JP7405389B2 - 細胞培養上清および生体液からの微小胞の単離および精製のための方法 - Google Patents
細胞培養上清および生体液からの微小胞の単離および精製のための方法 Download PDFInfo
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Description
一実施形態では、微小胞が、微小胞を含有する生体液から単離され、
a)微小胞を含有する生体液を得るステップ、
b)細胞デブリを除去するために生体液を清澄化するステップ、
c)清澄化された生体液に沈殿剤を追加することによって、微小胞を沈殿させるステップ、
d)沈殿した微小胞を収集し、沈殿剤を除去するためにその物質を洗浄するステップ、および
e)保存またはその後の使用のために、洗浄された微小胞を溶液中に懸濁するステップを含む。
a)微小胞を含有する生体液を得るステップ、
b)細胞デブリを除去するために生体液を清澄化するステップ、
c)清澄化された生体液に沈殿剤を追加することによって、微小胞を沈殿させるステップ、
d)沈殿した微小胞を収集し、沈殿剤を除去するためにその物質を洗浄するステップ、
e)洗浄された微小胞を溶液中に懸濁するステップ、ならびに
f)核酸、炭水化物、脂質、小分子、および/またはタンパク質内容物を分析するために微小胞をプロセシングするステップを含む。
a)骨髄由来間葉系幹細胞の集団を得、細胞を1:4の希釈でフラスコに接種するステップ、
b)細胞が80~90%コンフルエントになるまで、培地中で細胞を培養するステップ、
c)細胞デブリを除去するために培地を除去し、清澄化するステップ、
d)清澄化された培養培地に沈殿剤を追加することによって、微小胞を沈殿させるステップ、
e)沈殿した微小胞を収集し、沈殿剤を除去するためにその物質を洗浄するステップ、および
f)保存またはその後の使用のために、洗浄された微小胞を溶液中に懸濁するステップを含む。
a)骨髄由来単核細胞の集団を得、細胞を1:4の希釈でフラスコに接種するステップ、
b)細胞が80~90%コンフルエントになるまで、培地中で細胞を培養するステップ、
c)細胞デブリを除去するために培地を除去し、清澄化するステップ、
d)清澄化された培養培地に沈殿剤を追加することによって、微小胞を沈殿させるステップ、
e)沈殿した微小胞を収集し、沈殿剤を除去するためにその物質を洗浄するステップ、および
f)保存またはその後の使用のために、洗浄された微小胞を溶液中に懸濁するステップを含む。
a)血漿を得、細胞培養培地により血漿を希釈するステップ、
b)希釈された血漿に沈殿剤を追加することによって、微小胞を沈殿させるステップ、
c)沈殿した微小胞を収集し、沈殿剤を除去するためにその物質を洗浄するステップ、および
d)保存またはその後の使用のために洗浄された微小胞を溶液中に懸濁するステップを含む。
a)骨髄穿刺液を得、非細胞部分および細胞部分に骨髄穿刺液を分離するステップ、
b)非細胞部分を希釈するステップ、
c)細胞デブリを除去するために、希釈された非細胞部分を清澄化するステップ、
d)希釈された非細胞部分に沈殿剤を追加することによって、非細胞部分中に微小胞を沈殿させるステップ、
e)沈殿した微小胞を収集し、沈殿剤を除去するためにその物質を洗浄するステップ、および
f)保存またはその後の使用のために、洗浄された微小胞を溶液中に懸濁するステップを含む。
a)尿サンプルを得るステップ、
b)細胞デブリを除去するために尿を清澄化するステップ、
c)清澄化された尿に沈殿剤を追加することによって、微小胞を沈殿させるステップ、
d)沈殿した微小胞を収集し、沈殿剤を除去するためにその物質を洗浄するステップ、および
e)保存またはその後の使用のために洗浄された微小胞を溶液中に懸濁するステップを含む。
一実施形態では、本発明の微小胞が、電子顕微鏡法によって決定される、約2nm~約5000nmのサイズを有する。代替の実施形態では、本発明の微小胞が、電子顕微鏡法によって決定される、約2nm~約1000nmのサイズを有する。代替の実施形態では、本発明の微小胞が、電子顕微鏡法によって決定される、約2nm~約500nmのサイズを有する。代替の実施形態では、本発明の微小胞が、電子顕微鏡法によって決定される、約2nm~約400nmのサイズを有する。代替の実施形態では、本発明の微小胞が、電子顕微鏡法によって決定される、約2nm~約300nmのサイズを有する。代替の実施形態では、本発明の微小胞が、電子顕微鏡法によって決定される、約2nm~約200nmのサイズを有する。代替の実施形態では、本発明の微小胞が、電子顕微鏡法によって決定される、約2nm~約100nmのサイズを有する。代替の実施形態では、本発明の微小胞が、電子顕微鏡法によって決定される、約2nm~約50nmのサイズを有する。代替の実施形態では、本発明の微小胞が、電子顕微鏡法によって決定される、約2nm~約20nmのサイズを有する。代替の実施形態では、本発明の微小胞が、電子顕微鏡法によって決定される、約2nm~約10nmのサイズを有する。
本発明の微小胞は、たとえば状態もしくは疾患または疾患のステージもしくは進行などのような、特定の表現型を同定するバイオマーカーを検出する診断試験において使用することができる。基となる細胞(cell-of-origin)に特異的な微小胞由来のバイオマーカーまたはマーカーは、疾患、状態、疾患ステージ、および状態のステージについての処置レジメンを決定するために使用することができ、また、処置効能を決定するために使用することもできる。基となる細胞に特異的な微小胞由来のマーカーはまた、未知の起源の疾患の状態を同定するために使用することもできる。
配列1:
フォワード:AGACCTCACAGTAAAAATAGGTGA
リバース:CTGATGGGACCCACTCCATC
増幅産物長:70
配列2:
フォワード:GAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTG
リバース:CTGATGGGACCCACTCCATC
増幅産物長:82
本発明の微小胞は、疾患を処置するための療法として使用することができる。
この実施例は、微小胞が細胞培養培地または任意の生体液から単離される、典型的な方法を例証する。細胞培養培地から微小胞を単離するための方法の概要は、図1において示される。要約すると、細胞は、微小胞なしの血清により補足された培地において培養される(血清は、超遠心分離法、ろ過、沈殿などによって微小胞を排除してもよい)。ある期間、細胞を培養した後に、培地を取り出し、コニカルチューブに移し、4℃で10分間、400xgで遠心分離して、細胞をペレットにする。次に、上清を新しいコニカルチューブに移し、4℃で30分間、2000xgで遠心分離して、細胞および細胞デブリをさらに除去する。これに、もう1回の遠心分離法ステップを続けてもよい(たとえば、さらに細胞デブリを排除するおよび/またはより大きな微小胞を除去するために、30分間、10000xg)。結果として生じた上清は、超遠心チューブに移し、均等な重量であることを確かめるために秤量し、4℃で70分間、70000+xgで超遠心分離して、微小胞をペレットにする。
この実施例は、微小胞が本発明の方法によって細胞培養培地から単離される方法を示す。培養細胞を有する培地から微小胞を単離するための方法の概要は、図2および3において示される。要約すると、細胞は、微小胞なしの血清により補足された培地において培養される(血清は、超遠心分離法、ろ過、沈殿などによって微小胞を排除してもよい)。ある期間、細胞を培養した後に、培地を取り出し、コニカルチューブに移し、4℃で10分間、400xgで遠心分離して、細胞をペレットにする。次に、上清を新しいコニカルチューブに移し、4℃で30分間、2000xgで遠心分離して、細胞および細胞デブリをさらに除去する。これに、もう1回の遠心分離法ステップを続けてもよい(たとえば、さらに細胞デブリを排除するおよびより大きな粒子を除去するために、30分間、10000xg)。
正常ドナーヒト骨髄は、AllCells LLC(Emeryville、CA、http://www.allcells.com)から得た。MSCは、標準的なプラスチック付着方法によって単離した。骨髄単核細胞は、メーカーのプロトコール(GE Healthcare Life Sciences、Pittsburgh、PA)に従って、Ficoll-Paque Premium(密度:1.077g/ml)を使用する低密度遠心分離法によって単離した。単核細胞は、界面で収集し、2%FBS(Atlanta Biologics、Atlanta、GA)を補足したリン酸緩衝食塩水(PBS)中で3回洗浄し、アルファ-最小必須培地(α-MEM)(Mediatech Inc.、Manassas、VA)および20% FBS、1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Lonza、Allendale、NJ)、ならびに1%グルタミン(Lonza)からなるMSC培地中に再懸濁した。
およそ6~8mlの血液(ヒトおよびブタ)を静脈穿刺を介して収集し、BD Vacutainer plastic EDTA lavender tube(BD Biosciences、San Jose、CA)の中に置いた。静脈穿刺チューブを室温で30分間、400xgで遠心分離した。血漿を取り出し(およそ3~4ml)、新しい50mlコニカル遠心分離チューブ(Thermo Fisher Scientific Inc、Weston、FL)の中に置いた。滅菌アルファ-最小必須培地(α-MEM)(Mediatech Inc.、Manassas、VA)を1:10(血漿対培地)の比で追加した。
ブタ骨髄を腸骨稜から単離した。皮膚領域は、ポビドンヨード7.5%およびイソプロパノール70%により注意深くきれいにした。11ゲージ3mmトロカール(Ranafac、Avon、MA)を腸骨稜の中に挿入した。骨髄サンプルの凝固を予防するために吸引シリンジに5000~1000ユニットのヘパリンを添加した。およそ20~25mlの骨髄を吸引し、その溶液を50mlコニカル遠心分離チューブに移した。その代わりに、正常ドナーヒト骨髄(およそ50 ml)を、AllCells LLC(Emeryville、CA、http://www.allcells.com)から得た。
およそ500mlの清浄採取ヒト尿を単離し、50mlコニカルチューブ(Thermo Fisher Scientific Inc、Weston、FL)の中に置いた。
骨髄は、吸引液から得(実施例1を参照されたい)、赤血球は、0.1mM EDTA(Stem Cell Technologies、Vancouver、BC)を含有する0.8%塩化アンモニウム溶液を使用して溶解した。有核細胞は、5分間、400Xgでウシ胎児血清(Atlanta Biologics、Atlanta、GA)クッション下でペレットにした。有核細胞は、5分間、400xgでペレットにすることによってMcCoys 5a培地(Mediatech Inc.、Manassas、VA)中で洗浄した。細胞を1×106細胞/mlの密度で培養培地中に再懸濁し、25、75、または225cm2フラスコ(Corning、Corning、NY)中で平板培養した。
微小胞のサンプルは、電子顕微鏡法によって分析した。透過型電子顕微鏡法(TEM)については、微小胞のそれぞれの検体を、20分間、ホルムバールコーティング150メッシュ銅製グリッド(Electron Microscopy Sciences、Fort Washington、PA)上にロードした。グリッドの水気を切り、5分間、数滴の2%グルタルアルデヒド上で浮かせ、次いで、再留水(DDOH)中で洗浄し、その後、数滴の4%水性酢酸ウラニルで染色し、DDOH中で複数回洗浄した。グリッドは、Philips CM10電子顕微鏡において80kVで検査した。
創傷治癒を促進するまたは増強する本発明の微小胞の能力を研究するために、微小胞が皮膚線維芽細胞の増殖を刺激する能力を試験した。正常ヒト成人皮膚線維芽細胞をLife Technology(Carlsbad、CA)から得た。慢性創傷患者線維芽細胞(圧迫性足潰瘍および糖尿病性足潰瘍)を、標準的なケアおよび高度創傷ケア処置にもかかわらず、治癒の証拠を伴わない2年間の継続期間の創傷から、IRBにより承認されたプロトコール(IND# BB IND 13201)下で収集した。正常および慢性創傷線維芽細胞を、24ウェル組織培養プレート(BD Biosciences、San Jose、CA)上で、ウェル当たり5×103細胞で平板培養した。MTT細胞増殖アッセイを0日目および3日目に実行した。微小胞を0日目に追加した。PEG単離微小胞および超遠心単離微小胞の両方は、3日後の両正常および慢性創傷線維芽細胞の増加性の成長において、ほぼ等価であった。リン酸緩衝食塩水(PBS)および微小胞を排除した条件MSC培地は、成長をほとんど示さなかった。図12を参照されたい。
本発明の方法に従って条件培地から単離されたヒトMSC微小胞は、メーカーの説明書(Sigma-Aldrich、St.Louis、MO)に従ってリン脂質細胞リンカー色素PKH-26(赤)により標識した。正常皮膚線維芽細胞は、メーカーの説明書に従ってVybrant-Dio(Life technology)により標識した。正常皮膚線維芽細胞は、フィブロネクチン(Sigma-Aldrich)コーティング4ウェルNunc* Lab-Tek* II Chamber Slides(Thermo Fisher Scientific Inc、Weston、FL)上で平板培養した(ウェル当たり5×103細胞)。細胞は、メーカーの説明書に従って核色素Hoechst 33342(Life technology)により染色した。Dio標識線維芽細胞は、24時間、PKH-26標識微小胞により処置した。画像は、倒立IX81 Olympus顕微鏡およびORCA-AG Hamamatsuデジタルカメラにより撮った。正常皮膚線維芽細胞(緑色脂質膜色素Dioにより染色)は、核周囲の場所における、PEG沈殿によって単離されたPKH-26標識ヒトMSC MVの取込みを実証した。図15および16を参照されたい。図16において、微小胞は、核周囲の場所において見られる。
正常皮膚線維芽細胞を、6ウェル組織培養プレート(BD Biosciences)において1×105細胞/ウェルの密度で平板培養した。線維芽細胞は、一晩、血清を欠乏させ、PBS(コントロール)、10マイクログラムの関節リウマチに罹患している患者から得られた血漿から本発明の方法に従って単離された微小胞(ヒト血漿MV PEG沈殿);骨髄由来間葉系幹細胞により条件付けられた培地から本発明の方法に従って単離された微小胞(ヒトhMSC MV PEG沈殿);骨髄由来間葉系幹細胞により条件付けられた培地から超遠心分離法を介して単離された微小胞(ヒトhMSC MV超遠心分離法);PBSコントロール;および排除培地コントロール(MVを排除したhMSC条件培地)のいずれかにより処置した。線維芽細胞において観察されたSTAT3リン酸化の量は、本発明の方法に従って単離された微小胞においてより多かった。図17を参照されたい。
BRAFは、B-Rafと呼ばれるタンパク質を作製するヒト遺伝子である。ヒト癌に関連するBRAF遺伝子の30を超える突然変異が同定されてきた。発明者らは、転移性黒色腫に関連づけられるBRAFの突然変異形態を増幅するために、PCRプライマーを設計した。突然変異は、BRAFにおけるエクソン15におけるT1799A突然変異である。これは、バリン(V)のコドン600でのグルタミン酸(E)による置換に至る(以降V600Eと称す)。この突然変異の存在は、BRAF阻害剤ベムラフェニブによる処置が必要とされる。
配列1:
フォワード:AGACCTCACAGTAAAAATAGGTGA
リバース:CTGATGGGACCCACTCCATC
増幅産物長:70
配列2:
フォワード:GAAGACCTCACAGTAAAAATAGGTG
リバース:CTGATGGGACCCACTCCATC
増幅産物長:82
ヒトユビキチンCプロモーターの指示下で高感度緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現するホモ接合性トランスジェニックマウス(C57BL/6-Tg(UBC-GFP)30Scha/J)は、Jackson Laboratories(Bar Harbor、Maine)から得た。これらのマウスは、すべての組織においてGFPを発現することが知られている。
全層性創傷は、10mmパンチ生検機器を使用して、ブタの背中に作った。微小胞は、実施例1において記載される方法(「従来の」超遠心分離法による方法」)に従ってまたは実施例3において記載される方法のいずれかによって、自己由来骨髄由来間葉系幹細胞を使用して条件付けた培養培地から単離した。30マイクログラムの微小胞を、創傷時にならびに1日目および2日目に局所的な注射によって創傷に投与した。コントロールは、食塩水により処置したまたは空気への曝露により治癒させた。5日後、動物を安楽死させ、創傷を検査した。
C57/CJ6(GFP-)マウスは、それらの宿主骨髄前駆体を除去するために、2サイクルの400cGyガンマ線照射を致死的に照射した。照射の後に、マウスは、アブレイティブフラクショナルエルビウム:YAGレーザーによりおよそ2cm2のエリアを処置した。レーザー処置の後に、プラスチックチャンバーを皮膚に付着させ、同系GFP+トランスジェニックマウスから得られた骨髄由来細胞をチャンバーに追加した。GFP+骨髄細胞は、新たに摘出した全骨髄細胞、系列ネガティブ選択骨髄細胞、間葉系幹細胞、および骨髄完全培養細胞(本出願において記載される)を含んだ。ほんの少数の動物においてしか、キメラ現象を実現することができず、細胞の投与の4~6週間後に循環GFP+細胞によって検出された。図29を参照されたい。驚いたことに、多くの動物が、ドナー骨髄移植の証拠を伴うことなく、生存した。全体的に(細胞を与えたすべてのグループにおいて)、細胞を受けた30%の動物が生存した。異なるグループの中で、生存率は、系列ネガティブ選択細胞(45%)および新鮮な骨髄細胞(30%)を受けた動物について最も高かった。細胞を受けなかったコントロール照射動物は、100%の死亡率を有した。サイトカインは、同様に致死的に照射された動物を救出せず、これらの生存動物において実証することができた機能的ドナー骨髄移植はなかった。送達された細胞によって分泌される微小胞が、宿主骨髄の回復を担い、これらの動物の生存に至る可能性が高い。発明者らは、新鮮な骨髄(系列ネガティブ細胞を含む)および間葉系幹細胞が、この効果を達成し得る十分な量の微小胞を産生することを実証した。
骨髄穿刺液微小胞の単離:およそ25mlの新鮮な全骨髄を、Allcells, Inc.(Alameda、CA)から得た。骨髄は、新しい50mlコニカル遠心分離チューブに注意深く置き、室温で30分間、400xgで遠心分離した。上清を注意深く取り出し(およそ15ml)、新しい50mlコニカル遠心分離チューブ(Thermo Fisher Scientific Inc、Weston、FL)に置き、4℃で30分間、2000xgで遠心分離した。上清をもう一度注意深く取り出し、新しい50mlコニカル遠心分離チューブに置き、これに、滅菌アルファ-最小必須培地(α-MEM)(Mediatech Inc.、Manassas、VA)を1:10(骨髄上清対培地)の比で追加した。その溶液に、8.5w/v%の、RNアーゼおよびプロテアーゼなしのポリエチレングリコール平均分子量6000(Sigma Aldrich、Saint Louis、MO)ならびに塩化ナトリウム(最終濃度0.4M)を追加した。その溶液を振動させながら一晩、4℃の低温室に置いた。その溶液を30分間、4℃で10000xgで遠心分離した。上清をデカントし、微小胞濃縮ペレットをリン酸緩衝食塩水(PBS)中に再懸濁した。微小胞濃縮溶液をamicon ultra-15遠心フィルターユニット(公称分子量限界100kDa)(Millipore、Billerica、MA)に移し、30分間5000xgで遠心分離した。フィルターユニットをリン酸緩衝食塩水により洗浄し、30分間5000xgでもう一度遠心分離した。濃縮サンプルをフィルターデバイスの底から回収した(およそ200~400μl)。
血管新生アッセイ:血管新生は、内皮管形成アッセイ(Invitrogen Life Technologies、Grand Island、NY)を使用して測定した。凍結保存された初代ヒト臍静脈内皮細胞(HUVEC)(Invitrogen Life Technologies)を、2%低血清成長サプリメント(Invitrogen Life Technologies)を補足したMedium 200PRF中で6日間、75cm2組織培養のフラスコにおいて成長させた。次いで、細胞は、サプリメントなしの培地を含有する24ウェル組織培養プレートにおいて3×104の密度で平板培養した。HUVEC細胞を、骨髄微小胞(およそ100μg)により続いて処置した。PBSは、ビヒクルコントロールとして使用した。処置した細胞を、37℃および5%CO2で6時間インキュベートした。2μg/mlの濃度のカルセインAM蛍光色素を、管形成の可視化のために使用した。蛍光画像は、倒立IX81 Olympus顕微鏡(Olympus America、Center Valley、PA)により撮った。骨髄MVは、ビヒクル(PBS)コントロールと比較して、有意な管形成能力を示した(図31を参照されたい)。
成長アッセイ:正常成人線維芽細胞を、アッセイのために、成長培地(5% FBS、1%グルタミン、1%ペニシリン/ストレプトマイシン)において24ウェルプレート(10000細胞/ウェル)上で平板培養した。一晩のインキュベーションの後に、3つのウェルを無作為に選択し、細胞をNucBlue Live ReadyProbes Reagent(Invitrogen Life technologies)により染色した(0日目)。蛍光画像は、EVOS FL Auto Cell Imaging System(Invitrogen Life technologies)を使用して撮った。線維芽細胞に、骨髄由来微小胞(およそ100μg)またはPBS(ビヒクルコントロール)を含有する新鮮な培地を再供給し、3日後(3日目)に、細胞を染色し、画像化した。骨髄由来微小胞処置線維芽細胞は、数がおよそ3倍(0日目と比較して)およびビヒクルコントロールよりも有意な大きな速度で増加した(図32、パネルAおよび図32、パネルB)。
Claims (18)
- 対象において少なくとも1つの皮膚組織の再生をもたらす、対象の皮膚組織への投与において使用するための医薬組成物であって、
医薬組成物が、バッファー溶液に懸濁された哺乳動物細胞に由来する、RNA、DNA、脂質、炭水化物、代謝物質、タンパク質およびその組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つの分子を含む単離された微小胞の濃縮調製物を含み、
微小胞は、生体液または細胞培養培地からポリエチレングリコール(PEG)沈殿によって単離されており;
微小胞の沈殿は、微小胞の構造的および/または機能的完全性に損傷または影響を与えることはなく、および
微小胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に由来する、
医薬組成物。 - 皮膚創傷が、全層性皮膚創傷である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 皮膚創傷が、第2度熱傷である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 皮膚創傷が、全層性熱傷である、請求項1に記載の医薬組成物。
- 再生される少なくとも1つの皮膚組織が、上皮組織、間質性組織、神経組織、血管組織、および付属器組織からなる群から選択される、請求項1-4のいずれかに記載の医薬組成物。
- 対象において少なくとも1つの皮膚組織の再生をもたらす、対象の皮膚組織への投与において使用するための医薬組成物であって、
医薬組成物が、バッファー溶液に懸濁された哺乳動物細胞に由来する、RNA、DNA、脂質、炭水化物、代謝物質、タンパク質およびその組み合わせからなる群から選択される少なくとも1つの分子を含む単離された微小胞の濃縮調製物を含み、
微小胞は、生体液または細胞培養培地からポリエチレングリコール(PEG)沈殿によって単離されており;
微小胞の沈殿は、微小胞の構造的および/または機能的完全性に損傷または影響を与えることなく;
非増殖性の培養された線維芽細胞に投与されたとき、微小胞が、細胞遊走アッセイにおいて非増殖性の培養された線維芽細胞の遊走を促進し、および
微小胞は、骨髄由来間葉系幹細胞に由来する、
医薬組成物。 - 線維芽細胞が、慢性創傷線維芽細胞である、請求項6に記載の医薬組成物。
- 対象への医薬組成物の投与が、対象の皮膚においてしわ形成または瘢痕形成の低下をもたらす、請求項6または7に記載の医薬組成物。
- 間葉系幹細胞が、起源において自己由来である、請求項6に記載の医薬組成物。
- 間葉系幹細胞が、起源において同種である、請求項6に記載の医薬組成物。
- 組成物が、局所的な投与のために製剤化されている、請求項1-10のいずれかに記載の医薬組成物。
- 組成物が、局所的な注射によって投与される、請求項1-10のいずれかに記載の医薬組成物。
- 微小胞が、サイズにおいて2nm~5000nmの範囲にわたる、請求項1-12のいずれかに記載の医薬組成物。
- 微小胞が、サイズおよび形状において不均一であり、エクトソーム(ectosome)、微粒子、微小胞、ナノ小胞(nanovesicle)、脱粒小胞(shedding vesicle)、アポトーシス小体、および/または膜粒子を含む、請求項1-13のいずれかに記載の医薬組成物。
- 微小胞が、サイズにおいて2nm~200nmの範囲にわたる、請求項1-14のいずれかに記載の医薬組成物。
- 微小胞が、エキソソームマーカー HSP70、CD63、および/またはSTAT3を含む、請求項1-15のいずれかに記載の医薬組成物。
- STAT3がリン酸化されている、請求項16に記載の医薬組成物。
- ポリエチレングリコールの平均分子量が、約6,000Da、約8,000Da、約10,000Daまたは約20,000Daである、請求項1に記載の医薬組成物。
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