ES2935906T3 - Composiciones y métodos tumoricidas y antimicrobianos - Google Patents

Abstract

En el presente documento se proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden componentes tumoricidas y/o antimicrobianos aislados del sobrenadante del medio de células NK-92 y métodos de uso de las composiciones para matar células cancerosas. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Composiciones y métodos tumoricidas y antimicrobianos

Campo de la invención

Esta invención se relaciona en general con composiciones farmacéuticas que tienen propiedades antifúngicas y usos médicos de estas composiciones para matar microbios fúngicos.

Estado de la técnica

El cáncer de piel es el principal tipo de cáncer en humanos, así como en muchos animales domésticos. La aparición de cáncer de piel y melanomas está aumentando significativamente debido a una variedad de factores, incluida la exposición de la piel sin protección a los rayos UV, como los que se encuentran en la luz solar o en las camas de bronceado. Cuando se diagnostican en su etapa incipiente, estos cánceres se pueden tratar fácilmente mediante la escisión del cáncer y el tejido circundante. Sin embargo, como en cualquier procedimiento quirúrgico, existe la posibilidad de que las células cancerosas anómalas puedan quedar retenidas en el sitio de la incisión, provocando así la recurrencia del cáncer. Este es particularmente el caso de los melanomas, y el fallo en extirpar todo el tumor puede resultar en metástasis acompañada de altos niveles de morbilidad.

Existen numerosos protocolos agresivos que se pueden tomar para minimizar el riesgo de recurrencia, incluidos los protocolos terapéuticos convencionales, así como numerosos controles con el médico tratante. A pesar de tales protocolos, los melanomas tienden a ser muy agresivos y se informa que el melanoma tiene una probabilidad de recurrencia del 2 % al 65 % dentro de 5 años, dependiendo de la etapa del cáncer en el momento del tratamiento. Consulte, por ejemplo, www.aimatmelanoma.org/en/aim-for-answers/moving-on-after-treatment/follow-up-bystage.html.

Los animales también son propensos a los cánceres de piel, especialmente melanoma, carcinoma de células escamosas y tumores de mastocitos. Los cánceres de piel son especialmente prevalentes en animales que pasan mucho tiempo al sol.

Las infecciones son un problema común en todo el mundo. Muchas infecciones son causadas por bacterias, hongos y otros microbios. Aunque el tratamiento actual para tales infecciones se basa en gran medida en antibióticos y fármacos antimicrobianos, se ha encontrado que un número creciente de infecciones bacterianas son resistentes al menos a algunos antibióticos. El CDC informa que más de dos millones de estadounidenses se infectan con microbios resistentes a los antibióticos cada año, lo que provoca más de 23,000 muertes. Véase, por ejemplo, www.medicalnewstoday.com/articles/266182.php. Las infecciones de la piel y los tejidos blandos representan el tercer diagnóstico más común en los entornos de atención de emergencia, y se estima que entre el 7 % y el 10 % de todos los pacientes hospitalizados tienen una infección de la piel o los tejidos blandos. Ki y Rotstein, Can. J. Infect. Dis. Med. Microbiol. 2008 marzo; 19(2): 173-184. Otras infecciones comunes incluyen infecciones sistémicas, infecciones respiratorias, infecciones del oído, infecciones gastrointestinales e infecciones del tracto urinario. Las infecciones son igualmente comunes en animales domésticos y pueden ser difíciles de tratar. Las infecciones virales también son comunes y hay pocos tratamientos disponibles para tratar tales infecciones.

El documento US-A-2004/0018183 (Klingemann) describe una línea de células asesinas naturales denominada NK-92 y proporciona un vector para transfectar una célula de mamífero que incluye una secuencia de ácido nucleico que codifica una citoquina que promueve el crecimiento de NK-92. Además, el documento US2004/0018183 describe usos terapéuticos de las células NK-92, incluido el Ejemplo 23 que muestra que las células NK-92 lisan eficazmente las células infectadas por el VIH.

Por consiguiente, sigue existiendo la necesidad de composiciones antitumorales útiles para lisar células cancerosas, especialmente aquellas relacionadas con cánceres dérmicos y subdérmicos. También sigue existiendo la necesidad de nuevas composiciones antimicrobianas útiles en el tratamiento de infecciones.

Sumario de la invención

La invención está definida por las reivindicaciones y se relaciona con composiciones antifúngicas.

En un aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y uno o más exosomas y/o microvesículas aisladas de células NK-92, para usar en un método para tratar una infección fúngica en un paciente.

En otro aspecto, la invención proporciona una composición farmacéutica antifúngica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y uno o más componentes aislados de células NK-92, en donde uno o más componentes comprenden exosomas y/o microvesículas, en donde los exosomas y/o microvesículas son antifúngicos.

Ciertas células del sistema inmunitario tienen actividad citotóxica contra células diana particulares. Las células asesinas naturales (NK), que generalmente representan aproximadamente 10-15 % de los linfocitos circulantes, se enlazan y matan las células diana, incluidas las células infectadas por virus y muchas células malignas, de forma no específica con respecto al antígeno y sin sensibilización inmunitaria previa. Herberman et al., Science 214:24 (1981). La destrucción de las células diana se produce mediante la inducción de la lisis celular. Se ha demostrado que las células NK son eficaces tanto en terapia ex vivo y tratamiento en vivo en pacientes con cáncer avanzado. Sin embargo, las células NK endógenas (es decir, aquellas que se cosechan de un donante o del paciente) siguen siendo difíciles de trabajar y aplicar en inmunoterapia. Es difícil expandir las células NK ex vivo de manera que mantengan sus capacidades de direccionamiento tumoral, tumoricidas y viricidas en vivo, un obstáculo importante para su uso clínico en la inmunoterapia celular adoptiva. Melder, et al., Cancer Research 48:3461-3469 (1988); Stephen et al., Leuk. Lymphoma 377-399 (1992); Rosenberg et al., New Engl. J. Med. 316:889-897 (1987). Además, las preparaciones de células NK endógenas incluyen células T y/u otras células efectoras inmunitarias que deben eliminarse si las células NK se utilizan para tratar a un paciente no relacionado con el donante.

La línea celular NK-92 es una línea celular única que se descubrió para proliferarse en presencia de interleucina 2 (IL-2). Gong et al., Leukemia 8:652-658 (1994). A diferencia de las células NK, NK-92 es una línea celular de cáncer citolítico que se descubrió en la sangre de un sujeto que padecía un linfoma no Hodgkins y luego se inmortalizó ex vivo. Esta línea celular tiene una alta actividad citolítica contra una variedad de cánceres. La línea de células NK-92 es una población de células NK homogénea en lo que se refiere a su actividad de lisis. Los ensayos clínicos de fase I han confirmado su perfil de seguridad y se han observado respuestas antitumorales en ciertos pacientes con cáncer avanzado.

Las células NK endógenas son significativamente diferentes de las células NK-92, en gran parte debido a sus distintos orígenes: NK-92 es una línea celular derivada del cáncer, mientras que las células NK endógenas se extraen de un donante (o del paciente) y se procesan para infundirlas a un paciente. Las preparaciones de células NK endógenas son poblaciones de células heterogéneas, mientras que las células NK-92 son una línea celular clonal que es homogénea en el sentido de que todas exhiben actividad de lisis. Las células NK-92 se proliferan fácilmente en cultivo mientras mantienen la citotoxicidad, mientras que las células NK endógenas no lo hacen.

Las células, incluidas las células NK, liberan una variedad de componentes en el medio en el que crecen. Ejemplos de tales componentes son proteínas, exosomas y microvesículas. Los exosomas son nanovesículas (hasta 100 nm) que son liberadas por una variedad de células normales y tumorales. Las microvesículas son similares a los exosomas pero de mayor tamaño (más de 100 nm). Los exosomas y las microvesículas se pueden detectar y aislar a partir de sobrenadantes de cultivos celulares y de fluidos corporales (por ejemplo, sangre).

Los exosomas aislados del sobrenadante del cultivo celular de células NK endógenas contienen proteínas que incluyen CD56, perforina, FasL y Rab5B. Lugini, et al. J Immunol. (2012) 189, 2833-2842. Sin embargo, los exosomas y otros factores derivados de las células NK endógenas son muy variables, tanto en lo que respecta a la cantidad de exosomas recuperados como a las proteínas contenidas en ellos. Id. en 2839. Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que esta variabilidad surge porque las células NK endógenas se cosechan de donantes individuales, y también porque las células NK endógenas comprenden una población heterogénea de células. Las diferencias en las condiciones, como las condiciones del cultivo celular, métodos de purificación, poblaciones celulares iniciales y las proporciones de los tipos de células en el cultivo, pueden conducir a la variabilidad en la composición y la cantidad de exosomas que se pueden purificar a partir de células NK endógenas. Por ejemplo, ciertas poblaciones celulares dentro de las preparaciones de células NK pueden seleccionarse a favor o en contra mediante el método de purificación y/o las condiciones de cultivo utilizadas.

Los problemas de variabilidad asociados con las células NK endógenas no se aplican a la línea celular NK-92. Debido a que es una línea celular, se pueden cultivar y propagar grandes cantidades de células durante largos períodos de tiempo. Estos cultivos son poblaciones celulares homogéneas que proporcionan preparaciones consistentes y reproducibles de exosomas y/o microvesículas. Los exosomas y/o microvesículas secretadas por las células NK-92 contienen proteínas que se contempla que tienen propiedades tumoricidas, por ejemplo, son citotóxicas y/o citolíticas. Se pueden aislar otros componentes del medio que contiene células NK-92, incluidos componentes con propiedades antimicrobianas, propiedades inmunomoduladoras, etc.

Por otro lado, las células NK-92 son una línea celular cancerosa. Se ha demostrado que algunas células cancerosas liberan exosomas que contienen factores que, en algunas situaciones, contribuyen al crecimiento tumoral, por ejemplo, micro ARN. Muchas células cancerosas liberan exosomas y otros factores que son distintos de los que liberan sus contrapartes no malignas. Por ejemplo, las células NK-92 liberan factores con propiedades antimicrobianas, una característica que no se observa en las células NK endógenas. En una realización, los exosomas y/o microvesículas obtenidos a partir de células NK-92 se incuban en una solución adecuada, como PBS o solución salina isotónica, para extraer dichos factores antes de su uso. Este período de incubación se contempla para reducir o eliminar significativamente aquellos factores que contribuyen al crecimiento del tumor.

La invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden uno o más componentes de exosomas y/o microvesículas obtenidos a partir del sobrenadante del medio de células NK-92. Los componentes son antifúngicos. Los componentes también pueden tener propiedades inmunomoduladoras. En una realización, los exosomas y/o microvesículas son citotóxicos. En una realización, los exosomas y/o microvesículas tienen la capacidad de lisar células cancerosas. En una realización, los exosomas y/o microvesículas son antivirales. En una realización, los exosomas y/o microvesículas son antibacterianos. En una realización, los exosomas y/o microvesículas son inmunomoduladores.

En una realización preferida, la composición farmacéutica no comprende células vivas. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es una composición inyectable. En algunas realizaciones, se contempla que la inyección proporcione actividad inmunomoduladora sistémica.

Se han observado subpoblaciones de células NK-92 en cultivo y se pueden separar. Las subpoblaciones pueden diferir en términos de expresión de marcadores de superficie celular, expresión de proteínas, etc. En una realización de la invención, una o más subpoblaciones de células NK-92 se aíslan antes de obtener uno o más componentes del sobrenadante del medio celular NK-92. El aislamiento de una subpoblación o subpoblaciones definidas permite exosomas y/o microvesículas consistentemente definidos, y en particular exosomas y/o microvesículas que exhiben menos o ninguna propiedad tumoricida.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para uso tópico. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica se formula para aplicarse por vía subdérmica. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende un poloxámero de transición de fase.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es una forma inyectable que comprende un polímero de transición de fase de modo que la composición se inyecta como un líquido y la fase cambia a un gel en el cuerpo (por ejemplo, a temperatura corporal) proporcionando así un depósito de fármaco.

Otro aspecto de la invención proporciona composiciones farmacéuticas que comprenden componentes antifúngicos obtenidos del sobrenadante del medio de células NK-92. En algunas realizaciones, los componentes antifúngicos comprenden componentes tumoricidas. Los componentes antifúngicos son exosomas y/o microvesículas aisladas del sobrenadante. En una realización preferida, los componentes antifúngicos comprenden microvesículas aisladas del sobrenadante.

La divulgación también proporciona métodos para lisar células cancerosas que comprenden administrar a un paciente humano o animal que lo necesite un componente antitumoral o citotóxico aislado del sobrenadante del medio de cultivo de células NK-92. En una realización divulgada, el componente se inyecta en un tumor (por ejemplo, un tumor sólido). En una realización divulgada, el componente se inyecta en el área alrededor o cerca de un tumor. En una realización divulgada, el componente se aplica tópicamente a un tumor (por ejemplo, cáncer de piel). En una realización divulgada, el componente se administra sistémicamente.

En algunas realizaciones divulgadas, el cáncer es un carcinoma, linfoma, sarcoma, melanoma, astrocitoma, células de mesotelioma, carcinoma de ovario, carcinoma de colon, carcinoma de páncreas, carcinoma de esófago, carcinoma de estómago, carcinoma de pulmón, carcinoma urinario, carcinoma de vejiga, cáncer de mama, cáncer gástrico, leucemia, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer del sistema nervioso central, cáncer de ovario, cáncer de cuello uterino, cáncer renal o cáncer de próstata. En una realización preferida, el cáncer es cáncer de piel.

Estos y otros aspectos de la invención y la divulgación se expondrán en detalle a continuación.

Breve descripción de los dibujos

Figura 1 muestra el efecto de las células NK-92 sobre el crecimiento de Cryptococcus neoformans.

Figura 2 muestra los mismos datos que en la figura 1, expresado como un porcentaje de crecimiento de C. neoformans.

Figura 3A es una imagen de una inmunoprecipitación Western que analiza el contenido de proteínas de exosomas/microvesículas (EV/MV) aisladas de células NK-92 bajo una variedad de condiciones de cultivo (carriles 4-7). Las células NK-92 (carril 3) se utilizan como control positivo. Las células MCF-7 (carril 1) y los exosomas (EV, carril 2) son controles positivos para tubulina y/o Rab5B y controles negativos para proteínas citolíticas.

Figura 3B es una imagen de una inmunoprecipitación Western que analiza la presencia de marcadores de membrana nuclear (nucleoporina), mitocondrias (prohibitina) y exosomas (Rab5B) en células NK-92 y preparación de exosomas/microvesículas.

Figura 4 muestra la actividad citolítica de la preparación de exosomas/microvesículas NK-92 frente a células Jurkat en un ensayo de yoduro de propidio.

Descripción detallada de la invención

Definiciones

Antes de divulgar y describir los presentes artículos y métodos, debe entenderse que los aspectos descritos a continuación no se limitan a composiciones, métodos de preparación o usos específicos, ya que tales pueden, por supuesto, variar. También debe entenderse que la terminología utilizada aquí tiene el propósito de describir aspectos particulares únicamente y no pretende ser limitativa.

En esta especificación y en las reivindicaciones que siguen, se hará referencia a una serie de términos que se definirán para tener los siguientes significados:

Debe señalarse que, como se usa en la especificación y las reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un/una", y "el/la" incluyen referentes plurales a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Así, por ejemplo, la referencia a "una citoquina" incluye mezclas de dos o más citoquinas y similares.

"Opcional" u "opcionalmente" significa que el evento o circunstancia descrito posteriormente puede ocurrir o no, y que la descripción incluye instancias donde ocurre el evento o circunstancia e instancias donde no ocurre.

El término "que comprende" pretende significar que las composiciones y métodos incluyen los elementos enumerados, pero sin excluir otros. “Que consiste esencialmente de cuando se usa para definir composiciones y métodos, significará excluir otros elementos de cualquier importancia esencial para la combinación. Por ejemplo, una composición que consta esencialmente de los elementos definidos aquí no excluiría otros elementos que no afecten materialmente a la característica o características básicas y novedosas de la invención reivindicada. "Que consiste en significará excluir más de una cantidad mínima de otros ingredientes y etapas sustanciales del método enumeradas. Las realizaciones definidas por cada uno de estos términos de transición están dentro del alcance de esta invención.

El término "paciente", como se usa aquí, es cualquier organismo vertebrado que incluye, pero no se limita a, pacientes mamíferos tales como humanos, animales de granja, mascotas domesticadas y similares. En una realización preferida, el paciente es un humano.

El término "aproximadamente", cuando se usa antes de un valor numérico, indica que el valor puede variar dentro de un intervalo razonable, como ± 5 %, ± 1 % y ± 0.2 %.

El término "células NK endógenas" se usa para referirse a las células NK derivadas de un donante (o del paciente), a diferencia de la línea celular NK-92. Una célula NK es una célula del sistema inmunitario que mata células diana en ausencia de un estímulo antigénico específico y sin restricción de acuerdo con la clase de MHC. Las células NK endógenas son generalmente poblaciones heterogéneas de células dentro de las cuales se han enriquecido las células NK. Las células NK endógenas pueden estar destinadas al tratamiento autólogo o alogénico de un paciente.

El término "célula NK-92" incluye tanto células NK-92 de tipo salvaje como células NK-92 modificadas. Se encontró que las células NK-92 son más citotóxicas para los tipos de células tumorales e infectadas que las células NK.

El término "célula NK-92 de tipo salvaje" se refiere a una línea de células NK, NK-92, obtenida originalmente de un paciente que tenía linfoma no Hodgkin e inmortalizada ex vivo. Las células NK-92 están disponibles en la American Type Culture Collection con el número de depósito CRL-2407 y se describen, por ejemplo, en la Patente de los Estados Unidos 7,618,817.

El término "célula NK-92 modificada" se refiere a una célula NK-92 que se ha tratado adicionalmente para dotarla de propiedades que no se encuentran en la célula NK-92 de tipo salvaje de la que se deriva. Dichos tratamientos incluyen, por ejemplo, tratamientos físicos, tratamientos químicos y/o biológicos y similares. Los tratamientos confieren propiedades a las células NK-92 modificadas que las hacen más ventajosas para los fines deseados. Se describen ejemplos de células NK-92 modificadas en, por ejemplo, Patentes de Estados Unidos 7,618,817; 8,034,332; y 8,313,943.

El término "vesícula extracelular" abarca tanto los exosomas como microvesículas, así como cualquier otra vesícula secretada por una célula (por ejemplo, una célula NK-92) en el medio. Generalmente, los exosomas son nanosomas que tienen menos de aproximadamente 100 nanómetros (nm) de diámetro. Las microvesículas tienen un diámetro de aproximadamente 100 nm o mayor.

Como se usa para describir la presente divulgación, "cáncer", "tumor" y "malignidad" se relacionan todos de manera equivalente a una hiperplasia de un tejido u órgano. Si el tejido forma parte del sistema linfático o inmunitario, las células malignas pueden incluir tumores no sólidos de células circulantes. Las malignidades de otros tejidos u órganos pueden producir tumores sólidos. En general, los métodos pueden usarse en el tratamiento de células linfáticas, células inmunitarias circulantes y tumores sólidos.

El término "componente tumoricida" se refiere a componentes que tratan tumores cancerosos y/o células cancerosas. El tratamiento de tumores abarca reducir o eliminar el tumor, matar células cancerosas y/o inhibir el crecimiento, proliferación y/o metástasis de células cancerosas. Preferiblemente, las células tumorales se destruyen, por ejemplo, mediante citólisis.

El término "componente antimicrobiano" se refiere a componentes que tratan o previenen la infección por microbios. Los microbios incluyen bacterias, hongos, mohos, virus, etc. En consecuencia, antimicrobiano también se refiere a componentes antivirales, componentes antibacterianos, componentes antifúngicos y similares.

Como se usan para describir la presente invención, los términos "citotóxico" y "citolítico", cuando se usan para describir la actividad de células efectoras tales como células NK, pretenden ser sinónimos. En general, la actividad citotóxica se relaciona con la destrucción de células diana por cualquiera de una variedad de mecanismos biológicos, bioquímicos o biofísicos. La citólisis se refiere más específicamente a la actividad en la que el efector lisa la membrana plasmática de la célula diana, destruyendo así su integridad física. Esto da como resultado la destrucción de la célula diana. Sin desear limitarse a ninguna teoría, se cree que el efecto citotóxico de las células NK se debe a la citólisis.

El término "medio de crecimiento" o "medio" como se usa aquí pretende ser sinónimo. En general, los términos se refieren a cualquier medio o solución acuosa en el que las células NK-92 puedan crecer o colocarse y en el que las células NK-92 liberen exosomas, microvesículas y/u otros componentes activos. El medio puede comprender medios de crecimiento (por ejemplo, medio comercialmente disponible) comoX-VIVO 10 o RPMI. Alternativamente, el medio puede comprender PBS u otra solución acuosa.

Como se usa aquí, "tratamiento", "tratando" y "tratar" se definen como actuar sobre una enfermedad, trastorno o afección con un agente para reducir o mejorar los efectos nocivos o cualquier otro efecto no deseado de la enfermedad, trastorno o afección y/o sus síntomas. "Tratamiento", como se usa aquí, cubre el tratamiento de un paciente e incluye: (a) reducir el riesgo de ocurrencia de la afección en un paciente que se determina que está predispuesto a la afección pero que aún no se le ha diagnosticado la afección, (b) impedir el desarrollo de la afección y/o (c) aliviar la afección, es decir, provocar la regresión de la afección y/o aliviar uno o más síntomas de la afección. "Tratando" o "tratar una afección o un paciente" se refiere a tomar medidas para obtener resultados beneficiosos o deseados, incluidos resultados clínicos como la reducción de los síntomas. Para los fines de esta divulgación, los resultados clínicos beneficiosos o deseados incluyen, pero no se limitan a: reducir el tamaño o el potencial metastásico de un tumor; matar células tumorales; o reducir la gravedad de la infección por un agente infeccioso (microbio), por ejemplo, reducir uno o más síntomas, reducir la duración de la infección, etc.

Componentes aislados del sobrenadante de un medio de células NK-92

Las células NK-92 se pueden expandir, modificar y/o mantener en medio de cultivo. Puede usarse cualquier condición de cultivo aceptable. En una realización, las células NK-92 se cultivan en medio esencial mínimo alfa-enriquecido (MEM; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.) complementado con suero de ternero fetal (por ejemplo, al 12.5 %; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.), y/o suero de caballo (por ejemplo, al 12.5 %; Sigma Chemical Co., St. Louis, Mo.). En otra realización, las células NK-92 se cultivan en medio XVivo 10 suplementado con suero humano, plasma humano o albúmina de suero humano (por ejemplo, al 5 %). En una realización preferida, el suero, plasma o albúmina sérica se agotan en exosomas antes del cultivo de las células NK-92.

El medio se complementa opcionalmente con otros nutrientes, citoquinas y/o factores de crecimiento, por ejemplo, interleucina 2 (IL-2), L-asparagina, L-glutamina y/o L-serina. Las células NK-92, cuando están en el medio, pueden liberar componentes tales como proteínas (por ejemplo, citoquinas), microvesículas y/o exosomas al medio. Después de aislar las células del medio, por ejemplo, mediante centrifugación, los componentes liberados de las células permanecen en el sobrenadante.

Otro medio adecuado empleado incluye medio X-VIVO 10, AB de suero humano al 5 %, L-asparagina 36 pM, L-glutamina 450 pM, L-serina 324 pM y 500 UI de IL-2.

En algunas realizaciones, el medio es un medio sin suero, PBS u otra solución acuosa, por ejemplo, solución de Ringer, solución de dextrosa, solución de Hank y otras soluciones salinas acuosas fisiológicamente equilibradas. Sin estar ligado a la teoría, algunos componentes del medio de crecimiento (por ejemplo, suero) pueden contener exosomas, microvesículas y/u otros componentes que no están relacionados con las células NK-92. En consecuencia, puede ser beneficioso mantener las células NK-92 en un medio sin suero u otra solución acuosa durante un período de tiempo antes de aislar exosomas, microvesículas u otros componentes del medio. Alternativamente, las células NK-92 pueden cultivarse en suero con exosomas agotadas, o suero sin exosomas o un suero alternativo.

En algunas realizaciones, se añaden al medio uno o más agentes estimulantes. Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que la estimulación de las células NK-92 con dichos agentes puede dar como resultado una liberación de componentes más constante, robusta y/o reproducible, incluidos exosomas y/o microvesículas. Los agentes estimulantes incluyen, por ejemplo, citoquinas o estimuladores farmacéuticos. En una realización, el agente estimulador es IL-15. En una realización, el agente estimulador es interferón gamma.

En algunas realizaciones, el uno o más componentes tumoricidas y/o antimicrobianos comprenden exosomas aislados del sobrenadante. En algunas realizaciones, uno o más componentes tumoricidas y/o antimicrobianos comprenden microvesículas aisladas del sobrenadante. En algunas realizaciones, el uno o más componentes tumoricidas y/o antimicrobianos comprenden exosomas y microvesículas aisladas del sobrenadante.

Los exosomas son nanovesículas excretadas por las células, que tienen un diámetro de hasta unos 100 nm. En algunas realizaciones, tienen un diámetro de aproximadamente 30 a aproximadamente 100 nm. Las microvesículas son no celulares y tienen un diámetro mayor de aproximadamente 100 nm y preferiblemente menores de aproximadamente 1.5 micrómetros.

Los exosomas y/o microvesículas pueden aislarse del medio mediante varios métodos. Un método es por ultracentrifugación. Otros métodos incluyen kits de aislamiento de exosomas disponibles comercialmente (por ejemplo, kit de aislamiento de exosomas totales [Life Technologies], Exo-spin™ Kit de purificación de exosomas [Cell Guidance Systems], o PureExo® Kit de aislamiento de exosomas [101 Bio]); instrumentos disponibles comercialmente, como Dynabeads® Sistema de purificación específico de CD63 humano o Dynabeads® sistema de purificación de estreptavidina (disponible de Life Technologies Corporation); filtración; o métodos de centrifugación diferencial (por ejemplo, los descritos en S. Rani et al, Methods Mol Biol, 784: 181-95 (2011)). La presencia, tamaño y pureza, etc. de exosomas y/o microvesículas se pueden caracterizar mediante métodos, como inmunoprecipitación Western, microscopía electrónica de transmisión, citometría de flujo, microscopía de fuerza atómica, análisis de seguimiento de nanopartículas, microespectroscopía Raman, detección de pulso resistivo y microscopía de transmisión por electrones.

En algunas realizaciones, las células NK-92 comprenden células NK-92 de tipo salvaje.

En algunas realizaciones, las células NK-92 comprenden células NK-92 modificadas. Las células NK-92 se pueden modificar mediante métodos conocidos en la técnica, como los descritos en la Patente de Estados Unidos 7,618,817. Por ejemplo, las células NK-92 pueden modificarse para expresar un receptor Fc sobre una superficie de la célula. El receptor Fc puede ser un receptor F^cy activador, CD 16 (FcyRIII-A), FCyRI (^c D64), FCyRIl (CD32), FC^yRIII, FcRn, Fca y Fc£, etc. Los receptores Fc pueden tener cualquier afinidad de enlace por sus ligandos, o fragmentos de sus ligandos, incluidas las formas de afinidad de enlace alta y baja. Las células NK-92 pueden modificarse adicionalmente para expresar uno o más polipéptidos asociados accesorios de señalización, como FceRI-y o TCR-Z, citoquinas o fragmentos de los mismos.

En algunas realizaciones, las células NK-92 comprenden células NK-92 modificadas para expresar receptores Fc. En algunas realizaciones, las células NK-92 comprenden células NK-92 modificadas para expresar FcyRIII-A, FCyRI, FCyRIl, FCyRIll, FcRn, Fca o Fc£, o una combinación de los mismos. En algunas realizaciones, las células NK-92 comprenden células NK-92 modificadas para expresar uno o más receptores de antígenos quiméricos. En algunas realizaciones, las células NK-92 comprenden células NK-92 modificadas disponibles de la American Type Culture Collection con el número de depósito PTA-8836, PTA-6967, PTA-8837 o PTA-6672, o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, las células NK-92 comprenden NK-92-CD16, NK-92-CD16-y o NK-92-CD16-Z, o una combinación de las mismas.

En algunas realizaciones, las células NK-92 comprenden células NK-92 modificadas para expresar una citoquina. En algunas realizaciones, las células NK-92 comprenden células NK-92 modificadas para expresar una citoquina que promueve el crecimiento de las células y/o un receptor de citoquina. En algunas realizaciones, las células NK-92 comprenden células NK-92 modificadas para expresar lL-2 y/o receptor de lL-2. En algunas realizaciones, las células NK-92 comprenden células NK-92 modificadas para expresar lL-15, lL-18 o lL-21, o un receptor de las mismas. En algunas realizaciones, las células NK-92 comprenden células NK-92 modificadas disponibles de la American Type Culture Collection con el número de depósito c RL-2408 o CRL-2409, o una combinación de las mismas. En algunas realizaciones, las células NK-92 comprenden NK-92MI, NK-92CI o una combinación de las mismas.

Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que los exosomas y/o microvesículas de las células NK-92 modificadas serán distintos de los de las células NK-92 de tipo salvaje. Por ejemplo, los exosomas y/o microvesículas de células NK-92 modificadas pueden contener diferentes receptores y/u otras proteínas (por ejemplo, enzimas citolíticas), en función de la modificación o modificaciones de las células. Los exosomas y/o microvesículas de células NK-92 modificadas también pueden contener diferentes cantidades o cantidades relativas de algunos receptores y/u otras proteínas.

Composiciones farmacéuticas

La divulgación divulga una composición farmacéutica útil para matar células cancerosas en un animal de sangre caliente, cuya composición comprende un portador farmacéuticamente aceptable y uno o más componentes aislados del sobrenadante de un medio de crecimiento de células NK-92.

La invención proporciona una composición farmacéutica antifúngica, según se reivindica.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es líquida a temperatura ambiente y un gel cuando se aplica al paciente. En algunas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable comprende un poloxámero.

En otro aspecto, se proporciona una composición farmacéutica que comprende exosomas y/o microvesículas aisladas del sobrenadante de un medio de cultivo de células NK-92 y un portador acuoso estéril.

En otro aspecto descrito, se proporciona un kit que comprende una primera composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y exosomas y/o microvesículas aisladas del sobrenadante de un medio de crecimiento de células NK-92, y una segunda composición farmacéutica que comprende un gel, en donde la primera composición farmacéutica y la segunda composición farmacéutica son formulaciones tópicas. En algunas realizaciones, la segunda composición farmacéutica es un poloxámero. En algunas realizaciones, la segunda composición farmacéutica comprende exosomas y/o microvesículas aisladas del sobrenadante de un medio de cultivo de células NK-92. En una realización preferida, el primer y/o segundo componente farmacéutico comprende microvesículas.

En algunas realizaciones, la primera composición farmacéutica comprende un líquido y la segunda composición farmacéutica comprende un gel, poloxámero o una composición que es un líquido a temperatura ambiente y un gel a temperatura corporal. El líquido se aplica primero en el área de tratamiento y el gel se aplica sobre el líquido. Sin estar ligado a ninguna teoría, se cree que la formulación líquida proporciona un tratamiento rápido del área, mientras que el gel mantiene el líquido en el sitio de aplicación. En algunas realizaciones, el gel comprende exosomas y/o microvesículas aisladas del sobrenadante de un medio de cultivo de células NK-92 y un portador acuoso estéril. Sin estar ligado a la teoría, se cree que el gel proporcionará una liberación más lenta de exosomas y/o microvesículas al área de tratamiento, proporcionando así una liberación sostenida y un tratamiento del área afectada.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica comprende además una o más citoquinas.

El componente o componentes tumoricidas y/o antimicrobianos descritos pueden administrarse junto con una citoquina como IFN-^y, TGF-p, IL-4, IL-10, IL-13, IL-2, etc., para mantener la eficacia funcional de la composición que comprende el componente o componentes tumoricidas y/o antimicrobianos. El término "junto" indica que la citoquina puede administrarse poco antes de la administración de la composición que comprende el componente, o puede administrarse simultáneamente con la composición que comprende el componente, o poco después de que se haya administrado la composición que comprende el componente tumoricida. La citoquina también se puede administrar en dos de esos momentos, o en los tres momentos con respecto al momento de administrar la composición que comprende el componente tumoricida. En algunas realizaciones, la citoquina y el componente se administran en una única composición.

En algunas realizaciones, la una o más citoquinas incluyen al menos IL-2.

La composición farmacéutica puede estar en una variedad de formulaciones adecuadas para la administración oral, tópica, transdérmica, rectal, por inhalación o parenteral (intravenosa, intramuscular o intraperitoneal) y similares. La composición farmacéutica puede estar en una formulación adecuada para inyección en un tumor o en o alrededor del sitio del tumor. En una realización, la composición farmacéutica se inyecta o aplica en el sitio del tumor después de la cirugía para extirpar todo o la mayor parte del tumor.

Como se usa aquí, "portador farmacéuticamente aceptable" o "excipiente farmacéuticamente aceptable" incluye todos y cada uno de los disolventes, agentes o medios dispersivos, recubrimiento o recubrimientos, agentes antimicrobianos, agentes iso/hipo/hipertónicos, agentes modificadores de la absorción y similares, adecuados para uso farmacéutico y compatible con los componentes tumoricidas y/o antimicrobianos. Además, también se pueden incorporar a la composición final otros o ingredientes activos complementarios.

Las composiciones farmacéuticas descritas aquí se pueden administrar de varias formas dependiendo de si se desea un tratamiento local o sistémico y sobre el área a tratar. En un aspecto, la administración puede ser por inyección, donde la composición se formula en un líquido o gel. En otros aspectos, la composición puede formularse para aplicarse internamente a un paciente. En otros aspectos, la composición se puede aplicar por vía tópica (incluyendo por vía oftálmica, vaginal, rectal, intranasal, oral o directamente sobre la piel). Por ejemplo, una composición tópica que comprende exosomas y/o microvesículas se puede aplicar a cualquier tumor o infección accesible, por ejemplo, un tumor de piel u otro tumor (por ejemplo, sarcoma de Kaposi); una infección viral (por ejemplo, verrugas, verrugas genitales, herpes); o una infección bacteriana.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es una formulación inyectable.

La composición farmacéutica se puede administrar por vía parenteral, por ejemplo, por vía intravenosa, intramuscular, intravenosa, subcutánea o interperitónica. La composición se puede inyectar sistémica o localmente en o cerca del sitio de un cáncer. Se puede administrar una dosis única intravenosa o intraperitoneal. Alternativamente, se puede utilizar una infusión lenta a largo plazo o múltiples infusiones diarias a corto plazo, que normalmente duran de 1 a 8 días. También se pueden utilizar días alternos o dosificación una vez cada varios días.

Las composiciones inyectables estériles se preparan incorporando los componentes tumoricidas y/o antimicrobianos en una cantidad adecuada en un portador apropiado. Los portadores adecuados incluyen portadores acuosos, como agua y regulador acuoso (por ejemplo, solución salina regulada con fosfato (PBS), regulador de citrato, etc.), disolventes orgánicos solubles en agua (por ejemplo, polietilenglicol 300, polietilenglicol 400, etanol, propilenglicol, glicerina, N-metil-2-pirrolidona, dimetilacetamida y dimetilsulfóxido), líquidos/semisólidos orgánicos (cera de abejas, d-tocoferol, ácido oleico, monoglicéridos y diglicéridos de cadena media), tensioactivos no iónicos (aceites de ricino polietoxilados (por ejemplo, Cremophor EL, Cremophor RH 40, Cremophor RH 60), polisorbato 20, polisorbato 80, poloxámero 188, poloxámero 407, d-tocoferol polietilenglicol 1000 succinato, polietilenglicol (15)-hidroxiestearato, monooleato de sorbitán, oleoil polioxil-6 glicéridos, linoleoil polioxil-6 glicéridos, caprilocaproil polioxil-8 glicéridos, Gellucire® 44/14, Softigen® 767, y mono y diésteres de ácidos grasos de PEG 300, 400 o 1750, etc.), un lípido (por ejemplo, aceite de ricino, aceite de maíz, aceite de semilla de algodón, aceite de oliva, aceite de maní, aceite de menta, aceite de cártamo, aceite de sésamo, aceite de semilla de soja, aceites vegetales hidrogenados, aceite de semilla de soja hidrogenado y triglicéridos de cadena media de aceite de coco y aceite de semilla de palma), ciclodextrina (como a-ciclodextrina, p-ciclodextrina y yciclodextrina, hidroxipropil-ciclodextrina, y sulfobutiléter- -ciclodextrina), y fosfolípidos (por ejemplo, fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina, fosfatidilserina, diestearoilfosfatidilglicerol, 1 -dimiristoilfosfatidilcolina, 1-dimiristoilfosfatidilglicerol, etc.), o una mezcla de los mismos. En algunas realizaciones, el portador acuoso comprende ácido hialurónico, solución salina, solución de Ringer, solución de dextrosa, solución de Hank y otras soluciones salinas acuosas fisiológicamente equilibradas. En algunas realizaciones, el portador no acuoso comprende aceites fijos, aceites vegetales como aceite de oliva y aceite de sésamo, triglicéridos, propilenglicol, polietilenglicol o ésteres orgánicos inyectables como oleato de etilo. En algunas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable comprende además un agente potenciador de la viscosidad, como carboximetilcelulosa o sus sales, sorbitol o dextrano; una sustancia que potencia la isotonicidad y estabilidad química, como el regulador de fosfato, regulador de bicarbonato y regulador Tris; un conservante tal como timerosal, cresoles, formalina y alcohol bencílico.

Las composiciones inyectables pueden estar en solución o suspensión, pero deben poder pasar fácilmente a través de un dispositivo de inyección tal como una aguja hueca. Se puede lograr y mantener una viscosidad adecuada mediante la elección adecuada de disolventes o excipientes. En algunas realizaciones, el portador farmacéuticamente aceptable comprende agentes potenciadores de viscosidad. En algunas realizaciones, la composición tiene una viscosidad de entre aproximadamente 5 centipoises (cP) y aproximadamente 1 * 106 cP, o aproximadamente 5 cP a aproximadamente 1 * 105 cP, o aproximadamente 5 cP a aproximadamente 1 * 104 cP, o aproximadamente 5 cP a aproximadamente 1 * 103 cP, o aproximadamente 6 cP a aproximadamente 100 cP a 25 ° C.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es una formulación inyectable de liberación prolongada. Los componentes tumoricidas y/o antimicrobianos en la formulación de liberación prolongada pueden liberarse de la composición al cuerpo durante un período de tiempo prolongado, como más de al menos varios minutos, al menos una hora, al menos varias horas, al menos un día, al menos varios días, o en semanas, etc. para proporcionar un efecto terapéutico a largo plazo y/o continuo.

En algunas realizaciones, la composición comprende un agente de localización que permite la retención localizada de la composición cuando se administra al sitio de un tumor o cerca del mismo, opcionalmente para la liberación prolongada y/o continua del componente tumoricida y/o antimicrobiano en la composición. Dichos agentes incluyen agentes tixotrópicos, agentes de cambio de fase, tales como hidrogel, polímero bioerosionable, biocompatible y geles de colágeno, y similares. Estas composiciones están en forma inyectable o líquida en condiciones ambientales y forman una masa bioerosionable o biodegradable viscosa o tipo gel después de la aplicación que limita el transporte lejos del sitio de administración y permite la difusión del componente tumoricida y/o antimicrobiano desde la composición.

Los hidrogeles útiles en las composiciones pueden ser hidrogeles entrecruzados química y/o físicamente. El entrecruzamiento químico se obtiene, por ejemplo, a través de polimerización por adición fotoiniciada, redoxiniciada o de tipo Michael que preferiblemente implica la formación de enlaces covalentes. Los hidrogeles entrecruzados físicamente se autoensamblan bajo estímulos externos y no dependen de la formación de enlaces covalentes. La temperatura, pH, concentración de iones e interacciones hidrófobas son algunos de los estímulos externos útiles para tal autoensamblaje y para la inmovilización de tales hidrogeles.

Los polímeros de ejemplo adecuados para uso en las composiciones incluyen poliláctidos, poliglicólidos, poli(caprolactona), polianhídridos, poliaminas, poliesteramidas, poliortoésteres, polidioxanonas, poliacetales, policetales, policarbonatos, polifosfoésteres, poliortocarbonatos, polifosfacenos, succinatos, poli(ácido málico), poli (aminoácidos), polivinilpirrolidona, polietilenglicol, polihidroxicelulosa, polifosfoésteres, polisacáridos, quitina, quitosano, ácido hialurónico y copolímeros, tales como poloxámeros, terpolímeros y mezclas de los mismos.

En algunas realizaciones, el agente de localización es un poloxámero. El poloxámero es un copolímero tribloque no iónico compuesto por una cadena hidrófoba central de polioxipropileno {por ejemplo, (poli(óxido de propileno)) flanqueada por dos cadenas hidrófilas de polioxietileno {por ejemplo, poli(óxido de etileno)). En un aspecto, el poloxámero tiene la fórmula

HO(C2H4O)b(C3H6O)a(C2H4O)bOH

en donde a es de 10 a 100, 20 a 80, 25 a 70, o 25 a 70, o de 50 a 70; b es de 5 a 250, 10 a 225, 20 a 200, 50 a 200, 100 a 200 o 150 a 200. En otro aspecto, el poloxámero tiene un peso molecular de 2,000 a 15,000, de 3,000 a 14,000 o 4,000 a 12,000. Los poloxámeros útiles aquí se venden bajo el nombre comercial Pluronic fabricado por BASF. Los ejemplos no limitantes de poloxámeros útiles aquí incluyen, pero no se limitan a, Pluronic® F68, P103, p 105, P123, F127 y L121. A concentraciones adecuadas, como 10 %-30 % p/p de poloxámero, una solución de poloxámero es un líquido a temperatura ambiente y forma un gel blando en el cuerpo.

Los colágenos adecuados incluyen, por ejemplo, tratamiento alcalino de colágeno insoluble extraído de diversos animales, o tratamiento con enzimas como pepsina, tripsina, quimotripsina, papina o pronasa. El colágeno se puede obtener de la piel, hueso, cartílago, tendón u órganos, etc. de aves o mamíferos. El colágeno puede ser flexible después del curado y requiere solo un corto tiempo para el entrecruzamiento, en otras palabras, requiere solo un corto tiempo para la gelificación. La solución de colágeno también se puede preparar disolviendo el colágeno en un disolvente no tóxico, entre los cuales se incluyen agua, solución salina fisiológica, un regulador como el regulador de borato o una solución acuosa que contiene una sal como cloruro de sodio, bromuro de sodio y bromuro de potasio o proteína, azúcar o lípido, etc.

El colágeno también puede formar un gel incluso en presencia de humedad como la de la sangre o tumor, y puede demostrar un alto grado de adhesividad con respecto al tejido corporal vivo. Las soluciones de colágeno utilizadas en la presente invención se pueden preparar a diversas concentraciones, neutralizar y preparar para inyección. En diversas realizaciones, la concentración de colágeno en la composición puede ser de 0.2 mg/mL, 0.5 mg/mL, 0.75 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL, 5 mg/mL, 6 mg/mL, 7 mg/mL, 8 mg/mL, 10 mg/mL, 20 mg/mL, 30 mg/mL, 40 mg/mL y 50 mg/mL, o cualquier intervalo entre dos de los números. Tras la inyección en un órgano, los geles de colágeno enfriados pueden termogelificarse a medida que alcanzan la temperatura corporal o aproximadamente 37 ° C.

En algunas realizaciones, la composición farmacéutica proporciona una liberación prolongada, sostenida y/o continua del componente o componentes tumoricidas y/o antimicrobianos de la composición.

La esterilización de la composición se puede realizar mediante procedimientos conocidos, como la filtración.

La forma final debe ser estable bajo las condiciones de fabricación y almacenamiento. Además, la forma farmacéutica final debe estar protegida contra la contaminación y, por lo tanto, debe poder inhibir el crecimiento de microorganismos tales como bacterias u hongos.

La prevención o inhibición del crecimiento de microorganismos puede lograrse mediante la adición de uno o más agentes antimicrobianos tales como clorobutanol, ácido ascórbico, parabenos, timerosal o similares. También puede ser preferible incluir agentes que alteren la tonicidad como azúcares o sales.

La composición farmacéutica también se puede preparar como un polvo estéril. El polvo estéril que comprende los componentes tumoricidas y/o antimicrobianos se puede preparar mediante métodos que incluyen secado bajo vacío o liofilización de una composición líquida, tal como una composición que comprende un portador acuoso. El polvo estéril se puede reconstituir con una cantidad adecuada de un portador acuoso, como PBS, para proporcionar una composición inyectable para administrar a un paciente.

En algunas realizaciones descritas, las composiciones se formulan como una composición tópica aplicada directamente sobre la piel para tratar un cáncer de piel. En algunas realizaciones, las composiciones se formulan como una composición tópica aplicada directamente a otros cánceres accesibles, por ejemplo, cáncer de cuello uterino o cáncer oral. En algunas realizaciones, la composición tópica se aplica a células infectadas por virus, por ejemplo, una verruga. En algunas realizaciones, la verruga es una verruga genital (venérea). En algunas realizaciones, la verruga es una verruga común, una verruga plana, una verruga filiforme/digitada, una verruga en mosaico, una verruga periungal o una verruga plantar.

Las formulaciones para administración tópica pueden incluir emulsiones, cremas, soluciones acuosas, aceites, ungüentos, pastas, geles, lociones, leches, espumas, suspensiones y polvos. En algunas realizaciones, la composición farmacéutica es una crema o loción. En un aspecto, la composición tópica puede incluir uno o más tensioactivos y/o emulsionantes. En una realización, el emulsionante no altera la estructura de los exosomas y/o microvesículas. En una realización, el emulsionante altera la estructura de los exosomas y/o microvesículas. Por ejemplo, el emulsionante puede destruir la estructura del exosoma y/o microvesículas, liberando así factores activos dentro de los exosomas y/o microvesículas.

Los tensioactivos (o sustancias con actividad de superficie) que pueden estar presentes son tensioactivos aniónicos, no iónicos, catiónicos y/o anfóteros. Los ejemplos típicos de tensioactivos aniónicos incluyen, pero no se limitan a, jabones, alquilbencenosulfonatos, alcanosulfonatos, olefinasulfonatos, alquil éter sulfonatos, glicerol éter sulfonatos, a-metil éster sulfonatos, sulfoácidos grasos, alquil sulfatos, alcoholes grasos éter sulfatos, glicerol éter sulfatos, éter sulfatos de ácidos grasos, hidroxi éter sulfatos mixtos, monoglicéridos (éter) sulfatos, amidas de ácidos grasos (éter) sulfatos, mono y dialquil sulfosuccinatos, mono y dialquil sulfosuccinamatos, sulfotriglicéridos, jabones de amida, ácidos éter carboxílicos y sales de los mismos, isetionatos de ácidos grasos, sarcosinatos de ácidos grasos, tauridas de ácidos grasos, N-acilaminoácidos, por ejemplo, lactilatos de acilo, tartratos de acilo, glutamatos de acilo y aspartatos de acilo, sulfatos de oligoglucósidos de alquilo, condensados de ácidos grasos de proteínas (en particular, productos vegetales a base de trigo) y fosfatos de alquilo (éter). Ejemplos de tensioactivos no iónicos incluyen, pero no se limitan a, éteres de poliglicol de alcohol graso, éteres de alquilfenol poliglicol, ésteres de poliglicol de ácido graso, éteres de poliglicol de amida de ácido graso, éteres de poliglicol de amina grasa, triglicéridos alcoxilados, éteres mixtos o formas mixtas, de manera opcional alqu(en)iloligoglucósidos parcialmente oxidados o derivados del ácido glucorónico, N-alquilglucamidas de ácidos grasos, hidrolizados de proteínas (en particular productos vegetales a base de trigo), ésteres de ácidos grasos de poliol, ésteres de azúcar, ésteres de sorbitán, polisorbatos y óxidos de amina. Los ejemplos de tensioactivos anfóteros o zwitteriónicos incluyen, pero no son limitados a, alquilbetaínas, alquilamidobetaínas, aminopropionatos, aminoglicinatos, imidazoliniobetaínas y sulfobetaínas.

En algunas realizaciones, el tensioactivo puede ser sulfatos de éter de poliglicol de alcohol graso, sulfatos de monoglicérido, sulfosuccinatos de mono y/o dialquilo, isetionatos de ácidos grasos, sarcosinatos de ácidos grasos, tauridas de ácidos grasos, glutamatos de ácidos grasos, alfa-olefinsulfonatos, ácidos éter carboxílicos, alquil oligoglucósidos, glucamidas de ácidos grasos, alquilamidobetaínas, anfoacetales y/o condensados de ácidos grasos de proteínas.

Los ejemplos de tensioactivos zwitteriónicos incluyen betaínas, como glicinatos de N-alquil-N,N-dimetilamonio, por ejemplo glicinato de cocoalquildimetilamonio, glicinatos de N-acilaminopropil-N,N-dimetilamonio, por ejemplo glicinato de cocoacilaminopropildimetilamonio y 2-alquil-3-carboximetil-3-hidroxietilimidazolina que tienen en cada caso de 8 a 18 átomos de carbono en el grupo alquilo o acilo, y glicinato de cocoacilaminoetilhidroxietil-carboximetilo.

En algunas realizaciones, el emulsionante puede ser un tensioactivo no ionogénico seleccionado entre los siguientes: los productos de adición de 2 a 30 moles de óxido de etileno y/o de 0 a 5 moles de óxido de propileno sobre alcoholes grasos lineales que tienen de 8 a 22 átomos de carbono, sobre ácidos grasos que tienen de 12 a 22 átomos de carbono, sobre alquilfenoles que tienen de 8 a 15 átomos de carbono en el grupo alquilo, o sobre alquilaminas que tienen de 8 a 22 átomos de carbono en el radical alquilo; oligoglicósidos de alquilo y/o alquenilo que tienen de 8 a 22 átomos de carbono en el radical alqu(en)ilo y sus análogos etoxilados; los productos de adición de 1 a 15 moles de óxido de etileno sobre aceite de ricino y/o aceite de ricino hidrogenado; los productos de adición de 15 a 60 moles de óxido de etileno sobre aceite de ricino y/o aceite de ricino hidrogenado; ésteres parciales de glicerol y/o sorbitán con ácidos grasos insaturados, lineales o saturados, ramificados que tienen de 12 a 22 átomos de carbono y/o ácidos hidroxicarboxílicos que tienen de 3 a 18 átomos de carbono, y sus aductos con 1 a 30 moles de óxido de etileno; ésteres parciales de poliglicerol (grado promedio de autocondensación de 2 a 8), trimetilolpropano, pentaeritritol, alcoholes de azúcar (por ejemplo, sorbitol), glucósidos de alquilo (por ejemplo, glucósido de metilo, glucósido de butilo, glucósido de laurilo) y poliglucósidos (por ejemplo, celulosa) con ácidos grasos saturados y/o insaturados, lineales o ramificados que tienen de 12 a 22 átomos de carbono y/o ácidos hidroxicarboxílicos que tienen de 3 a 18 átomos de carbono, y sus aductos con 1 a 30 moles de óxido de etileno; ésteres mixtos de pentaeritritol, ácidos grasos, ácido cítrico y alcoholes grasos y/o ésteres mixtos de ácidos grasos con 6 a 22 átomos de carbono, metilglucosa y polioles, preferiblemente glicerol o poliglicerol, mono, di y trialquil fosfatos y mono, di y/o fosfatos de tri-PEG alquilo y sales de los mismos; alcoholes de cera de lana; copolímeros de polisiloxano-polialquil-poliéter y derivados correspondientes; y copolímeros de bloque, por ejemplo, polietilenglicol-30 dipolihidroxiestearatos.

En algunas realizaciones, el emulsionante es un polialquilenglicol como, por ejemplo, polietilenglicol o polipropilenglicol. En algunas realizaciones, el emulsionante es polietilenglicol que tiene un peso molecular de 100 Da a 5,000 Da, 200 Da a 2,500 Da, 300 Da a 1,000 Da, 400 Da a 750 Da, 550 Da a 650 Da, o aproximadamente 600 Da.

En algunas realizaciones, el emulsionante es un poloxámero como se describe aquí.

En algunas realizaciones, el emulsionante se compone de uno o más alcoholes grasos. En algunas realizaciones, el alcohol graso es un alcohol graso C6 a C35 lineal o ramificado. Los ejemplos de alcoholes grasos incluyen, pero no se limitan a, alcohol caprílico (1-octanol), 2-etilhexanol, alcohol pelargónico (1-nonanol), alcohol cáprico (1-decanol, alcohol decílico), alcohol undecílico (1-undecanol , undecanol, hendecanol), alcohol laurílico (dodecanol, 1-dodecanol), alcohol tridecílico (1-tridecanol, tridecanol, isotridecanol), alcohol miristílico (1-tetradecanol), alcohol pentadecílico (1-pentadecanol, pentadecanol), alcohol cetílico (1-hexadecanol), alcohol palmitoleílico (cis-9-hexadecen-l-ol), alcohol heptadecílico (1-n-heptadecanol, heptadecanol), alcohol estearílico (1-octadecanol), alcohol isoestearílico (16-metilheptadecano-l-ol), alcohol elaidílico (9E-octadecen-l-ol), alcohol oleílico (cis-9-octadecen-1-ol), alcohol linoleílico (9Z,12Z-octadecadien-l-ol), alcohol elaidolinoleílico (9E,12E-octadecadien-l-ol), alcohol linolenílico (9Z,12Z,15Z-octadecatrien-l-ol), alcohol elaidolinolenílico (9E,12E,15-E-octadecatrien-l-ol), alcohol ricinoleílico (12-hidroxi-9-octadecen-l-ol), alcohol nonadecílico (1-nonadecanol), alcohol aráquidílico (1-eicosanol), alcohol heneicosílico (1-heneicosanol), alcohol behenílico (1-docosanol), alcohol erucílico (cis-13-docosen-l-ol), alcohol lignocerílico (1-tetracosanol), alcohol cerílico (1-hexacosanol), alcohol montanílico, alcohol cluitílico (1-octacosanol), alcohol miricílico, alcohol melissílico (1-triacontanol), alcohol geddílico (1-tetratriacontanol) o alcohol cetearílico.

En algunas realizaciones, el portador utilizado para producir la composición tópica es una mezcla de polietileno y uno o más alcoholes grasos. Por ejemplo, el portador comprende aproximadamente 50 % a aproximadamente 99 % en peso, de aproximadamente 75 % a aproximadamente 99 % en peso, de aproximadamente 90 % a aproximadamente 99 % en peso, o aproximadamente 95 % en peso de polietilenglicol y aproximadamente 1 % a aproximadamente 50 %) en peso, aproximadamente 1 % a aproximadamente 25 % en peso, aproximadamente 1 % a aproximadamente 10 % en peso, o aproximadamente 5 % en peso de alcohol graso. En algunas realizaciones, el portador es una mezcla de polietilenglicol y alcohol cetílico.

Las composiciones tópicas también pueden incluir componentes adicionales adecuados en tales composiciones. En algunas realizaciones, la composición tópica puede incluir uno o más de los siguientes componentes: grasas, ceras, ceras nacaradas, agentes solidificador, espesantes, agentes superengrasantes, estabilizantes, polímeros, compuestos de silicona, lecitinas, fosfolípidos, ingredientes activos biogénicos, desodorantes, agentes antimicrobianos, antitranspirantes, agentes de hinchamiento, repelentes de insectos, hidrótropos, solubilizantes, conservantes, aceites perfumados y tintes. Los ejemplos de cada uno de estos componentes se divulgan en la Patente de Estados Unidos No. 8,067,044.

Las composiciones tópicas que comprenden el componente o componentes tumoricidas y/o antimicrobianos descritos aquí se pueden preparar mezclando el componente o componentes con el portador durante un tiempo suficiente para que las partículas se dispersen uniformemente por todo el portador. En el caso cuando el portador comprenda dos o más componentes, los componentes pueden mezclarse entre sí antes de la adición del componente tumoricida y/o antimicrobiano. La cantidad de componentes tumoricidas y/o antimicrobianos presentes en la composición tópica puede variar dependiendo de la aplicación. En algunas realizaciones, el componente tumoricida y/o antimicrobiano es del 0.5 % al 20 %, del 1 % al 10 %, del 2 % al 5 % o aproximadamente el 3 % en peso de la composición tópica.

Se apreciará que las cantidades de los componentes tumoricidas y/o antimicrobianos en la composición en un caso específico variarán de acuerdo con los componentes tumoricidas y/o antimicrobianos específicos que se utilicen, las composiciones particulares formuladas, el modo de aplicación y el situs particular y paciente en tratamiento. Las dosificaciones para un huésped determinado se pueden determinar utilizando consideraciones convencionales, por ejemplo, por comparación habitual de las actividades diferenciales de la composición y de una terapia conocida, por ejemplo, por medio de un protocolo farmacológico convencional apropiado. Los médicos y formuladores experimentados en la técnica de la determinación de dosis de agentes farmacéuticos no tendrán problemas para determinar la dosis de acuerdo con las recomendaciones estándar (Physician's Desk Reference, Barnhart Publishing (1999)).

Se contemplan dosis unitarias o formas de dosis múltiples, cada una ofrece ventajas en ciertos entornos clínicos. La dosis unitaria contendría una cantidad predeterminada de los componentes tumoricidas y/o antimicrobianos calculados para producir el efecto o efectos deseados en el contexto del tratamiento del cáncer. La forma de dosis múltiples puede ser particularmente útil cuando se requieren múltiples dosis individuales o dosis fraccionadas para lograr los fines deseados.

Cualquiera de estas formas de dosificación puede tener especificaciones dictadas o directamente dependientes de la característica única del componente tumoricida y/o antimicrobiano particular, el efecto terapéutico particular a lograr, la enfermedad a tratar y las condiciones del paciente, etc.

Una dosis unitaria contendrá una cantidad terapéuticamente eficaz suficiente para tratar una enfermedad en un paciente y puede contener de aproximadamente 0.001 mg a 100 mg del componente tumoricida, citotóxico y/o antimicrobiano. La cantidad del componente tumoricida, citotóxico y/o antimicrobiano puede variar de 0.001 % a 90 % p/p de la composición, como 0.001 %, 0.01 %, 0.1 %, 1 %, 10 %, 50 % o 90 %, o en cualquier intervalo entre dos números cualesquiera. La enfermedad tratada puede ser cualquier enfermedad tratable por los exosomas de la divulgación, por ejemplo, un cáncer, una infección bacteriana, una infección viral o una infección fúngica.

La composición farmacéutica puede estar además en una formulación oral tal como un comprimido ingerible, un comprimido bucal, cápsula, comprimido oblongo, elixir, suspensión, jarabe, trocisco, oblea, pastilla para chupar y similares.

La composición puede ser una preparación de liberación sostenida. La composición puede encerrarse en una cápsula dura o blanda, puede comprimirse en comprimidos o puede incorporarse con bebidas, alimentos o de otro modo en la dieta. Por supuesto, el porcentaje de la composición final y las preparaciones puede variar y puede variar convenientemente entre el 1 y 90 % del peso de la forma final, por ejemplo, comprimido. La cantidad en dichas composiciones terapéuticamente útiles es tal que se obtendrá una dosificación adecuada.

La formulación adecuada de una composición oral también puede contener: un aglomerante, tal como goma de tragacanto, acacia, almidón de maíz, gelatina; agentes edulcorantes tales como lactosa o sacarosa; agentes disgregantes tales como almidón de maíz, ácido algínico y similares; un lubricante tal como estearato de magnesio; o saborizante tal como menta, aceite de gaulteria o similares. Pueden estar presentes diversos otros materiales como recubrimiento o para modificar de otro modo la forma física de la unidad de dosificación oral. La unidad de dosificación oral se puede recubrir con goma laca, un azúcar o ambos. El jarabe o elixir puede contener componentes tumoricidas y/o antimicrobianos, sacarosa como agente edulcorante, metil y propilparabenos como conservante, un colorante y saborizante. Cualquier material utilizado debe ser farmacéuticamente aceptable y sustancialmente no tóxico.

Se pueden encontrar descripciones adicionales de la preparación de una composición farmacéutica en la 19.a edición de Remington's Pharmaceutical Sciences, publicado por Mack Publishing Co., Easton, Pensilvania. 18040.

Tratamiento de la invención

Las composiciones descritas aquí son útiles en el tratamiento de una variedad de enfermedades, como el cáncer. La invención se relaciona con el tratamiento de infecciones fúngicas.

Los ejemplos de enfermedades que pueden tratarse con las composiciones de la divulgación incluyen enfermedades malignas del sistema inmunitario, el sistema linfático y el sistema hematopoyético, tumores formados y tumores sólidos. Los ejemplos no limitantes de cánceres que pueden tratarse con las composiciones incluyen leucemia de mastocitos, leucemia mielógena aguda (AML), eritroleucemia, trastornos mieloides (por ejemplo, leucemia mieloide, mieloma múltiple y eritroleucemia), tumores de células germinales, carcinoma de pulmón, carcinoma de pulmón de células pequeñas, tumores del estroma gastrointestinal, neuroblastoma, carcinoma de cuello uterino, carcinoma de ovario, carcinoma cerebral, carcinoma de mama, carcinoma de ovario, carcinoma de endometrio, carcinoma de riñón, carcinoma de tiroides, carcinoma de vejiga, carcinoma de colon, carcinoma de páncreas y carcinoma de próstata, carcinoma de piel tales como melanoma, adenomas (por ejemplo, adenoma de colon velloso) y sarcomas (por ejemplo, osteosarcoma), etc.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se usan para tratar el cáncer de piel, por ejemplo, melanoma, cáncer de células escamosas, cáncer de células basales o tumores de mastocitos.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se usan para tratar otros cánceres de células epiteliales, por ejemplo, cáncer de cuello uterino o cáncer oral. En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se usan para tratar células infectadas por virus, por ejemplo, verrugas.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas aquí se utilizan para modular el sistema inmunitario. Por ejemplo, los exosomas y/o microvesículas pueden inducir una respuesta de células T citotóxicas (por ejemplo, contra tumores) y/o inducir la apoptosis (por ejemplo, de células inmunitarias activadas). Los exosomas y/o microvesículas también pueden desempeñar un papel en la vigilancia inmunitaria.

En algunas realizaciones, las composiciones farmacéuticas descritas aquí son útiles para tratar infecciones. En una realización, las composiciones farmacéuticas descritas aquí son útiles para tratar infecciones por virus patógenos. Los virus patógenos incluyen, sin limitación, virus del papiloma humano, virus de la inmunodeficiencia humana, virus de Epstein-Barr, citomegalovirus, virus del Ébola, virus de Marburg, influenza, virus respiratorio sincitial, poxvirus, virus de varicela-zóster y herpes. En una realización, las composiciones farmacéuticas descritas aquí son útiles para tratar infecciones bacterianas. Las bacterias infecciosas incluyen, sin limitación, estreptococo, estafilococo, Criptococo, Clamidia, Escherichia, Pseudomonas, Clostridium y Candida, incluidas las cepas resistentes a los antibióticos de cualquiera de las anteriores. En una realización, las composiciones farmacéuticas descritas aquí son útiles para tratar infecciones provocadas por otros microbios, incluidos hongos y levaduras.

Con mamíferos, incluidos humanos y animales domésticos, la cantidad eficaz se puede administrar en base al área de la superficie corporal a cubrir (por ejemplo, área afectada), por ejemplo, en una composición tópica. Un intervalo de dosis adecuado es de aproximadamente 0.001 mg a aproximadamente 100 mg de equivalente por m de área de superficie corporal de un componente tumoricida y/o antimicrobiano, por ejemplo, de aproximadamente 0.005 mg/m2 a aproximadamente 50 mg/m2. La dosificación se puede administrar diariamente, como una, dos, tres o más veces al día, o cada dos o varios días, o cada semana, etc. La frecuencia de administración se puede reducir si se administra una formulación de liberación prolongada.

En una realización, la cantidad eficaz puede administrarse sobre la base del volumen del tumor. Un intervalo de dosis adecuado es de aproximadamente 1:100 a aproximadamente 1:10,000 de proporción de preparación de exosoma/microvesícula a volumen tumoral. En una realización, la dosis adecuada oscila entre aproximadamente 1:100 y aproximadamente 1:1,000 de proporción de preparación de exosoma/microvesícula a volumen tumoral. En una realización, la dosis adecuada oscila entre aproximadamente 1:1,000 y aproximadamente 1:10,000 de proporción de preparación de exosoma/microvesícula a volumen tumoral.

En una realización, la cantidad eficaz se puede administrar en función del peso corporal del paciente. Un intervalo de dosis adecuado es de aproximadamente 1 |jg a aproximadamente 100 mg de preparación de exosoma/microvesícula por kg de peso corporal. En una realización, la dosis adecuada oscila entre aproximadamente 1 jg a aproximadamente 10 mg de preparación de exosoma/microvesícula por kg de peso corporal. En una realización, la dosis adecuada oscila entre aproximadamente 1 jg a aproximadamente 100 jg de preparación de exosoma/microvesícula por kg de peso corporal. En una realización, la dosis adecuada oscila entre aproximadamente 10 jg y aproximadamente 10 mg de preparación de exosoma/microvesícula por kg de peso corporal. En una realización, la dosis adecuada oscila entre aproximadamente 100 jg y aproximadamente 10 mg de preparación de exosoma/microvesícula por kg de peso corporal.

La dosificación y frecuencia de administración pueden depender del tipo de formulación, la enfermedad a tratar, la cantidad del componente tumoricida y/o antimicrobiano, la edad del paciente, género, especie, otras condiciones, etc.

Terapia de combinación

En otro aspecto descrito, las composiciones descritas aquí se pueden administrar junto con otras terapias contra el cáncer, como cirugía, radiación, quimioterapia (por ejemplo, cisplatino, carboplatino, oxaliplatino, satraplatino y picoplatino, especialmente cisplatino y carboplatino; taxanos, como paclitaxel y docetaxel y antraciclinas como daunorrubicina, doxorrubicina, epirrubicina, idarrubicina o valrrubicina, etc.), terapia a base células (por ejemplo, terapia con células NK-92), terapia con anticuerpos, etc. En algunas realizaciones, la composición se puede administrar junto con una o más citoquinas como se describe aquí.

Los siguientes ejemplos se incluyen para ilustrar la invención.

Ejemplos

Ejemplo 1: Efecto antimicrobiano de las células NK-92

Las células NK-92 se incubaron con Cryptococcus neoformans en placas de fondo redondo en medio Myelocult durante 24 horas. Una proporción efector:diana (NK-92: C. neoformans) de 100:1 (I*l06: lx l04 células/pozo). C. neoformans (l * l04 células/pozo) se incubaron en medio Myelocult sin células NK-92 como control. Después de la incubación de 24 horas, los cultivos se diluyeron en serie y se sembraron sobre placas de agar Sabouraud. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 48 horas. Se midió el número de colonias en cada dilución.

El número de colonias por placa en cada dilución se indica en la figura 1. Barras blancas: Células NK-92 C. neoformans. Barras negras: C. neoformans solo. Figura 2 indica que las células NK-92 inhibieron el crecimiento de C. neoformans de aproximadamente un 60 %.

Se observaron resultados similares cuando las células NK-92 se incubaron con otra especie de hongo (una especie de Aspergillus). Las células NK-92 causaron daños en las hifas del hongo de una manera dependiente de la dosis y el tiempo.

Ejemplo 2: Aislamiento de exosomas y/o microvesículas del sobrenadante de células NK-92

Las vesículas extracelulares (exosomas y/o microvesículas) se aislaron por ultracentrifugación. Las células NK-92 cultivadas se centrifugaron a 300 xg durante 10 minutos y se descartó el sedimento celular. El sobrenadante se centrifugó a 2000xg durante 20 minutos y se descartó el sedimento (desechos celulares). El sobrenadante resultante se sometió a ultracentrifugación a 100,000xg durante 80 minutos. El sedimento resultante se lavó con solución salina regulada con fosfato y se sometió a ultracentrifugación a 100,000xg durante 80 minutos. El sedimento lavado que contenía exosomas y microvesículas (preparación EV/MV) se retuvo para estudios adicionales.

Ejemplo 3: Caracterización de vesículas extracelulares

Las células NK-92 se cultivaron bajo una variedad de condiciones y las vesículas extracelulares se aislaron del medio como se describe en el ejemplo 2. Las condiciones de cultivo se proporcionan en la Tabla 1. Las células se acondicionaron en FBS exofree durante al menos 24 a 46 horas antes de la cosecha de exosomas. ExoFree FBS se agota en exosomas para evitar la contaminación de las preparaciones de vesículas extracelulares NK-92.

Tabla 1. Condiciones de crecimiento de NK-92

Las preparaciones de EV/MV se analizaron en busca de la presencia de varias proteínas usando técnicas estándar de inmunoprecipitación Western, como se muestra en la figura 3A y la figura 3B. La línea celular MCF-7 se usó como control positivo para la producción de exosomas y como control negativo para las proteínas citolíticas. El sedimento de células NK-92 (células NK-92) se utilizó como control positivo. Las células MCF-7 se cultivaron en DMEM con suero bovino fetal (FBS) ExoFree al 10 % y L-glutamina 2 mM.

Las vesículas extracelulares de las células NK-92 y MCF-7 dieron positivo para Rab5B, un marcador de exosomas. Las preparaciones de NK-92 EV/MV (pero no las preparaciones de MCF-7 EV/MV) también fueron positivas para varias proteínas inductoras de apoptosis y/o citolíticas que se sabe que están involucradas en la actividad de las células NK, incluida la perforina, el ligando Fas (FasL), granzima B y granulisina. Sin embargo, la cantidad de cada una de estas proteínas parece depender de las condiciones de crecimiento de las células NK-92, incluido el esqueleto de medios (por ejemplo, aMEM(NK), RPMI, X-Vivo) y la concentración sérica.

Las preparaciones de EV/MV de células NK-92 se analizaron en busca de contaminación por otros organelos. EV/MV aislados de NK-92 muestran cierta contaminación con material nuclear (pequeños cuerpos apoptóticos) pero no tenían otros organelos contaminantes, como se muestra en la figura 3B.

Ejemplo 4: Citotoxicidad de las preparaciones EV/MV

La citotoxicidad de las preparaciones de EV/MV frente a las células Jurkat se probó utilizando las condiciones de cultivo indicadas en la Tabla 1. Células Jurkat (2 * 104) se incubaron en medio 170 (con ExoFree FBS) y 5, 15 o 30 de preparación EV/MV (con PBS para lograr un volumen de incubación total de 200 j l) durante 2 horas o 20 horas. La citotoxicidad se determinó mediante el ensayo de yoduro de propidio (PI), y los datos se expresan como el porcentaje de células que son positivas para PI (indicativo de células muertas).

Como se muestra en la Figura 4, las preparaciones de EV/MV de células NK-92, pero no de células MCF-7, tienen actividad citotóxica contra células Jurkat in vitro. La composición del medio cambia el potencial lítico de EV/MV, y la presencia de suero en el medio de crecimiento estimula la producción de EV/MV lítico por parte de las células NK-92.

Claims (13)

REIVINDICACIONES

1. Una composición farmacéutica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y uno o más exosomas y/o microvesículas aisladas de células NK-92, para uso en un método para tratar una infección fúngica en un paciente.

2. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 1, en donde la composición comprende una solución acuosa estéril, que comprende opcionalmente PBS estéril, solución salina estéril o un sobrenadante de un medio de células NK-92.

3. La composición farmacéutica para uso de la reivindicación 1 o reivindicación 2, en donde las células NK-92 comprenden células n K-92 de tipo salvaje o células NK-92 modificadas.

4. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células NK-92 comprenden células NK-92 modificadas para expresar un receptor Fc, una citoquina, un receptor de citoquina y/o un receptor de antígeno quimérico.

5. La composición farmacéutica para uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición farmacéutica es una formulación inyectable, opcionalmente en donde la composición farmacéutica se formula para inyección subdérmica o subcutánea, o en donde la composición farmacéutica es una formulación inyectable de liberación prolongada.

6. La composición farmacéutica para uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el portador farmacéuticamente aceptable comprende un agente espesante.

7. La composición farmacéutica para uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición farmacéutica es una formulación tópica, opcionalmente en donde la formulación tópica es líquida a temperatura ambiente y se vuelve un gel cuando se aplica al cuerpo y en donde la formulación tópica comprende opcionalmente un poloxámero, o en donde la composición farmacéutica es una crema o loción.

8. La composición farmacéutica para uso de cualquier reivindicación anterior, en donde la composición farmacéutica comprende además una o más citoquinas, opcionalmente en donde una o más citoquinas incluyen al menos IL-2.

9. La composición farmacéutica para el uso de cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde las células NK-92 se tratan con al menos un agente estimulante antes del aislamiento de el uno o más componentes, opcionalmente en donde el al menos un agente estimulante es IL-15 y/o interferón gamma.

10. Una composición farmacéutica antifúngica que comprende un portador farmacéuticamente aceptable y uno o más componentes aislados de células NK-92, en donde uno o más componentes comprenden exosomas y/o microvesículas, en donde los exosomas y/o microvesículas son antifúngicos.

11. La composición farmacéutica antifúngica de la reivindicación 10, en donde la composición farmacéutica está formulada para uso tópico o inyección.

12. La composición farmacéutica antifúngica de la reivindicación 11, en donde la formulación tópica proporciona una liberación sostenida de los exosomas y/o microvesículas, o en donde la composición farmacéutica es un gel, un hidrogel o un gel de colágeno, emulsión, aceite, ungüento, pasta, leche o espuma.

13. La composición farmacéutica antifúngica de la reivindicación 10, en donde o en donde la composición farmacéutica comprende además uno o más agentes antimicrobianos adicionales.