JP2016022079A - 膵液瘻の予防及び治療 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】マンノースによって活性が高められた脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する、膵液瘻治療用細胞シートが提供される。
【選択図】なし
Description
[1]マンノースによって活性が高められた脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する、膵液瘻治療用細胞シート。
[2]脂肪組織由来間葉系幹細胞シートをマンノースで処理することによって得られたものである、[1]に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
[3]前記処理が、マンノースを含有する溶液への前記脂肪組織由来間葉系幹細胞シートの浸漬である、[2]に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
[4]前記処理が、前記脂肪組織由来間葉系幹細胞シートに対する、マンノースを含有する溶液の塗布である、[2]に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
[5]前記脂肪組織由来間葉系幹細胞シートが、以下のステップ(1)〜(4)によって作製される、[2]〜[4]のいずれか一項に記載の膵液瘻治療用細胞シート:
(1)磁気ラベルした脂肪組織由来間葉系幹細胞を用意するステップ;
(2)I型コラーゲン、ラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンを有効成分として含むゲル材料と前記脂肪組織由来間葉系幹細胞との混合物を培養容器に播種するステップ;
(3)磁力を作用させることによって、前記混合物中の前記脂肪組織由来間葉系幹細胞を前記培養容器の培養面に引き寄せ、多層の細胞層を形成させるステップ;
(4)前記ゲル材料をゲル化させるステップ。
[6]ステップ(2)における前記混合物が、I型コラーゲンを有効成分とした第1ゲル要素と、ラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンを有効成分とした第2ゲル要素と、前記脂肪組織由来間葉系幹細胞とを混合することによって得られる、[5]に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
[7]ステップ(2)における前記培養容器の培養面上には、着脱可能な仕切りによる、上方が開放された区画が形成されており、該区画内に前記混合物が播種される、[5]又は[6]に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
[8]ステップ(3)と(4)の間に以下のステップ(3')を行う、[5]〜[7]のいずれか一項に記載の膵液瘻治療用細胞シート:
(3')前記細胞層の上方に存在する余分なゲル材料を除去するステップ。
[9]マンノースを含有している、[1]に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
[10]マンノースで処理された脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する、[1]に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
[11]脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有し、その使用時に、マンノース含有組成物がシート面に貼付又は塗布される、膵液瘻治療用細胞シート。
[12]前記マンノースが低濃度である、[1]〜[11]のいずれか一項に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
[13]低濃度が、0.8%(w/v)以下の濃度である、[12]に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
[14]低濃度が、0.2%(w/v)〜0.8(w/v)である、[12]に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
ASCsは、脂肪基質からの幹細胞の分離、洗浄、濃縮、培養等の工程を経て調製される。ASCsの調製法は特に限定されない。例えば公知の方法(Fraser JK et al. (2006), Fat tissue: an underappreciated source of stem cells for biotechnology. Trends in Biotechnology; Apr;24(4):150-4. Epub 2006 Feb 20. Review.; Zuk PA et al. (2002), Human adipose tissue is a source of multipotent stem cells. Molecular Biology of the Cell; Dec;13(12):4279-95.; Zuk PA et al. (2001), Multilineage cells from human adipose tissue: implications for cell-based therapies. Tissue Engineering; Apr;7(2):211-28.等が参考になる)に従ってASCsを調製することができる。また、脂肪組織からASCsを調製するための装置(例えば、Celution(登録商標)装置(サイトリ・セラピューティクス社、米国、サンディエゴ))も市販されており、当該装置を利用してASCsを調製することにしてもよい。当該装置を利用すると、脂肪組織より、細胞表面マーカーCD29及びCD44陽性の細胞を分離できる。以下、ASCsの調製法の具体例を示す。
脂肪組織は動物から切除、吸引などの手段で採取される。ここでの用語「動物」はヒト、及びヒト以外の哺乳動物(ペット動物、家畜、実験動物を含む。具体的には例えばマウス、ラット、モルモット、ハムスター、サル、ウシ、ブタ、ヤギ、ヒツジ、イヌ、ネコ等)を含む。免疫拒絶の問題を回避するため、本発明の細胞シートを適用する対象(患者)と同一の個体から脂肪組織(自己脂肪組織)を採取することが好ましい。但し、同一の個体からの採取が困難な場合や好ましくない場合(例えば、採取の際の過度の侵襲が想定される場合など)には、同種の個体(他家)から脂肪組織を採取するとよい。尚、異種動物の脂肪組織の使用を妨げるものではない。
細胞集団は続いて遠心処理に供される。遠心処理による沈渣を沈降細胞集団(本明細書では「SVF画分」ともいう)として回収する。遠心処理の条件は、細胞の種類や量によって異なるが、例えば1〜10分間、800〜1500rpmである。尚、遠心処理に先立ち、酵素処理後の細胞集団をろ過等に供し、その中に含まれる酵素未消化組織等を除去しておくことが好ましい。
SVF画分にはASCsの他、他の細胞成分(内皮細胞、間質細胞、血球系細胞、これらの前駆細胞等)が含まれる。そこで本発明の一態様では以下の選択培養を行い、SVF画分から不要な細胞成分を除去する。そして、その結果得られた細胞を本発明の細胞シートに用いる。
本発明の一態様では、上記(3)の操作の代わりに又は上記(3)の操作の後に以下の低血清培養を行う。その結果得られた細胞をASCsとして本発明の細胞シートに用いることもできる。
(1)磁気ラベルした脂肪組織由来間葉系幹細胞を用意するステップ;
(2)I型コラーゲン、ラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンを有効成分として含むゲル材料と前記脂肪組織由来間葉系幹細胞との混合物を培養容器に播種するステップ;
(3)磁力を作用させることによって、前記混合物中の前記脂肪組織由来間葉系幹細胞を前記培養容器の培養面に引き寄せ、多層の細胞層を形成させるステップ;
(4)前記ゲル材料をゲル化させるステップ。
ステップ(1)では、磁気ラベルした脂肪組織由来間葉系幹細胞(ASCs)を用意する。「磁気ラベル」とは「磁性化」と同義であり、細胞に磁性粒子を導入したり、付着したりすること等によって、細胞を磁力で操作可能な状態にすることをいう。細胞の磁気ラベルは、好ましくは磁性粒子の導入又は付着によって行う。磁性粒子は、細胞が保持可能であり且つ細胞が保持した際に細胞に磁性を付加するものであればどのようなものでもよい。例えば、フェライトやマグネタイトなどの酸化鉄、酸化クロム、コバルトなどの磁性材料の粒子を磁性粒子として用いることができる。二種類以上の磁性粒子を組み合わせて用いてもよい。磁性粒子の粒径は特に限定しないが、例えば粒径が5nm〜100μmの磁性粒子を用いることができる。後述するリポソーム封入型の磁性粒子の場合は特に粒径が5nm〜25nmの磁性粒子を用いることが好ましい。この範囲の粒径の磁性粒子を用いることにより、リポソームの分散安定性を高めることができる。
ステップ(1)に続くステップ(2)では、ゲル材料とASCsとの混合物を培養容器に播種する。ゲル材料として、間質の主成分であるI型コラーゲンと、基底膜を構成する成分であるラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンを用いることができる。ゲル材料を構成する各有効成分(I型コラーゲン、ラミニン、IV型コラーゲン、エンタクチン)の由来としてはウマ、ウシ、ブタ、ヒツジ、サル、チンパンジー、及びヒトを例示できる。また、遺伝子組換え技術で調製した(リコンビナント)ものを使用してもよい。
ゲル材料とASCsとの混合物を培養容器に播種した後、例えば、培養面の後方(即ち培養面の裏面側)から磁力を作用させ、混合物中のASCsを培養面に引き寄せる。具体的には例えば、培養面の後方に磁石を配置して当該操作を行う。培養容器として培養皿を使用する場合、典型的には、磁石の上に培養皿を設置することになる。培養皿の場合は通常、内底面が培養面となるが、容器の種類や形態の如何によっては容器の内底面以外の内壁面が培養面に設定される場合がある。
次に、ゲル材料をゲル化させる。典型的には、培養容器ごと、ゲル化に必要な温度(例えば37℃)でインキュベートする。ゲル化に必要な時間はゲル材料の組成や実施スケール等によって変動し得るが、例えば30分〜1時間である。
以下の(1)〜(5)によってASCsシートを作製した。
マイクロチューブにマウスASCs(コラゲナーゼ処理(1〜3%コラゲナーゼ、37℃、60〜90分)および遠心処理(1200rpm、5分間)で調製)を懸濁させて浮遊状態にし、磁性ナノ微粒子(MCL)を添加した。37℃で2時間インキュベートし、MCLを細胞に取り込ませた。
I型コラーゲン(3mg/ml)、10xMEM、緩衝液(NaHCO3)及びFBSを7:1:1:1の比率(重量比)で混合し、コラーゲンゲル(1ml中にI型コラーゲンを2.1mg含有する)とした。一方、ラミニン(560mg/ml)、IV型コラーゲン(310mg/ml)及びエンタクチン(80mg/ml)を含む基底膜ゲルを用意した。尚、以下の実験では基底膜ゲルとしてBDマトリゲル(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)(組成比率はラミニン56%、IV型コラーゲン31%、エンタクチン8%であり、bFGFを0〜0.1 pg/ml、EGFを0.5〜1.3 ng/ml、IGF-1を15.6 ng/ml、PDGFを12 pg/ml、NGFを0.2 ng/ml未満、TGF-βを2.3 ng/ml含有する)を使用した。
磁気ラベルした細胞(細胞数1.7x106(100μl))、コラーゲンゲル(170μl)及び基底膜ゲル(30μl)を混和し、低接着性ディッシュ(Ultra Low Attachment Culture Dish:コーニング社)に播種した。
ディッシュの底面に磁石を配置して磁力を印加し、細胞を培養面に引き寄せた。細胞層が形成された段階で余分な上澄み液を除いた。
37℃で1時間インキュベートし、ゲルを固める。その後、培地を添加した。
(1)方法
(1−1)使用動物
7〜8週齢Wistar/STラット:体重は255g〜314g(試験開始の少なくとも4日前に日本SLC社より購入した)
飼育環境:12時間ごとに明暗が切り替わり、室内温度23±2℃、湿度55±10%を維持
飼料:日本クレア社のCE-2
絶飲食は行わず、摂食、飲水は自由とした。
体位:ラットを仰臥位とし約20×30cmのコルク板にガムテープなどを用いて四肢を固定した。
麻酔方法:マスクを用いた吸入麻酔にて、イソフルレン(商品名:エスカイン、ファイザー株式会社)を流量1L/分で、麻酔導入時に濃度5%、維持麻酔は濃度1.5〜2.0%にて行う。呼吸状態、覚醒状態に応じて麻酔の濃度を変更して行う。
手術:ラット腹部には体毛を認めるが剃毛は行わず、消毒用アルコールにて腹部の表皮の消毒を行う。皮切は腹部正中切開にて行う。消毒後、腹部正中の表皮に剣状突起から尾側にメスを用いて約3.5cmの切開を加えた。表皮の切開による出血は圧迫止血を行う。表皮を切開したのち腹直筋の白線、腹膜を切開し腹腔内に到達する。開創器をかけ胃を牽引し、大網及び脾臓を確認する。大網および脾臓を体外へ引出し、胃大網動静脈を温存するように、胃大網動静脈の尾側に沿って大網を切開する。これだけでは脾臓が短胃動静脈に固定されたままであり、このあとの膵臓の切離や細胞シートの貼付が行いにくいので、短胃動静脈も切離し脾臓および膵臓の可動性を良好にする。切離した血管より出血を認める場合もあるが、これらは圧迫による止血が可能であった。ラットの膵臓は大網と連続しており明確な境界がないため、脾動静脈を基準としてこの動静脈の約0.5mm手前まで膵臓に切れ込みをいれる。その後膵断端をセッシで挫滅を行う。これはヒトの膵臓においても膵断端を強く把持すると術後の膵液瘻の発生が上昇するため、膵液瘻の発生をより起こりやすくするために行う。次に、外に引っ張り出しておいた大網および脾臓などの臓器を一旦腹腔内の所定の位置に戻す。続いて、開創器を外し、生食20ml(大塚生食注(登録商標)、大塚製薬株式会社)を湿らせたキムワイプ(登録商標)(日本製紙クレシア株式会社)で開腹部を覆い、腹腔内の乾燥を防止しながら30分放置する。30分後再び胃を牽引し膵断端を直視下に確認し、止血が完全であることを確認した上で各種シート(ASCsシート、マンノース処理ASCsシート)を貼付した。また、コントロール群ではシートは貼付しなかった。そのまま1分ほどシートが定着するのを待ってシートがずれないように胃をもとの位置に戻す。腹膜、腹直筋及び表皮を1-0ナイロン(株式会社ベアーメディック)で連続縫合する。ラットは手術終了後速やかにケージに戻し手術終了とする。
第2病日に腹部正中創の抜糸をクーパーにて行い再開腹する。開腹時に腹水の有無、腹腔内の鹸化の程度を確認する。その後、5mLのシリンジで腹水をできるだけ回収し生化学スピッツに移し替える。腹水は全量でおよそ0.2mL〜0.5mLほどであり、この量ではアミラーゼの測定は困難であるため、5mLのシリンジで生食2mlを吸引し、先ほど腹水を入れた生化学スピッツに追加で加える。次に腸管を体外へ出し大動脈を確認し左右総腸骨動脈の分岐部より10mLシリンジに22G針を用いて採血を行う。この後、手術にて膵切離した部位で脾動静脈を切離し膵臓と脾臓を摘出する。膵臓と脾臓は7.4%ホルマリン(マスクドホルム2A(登録商標)、日本ターナー株式会社)内にいれ固定する。
(血液、腹水)
回収後、可及的速やかに遠心分離機(KUBOTA5920(登録商標)、久保田商事株式会社)で2500回転10分間の遠心を行い血液は血漿と血球成分に、腹水は液体成分と細胞成分に分離する。分離後上澄みを5mL サンプルチューブ(ワトソン株式会社)に回収し、使用直前まで-80℃で保管する。この検体をアミラーゼ及びリパーゼの検出に供した。
(臓器)
摘出後、可及的速やかに7.4%ホルマリンで固定後、パラフィン包埋し薄切切片を作製する。H.E.染色を行い、プレパラートを作製する。
第2病日に再開腹したときの各群の腹腔内の状態を図2に示す。未治療群(左)及びASCsシート群(中央)では膵液瘻による白色に変性した著明な鹸化を認めた。対照的に、マンノース処理ASCsシート群(右)では鹸化の範囲は縮小した。
マンノース処理ASCsシートはラット膵液瘻モデルにおいて優れた治療効果を発揮した。マンノースで活性化されたASCsを含有した細胞シートは、膵液瘻に対する新たな治療手段として極めて有望といえる。
Claims (14)
- マンノースによって活性が高められた脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する、膵液瘻治療用細胞シート。
- 脂肪組織由来間葉系幹細胞シートをマンノースで処理することによって得られたものである、請求項1に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
- 前記処理が、マンノースを含有する溶液への前記脂肪組織由来間葉系幹細胞シートの浸漬である、請求項2に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
- 前記処理が、前記脂肪組織由来間葉系幹細胞シートに対する、マンノースを含有する溶液の塗布である、請求項2に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
- 前記脂肪組織由来間葉系幹細胞シートが、以下のステップ(1)〜(4)によって作製される、請求項2〜4のいずれか一項に記載の膵液瘻治療用細胞シート:
(1)磁気ラベルした脂肪組織由来間葉系幹細胞を用意するステップ;
(2)I型コラーゲン、ラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンを有効成分として含むゲル材料と前記脂肪組織由来間葉系幹細胞との混合物を培養容器に播種するステップ;
(3)磁力を作用させることによって、前記混合物中の前記脂肪組織由来間葉系幹細胞を前記培養容器の培養面に引き寄せ、多層の細胞層を形成させるステップ;
(4)前記ゲル材料をゲル化させるステップ。 - ステップ(2)における前記混合物が、I型コラーゲンを有効成分とした第1ゲル要素と、ラミニン、IV型コラーゲン及びエンタクチンを有効成分とした第2ゲル要素と、前記脂肪組織由来間葉系幹細胞とを混合することによって得られる、請求項5に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
- ステップ(2)における前記培養容器の培養面上には、着脱可能な仕切りによる、上方が開放された区画が形成されており、該区画内に前記混合物が播種される、請求項5又は6に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
- ステップ(3)と(4)の間に以下のステップ(3')を行う、請求項5〜7のいずれか一項に記載の膵液瘻治療用細胞シート:
(3')前記細胞層の上方に存在する余分なゲル材料を除去するステップ。 - マンノースを含有している、請求項1に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
- マンノースで処理された脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有する、請求項1に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
- 脂肪組織由来間葉系幹細胞を含有し、その使用時に、マンノース含有組成物がシート面に貼付又は塗布される、膵液瘻治療用細胞シート。
- 前記マンノースが低濃度である、請求項1〜11のいずれか一項に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
- 低濃度が、0.8%(w/v)以下の濃度である、請求項12に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
- 低濃度が、0.2%(w/v)〜0.8(w/v)である、請求項12に記載の膵液瘻治療用細胞シート。
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