KR101751513B1 - 인 비트로 섬유증 모델, 그의 제조방법 및 용도 - Google Patents

인 비트로 섬유증 모델, 그의 제조방법 및 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR101751513B1
KR101751513B1 KR1020150089090A KR20150089090A KR101751513B1 KR 101751513 B1 KR101751513 B1 KR 101751513B1 KR 1020150089090 A KR1020150089090 A KR 1020150089090A KR 20150089090 A KR20150089090 A KR 20150089090A KR 101751513 B1 KR101751513 B1 KR 101751513B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fibrosis
cells
cell
dimensional cell
cell cluster
Prior art date
Application number
KR1020150089090A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20170000189A (ko
Inventor
김상헌
박귀덕
이강원
타나벨 라장암
Original Assignee
한국과학기술연구원
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 한국과학기술연구원 filed Critical 한국과학기술연구원
Priority to KR1020150089090A priority Critical patent/KR101751513B1/ko
Priority to EP16814592.8A priority patent/EP3315602A4/en
Priority to CN201680003618.0A priority patent/CN107002034A/zh
Priority to US15/551,595 priority patent/US20180112183A1/en
Priority to JP2017567167A priority patent/JP6902788B2/ja
Priority to PCT/KR2016/005501 priority patent/WO2016208879A1/ko
Publication of KR20170000189A publication Critical patent/KR20170000189A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101751513B1 publication Critical patent/KR101751513B1/ko
Priority to US16/678,014 priority patent/US11365396B2/en

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0662—Stem cells
    • C12N5/0667—Adipose-derived stem cells [ADSC]; Adipose stromal stem cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5044—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics involving specific cell types
    • G01N33/5073—Stem cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
    • G01N33/5082—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms
    • G01N33/5088—Supracellular entities, e.g. tissue, organisms of vertebrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2320/00—Applications; Uses
    • C12N2320/10—Applications; Uses in screening processes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2503/00—Use of cells in diagnostics
    • C12N2503/02—Drug screening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1307—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from adult fibroblasts
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1384—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from adipose-derived stem cells [ADSC], from adipose stromal stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
    • C12N2506/13—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells
    • C12N2506/1346—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells
    • C12N2506/1392—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from connective tissue cells, from mesenchymal cells from mesenchymal stem cells from mesenchymal stem cells from other natural sources
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2513/00—3D culture
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/10—Mineral substrates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2533/00—Supports or coatings for cell culture, characterised by material
    • C12N2533/30—Synthetic polymers
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)

Abstract

간엽세포로부터 분화된 세포집합체를 포함하고, 상기 세포집합체는 섬유증의 병리학적 특징을 나타내는 것인 인 비트로 섬유증 모델, 그의 제조방법 및 용도를 제공한다.

Description

인 비트로 섬유증 모델, 그의 제조방법 및 용도{In vitro fibrosis model, method for producing the same and uses}
인 비트로 섬유증 모델, 그의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
현재 전 세계적으로 500만 명 이상의 사람이 섬유증으로 고통받고 있고, 매년 10만 명의 새로운 환자가 섬유증으로 진단받고 있으며, 매년 4만 명의 환자가 섬유증으로 사망하고 있다.
섬유증은 기관의 기능 장애 및 사멸을 일으키는 과도한 결합 조직의 발달로 특징지어진다. 섬유증은 일반적으로 다양한 기관, 예를 들면, 신장, 간, 폐, 심장, 피부, 또는 골수에 영향을 준다. 이들 중에서, 신장 세뇨관 간질성 섬유증 또는 사구체 경화증을 포함하는 신장 섬유증은 치료하기 어렵고, 비가역적인 것으로 알려져 있다.
한편, 섬유증에 대한 실험 동물 모델로 마우스에 블레오마이신을 투여하거나, 형질전환을 통해서 폐 섬유증 등의 동물 모델을 제조하는 방법 알려져 있으나, 인 비트로 시스템에서 섬유성 조직을 연구하고 치료제를 개발하기 위한 모델에 대해서는 알려진 바가 없다. 따라서, 섬유증 치료제를 개발하기 위해 생체 내 환경을 잘 모사하고 섬유증의 병리학적 특성을 나타내는 인 비트로 섬유증 모델의 개발이 요구된다.
일 양상은 간엽세포로부터 분화된 세포집합체(cell cluster)를 포함하고, 상기 세포집합체는 섬유증의 병리학적 특징을 나타내는 것인 인 비트로(In vitro) 섬유증 모델을 제공하는 것이다.
다른 양상은 간엽세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접착시켜 배양하여 세포집합체를 형성하는 단계; 및 상기 형성된 세포집합체를 적어도 12시간 이상 추가적으로 배양하여 상기 세포집합체에서 섬유증의 병리학적 특징을 형성하는 단계를 포함하는 인 비트로(In vitro) 섬유증 모델을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.
또 다른 양상은 상기 인 비트로 섬유증 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 및 상기 인 비트로 섬유증 모델의 세포집합체 또는 상기 세포집합체 내의 세포에서 무처리 대조군과 비교하여 섬유증의 병리학적 특징의 개선 또는 치료를 나타내는 피검물질을 섬유증 치료를 위한 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 섬유증 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
일 양상은 간엽세포로부터 분화된 세포집합체(cell cluster)를 포함하고, 상기 세포집합체는 섬유증의 병리학적 특징을 나타내는 것인 인 비트로(In vitro) 섬유증 모델을 제공한다.
본 명세서에서 용어 "간엽세포(mesenchymal cells)"는 자가 증식할 수 있고, 다양한 계통(lineages)으로 분화할 수 있는 다능성 줄기세포로서, 중배엽과 내배엽 사이를 차지하는 소성의 조직, 결합조직, 진피, 피하조직, 뼈, 연골, 골수, 골격근, 평활근, 심근, 혈액세포, 임파절, 임파관, 혈관, 비장, 위 등으로 분화할 수 있는 중배엽성의 미분화세포를 의미할 수 있다. 상기 간엽세포는 대상체, 예를 들면, 인간 등을 포함하는 포유류로부터 분리된 것일 수 있으며, 지방줄기세포, 중간엽줄기세포, 중간엽기질세포, 골수줄기세포 또는 섬유아세포를 포함할 수 있다. 상기 세포에서 언급된 용어 "분리된"은 자연적으로 발생하는 세포 내의 환경과는 다른 환경에 존재하는 세포를 의미할 수 있다. 예를 들면, 세포는 자연적으로 다세포 기관에서 발생하고, 상기 세포가 다세포 기관으로부터 제거되었다면 세포는 "분리된" 것이다.
용어 "세포집합체(cell cluster)" 또는 "3차원 세포집합체" ('세포조직체'와 호환적으로 사용됨)는 2 이상의 세포가 밀집된 상태를 말하며, 조직 상태일 수도 있고, 단일 세포 상태일 수도 있다. 각각의 세포 집합체는 조직 자체 또는 일부, 또는 단일 세포의 집합체로 존재할 수 있으며, 간엽세포로부터 분화된 세포 유사-조직체를 포함할 수 있다. 또한, 용어 "3차원(three-dimension)"은 2차원이 아닌 기하학적인 3개의 파라미터(예를 들면, 깊이, 넓이, 높이 또는 X, Y, Z 축) 모델을 갖는 입체를 의미할 수 있으며, 따라서 일 구체예에 따른 간엽세포로부터 분화된 세포집합체는 3차원 배양, 즉 배양용기에서 탈착되어 부유상태로 배양되어 세포가 증식함에 따라 입체적으로 구형, 시트(sheet) 또는 그와 유사한 3차원의 형태(예를 들면, 유사 조직체)를 갖는 세포집합체를 의미할 수 있다. 상기 세포집합체는 직경이 300 ㎛ 이상, 예를 들면 300 내지 2000 ㎛, 400 내지 1500 ㎛, 400 내지 1000 ㎛ 일 수 있다. 또한 상기 세포집합체는 간엽세포로부터 분화된 혈관세포를 포함하는 것일 수 있으며, 예를 들면 혈관 세포를 2 × 104 내지 1 × 105 세포/cm2 포함하는 것일 수 있다.
상기 간엽세포로부터 세포집합체로의 분화는 상기 간엽세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접착시켜 배양함으로써 분화시킬 수 있다. 상세하게는 상기 간엽세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접착시켜 배양하면 상기 접착된 간엽세포의 밀도가 증가함에 따라 간엽세포가 배양용기로부터 탈착되어 세포집합체를 형성하게 된다. 또한, 상기 배양은 간엽세포로부터 세포집합체로 분화된 후 추가적으로 적어도 12시간 이상, 또는 적어도 1일 이상, 예를 들면 12시간 내지 15일, 1일 내지 15일, 3일 내지 10일, 3일 내지 7일, 또는 5일 내지 7일 더 배양된 것일 수 있다. 상기 배양하여 세포집합체를 형성하는 방법의 상세한 설명은 후술한다.
상기 섬유증의 병리학적인 특징은 섬유증-특이적, 또는 비특이적인 증상, 섬유증-특이적, 또는 비특이적인 조직학적인 형태 특성, 분자생물학적 특성, 또는 병리학적 특성을 포함할 수 있다. 예를 들면, 섬유증의 병리학적인 특징은 섬유증이 없는 세포 또는 조직에 비해 과도한 결합 조직의 형성; 콜라겐의 침착; 섬유증 관련 분자의 발현, 분비, 또는 합성의 증가; 및 세포의 사멸 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 섬유증 관련 분자는 섬유증-특이적, 또는 비특이적인 마커 유전자 또는 단백질을 포함할 수 있고, 예를 들면, TGF(Transforming growth factor)-베타, Smad, 라미닌, 및 SMA(Smooth muscle actin)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 TGF-베타는 TGF-β1, 2, 또는 3을 포함하고, 상기 Smad는 Smad 1 내지 8, R-Smad, Co-Smad, 또는 I-Smad를 포함할 수 있다. 상기 SMA는 근섬유아세포의 마커로서, 섬유증에 있어서 콜라겐의 침착은 근섬유아세포에 기인한 것일 수 있다. 따라서, 일 구체예에 따른 상기 세포집합체 또는 상기 세포집합체 내의 세포는 상기한 바와 같은 섬유증의 병리학적인 특징을 나타내는 것일 수 있다.
본 명세서에서 용어 "섬유증(fibrosis)"은 기관이나 조직에 과도한 섬유성 결합조직이 형성되는 것을 의미할 수 있다. 상기 섬유증은 특발성 폐 섬유증(IPF), 폐섬유증, 간질성 폐 질환, 비특이적 간질성 폐렴(NSIP), 통상성 간질성 폐렴 (UIP), 심내막 심근 섬유증, 종격 섬유증, 골수 섬유증, 후복막 섬유증, 진행성 종괴성 섬유증, 신원성 전신 섬유증, 크론병, 진구성 심근경색증, 피부경화증/전신 경화증, 신경섬유종증, 헤르만스키-푸들라크 증후군, 당뇨신장병증, 신장 섬유증, 비대심근병증(HCM), 고혈압-관련 신장병증, 신장 세뇨관 간질성 섬유증, 사구체 경화증(FSGS), 방사선-유도 섬유증, 자궁근종(fibroids), 알코올성 간질환, 간 지방증, 간 섬유증, 간경변증, C형 간염 바이러스(HCV) 감염, 만성 기관 이식 거부, 피부의 섬유성 질환, 켈로이드 반흔, 뒤퓌트랑 구축, 엘러스-단로스 증후군, 이영양성 표피 수포증, 구강 점막하 섬유증, 및 섬유-증식 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 구체예에 따른 간엽세포로부터 분화된 세포집합체는 3차원적으로 배양된 것이기 때문에 생체 내 환경을 잘 모사할 수 있으며, 섬유증의 표현형, 즉 섬유증에서 나타나는 병리학적 특성을 나타내므로 인 비트로 섬유증 모델에 유용하게 사용될 수 있다. 본 명세서에서 용어 "섬유증 모델(fibrosis model)"은 섬유증을 갖는 기관, 조직 또는 세포의 구조나 형상을 모식화한 것을 의미할 수 있으며, 섬유증을 갖는 기관, 조직 또는 세포간의 상호작용, 구조나 형태와의 관련성을 밝히기 위해 고려된 섬유증 모형을 의미할 수 있다. 따라서 섬유증 모델은 섬유증-특이적, 또는 비특이적인 표현형을 나타내거나, 섬유증-특이적, 또는 비특이적인 마커 유전자 또는 단백질의 발현을 나타내는 것일 수 있다.
다른 양상은 간엽세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접착시켜 배양하여 세포집합체를 형성하는 단계; 및 상기 형성된 세포집합체를 적어도 12시간 이상 추가적으로 배양하여 상기 세포집합체에서 섬유증의 병리학적 특징을 형성하는 단계를 포함하는 인 비트로(In vitro) 섬유증 모델을 제조하는 방법을 제공한다.
상기 간엽세포, 세포집합체, 및 섬유증에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 간엽세포는 소수성 표면과의 세포-기질간 상호작용에 의해 배양용기에 접착되는 것일 수 있다. 상기 간엽세포(예, 지방줄기세포)는 예를 들면, 인간 지방조직으로부터 분리할 수 있고, 인간 지방조직은 성숙한 지방세포와 이를 둘러싼 결체조직을 포함하는 것을 의미할 수 있으며, 환자 자신 또는 표현형이 일치하는 타인으로부터 용이하게 얻을 수 있다. 이때 체내 위치에 상관없이 지방을 채취할 때 사용되는 모든 방법에 의하여 수득되는 모든 지방조직을 사용할 수 있으며, 예를 들면, 피하 지방조직, 골수 지방조직, 장간막 지방조직, 위장 지방조직, 또는 후복막 지방조직을 포함할 수 있다. 상기한 인간 지방조직으로부터 지방줄기세포는 공지의 방법에 의해 분리될 수 있다. 예를 들어, 국제특허공개 제WO2000/53795호 및 제WO2005/04273호에 개시된 바와 같이, 지방조직으로부터 지방흡입(liposuction), 침강, 콜라게나제(collagenase) 등의 효소처리, 원심분리에 의한 적혈구 등의 부유세포 제거 등의 과정을 통하여 획득할 수 있다. 이외에도 다양한 조직으로부터 공지의 방법으로 간엽세포, 예를 들면, 중간엽줄기세포, 중간엽기질세포, 골수줄기세포, 또는 섬유아세포를 분리할 수 있다.
상기와 같이 분리된 간엽세포는 수차례의 계대배양에도 계대수(passage number)가 16에 이르기까지 우수한 증식율을 나타낸다. 따라서 인간 조직으로부터 분리된 다분화능 간엽세포는 이후의 3차원 세포접합체 형성에 1 계대 배양된 세포를 그대로 사용하거나, 60% 조밀도(confluency)에서 10 계대 이상 배양된 세포를 사용할 수 있다.
상기와 같이 준비된 간엽세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접종하여 배양하면, 배양용기의 소수성 표면으로 인해 간엽세포와 배양용기 사이에 세포-기질간 상호작용이 이루어져 물리적 흡착에 의해 간엽세포가 배양용기 표면에 접착된 상태로 증식하게 된다. 이후 상기 세포집합체를 형성하는 단계는 상기 접착된 간엽세포의 밀도가 증가함에 따라 간엽세포가 배양용기로부터 탈착되어 세포집합체를 형성하는 것일 수 있다.
본 발명에 적합한 표면이 소수성을 띠는 배양용기는 통상적인 세포 배양용기에 소수성을 부여하는 고분자로 표면 처리되거나 그러한 고분자로 제조된 세포 배양용기일 수 있다. 이러한 소수성 고분자로는 폴리스티렌(polystyrene), 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리에틸렌 테레프탈레이트(PET), 폴리비닐클로라이트(PVC), 폴리에틸렌(PE), 폴리프로필렌(PP), 폴리테트라플루오르에틸렌(PTFE), 지방족 폴리에스테르계 고분자로서, 폴리(L-락트산)(PLLA), 폴리(D,L-락트산）(PDLLA), 폴리(글리콜산)(PGA), 폴리(카프로락톤)(PCL), 폴리(하이드록시알카노에이트), 폴리다이옥산온(PDS), 폴리트라이메틸렌카보네이트 중에서 선택된 1종이거나, 또는 이들 단위들의 공중합체인 폴리(락트산-co-글리콜산)(PLGA), 폴리(L-락트산-co-카프로락톤)(PLCL), 폴리(글리콜산-co-카프로락톤)(PGCL), 또는 이들의 유도체 등을 예로 들 수 있다. 또한 배양용기는 소수성 표면으로 실란화된 표면(silanized surface), 탄소나노튜브(CNT) 표면, 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 또는 금속(예컨대, 스테인레스 스틸, 티탄, 금, 백금 등) 표면을 갖는 것일 수 있다.
또한, 본 발명의 다른 구체예에 있어서, 간엽세포와 소수성 배양용기 표면과의 상호작용에 의한 물리적 흡착보다 효과적으로 간엽세포를 배양용기에 접착시키기 위해, 간엽세포에 접착활성을 갖는 성장인자와의 상호작용에 의해 배용용기에 접착될 수 있다. 예를 들면, 배양용기 표면에 상기 성장인자를 고정시킨 후 고정된 성장인자와 간엽세포와의 생화학적 상호작용을 이용할 수 있다.
상기 성장인자는 간엽세포에 접착활성을 갖는 것을 포함할 수 있으며, 그의 예로는 혈관내피 성장인자(VEGF), 섬유아세포 성장인자(FGF), 표피 성장인자(EGF), 혈소판-유도 내피 성장인자(PDGF), 간세포 성장인자 (HGF), 인슐린 유사 성장인자 (IGF), 또는 헤파린 결합 도메인 (HBD) 등을 포함할 수 있다. 상기 성장인자는 5 내지 100 ㎍/㎖의 농도로 배양용기 표면에 고정될 수 있다.
배양용기 표면에 대한 성장인자의 고정화는 폴리펩티드를 고체 기질 표면에 고정하는데 이용되는 것으로 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 달성될 수 있는데, 물리적인 흡착, 비선택적인 화학반응에 의한 공유결합 등을 이용할 수 있다. 이러한 고정화 방법의 예로는, 단백질에 바이오틴(biotin)을 결합시킨 후, 이 단백질을 스트렙타비딘(streptavidin)이나 아비딘(avidin)으로 처리된 고체 표면에 적용시킴으로써 바이오틴-스트렙타비딘/아비딘 결합을 이용하여 단백질을 고정하는 방법; 플라즈마를 이용하여 기판 위에 활성기(화학결합에 의해 단백질을 고정하기 위한 화학적 작용기)를 집적시켜 단백질을 고정하는 방법; 고체 기판 표면에 졸-겔(sol-gel)법을 이용하여 비표면적이 충분히 증가된 다공성 졸-겔 박막을 형성한 후에, 상기 다공성 박막에 물리적인 흡착에 의해 단백질을 고정하는 방법; 플라즈마 반응에 의하여 폴리테트라플루오로에틸렌(PTFE) 표면에 항혈전성 단백질을 고정하는 방법; 양이온성 아미노 잔기가 2개의 효소에 2개 이상 연속적으로 융합된 효소를 결합시켜 단백질을 고정하는 방법; 기질을 이용하여 고체상 지지대에 결합되어 있는 소수성 고분자 층에 단백질을 고정하는 방법; 플라스틱 표면에서 완충성분을 이용하여 단백질을 고정하는 방법; 알코올 용액에서 소수성 표면을 가지는 고체 표면에 단백질을 접촉시켜 단백질을 고정하는 방법 등이 알려져 있다.
일 구체예에 있어서, 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능한 폴리펩티드 링커를 사용하여 상기 폴리펩티드 링커의 카르복실 말단에 성장인자의 아미노 말단이 융합되어 있는 폴리펩티드 링커-성장인자 재조합 단백질 형태로 고정화를 수행할 수 있다.
본 발명에 적합한 폴리펩티드 링커는 그의 카르복실 말단을 통해 성장인자의 아미노 말단과 결합하고 그의 아미노 말단에 존재하는 소수성 도메인을 통해 소수성 표면을 갖는 배양용기에 흡착할 수 있는 것으로서, 재조합적으로 대량 발현 및 용이한 정제가 가능하고 간엽세포의 배양에 영향을 미치지 않는 것을 포함할 수 있다. 이러한 폴리펩티드 링커로는 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP), 하이드로포빈(hydrophobin), 또는 소수성 세포 투과성 펩티드(hydrophobic cell penetrating peptides, CPPs) 등을 포함할 수 있다.
상기한 바와 같이, 간엽세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 세포-기질간 상호작용에 의해 물리적으로 접착시켜 배양하거나 상기 배양용기 표면에 고정된 성장인자와의 생화학적 상호작용에 의해 성장인자에 결합된 상태로 배양하면, 초기에는 간엽세포가 배양용기 표면에 접착된 상태로 증식할 수 있다. 상기 간엽세포는 1× 103 내지 1× 107 세포/㎠의 농도로 파종될 수 있다. 또한 상기 배양 온도는 35 ℃내지 38.5 ℃일 수 있으며, 세포집합체를 형성하기 위한 배양 기간은 4시간 내지 2일, 예를 들면, 1일 일 수 있다. 상기 배양에 적합한 배지는 간엽세포의 배양 및/또는 분화에 통상적으로 사용되는 배지로서 혈청 혹은 무혈청을 함유한 것이면 어느 것이나 제한 없이 사용될 수 있으며, 예를 들면 DMEM(Dulbeco's modified eagle medium), Ham's F12, 이들의 혼합물 등에 혈청을 첨가한 배지를 사용할 수 있다.
이후에 간엽세포가 배양용기 표면에 접착된 상태로 증식하다가 높은 세포 밀도에서 세포-세포간 상호작용이 세포-기질간 상호작용보다 강해지면 간엽세포가 배양용기 표면으로부터 탈착되어 배양액 내에 부유된 상태로 증식하면서 서로 응집되어 육안으로 검출 가능한 크기의 부유하는 3차원 세포집합체(cell cluster)를 형성할 수 있다.
일 구체예에 있어서, 표면이 소수성을 띠어 이에 대한 세포접착이 상대적으로 약하게 일어나는 배양용기로서 폴리스티렌으로 제조된 비-조직세포 배양용 플레이트(non-tissue culture plate; NTCP)에 간엽세포를 접종하여 3차원 세포집합체의 형성을 유도할 수 있다. 폴리스티렌 NTCP에 접종된 간엽세포는 초기에 세포-기질간 상호작용에 의해 플레이트 표면에서 약한 세포접착이 유도되어 접착된 상태로 2차원 단층으로 증식하다가 배양시간이 경과함에 따라 세포의 밀도가 높아지면 세포-기질간 상호작용보다 세포-세포간 상호작용이 더 강하게 작용하여 2차원 단층 배양된 세포들이 배양용기 표면에서 탈착된다. 이때 초기에는 간엽세포가 배양용기 표면에 접착된 상태로 배양될 수 있으며, 초기부터 세포접착이 일어나지 않고 부유된 상태로 배양되면 형성되는 3차원 세포집합체의 크기가 작고 대부분의 세포가 사멸되는 현상을 나타낼 수 있다. 배양용기로부터 탈착된 세포를 배양액 내에 부유된 상태로 더 배양하게 되면 세포-세포간 상호작용에 의해 세포들이 서로 응집되면서 3차원 세포집합체가 형성될 수 있다. 이렇게 형성되는 3차원 세포집합체는 초기에는 세포들이 약하게 결합되어 있으나 배양시간이 경과함에 따라 세포-세포간 상호작용에 의해 세포집합체를 형성하고 있는 세포들 사이의 접착력이 강화되어 조밀한(compact) 3차원 세포집합체를 형성하게 된다.
또한, 상기 형성된 세포집합체를 추가적으로 적어도 12시간 이상 배양하게 되면, 세포집합체 또는 세포집합체 내의 세포에서 섬유증의 병리학적 특징이 형성될 수 있다. 상기 추가적인 배양 시간은 적어도 12시간 이상, 또는 적어도 1일 이상, 예를 들면 12시간 내지 15일, 1일 내지 15일, 3일 내지 10일, 3일 내지 7일, 또는 5일 내지 7일 일 수 있다. 상기 섬유증의 병리학적 특징에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 3차원 세포집합체는 형성된 3차원 세포집합체 형태로 증식하면서 혈관내피세포로 분화될 수 있다. 간엽세포가 3차원 세포집합체 형태로 배양되면, 세포집합체가 형성됨에 따라 내부로의 산소 투과가 감소하게 되고 그로 인해 저산소 상태가 조성될 수 있다. 세포집합체 내부에 조성된 저산소 상태는 혈관내피세포의 분화에 영향을 미치는 다양한 혈관신생 촉진인자의 생성을 유도하고, 그 결과로 혈관내피세포로의 분화가 이루어 지게 될 수 있다.
상기와 같이 배양용기 표면에 간엽세포를 접착시켜 배양하여 형성된 3차원 세포집합체는 육안으로 검출가능한 크기, 예를 들면, 300 ㎛ 내지 2000 ㎛의 직경을 가지고 있어 여과 또는 원심분리 등의 방법에 의해 용이하게 회수할 수 있다. 이렇게 회수된 3차원 세포집합체는 콜라게나제, 트립신 또는 디스파제(dispase)를 이용한 효소학적 처리, 압력을 이용한 기계적인 처리, 또는 이들의 병용 처리에 의해 집합체 형태를 와해시켜 단일 세포 형태로 사용하거나, 3차원 세포집합체 형태 그대로 사용할 수 있다.
또 다른 양상은 상기 인 비트로 섬유증 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 및 상기 인 비트로 섬유증 모델의 세포집합체 또는 상기 세포집합체 내의 세포에서 무처리 대조군과 비교하여 섬유증의 병리학적 특징의 개선 또는 치료를 나타내는 피검물질을 섬유증 치료를 위한 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 섬유증 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.
상기 간엽세포, 세포집합체, 및 섬유증에 대해서는 상기한 바와 같다.
상기 스크리닝 방법에 있어서, 피검 물질은 저분자 화합물, 항체, 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(short interfering RNA), 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA), 핵산, 단백질, 펩티드, 기타 추출물 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있다.
또한, 상기 스크리닝 방법에 있어서, 상기 섬유증의 병리학적인 특징은 섬유증-특이적, 또는 비특이적인 증상, 섬유증-특이적, 또는 비특이적인 조직학적인 형태 특성, 분자생물학적 특성, 또는 병리학적 특성을 포함할 수 있다. 예를 들면, 섬유증의 병리학적인 특징은 섬유증이 없는 세포 또는 조직에 비해 과도한 결합 조직의 형성; 콜라겐의 침착; 섬유증 관련 분자의 발현, 분비, 또는 합성의 증가; 및 세포의 사멸 증가로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 그들의 조합을 포함할 수 있다. 상기 섬유증 관련 분자는 섬유증-특이적, 또는 비특이적인 마커 유전자 또는 단백질을 포함할 수 있고, 예를 들면, TGF(Transforming growth factor)-베타, Smad, 라미닌, 및 SMA(Smooth muscle actin)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것일 수 있다. 상기 TGF-베타는 TGF-β1, 2, 또는 3을 포함하고, 상기 Smad는 Smad 1 내지 8, R-Smad, Co-Smad, 또는 I-Smad를 포함할 수 있다. 상기 SMA는 근섬유아세포의 마커로서, 섬유증에 있어서 콜라겐의 침착은 근섬유아세포에 기인한 것일 수 있다. 따라서, 예를 들면, 상기 섬유증 치료를 위한 후보 물질을 선별하는 단계는 피검 물질이 무처리 대조군에 비해 세포집합체 또는 세포집합체 내의 세포의 결합 조직의 형성, 콜라겐 침착, 또는 콜라겐 섬유질의 두께를 감소시키는 경우, 또는 세포의 생존율을 증가시키는 경우 상기 피검 물질을 섬유증 치료를 위한 후보 물질로 선별하는 것일 수 있다. 상기 섬유증의 표현형, 즉 결합 조직의 형성 여부, 콜라겐 침착 여부, 또는 콜라겐 섬유질의 두께 측정은 통상의 당업자에게 공지된 H&E 염색, MT 염색, 면역형광 염색, 또는 면역조직화학적 염색 등을 사용하여 확인할 수 있고, 세포의 생존율 또는 사멸 정도는 LDH 어세이, 또는 생존/사멸 어세이(live/dead assay)를 사용하여 확인할 수 있다. 또한, 상기 피검 물질이 섬유증 관련 분자, 즉, 섬유증-특이적, 또는 비특이적인 마커 유전자 또는 단백질의 발현을 감소시키거나 증가시키는 경우 상기 피검 물질을 섬유증 치료를 위한 후보 물질로 선별하는 것일 수 있다. 예를 들면, 상기 피검 물질이 TGF-베타, Smad, 라미닌, 또는 SMA의 발현을 감소시키는 경우 상기 피검 물질은 섬유증 치료를 위한 후보 물질로 선별될 수 있다. 상기 발현을 측정하는 방법은 역전사 중합효소 연쇄반응(RT-PCR), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나를 포함할 수 있다.
일 양상에 따른 인 비트로 섬유증 모델 및 그의 제조방법에 의하면, 3차원 세포집합체로서 생체 내 환경을 잘 모사할 수 있고, 섬유증의 표현형, 즉 섬유증에서 나타나는 병리학적 특성을 나타내므로 섬유증의 연구 또는 치료제 스크리닝 방법에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.
도 1은 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 주사전자현미경 이미지 및 H&E 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 저산소 상태를 면역 형광 염색으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 3은 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 TGF-베타 발현을 나타낸 도면이다.
도 4는 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 섬유증 관련 인자의 발현을 나타낸 도면이다.
도 5는 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 콜라겐 침착을 면역형광염색 및 히드록시프롤린 함량 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 제1 형 콜라겐(collagen type I) 침착을 면역형광 염색으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 제1 형 콜라겐 침착을 면역화학적 염색으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체를 투과전자현미경을 관찰한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 9는 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 세포 생존율 및 사멸을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
실시예 : 인 비트로( In vitro ) 섬유증 모델 제조 및 그의 섬유증 모델링 특성 분석
(1) 인 비트로( In vitro ) 섬유증 모델 제조
(1.1) 인간지방줄기세포( Human adipose stem cell : hASC )의 분리
가톨릭대학교 성형외과 연구실에서 분양받은 정상인의 피하 지방조직을 1% 페니실린/스트렙토마이신(PS)을 함유하는 PBS로 3회 세척하여 오염된 혈액을 제거한 후 수술용 가위로 잘게 조각내었다(chopping). 이 지방조직을 1% BSA(w/v), 0.3% 콜라게나제 타입 1, 및 1% PS을 함유하는 조직용해액(DMEM/F-12, 웰진)에 담그고 1시간 동안 37℃에서 교반하였다(orbital shaking). 이후 상층액은 버리고 세포 현탁액을 250 ㎛ Nitex 필터(Sefar America Inc.)로 여과하여 조직파편들(debris)을 제거하였고 1,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하였다. 원심분리에 의해 수집된 세포를 10% BSA를 함유하는 DMEM/F-12에 재현탁하였다. 분리된 1차 세포를 5% CO2 및 95% 공기를 갖는 37℃의 습윤한 대기에서 24시간 동안 조직 배양 플라스크(tissue culture flask)에 플레이트하였다. 이후 비-부착성 세포를 동일한 부피의 신선한 배지로 교체함으로써 제거하였다. 부착성 hASC의 형태를 위상차 현미경으로 관찰하였고, 5계대의 hASC를 모든 실험에 대하여 사용하였다.
(1.2) 지방줄기세포 유래의 3차원 세포집합체의 제조
상기 수득한 지방줄기세포로부터 3차원 세포집합체를 제조하기 위해, 상기 지방줄기세포를 비-조직세포 배양용 96-웰 플레이트(Non-Tissue Culture Treated 96-well Plate, "NTCP", 폴리스티렌 재질로 표면이 소수성을 띰, Falcon사)에서 배양하였다. 상기 플레이트는 융합 단백질 MBP(Maltose Binding Protein)-FGF(Fribroblast Growth Factor)가 코팅된 플레이트이고, 상기 융합 단백질이 코팅된 플레이트에 대해서는 대한민국 특허 제1109125호에 기재되어 있으며, 본 명세서에 전체가 참조로 포함된다. 구체적으로, 상기 웰플레이트에 웰당 1× 105 세포/㎠ 의 지방줄기세포를 접종한 후 10% FBS 함유 DMEM/F-12 배지에서 배양하였다. 배양 24 시간 이내에 각 세포접착 표면에서 지방줄기세포의 3차원 세포집합체가 형성되었다. 상기 형성된 3차원 세포집합체에 대한 섬유증 모델 특성 분석을 위해 배양 1일째(1 day), 3일째(3 day) 및 5일째(5 day)의 3차원 세포집합체를 수집하였다. 또한, 상기 3차원 세포집합체는 약 500 ㎛ 이상의 직경을 갖는 것으로 확인되었다. 이하에서 3차원 세포집합체를 '3DCM'이라 표시한다.
또한, 비교예로서 지방줄기세포를 2차원적으로 배양하였다. 구체적으로, 조직세포 배양용 96-웰 플레이트(TCP)에 웰당 1× 105 세포/㎠ 의 지방줄기세포를 접종한 후 10% FBS 함유 DMEM/F12 배지에서 배양하였고, 상기 3차원 세포집합체와 동일하게 섬유증 모델 특성 분석을 위해 배양 1일째(1 day), 3일째(3 day) 및 5일째(5 day)의 세포를 수집하였다. 이하에서 2차원적으로 배양된 세포를 '2D'라 표시한다.
(2) 인 비트로( In vitro ) 섬유증 모델의 섬유증 모델링 특성 분석
(2.1) 지방줄기세포 유래의 3차원 세포집합체의 특성 분석
지방줄기세포 유래의 3차원 세포집합체의 형태학적 특성을 분석하기 위해 주사전자현미경 및 H&E 염색을 수행하였다. 또한, 상기 3차원 세포집합체 내부의 저산소 상태를 확인하기 위해 면역 염색을 수행하였다.
구체적으로, 주사전자현미경 관찰을 위해, 상기 수집된 3차원 세포집합체를 2.5% 글루타알데하이드로 4 ℃에서 2시간 동안 고정하였고, 탈이온수 중 1% 오스뮴 테트록사이드(osmium tetroxide)로 후고정하였다. 고정된 3차원 세포집합체를 일련의 농도의 에탄올(50%, 70%, 80%, 90% 및 100%)로 2번 탈수시켰다. 탈수 후에, 3차원 세포집합체를 헥사메틸디실라잔(hexamethyldisilazane: HMDS)에 2분 동안 침지하였고, 하루 동안 진동 건조하였다. 주사전자현미경 이미지를 얻기 위해 3차원 세포집합체를 부착성 탄소 테이프에 부착하였고 금으로 10 mA에서 60 총안 스푸터 코팅을 수행하였으며, 이미지는 15 kV에서 얻었고, 그 결과를 도 1a에 나타내었다.
또한 H&E 염색을 위해, 상기 수집된 3차원 세포집합체를 30분 동안 상온에서 4% PFA로 고정하고, 일련의 농도의 에탄올(50%, 70%, 80%, 90% 및 100%)로 탈수시켜서 파라핀 왁스에 넣었다. 4 ㎛ 두께의 절편을 제조하고 헤막토실린 및 에오신(H&E)으로 염색하였다. 절편을 탈파라핀화 하였고 증류수로 수화시킨 후 PBS로 세번 세척하였다. 이후에 10초 동안 헤마토실린(Harris; Sigma-Aldrich)에 침지하였고 흐르는 물에 10 내지 15분 동안 세척하였고, 15초 동안 에오신으로 카운터 염색을 한 후 다시 10 내지 15분 동안 세척하였다. 이후 슬라이드에 올려놓고 광현미경으로 관찰하였으며, 그 결과를 도 1b에 나타내었다.
또한 저산소 면역형광 분석을 위해 상기 각각의 배양 시점에서 수집되기 전에 3차원 세포집합체를 0.1 ml 용액 중 10 mmol 피모니다졸 염화수소(pimonidazole hydrochloride) (히드록시프로브(HypoxyprobeTM-1) 키트, Hypoxyprobe, USA)로 2시간 동안 인큐베이션하였다. 이후 3차원 세포집합체를 수집하고 4% 파라폼알데하이드(paraformaldehyde)로 4 ℃에서 30분 동안 고정하고, OCT 화합물(optimal cutting temperature compound)(TISSUE-TEK® 4583; Sakura Finetek USA, Inc.)에 포매하였다. 6 ㎛의 동결정지 절편을 PBS로 세척하고, 비특이적이 결합을 막기 위해 PBS 중 4% BSA로 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 피모니다졸은 1차 마우스 항체(히드록시프로브) 및 2차 고트 항-마우스 알렉사 488 항체(Invitrogen)에 의해 검출되었다. 또한, DAPI(4,5-디아미디노-2-페닐인돌)(Vector Laboratories)를 핵 염색을 위해 사용하였다. 대조군은 동일한 조건 하에서 1차 항체 없이 수행하였으며, 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 1은 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 주사전자현미경 이미지 및 H&E 염색 결과를 나타낸 도면이다.
도 2는 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 저산소 상태를 면역 형광 염색으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 배양 1일째의 3차원 세포집합체의 외부 표면은 H&E에 의한 염색이 조밀하게 나타나므로 섬유성 매트릭스에 의해 세포들이 연결되어 있는 것을 확인할 수 있다. 배양이 계속해서 진행되면서 배양 3일째의 3차원 세포집합체의 세포 사이의 간격이 감소하였고, 배양 5일째의 3차원 세포집합체의 세포 사이의 간격이 거의 존재하지 않는 것(화살표)을 확인할 수 있다.
또한, 도 2에 나타낸 바와 같이, 배양 1일째에 DAPI-염색 세포가 3차원 세포집합체 전체에 균일하게 분포되어 있고, 더 많은 저산소프로브-양성 세포가 3차원 세포집합체의 내부에 존재하는 것을 확인할 수 있다. 배양이 계속해서 진행되면서 배양 3일째의 3차원 세포집합체의 내부에 저산소프로브-양성 세포가 증가되어 있으며, 배양 5일째의 3차원 세포집합체는 외부에도 저산소프로브-양성 세포가 증가되어 있는 것을 확인할 수 있다. 이에 의해 저산소가 3차원 세포집합체의 내부에서 유도되었고, 이것이 외부로 확산되었음을 알 수 있다. 이는 도 1의 결과와 관련되어 3차원 세포집합체의 외부 표면에서 세포 사이의 간격이 닫힘으로써 저산소가 유도되었음을 알 수 있다. 섬유증에 있어서 TGF-1가 중요한 관련인자이고, TGF-1는 저산소증에서 과발현이 된다. 즉 세포와 세포사이의 간격이 좁아지면 세포집합체 내부에 산소의 공급이 제한되고, TGF-1가 유도되어 섬유증이 유발된다. 따라서, 상기의 결과로 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체는 섬유증의 병리학적 특성을 모델링함을 확인할 수 있다.
(2.2) 지방줄기세포 유래의 3차원 세포집합체의 섬유증 관련 인자 분석
TGF 베타는 섬유증의 주요 분자이고 저산소 조건에 의해 유도되는 것으로, 지방줄기세포 유래의 3차원 세포집합체에서 섬유증 관련 인자가 발현되는지 확인하기 위해 TGF 베타를 포함한 섬유증 관련 인자들에 대해 ELISA를 수행하였다.
구체적으로, 총 TGF-β1의 양을 측정하기 위해, 배양 배지를 정상 세포NCC(normal cell concentration), 2차원적으로 배양된 세포(2D), 및 3차원 세포집합체(3DCM)로부터 제조하였다. 잠재된 TGF-β1을 면역반응성 형태로 활성화시키기 위해 배양상층액을 1N HCL로 인큐베이션하고 1.2 N NaOH/0.5 M HEPES로 중화시켰다. 어세이는 Quantikine ELISA 인간 TGF-β1 키트(R&D System)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 흡광도는 Multisakn(Thermo)를 사용하여 560 nm에서 측정하였고, 그 결과를 도 3에 나타내었다.
또한, 3차원 세포집합체의 섬유증 관련 인자들의 발현을 확인하기 위해 상기 수집된 3차원 세포집합체로부터 총 RNA를 트리졸 시약(Invitrogen, USA)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 추출하였다. 추출된 RNA는 뉴클리아제-제거 물에 용해시켰고, RNA 농도는 NanoDrop ND1000 분광광도계(Spectrophotometer) (Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 정량화하였다. 상보적 DNA 합성은 Maxime RT PreMIX(iNtROn)을 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 모든 타겟 프라이머는 바이오니어(Bioneer)로부터 구입하여 사용하였다. 모든 중합효소 연쇄반응은 ABI Prism 7500(Applied Biosystems)를 사용하여 수행하였고, 유전자 발현 수준은 SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa)를 사용하여 정량화하였다. 상대적 유전자 발현 수준은 상대적 Ct 방법(comparative Ct method)을 사용하여 계산하였고, 그 결과를 도 4에 나타내었다.
도 3은 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 TGF-베타 발현을 나타낸 도면이다.
도 4는 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 섬유증 관련 인자의 발현을 나타낸 도면이다.
도 3 및 4에 나타낸 바와 같이 지방줄기세포 유래의 3차원 세포집합체는 정상 세포 및 2D에 비해 TGF 베타를 포함한 섬유증 관련 인자인 라미닌, SMA(Smooth muscle actin), 콜라겐 타입 I 및 SMAD3의 발현이 증가되어 있음을 확인할 수 있다.
(2.3) 지방줄기세포 유래의 3차원 세포집합체의 콜라겐 침착 분석
지방줄기세포 유래의 3차원 세포집합체의 총 콜라겐 침착을 분석하기 위해 면역형광 염색, 면역조직화학적 염색 및 히드록시프롤린(hydroxyproline) 정량을 수행하였고, 투과전자현미경으로 관찰하였다.
구체적으로, MT 염색(Masson Trichrome staining)을 위해 상기 H&E 염색과 동일하게 전처리를 수행하였고 Masson's trichrome으로 염색하였다. 3차원 세포집합체에서 섬유증의 퍼센트는 ImageJ 소프트웨어(NIH)를 사용하여 디지털 이미지 내의 염색된 콜라겐 면적의 픽셀의 수를 카운트하여 결정하였고, 그 결과를 도 5a에 나타내었다. 또한, 히드록시프롤린 어세이를 수행하기 위하기 2차원적으로 배양된 세포 및 3차원 세포집합체를 RIPA 버퍼를 사용하여 준비하였고, 12N HCL로 120 ℃에서 3시간 동안 가수분해하였다. 어세이는 제조사의 지시에 따라 히드록시프롤린 키트(Sigma-Aldrich)를 사용하여 수행하였다. 흡광도는 Multisakn(Thermo)를 사용하여 560 nm에서 측정하였고, 그 결과를 도 5b에 나타내었다.
또한, 또한 면역형광 염색(immunofluorescence:IF)을 위해 상기 H&E 염색과 같이 3차원 세포 집합체를 고정하고, OCT 화합물(optimal cutting temperature compound)(TISSUE-TEK® 4583; Sakura Finetek USA, Inc.)에 포매하고, -28 ℃에서 동결하고 6 ㎛ 두께로 잘라내었다. 비특이적인 결합을 피하기 위해, 절편을 상온에서 1시간 동안 BSA(4%)에서 인큐베이션하였다. 이후에, 4 ℃에서 콜라겐 I에 대한 1차 항체(Rabit, Abicam)로 하룻밤 동안 인큐베이션하였다. 이후에, 시료를 PBS로 세척하고, 1% BSA 내의 상응하는 형광 컨쥬게이트 2차 항체(Donkey anti-rabbit)(Life Technologies)로 1시간 동안 상온에 인큐베이션하였다. 또한, DAPI(4,5-디아미디노-2-페닐인돌)(Vector Laboratories)를 핵 염색을 위해 사용하였다. 대조군은 동일한 조건 하에서 1차 항체 없이 수행하였으며, 공초점 현미경(Carl Zeiss)으로 관찰하였고, 그 결과를 도 6에 나타내었다.
또한, 면역조직화학적 염색을 위해 상기 H&E 염색과 동일하게 전처리하였다. 피브로넥틴(FN) 및 라미닌(LN)을 각각 마우스 단일클론 항체 및 FN 및 LN에 대한 고트 다클론 항체(Santa cruz Biotechnology)를 사용하여 검출하였다. αSMA 분석을 위해 마우스 단일클론 항체(Dako)를 사용하여 검출하였다. 4 ℃에서 이들 각각의 1차 항체로 하룻밤 동안 인큐베이션한 후에, 절편을 홀스래디쉬 라벨 항-마우스(horse radish labelled anti-mouse)(FN 및 αSMA), 및 항-고트(LN) 2차 항체(Vector)로 상온에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 양성 염색은 디아미노벤지딘(diaminobenzidine)(DAB, Vector)으로 시각화하였다. 음성 대조군은 동일한 조건 하에서 1차 항체 없이 수행하였다. 절편을 헤마톡실린으로 카운터 염색하였고 통상적인 광학 현미경하에서 관찰하였으며, 그 결과를 도 7에 나타내었다.
또한, 투과전자현미경 관찰을 위해 상기 주사전자현미경 관찰과 같이 시료를 전처리하였다. 추가적으로 고정된 3차원 세포집합체를 에폭시 레진(epoxy resin)으로 침윤시키고, 포매하고, 60 ℃에서 24시간 동안 중합하였다. 초박절편(ultrathin section)을 초마이크로톰(ultramicrotome)(Ultra cut C, Leica CO. Ltd)으로 제조하였고, 우라닐 아세테이트 및 납 시트레이트로 염색하였다. 이미지는 동결 TEM(cryoTecanai F20, FEI Co. Ltd)을 사용하여 관찰하였고, 그 결과를 도 8에 나타내었다.
도 5는 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 콜라겐 침착을 면역형광염색 및 히드록시프롤린 함량 분석으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 6은 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 제1 형 콜라겐 침착을 면역형광 염색으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7은 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 제1 형 콜라겐 침착을 면역화학적 염색으로 확인한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8은 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체를 투과전자현미경을 관찰한 이미지를 나타낸 도면이다.
도 5 에 나타낸 바와 같이, MT 염색에서 콜라겐이 3차원 세포집합체에서 다수 염색되어 있는 것을 확인할 수 있고, 히드록시프롤린 함량도 2차원적으로 배양된 세포에 비해 3차원 세포집합체에서 증가되어 있는 것을 확인할 수 있다.
또한 도 6에 나타낸 바와 같이, 면역형광 염색에서 콜라겐 타입 I이 3차원 세포집합체에서 현저하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있다.
또한 도 7에 나타낸 바와 같이, 면역화학적 염색에서 αSMA가 3차원 세포집합체에서 현저하게 증가되어 있는 것을 확인할 수 있다. αSMA는 근섬유아세포의 전형적인 마커로, 콜라겐 타입 I은 섬유증에서 근섬유아세포로부터 합성되므로, 상기의 결과는 도 6의 결과와 일치함을 알 수 있다.
또한, 도 8에 나타낸 바와 같이, 투과전자현미경 이미지에서 3차원 세포집합체에서 배양 기간이 길어짐에 따라 점진적으로 콜라겐 섬유질(fiber) 및 콜라겐 침착이 증가함을 확인할 수 있다. 상세하게는 더 두꺼운 콜라겐 섬유질이 배양 5일째에 관찰(화살표)되었고, 이것은 콜라겐의 가교에 기인한 것이다. 또한 배양 5일째에 3차원 세포집합체의 내부에 원래 그대로의 세포 구조가 거의 관찰되지 않았음을 알 수 있다. 상기의 결과로 세포 주변으로 콜라겐 섬유질이 더 두꺼워 지고, 이것이 영양분의 수송을 맞아 세포 사멸을 일으키게 되며, 따라서 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체는 섬유증의 병리학적 특성을 모델링함을 확인할 수 있다.
(2.4) 지방줄기세포 유래의 3차원 세포집합체의 세포 생존율 및 사멸 분석
콜라겐 침착은 섬유증에서 최종적으로 세포의 사멸을 유도하므로, 이러한 특성이 지방줄기세포 유래의 3차원 세포집합체에서도 나타나는지 확인하기 위해 LDH 어세이 및 생존/사멸 어세이(live/dead assay)를 수행하였다.
구체적으로, LDH 어세이를 수행하기 위해 정상 세포 NCC(normal cell concentration), 2차원적으로 배양된 세포(2D), 및 3차원 세포 집합체(3DCM) 배양 배지 중 절대적 락테이트 디하이드로게나아제(LDH) 방출을 측정하였다. 상기 측정은 LDH 어세이 키트(Promega)를 사용하여 제조사의 지시에 따라 수행하였다. 흡광도는 Multisakn(Thermo)를 사용하여 490 nm에서 측정하였고, 그 결과를 도 9a에 나타내었다. 또한, 생존/사멸 어세이는 제조사의 지시에 따라 생존/사멸 어세이 키트(Molecular probes)를 사용하여 수행하였다. 요약하여, 수집된 3차원 세포집합체를 1 ㎕의 녹색 형광 핵산 염색 용액(SYTO 10) 및 1 ㎕의 적색 형광 염색 용액(ethidium homodimer-2)을 함유하는 1 ml의 HEPES-버터 염수(HBSS)로 처리하고, CO2 배양기에서 30분 동안 배양하였다. 이후, 3차원 세포집합체를 PBS로 3번 세척하고, 30분 동안 4% PFA로 고정하고, OCT 화합물(optimal cutting temperature compound)(TISSUE-TEK® 4583; Sakura Finetek USA, Inc.)에 포매하고, -28 ℃에서 동결하고 10 ㎛ 두께로 잘라내었다. 전체 3차원 세포집합체를 완전히 잘라내었고, 각 시료의 중간 및 바깥쪽 부분으로부터 2 개의 슬라이드를 선택하였다. 절편은 공초점 현미경(Carl Zeiss)을 사용하여 분석되었고, 그 결과를 도 9b에 나타내었다.
도 9는 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체의 세포 생존율 및 사멸을 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 9a에 나타낸 바와 같이, LDH 어세이에서 3차원 세포집합체는 정상 배양 세포 및 2D에 비해 LDH 수준이 증가되어 있음을 확인할 수 있다. 또한, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 도 9a의 결과와 일치하게 3차원 세포집합체에서 세포 사멸이 시각적으로 검증되었다.
이상의 결과로, 일 구체예에 따른 3차원 세포집합체는 섬유증의 병리학적 특성을 나타내므로, 인 비트로(In vitro) 섬유증 모델로서 유용하게 사용될 수 있음을 알 수 있다.

Claims (15)

  1. 간엽세포를 배양하여 형성된 3차원 세포집합체(cell cluster)를 포함하고, 상기 세포집합체는 섬유증의 병리학적 특징을 나타내는 것인 인 비트로(In vitro) 섬유증 모델로서, 상기 병리학적 특징은 상기 3차원 세포집합체 또는 상기 3차원 세포집합체 내의 세포에서,
    정상 세포 대비 증가된 결합 조직의 형성;
    콜라겐의 침착;
    TGF(Transforming growth factor)-베타, 및 SMA(Smooth muscle actin)의 발현, 분비, 또는 합성의 증가; 및
    정상 세포 대비 증가된 세포의 사멸인 것인 모델.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 간엽세포는 지방줄기세포, 중간엽줄기세포, 중간엽기질세포, 골수줄기세포 및 섬유아세포로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 모델.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 3차원 세포집합체는 구형이고, 직경이 300 내지 2000 ㎛인 것인 모델.
  4. 청구항 1에 있어서, 상기 3차원 세포집합체는 상기 간엽세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접착시켜 배양함으로써 분화시킨 것인 모델.
  5. 청구항 4에 있어서, 상기 배양은 상기 3차원 세포집합체로 분화된 후 추가적으로 적어도 12시간 이상 더 배양된 것인 모델.
  6. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유증의 병리학적 특징은 상기 3차원 세포집합체 또는 상기 3차원 세포집합체 내의 세포에서,
    Smad, 또는 라미닌의 발현, 분비, 또는 합성의 증가를 더 포함하는 것인 모델.
  7. 청구항 1에 있어서, 상기 섬유증은 특발성 폐 섬유증(IPF), 폐섬유증, 간질성 폐 질환, 비특이적 간질성 폐렴(NSIP), 통상성 간질성 폐렴 (UIP), 심내막 심근 섬유증, 종격 섬유증, 골수 섬유증, 후복막 섬유증, 진행성 종괴성 섬유증, 신원성 전신 섬유증, 크론병, 진구성 심근경색증, 피부경화증, 전신 경화증, 신경섬유종증, 헤르만스키-푸들라크 증후군, 당뇨신장병증, 신장 섬유증, 비대심근병증(HCM), 고혈압-관련 신장병증, 신장 세뇨관 간질성 섬유증, 사구체 경화증(FSGS), 방사선-유도 섬유증, 자궁근종(fibroids), 알코올성 간질환, 간 지방증, 간 섬유증, 간경변증, C형 간염 바이러스(HCV) 감염, 만성 기관 이식 거부, 피부의 섬유성 질환, 켈로이드 반흔, 뒤퓌트랑 구축, 엘러스-단로스 증후군, 이영양성 표피 수포증, 구강 점막하 섬유증, 및 섬유-증식 장애로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것인 모델.
  8. 간엽세포를 표면이 소수성을 띠는 배양용기에 접착시켜 배양하여 3차원 세포집합체를 형성하는 단계; 및
    상기 형성된 3차원 세포집합체를 적어도 12시간 이상 추가적으로 배양하여 상기 3차원 세포집합체에서 섬유증의 병리학적 특징을 형성하는 단계로서, 상기 병리학적 특징은 상기 3차원 세포집합체 또는 상기 3차원 세포집합체 내의 세포에서,
    정상 세포 대비 증가된 결합 조직의 형성;
    콜라겐의 침착;
    TGF(Transforming growth factor)-베타, 및 SMA(Smooth muscle actin)의 발현, 분비, 또는 합성의 증가; 및
    정상 세포 대비 증가된 세포의 사멸인 것인 단계를 포함하는 인 비트로(In vitro) 섬유증 모델을 제조하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 3차원 세포집합체를 형성하는 단계는 상기 접착된 간엽세포의 밀도가 증가함에 따라 간엽세포가 배양용기로부터 탈착되어 3차원 세포집합체를 형성하는 것인 방법.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 배양용기의 표면은 실란화된 표면(silanized surface), 탄화수소 코팅된 표면(hydrocarbon coated surface), 고분자 표면 및 금속 표면으로 구성된 군으로부터 선택되는 소수성 표면인 것인 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 간엽세포가 소수성 표면과의 세포-기질간 상호작용에 의해 배양용기에 접착되거나, 배양용기 표면에 고정된 간엽세포에 접착활성을 갖는 성장인자와의 상호작용에 의해 배양용기에 접착되는 것인 방법.
  12. 청구항 11에 있어서, 상기 성장인자는 폴리펩티드 링커를 이용하여 폴리펩티드 링커의 카르복실 말단에 성장인자의 아미노 말단이 융합되어 있는 폴리펩티드 링커-성장인자 재조합 단백질 형태로 배양용기 표면에 고정되는 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 폴리펩티드 링커는 말토오스 결합 단백질(maltose-binding protein, MBP), 하이드로포빈(hydrophobin) 및 소수성 세포 투과성 펩티드(hydrophobic cell penetrating peptides, CPPs)로 구성된 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  14. 청구항 1의 인 비트로 섬유증 모델에 피검 물질을 처리하는 단계; 및
    상기 인 비트로 섬유증 모델의 세포집합체 또는 상기 세포집합체 내의 세포에서 무처리 대조군과 비교하여 섬유증의 병리학적 특징의 개선 또는 치료를 나타내는 피검물질을 섬유증 치료를 위한 후보 물질로 선별하는 단계를 포함하는 섬유증 치료제를 스크리닝하는 방법.
  15. 청구항 14에 있어서, 상기 섬유증의 병리학적 특징은 상기 세포집합체 또는 상기 세포집합체 내의 세포에서,
    정상 세포 대비 증가된 결합 조직의 형성;
    콜라겐의 침착;
    TGF(Transforming growth factor)-베타, Smad, 라미닌, 및 SMA(Smooth muscle actin)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 섬유증 관련 분자의 발현, 분비, 또는 합성의 증가; 및
    정상 세포 대비 증가된 세포의 사멸로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 또는 그들의 조합인 것인 방법.
KR1020150089090A 2015-06-23 2015-06-23 인 비트로 섬유증 모델, 그의 제조방법 및 용도 KR101751513B1 (ko)

Priority Applications (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150089090A KR101751513B1 (ko) 2015-06-23 2015-06-23 인 비트로 섬유증 모델, 그의 제조방법 및 용도
EP16814592.8A EP3315602A4 (en) 2015-06-23 2016-05-25 In vitro fibrosis model, preparing method therefor, and use thereof
CN201680003618.0A CN107002034A (zh) 2015-06-23 2016-05-25 体外纤维化模型、该模型的制造方法以及用途
US15/551,595 US20180112183A1 (en) 2015-06-23 2016-05-25 In vitro fibrosis model, preparing method therefor, and use thereof
JP2017567167A JP6902788B2 (ja) 2015-06-23 2016-05-25 インビトロ線維症モデル、その製造方法及び該用途
PCT/KR2016/005501 WO2016208879A1 (ko) 2015-06-23 2016-05-25 인 비트로 섬유증 모델, 그의 제조방법 및 용도
US16/678,014 US11365396B2 (en) 2015-06-23 2019-11-08 In vitro fibrosis model, preparing method therefor, and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020150089090A KR101751513B1 (ko) 2015-06-23 2015-06-23 인 비트로 섬유증 모델, 그의 제조방법 및 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170000189A KR20170000189A (ko) 2017-01-02
KR101751513B1 true KR101751513B1 (ko) 2017-06-27

Family

ID=57586437

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020150089090A KR101751513B1 (ko) 2015-06-23 2015-06-23 인 비트로 섬유증 모델, 그의 제조방법 및 용도

Country Status (6)

Country Link
US (2) US20180112183A1 (ko)
EP (1) EP3315602A4 (ko)
JP (1) JP6902788B2 (ko)
KR (1) KR101751513B1 (ko)
CN (1) CN107002034A (ko)
WO (1) WO2016208879A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020139041A1 (ko) * 2018-12-28 2020-07-02 주식회사 씨아이에스티이엠 전신경화증 질환 모델 및 이의 용도

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109337860B (zh) * 2018-10-29 2019-11-12 妙顺（上海）生物科技有限公司 一种体外肝纤维化3d模型构建方法
US10949706B2 (en) * 2019-01-16 2021-03-16 Microsoft Technology Licensing, Llc Finding complementary digital images using a conditional generative adversarial network
CN112508854B (zh) * 2020-11-13 2022-03-22 杭州医派智能科技有限公司 一种基于unet的肾小管检测分割方法

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101109125B1 (ko) * 2009-03-24 2012-02-15 한국과학기술연구원 줄기세포를 혈관세포로 분화시키는 방법 및 이를 이용한 생체 내 혈관신생 유도

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI2254586T1 (sl) * 2008-02-22 2015-07-31 Agency For Science, Technology And Research (A*Star) Delci mezenhimske matične celice
US20150284689A1 (en) * 2012-10-26 2015-10-08 The Regents Of The University Of California Strategy for engineering various 3d tissues, organoids and vasculature

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101109125B1 (ko) * 2009-03-24 2012-02-15 한국과학기술연구원 줄기세포를 혈관세포로 분화시키는 방법 및 이를 이용한 생체 내 혈관신생 유도

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2020139041A1 (ko) * 2018-12-28 2020-07-02 주식회사 씨아이에스티이엠 전신경화증 질환 모델 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016208879A1 (ko) 2016-12-29
US20180112183A1 (en) 2018-04-26
CN107002034A (zh) 2017-08-01
JP6902788B2 (ja) 2021-07-14
EP3315602A4 (en) 2018-11-21
KR20170000189A (ko) 2017-01-02
EP3315602A1 (en) 2018-05-02
US11365396B2 (en) 2022-06-21
US20200071674A1 (en) 2020-03-05
JP2018523995A (ja) 2018-08-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US10039860B2 (en) 3-dimensional cardiac fibroblast derived extracellular matrix
US11365396B2 (en) In vitro fibrosis model, preparing method therefor, and use thereof
Rashedi et al. Collagen scaffold enhances the regenerative properties of mesenchymal stromal cells
Gustafsson et al. Viability and proliferation of rat MSCs on adhesion protein-modified PET and PU scaffolds
US9644183B2 (en) Method for differentiation of stem cells into vascular cells and the induction of angiogenesis using the same
US20120027807A1 (en) Tissue engineered myocardium and methods of production and uses thereof
WO2013151755A1 (en) Systems and method for engineering muscle tissue
KR101575226B1 (ko) 폴리도파민이 결합된 생리활성 펩타이드로 고정화된 고분자 지지체 및 이의 제조방법
EP2007875A2 (en) Dermis-derived cells for tissue engineering applications
JP2016520068A (ja) 創傷治癒および組織工学
KR101815370B1 (ko) 세포 표면 고분자층 적층 기술 개발
Chang et al. Time course of cell sheet adhesion to porcine heart tissue after transplantation
Wu et al. Isolation and myogenic differentiation of mesenchymal stem cells for urologic tissue engineering
US20170182221A1 (en) Methods Of Producing Tissue-Mimetic Constructs And Uses Thereof
Hoshiba et al. Fabrication of cell-derived decellularized matrices on three-dimensional (3D)-printed biodegradable polymer scaffolds
Gökçinar-Yagci et al. Generation of human umbilical cord vein CD146+ perivascular cell origined three-dimensional vascular construct
WO2010110596A2 (en) Method for differentiation of stem cells into vascular cells and the induction of angiogenesis using the same
JP2016022079A (ja) 膵液瘻の予防及び治療
US20170049823A1 (en) Pharmaceutical composition including three-dimensional cell cluster and angiopoietin for preventing and treating ischemic disease
KR101838728B1 (ko) 나노패턴을 이용한 줄기세포의 심근세포로의 분화방법
CN116322719A (zh) 甲状旁腺细胞
US20170335288A1 (en) Method of classifying mesenchymal stem cells by controlling cell adhesion, and protein-coated culture container therefor

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant