JP2011513217A - 間葉系幹細胞粒子 - Google Patents
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Abstract
Description
間葉系幹細胞(MSC)から誘導し得る粒子を説明する。
間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)などの馴化細胞培養培地は、間葉系幹細胞(MSC)、その子孫またはそれに由来する細胞株を細胞培養培地で培養することによって入手し得る。間葉系幹細胞は、胚幹(ES)細胞コロニーを分散させることによって細胞を得ることを含む工程によって生産し得る。細胞またはその子孫を、FGF2を含む無血清培地において共培養物なしで増殖させ得る。
粒子は多くの方法で生成または単離し得る。そのような方法は、間葉系幹細胞(MSC)から粒子を単離することを含み得る。そのような方法は、間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)から粒子を単離することを含み得る。
間葉系幹細胞の性質は、間葉系幹細胞によって馴化された培地(MSC−CM)の性質を含み得る。そのような間葉系幹細胞馴化培地を生成する方法は、本明細書の別の部分で述べられていて、たとえば以下の実施例1で説明される。
粒子は、心保護作用を含む、間葉系幹細胞および/または間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)の性質を有し得る。心保護作用は、虚血および/または再灌流の間の心機能の修復または維持を含み得る。
心保護作用は、たとえば実施例5、10、14および20で述べる方法の1つまたはそれ以上を使用して検定し得る。
粒子は、酸化ストレスを低減する能力(または細胞保護作用)を含む、間葉系幹細胞および/または間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)の性質を有し得る。
酸化ストレスの低減は、たとえば過酸化水素(H2O2)誘導性細胞死のインビトロアッセイを使用して検定し得る。要約すると、過酸化水素(H2O2)媒介性酸化ストレスをヒト白血病CEM細胞において誘導し、細胞の生存能をトリパンブルー排除法によって観測する。ヒト白血病CEM細胞を粒子、馴化培地または間葉系幹細胞と共に(対照として食塩水と共に)インキュベートし、50μMのH2O2で処理して、酸化ストレスを誘導する。H2O2処理の12、24、36および48時間後にトリパンブルー排除法を使用して細胞生存能を評価する。
粒子は、梗塞の大きさを縮小する能力を含む、間葉系幹細胞および/または間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)の性質を有し得る。
梗塞の大きさは、たとえば実施例6および13で述べる方法の1つまたはそれ以上を使用して検定し得る。
粒子は100kDa超の分子量を有し得る。粒子は500kDa超の分子量を有し得る。たとえば、粒子は1000kDa超の分子量を有し得る。
粒子は100kDa超の分子量を有し得る。たとえば、粒子は、ろ過に供した場合、100kDa未満の分子量を有する粒子の大部分のタンパク質が100kDa超の分子量の保持液画分中に分離されるような粒子であり得る。同様に、500kDaのカットオフ値を有する膜でのろ過に供した場合、500kDa未満の分子量を有する粒子の大部分のタンパク質は、500kDa超の分子量の保持液画分中に分離され得る。これは、粒子が500kDa超の分子量を有し得ることを指示する。
粒子は1000kDa以上の分子量を有し得る。たとえば、粒子は、1000kDaのカットオフ値を有する膜でのろ過に供した場合、関連する生物活性が実質的にまたは主として保持液画分中に残存するような粒子であり得る。あるいはまたは加えて、生物活性がろ液画分中に存在しなくてもよい。生物活性は、本明細書の別の部分で述べる粒子の生物活性のいずれかを含み得る。
たとえば、生物活性は、心筋虚血および再灌流障害の任意の適切なモデルにおいて検定される、梗塞の大きさの縮小を含み得る。たとえば、生物活性は、実施例で述べるようなマウスまたはブタモデルにおいて検定し得る。
粒子は2nm超の大きさを有し得る。粒子は、5nm、10nm、20nm、30nm、40nmまたは50nm超の大きさを有し得る。粒子は、100nm超、たとえば150nm超の大きさを有し得る。粒子は、実質的に200nmまたはそれ以上の大きさを有し得る。
粒子は、間葉系幹細胞によって分泌される1つまたはそれ以上のタンパク質を含有し得る。粒子は、間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)中に存在する1つまたはそれ以上のタンパク質を含有し得る。
タンパク質は、以下の表D1に示すものから選択され得る。表D1は、1〜250の番号を付した以下のタンパク質、ならびに以下の段落中の「機能未同定のタンパク質」を含む:
1.IPI00021428 α骨格筋アクチン;2.IPI00414057 α1骨格筋アクチンタンパク質;3.IPI00008603 大動脈平滑筋アクチン;4.IPI00021439 細胞質アクチン1;5.IPI00023006 α心臓アクチン;6.IPI00021440 細胞質アクチン2;7.IPI00025416 γ腸平滑筋アクチン;8.IPI00479925 アグリン;9.IPI00015102 CD166抗原前駆体;10.IPI00007423 酸性ロイシンリッチ核ホスホプロテイン32ファミリー成員B;11.IPI00413331 36kDaタンパク質;12.IPI00412577 34kDaタンパク質;13.IPI00413506 33kDaタンパク質;14.IPI00418169 仮説タンパク質DKFZp686P03159;15.IPI00003815 Rho GDP解離阻害因子1;16.IPI00004656 β2−マイクログロブリン前駆体;17.IPI00218042 骨形成タンパク質1前駆体のスプライスアイソフォームBMP1−5;18.IPI00009054 骨形成タンパク質1前駆体のスプライスアイソフォームBMP1−3;19.IPI00014021 骨形成タンパク質1前駆体のスプライスアイソフォームBMP1−1;20.IPI00218040 骨形成タンパク質1前駆体のスプライスアイソフォームBMP1−4;21.IPI00006980 タンパク質C14orf166;22.IPI00296165 補体C1rサブコンポーネント前駆体;23.IPI00152540 OTTHUMP00000016748;24.IPI00305064 CD44抗原前駆体のスプライスアイソフォームCD44;25.IPI00297160 仮説タンパク質DKFZp451K1918;26.IPI00293539 カドヘリン−11前駆体のスプライスアイソフォーム2;27.IPI00304227 カドヘリン−11前駆体のスプライスアイソフォーム1;28.IPI00386476 カドヘリン11、2型、アイソフォーム1プレプロタンパク質;29.IPI00024046 カドヘリン−13前駆体;
30.IPI00290085 神経カドヘリン前駆体;31.IPI00029739 補体因子H前駆体のスプライスアイソフォーム1;32.IPI00012011 コフィリン、非筋型アイソフォーム;33.IPI00007257 カルシンテニン1アイソフォーム2;34.IPI00218539 コラーゲンα−1(XI)鎖前駆体のスプライスアイソフォームB;35.IPI00477350 XI型コラーゲンα1;36.IPI00329573 コラーゲンα−1(XII)鎖前駆体のロングスプライスアイソフォーム;37.IPI00221384 コラーゲンα−1(XII)鎖前駆体のショートスプライスアイソフォーム;38.IPI00400935 コラーゲンα−1(XVI)鎖前駆体;39.IPI00297646 コラーゲンα−1(I)鎖前駆体;40.IPI00164755 プレプロα2(I)コラーゲン前駆体;41.IPI00304962 コラーゲンα−2(I)鎖前駆体;42.IPI00021033 コラーゲンα−1(III)鎖前駆体;43.IPI00167087 COL3A1タンパク質;44.IPI00021034 コラーゲンα−1(IV)鎖前駆体;45.IPI00479324 α2、IV型コラーゲンプレプロタンパク質;46.IPI00306322 コラーゲンα−2(IV)鎖前駆体;47.IPI00303313 コラーゲンα−1(V)鎖前駆体;48.IPI00477611 184kDaタンパク質;49.IPI00293881 COL5A2タンパク質;50.IPI00018279 コラーゲンα−3(V)鎖前駆体;51.IPI00291136 コラーゲンα−1(VI)鎖前駆体;52.IPI00304840 コラーゲンα−2(VI)鎖前駆体のスプライスアイソフォーム2C2;53.IPI00220613 コラーゲンα−2(VI)鎖前駆体のスプライスアイソフォーム2C2A;54.IPI00022200 α3、VI型コラーゲンアイソフォーム1前駆体;55.IPI00072918 α3、VI型コラーゲンアイソフォーム4前駆体;56.IPI00220701 コラーゲンα−3(VI)鎖前駆体のスプライスアイソフォーム2;57.IPI00072917 α3、VI型コラーゲンアイソフォーム3前駆体;58.IPI00021828 シスタチンB;59.IPI00007778 ジ−N−アセチルキトビアーゼ前駆体;60.IPI00295741 カテプシンB前駆体;
61.IPI00299219 タンパク質CYR61前駆体;62.IPI00514900 42kDaタンパク質;63.IPI00333770 細胞質分裂のデディケイタータンパク質10(Dedicator of cytokinesis protein 10)に類似;64.IPI00478332 細胞質分裂のデディケイタータンパク質9に類似;65.IPI00000875 伸長因子1γ;66.IPI00465248 α−エノラーゼ;67.IPI00013769 肺特異的α−エノラーゼ;68.IPI00216171 γ−エノラーゼ;69.IPI00218803 フィブリン−1前駆体のスプライスアイソフォームB;70.IPI00296537 フィブリン−1前駆体のスプライスアイソフォームC;71.IPI00328113 フィブリリン−1前駆体;72.IPI00019439 フィブリリン−2前駆体;73.IPI00385645 線維芽細胞増殖因子17前駆体のスプライスアイソフォーム2;74.IPI00216602 線維芽細胞増殖因子受容体2前駆体のスプライスアイソフォーム5;75.IPI00216604 線維芽細胞増殖因子受容体2前駆体のスプライスアイソフォーム8;76.IPI00034099 仮説タンパク質FLJ21918;77.IPI00333541 フィラミンA;78.IPI00302592 フィラミンA、α;79.IPI00339227 仮説タンパク質DKFZp686O1166;80.IPI00414283 フィブロネクチン前駆体(FN)(寒冷不溶性グロブリン)(CIG)、スプライスアイソフォーム3;81.IPI00339225 フィブロネクチン前駆体のスプライスアイソフォーム5;82.IPI00339319 フィブロネクチン前駆体のスプライスアイソフォーム11;83.IPI00556632 フィブロネクチン前駆体のスプライスアイソフォーム12;84.IPI00411462 仮説タンパク質DKFZp686B18150;85.IPI00029723 フォリスタチン関連タンパク質1前駆体;86.IPI00005401 ポリペプチドN−アセチルガラクトサミニルトランスフェラーゼ5;87.IPI00219025 グルタレドキシン1;88.IPI00171411 ゴルジホスホプロテイン2;89.IPI00026314 ゲルゾリン前駆体;
90.IPI00219757 グルタチオンS−トランスフェラーゼP;91.IPI00027569 ヘテロ核リボ核タンパク質C様1;92.IPI00003881 HNRPFタンパク質;93.IPI00442294 ニューロトリミン前駆体のスプライスアイソフォーム1;94.IPI00003865 71kDaの熱ショックコグネイトタンパク質のスプライスアイソフォーム1;95.IPI00037070 71kDaの熱ショックコグネイトタンパク質のスプライスアイソフォーム2;96.IPI00220362 10kDaのミトコンドリア熱ショックタンパク質;97.IPI00024284 基底膜特異的へパラン硫酸プロテオグリカンコアタンパク質前駆体;98.IPI00297284 インスリン様増殖因子結合タンパク質2前駆体;99.IPI00297284 インスリン様増殖因子結合タンパク質2前駆体;100.IPI00029236 インスリン様増殖因子結合タンパク質5前駆体;101.IPI00029236 インスリン様増殖因子結合タンパク質5前駆体;102.IPI00029235 インスリン様増殖因子結合タンパク質6前駆体;103.IPI00029235 インスリン様増殖因子結合タンパク質6前駆体;104.IPI00016915 インスリン様増殖因子結合タンパク質7前駆体;105.IPI00016915 インスリン様増殖因子結合タンパク質7前駆体;106.IPI00328163 K−ALPHA−1タンパク質;107.IPI00021396 血管内皮増殖因子受容体2前駆体;108.IPI00298281 ラミニンγ1鎖前駆体;109.IPI00219219 ガレクチン−1;110.IPI00023673 ガレクチン−3結合タンパク質前駆体;111.IPI00021405 ラミンA/CのスプライスアイソフォームA;112.IPI00216953 ラミンA/CのスプライスアイソフォームAδ10;113.IPI00180173 予測:トロポミオシン4に類似;114.IPI00401614 予測:FKSG30に類似;115.IPI00374397 予測:トロポミオシン4に類似;116.IPI00374732 予測:PPIAタンパク質に類似;117.IPI00402104 予測:ペプチジルプロリルイソメラーゼAアイソフォーム1に類似;シクロフィリンA;ペプチジルプロ;118.IPI00455415 予測:ヘテロ核リボ核タンパク質C様dJ845O24.4に類似;119.IPI00454722 予測:ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質に類似;120.IPI00454852 予測:奇形がん由来増殖因子1に類似;
121.IPI00002802 タンパク質−リシン6−オキシダーゼ前駆体;122.IPI00410152 潜伏トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質1アイソフォームLTBP−1L;123.IPI00220249 潜伏トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質、アイソフォーム1L前駆体;124.IPI00220249 潜伏トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質、アイソフォーム1L前駆体;125.IPI00410152 潜伏トランスフォーミング増殖因子β結合タンパク質1アイソフォームLTBP−1L;126.IPI00020986 ルミカン前駆体;127.IPI00291006 ミトコンドリアリンゴ酸デヒドロゲナーゼ前駆体;128.IPI00005707 マクロファージマンノース受容体2前駆体;129.IPI00020501 ミオシン11;130.IPI00019502 ミオシン9;131.IPI00604620 ヌクレオリン;132.IPI00220740 ヌクレオフォスミンのスプライスアイソフォーム2;133.IPI00219446 ホスファチジルエタノールアミン結合タンパク質;134.IPI00299738 プロコラーゲンC−エンドペプチダーゼエンハンサー1前駆体;135.IPI00015902 β血小板由来増殖因子受容体前駆体;136.IPI00216691 プロフィリン1;137.IPI00169383 ホスホグリセリン酸キナーゼ1;138.IPI00219568 精巣特異的ホスホグリセリン酸キナーゼ;139.IPI00296180 ウロキナーゼ型プラスミノーゲン活性化因子前駆体;140.IPI00215943 プレクチン1のスプライスアイソフォーム3;141.IPI00215942 プレクチン1のスプライスアイソフォーム2;142.IPI00014898 プレクチン1のスプライスアイソフォーム1;143.IPI00398777 プレクチン1アイソフォーム8;144.IPI00398776 プレクチン1アイソフォーム7;145.IPI00186711 プレクチン1アイソフォーム6;146.IPI00420096 プレクチン1アイソフォーム3;147.IPI00398779 プレクチン1アイソフォーム11;148.IPI00398778 プレクチン1アイソフォーム10;149.IPI00398002 プレクチン1アイソフォーム1;150.IPI00419585 ペプチジル−プロリルシス−トランスイソメラーゼA;
151.IPI00472718 ペプチジルプロリルイソメラーゼAアイソフォーム2;152.IPI00000874 ペルオキシレドキシン1;153.IPI00024915 ミトコンドリアペルオキシレドキシン5前駆体;154.IPI00375306 ペルオキシレドキシン5前駆体、アイソフォームb;155.IPI00012503 プロアクチベーターポリペプチド前駆体のスプライスアイソフォームSap−mu−0;156.IPI00374179 プロテアソーム活性化因子サブユニット1アイソフォーム2;157.IPI00030154 プロテアソーム活性化因子複合体サブユニット1;158.IPI00168812 PTK7プロテインチロシンキナーゼ7アイソフォームd前駆体;159.IPI00419941 PTK7プロテインチロシンキナーゼ7アイソフォームa前駆体;160.IPI00003590 クイエシンQ6、アイソフォームa;161.IPI00015916 骨由来増殖因子(フラグメント);162.IPI00015916 骨由来増殖因子;163.IPI00298289 レチクロン4のスプライスアイソフォーム2;164.IPI00021766 レチクロン4のスプライスアイソフォーム1;165.IPI00013895 カルギザリン;166.IPI00010402 仮説タンパク質;167.IPI00218733 スーパーオキシドジスムターゼ;168.IPI00014572 SPARC前駆体;169.IPI00005614 脳スペクトリンβ鎖1のロングスプライスアイソフォーム;170 IPI00008780 スタニオカルシン2前駆体;171.IPI00301288 SEL−OBタンパク質;172.IPI00216138 トランスゲリン;173.IPI00018219 トランスフォーミング増殖因子β誘導性タンパク質ig−h3前駆体;174.IPI00304865 トランスフォーミング増殖因子β受容体III;175.IPI00296099 トロンボスポンジン1前駆体;176.IPI00032292 メタロプロテイナーゼ阻害因子1前駆体;177.IPI00027166 メタロプロテイナーゼ阻害因子2前駆体;178.IPI00220828 チモシンβ4;179.IPI00180240 チモシン様3;
180.IPI00299633 OTTHUMP00000031270(フラグメント);181.IPI00465028 トリオースリン酸イソメラーゼ1変異体(フラグメント);182.IPI00451401 トリオースリン酸イソメラーゼスプライスアイソフォーム2;183.IPI00010779 トロポミオシン4;184.IPI00216975 トロポミオシンα4鎖のスプライスアイソフォーム2;185.IPI00180675 チューブリンα3鎖;186.IPI00218343 チューブリンα6鎖;187.IPI00216298 チオレドキシン;188.IPI00472175 CDNA FLJ46672 fis、クローンTRACH3009008、チオレドキシンレダクターゼに極めて類似;189.IPI00450472 ユビキチン結合酵素E2I;190.IPI00018352 ユビキチンカルボキシル末端加水分解酵素イソ酵素L1;191.IPI00010207 ユビキチン折りたたみ修飾因子1前駆体;192.IPI00260630 URB;193.IPI00021263 14−3−3タンパク質ζ/δ;194.IPI00642991 仮説タンパク質DKFZp686F10164;195.IPI00470919 仮説タンパク質DKFZp686K08164;196.IPI00719088 VI型コラーゲンα1前駆体;197.IPI00654685 SPARC 前駆体に類似;198.IPI00641961 XII型コラーゲンα1;199.IPI00645849 細胞外マトリックスタンパク質1;200.IPI00554786 チオレドキシンレダクターゼ1;201.IPI00645018 ウロキナーゼプラスミノーゲン活性化因子;202.IPI00552339 メタロプロテイナーゼ1の組織阻害因子;203.IPI00642997 細胞質アクチン2;204.IPI00719778 アネキシンA2に類似;205.IPI00647915 トランスゲリン2;206.IPI00552815 V型コラーゲンα1;207.IPI00552981 CDNA PSEC0266 fis、クローンNT2RP3003649、ホモサピエンスフィブリン1D mRNAに極めて類似;208.IPI00180776 29kDaタンパク質;209.IPI00552416 フィラミンA、α;
210.IPI00640698 γ−腸平滑筋アクチン;211.IPI00514530 α1骨格筋アクチン;212.IPI00556442 インスリン様増殖因子結合タンパク質2変異体(フラグメント);213.IPI00513782 ゲルゾリン;214.IPI00478731 29kDaタンパク質;215.IPI00396479 24kDaタンパク質;216.IPI00334627 39kDaタンパク質;217.IPI00555762 PTK7プロテインチロシンキナーゼ7アイソフォーム変異体(フラグメント);218.IPI00658202 97kDaタンパク質;219.IPI00006273 CYR61タンパク質;220.IPI00719405 TMSL6タンパク質;221.IPI00658096 チモシンβ4;222.IPI00376163 5kDaタンパク質;223.IPI00556217 フィブリリン1変異体(フラグメント);224.IPI00514817 ラミンA/Cに類似;225.IPI00644087 プロゲリン;226.IPI00655812 横紋筋肉腫抗原MU−RMS−40.12;227.IPI00604517 ヌクレオリンに類似;228.IPI00444262 CDNA FLJ45706 fis、クローンFEBRA2028457、ヌクレオリンに極めて類似;229.IPI00412473 タンパク質;230.IPI00414489 タンパク質;231.IPI00411463 タンパク質;232.IPI00556415 トランスゲリン変異体(フラグメント);233.IPI00718825 カルモジュリン;234.IPI00478156 17kDaタンパク質;235.IPI00386621 CALM3タンパク質;236.IPI00647001 酸性;237.IPI00642650 スタニオカルシン2前駆体に類似;238.IPI00641471 コラーゲン様タンパク質;239.IPI00514669 SH3ドメイン結合グルタミン酸リッチタンパク質様3;240.IPI00719422 トリオースリン酸イソメラーゼ(フラグメント);241.IPI00003734 推定上のS100カルシウム結合タンパク質H_NH0456N16.1;242.IPI00029574 11kDaタンパク質;243.IPI00641047 ゲルゾリン;244.IPI00647556 ゲルゾリン;245.IPI00654821 仮説タンパク質LOC54845アイソフォーム1;246.IPI00647572 Dickkopf関連タンパク質3前駆体;247.IPI00639879 細胞質分裂タンパク質sepAに類似;248.IPI00657746 細胞質分裂のデディケイタータンパク質8に類似;249.IPI00555993 血管内皮増殖因子受容体3変異体;250.IPI00552545 細胞質分裂のデディケイタータンパク質8。
タンパク質は、以下の表D2に示す遺伝子の遺伝子産物から選択され得る。表D2は、以下の段落中の以下の遺伝子を含む:
ACTA1;COL5A2;HSPA8;PSAP;ACTA2;COL5A3;HSPE1;PSME1;ACTB;COL6A1;HSPG2;PTK7;ACTC;COL6A2;IGFBP2;QSCN6;ACTG1;COL6A3;IGFBP5;RTN4;ACTG2;CSTB;IGFBP6;S100A11;AGRN;CTBS;IGFBP7;SH3BGRL3;ALCAM;CTSB;K−ALPHA−1;SOD1;ANP32B;CYR61;KDR;SPARC;ANXA2;DOCK10;LAMC1;SPTBN1;ARHGDIA;DOCK8;LGALS1;STC2;B2M;ECM1;LGALS3BP;SVEP1;BMP1;EEF1G;LMNA;TAGLN;C14orf166;ENO1;LOX;TAGLN2;C1R;ENO1B;LTBP1;TGFBI;CALM1;ENO2;LUM;TGFBR3;CD109;FBLN1;MDH2;THBS1;CD44;FBN1;MRC2;TIMP1;CDH11;FBN2;MYH11;TIMP2;CDH13;FGF17;MYH9;TMSB4X;CDH2;FGFR2;NCL;TMSL3;CFH/HF1;FLJ21918;NPM1;TMSL6;CFL1;FLNA;PBP;TPI1;CLSTN1;FN1;PCOLCE;TPM4;COL11A1;FSTL1;PDGFRB;TUBA3;COL12A1;GALNT5;PFN1;TUBA6;COL16A1;GLRX;PGK1;TXN;COL1A1;GOLPH2;PGK2;TXNRD1;COL1A2;GSN;PLAU;UBE2I;COL3A1;GSTP1;PLEC1;UCHL1;COL4A1;HNRPCL1;PPIA;UFM1;COL4A2;HNRPF;PRDX1;URB;COL5A1;HNT;PRDX5;YWHAZ。
粒子は、付加的にまたは代替的に、以下の表D3に列挙する201個の遺伝子の遺伝子産物のいずれかを含み得る。これらの遺伝子は、その遺伝子が関与する生物学的過程によって特徴づけられる。
粒子は、付加的にまたは代替的に、以下の表D4に列挙する201個の遺伝子の遺伝子産物のいずれかを含み得る。これらの遺伝子は、その遺伝子が関与する経路によって特徴づけられる。
粒子は、付加的にまたは代替的に、以下の表D5に列挙する593個の遺伝子および/または794個の遺伝子産物のいずれかを含み得る。
粒子は特に小胞を含み得る。粒子はエキソソームを含み得る。
粒子は、前述したようにMSCまたはMSC−CMの代替物として使用し得る。特に、粒子は、MSCまたはMSC−CMが現在使用されている、または将来使用され得る治療目的のいずれかのために使用し得る。
MSCのプロテオームの解析は、発現されるタンパク質が3つの生物学的過程(代謝、防御応答、ならびに、脈管形成、造血および骨格発達を含む組織分化)に関与することを示す。従って、本明細書で述べるMSCからの粒子は、これらの機能が役割を果たし得る、またはその修復もしくは治療がこれらの生物学的過程の1つもしくはそれ以上を含む疾患を治療するために使用し得る。同様に、単独でまたは組み合わせとして、好ましくは本明細書で述べる粒子の形態で、MSCによって発現されるタンパク質は、たとえばそのような疾患を治療するかまたは予防することを目的として、MSCまたはMSCによって馴化された培地の活性を補足するためにまたはそれらの代わりに使用し得る。
本明細書で述べる間葉系幹細胞粒子の方法および組成物は、心疾患の治療または予防のために使用し得る。
冠状動脈疾患は、心筋層に供給する動脈の壁内にじゅく状斑が蓄積することによって引き起こされる動脈の疾患である。狭心症(胸痛)および心筋梗塞(心臓発作)が冠状動脈心疾患の症状であり、冠状動脈心疾患によって引き起こされる病変である。459,000人超のアメリカ人が毎年冠状動脈心疾患のために死亡している。英国では、年間101,000例の死亡が冠状動脈心疾患によるものである。
心筋症は、何らかの理由による心筋(すなわち実際の心臓の筋肉)の機能の低下である。心筋症を有する人々は、しばしば不整脈および/または心臓性突然死の危険性がある。外因性心筋症−主たる病因が心筋自体の外部にある心筋症−が心筋症の大部分を構成する。心筋症の群を抜いて最も一般的な原因は虚血である。
全身性代謝疾患に続発する心筋症
内因性心筋症(同定可能な外部原因によるものではない心臓の筋肉の脆弱性)
拡張型心筋症(DCM、最も一般的な形態であり、心臓移植のための主要な適応症の1つ。DCMでは、心臓(特に左室)が拡張し、ポンプ機能が低下する)
肥大型心筋症(HCMまたはHOCM、筋節タンパク質をコードする遺伝子の様々な突然変異によって引き起こされる遺伝的障害。HCMでは、心筋が肥厚し、それが血流を閉塞させ、心臓が正しく機能するのを妨げ得る)
不整脈原性右室心筋症(ARVC、心筋が線維性瘢痕組織によって置き換えられる、心臓の電気的障害から生じる。右室が一般に最も影響を受ける)
拘束型心筋症(RCM、最も少ない心筋症である。心室の壁が堅くなるが、肥厚していないこともあり、血液による心臓の正常な充満に抵抗する)
心筋緻密化障害(左室壁が生後から正しく成長することができず、心エコー検査図で観察した場合海綿状の外観を有する)
も含まれる。
心臓血管疾患は、心臓自体および/または血管系、特に心臓に至り、かつ心臓から出ていく静脈と動脈を侵す多くの特定疾患のいずれかである。疾患の二形性に関する研究は、心臓血管疾患を有する女性は通常、血管を侵す形態に罹患しているが、男性は通常、心筋自体を侵す形態に罹患していることを示唆する。心臓血管疾患の公知のまたは関連する原因としては、糖尿病、高血圧、高ホモシステイン血症および高コレステロール血症を含む。
心臓血管疾患のタイプは、アテローム性動脈硬化症を含む。
虚血性心不全は、器官への血液供給の低下によって特徴づけられる心臓自体の疾患である。これは、酸素と養分を供給する動脈が閉塞して、心臓が十分な酸素と養分を得られず、最終的に拍動を停止する場合に起こる。
うっ血性心不全(congestive heart failure(またはCHF)およびcongestive cardiac failure(CCF))とも呼ばれる心不全は、心臓が十分な量の血液で満たされ、身体全体に十分な量の血液を送り出す能力が損なわれる、何らかの構造的または機能的心障害から生じ得る状態である。肺性心は心臓の右側部分の不全である。
高血圧性心疾患は、高血圧、特に局所性高血圧によって引き起こされる心疾患である。高血圧性心疾患によって生じ得る状態は:左心室肥大、冠状動脈心疾患、(うっ血性)心不全、高血圧性心筋症、心律動異常、炎症性心疾患等を含む。
心臓弁膜症は、心臓の1つまたはそれ以上の弁を侵す疾患過程である。心臓の右側部分の弁は三尖弁と肺動脈弁である。心臓の左側部分の弁は僧帽弁と大動脈弁である。大動脈弁閉塞、僧帽弁逸脱および弁膜性心筋症が含まれる。
本明細書で述べる粒子は、任意の適切な手段によってヒトまたは動物の身体に送達し得る。
本明細書で述べる方法および組成物によって生産される間葉系幹細胞および分化細胞、ならびにそれらから誘導される粒子はまた、その必要のあるヒト患者において組織再構築または再生のためにも使用し得る。細胞は、意図される組織部位にそれらを移植し、機能不全領域を再構築または再生することを可能にするように投与される。
本明細書で述べる方法および組成物によって生産される間葉系幹細胞および分化細胞、ならびにそれらから誘導される粒子は、がんの治療のために使用し得る。
本明細書で述べる粒子は、間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)から単離または生産し得る。馴化培地および粒子の生産における使用に適するMSCは、当技術分野で公知の任意の方法によって生産し得る。
間葉系幹細胞を生産する1つの方法は、胚性幹細胞コロニーを細胞に分散させるかまたは離解させることを含み得る。
離解した細胞は、細胞培養物としてプレートし、維持し得る。
細胞は共培養物の不在下で培養し得る。「共培養物」という用語は、共に増殖させる2またはそれ以上の異なる種類の細胞の混合物、たとえば間質支持細胞を指す。
解離または分離した胚性幹細胞は、無血清培地を含み得る培地中で培養し得る。
解離または分離した胚性幹細胞を培養する無血清培地は、1つまたはそれ以上の増殖因子を含有し得る。多くの増殖因子が当技術分野において公知であり、たとえばPDGF、EGF、TGF−α、FGF、NGF、エリスロポエチン、TGF−β、IGF−IおよびIGF−IIを含む。
培養下の細胞は一般に、接触阻害が細胞の分裂および増殖の停止を生じさせる場合、集密まで増殖し続ける。そのような細胞を、次に、基質またはフラスコから解離し、「分割して(split)」、組織培養培地への希釈によって二次培養または継代し、再プレートし得る。
方法は、間葉系幹細胞をさらに単離するかまたは選択する、選択または選別工程をさらに含み得る。
成体骨髄に由来する間葉系幹細胞は、心臓血管疾患を治療するための最も有望な幹細胞型の1つとして浮上した(Pittenger and Martin,2004)。自家MSCの治療作用は、心筋細胞、内皮細胞および血管平滑細胞などの多くの異なる修復または置換細胞型へと分化するそれらの潜在能に帰せられてきたが(Minguell and Erices,2006;Zimmet and Hare,2005)、移植したMSCが損傷組織において治療的に有用な数の機能的修復細胞へと分化する効率はまだ確立されていない。
MSCの生成とCMの調製についてのプロトコールは以前に記述されている15、16。
すべての実験は、実験動物資源局(Laboratory Animal Resources)によって作成された「実験用ブタの管理と使用に関する指針(Guide for the Care and Use of Laboratory Pigs)」およびFaculty of Medicine,Utrecht University,the Netherlandsの動物実験委員会による事前の承認に従って実施する。
すべてクロピドグレル75mg/日で3日間およびアミオダロン400mg/日で10日間前処置した、30頭の雌性Dalland Landraceブタ(60−70kg;IDDLO,Lelystad,The Netherlands)を、MSC−CM、非CMまたは食塩水処置に無作為に割り当てる。
全手術期間中、ECG、全身動脈圧およびカプノグラムを継続的に観測する。先に記述されているような全身麻酔下で18、胸骨正中切開を実施し、6Frのガイディングカテーテルと8Frのコンダクタンスカテーテル(CD Leycom,Zoetermeer,the Netherlands)のために2枚の導入シートを頸動脈に挿入する。
左室(LV)圧および容積を、先に述べられているように18コンダクタンスカテーテル法を使用して測定する。コンダクタンスカテーテルに由来するLV圧および容積シグナルを、Leycom CFL−512(CD Leycom)を用いて250Hzのサンプリング周波数で表示し、取得する。
心臓の切除の直前に、LCxCA(ブタ)またはLCA(マウス)をMIの誘導の場合と正確に同じ位置で再結紮する。危険領域(AAR)を描出するために冠状動脈系を通してエバンスブルー染料を注入する。
ヒト白血病CEM細胞をCMまたは非CM中でインキュベートし、50μMのH2O2 で処理して酸化ストレスを誘導する。H2O2処理後12、24、36および48時間目にトリパンブルー排除を使用して細胞生存能を評価する。
虚血および再灌流領域における核酸化ストレスを、DNAに対する酸化ストレスの産物である、8−ヒドロキシ−2’−デオキシグアノシン(8−OHdG)を免疫染色することによって評価する。組織試料を4%ホルマリンに固定した後、パラフィンに包埋する。
製造者のプロトコールに従ってTripure Isolation Reagent(Boehringer,Mannheim,Germany)1mlを使用してブタの虚血/再灌流領域より収集した凍結組織試料からタンパク質を単離する。ウエスタンブロット法のために、全タンパク質8μgを10%SDS−PAGEゲル上で分離し、ニトロセルロースC膜(Amersham,Buckinghamshire,UK)に移して、リン酸緩衝食塩水(PBS)−0.1%Tween−5%Protifar(Nutricia,Netherlands)を用いてブロックする。
MSC−CMを220nmフィルターでの滅菌ろ過によって調製し、10nmフィルターを通して濃縮し、それゆえMSC−CMは10〜220nmの成分を含有する。その後、100nmの公称細孔径を有する1000kDaのMWカットオフ膜(Pall Corporation,Singapore)を通してMSC−CMをろ過することによって<1000kDa画分を調製し、10〜100nmの生成物を含有する画分を生成する。
データを平均±SEMとして提示する。数値を盲検的に収集し、SPSS11.5においてポストホックボンフェローニ検定による一方向ANOVAを用いて比較する。P値<0.05を有意とみなす。
4匹のブタが処置前に虚血の間の抗療性心室細動のために死亡し、それゆえ試験から除外している。CM(n=9)、非CM(n=9)または食塩水(n=8)で処置したすべてのブタは、フォローアップ期間も生存した。
危険領域(AAR)ならびにLVと比較した梗塞の大きさは、非CMおよび食塩水で処置したブタと比較して、MSC−CMで処置したブタにおいて著明に縮小した。MSC−CM処置は、梗塞の大きさの約60%の縮小を生じさせた。重要な点として、AARはすべてのブタにおいて同様であり、これは、初期虚血損傷がすべてのブタにおいて同様であることを指示する(以下の表E1)。
基線パラメータはすべての群において同様である(上記表E1)。虚血の間、心エコー検査での収縮期壁肥厚の負の値によって認められるように、すべての群において後外側壁が完全にジスキネジーとなった(SWT、図2A)。再灌流の4時間後、非CMおよび食塩水対照の両群の再灌流された後外側壁はまだジスキネジーのままである。しかし、MSC−CMで処置したブタでは、SWTは部分的に回復した(図2A)。
梗塞の大きさの縮小および機能の改善が明らかになったので、本発明者らは、虚血再灌流障害の主要原因である酸化ストレスへのCMおよび非CMの作用を測定するために過酸化水素(H2O2)誘導性細胞死のインビトロアッセイを使用した。
MSCの分泌物は、TGF−βシグナル伝達に関与する多くのタンパク質を含有した16。TGF−βシグナル伝達へのCM処置の影響をインビボで評価するため、本発明者らは、CM処置ブタおよび対照ブタの心筋組織試料におけるリン酸化SMAD−2をウエスタンブロット法によって定量した。CM処置はpSMAD−2発現の低下を生じさせ、ALK−5を介したTGF−βシグナル伝達が低下することを指示した(図4A、B)。
再灌流障害は、壊死よりもアポトーシスを介した細胞死を生じさせる20〜22。CM処置が再灌流の間のアポトーシスを低減することを確認するため、本発明者らは、アポトーシスの鍵となるメディエイターである活性カスパーゼ3のレベルをウエスタンブロット法によって定量した。MSC−CMで処置したブタでは、活性カスパーゼ3レベルは非CM対照および食塩水対照の両方に比べて低く、CMがインビボでアポトーシスを阻害することを示唆する(図4C、D)。
未分画MSC−CMは10〜220nmの生成物を含有する。MSC−CM内の心保護因子を同定することに近づくため、10〜100nmにわたる大きさの生成物を含有する<1000kDa画分を生成する。未分画MSC−CMは心保護作用を付与するが、<1000kDa画分は心保護作用を付与せず(図5)、心保護因子が100〜220nmの範囲の大きさを有する>1000kDa画分中にあることを指示する。
馴化培地中の活性成分を同定するため、本発明者らは、種々のMWカットオフ値を有する膜で馴化培地をろ過することにより、馴化培地を異なるMW画分にサイズ分画することを試みた。
推定上の分泌複合体の大きさの上限または下限を調べるため、本発明者らは、馴化培地のサイズ分画を実施し、虚血再灌流障害のマウスにおいて生物活性を試験した。馴化培地を0.2μMフィルターでろ過し、10kDのMWカットオフ値を有する膜で濃縮した場合、これは、推定上の分泌複合体を2〜200nmのサイズ範囲に有効に位置づけた(図8)。
標準的な方法を用いて馴化培地の電子顕微鏡分析を実施する。簡単に述べると、PBS中の馴化培地をフォルムバールカーボン被覆グリッド(Ted Pella Inc,Redding,CA,USA、カタログ番号01800N−F)に負荷し、2.5%グルタルアルデヒドに固定して、洗浄し、2%酢酸ウラニルでコントラスト強調し(contrasted)、酢酸ウラニル(0.8%)とメチルセルロース(0.13%)の混合物に包埋して、電子顕微鏡下で検査する。上記のサイズ分画試験と一致して、約50〜150nmの数多くの小胞の存在を認め、これらの小胞が分泌物中の推定上の活性複合体であることを示唆した(図11)。
馴化培地の脂質組成を分析するため、馴化培地およびNCMの疎水性脂質/ステロイド成分をフォルチ法によって抽出する。簡単に述べると、馴化培地またはNCM(50ml)をクロロホルム5mlおよびメタノール2mlと強く混合する。有機相と水相を分離させる。底部クロロホルム層を取り出し、スピードバックによって蒸発乾固させる。
細胞からのRNAの抽出において一般的に使用される、馴化培地のトリゾール抽出およびそれに続くイソプロパノール沈殿により、水中で1.9の260:280nm吸光度比を有するペレットが生成され、それがRNAであり得ることを示唆する。
分泌物中に存在すると記述されている約700個のタンパク質の中に(米国特許仮出願第60/878,222号および国際特許出願第PCT/SG2006/000232号、Mesenchymal Stem Cell Conditioned Medium)、他のエキソソームのプロテオームにおいて一般的に存在することが認められた多くのタンパク質がある(図13)44。また、エキソソーム内に存在することが記述されていなかった多くのタンパク質も約700個のタンパク質のリスト中に存在する。網羅的ではないが一部の顕著な例は、Thy1、Wnt 5a、Wnt 5b、インヒビンA(またはアクチビンA)である。
馴化培地のプロテオームプロフィールも、膜結合であることが公知のタンパク質の存在を示す。網羅的ではないが一部の顕著な例は、CD9、CD109、thy−1を含む20。エキソソームの他の公知の表面抗原、たとえば尿中に分泌されるエキソソームの表面で認められるCD24は45、MSC19またはその分泌物中20では発現されない。
所見に基づき、本発明者らは、馴化培地中の最小活性心保護単位がエキソソームであると仮定する。
すべてクロピドグレル75mg/日で3日間およびアミオダロン400mg/日で10日間前処置した、30頭の雌性Dalland Landraceブタ(60−70kg;IDDLO,Lelystad,The Netherlands)を、MSC−CM、非CMまたは食塩水処置に無作為に割り当てる。
全手術期間中、ECG、全身動脈圧およびカプノグラムを継続的に観測する。先に記述されているような全身麻酔下で47、胸骨正中切開を実施し、6Frのガイディングカテーテルと8Frのコンダクタンスカテーテル(CD Leycom,Zoetermeer,the Netherlands)のために2枚の導入シートを頸動脈に挿入する。
ECG、動脈圧および心拍出量を250Hzのサンプリング周波数でデジタル化し、オフライン解析のために保存する(Leycom CFL−512,CD Leycom)。左心室(LV)圧および容積を、先に述べられているように47コンダクタンスカテーテル法を使用して測定する。コンダクタンスカテーテルに由来するLV圧および容積シグナルを、Leycom CFL−512(CD Leycom)を用いて250Hzのサンプリング周波数で表示し、取得する。
心臓の切除の直前に、LCxCA(ブタ)またはLCA(マウス)をMIの誘導の場合と正確に同じ位置で再結紮する。危険領域(AAR)を描出するために冠状動脈系を通してエバンスブルー染料を注入する。次に心臓を切除し、LVを単離して、心尖から心底まで5つの切片に切り分ける。
HuES9.E1細胞を先に述べられているように培養する(Lian et al.,2007;Sze et al.,2007)。
透析した馴化培地(CM)または非馴化培地(NCM)2ml中のタンパク質を、先に述べられているように(Sze et al.,2007)還元し、アルキル化して、トリプシン消化する。次に、消化した混合物を馴化SepPak−C18−SPEカートリッジ(Waters,Milford,MA,USA)に通すことによって試料を脱塩し、3%アセトニトリル(ACN)(JT Baker,Phillipsburg,NJ)および0.1%ギ酸(FA)緩衝液で2回洗浄して、70%ACNおよび0.1%FA緩衝液で溶出する。次に、溶出した試料を、真空遠心分離機において有機溶媒を除去することにより、それらの最初の容積の約10%に乾燥させる。
装置の組立は、バイナリーポンプつき液体クロマトグラフィーシステム、自動注入器、サーモスタットカラムオーブン、Shimadzu Corporation(Kyoto,Japan)からのClass VPソフトウエアによって操作される紫外可視検出器から成る。使用するクロマトグラフィーカラムは、Tosoh Corporation(Tokyo,Japan)からのTSK−GuardカラムSWXL、6×40mmおよびTSKゲルG4000 SWXL、7.8×300mmである。以下の検出器、Dawn 8(光散乱)、Optilab(屈折率)およびQELS(動的光散乱)を紫外可視検出器の後に直列につなぐ。最後の3つの検出器はWyatt Technology Corporation(California,USA)からであり、ASTRAソフトウエアによって操作される。
ショ糖勾配密度平衡遠心分離のために、22.8〜60%(w/v)の濃度の14のショ糖溶液を調製する。最も濃厚な溶液をSW60Ti遠心分離管(Beckman Coulter Inc.,Fullerton CA,USA)の底部に積層し、続いてその次に高いショ糖濃度を積層する。CMを上部に慎重に負荷した後、SW60Tiローター(Beckman Coulter Inc.)において200,000×g、4℃で16時間半にわたって超遠心する。ショ糖勾配の上部から底部までで16の画分を収集する。微量天秤を使用してすべてのショ糖画分の密度を計算し、13の画分に集約する。一部のCMについては、CMを細胞溶解緩衝液(Cell Extraction Buffer,Biovision,www.BioVision.com)で前処理した後、ショ糖勾配密度平衡遠心分離機に負荷する。溶解緩衝液は、プロテアーゼ阻害剤のカクテル(Halt Protease Inhibitor Cocktail,EDTA−Free,Thermo Scientific,www.thermofisher.com)と共に1:1の容積でCMに添加する。混合物を静かに振とうしながら室温で30分間インキュベートする。
CMのタンパク質濃度を、製造者の指示に従ってNanoOrange Protein Quantificationキット(Invitrogen)を使用して定量する。
CMの全タンパク質をポリアクリルアミドゲル上で分離した後、ニトロセルロース膜(Amersham Biosciences,Uppsala,Sweden)に移す。膜をブロックし、ヒトCD9、CD81、SOD−1、ピルビン酸キナーゼ、Alix、Tsp−1に対するマウス抗体と共にインキュベートして、続いてマウス一次抗体に対するホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にインキュベートする。その後、結合一次抗体を検出する、そしてそれゆえ抗原の存在を検出するための化学発光HRP基質と共にブロットをインキュベートする。
CMの2つの独立した製剤および100,000×g、4℃で2時間のCMの超遠心からのペレット中のコレステロール、スフィンゴミエリンおよびホスファチジルコリン濃度を、市販のアッセイキットを使用して測定する。コレステロールはAmplex(登録商標) Red Cholesterol Assay Kit(Molecular Probes,USA)を使用して測定し、スフィンゴミエリンはSphingomyelin Assay Kit(Cayman Chemical Company,Ann Arbor,MI,USA)によって、およびホスファチジルコリンはPhosphatidylcholine Assay Kit(Cayman Chemical Company,Ann Arbor,MI,USA)を使用して測定する。
CMを、TritonXもしくは溶解緩衝液によって、またはTritonXもしくは溶解緩衝液なしで、静かに振とうしながら4℃で30分間処理する。処理したCMに、静かに振とうしながら室温で3秒から20分間トリプシンを添加することによってタンパク質分解消化を実施させる。トリプシン阻害剤、PMSFを使用して消化を停止させる。
MSCからの全細胞RNAの2つの生物学的複製物およびCMからの分泌RNAの2つの生物学的複製物をmiRNAマイクロアレイによって分析する。ハイブリダイゼーションおよびデータ解析はLLC(www.LCsciences.com)に委託する。チップは、Sanger miRBase Release 10.1(http://www.sanger.ac.uk/Software/Rfam/mirna/)に列挙されているmiRNA転写産物についてのプローブを含んだ。
活性成分を同定するため、本発明者らは先に、異なるMWCOを有する膜での限外ろ過によってCMを分画した。CMを1000kDaのMWCOを有する膜でろ過した場合、ろ液は保護性でないことが示されている。しかし、同様の膜で約125倍に濃縮したCMは、虚血/再灌流障害のマウスモデルにおいて心保護性である。要約すると、100kDa、300kDa、500kDaまたは1000kDaなどの0.2μmより小さいMWCOを有するフィルターでのろ過は心保護性ではない(図14)が、1000kDa膜(Timmers et al.,2008)または100kDa膜で濃縮したCMは心保護性である(図14)。これらの所見は、活性画分が、>1000kDaのまたは50〜100nmの直径を有する、大型複合体から成ることを示唆した。粒子のサイズ範囲に基づき、本発明者らはCM中の粒子がエキソソームであると仮定した。エキソソームは、形質膜と同じ配向を有する二重脂質膜と多小胞体から形成される(Fevrier and Raposo,2004;Keller et al.,2006)。それらは多くの細胞型によって産生されることが公知であり、細胞間情報伝達において重要であると考えられる。エキソソームは40〜100nmの直径を有する。エキソソームは多くの細胞型によって分泌されることが示されていて、これらのエキソソームのタンパク質組成は細胞特異的であると思われた。しかし、CD9、ピルビン酸キナーゼおよびAlixなどの一部のタンパク質は、エキソソームにおいて一般的に発現されると思われる(Sze et al.,2007)。本発明者らは以前に、分泌物中の約201個のタンパク質を同定した(Sze et al.,2007)。
CM中のエキソソームの存在を確認するため、CMを200,000gで2時間超遠心する。ペレット中にはエキソソーム関連タンパク質であるCD9の>200倍の富化が存在し、上清中には検出可能なレベルのCD9は存在しない(図16)。100,000gで1時間の超遠心は、すべてのCD9を沈降させるのに十分ではない(図16)。500kDaのMWCOを有するフィルターでのCMのろ過およびそれに続くろ液または保持液の200,000gで2時間の遠心分離は、保持液画分中にペレットを生成した(図16)。このペレット中では、それぞれ19kDaのMWを有するCD9が高度に富化されている。しかし、このペレットは虚血/再灌流障害のマウスモデルにおいて全く心保護作用を付与せず、本発明者らは、これが、強くボルテックス撹拌し、ピペットで分注してペレットを再懸濁する必要があるためであると推測した。本発明者らは、CD9の画分だけが100,000gおよび200,000gで1時間の遠心で沈降し、大部分は200,000gで2時間によって沈降することを認めた。小さな画分は200,000gで4時間によって沈降した。合わせて考慮すると、これらの所見は、活性成分が超遠心によって沈降し得る比較的大きな複合体であるという本発明者らの仮説を裏付ける。
エキソソーム関連タンパク質は、CD9などの多くの公知の膜タンパク質およびSOD1などの細胞質タンパク質を含むので、本発明者らはそれゆえ、これらのタンパク質が同様に小胞の脂質膜および内腔に局在するかどうかを測定した。CMを経時的に限定的トリプシン処理に供する(図18A)。SOD1と類似のMWを有するCD9は、SOD1よりも比較的トリプシン消化を受けやすい。SOD1の消化は、CD9の50%超が消化された後でのみ認められる(図18A)。検出可能な中間体を生じなかったSOD1のトリプシン消化と異なり、CD9のトリプシン消化は3つのトリプシンペプチド中間体を生成し、CD9が異なるトリプシン感受性を備えたドメインを有することを示唆した。CD9のペプチド中間体および公知のトリプシン部位の長さに基づき、3つの感受性トリプシンペプチド中間体は膜貫通ドメインまたは細胞質ドメインにマッピングされる。これは、細胞CD9の公知の細胞質外ドメインは分泌されたCD9上でも同様に露出されていて、それゆえトリプシン感受性であるが、膜貫通ドメインおよび細胞質ドメインは露出されておらず、それゆえトリプシン消化に対して比較的抵抗性であることを示唆した。合わせて考慮すると、これらの所見は、公知の膜タンパク質であるCD9もエキソソームにおいて膜結合していて、細胞膜中のCD9と同じ方向に配向されているが、細胞質SOD−1は内腔に局在し、膜タンパク質の消化によって膜の完全性が損なわれた場合にのみ消化され得ることを示唆した。
RNAが細胞によってエキソソーム中に分泌されることは以前に報告されている(Smalheiser,2007;Taylor and Gercel−Taylor,2008;Valadi et al.,2007)。RNAが心保護性分泌物中に存在するか否かを測定するため、トリゾールによってCMからRNAを抽出し、タンパク質mg当たり5〜6μgのRNAを生成する。グリオキサール−アガロースゲル(図19A)または尿素−PAGE(図19B)上で分離した場合、RNAは検出不能レベルの18Sおよび28SリボソームRNAを含有し、大部分のRNAは<300ヌクレオチドであった。分泌物中のRNAの安定性が、タンパク質について認められたようなリン脂質小胞への封入のためであるのかどうかを測定するため、CMをRNアーゼで処理した後、RNAを抽出する。RNAの収率およびサイズ分布は未処置CMと同様であり(図19C)、分泌されたRNAがRNアーゼ分解から保護されることを示唆する。本発明者らは次に、SDSに基づく細胞溶解緩衝液、シクロデキストリンまたはホスホリパーゼA2でCMを処理することにより、RNAが、細胞膜に類似する、脂質膜によって保護されている可能性を試験した。4つの試薬の1つによる処理後、CMをRNアーゼに暴露し、次にRNAを抽出する。SDSに基づく細胞溶解緩衝液による前処理はRNAの完全な喪失を生じさせたが、シクロデキストリンまたはホスホリパーゼA2による処理はRNAの部分的な分解と喪失を導いた。これらの所見は、RNAが、コレステロールに富むリン脂質膜によってRNアーゼ活性から保護されていて、膜は、SDSに基づく細胞溶解緩衝液、脂質を溶解するTritonX−100などの界面活性剤、コレステロールをキレート化し、抽出するシクロデキストリンによって、またはホスホリパーゼDによる分解によって容易に溶解または損傷されることを示唆した。本発明者らはまた、約70〜100ヌクレオチドのRNAがより小さいMWのRNAよりもRNアーゼIII活性に対して感受性であることを認め、より大きなRNAが二本鎖であることが示唆された(図19D)。
RNAは脂質小胞であることが示されているので、本発明者らは次に、ショ糖勾配平衡超遠心法を使用してこれらの小胞の浮遊密度を測定した。CM、溶解緩衝液で前処理したCMまたはRNA MWマーカーのセットをショ糖密度勾配に負荷し、図4a、bに示されているように超遠心する。次に勾配を13の画分に取り、各々の画分をRNAについて抽出する。分泌RNAを1.074〜1.1170g/mlの密度で平衡させた(図20)。これに対し、RNA MWマーカーは1.115〜1.1170g/mlの浮遊密度を示し、溶解緩衝液によるCMの前処理とその後の遠心分離は、分泌RNAの密度をRNA MWマーカーの密度、すなわち1.115〜1.1145g/mlに上昇させた(図20C)。これらの所見は、それゆえ、RNAが脂質小胞に封入されていて、それゆえ可溶性RNAよりもはるかに低い見かけ密度を有することと一致する。溶解緩衝液によるCMの前処理はRNAを放出させ、RNAマーカーの密度で沈降するRNAを生じさせた。
上記に示すように、CD9、CD81およびAlixは抗CD81抗体によって共免疫沈降する。本明細書において本発明者らは、RNAもCD81と免疫沈降するか否かを試験した。免疫沈降後、RNAは沈殿物中には存在せず、上清中に残存した(図21)。それゆえ、分泌RNAはCD81+、CD81+CD9+またはCD81+CD9+Alix+小胞内に隔離されていない。
エキソソームはマイクロRNAを含有することが報告されていて(Smalheiser,2007;Taylor and Gercel−Taylor,2008;Valadi et al.,2007)、CM中のRNAの大部分は300ヌクレオチド未満であるので、本発明者らは、マイクロアレイハイブリダイゼーションを実施することによってMSCおよびそれらのCMからのRNAをマイクロRNA(miRNA)の存在に関して試験した。149個のmiRNAがMSCにおいて検出され、63個がCMにおいて検出される(図22A、以下の表E3)。
分泌物が大型複合体を含有することを確認するため、CMおよびNCMを最初にHPLCでのサイズ排除によって分離し(図13)、次に220nmの吸光度によって測定した場合の各々の溶出ピークを、準弾性光散乱(QELS)検出器を使用して動的光散乱(DLS)に関して検査する。
Claims (18)
- 間葉系幹細胞により分泌され、間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)の生物活性、たとえば心保護作用などの、間葉系幹細胞の少なくとも1つの生物学的性質を含む粒子。
- たとえば心筋虚血および再灌流障害のマウスもしくはブタモデルにおいて評価した場合、梗塞の大きさを縮小することができる、またはたとえば過酸化水素(H2O2)誘導性細胞死のインビトロアッセイにおいて評価した場合、酸化ストレスを低減することができる、請求項1に記載の粒子。
- 前記粒子が、たとえば、表D1もしくはE2に示すリストから選択されるような間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)中のタンパク質の少なくとも70%を含有するエキソソームなどの小胞を含むか、または表D2に示す遺伝子もしくは表E3に示す1つもしくはそれ以上のmiRNAを含有する遺伝子の遺伝子産物である、請求項1または2に記載の粒子。
- 前記粒子が、(a)たとえば<100kDaのタンパク質を含有する、分子量>100kDaの複合体;(b)たとえば<300kDaのタンパク質を含有する、分子量>300kDaの複合体;または(c)分子量>1000kDaの複合体を含む、請求項1、2または3に記載の粒子。
- 前記粒子が、たとえば0.2μMフィルターでのろ過および10kDaの分子量カットオフ値を有する膜による濃縮によって測定した場合もしくは電子顕微鏡検査によって測定した場合、2nm〜200nmの大きさ、たとえば50nm〜150nmの大きさもしくは50nm〜100nmの大きさを有する、または、たとえばレーザー回折もしくは動的光散乱によって測定した場合、100nm未満、たとえば約30nm〜約70nm、約40nm〜約60nm、たとえば約45nm〜約55nm、たとえば約50nmの流体力学的半径を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記粒子が、リン脂質、ホスファチジルセリン、ホスファチジルイノシトール、ホスファチジルコリン、スフィンゴミエリン、セラミド類、糖脂質、セレブロシド、ステロイド類、コレステロールから成る群から選択される脂質を含有し、たとえば前記コレステロール−リン脂質比が0.3〜0.4(モル/モル)超である、請求項1〜5のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記粒子が脂質ラフトを含有する、または前記粒子が非イオン性界面活性剤、好ましくはTriton−X100に不溶性である、または前記粒子が、前記粒子を非イオン性界面活性剤で処理した場合、請求項4で規定される前記分子量のタンパク質が前記請求項で規定される前記分子量の複合体中に実質的に残存する前記粒子である、または前記粒子が、たとえばシクロデキストリンでの処理が請求項4で規定される前記複合体の実質的な溶解を引き起こすように、シクロデキストリン、好ましくは20mMシクロデキストリンに対して感受性である、請求項1〜6のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記粒子がリボ核酸(RNA)を含有し、好ましくは前記粒子が1.9の吸光度比(260:280nm)を有する、または前記粒子がCD9、CD109およびthy−1から成る群から選択される表面抗原を含有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の粒子。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の粒子を作製する方法であって、間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)から前記粒子を単離することを含み、場合により、たとえば前記分子量が請求項4に記載される前記分子量から選択される、または前記大きさが請求項5に記載される前記大きさから選択される、または前記組成物が請求項6に記載される前記組成物から選択される、または前記生物活性が請求項1もしくは2のいずれか一項に記載される前記生物活性から選択されるような、分子量、大きさ、形状、組成物または生物活性に基づき前記粒子を他の成分から分離することを含む方法。
- 請求項1〜8のいずれか一項に記載の粒子を作製する方法であって、
(a)間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)を得ること;
(b)前記間葉系幹細胞馴化培地を、たとえば>1000kDa膜での限外ろ過によって、濃縮すること;
(c)前記濃縮間葉系幹細胞馴化培地を、たとえばTSK GuardカラムSWXL、6×40mmまたはTSKゲルG4000 SWXL、7.8×300mmカラムを使用して、サイズ排除クロマトグラフィーに供すること;および
(d)たとえば220nmで、準弾性光散乱(QELS)によって検出されるような動的光散乱を示すUV吸収画分を選択すること
を含み、工程(d)が、たとえば、11〜13分、たとえば12分の保持時間で溶出する画分を収集することを含む方法。 - 請求項1〜10のいずれか一項に記載の粒子を医薬的に許容される賦形剤、希釈剤または担体と共に含有する医薬組成物。
- 疾患を治療する方法における使用のための、請求項1〜10のいずれか一項に記載の粒子または請求項11に記載の医薬組成物。
- 疾患の治療のための医薬組成物の製造のための、または個体における疾患の治療の方法における、請求項1〜10のいずれか一項に記載の粒子の使用。
- 前記疾患が、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、熱傷、および糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病などの変性疾患、がん、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚障害、皮膚病変、皮膚炎、乾癬、コンジローム、ゆうぜい、血管腫、ケロイド、皮膚がん、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫症、皮膚T細胞リンパ腫、潰瘍形成、炎症を誘導する初期損傷によって特徴づけられる病的状態、ならびに線維症および機能喪失を含む慢性組織リモデリングを導く免疫機能不全、腎虚血障害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎および鼻炎または整形外科的疾患から成る群から選択される、請求項12に記載の粒子または請求項13に記載の使用。
- 個体における創傷治癒、瘢痕減少、骨形成、骨移植もしくは骨髄移植を助けるため、または(i)以下の1つもしくはそれ以上から選択される経路の調節:Rho GTPアーゼによる細胞骨格調節、細胞周期、インテグリンシグナル伝達経路、ケモカインおよびサイトカインシグナル伝達経路によって媒介される炎症、FGFシグナル伝達経路、EGF受容体シグナル伝達経路、血管新生、プラスミノーゲン活性化カスケード、血液凝固、解糖、ユビキチンプロテアソーム経路、de novoプリン生合成、TCA回路、フェニルアラニン生合成、ヘム生合成;(ii)以下の1つもしくはそれ以上を含む過程の調節:細胞の構造および運動性、細胞構造、細胞間情報伝達、細胞運動性、細胞接着、エンドサイトーシス、有糸分裂、エキソサイトーシス、細胞質分裂、細胞周期、免疫および防御、サイトカイン/ケモカイン媒介性免疫、マクロファージ媒介性免疫、顆粒球媒介性免疫、リガンド媒介性シグナル伝達、サイトカインおよびケモカイン媒介性シグナル伝達経路、シグナル伝達、細胞外マトリックスタンパク質媒介性シグナル伝達、増殖因子ホメオスタシス、受容体タンパク質チロシンキナーゼシグナル伝達経路、細胞接着媒介性シグナル伝達、細胞表面受容体媒介性シグナル伝達、JAK−STATカスケード、抗酸化およびフリーラジカル除去、ホメオスタシス、ストレス応答、血液凝固、発生過程、中胚葉発生、骨格発達、血管新生、筋形成、筋収縮、タンパク質の代謝と修飾、タンパク質分解、タンパク質の折りたたみ、タンパク質複合体構築、アミノ酸活性化、細胞内タンパク質輸送、他のタンパク質ターゲティングと局在化、アミノ酸代謝、タンパク質生合成、タンパク質ジスルフィドイソメラーゼ反応、炭水化物代謝、解糖、ペントースリン酸回路、他の多糖代謝、プリン代謝、リン酸代謝の調節、ビタミン代謝、アミノ酸生合成、プレmRNAプロセシング、翻訳調節、mRNAスプライシング;または(iii)以下の1つもしくはそれ以上を含む機能の供給:シグナル伝達分子、ケモカイン、増殖因子、サイトカイン、インターロイキン、他のサイトカイン、細胞外マトリックス、細胞外マトリックス構造タンパク質、他の細胞外マトリックス、細胞外マトリックス糖タンパク質、プロテアーゼ、メタロプロテアーゼ、他のプロテアーゼ、プロテアーゼ阻害因子、メタロプロテアーゼ阻害因子、セリンプロテアーゼ阻害因子、オキシドレダクターゼ、デヒドロゲナーゼ、ペルオキシダーゼ、シャペロン、シャペロニン、Hsp 70ファミリーのシャペロン、他のシャペロン類、シンテターゼ、シンターゼおよびシンテターゼ、セレクトカルシウム結合タンパク質、アミノアシル−tRNAシンテターゼ、リアーゼ、イソメラーゼ、他のイソメラーゼ、ATPシンターゼ、ヒドラターゼ、トランスアミナーゼ、他のリアーゼ、他の酵素調節因子、セレクト調節分子、アクチン結合細胞骨格タンパク質、細胞骨格タンパク質、非モーターアクチン結合タンパク質、アクチンおよびアクチン関連タンパク質、アネキシン、チューブリン、細胞接着分子、アクチン結合モータータンパク質、中間径フィラメント、リボ核タンパク質、リボソームタンパク質、翻訳因子、他のRNA結合タンパク質、ヒストン、カルモジュリン関連タンパク質、小胞コートタンパク質における、請求項1〜10のいずれか一項に記載の粒子の使用。
- 請求項1〜10のいずれか一項に記載の粒子を送達するための送達システムであって、粒子の供給源を、前記粒子を標的に送達するように作動し得るディスペンサーと共に含む送達システム。
- 粒子を標的に送達する方法における、請求項16に記載の送達システムの使用。
- 添付の図面に関連して実質的に前述した、添付の図面の図1〜23に示す粒子、粒子を製造する方法または使用。
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