KR101298012B1 - 암세포로의 표적지향을 위한 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조방법 및 이를 포함하는 약학 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 면역글로불린 G 존재하에서 단핵구 세포를 배양함으로써 인터페론-γ 생성능이 현저하게 증가된 NK 세포를 포함하는 림프구에 항-HER2/neu 항체를 결합시킴으로써, 유방암, 난소암 등의 HER2/neu 항원을 발현하는 암세포로의 표적지향을 위한 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조방법 및 이를 포함하는 암세포 표적지향을 위한 약학 조성물을 제공한다.
Description
본 발명은 활성화된 자연살해 세포를 포함하는 림프구에 항-HER2/neu 항체를 결합시켜 암세포로의 표적지향을 위한 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 제조하는 방법; 및 이를 포함하는 암세포 표적지향을 위한 약학 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 면역글로불린 G 존재하에서 단핵구 세포를 배양함으로써 인터페론-γ 생성능이 현저하게 증가된 NK 세포를 포함하는 림프구에 항-HER2/neu 항체를 결합시킴으로써, 유방암, 난소암 등의 HER2/neu 항원을 발현하는 암세포로의 표적지향을 위한 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조방법 및 이를 포함하는 암세포 표적지향을 위한 약학 조성물에 관한 것이다.
지금까지의 항암제 개발은 주로 암세포 증식에 관련하는 생리화학적 경로를 조절하는 관점에서 많은 연구가 진행되어 왔으며, 기존의 전통적인 치료법인 외과적 수술(surgery), 방사선(radiation) 및 화학요법(chemotherapy) 등과 병행하여 사용되고 있으나, 20% 내외의 저조한 수준의 낮은 치료율을 보여왔다. 이러한 치료법들은 암환자 체내의 조혈기능 등에 대한 심한 부작용과 면역체계의 억제(immune suppression)를 유발시킴으로써 암의 재발(recurrence)과 전이(metastasis) 등의 심각한 문제점을 야기하고 있어, 우수한 효능은 물론, 독성면에서 부작용을 최소화할 수 있는 새로운 항암 치료법의 개발이 절실한 실정이다.
최근에는 종양세포 백신 치료법(tumor cell vaccine), 종양세포 특이적 항체 치료법(tumor-specific antibody), 유전자 치료법(gene therapy), 수지상세포 백신 치료법(dendritic cell vaccination), 자연살해세포 치료법(natural killer cell), 및 활성화림프구 치료법(activated killer cell) 등의 새로운 치료요법들이 개발되고 있다. 면역세포치료법에 이용되고 있는 자연살해세포는 형태학적으로 세포질에 큰 과립을 가지는 세포로 혈액내 림프구의 약 10∼20%를 차지한다. 자연살해세포는 T 세포 수용체(T cell receptor), CD4 또는 면역글로불린(immunoglobulin) 같은 세포표면 수용체를 가지고 있지 않음으로써 기존의 T 세포와 B 세포와는 다른 독특한 면역세포로 분류된다. 자연살해세포는 혈액 이외에도 비장, 간, 편도선, 임파선 등에서도 발견되었고, 골수조직이 자연살해세포의 형성과 분화과정에 중요한 조직이라고 알려졌다.
현재까지 밝혀진 자연살해세포의 주요기능으로는 종양세포를 살해할 수 있는 능력, 바이러스 감염세포에 대한 세포독성, 세균과 진균을 살해하는 능력 등이 알려져 있으며, 따라서, 자연살해세포는 항종양, 면역과 미생물에 대한 보호면역에 대하여 중요한 역할을 할 것으로 기대되고 있다. 또한 자연살해세포는 다양한 사이토카인(cytokine) 등을 생산함으로써 면역계의 조절에도 깊게 관여하며 CD16의 표면수용체를 통해 항체의존성 세포매개성 세포독성(antibody-dependent cellular cytotoxicity, ADCC) 기능도 밝혀진 바 있다.
NK 세포에 인터루킨-2, 인터루킨-12 등과 같은 사이토카인들을 첨가하여 세포를 활성화시킴으로써 LAK 세포(lymphokine-activated killer cell)를 제조할 수 있다는 것이 알려진 바 있고, 이들 LAK 세포는 자연살해세포에 의해 파괴되지 않는 종양세포를 살해함으로써 항암효과를 극대화 할 수 있어 면역치료법에 중요하게 사용되고 있다. 항종양면역과 미생물에 대한 보호면역에 NK/LAK 세포가 중요한 역할을 하고 있는 반면에, 골수이식(bone marrow transplantation)의 거부반응과 자가면역질환(autoimmune disease) 등에도 NK/LAK 세포들이 관여한다고 밝혀지고 있어 이들 살해세포의 살상기능조절의 중요성이 더욱 더 관심깊게 인지되고 있다.
현재까지 개발된 활성화된 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조방법으로는 단핵구 세포, 구체적으로는 환자의 말초혈액으로부터 분리된 단핵구 세포(mononuclear cells)를 인터루킨-2 및 항체를 포함하는 배양액 중에서 배양함으로써, 자연살해 세포의 활성화가 유도된 림프구를 제조하고 있다. 예를 들어, 대한민국 특허공개 제10-2009-0127973호는 인간의 말초혈액에서 림프구를 분리한 후 인터루킨2(IL-2)와, 항CD3, 항CD16 및 항CD56 항체의 존재하에 배양하여 림프구 세포들 중 NK 세포가 차지하는 비율을 상승시켜 NK 세포, T 세포 및 NKT 세포가 고르게 활성화시키는 것을 개시한 바 있다.
그러나, 기존에 개발된 활성화된 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조방법에 따라 얻어진 림프구는 증식율 및 세포독성 활성능에 있어서 다양한 편차가 존재하며, 특히 암세포 살상능에 중요한 역할을 하는 IFN-γ 생산능이 아직은 만족스러운 수준에 이르지 못하고 있는 실정이다.
본 발명자들은 우수한 IFN-γ 생산능을 갖는 활성화된 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 면역글로블린 중 하나인 면역글로블린 G(IgG) 존재하에서 단핵구 세포를 배양하였을 때, IgG에 의해 자연살해세포의 CD16 표면수용체가 활성화됨으로써 IFN-γ 생산능이 높은 림프구를 제조할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한, 활성화된 자연살해 세포를 포함하는 림프구에 항-HER2/neu 항체를 결합시켰을 때, 얻어진 세포가 유방암, 난소암 등과 같은 HER2/neu 항원을 발현하는 암세포로의 표적지향(targeting)이 가능하다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 면역글로블린 G 존재하에서 단핵구 세포를 배양하여 얻어진 활성화된 자연살해 세포를 포함하는 림프구에 항-HER2/neu 항체를 결합시켜, HER2/neu 항원을 발현하는 암세포로의 표적지향을 위한 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 상기 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 포함하는, HER2/neu 항원을 발현하는 암을 치료하기 위한 표적지향용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 바닥면에 면역글로블린 G가 코팅된 배양용기에, 자연살해 세포의 표면 단백질 항체, 혈청, 및 인터루킨-2를 포함하는 배양액을 가한 후, 말초혈액으로부터 분리된 단핵구 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 배양액에 항-HER2/neu 항체를 처리하여 추가로 배양하여 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 얻는 단계를 포함하는, HER2/neu 항원을 발현하는 암세포로의 표적지향을 위한 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조방법이 제공된다.
단계(a)에서, 상기 바닥면에 면역글로블린 G가 코팅된 배양용기는 접착단백질을 바닥면에 코팅한 후, 면역글로불린 G를 함유하는 용액을 가하여 코팅함으로써 제작될 수 있다. 또한, 상기 혈청은 상기 단핵구 세포가 분리된 말초혈액으로부터 얻어지는 것이 바람직하며, 상기 자연살해 세포의 표면 단백질 항체는 항 NKp46 항체, 항 NKp44 항체, 항 NKp30 항체 및 항 NKG2D 항체로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있다.
단계(b)는 단계(a)로부터 얻어진 배양액에 항-HER2/neu 항체를 50∼500 ㎍ / 1×106 cells의 비율로 처리하고, 4℃ 내지 37 ℃에서 30분∼24시간 동안 배양한 후, 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 분리함으로써 수행될 수 있다.
본 발명의 다른 태양에 따라, 상기 제조방법으로 제조된 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, HER2/neu 항원을 발현하는 암을 치료하기 위한 표적지향용 약학 조성물이 제공된다.
상기 HER2/neu 항원을 발현하는 암은 유방암, 난소암, 위암 및 자궁내막암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 유방암일 수 있다.
본 발명에 의해, 면역글로블린 G 존재하에서 단핵구 세포를 배양할 경우, IgG에 의해 자연살해세포의 CD16 표면수용체가 활성화됨으로써 IFN-γ 생산능이 높은 림프구 즉, CD16+ IFN-γ+ NK세포를 포함하는 림프구를 제조할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서, 본 발명의 제조방법은 CD16+ IFN-γ+ NK세포를 포함한, 우수한 IFN-γ 생산능 및 암세포에 대한 세포독성을 갖는 림프구를 안정적으로 제공할 수 있다. 또한, 상기 활성화된 자연살해 세포를 포함하는 림프구에 항-HER2/neu 항체를 결합시켜 얻어진 세포는 유방암 등과 같은 HER2/neu 항원을 발현하는 암세포로의 효과적인 표적지향(targeting)이 가능하다는 것이 본 발명에 의해 밝혀졌다. 따라서, 본 발명에 따라 얻어진 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구는 유방암 등과 같은 HER2/neu 항원을 발현하는 암을 치료하기 위한 표적지향용 약학 조성물에 유용하게 적용될 수 있다.
도 1 내지 도 4는 각각 본 발명의 제조방법에 따라 얻어진 활성화 림프구의 유세포 분석 결과이다.
도 5는 본 발명의 제조방법에 따라 얻어진 CD3- CD56+ CD16+ IFN-γ+ 세포집단을 포함하는 전체 활성화림프구를 대상으로 IFN-γ 분비량을 ELISA 분석을 통하여 얻어진 결과이다.
도 6은 인체유래 유방암 세포주 MCF-7 세포를 대상으로 본 발명에 따라 얻어진 활성화림프구의 세포독성(cytotoxicity)을 평가한 결과이다.
도 7은 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구에 대하여 항체의 결합능을 유세포 분석(flow cytometry analysis)을 통하여 분석한 결과이다.
도 8은 Terascan Assay 방법에서, Terascan 플레이트 디자인을 나타낸 것이다. 도 8에서 P. Control(양성 대조군)은 사멸된 SKBr3를 첨가한 것이고, N. Control (음성 대조군)은 살아있는 SKBr3 세포를 첨가한 것이다.
도 9는 유방암 세포주인 SKBr3 세포에 대한, 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 세포독성(cytotoxicity) %를 Terascan Assay 방법으로 평가한 결과이다.
도 10은 항-HER2/neu 항체가 결합 또는 비결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 항종양 활성을 생체 내(in vivo)로 평가한 결과이다.
도 11은 도 10에서 2주째에 각 군의 마우스를 촬영한 사진 및 상기 마우스를 치사시킨 후 종양 크기를 측정한 결과이다.
도 5는 본 발명의 제조방법에 따라 얻어진 CD3- CD56+ CD16+ IFN-γ+ 세포집단을 포함하는 전체 활성화림프구를 대상으로 IFN-γ 분비량을 ELISA 분석을 통하여 얻어진 결과이다.
도 6은 인체유래 유방암 세포주 MCF-7 세포를 대상으로 본 발명에 따라 얻어진 활성화림프구의 세포독성(cytotoxicity)을 평가한 결과이다.
도 7은 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구에 대하여 항체의 결합능을 유세포 분석(flow cytometry analysis)을 통하여 분석한 결과이다.
도 8은 Terascan Assay 방법에서, Terascan 플레이트 디자인을 나타낸 것이다. 도 8에서 P. Control(양성 대조군)은 사멸된 SKBr3를 첨가한 것이고, N. Control (음성 대조군)은 살아있는 SKBr3 세포를 첨가한 것이다.
도 9는 유방암 세포주인 SKBr3 세포에 대한, 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 세포독성(cytotoxicity) %를 Terascan Assay 방법으로 평가한 결과이다.
도 10은 항-HER2/neu 항체가 결합 또는 비결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 항종양 활성을 생체 내(in vivo)로 평가한 결과이다.
도 11은 도 10에서 2주째에 각 군의 마우스를 촬영한 사진 및 상기 마우스를 치사시킨 후 종양 크기를 측정한 결과이다.
본 명세서에서, "단핵구 세포(mononuclear cells)"라 함은 포유동물, 바람직하게는 사람의 말초혈액으로부터 분리된 단핵의 세포 즉, 말초혈액 유래의 단핵 세포(peripheral blood - derived mononuclear cells, PBMC)로서, 상기 PBMC는 B 세포, T 세포, 자연살해 세포(natural killer cells, NK 세포)와 같은 면역세포; 및 호염기구(basophil), 호산구(eosinophil), 호중구(neutrophil)와 같은 과립구세포(granulocytes) 등을 포함하고 있다. 상기 PBMC는 통상의 제조방법, 예를 들어 Ficoll-Paque을 이용한 비중 원침법으로 분리할 수 있다(Blood, 1998, 92: 2989-93 등).
또한, 본 명세서에서, "활성화된 자연살해 세포(activated natural killer cells)"라 함은 인터페론-γ 생성능을 지닌 자연살해 세포가 바람직하게는 50% 이상, 더욱 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 약 70% 이상인 자연살해 세포를 말하며, 상기 활성화된 자연살해 세포는 인터페론-γ를 높게 분비함으로써 암세포에 대한 살상력(cytotoxicity)을 갖는다. 통상 PBMC 중의 NK 세포는 10∼20% 정도로 존재하는 것으로 알려져 있으며, 상기 PBMC 중에 존재하는 NK 세포는 약 0.5 내지 6 % 범위에 불과한 인터페론-γ 생성능을 갖는다.
또한, 본 명세서에서, "HER2/neu 항원"이라 함은 NEU, NGL, HER2, TKR1, HER-2, c-erb B2, 리셉터 타이로신-단백질 키나아제(Receptor tyrosine-protein kinase) erbB-2, EC 2.7.10.1, p185erbB2, C-erbB-2, NEU proto-oncogene, 타이로신 키나아제-타입 세포 표면 리셉터 HER2(Tyrosine kinase-type cell surface receptor HER2), MLN 19, CD340 항원 등의 명칭으로 알려져 있는 단백질을 지칭한다. 상기 HER2/neu 항원은 다양한 유전공학적 방법에 의해 제조될 수 있으며, 상업적으로 구입될 수 있다(예를 들어, Prospec 사, 카탈로그 번호: PKA-343 등).
또한, 본 명세서에서, "항-HER2/neu 항체"라 함은 HER2/neu 항원에 특이적으로 결합하는 항원을 지칭하며, 일반적인 단일클론항체 제조방법에 따라 얻어질 수 있다. 또한, 상기 항-HER2/neu 항체는 허셉틴(Herceptin)TM (성분명: Trastuzumab)으로 시판되는 항체를 사용할 수도 있다.
본 발명은 (a) 바닥면에 면역글로블린 G가 코팅된 배양용기에, 자연살해 세포의 표면 단백질 항체, 혈청, 및 인터루킨-2를 포함하는 배양액을 가한 후, 말초혈액으로부터 분리된 단핵구 세포를 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 배양액에 항-HER2/neu 항체를 처리하여 추가로 배양하여 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 얻는 단계를 포함하는, HER2/neu 항원을 발현하는 암세포로의 표적지향을 위한 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조방법을 제공한다.
이하, 단계(a)에 대하여 상세히 설명한다.
상기 면역글로불린 G 존재하에서의 PBMC의 배양은 바닥면에 면역글로블린 G가 코팅된 배양용기 중에서 수행된다. 상기 바닥면에 면역글로블린 G가 코팅된 배양용기는 접착단백질(adhesion proteins)을 바닥면에 코팅한 후, 면역글로불린 G를 함유하는 용액을 가하여 코팅함으로써 제작될 수 있다. 상기 접착단백질로는 세포배양 시 통상적으로 사용되는 코팅용 단백질을 사용할 수 있으며, 예를 들어 파이브로넥틴(fibronectin) 또는 콜라겐(collagen) 등을 사용할 수 있다. 상기 접착단백질 코팅은 배양용기(예를 들어 T75 플라스크)에 접착단백질-함유 용액을 가한 후, 실온에서 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다. 또한, 면역글로블린 G의 코팅은 상기 접착단백질 코팅면 상에 면역글로블린 G를 함유하는 용액을 가하고 실온에서 인큐베이션함으로써 수행될 수 있다.
NK 세포의 증식 및 활성화를 유도하는 배양액으로는, 인터루킨-2를 포함하는 통상의 면역세포 배양용 배지(media)를 사용할 수 있으며, 부가적으로 혈청 및 자연살해 세포 표면 단백질 항체가 첨가될 수 있다. 상기 자연살해 세포 표면 단백질 항체는 자연살해 세포의 증식 및 활성화를 유도하는 단백질로서, 항 NKp46 항체, 항 NKp44 항체, 항 NKp30 항체 및 항 NKG2D 항체 등으로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택될 수 있으며, 바람직하게는 항 NKp46 항체를 사용할 수 있다. 상기 단백질은 공지의 단백질로서 상업적으로 구입할 수 있다.
또한, 상기 혈청으로는 상기 단핵구 세포가 분리된 말초혈액으로부터 얻어지는 것이 바람직하다. 즉, 본 발명에 따른 제조방법에 의해 얻어진 활성화된 자연살해 세포를 포함하는 림프구가 투여되는 환자의 말초혈액으로부터 단핵구 세포 및 혈청(또는 혈청을 포함하는 혈장)을 각각 분리하고, 얻어진 단핵구 세포(즉, PBMC)를 자연살해 세포의 표면 단백질 항체, 상기 분리된 혈청(또는 혈청을 포함하는 혈장), 및 인터루킨-2를 포함하는 배지 중에서 바람직하게 수행될 수 있다.
상기 배지는 통상의 면역세포 배양용 배지에 자연살해 세포의 표면 단백질 항체, 혈청, 및 인터루킨-2를 가하여 준비할 수 있다. 예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 알부민을 함유하는 인간 말초혈액 T세포용 배지인 ALyS505N (Cell Science ＆ Technology Inst. Inc., 일본)에 상기한 자연살해 세포의 표면 단백질 항체, 혈청, 및 인터루킨-2을 가하여 준비할 수 있다. 또한, 인슐린, 트랜스페린, 알부민, 및 인터루킨-2(1,000IU/ml)를 함유하는 면역세포 배양용 배지인 ALyS505N-10 (Cell Science ＆ Technology Inst. Inc., 일본)에 자연살해 세포의 표면 단백질 항체 및 혈청을 가하여 준비할 수도 있다. 물론, 상기 배지는 자연살해 세포의 표면 단백질 항체, 혈청, 및 인터루킨-2를 포함하는 면역세포 배양용 배지라면 제한없이 사용될 수 있다.
PBMC의 배양은 통상의 세포배양 조건 즉, 약 37℃, CO2 배양기 중에서 수행될 수 있으며, 배지를 2일 혹은 3일에 한 번씩 첨가해 주면서 계속적으로 배양할 수 있다. 또한, 배지에 가해지는 PBMC의 농도는 4 X 105 ∼ 2 X 107 cells/ml의 범위일 수 있으나, 크게 제한되는 것이며, 배양기간은 10∼14일 동안, 바람직하게는 약 14일 동안 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
이하, 단계(b)에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 단계(b)는 단계(a)로부터 얻어진 배양액에 항-HER2/neu 항체를 처리하여 추가로 배양하여 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 얻음으로써 수행될 수 있다.
일 구현예에서, 단계(a)로부터 얻어진 배양액에 항-HER2/neu 항체를 50∼500 ㎍ / 1×106 cells의 비율로 처리하고, 4℃ 내지 37 ℃에서, 30분∼24시간 동안 배양한 후, 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 분리함으로써 수행될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 상기 배양은 약 4℃에서 수행될 수 있으며, 또한 약 1시간 동안 수행될 수 있다.
본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, HER2/neu 항원을 발현하는 암을 치료하기 위한 표적지향용 약학 조성물을 제공한다.
상기 HER2/neu 항원을 발현하는 암은 유방암,난소암, 위암 및 자궁내막암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으며, 바람직하게는 HER2/neu을 특이적으로 높게 발현하는 유방암일 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 상기한 바와 같이 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 포함하고, 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 동결건조제 등의 비경구용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함할 수 있다. 기타 통상의 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 있어서, 상기 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 투여량은 암 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 투여형태, 투여경로 및 기간에 따라 상이하지만, 예를 들면, 상기 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구는 1일 1X106 내지 1X109 cells/kg의 용량, 바람직하게는 1X107 내지 1X109 cells/kg의 용량으로 투여될 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여될 수도 있다. 또한, 액제, 현탁액, 에멀젼 등의 액상 단위 제제(liquid unit formulation)로 제제화될 경우, 역시 상기 세포농도로 환자에게 투여될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
실시예 1∼4
건강한 지원자 4명으로부터 말초혈액을 각각 얻은 다음, 하기와 같은 방법으로 PBMC를 분리한 후, 이를 배양하여 NK 세포의 활성화를 유도하였다.
(1) 사람의 말초혈액으로부터 PBMC의 분리
사람으로부터 얻은 각각의 말초혈액을 2500 rpm으로 5분간 원심분리하여 혈청 및 세포펠렛을 분리하였다. 얻어진 혈청을 새로운 시험관에 옮긴 후, 56℃에서 30분 동안 열처리하여 불활성화시켰다. 또한, 혈청이 제거된 세포 펠렛은 인산완충식염수에 부유시켰다. 피콜(ficoll)(GE healthcare 17-1440-02)을 샘플당 10 ml 씩 분주하고(세포부유물 20 ml 당), 인산완충식염수에 부유시킨 세포펠렛을 상기 피콜위에 가한 후, 2500 rpm으로 15분간 원심분리하여, 단핵구 세포를 함유하는 잔류 세포층(백혈구 세포층)을 분리하여 새로운 시험관에 옮겼다. 상기 세포에 인산완충식염수를 가하여 2500 rpm으로 5분간 원심분리하여 세척하였다. 얻어진 세포층 즉, PBMC를 ALyS505N-10 (Cell Science ＆ Technology Inst. Inc., 일본) 15 ml에 가하여 배양하였다.
(2) 분리된 PBMC의 배양을 통한 NK 세포의 활성화 유도
T75 플라스크에 인산완충식염수에 용해된 파이브로넥틴 용액(10 μg/ml) 5 ml를 가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 바닥면에 코팅층을 형성시킨 후, 인산완충식염수로 세척하였다. 인산완충식염수에 용해된 면역글로블린 G 용액(2 mg/ml) 5 ml를 가하고, 실온에서 30분 동안 인큐베이션하여 면역글로블린 G 코팅층을 형성시킨 후, 인산완충식염수로 세척하였다.
ALyS505N-10 (Cell Science ＆ Technology Inst. Inc., 일본) 15 ml에 (1)에서 분리한 불활성화된 혈청을 5%의 농도로 첨가하고, (1)에서 얻어진 PBMC를 약 1-2 X 107 의 농도로 부유시킨 후, human 항 NKp46 항체를 0.5 μg/ml의 농도로 가하였다. 얻어진 배양혼합물을 상기에서 준비한 파이브로넥틴 및 면역글로블린 G가 코팅된 플라스크에 가한 후, 38℃에서 20시간 배양하고, 다시 37℃에서 13일간 CO2 배양기에서 배양하였다. 배양기간 중 2-3일에 한 번씩 배지(즉, (1)에서 분리한 불활성화된 혈청 및 항 NKp46 항체를 함유하는 ALyS505N-10(Cell Science ＆Technology Inst. Inc., 일본)를 동일한 부피로 첨가해 주었다. 항 NKp46 항체는 PBMC를 첫 번째 배지에 부유시킬 경우에만 사용하였으며, 그 후 배지를 보충할 때는 첨가하지 않았다.
시험예 1. 유세포 분석(flow cytometry analysis)
실시예 1∼4의 (1)에서 분리된 각각의 PBMC 및 (2)에서 얻어진 각각의 수확된 세포(즉, 활성화시킨 NK 세포를 포함하는 림프구)를 인산완충식염수에 부유시키고, 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 각각의 세포를 세척하였다. 각각의 세포를 1 x 106/ml의 농도로 에펜도르프 시험관에 분주하고, 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리한 다음 상층액을 제거하고 세포 펠렛을 얻었다. 얻어진 세포 펠렛에 하기 표 1의 형광물질을 포함하는 항체를 각각 가한 후, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
| 형광물질 | 항체 | 사용량 |
| FITC | 인간 항-CD3 항체 | 10㎕ |
| PerCp | 인간 항-CD16 항체 | 5㎕ |
| APC | 인간 항-CD56 항체 | 5㎕ |
상기 혼합물을 1200 rpm으로 5분 동안 2회 원심분리하여 세척하고, Cytofix/cytopermTM(BD science, 미국) 250 ㎕를 넣고, 4℃에서 20분 동안 인큐베이션하였다. 1x Perm/WashTM 완충액(BD science, 미국)을 가하여 1200 rpm으로 5분 동안 2회 원심분리한 후, 얻어진 세포 펠렛에 PE-컨쥬게이티드 인간 항-IFN-γ 항체 20 ㎕를 가하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. FACS 완충액(2% FBS가 첨가된 인산완충식염수)을 가하여 1200 rpm으로 5분 동안 2회 원심분리하고, 유세포 분석기(BD FACS calibur)로 분석하였다. 실시예 1 내지 4로부터 얻어진 샘플들로부터 도출된 결과는 각각 도 1 내지 도 4와 같다.
도 1(실시예 1로부터 얻어진 세포)의 결과로부터, PBMC로 부터 14일간 배양 증식한 활성화 림프구는 CD3- CD56+ CD16+ IFN-γ+ 세포집단을 배양개시일 0.5%에서 배양 14일 후 64.6%로 현저히 증가되는 것을 확인할 수 있다. IFN-γ은 면역세포의 활성능을 평가하는 중요한 지표로서, 상기 결과는 얻어진 NK 세포를 포함하는 림프구가 우수한 암세포 살상력을 가지고 있음을 의미한다. 도 1의 결과와 마찬가지로, 도 2-4 결과 역시, CD3- CD56+ CD16+ IFN-γ+ 세포집단이 배양개시일에 비해 배양 14일 후 현저히 증가되었다. 각각의 결과를 요약하면 하기 표 2와 같다.
|
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CD3-CD56+ | CD3- CD56+ CD16+ | CD3- CD56+ CD16+ IFN-γ+ | 증가 배수 | |||
| 배양 0일 | 배양 14일 | 배양 0일 | 배양 14일 | 배양 0일 | 배양 14일 | ||
| 실시예 1 | 18.7 | 28.3 | 69.1 | 18.6 | 0.5 | 64.6 | 42.9 |
| 실시예 2 | 19.8 | 35.2 | 51.7 | 64.8 | 6.9 | 70.1 | 111 |
| 실시예 3 | 37.7 | 46.3 | 84.8 | 72.7 | 6.1 | 74.4 | 100 |
| 실시예 4 | 24.3 | 10.9 | 86.3 | 54.1 | 0.2 | 54 | 82.5 |
* CD3- CD56+: 일반적인 NK세포,
* CD3- CD56+ CD16+: NK 세포를 활성화시킬 수 있는 CD16 마커를 가진 NK 세포
* CD3- CD56+ CD16+ IFN-γ+: 우수한 암세포 살상력을 지닌 NK 세포
시험예 2. 세포 배양액(cell culture supernatant) 중 IFNγ의 함량 측정
실시예 1 내지 4의 (2)에서 얻어진 각각의 수확된 세포(즉, 활성화시킨 NK 세포를 포함하는 림프구)를, 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리한 다음, 상층액을 취하여 에펜도르프 시험관에 옮기고 -20℃에서 보관하였다. 샘플 중 IFN-γ의 함량은 Human IFNg ELISA Ready-Set-Go kit (Ebioscience Cat 88-7316)을 이용하여, 하기 완충액(표 3)을 사용하여, 측정하였다.
| 완충액 | |
| 1 | Coating Buffer powder (Cat 00-0044-59) |
| 2 | 세척 완충액 (0.05% 트윈20을 포함하는 1X 인산완충식염수) |
| 3 | 반응정지 용액(2N H2SO4) |
| 4 | 5X assay diluent (Cat 00-4202-55) |
코팅 완충액 12 ㎖에 Capture Ab (14-7318-68) 48 ㎕를 가하여, 웰당 100 ㎕의 부피로 가한 후, 4℃에서 약 12시간 이상 인큐베이션하였다. 세척 완충액을 사용하여 5회 세척하고, 1x asssy diluent 완충액을 웰당 200 ㎕를 가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 재조합 인간 IFN-γ (39-8319-60) 5 ㎕를 1x asssy diluent 완충액 10 ㎖에 첨가하고(500 pg/㎖), 7.8 pg/ml ∼ 500 pg/ml의 농도로 희석하여 얻어진 희석액을 웰당 100 ㎕를 가하여 표준액(Standard solution)을 제조하였다. 또한, 실시예 1 내지 4에서 얻어진 각각의 배양액을 웰당 100 ㎕씩 첨가하여 샘플 용액을 제조하였다. 표준액 및 샘플을 각각 4℃에서 약 12시간 이상 인큐베이션하였다. 각각의 웰에 세척 완충액을 첨가하여 5회 세척하였다. 1x asssy diluent 완충액 12 ㎖에 detection Ab (Cat 33-7319-68) 48 ㎕를 첨가하여 얻어진 용액을 웰당 100 ㎕를 가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척 완충액으로 5회 세척하였다. 효소(아비딘-HRP) (Cat 00-4100-94) 48 ㎕를 1x asssy diluent 완충액 12 ㎖에 첨가하여 얻어진 용액을 웰당 100 ㎕를 가하고 실온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 세척완충액으로 7회 세척하였다. 기질용액(1x TMB)(Cat 00-4202-56)을 웰당 100 ㎕를 가하고, 약 15분 후에 샘플의 발색 변화를 확인한 다음, 반응정지 용액을 웰당 50 ㎕를 가한 후, 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 5는, 상기와 같이, 실시예 1 내지 4에서 얻어진 CD3- CD56+ CD16+ IFN-γ+ 세포집단을 포함하는 전체 활성화림프구를 대상으로 IFN-γ 분비량을 ELISA 분석을 통하여 얻어진 결과이다. 도 5의 결과로부터, 모든 검체(즉, 실시예 1 내지 4에서 얻어진 세포)에 있어서 배양개시일에 비해 14일간 배양 증식한 경우에 월등히 높은 IFN-γ 생산능을 나타냈다. 이러한 결과는 도 1 내지 4의 세포질 내 IFN-γ 생산능 결과와 일치하며, 따라서 이러한 IFN-γ 생산능에 비추어 볼 때, 우수한 암세포 살상력을 예측할 수 있다.
시험예 3. MTT 분석
96 웰 플레이트에 인체유래 유방암 세포주 MCF-7 세포를 1x104 cells/100 ㎕의 농도로 시딩한 후, 37℃에서 24시간 동안 인큐베이션하였다. 실시예 2에서 얻어진 세포를 하기 Effector cell:Target cell (E/T) 비율(표 4)로 100 ㎕ 배지(ALyS505N)에 부유하고, 상기 MCF-7 세포와 함께 37℃에서 24시간 동안 공배양하였다.
| ET 비율 | 세포수 |
| 5:1 | 5 x 104 |
| 10:1 | 1 x 105 |
| 20:1 | 2 x 105 |
배양액을 2500 rpm에서 5분간 원심분리하고, 상층액을 조심스럽게 걷어내고 세포 펠렛을 1x 인산완충식염수로 2회 세척한 다음, 1x MTT 시약을 웰당 100 ㎕를 첨가한 후, 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션하였다. MTT 시약을 조심스럽게 제거하고, DMSO (dimethyl sulfoxide)를 웰당 50 ㎕를 첨가한 후, 샘플의 발색변화를 확인하고, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
도 6은, 상기와 같이, 인체유래 유방암 세포주 MCF-7 세포를 대상으로 본 발명에 따라 얻어진 활성화림프구의 세포독성(cytotoxicity)을 평가한 결과이다. 도 6으로부터 알 수 있는 바와 같이, 활성화림프구의 비율을 증가시킬수록 유방암 세포 MCF-7이 더 억제되는 현상을 나타냈다.
따라서, 상기 결과들로부터, 본 발명에 따라 얻어진 림프구는 CD16+ IFN-γ+ NK세포를 포함하고 있으며, 우수한 IFN-γ 생산능 및 암세포에 대한 세포독성을 가지고 있음을 알 수 있다.
실시예 5. 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조
건강한 지원자로부터 말초혈액을 각각 얻은 다음, 실시예 1∼4와 동일한 방법으로 PBMC를 분리한 후, 이를 배양하여 NK 세포의 활성화를 유도하였다. 즉, 실시예 1∼4의 (1)과 동일한 방법으로 사람의 말초혈액으로부터 PBMC를 분리한 후, 실시예 1∼4의 (2)와 동일한 방법으로 38℃에서 20시간 배양하고, 다시 37℃에서 13일간 CO2 배양기에서 배양한 다음, 허셉틴(Herceptin)TM을 100 ㎍/1 X 106 cells의 농도로 처리하고 다시 37℃에서 1시간 동안 CO2 배양기에서 배양한 후, 인산완충액으로 2회 세척하여 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 얻었다.
실시예 6.
허셉틴(Herceptin)TM을 처리 후, 4℃에서 1시간 동안 CO2 배양기에서 배양한 것을 제외하고는, 실시예 5와 동일한 방법으로, 항HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 얻었다.
실시예 7.
허셉틴(Herceptin)TM을 처리 후, 실온(약 25℃)에서 1시간 동안 CO2 배양기에서 배양한 것을 제외하고는, 실시예 5와 동일한 방법으로, 항HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 얻었다.
시험예 4. 인큐베이션 온도에 따른 결합능 분석
항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구에 대하여 항체의 결합능을 유세포 분석(flow cytometry analysis)을 통하여 분석하였다.
유세포 분석을 위하여, 형광물질 FITC 가 결합된 허셉틴(Herceptin)TM을 먼저 제조하였다. 즉, FITC 분말(Sigma 사) 10 mg을 1 ml 디메틸술폭시드에 용해시킨 후, 허셉틴(Herceptin)TM 15 mg을 상기 용액에 첨가한 후 볼텍싱(vortexing)하였다. 은박지로 차광한 후, 교반하면서 4℃에서 밤새 반응시켰다. PD-10 Desalting 컬럼 (GE Healthcare)을 사용하여 FITC가 결합된 항체를 분리하였다. 상기 분리는 다음과 같이 수행하였다: PD-10 컬럼으로부터 보존 용액(Storage Solution)을 제거한 후, 인산완충액으로 평형화시키고, FITC와 허셉틴(Herceptin)TM과의 반응용액 1 ml을 컬럼에 통과시킨 다음, 인산완충액 5 ml를 통과시켰다. 컬럼을 통해 나온 용액을 5 drop씩 1.5 ml 시험관에 채취하고, 각각의 시험관에서 5 ㎕씩 차례로 취하여 브래드포드 시약(Bradford reagent)(PIERCE 사)으로 허셉틴(Herceptin)TM 유/무를 확인하였다. 허셉틴(Herceptin)TM이 함유된 시험관만 50 ml로 옮기고, BSA Standard Protein (PIERCE 사)과 브래드포드 시약(Bradford reagent)(PIERCE 사)을 이용하여, 용액 내 허셉틴(Herceptin)TM을 정량한 다음, 인산완충액을 사용하여 500 ㎍/500㎕의 농도로 희석하였다.
상기에서 얻어진 FITC-허셉틴(Herceptin)TM 100 ㎍을 함유하는 용액을 사용하여, 실시예 5 내지 7과 동일한 방법으로, FITC-항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 얻었다. 얻어진 각각의 세포를 인산완충액으로 2회 세척한 후, 하기 표 5의 형광물질을 포함하는 항체를 각각 가한 후, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다.
| 형광물질 | 항체 | 사용량 |
| PE | 인간 항-CD3 항체 | 10㎕ |
| APC | 인간 항-CD56 항체 | 5㎕ |
상기 인큐베이션 혼합물을 1200 rpm으로 5분 동안 2회 원심분리하여 세척하고, FACS 완충액(2% FBS가 첨가된 인산완충식염수)을 가하여 유세포 분석기(BD FACS calibur)로 분석하였다. 그 결과는 도 7과 같다.
도 7의 결과로부터, 말초혈액 단핵구세포(PBMC)로부터 약 14일간 배양 증식한 활성화 림프구에 항-HER2/neu 항체를 4 ℃, 1시간 처리한 경우, 약 51.1%의 CD3- CD56+ NK 세포에 항-HER2/neu 항체가 결합되어 가장 우수한 결합능을 나타냄을 알 수 있다.
시험예 5. 시험관 내(in vitro) 세포독성 시험
유방암 세포주인 SKBr3(연세대학교 의과대학 김경섭교수님 연구실로부터 분양)에 대한, 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 세포독성을 Terascan Assay 방법으로 평가하였다. Terascan Assay 장치(미네르바텍 사, 일본)는 세포의 형광량을 이용하여, 세포 살상정도를 측정하는 장치로서, Calcein-AM 형광물질을 이용하여, 암세포 세포질에 형광물질을 염색시켜 살아있는 세포에서만 발색되고 세포가 죽으면 형광발색이 안되는 원리를 이용한 것이다.
유방암 세포주 SKBr3 세포를 시험에 사용하기 24 시간 전에 FBS 10%를 함유하는 RPMI 1640 배지 중에서 37℃에서 배양하여 사용하였다. SKBr3 세포를 1X106 cells/ml의 농도로 FBS 10%를 함유하는 RPMI 1640 배지에 부유시키고, Calcein-AM 형광물질을 20 ㎍/20 ㎕로 첨가한 후, 37℃에서 30 분 동안 인큐베이션 하였다. 얻어진 배양물을 2000 rpm에서 3분 동안 원심분리하여 세척한 후(3회), SKBr3 세포를 5X103 cells/50 ul의 비율로 FBS 10%를 함유하는 RPMI 1640 배지에 부유시켰다. SKBr3 세포를 96 well Micro Half Well Plate에 5X103 cells/well로 접종하였다.
실시예 5에서 얻어진 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 2X106 cells/500 ㎕의 비율로 FBS 10%를 함유하는 RPMI 1640 배지에 부유시킨 후, 다음 표 6과 같이 half dilution 하였다.
| 1X106 | 250 ㎕ |
| 5X105 | 250 ㎕ |
| 2.5X105 | 250 ㎕ |
| 1.25X105 | 500 ㎕ |
상기의 비율로 부유된 세포를 96 well Micro Half Well Plate에 100 ㎕/well의 농도로 접종하였다 (각각 duplication).
Terascan Assay 방법에서, Terascan 플레이트 디자인은 도 8과 같으며, 도 8에서 P. Control(양성 대조군)은 사멸된 SKBr3를 첨가한 것이고(세포 사멸 유도시약인 20% NP-40을 이용하여 SKBr3를 완전 사멸시킨 후, 최대 형광을 나타나게 하여 양성대조군으로 사용), N. Control (음성 대조군)은 살아있는 SKBr3 세포를 첨가한 것이고, Effector cell(항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구)과 Target cell(SKBr3 세포)의 공배양에 있어서의 비율은 다음 표 7과 같다.
| 비율 | Effector cell | Target cell |
| 40 : 1 | 1X106 | 5X103 |
| 20 : 1 | 5X105 | 5X103 |
| 10 : 1 | 2.5X105 | 5X103 |
| 5 : 1 | 1.25X105 | 5X103 |
상기와 같은 비율로 96 well Micro Half Well Plate에서 30분간 실온에서 인큐베이션한 후, Zero time 때 SKBr3 형광량을 측정(Terascan 고유 측정 프로그램을 이용하여 측정)하고, 양성 대조군에는 세포의 완전사멸을 위하여 20% NP-40 20 ㎕을 첨가하였다. 37℃에서 4시간 동안 인큐베이션한 후, Terascan 고유 측정 프로그램을 이용하여 SKBr3의 형광량 측정하고, Terascan Calibration 프로그램을 이용하여, 세포독성(cytotoxicity) %를 측정하였다.
상기와 같이 세포독성을 측정한 결과는 도 9와 같다. 도 9의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구는 항체가 비결합된 림프구에 비하여 2배 이상의 높은 세포독성을 나타내었다.
시험예 6. 생체 내(in vivo) 항-종양 활성 평가
5주령의 Nod-Scid 마우스를 각각 3마리씩 다음과 같이 3개의 군으로 나누었다. 제1군: 유방암 세포주인 SKBr3 세포를 처리한 군, 제2군: SKBr3 세포 및 항-HER2/neu 항체가 비-결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구(즉, 항체 결합없이, 활성화된 자연살해 세포를 포함하는 림프구)를 처리한 군, 제3군: SKBr3 세포 및 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 처리한 군.
종양세포 이식 5일 및 3일 전에 면역억제제인 사이클로포스파미드( cyclophosphamide)를 150 mg/kg의 용량으로 각 군의 마우스에 복강내 주사하였다. 각군의 마우스에 유방암 세포주인 SKBr3 세포를 각각 2X107 cells/마리로 피하주사하였다. 제2군의 마우스에는 항-HER2/neu 항체가 비-결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 5X107 cells/100 ㎕의 비율로 PBS에 현탁시켜 꼬리정맥을 통하여 주입한 후 다시 7일째에 동일한 방법으로 세포를 주입하였다. 제3군에는 실시예 5에서 얻어진 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 5X107 cells/100 ㎕의 비율로 PBS에 현탁시켜 꼬리정맥을 통하여 주입한 후 다시 7일째에 동일한 방법으로 세포를 주입하였다. SKBr3 세포의 주입 후, 2 주 동안 종양 크기[(길이 X 넓이 X 높이) / 2]를 측정하였으며, 그 결과는 도 10과 같다. 또한, 2주째에 각 군의 마우스를 촬영한 사진 및 상기 마우스를 치사시킨 후 종양 크기를 측정한 결과는 도 11과 같다.
도 10 및 도 11의 결과로부터 알 수 있는 바와 같이, 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 투여한 군이 항체가 비결합된 림프구를 투여한 군에 비하여 우수한 항종양 활성을 나타내었다. 종양 대조군(제1군)도 종양크기가 자연적으로 감소하는 경향을 보였으나, 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 투여한 군이 종양 크기 감소가 현저하게 증가하였다.
Claims (9)
- (a) 바닥면에 면역글로블린 G가 코팅된 배양용기에, 항 NKp46 항체, 항 NKp44 항체, 항 NKp30 항체 및 항 NKG2D 항체로 이루어진 군으로부터 1종 이상 선택된 자연살해 세포의 표면 단백질 항체, 혈청, 및 인터루킨-2를 포함하는 배양액을 가한 후, 말초혈액으로부터 분리된 단핵구 세포를 배양하는 단계; 및
(b) 단계(a)로부터 얻어진 배양액에 항-HER2/neu 항체를 처리하여 추가로 배양하여 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 얻는 단계
를 포함하는, HER2/neu 항원을 발현하는 암세포로의 표적지향을 위한 자연살해 세포를 포함하는 림프구의 제조방법. - 제1항에 있어서, 단계(a)에서 상기 바닥면에 면역글로블린 G가 코팅된 배양용기가 접착단백질을 바닥면에 코팅한 후, 면역글로불린 G를 함유하는 용액을 가하여 코팅함으로써 제작되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항에 있어서, 단계(a)에서 상기 혈청이 상기 단핵구 세포가 분리된 말초혈액으로부터 얻어진 것임을 특징으로 하는 제조방법.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 단계(b)가 단계(a)로부터 얻어진 배양액에 항-HER2/neu 항체를 50∼500 ㎍ / 1×106 cells의 비율로 처리하고, 4℃ 내지 37 ℃에서 30분∼24시간 동안 배양한 후, 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구를 분리함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제5항에 있어서, 상기 배양이 4 ℃에서 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
- 제1항 내지 제3항, 제5항, 및 제6항 중 어느 한 항에 따른 제조방법으로 제조된 항-HER2/neu 항체가 결합된 자연살해 세포를 포함하는 림프구; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, HER2/neu 항원을 발현하는 암을 치료하기 위한 표적지향용 약학 조성물.
- 제7항에 있어서, 상기 HER2/neu 항원을 발현하는 암이 유방암, 난소암, 위암 및 자궁내막암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
- 제8항에 있어서, 상기 HER2/neu 항원을 발현하는 암이 유방암인 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
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