（例えば、タダラフィル（Ａｄｃｉｒｃａ）および可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激薬（Ｐｒｏ－ＳＧＣ）などのＰＤＥ５阻害剤）、エンドセリン受容体拮抗薬、および他のプロスタサイクリンからなる群から選択され得る。

本開示の実施形態として提供されるものは、例証を用いて説明するのみであり、限定するものではない図である。

ヒト骨髄由来ＭＳＣの免疫表現型分析の結果を示す図である。 培養下で様々な濃度のトレプロスチニルに４８時間曝露されたＭＳＣの代表的な画像を提供する図である。 ＭＳＣの炎症に対するトレプロスチニルへの曝露の作用を示すグラフである。図３Ａは、ｉｎ ｖｉｖｏの慢性低酸素下におけるＴＮＦαの血中レベルが対照と比較して４８％増加したことを示す。図３Ｂは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、８３．３μｇ／ｍＬ～０．３μｇ／ｍＬの間の用量のトレプロスチニルへの曝露が、ＭＳＣにおける炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦαの発現を減少させたことを示す。 トレプロスチニルへの曝露によって、抗炎症性因子であるＩＬ１０およびＩＬ１３の発現レベルが増加したことを例示するグラフである。 トレプロスチニルへの曝露によって、抗炎症性因子であるＩＤＯ１、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβの発現レベルが増加したことを例示するグラフである。 ９．３μｇ／ｍＬのトレプロスチニルへの曝露による免疫調節作用に関する要約を示すグラフである。 ＭＳＣにおけるトレプロスチニルへの曝露による免疫調節作用に関する可能性モデル（potential model）を示す図である。具体的には、トレプロスチニルへの曝露によって、細胞内シグナル伝達（１）または核シグナル伝達（２、３、４）を介し、炎症誘発性サイトカインの発現が減少し、抗炎症性サイトカインの発現が増加した。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を、比較的低濃度のトレプロスチニルなどのプロスタサイクリンに曝露させることは、抗炎症性表現型をもたらす。ＭＳＣを低濃度のプロスタサイクリンに曝露させることは、それらの独自の遺伝子発現パターンに基づいて、ＭＳＣの治療上の可能性を増大させる。

高濃度、例えば、２５０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルに曝露されたＭＳＣは、ＭＳＣにおける血管新生を促進する因子の発現を亢進させた。しかし、ＭＳＣの高濃度のトレプロスチニルへの曝露は、場合によってはＰＡＨ治療において望ましくないと思われる炎症誘発性因子の発現も促進し、さらに細胞生存率に悪影響も及ぼした。本発明者らは、本明細書に記載されているとおり、低濃度のプロスタサイクリンへの曝露（例えば、１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニル）は、ＭＳＣにおける炎症誘発性因子の発現を減少させ、抗炎症性因子の発現を増加させることを予想外に発見した。例えば、ＭＳＣの低濃度のトレプロスチニルへの曝露は、トレプロスチニルに曝露されたＭＳＣにおいて、ＴＮＦαの発現を顕著に減少させ、ＩＬ－１０およびＩＬ－１３の発現を顕著に増加させた。ＭＳＣの低濃度のトレプロスチニルへの曝露は、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβなどの他の抗炎症性因子の発現も増加させた。

本明細書に記載されているとおりにプロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣ、およびこのようなＭＳＣの生成物は、治療剤として適用することができる。例えば、患者に投与する前に、ＭＳＣを低濃度のプロスタサイクリンに曝露させ、抗炎症性とすることによって準備してもよい。別の例として、適切な濃度のトレプロスチニルなどのプロスタサイクリンで処理したＭＳＣから得られたエクソソームは、ＰＡＨなどの血管症を治療するために投与することが可能である。本発明が、バイオプロセスステップにおいて、ペプチドおよび小胞など、治療剤として使用してよいＭＳＣ分泌シグナルを変化または増強させるために使用し得ることはさらに検討される。

Ａ．定義
別段の指定がない限り、「１つの（ａ）」または「１つの（ａｎ）」は、「１つまたは複数」を意味する。

別段具体的に定義されていない限り、本明細書で用いる専門用語および科学用語のすべては、当技術分野（例えば、幹細胞生物学、細胞培養、分子遺伝学、免疫学、免疫組織化学、タンパク質化学、および生化学）の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を持つと解すべきである。

別段の指示がない限り、本開示で用いた組換えタンパク質技術、細胞培養技術、および免疫学的技術は、当業者に公知の標準の手順である。このような技術は、J. Perbal, A Practical Guide to Molecular Cloning, John Wiley and Sons (1984)、J. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory Press (1989)、T. A. Brown (editor), Essential Molecular Biology: A Practical Approach, Volumes 1 and 2, IRL Press (1991)、D. M. Glover and B. D. Hames (editors), DNA Cloning: A Practical Approach, Volumes 1-4, IRL Press (1995 and 1996)、F. M. Ausubel et al. (editors), Current Protocols in Molecular Biology, Greene Pub. Associates and Wiley-Interscience (1988, including all updates until present)、Ed Harlow and David Lane (editors) Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, (1988)、およびJ. E. Coligan et al. (editors) Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons（現在までの全ての改訂版を含む）などの出典中の文献全体を通して記載および説明され、参照によって本明細書に組み込まれる。

本明細書で用いる場合、「対象」（本明細書では「患者」とも呼ばれる）という用語は、ヒトを含む温血動物、好ましくは哺乳動物を含む。好ましい実施形態において、対象は霊長類である。さらにより好ましい実施形態において、対象はヒトである。

本明細書で用いる場合、「治療すること」、「治療する」、または「治療」という用語は、疾患もしくは状態または１種もしくは複数のその症状が、疾患または状態が、「治癒」または「回復」したと判断されるか否かにかかわらず、またすべての症状が消失したか否かにかかわらず、除去、改善、軽減、または寛解することを含む。これらの用語は、疾患もしくは状態または１種もしくは複数のその症状の進行を低減または予防すること、疾患もしくは状態または１種もしくは複数のその症状の基礎となるメカニズムを阻害または阻止すること、ならびに何らかの治療的および／もしくは予防的利益を得ることも含む。

本明細書で用いる場合、「予防すること」、「予防する」、または「予防」という用語は、疾患もしくは状態または１種もしくは複数のその症状の発生が、未治療対照サンプルと比較して減少し、または疾患もしくは状態の１種もしくは複数のその症状の発症が、未治療対照サンプルと比較して遅延することを含む。

本明細書で用いる場合、「炎症誘発性因子」という用語は、概ね炎症プロセスを促進する、そうでなければ炎症プロセスと明確に関連している分子を指す。炎症誘発性因子には、以下に限定されないが、炎症誘発性サイトカインが含まれる。炎症誘発性因子には、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）、インターロイキン１（ＩＬ－１）、インターロイキン６（ＩＬ－６）、インターロイキン２１（ＩＬ－２１）、単球走化性タンパク質－１（ＭＣＰ１）、および単球走化性タンパク質－５（ＭＣＰ－５）が含まれる。

本明細書で用いる場合、「抗炎症性因子」という用語は、概ね炎症プロセスを阻害する、そうでなければ抗炎症プロセスと明確に関連している分子を指す。抗炎症性因子には、以下に限定されないが、抗炎症性サイトカインが含まれる。抗炎症性因子には、インターロイキン１０（ＩＬ１０）、インターロイキン１３（ＩＬ１３）、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβが含まれる。

Ｂ．血管症
血管症には、以下に限定されないが、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）を含む肺高血圧症、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症虚血肢（ＣＬＩ）、冠動脈疾患、および糖尿病性血管症が含まれる。

多くの原因および状態が、ＰＡＨに関連していることが認められているが、それらの多くは、共通して、複数の根本的な病理生理学的特徴を共有している。これらのプロセス中の１つの重要な特徴は、すべての血管壁の内側の細胞層である内皮の機能不全であり、内皮は、血管の緊張（vessel tone）および修復を調節し、血塊形成を阻害する大規模な一連の物質の生成および代謝を通常担っている。ＰＡＨの場合、内皮細胞機能不全は、有害物質の過剰な生成および保護物質の生成障害を招き得る。このことが、ＰＡＨの発生における最初の事象または下流カスケードの一部であるかどうかは不明のままであるが、いずれの場合も、疾患を特徴付ける進行性の血管収縮および血管増殖において重要な因子である。

末梢血管疾患（ＰＶＤ）という用語は、末梢の動脈および静脈内の損傷、機能不全、または閉塞を指す。末梢動脈疾患は、ＰＶＤの最も一般的な形態である。末梢血管疾患は、動脈の最も一般的な疾患であり、米国では極めて一般的な状態である。そのほとんどが、５０歳を超えるヒトに発生する。末梢血管疾患は、糖尿病のヒトと同様に、５０歳を超えるヒトにおける障害の原因の第一位である。米国の約１千万のヒトは、末梢血管疾患を有し、これは５０歳を超えるヒトの約５％を意味する。この状態を有する人数は、人口の高齢化にともない多くなると予想される。男性は、女性よりもわずかに末梢血管疾患に罹りやすい。

進行した末梢動脈閉塞による重症虚血肢（ＣＬＩ）は、安静時の血流量および酸素輸送量の減少を特徴とし、これは安静時の筋肉痛および回復しない皮膚の潰瘍または壊疽をもたらす（Rissanen et al., Eur. J. Clin. Invest. 31:651-666 (2001)、Dormandy and Rutherford, J. Vasc. Surg. 31:S1-S296 (2000)）。重症虚血肢は、１年間に百万人あたり５００～１０００人が発症していると推定される（"Second European Consensus Document on Chronic Critical Leg Ischemia", Circulation 84(4 Suppl.) IV 1-26 (1991)）。重症虚血肢の患者では、切断が、それに関連する病的状態、死亡率、および機能的意義にもかかわらず、機能障害をもたらす症状に対する解決策として推奨されることが多い（M. R. Tyrrell et al., Br. J. Surg. 80: 177-180 (1993)、M. Eneroth et al., Int. Orthop. 16: 383-387 (1992)）。重症虚血肢に対する最適な薬物療法は存在しない（Circulation 84(4 Suppl.): IV 1-26 (1991)）。

冠動脈疾患（アテローム性動脈硬化症）は、１つまたは複数の冠動脈がプラークの蓄積を介して徐々に閉塞される、ヒトにおける進行性の疾患である。この疾患を有する患者の冠動脈は、バルーン血管形成術または部分的に閉塞した動脈を開いて支えるためのステントの挿入によって治療されることが多い。最終的に、これらの患者は、多額の費用とリスクを負担し、冠動脈バイパス術を受けることを求められる。

Ｃ．間葉系幹細胞（ＭＳＣ）
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）は、骨髄、血液、歯髄細胞、脂肪組織、皮膚、脾臓、膵臓、脳、腎臓、肝臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、リンパ節、胸腺、骨格、靱帯、腱、骨格筋、真皮、および骨膜で発見された細胞である。ＭＳＣは、中胚葉、内胚葉、および外胚葉などの異なる生殖細胞系に分化することが可能である。したがって、ＭＳＣは、以下に限定されないが、脂肪組織、骨組織、軟骨組織、弾性組織、筋組織、および線維性結合組織を含む多くの細胞種に分化することが可能である。ＭＳＣが属する特定の分化系列決定および分化経路は、機械的影響、および／または増殖因子、サイトカインなどの内因性生理活性因子、および／または宿主組織によって確立される局所的な微小環境条件を含む種々の影響によって決まる。したがって、ＭＳＣは、分裂して、いずれ不可逆的に分化して表現型細胞を生じる幹細胞または前駆細胞のいずれかである娘細胞を生じる非造血先祖細胞である。ＭＳＣの例には、間葉系前駆細胞（ＭＰＣ）が含まれる。

本明細書で用いる場合、「幹細胞」という用語は、表現型および遺伝子型が同一の娘細胞、さらに少なくとも他に１種の最終的な細胞種（例えば、最終分化細胞）に成長することが可能である自己再生細胞を指す。「幹細胞」という用語には、全能性細胞、多能性細胞、および多分化能性細胞、さらにその分化から得られる先祖細胞および／または前駆細胞が含まれる。

本明細書で用いる場合、「全能細胞」または「全能性細胞」という用語は、完全な胚（例えば、胚盤胞）を形成することができる細胞を指す。

本明細書で用いる場合、「多能細胞」または「多能性細胞」という用語は、完全な分化万能性、すなわち、哺乳動物の身体の約２６０の細胞種のいずれにも成長する能力を有する細胞を指す。多能細胞は、自己再生することができ、組織内で休眠または静止状態を保つことができる。

「多分化能性細胞」または「多分化能細胞」という用語は、複数の成熟細胞種のいずれにも成長することが可能である細胞を指す。本明細書で用いる場合、この語句は、成体幹細胞または胚性幹細胞および先祖細胞、ならびにこれらの細胞の多分化能性子孫を包含する。多能細胞とは異なり、多分化能細胞は、すべての細胞種を形成する能力は持たない。

本明細書で用いる場合、「先祖細胞」または「前駆細胞」という用語は、特定の種類の細胞に分化すること、または特定の種類の組織を形成することが決定されている細胞を指す。

一実施形態において、細胞は、対象から得られたサンプルから濃縮される。「濃縮された」、「濃縮」、およびその変化形の用語は、特定の１つの細胞種の割合または特定の複数の細胞種の割合が、未処理の集団と比較して増加している細胞集団を説明するために本明細書で用いられる。

一実施形態において、本開示で使用された細胞は、ＴＮＡＰ^＋、ＳＴＲＯ－１^＋、ＶＣＡＭ－１^＋、ＴＨＹ－１^＋、ＳＴＲＯ－２^＋、ＣＤ４５^＋、ＣＤ１４６^＋、３Ｇ５^＋、またはその任意の組合せである。

所定のマーカーに対して「陽性」（同じく「＋」）とされる細胞は、マーカーが細胞表面に存在する程度に応じてそのマーカーの低（ｌｏまたはｄｉｍ）または高（ｂｒｉｇｈｔ、ｂｒｉ）発現体（expresser）のいずれかであり得ることを意味し、この用語は、細胞の色選別プロセスで使用される蛍光または他の色の強度を指す。ｌｏ（またはｄｉｍもしくはｄｕｌｌ）およびｂｒｉの区別は、選別された特定の細胞集団に使用されたマーカーとの関係において理解されると予想される。所定のマーカーに対して「陰性」（または「－」）とされる細胞は、マーカーがその細胞によってまったく発現されないことを意味するわけではない。これは、マーカーがその細胞によって比較的極めて低いレベルで発現されること、また検出可能な標識を施した場合に、極めて低いシグナルを生じることを意味する。いくつかの実施形態において、「陰性」は、プロスタサイクリンへの曝露など、何らかの方法で処理された細胞に存在しない、または減少した量で存在するマーカーを指すことができる。いくつかの実施形態において、「陰性」は、プロスタサイクリンに曝露されていない対照サンプルと比較して、曝露させた細胞に少なくとも５０％減少した量で存在するマーカーを指す。

本明細書で用いる場合、「ＴＮＡＰ」という用語は、組織非特異的アルカリホスファターゼのすべてのアイソフォームを包含することを意図している。例えば、この用語は、肝臓アイソフォーム（ＬＡＰ）、骨アイソフォーム（ＢＡＰ）、および腎臓アイソフォーム（ＫＡＰ）を包含する。好ましい実施形態において、ＴＮＡＰはＢＡＰである。特に好ましい実施形態において、本明細書で用いる場合、ＴＮＡＰは、ブダペスト条約の規定の下、受託番号ＰＴＡ－７２８２で２００５年１２月１９日にＡＴＣＣに寄託されたハイブリドーマ細胞株によって生成されたＳＴＲＯ－３抗体を結合することができる分子を指す。

本方法に有用な幹細胞は、成体組織、胚、胚体外組織、または胎児から得ることができる。「成体」という用語は、その最も広い意味で使用され、出生後の対象を含む。好ましい実施形態において、「成体」という用語は、思春期後である対象を指す。「成体」という用語は、本明細書で用いる場合、雌から得た臍帯血を含む場合もある。

いくつかの態様において、幹細胞は、子孫細胞（増殖後細胞（expanded cells）とも呼ぶことができる）であってよい。子孫細胞は、本明細書に記載されている幹細胞のｉｎ ｖｉｔｒｏ培養から生成され得る。本開示の増殖後細胞は、培養条件（培養培地中の刺激因子の数および／または種類を含む）、継代数などに応じて多種多様な表現型を有すると思われる。特定の実施形態において、子孫細胞は、親集団から約２、約３、約４、約５、約６、約７、約８、約９、または約１０継代後に得られる。しかし、子孫細胞は、親集団から任意の継代数後に得られてもよい。また、子孫細胞は、適当な培養培地で培養することによって得ることができる。

一実施形態において、子孫細胞は、ＳＴＲＯ－３抗体で標識した磁気ビーズを使用し、骨髄からＴＮＡＰ＋細胞を分離することによって得られ、２０％ウシ胎児血清、２ｍＭ Ｌ－グルタミン、および１００μｍ Ｌ－アスコルビン酸－２－リン酸を添加したα－ＭＥＭに播種される。

一実施形態において、このような増殖後細胞（少なくとも５継代後）は、ＴＮＡＰ－、ＣＣ９＋、ＨＬＡクラスＩ＋、ＨＬＡクラスＩＩ－、ＣＤ１４－、ＣＤ１９－；ＣＤ３－、ＣＤ１１ａ－ｃ－、ＣＤ３１－、ＣＤ８６－、および／またはＣＤ８０－であり得る。しかし、種々のマーカーの発現は、培養条件によって異なる可能性がある。同様に、これらの表現型の細胞は、増殖後細胞集団において優勢であり得るが、その表現型を持たない細胞が少ない割合で（例えば、少ない割合の増殖後細胞はＣＣ９－であり得る）存在する可能性がある。いくつかの実施形態において、これらの細胞は、増殖後細胞集団に存在する細胞総数の３０％、２０％、１５％、１０％、５％、または１％以下の数で存在する可能性がある。１つの好ましい実施形態において、増殖後細胞は、異なる細胞種に分化する能力を有する。

一実施形態において、増殖後細胞集団は、細胞の少なくとも２５％、より好ましくは少なくとも５０％がＣＣ９＋である細胞を含む。

別の実施形態において、本開示の方法で使用される増殖後細胞集団は、細胞の少なくとも４０％、より好ましくは少なくとも４５％がＳＴＲＯ－１＋である細胞を含む。

さらなる実施形態において、子孫細胞は、ＬＦＡ－３、ＴＨＹ－１、ＶＣＡＭ－１、ＰＥＣＡＭ－１、Ｐ－セレクチン、Ｌ－セレクチン、３Ｇ５、ＣＤ４９ａ／ＣＤ４９ｂ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＣＤ４９ｄ／ＣＤ２９、ＣＤ２９、ＣＤ１８、ＣＤ６１、インテグリンβ６～１９、トロンボモジュリン、ＣＤ１０、ＣＤ１３、ＳＣＦ、ＰＤＧＦ－Ｒ、ＥＧＦ－Ｒ、ＩＧＦ１－Ｒ、ＮＧＦ－Ｒ、ＦＧＦ－Ｒ、レプチン－Ｒ、（ＳＴＲＯ－２＝レプチン－Ｒ）、ＲＡＮＫＬ、ＳＴＲＯ－１ｂｒｉｇｈｔ、ＣＤ１４６、およびこれらのマーカーの任意の組合せからなる群から選択されるマーカーを発現することがある。

一実施形態において、子孫細胞は、国際公開第２００６／０３２０９２号パンフレットに記載されている多分化能性増殖後ＭＳＣ子孫（ＭＥＭＰ）である。子孫を得たと思われるＭＳＣを濃縮した集団を調製する方法は、国際公開第０１／０４２６８号パンフレットおよび国際公開第２００４／０８５６３０号パンフレットに記載されている。ｉｎ ｖｉｔｒｏ状況下において、ＭＳＣが、完全に純粋な調製物として存在することは稀であり、組織特異的分化決定済細胞（tissue specific committed cells）（ＴＳＣＣ）である他の細胞と共に一般的に存在すると予想される。国際公開第０１／０４２６８号パンフレットは、このような細胞を、約０．１％～９０％の純度レベルで骨髄から回収することについて言及している。子孫が得られるＭＳＣを含む集団は、直接組織源から回収されてよく、代替方法として、ｅｘ ｖｉｖｏで既に増殖させた集団であってよい。

例えば、子孫は、実質的に精製されたＭＳＣの回収された未増殖の集団であって、ＭＳＣが存在する集団の総細胞の少なくとも約０．１、１、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、または９５％を含む集団から得られてよい。このレベルは、例えば、ＴＮＡＰ、ＳＴＲＯ－１^ｂｒｉ、３Ｇ５＋、ＶＣＡＭ－１、ＴＨＹ－１、ＣＤ１４６、およびＳＴＲＯ－２からなる群から選択される少なくとも１種のマーカーに陽性である細胞から選択することによって達成してよい。

ＭＳＣの出発集団は、国際公開第０１／０４２６８号パンフレットまたは国際公開第２００４／０８５６３０号パンフレットに記載されている任意の１種または複数の組織種、すなわち、骨髄、歯髄細胞、脂肪組織、および皮膚、または、おそらくより広義には、脂肪組織、歯、歯髄、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、網膜、脳、毛嚢、腸、肺、脾臓、リンパ節、胸腺、膵臓、骨、靱帯、骨髄、腱、および骨格筋から得られてよい。

ＭＥＭＰは、マーカーであるＳＴＲＯ－１ｂｒｉに陽性であり、またマーカーであるアルカリホスファターゼ（ＡＬＰ）に陰性であるという点で、新たに回収されたＭＳＣと区別することができる。これに対し、新たに分離されたＭＳＣは、ＳＴＲＯ－１^ｂｒｉおよびＡＬＰに陽性である。本開示の好ましい実施形態において、投与された細胞の少なくとも１５％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、または９５％は、表現型ＳＴＲＯ－１^ｂｒｉ、ＡＬＰ－を有する。さらなる好ましい実施形態において、ＭＥＭＰは、マーカーであるＫｉ６７、ＣＤ４４および／またはＣＤ４９ｃ／ＣＤ２９、ＶＬＡ－３、α３β１のうちの１種または複数に陽性である。またさらなる好ましい実施形態において、ＭＥＭＰは、ＴＥＲＴ活性を示さない、かつ／またはマーカーであるＣＤ１８に陰性である。

一実施形態において、細胞は、血管症の患者から得られ、本明細書に記載されているとおりに細胞がプロスタサイクリンに曝露される培養期間の少なくとも一部の期間、標準的な技術を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで培養され、自家または同種移植として患者に投与される。代替の実施形態において、樹立したヒト細胞株のうちの１種または複数の細胞が使用される。本開示の別の有用な実施形態において、ヒト以外の動物（すなわち、患者がヒトでない場合、別の動物種から）の細胞が使用される。

本発明の技術は、以下に限定されないが、ヒト以外の霊長類の細胞、有蹄類、イヌ科、ネコ科、ウサギ目、げっ歯類、鳥類、および魚類の細胞を含む任意のヒト以外の動物種からの細胞を使用して実施することが可能である。本開示を実施するために用いてよい霊長類の細胞には、以下に限定されないが、チンパンジー、ヒヒ、カニクイザル、および任意の他の新または旧世界ザルの細胞が含まれる。本開示を実施するために用いてよい有蹄類の細胞には、以下に限定されないが、ウシ、ブタ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、バッファロー、およびバイソンの細胞が含まれる。本開示を実施するために用いてよいげっ歯類の細胞には、以下に限定されないが、マウス、ラット、モルモット、ハムスター、およびスナネズミの細胞が含まれる。本開示を実施するために用いてよいウサギ目種の例には、家畜化されたウサギ、ジャッキウサギ、ノウサギ、ワタオウサギ、カンジキウサギ、およびナキウサギが含まれる。ニワトリ（セキショクヤケイ（Gallus gallus））は、本開示を実施するために用いてよい鳥類種の例である。

細胞は使用前に保管することができる。真核細胞および特定の哺乳動物の細胞の保存および保管のための方法およびプロトコールは当業界において公知である（参照、例えば、Pollard, J. W. and Walker, J. M. (1997) Basic Cell Culture Protocols, Second Edition, Humana Press, Totowa, N.J.、Freshney, R. I. (2000) Culture of Animal Cells, Fourth Edition, Wiley-Liss, Hoboken, N.J.）。間葉系幹細胞／先祖細胞などの分離された幹細胞またはその子孫の生物学的活性を維持する任意の方法を、本開示に関連して用いてよい。１つの好ましい実施形態において、細胞は、凍結保存法を用いて維持および保管される。

細胞は、種々の技術を用いて得ることができる。例えば、細胞－抗体複合体に関連した特性または抗体に結合した標識を参照することによって、細胞を物理的に分離する多くの細胞選別技術を用いることができる。この標識は、磁性粒子または蛍光分子であってよい。抗体は、複数の細胞の集合体であって、その密度によって分離可能な集合体を形成するように架橋することがある。代替方法として、抗体は、望ましい細胞が付着する固定マトリックス（stationary matrix）に結合してよい。

好ましい実施形態において、ＴＮＡＰ＋、ＳＴＲＯ－１＋、ＶＣＡＭ－１＋、ＴＨＹ－１＋、ＳＴＲＯ－２＋、３Ｇ５＋、ＣＤ４５＋、ＣＤ１４６＋を結合する抗体（または、他の結合する物質）は、細胞を分離するために使用される。より好ましくは、ＴＮＡＰ＋またはＳＴＲＯ－１＋に結合する抗体（または、他の結合する物質）は、細胞を分離するために使用される。

抗体が結合している細胞を結合していない細胞から分離する種々の方法は公知である。例えば、細胞に結合された抗体（または、抗アイソタイプ抗体）は、標識することができ、その後、細胞は、標識の存在を検出する機械的細胞選別装置によって分離される。蛍光活性化細胞選別装置は当業界において公知である。一実施形態において、抗ＴＮＡＰ抗体および／または抗ＳＴＲＯ－１抗体は、固体支持体に結合される。種々の固体支持体は、当業者公知であり、以下に限定されないが、アガロースビーズ、ポリエチレンビーズ、中空糸膜、ポリマー、およびプラスチック製ペトリ皿を含む。抗体が結合している細胞は、細胞懸濁液から固体支持体を単に物理的に分離することによって、細胞懸濁液から取り出すことが可能である。

超常磁性マイクロ粒子を細胞分離のために使用してよい。例えば、マイクロ粒子を抗ＴＮＡＰ抗体および／または抗ＳＴＲＯ－１抗体でコーティングしてよい。次に、抗体でタグ付けされた超常磁性マイクロ粒子を、目的の細胞を含有する溶液と共にインキュベートしてよい。マイクロ粒子は、望ましい幹細胞の表面に結合し、次に、これらの細胞は、磁場内で採取することが可能である。

別の例では、細胞サンプルを、例えば、抗ＴＮＡＰモノクローナル抗体および／または抗ＳＴＲＯ－１モノクローナル抗体が結合している固相と物理的に接触させる。固相への結合には、例として、プラスチック、ニトロセルロース、または他の表面への抗体の吸着を含むことができる。抗体を、中空糸膜の大きな孔（細胞が流通できる程度に十分大きい）の壁に吸着させることも可能である。代替方法として、抗体を、表面またはＰｈａｒｍａｃｉａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ６ＭＢマクロビーズなどのビーズと共有結合させることが可能である。抗体が結合している固相と幹細胞を含有する懸濁液とのインキュベーションの厳密な条件および時間は、用いるシステムに特有の複数の要因次第と予想される。しかし、適切な条件の選択は、十分に当業者の技量の範囲内である。

次に、幹細胞を結合させる十分な時間の経過後、結合していない細胞を、生理的緩衝液で溶出させる、または洗い流す。結合していない細胞を、回収して他の目的に使用する、または望ましい分離が得られたことを確認するための適切な試験が行われた後に廃棄することができる。次に、結合している細胞を、主に固相および抗体の性質に応じた任意の適切な方法によって固相から分離する。例えば、結合している細胞は、激しい撹拌によってプラスチック製ペトリ皿から溶離することができる。代替方法として、結合している細胞を、酵素的「ニッキング」または固相と抗体の間の酵素感受性「スペーサー」配列の消化によって溶離することができる。アガロースビーズに結合したスペーサーは、例えば、Ｐｈａｒｍａｃｉａ社から購入可能である。

次に、溶離され、濃縮された細胞の画分を、遠心分離によって緩衝液を用いて洗浄し、前記濃縮された画分を、従来の技術に従った後の使用、培養増殖、および／または患者への導入のため、生存可能な状態で凍結保存してよい。

Ｄ．培養培地
本明細書で用いる場合、「培養培地」には、（ａ）ＭＳＣの存在下または非存在下で、ＭＳＣを培養するために使用される、アミノ酸、グルコース、および種々の塩などの典型的な成分を含有する培養培地、および（ｂ）培養中にＭＳＣから放出された成分を含む組成物を含む培養培地から分離した組成物のいずれも包含される。培養培地は、固体、液体、気体、または相および物質の混合物である成分を含有してよい。培養培地の成分には、以下に限定されないが、寒天、アガロース、ゼラチン、およびコラーゲンのマトリックスが含まれる。「培養培地」には、まだ細胞に接触していなくとも、細胞培養に使用することが意図されている物質が含まれる。例えば、細菌培養のために調製された栄養豊富な液体は、培養培地であり得る。

「ＭＳＣに接触した培養培地」は、ＭＳＣに接触し、そのためＭＳＣから放出された成分を含む培養培地を指す。このような放出された成分の非限定的な例には、メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖因子、または他の種類の生物活性物質を含み得る、エクソソームまたは他の微小胞が含まれる。

Ｅ．微小胞およびエクソソーム
ＭＳＣは、増殖または分化中、細胞外の環境に化合物および他の物質を放出し得る。いくつかの態様において、このような物質には、細胞外小胞が含まれる。細胞外小胞は、種々の細胞種から得られる原形質膜の断片を含む。通常、細胞外小胞は、直径（または粒子が球状でない場合は最も大きい寸法）が約１０ｎｍ～約５０００ｎｍの間（例えば、約５０ｎｍ～１５００ｎｍの間、約７５ｎｍ～１５００ｎｍの間、約７５ｎｍ～１２５０ｎｍの間、約５０ｎｍ～１２５０ｎｍの間、約３０ｎｍ～１０００ｎｍの間、約５０ｎｍ～１０００ｎｍの間、約１００ｎｍ～１０００ｎｍの間、約５０ｎｍ～７５０ｎｍの間など）である。細胞外小胞の代替名には、以下に限定されないが、微小胞、エクソソーム、エクトソーム、膜粒子（membrane particles）、エクソソーム様粒子、およびアポトーシス小胞が含まれる。別段の指定がない限り、細胞外小胞の任意の特定の種類または細胞外小胞の種類の組合せは、本開示に従って使用することができる。例えば、エクトソーム、エクソソーム様粒子、またはその組合せは、エクソソームの代わりに使用することができる。

エクソソームは、多小胞体選別経路から得られる小胞である。最近の研究では、エクソソームが、細胞間コミュニケーションおよび免疫調節プロセスの促進のために有用な生物活性のある小胞であることが示されている。ＭＳＣエクソソームは、２０Ｓプロテアソームおよび多くのＲＮＡ（メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、マイクロＲＮＡ）を含有し得る。いくつかの実施形態において、エクソソームは、直径が３０ｎｍ～２００ｎｍの間または直径が２０ｎｍ～５０ｎｍである。いくつかの実施形態において、エクソソームは、スクロース中の密度が１．１０～１．１９ｇ／ｍＬで、１００，０００ｇで沈降する。いくつかの実施形態において、エクソソームの膜は、スフィンゴミエリン、セラミド、脂質ラフト、および露出したホスファチジルセリンから構成され得る。

本発明の一態様は、トレプロスチニルなどのプロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣから分離されたエクソソームを含む組成物を提供する。このようなエクソソームは、肺高血圧症を含む血管症の治療に適している。一般的に、磁性粒子、濾過、透析、超遠心分離、ＥｘｏＱｕｉｃｋ（商標）（Ｓｙｓｔｅｍｓ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、ＣＡ、ＵＳＡ）、および／またはクロマトグラフィーを含む方法など、エクソソームを精製および／または濃縮するための任意の適当な方法が使用され得る。

いくつかの実施形態において、エクソソームは、遠心分離および／または超遠心分離によって分離される。このプロトコールは、例えば、Thery et al. Current Protocols in Cell Biol. (2006) 3.22に記載されている。いくつかの実施形態において、エクソソームは、一段階のサイズ排除クロマトグラフィーによって分離される。このプロトコールは、例えば、Boing et al. Journal of Extracellular Vesicles (2014) 3:23430に記載されている。

エクソソームの他に、ＭＳＣは、他の生物活性のある分子／小胞も放出する。このような分子および小胞には、限定されるものではないが、ミトコンドリアおよび増殖因子が含まれる。ＭＳＣから放出されたこのような分子および小胞を含有する培養培地を調製する方法、さらに特定の分子および小胞を分離する方法は、当該分野で知られている。Hu et al., Frontiers in Genetics, 2:56, 1-9 (2012)を参照。

Ｆ．プロスタサイクリン
本明細書で用いる「プロスタサイクリン」という用語は、任意のプロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）、任意のプロスタサイクリンアナログ、および任意のＰＧＩ_２受容体アゴニストを明確に含む。本技術に適したプロスタサイクリンの非限定的な例には、エポプロステノール、トレプロスチニル、イロプロスト、およびセレキシパグ、さらにトレプロスチニルナトリウムを含む任意のそれらの塩が含まれる。一態様において、プロスタサイクリンは、トレプロスチニル、その誘導体、その薬学的に許容される塩またはエステルである。

Ｇ．ＭＳＣのプロスタサイクリンへの曝露
いくつかの実施形態において、投与前に、ＭＳＣまたはＭＳＣに接触した培養培地は、プロスタサイクリンに曝露されてもよい。したがって、いくつかの実施形態において、ＭＳＣもしくはＭＳＣに接触した培養培地またはＭＳＣから得られたｉｎ ｖｉｖｏ送達のためのエクソソームを調製する方法であって、ＭＳＣまたはＭＳＣ馴化培養培地をプロスタサイクリンと接触させることを含む方法も提供される。さらに別の実施形態は、このような方法で得られたＭＳＣまたはＭＳＣ馴化培養培地を提供する。

細胞または培地の化学物質への曝露は、公知の技術を包含する。一態様において、プロスタサイクリンは、ＭＳＣを含有する培養培地に加え、共インキュベートすることができる。しかし、任意選択で、このような共インキュベーションは、さらに増殖因子（例えば、ＶＥＧＦおよびアンジオポエチン－１または－２、血小板由来増殖因子）の添加および／または低酸素を伴うことができる。

ＭＳＣまたはＭＳＣに接触した培養培地は、種々の方法でプロスタサイクリンに曝露されてもよい。例えば、ＭＳＣは、ＭＳＣの増殖中、ｅｘ ｖｉｖｏでプロスタサイクリンに曝露されてもよい。ＭＳＣはまた、増殖後にプロスタサイクリンに曝露されてもよい。本開示の一実施形態に従って、ＭＳＣは、対象自体の血液または骨髄から調製することができる。この場合、ＭＳＣは、対象から分離される前にプロスタサイクリンに曝露されてもよいし、および／またはＭＳＣは、分離後にプロスタサイクリンに曝露されてもよい。

いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、ｅｘ ｖｉｖｏでプロスタサイクリンに、少なくとも約１２時間、少なくとも約１８時間、少なくとも約２４時間、少なくとも約３０時間、少なくとも約３６時間、約４２時間、少なくとも約４８時間、または少なくとも約５４時間曝露される。

いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、ｅｘ ｖｉｖｏで、濃度が約０．００１μｇ／ｍＬ～約１００μｇ／ｍＬ、約０．００１μｇ／ｍＬ～約５０μｇ／ｍＬ、約０．０１μｇ／ｍＬ～約２０μｇ／ｍＬ、約０．１μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬ、または約１μｇ／ｍＬ～約５μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンに曝露される。いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、濃度が約０．３μｇ／ｍＬ～約８３．３μｇ／ｍＬ、または約０．３μｇ／ｍＬ～約１０μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンで処理される。いくつかの実施形態において、ＭＳＣは、濃度が１００μｇ／ｍＬ、７５μｇ／ｍＬ、５０μｇ／ｍＬ、２５μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、５μｇ／ｍＬ、２．５μｇ／ｍＬ、１μｇ／ｍＬ、０．５μｇ／ｍＬ、０．２５μｇ／ｍＬ、０．１μｇ／ｍＬ、０．０５μｇ／ｍＬ、または約０．０１μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンに曝露される。プロスタサイクリンの濃度とは、ＭＳＣ培養培地中のプロスタサイクリンの濃度を指す。

いくつかの実施形態において、プロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣは、炎症誘発性因子または炎症誘発性サイトカインの発現レベルが、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍低い。いくつかの実施形態において、炎症誘発性因子はＴＮＦ－αである。いくつかの実施形態において、２種以上の炎症誘発性因子の発現レベルは、プロスタサイクリンへの曝露によって減少する。

いくつかの実施形態において、プロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣは、抗炎症性因子または抗炎症性サイトカインの発現レベルが、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも１倍、少なくとも１．５倍、少なくとも２倍、少なくとも３倍、少なくとも４倍、または少なくとも５倍、少なくとも６倍、少なくとも７倍、少なくとも８倍、少なくとも９倍、または少なくとも１０倍高い。いくつかの実施形態において、２種以上の抗炎症性因子の発現レベルは、プロスタサイクリンへの曝露によって増加する。いくつかの実施形態において、抗炎症性因子は、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、ＴＧＦβ、およびその組合せからなる群から選択される。

いくつかの実施形態において、プロスタサイクリンへのＭＳＣの曝露によって、１種または複数の炎症誘発性因子の発現レベルの減少および１種または複数の抗炎症性因子の発現レベルの増加が同時に生じる。いくつかの実施形態において、プロスタサイクリンへのＭＳＣの曝露によって、ＴＮＦ－αおよび／またはＩＬ－４の発現レベルの減少ならびにＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβからなる群から選択される１種または複数の抗炎症性因子の発現レベルの増加が同時に生じる。

Ｈ．医薬組成物
一態様において、本開示は、治療上有効な量のＭＳＣを含む医薬組成物、またはＭＳＣと接触させた、ＭＳＣの１種もしくは複数の成分もしくはＭＳＣから得られたエクソソームを含む培養培地の一部を含む医薬組成物を提供する。

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、本明細書に記載されているようなトレプロスチニルに曝露されたＭＳＣを含む。いくつかの実施形態において、組成物中のすべてのＭＳＣの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％低いＴＮＦαの発現レベルを有する。いくつかの実施形態において、組成物中のすべてのＭＳＣの少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９８％、または少なくとも９９％は、プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％高いＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβのうちの少なくとも１種の発現レベルを有する。

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１種の薬学的に許容される担体をさらに含む。「薬学的に許容される」という語句は、健全な医学的判断の範囲内で、過度の毒性、刺激、アレルギー反応、または他の問題もしくは合併症を伴わずに、ヒトおよび動物の組織と接触する使用に適し、妥当な利益／リスク比に見合った化合物、物質、組成物、および／または剤形を指す。本明細書で用いる場合、「薬学的に許容される担体」という語句は、液体もしくは固体の充填剤、希釈剤、添加物、溶媒またはカプセル化物質などの薬学的に許容される物質、組成物、または賦形剤を意味する。

薬学的に許容される担体には、生理食塩水、水性緩衝液、溶媒、および／または分散媒が含まれる。このような担体の使用は当業界で公知である。溶液は、好ましくは滅菌されており、容易に注射器で使用できる程度の液体である。好ましくは、溶液は、製造および貯蔵の条件下で安定しており、例えば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどの使用によって、細菌および真菌などの微生物の汚染作用から保護される。

薬学的に許容される担体としての役割を果たし得る物質および溶液のいくつかの例には、（１）ラクトース、グルコース、およびスクロースなどの糖、（２）トウモロコシデンプンおよびジャガイモデンプンなどのデンプン、（３）カルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、および酢酸セルロースなどのセルロースおよびその誘導体、（４）粉末トラガカント、（５）麦芽、（６）ゼラチン、（７）タルク、（８）ココアバターおよび坐剤用ワックスなどの添加物、（９）ピーナッツ油、綿実油、ベニバナ油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、およびダイズ油などの油、（１０）プロピレングリコールなどのグリコール、（１１）グリセリン、ソルビトール、マンニトール、およびポリエチレングリコールなどの多価アルコール、（１２）オレイン酸エチルおよびラウリン酸エチルなどのエステル、（１３）寒天、（１４）水酸化マグネシウムおよび水酸化アルミニウムなどの緩衝剤、（１５）アルギン酸、（１６）発熱性物質除去水、（１７）等張生理食塩水、（１８）リンゲル液、（１９）エチルアルコール、（２０）ｐＨ緩衝液、（２１）ポリエステル、ポリカーボネート、および／またはポリ無水物、ならびに（２２）医薬製剤に使用される他の非毒性適合物質が含まれる。

本開示の方法のために有用な医薬組成物は、ポリマー担体または細胞外マトリックスを含んでよい。

種々の生物学的または合成の固体マトリックス物質（例えば、固体支持マトリックス、生物学的接着剤または被覆剤、および生物学的／医学的足場）は、本開示における使用に適している。マトリックス物質は、好ましくは、ｉｎ ｖｉｖｏ用途で使用するため、医学的に許容される。このような医学的に許容されるおよび／または生物学的もしくは生理学的に許容される、または適合性のある物質の非限定的な例には、以下に限定されないが、例えば、ブタ由来（および他のＳＩＳ供給源）の小腸粘膜下組織（ＳＩＳ）など、吸収性および／または非吸収性である固体マトリックス物質、架橋または非架橋アルギン酸塩、親水コロイド、泡状物質、コラーゲンゲル、コラーゲンスポンジ、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）メッシュ、ポリグラクチン（ＰＧＬ）メッシュ、フリース、泡状被覆剤、生体接着剤（例えば、フィブリン接着剤およびフィブリンゲル）、ならびに単層または多層の死んだ脱表皮化した皮膚（dead de-epidermized skin）の同等物が含まれる。

適当なポリマー担体には、ポリマー溶液と同様に、合成または天然のポリマーから形成される多孔質のメッシュまたはスポンジが含まれる。マトリックスの１種の形態は、ポリマーのメッシュまたはスポンジであり、他の形態は、ポリマーヒドロゲルである。使用し得る天然ポリマーには、コラーゲン、アルブミン、およびフィブリンなどのタンパク質、ならびにアルギン酸塩およびヒアルロン酸ポリマーなどの多糖が含まれる。合成ポリマーには、生分解性および非生分解性ポリマーのいずれも含まれる。生分解性ポリマーの例には、ポリ乳酸（ＰＬＡ）、ポリグリコール酸（ＰＧＡ）、およびポリ乳酸－グリコール酸（ＰＬＧＡ）などのヒドロキシ酸のポリマー、ポリオルトエステル、ポリ無水物、ポリホスファゼン、ならびにその組合せが含まれる。非生分解性ポリマーには、ポリアクリル酸塩、ポリメタクリル酸塩、エチレン酢酸ビニル、およびポリビニルアルコールが含まれる。

イオン性または共有結合性の架橋ヒドロゲルを形成し得る展延性のポリマーは、細胞のカプセル化に使用される。ヒドロゲルは、水分子を捕捉してゲルを形成する三次元開放格子構造を形成するため、有機ポリマー（天然または合成）が、共有結合、イオン結合、または水素結合によって架橋した場合に形成される物質である。ヒドロゲルを形成するために使用し得る物質の例には、イオン的に架橋したアルギン酸塩、ポリホスファジン、およびポリアクリル酸塩などの多糖、またはそれぞれ温度もしくはｐＨによって架橋されるポリエチレンオキシド－ポリプロピレングリコールブロック共重合体である、Ｐｌｕｒｏｎｉｃｓ（商標）もしくはＴｅｔｒｏｎｉｃｓ（商標）などのブロック共重合体が含まれる。他の物質には、フィブリンなどのタンパク質、ポリビニルピロリドンなどのポリマー、ヒアルロン酸、およびコラーゲンが含まれる。

一般に、これらのポリマーは、荷電した側基またはその一価イオン性塩を有し、水、緩衝塩類溶液、または水性アルコール溶液などの水溶液に対して少なくとも部分的に可溶性である。カチオンと反応し得る酸性側基を伴うポリマーの例は、ポリ（ホスファゼン）、ポリ（アクリル酸）、ポリ（メタクリル酸）、アクリル酸とメタクリル酸の共重合体、ポリ（酢酸ビニル）、およびスルホン化ポリスチレンなどのスルホン化ポリマーである。アクリル酸またはメタクリル酸とビニルエーテルのモノマーまたはポリマーの反応によって形成される酸性側基を有する共重合体も使用することができる。酸性基の例は、カルボン酸基、スルホン酸基、ハロゲン化（好ましくは、フッ化）アルコール基、フェノール性ＯＨ基、および酸性ＯＨ基である。アニオンと反応し得る塩基性側基を伴うポリマーの例は、ポリ（ビニルアミン）、ポリ（ビニルピリジン）、ポリ（ビニルイミダゾール）、およびいくつかのイミノ基で置換されたポリホスファゼンである。ポリマーのアンモニウムまたは第四級塩は、主鎖の窒素またはペンダント基のイミノ基から形成することも可能である。塩基性側基の例は、アミノ基およびイミノ基である。

いくつかの実施形態において、医薬組成物は、少なくとも１種の追加の治療剤を含むことができる。例えば、組成物は、炎症もしくは疼痛の治療に役立つ鎮痛剤または組成物で治療する部位の感染を予防するための抗感染剤を含有してよい。より具体的に、有用な治療剤の非限定的な例には、次の治療カテゴリーが含まれる：非ステロイド性抗炎症薬、アヘンアゴニスト、およびサリチル酸塩などの鎮痛薬、駆虫薬、抗嫌気性菌薬（antianaerobics）、抗生物質、アミノグリコシド系抗生物質、抗真菌性抗生物質、セファロスポリン系抗生物質、マクロライド系抗生物質、多岐にわたるβ－ラクタム系抗生物質、ペニシリン系抗生物質、キノロン系抗生物質、スルホンアミド系抗生物質、テトラサイクリン系抗生物質、抗マイコバクテリア薬、抗結核抗マイコバクテリア薬、抗原虫薬、抗マラリア抗原虫薬、抗ウイルス剤、抗レトロウイルス剤、抗疥癬薬、抗炎症剤、副腎皮質ステロイド抗炎症剤、鎮痒薬／局所麻酔薬、局所抗感染剤、抗真菌性局所抗感染剤、抗ウイルス性局所抗感染剤などの抗感染剤、酸性化剤、アルカリ化剤、利尿薬、炭酸脱水酵素阻害利尿薬、ループ系利尿薬、浸透圧利尿薬、カリウム保持性利尿薬、チアジド系利尿薬、電解質置換剤、および尿酸排泄促進剤などの電解質剤および腎臓用薬剤（renal agents）、膵酵素および血栓溶解酵素などの酵素、止瀉薬、胃腸抗炎症剤、胃腸抗炎症剤、制酸抗潰瘍剤、胃酸ポンプ阻害抗潰瘍剤、胃粘膜抗潰瘍剤、Ｈ２ブロッカー抗潰瘍剤、胆石溶解剤、消化薬、催吐薬、緩下薬、便軟化薬、および運動促進剤などの胃腸剤、吸入麻酔薬、ハロゲン化吸入麻酔薬、静脈麻酔剤、バルビツール酸系静脈麻酔薬、ベンゾジアゼピン系静脈麻酔薬、およびアヘンアゴニスト静脈麻酔薬などの全身麻酔薬、堕胎薬、副腎用薬剤（adrenal agents）、副腎皮質ステロイド副腎用薬剤、アンドロゲン薬、抗アンドロゲン薬などのホルモン薬およびホルモン調節薬、免疫グロブリン薬、免疫抑制薬、トキソイド、およびワクチンなどの免疫生物学的薬剤、アミド局所麻酔薬およびエステル局所麻酔薬などの局所麻酔薬、抗痛風抗炎症剤、副腎皮質ステロイド抗炎症剤、金化合物抗炎症剤、免疫抑制抗炎症剤、非ステロイド性抗炎症薬（ＮＳＡＩＤ）、サリチル酸系抗炎症剤などの筋骨格用薬剤（musculoskeletal agents）、無機物、ならびにビタミンＡ、ビタミンＢ、ビタミンＣ、ビタミンＤ、ビタミンＥ、およびビタミンＫなどのビタミン剤。

本開示の方法のために有用な組成物には、細胞培養成分、例えば、アミノ酸、金属、補酵素因子を含む培養培地、さらに、例えば、そのいくつかが幹細胞の次の分化によって生じることがある少数の他の細胞が含まれてよい。

本開示の方法のために有用な組成物は、例えば、培養培地から対象細胞を沈降させて取り出し、望ましい溶液または物質中に再懸濁させることによって調製してよい。例えば、遠心分離、濾過、超濾過などによって、細胞を培養培地から沈降させ、かつ／または細胞の培養培地を代えてよい。

Ｉ．投与
いくつかの実施形態において、医薬組成物は、単独投与またはプロスタサイクリンと併用投与することができる。いくつかの実施形態において、医薬組成物およびプロスタサイクリンは、同時に投与される。他の実施形態において、プロスタサイクリンと組成物は、個別に投与される。個別に投与される場合、プロスタサイクリンは、ＭＳＣ組成物の投与前または投与後に投与することができる。

当業者は、組成物中および本開示の方法で投与される場合の細胞および任意の担体の量を容易に決定することができる。ある実施形態において、（活性な細胞に加えて）任意の添加物は、リン酸緩衝生理食塩水中０．００１～５０％（重量）の量の溶液で存在し、有効成分は、約０．０００１～約５重量％、好ましくは約０．０００１～約１重量％、さらにより好ましくは約０．０００１～約０．０５重量％、または約０．００１～約２０重量％、好ましくは約０．０１～約１０重量％、およびさらにより好ましくは約０．０５～約５重量％など、マイクログラム～ミリグラムのオーダーで存在する。当然ながら、動物またはヒトに投与するための任意の組成物および任意の特定の投与方法に関して、適当な動物モデル、例えば、マウスなどのげっ歯類における致死量（ＬＤ）およびＬＤ５０を決定することなどによって毒性、ならびに適当な反応を引き起こす、組成物の用量、組成物中の成分の濃度、および組成物を投与するタイミングを決定することは好ましい。このような決定は、当業者の知識、本開示、および本明細書に引用された文章からの過度の実験を必要としない。また、連続投与の時点は、過度の実験を実施することなく確認することが可能である。

本開示の方法のために有用な組成物は、カテーテル投与、全身注射、局所注射、静脈内注射、子宮内注射、または非経口投与を含むが、特に、局所注射を介して投与することが可能である。本明細書に記載されている治療用組成物（例えば、医薬組成物）を投与する場合、一般的に、単位用量の注射可能な形態（溶液、懸濁液、エマルジョン）に製剤化されると思われる。

本開示の一実施形態によると、組成物は、血管症に対して、少なくとも１種の他の医薬品と併用投与することが可能である。例えば、医薬組成物は、プロスタグランジンＩ_２（ＰＧＩ_２）、プロスタサイクリンアナログ、ホスホジエステラーゼ－５（ＰＤＥ－５）阻害剤、エンドセリン受容体拮抗薬（ＥＴＲＡ）、チロシンキナーゼ阻害剤、または可溶性グアニル酸シクラーゼ刺激薬と併用投与することが可能である。

一実施形態によると、血管症を治療する方法は、肺動脈における血栓症を減少させること、肺動脈における炎症を低下させること、肺動脈における内膜平滑筋の増殖を減少させること、肺動脈における叢状病変の形成を減少させること、肺動脈における一酸化窒素の量を増加させること、肺動脈におけるＰＧＩ２の量を増加させること、肺動脈におけるエンドセリン－１のレベルを低下させること、肺動脈における増殖因子の量を減少させること、または肺動脈において適切な血管内皮形態となるよう促進させることをさらに含む。

前述の内容は、特定の好ましい実施形態を指すが、本開示がそれに限定されるものではないことは理解されると予想される。種々の修正が開示された実施形態に対して行われることがあり、このような修正は本開示の範囲内のものであることは、当業者に想起されると予想される。

本明細書に引用されているすべての公報、特許出願、および特許は、その全体が参照によって本明細書に組み込まれる。これらの公報、特許出願、および特許が、本明細書で提供される定義とは異なる定義または異なる形式での用語もしくは語句の使用を含む限りにおいて、本明細書における定義および使用法で統制する。

以下の実施例は、当業者に、本明細書に記載されている方法および組成物の作成方法ならびに使用方法に関する完全な開示および説明を提供することを意図するものであり、限定することを意図するものではない。

[実施例１]
ＭＳＣの表現型および形態の試験
本実施例によって、トレプロスチニルに曝露されたＭＳＣ細胞の表現型を確認し、ＭＳＣ細胞に対する細胞傷害作用が生じることなくトレプロスチニルに曝露されているための最適な用量範囲を決定する。

単一バイアルのヒト骨髄由来ＭＳＣを増殖させ、標準増殖培地を使用して播種した。９５～９９％の集密度で、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で十分に洗浄し、２５０μｇ／ｍＬ～０．００４μｇ／ｍＬの用量範囲でトレプロスチニルを含有する培地に曝露させた。４８時間の培養後、細胞を撮影し、形態における処置によって誘導された変化を評価した。

フローサイトメトリー分析（図１）によって、本試験に使用された骨髄ＭＳＣは、ＣＤ３４、ＣＤ４５、およびＨＬＡ－ＤＲに対して陰性または低反応であり、ＭＳＣマーカーであるＣＤ７３、ＣＤ１０５、およびＣＤ９０に対して陽性であったことが示された。ＭＳＣの定義は、Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ ｆｏｒ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ（Dominici et al., Cytotherapy 8(4):315-7, 2006）によって確立されている。

様々な濃度のトレプロスチニルに曝露されたＭＳＣの画像によって（図２）、トレプロスチニルの最大用量（２５０μｇ／ｍＬ）で、ＭＳＣは寄り集まって剥離しているようであることが示され、これは、ＭＳＣに対するトレプロスチニルの細胞傷害作用を示唆するものである。一方、トレプロスチニルの用量が８３．３μｇ／ｍＬ以下の場合、細胞死に関連する形態上の変化は生じなかった。

本実施例によって、高用量のトレプロスチニルは、ＭＳＣの細胞生存率に悪影響を及ぼすが、８３．３μｇ／ｍＬ未満の用量のトレプロスチニルは、この細胞傷害作用を生じなかったことが示された（図２）。次の試験には、細胞傷害作用を回避するため、一連の低用量のトレプロスチニルが含まれた。

[実施例２]
炎症誘発性および抗炎症性サイトカインに対するトレプロスチニルの作用
本実施例によって、ＭＳＣにおける炎症誘発性および抗炎症性サイトカインの生成に対するトレプロスチニルの作用が検討された。

実施例１に記載されたとおり、２５０μｇ／ｍＬ～０．００４μｇ／ｍＬの範囲のトレプロスチニルに曝露させた細胞を回収した。細胞のＲＮＡを抽出し、次に炎症誘発性および抗炎症性サイトカインに関して分析した。サイトカイン、または内部および分泌型細胞シグナル伝達のいずれにも関与する小さいタンパク質が、ＰＡＨの炎症性病因に関与していることが確認されている（Groth et al., Respiratory Research, 15:47 (2014)）。

ｉｎ ｖｉｖｏの慢性低酸素下における、血中のＴＮＦαレベルは、対照と比較して４８％増加した（図３Ａおよび３Ｂ）。ｉｎ ｖｉｔｒｏにおける、８３．３～０．３μｇ／ｍＬの間の用量のトレプロスチニルへの曝露によって、ＭＳＣにおける炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦαの発現レベルが減少した。

漸増用量のトレプロスチニルへのＭＳＣの曝露によって、対照と比較して、ＩＬ１０およびＩＬ１３のシグナル伝達の増加が認められた（図４）。

低酸素誘発性ＰＡＨマウスにおいて、血中のＴＮＦαレベルが４８％増加することが認められた（図３Ａ）。興味深いことに、０．３μｇ／ｍＬ～８３．３μｇ／ｍＬのトレプロスチニルへの曝露が、ＴＮＦαの発現を、対照と比較して最大４．７倍低下させた（図３Ｂ）。追加の分析によって、トレプロスチニルの同じ用量範囲が、抗炎症性サイトカインであるＩＬ１０およびＩＬ１３の発現レベルを増加させることが認められた。具体的には、９．３μｇ／ｍＬのトレプロスチニルに曝露させた場合、ＭＳＣにおけるＩＬ１０の発現は５．４倍増加した。２７．８μｇ／ｍＬのトレプロスチニルに曝露させた場合、ＭＳＣにおけるＩＬ１３の発現は８．８倍増加した（図４）。これらのデータは、低濃度のトレプロスチニルへの曝露によって、ＭＳＣの抗炎症能が誘発されたことを示唆する。

[実施例３]
免疫抑制因子の生成に対するトレプロスチニルの作用
本実施例は、ＭＳＣにおけるいくつかの免疫抑制因子の生成に対するトレプロスチニルの作用を検討した。

２５０μｇ／ｍＬ～０．００４μｇ／ｍＬのトレプロスチニルに曝露されたＭＳＣからのＲＮＡを、いくつかの他の抗炎症性因子について再分析した。ＩＤＯ１、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβを含む、ＭＳＣの免疫抑制特性において特定の役割を担うことが認められている遺伝子を評価した（Hoogduijn et al., International Immunopharmacology , 1496-1500(2010)）。

漸増用量のトレプロスチニルに曝露されたＭＳＣによって、対照と比較して、抗炎症性因子であるＩＤＯ１、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβの強力な増加が認められた（図５）。

９．３μｇ／ｍＬのトレプロスチニルへのＭＳＣの曝露によって、曝露されていない対照と比較して、ＴＮＦα（炎症誘発性サイトカイン）が減少し、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβ（抗炎症性因子）が増加する（図６）。

本実施例によって、漸増用量のトレプロスチニルに曝露されたＭＳＣによって、対照と比較して、抗炎症性因子であるＩＤＯ１、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβの強力な増加が認められたことが示された（図５）。この遺伝子発現プロファイルは、実施例２のサイトカインプロファイルと合わせて、ｉｎ ｖｉｔｒｏで複数の用量のトレプロスチニルに４８時間曝露させた後のＭＳＣ遺伝子発現パターンにおける変化を示す。９．３μｇ／ｍＬのトレプロスチニルへの曝露によって、炎症誘発性サイトカインであるＴＮＦαが減少し、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβを含むいくつかの抗炎症性因子が増加した（図６）。これらのデータは、トレプロスチニルに曝露されたＭＳＣが、疾患の治療において免疫調節因子としての役割を果たし得ることを示唆する。

トレプロスチニルへの曝露による免疫調節作用に関する提案されたモデルを図７に例示する。具体的には、トレプロスチニルへのＭＳＣの曝露によって、細胞内シグナル伝達（１）または核シグナル伝達（２、３、４）を介し、炎症誘発性サイトカインが減少し、抗炎症性サイトカインが増加した。追加の分析によって、トレプロスチニルに曝露されたＭＳＣにおける、ＲＮＡ発現における変化（３）によって評価される核シグナル伝達（２）を介した抗炎症状態への遺伝子再プログラミングが認められた。
本発明は、次の態様にも関する。
（１）血管症を治療または予防する方法であって、
（ｉ）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物、または（ｉｉ）前記ＭＳＣと接触させた、前記ＭＳＣの１種または複数の成分を含む培養培地の一部を含む組成物、または（ｉｉｉ）ＭＳＣ由来のエクソソームを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、
前記ＭＳＣは、ｅｘ ｖｉｖｏでプロスタサイクリンに曝露されており、前記プロスタサイクリンへの曝露が、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、前記ＭＳＣにおける１種または複数の抗炎症性因子の発現を増加させ、かつ／または１種または複数の炎症誘発性因子の発現を減少させる、方法。
（２）前記ＭＳＣが、０．３μｇ／ｍＬ～８３．３μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンを含む組成物に曝露されている、上記（１）に記載の方法。
（３）前記ＭＳＣが、０．３μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンに曝露されている、上記（１）に記載の方法。
（４）前記プロスタサイクリンが、トレプロスチニル、その誘導体または塩である、上記（１）に記載の方法。
（５）前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに少なくとも２４時間曝露される、上記（１）に記載の方法。
（６）前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに少なくとも４８時間曝露される、上記（１）に記載の方法。
（７）前記血管症が、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症虚血肢（ＣＬＩ）、冠動脈疾患、および糖尿病性血管症からなる群から選択される、上記（１）に記載の方法。
（８）前記血管症が、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）である、上記（１）に記載の方法。
（９）前記ＭＳＣが、増殖後に前記プロスタサイクリンに曝露される、上記（１）に記載の方法。
（１０）前記プロスタサイクリンに曝露された前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の発現レベルを減少させている、上記（１）に記載の方法。
（１１）前記プロスタサイクリンに曝露された前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβからなる群から選択される１種または複数の抗炎症性因子の発現レベルを増加させている、上記（１）に記載の方法。
（１２）前記プロスタサイクリンに曝露された前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％低いＴＮＦαの発現レベルを有する、上記（１）に記載の方法。
（１３）前記プロスタサイクリンに曝露された前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％高いＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβのうちの少なくとも１種の発現レベルを有する、上記（１）に記載の方法。
（１４）ＭＳＣを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＭＳＣは、ｅｘ ｖｉｖｏで、濃度が０．３～１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルまたはその塩に、少なくとも２４時間曝露されている、上記（１）に記載の方法。
（１５）前記ＭＳＣと接触させた、前記ＭＳＣの１種または複数の成分を含む培養培地の一部を含む組成物を、前記対象に投与することを含み、前記ＭＳＣは、ｅｘ ｖｉｖｏで、濃度が０．３～１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルまたはその塩に、少なくとも２４時間曝露されており、前記ＭＳＣの１種または複数の成分は、エクソソーム、微小胞、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖因子、およびその組合せからなる群から選択される、上記（１）に記載の方法。
（１６）前記ＭＳＣ由来のエクソソームを含む組成物を、それを必要とする対象に投与することを含み、前記ＭＳＣは、ｅｘ ｖｉｖｏで、濃度が０．３～１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルまたはその塩に、少なくとも２４時間曝露されている、上記（１）に記載の方法。
（１７）前記ＭＳＣが、濃度が０．３μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルまたはその塩に、少なくとも２４時間曝露される、上記（１）に記載の方法。
（１８）間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む組成物、または前記ＭＳＣと接触させた、前記ＭＳＣの１種または複数の成分を含む培養培地を含む組成物を調製する方法であって、
前記ＭＳＣをｅｘ ｖｉｖｏでプロスタサイクリンに曝露させるステップであって、前記プロスタサイクリンへの曝露が、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、前記ＭＳＣにおける１種または複数の抗炎症性因子の発現を増加させ、かつ／または１種または複数の炎症誘発性因子の発現を減少させる、ステップ、および
前記ＭＳＣまたはエクソソームを含む前記培養培地の少なくとも一部を分離するステップを含む、方法。
（１９）前記ＭＳＣを０．３μｇ／ｍＬ～５０μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンに曝露させることを含む、上記（１８）に記載の方法。
（２０）前記ＭＳＣを０．３μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンに曝露させることを含む、上記（１８）に記載の方法。
（２１）前記プロスタサイクリンが、トレプロスチニル、その誘導体または塩である、上記（１８）に記載の方法。
（２２）前記ＭＳＣが、プロスタサイクリンに少なくとも２４時間曝露される、上記（１８）に記載の方法。
（２３）前記ＭＳＣが、プロスタサイクリンに少なくとも４８時間曝露される、上記（１８）に記載の方法。
（２４）前記ＭＳＣが、増殖後にプロスタサイクリンに曝露される、上記（１８）に記載の方法。
（２５）前記プロスタサイクリンに曝露された前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、ＴＮＦαの発現レベルを減少させている、上記（１８）に記載の方法。
（２６）前記プロスタサイクリンに曝露された前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβからなる群から選択される１種または複数の抗炎症性因子の発現レベルを増加させている、上記（１８）に記載の方法。
（２７）前記プロスタサイクリンに曝露された前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％低いＴＮＦαの発現レベルを有する、上記（１８）に記載の方法。
（２８）前記プロスタサイクリンに曝露された前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％高いＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβのうちの少なくとも１種の発現レベルを有する、上記（１８）に記載の方法。
（２９）前記ＭＳＣの１種または複数の成分が、エクソソーム、微小胞、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖因子、およびその組合せからなる群から選択される、上記（１８）に記載の方法。
（３０）前記ＭＳＣが、濃度が０．３μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルまたはその塩を含む組成物に、少なくとも２４時間曝露される、上記（１８）に記載の方法。
（３１）前記培養培地からエクソソームを分離することをさらに含む、上記（１８）に記載の方法。
（３２）上記（１８）に記載の方法によって得られた分離されたＭＳＣを含む組成物。
（３３）上記（１８）に記載の方法によって得られた分離されたエクソソームを含む組成物。
（３４）少なくとも１種の薬学的に許容される担体をさらに含む、上記（３２）に記載の組成物。
（３５）血管症を治療または予防するための少なくとも１種の追加の治療剤をさらに含む、上記（３２）に記載の組成物。
（３６）少なくとも１種の薬学的に許容される担体をさらに含む、上記（３３）に記載の組成物。
（３７）血管症を治療または予防するための少なくとも１種の追加の治療剤をさらに含む、上記（３３）に記載の組成物。
（３８）変化した遺伝子発現パターンを有するＭＳＣの集団を含む組成物であって、前記変化した遺伝子発現パターンは、対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％低いＴＮＦαの発現レベルおよび／または対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％高いＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡおよびＴＧＦβのうちの少なくとも１種の発現レベルを含み、前記変化した遺伝子発現パターンを有するＭＳＣの集団は、前記組成物中のすべてのＭＳＣの少なくとも５０％を占める、組成物。

Claims (14)

1. 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を含む、血管症を治療または予防するために用いる医薬組成物であって、
   前記ＭＳＣは、ｅｘ ｖｉｖｏで０．３μｇ／ｍＬ～８３．３μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンに曝露されており、前記プロスタサイクリンへの曝露が、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、前記ＭＳＣにおける１種または複数の抗炎症性因子の発現を増加させ、かつ／または１種または複数の炎症誘発性因子の発現を減少させる、医薬組成物。
2. 前記プロスタサイクリンが、トレプロスチニルまたは塩である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに少なくとも２４時間、又は少なくとも４８時間曝露される、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 前記血管症が、肺動脈性肺高血圧症（ＰＡＨ）、末梢血管疾患（ＰＶＤ）、重症虚血肢（ＣＬＩ）、冠動脈疾患、および糖尿病性血管症からなる群から選択される、請求項１～３のいずれかに記載の医薬組成物。
5. 前記ＭＳＣが、増殖後に前記プロスタサイクリンに曝露される、請求項１～４のいずれかに記載の医薬組成物。
6. 前記プロスタサイクリンに曝露された前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、腫瘍壊死因子α（ＴＮＦα）の発現レベルを減少させているか、前記プロスタサイクリンに曝露された前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、ＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβからなる群から選択される１種または複数の抗炎症性因子の発現レベルを増加させているか、前記プロスタサイクリンに曝露された前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％低いＴＮＦαの発現レベルを有するか、あるいは、前記プロスタサイクリンに曝露された前記ＭＳＣが、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣの発現レベルより少なくとも５０％高いＩＬ１０、ＩＬ１３、ＩＤＯ、ｉＮＯＳ、ＨＬＡ、およびＴＧＦβのうちの少なくとも１種の発現レベルを有する、請求項１～５のいずれかに記載の医薬組成物。
7. （ｉ）前記ＭＳＣと接触させた、前記ＭＳＣの１種または複数の成分を含む培養培地の一部であって、前記ＭＳＣは、ｅｘ ｖｉｖｏで、濃度が０．３～１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルまたはその塩に、少なくとも２４時間曝露されており、前記ＭＳＣの１種または複数の成分は、エクソソーム、微小胞、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖因子、およびその組合せからなる群から選択される、前記培養培地の一部、又は（ｉｉ）前記ＭＳＣ由来のエクソソームであって、前記ＭＳＣがｅｘ ｖｉｖｏで、濃度が０．３～１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルまたはその塩に、少なくとも２４時間曝露されている、前記エクソソームを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
8. 前記ＭＳＣが、濃度が０．３μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬのトレプロスチニルまたはその塩に、少なくとも２４時間曝露される、請求項１～７のいずれかに記載の医薬組成物。
9. 間葉系幹細胞（ＭＳＣ）および前記ＭＳＣの１種または複数の成分を含む組成物を調製する方法であって、
   前記ＭＳＣをｅｘ ｖｉｖｏで０．３μｇ／ｍＬ～８３．３μｇ／ｍＬのプロスタサイクリンに曝露させるステップであって、前記プロスタサイクリンへの曝露が、前記プロスタサイクリンに曝露されていない対照ＭＳＣと比較して、前記ＭＳＣにおける１種または複数の抗炎症性因子の発現を増加させ、かつ／または１種または複数の炎症誘発性因子の発現を減少させる、ステップ、を含む、方法。
10. 前記ＭＳＣの１種または複数の成分が、エクソソーム、微小胞、マイクロＲＮＡ、メッセンジャーＲＮＡ、非コードＲＮＡ、ミトコンドリア、増殖因子、およびその組合せからなる群から選択される、請求項９に記載の方法。
11. 前記ＭＳＣからエクソソームを分離することをさらに含む、請求項９又は１０に記載の方法。
12. 請求項１に記載の前記プロスタサイクリンに曝露されたＭＳＣおよび請求項１１に記載の方法によって得られた分離されたエクソソームを含む組成物。
13. 少なくとも１種の薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１２に記載の組成物。
14. 血管症を治療または予防するための少なくとも１種の追加の治療剤をさらに含む、請求項１３に記載の組成物。

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