JP2017093429A - 治療用エキソソームを検出する方法 - Google Patents

Abstract

【課題】エキソソームの活性を検出するステップを含む、治療用エキソソームを検出する方法の提供。【解決手段】（ａ）免疫調節活性、（ｂ）補体阻害活性、（ｃ）プロテアソーム活性、（ｄ）糖分解酵素活性、（ｅ）抗酸化活性、（ｆ）細胞外マトリクス修飾活性、（ｇ）ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性、（ｈ）イオンホメオスタシス活性、および（ｉ）シャペロン活性からなる群から選択されるエキソソームの活性を検出するステップを含む、治療用エキソソームを検出する方法。【選択図】図１

Description

本発明は、医薬、細胞生物学、分子生物学、および遺伝学の分野に関する。本発明は、
医薬の分野に関する。

エキソソームはかつて、細胞が不要なタンパク質を廃棄するための「ごみ袋」であると
考えられていた^１。しかし、エキソソームは次第に、特に細胞伝達において重要な生理学
的機能を有していると考えられてきている。

エキソソームは、多くの細胞型によって分泌される５０〜１００ｎｍの脂質二重膜小胞
である^２。これらは、分泌された細胞生産物の分類に属し、全ての分泌された膜小胞を広
く含む微粒子として知られている。エキソソーム以外に、微粒子には、微小胞（１００〜
１０００ｎｍ）、エクトソーム（５０〜２００ｎｍ）、膜粒子（５０〜８０ｎｍ）、エキ
ソソーム様小胞（２０〜５０ｎｍ）、およびアポトーシス小胞（５０〜５００ｎｍ）が含
まれる。これらの異なるクラスの微粒子を区別するための主要なパラメータは、それらの
サイズであり、最も明確に定義されている分類はエキソソームである。

エキソソームは、１０００００ｇで沈殿させた場合に１．１０から１．１９ｇ／ｍｌの
ショ糖密度を有し、スフィンゴミエリン、セラミド、脂質ラフト、および曝露したホスフ
ァチジルセリンを含有する、コレステロールに富んだ脂質膜を有する。エキソソーム生合
成のプロセスは複雑であり、生合成経路およびエンドサイトーシス経路を介する複雑な細
胞内膜輸送およびカーゴ選別を伴う。この複雑な生合成の証拠として、エキソソームの顕
著な特徴に、小胞体のおよびＡｌｉｘタンパク質、Ｔｓｇ１０１タンパク質、Ｒａｂタン
パク質などのエンドソームのマーカーがある。エキソソームは、多小胞体（ＭＶＢ）と原
形質膜との融合を介する放出の前は、多小胞体内に保存されている。

エキソソームは、特に免疫細胞または腫瘍細胞における細胞間伝達を仲介することが示
されている^３−８。最近、本発明者らは、この機能を、組織修復を含むまでに拡張し、そ
の際、本発明者らは、心筋虚血再かん流（ＭＩ／Ｒ）傷害のマウスモデルにおいて、ヒト
ＥＳＣ由来のＭＳＣによって分泌されるエキソソームが梗塞サイズを約５０％低減させる
ことを報告した^９,１０。これらのエキソソームは、ＨＰＬＣでのサイズ排除によって直
径が約５０〜１００ｎｍの均質なサイズの微粒子の集団として精製され、これらは、タン
パク質負荷およびＲＮＡ負荷の両方を有している^{９,１１,１２}。

しかし、ＭＳＣエキソソームによるこの心保護効果の根底にある（１つまたは複数の）
メカニズムは、依然として解明されていない。その理由の一部は、本発明者によるエキソ
ソームの生物学的能力の理解が全体として欠如していることに起因し得る。様々な細胞型
および生体液からのエキソソームの広範囲なプロテオミクスおよびＲＮＡプロファイリン
グにも関わらず、エキソソームにおけるタンパク質およびＲＮＡの生物学的能力は、依然
としてほとんど調査されていない。生物学的能力についてのこれまでのほとんどの研究は
、免疫細胞、特に樹状細胞からのエキソソームによって引き起こされる免疫応答に限定さ
れているが^２、これらの生物学的応答の分子的または生化学的基礎は、依然として解明さ
れていない。

この欠如に対処するために、本発明者らは、ＨＰＬＣ精製されたエキソソームの包括的
なプロテオミクスプロファイリングを行って、これらのエキソソーム内に存在するタンパ
ク質をまず同定し、次いで、これらのタンパク質を用いて、エキソソームにおける生物学
的活性または生物学的能力のタイプを予測した。これを次に、生化学的または細胞的アッ
セイによって立証した。

全部で８６６の固有の遺伝子産物を検出し、これらは、３２の出現頻度の高い生物学的
プロセスに機能的にクラスター化することができ、このことは、エキソソームが、広範な
生化学的または細胞的影響を及ぼす能力を有することを示す。この能力を評価するために
、本発明者らはタンパク質を選択し、当該タンパク質は、その生化学的および／または細
胞的活性を評価するためのアッセイが利用可能なものであり、このアッセイは、組み合わ
せて、エキソソームにおける広範な生化学的および細胞的能力を実証し、ＭＳＣエキソソ
ームの心保護特性のための候補分子メカニズムを提供するものである。

本発明において調査されたタンパク質には、グルコースを分解してＡＴＰおよびＮＡＤ
Ｈを生成するための糖分解酵素、糖分解を増大させるＰＦＫＢ３、アデノシン受容体を介
してシグナル伝達カスケードを活性化し得るアデノシンにＡＭＰを加水分解するＣＤ７３
、膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成を阻害するＣＤ５９、ならびに２０Ｓプロテアソームが
含まれる。

本発明の第１の態様によれば、本発明者らは、治療用エキソソームを検出する方法を提
供する。本方法は、エキソソームの活性を検出するステップを含み得る。本方法は、免疫
調節活性を含み得る。これは、補体阻害活性を含み得る。これは、プロテアソーム活性を
含み得る。これは、糖分解酵素活性を含み得る。これは、抗酸化活性を含み得る。これは
、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性を含み得る。これは、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エク
ト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を含み得る。これは、イオンホメオスタシス活性
を含み得る。これは、シャペロン活性を含み得る。これは、上記のいずれか１つまたは複
数を含み得る。

活性は、免疫調節活性を含み得る。免疫調節活性は、表Ｄ１０に示されるタンパク質の
活性を検出することによって検出することができる。

活性は、補体阻害活性を含み得る。補体阻害活性は、表Ｄ１に示されるタンパク質の活
性を検出することによって検出することができる。

活性は、プロテアソーム活性を含み得る。プロテアソーム活性は、表Ｄ２に示される１
つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出すること
ができる。

活性は、糖分解酵素活性を含み得る。糖分解酵素活性は、表Ｄ３に示される１つまたは
複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる
。

活性は、抗酸化活性を含み得る。抗酸化活性は、表Ｄ４に示される１つまたは複数、好
ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。

活性は、細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性を含み得る。細胞外マトリクス（ＥＣＭ
）修飾活性は、表Ｄ５に示される１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を
検出することによって検出することができる。

活性は、ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を含み得る
。ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性は、表Ｄ６に示され
る１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出する
ことができる。

活性は、イオンホメオスタシス活性を含み得る。イオンホメオスタシス活性は、表Ｄ７
に示される１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって
検出することができる。

活性は、シャペロン活性を含み得る。シャペロン活性は、表Ｄ８に示される１つまたは
複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる
。

活性は、免疫調節活性を含み得る。免疫調節活性は、表Ｄ１０に示される１つまたは複
数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。

活性が検出される場合、エキソソームは、補体介在性の細胞溶解を阻害し得る可能性が
あり得る。これはまた、あるいは、またはそれに加えて、例えば心筋虚血および再かん流
傷害のマウスモデルもしくはブタモデルにおいて測定されたとき、梗塞サイズを低減させ
得るか、または、例えば過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）誘発性の細胞死のインビトロアッセイに
おいて測定されたとき、酸化ストレスを低減させ得る。これは、上記の活性の両方を有し
得る。

活性が検出される場合、エキソソームは、治療的活性を有する治療用エキソソームを含
む可能性があり得る。

治療的活性は、心保護活性を含み得る。

治療的活性は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、および変性疾患、例えば糖尿病、
アルツハイマー病、パーキンソン病、がん、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚障害、皮膚病変、
皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、ベ
ーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚のＴ細胞リンパ腫、潰瘍、線維症および機能喪失
を含む慢性的な組織リモデリングをもたらす炎症および免疫異常調節を誘発する初期の傷
害を特徴とする病的状態、腎臓虚血性傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎および鼻炎、または
整形外科的疾患からなる群から選択される１つまたは複数の疾患に対するものであり得る
。

本発明の第２の態様によれば、（ａ）分子量、サイズ、形状、組成、または生物学的活
性に基づいて他の成分からエキソソームを分離することを場合によって含む、間葉系幹細
胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）からエキソソームを単離するステップ、および（ｂ）上記に
記載されるような１つまたは複数のタンパク質の活性を好ましくは検出することによって
、単離されたエキソソームにおいて上記に記載されるような活性を検出するステップを含
む方法が提供される。

本発明者らは、本発明の第３の態様によれば、エキソソームを生産する方法を提供し、
本方法は、（ａ）間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）を得るステップと、（ｂ）例え
ば＞１０００ｋＤａの膜上での限外濾過によって、間葉系幹細胞馴化培地を濃縮するステ
ップと、（ｃ）濃縮された間葉系幹細胞馴化培地を、ＴＳＫ ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ
、６×４０ｍｍ、またはＴＳＫゲルＧ４０００ ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍカラムを
用いるような、サイズ排除クロマトグラフィーにかけるステップと、（ｄ）準弾性光散乱
（ＱＥＬＳ）によって検出されるもののような動的光散乱を示す、例えば２２０ｎｍでの
ＵＶ吸光画分を選択するステップとを含み、ステップ（ｄ）は、例えば、１１〜１３分、
例えば１２分の保持時間で溶出する画分を回収すること、および、上記に記載されるよう
な１つまたは複数のタンパク質の活性を好ましくは検出することによって、エキソソーム
における上記に記載されるような活性を検出することを含む。

本発明の第４の態様として、エキソソームが治療的活性を含むかどうかを検出する方法
が提供され、本方法は、上記に記載されるような酵素活性を検出することを含み、ここで
、酵素活性が検出される場合、エキソソームは治療的活性を含む。

本発明の実施は、別段の指示がない限り、化学、分子生物学、微生物学、組換えＤＮＡ
、および免疫学の従来の技術を採用し、これらは当業者の能力の範囲内である。このよう
な技術は、文献において説明されている。例えば、Ｊ．Ｓａｍｂｒｏｏｋ、Ｅ．Ｆ．Ｆｒ
ｉｔｓｃｈ、およびＴ．Ｍａｎｉａｔｉｓ、１９８９、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉ
ｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、第１〜３巻、Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ；Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ
．ら（１９９５および定期的な増補、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、チャプター９、１３、および１６、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌ
ｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、Ｎ．Ｙ．）；Ｂ．Ｒｏｅ、Ｊ．Ｃｒａｂｔｒｅ
ｅ、およびＡ．Ｋａｈｎ、１９９６、ＤＮＡ Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｅｑｕｅ
ｎｃｉｎｇ：Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆
Ｓｏｎｓ；Ｊ．Ｍ．ＰｏｌａｋおよびＪａｍｅｓ Ｏ’Ｄ．ＭｃＧｅｅ、１９９０、Ｉｎ
Ｓｉｔｕ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ａｎｄ Ｐｒａｃｔ
ｉｃｅ、Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ（編）、
１９８４、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃ
ａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉｒｌ Ｐｒｅｓｓ；Ｄ．Ｍ．Ｊ．ＬｉｌｌｅｙおよびＪ．Ｅ
．Ｄａｈｌｂｅｒｇ、１９９２、Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ：ＤＮＡ
Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ Ｐａｒｔ Ａ：Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｈｙｓｉｃａｌ
Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、Ａ
ｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ、Ｕｓｉｎｇ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ：Ｐｏｒｔａｂｌｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ＮＯ．Ｉ ｂｙ Ｅｄｗ
ａｒｄ Ｈａｒｌｏｗ、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ、Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ（１９９９、Ｃｏｌ
ｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢＮ ０−
８７９６９−５４４−７）；Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎ
ｕａｌ ｂｙ Ｅｄ Ｈａｒｌｏｗ（編者）、Ｄａｖｉｄ Ｌａｎｅ（編者）（１９８８
、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、ＩＳＢ
Ｎ ０−８７９６９−３１４−２）、１８５５．Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｓ
ｃｒｅｅｎｉｎｇ、Ｒａｍａｋｒｉｓｈｎａ Ｓｅｅｔｈａｌａ、Ｐｒａｂｈａｖａｔｈ
ｉ Ｂ．Ｆｅｒｎａｎｄｅｓ編（２００１、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、ＮＹ、Ｍａｒｃｅｌ Ｄ
ｅｋｋｅｒ、ＩＳＢＮ ０−８２４７−０５６２−９）；ならびにＬａｂ Ｒｅｆ：Ａ
Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｒｅｃｉｐｅｓ，Ｒｅａｇｅｎｔｓ，ａｎｄ Ｏｔｈｅｒ Ｒ
ｅｆｅｒｅｎｃｅ Ｔｏｏｌｓ ｆｏｒ Ｕｓｅ ａｔ ｔｈｅ Ｂｅｎｃｈ、Ｊａｎｅ
ＲｏｓｋａｍｓおよびＬｉｎｄａ Ｒｏｄｇｅｒｓ編、２００２、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉ
ｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ＩＳＢＮ ０−８７９６９−６３０−３を
参照されたい。これらの一般的なテキストのそれぞれは、参照することによって本明細書
に組み込まれる。

ＭＳＣ馴化培地において事前に同定された７３９のタンパク質と、精製されたエキソソームにおいて同定された８６６のタンパク質との共通集合を示す図である。 エキソソームタンパク質のプロテオミクス分析を示す図である。エキソソームにおける８６６の遺伝子産物を、３２の出現頻度の高い生物学的プロセスおよび３つの出現頻度の低い生物学的プロセスに機能的にクラスター化した（ｐ＜０．００１）。馴化培地（ＣＭ）において見られたがエキソソームにおいては見られなかった４２１のタンパク質を、１１の出現頻度の高い生物学的プロセスおよび２つの出現頻度の低い生物学的プロセスに機能的にクラスター化した。黒いバーは、エキソソームにおける遺伝子産物についてのプロセスを表し、白いバーは、ＣＭにおけるものであるがエキソソームにおけるものではない遺伝子産物についてのプロセスを表す。 エキソソームが糖分解を調節することを示す図である。 糖分解の略図である。 ゲラルデヒドホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ピルビン酸キナーゼｍ２アイソフォーム（ＰＫｍ_２）、およびｐＰＦＫＦＢ３についての、馴化培地（ＣＭ）およびエキソソーム（Ｅｘｏ）のウェスタンブロット分析を示す図である。 ＭＳＣエキソソームにおけるＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、およびＰＫｍ_２の酵素活性を、市販されているアッセイキットを用いて、ＡＴＰまたはピルビン酸の生産によって決定した図である。１単位（Ｕ）の酵素活性を、３７℃で１分当たり１μモルの生成物を生成するための活性であると規定する。 オリゴマイシン処理した細胞におけるＡＴＰ生産に対するエキソソームの影響を示す図である。Ｈ９Ｃ２心筋細胞をタイロード緩衝液で２回洗浄し、次いで、２０μｍｏｌのミトコンドリア阻害剤、オリゴマイシン、６ｍｍｏｌのグルコースを含有し、０．１μｇ／ｍｌのエキソソームを含むまたは含まないタイロード緩衝液内で１５分、３０分、および６０分間インキュベートした。細胞のＡＴＰ濃度を、ＡＴＰｌｉｔｅ １ステップ発光ＡＴＰ検出アッセイ系を用いて測定し、１５分でのエキソソームを有さない試料のＡＴＰ濃度に対して正規化した。^＊ｐ＝０．０１７３、^＊＊ｐ＝０．００９０ エキソソームにおける２０Ｓプロテアソームを示す図である。 ＰＭＳＡ１〜７ペプチドに特異的な抗体を用いる、ＭＳＣ馴化培地（ＣＭ）およびエキソソーム（Ｅｘｏ）のウェスタンブロット分析を示す図である。 ＭＳＣエキソソームにおけるプロテアソーム活性を、市販されているプロテアソーム活性アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて決定した。プロテアソーム活性は、プロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンの不存在下または存在下での蛍光発生ペプチドの分解速度によって測定した。１単位（Ｕ）の酵素活性を、３７℃で１分当たり１μモルの生成物を生成するための活性であると規定する。^＊ｐ＝０．０００２３ ＮＴ５Ｅ（エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼＣＤ７３）を介する、エキソソームのリン酸化されたＥＲＫおよびＡＫＴを示す図である。 特異的抗体を用いる、ＣＤ７３についてのＭＳＣ ＣＭおよびエキソソームのウェスタンブロット分析を示す図である。 馴化培地（ＣＭ）およびエキソソーム（Ｅｘｏ）におけるＣＤ７３活性がＡＭＰの加水分解からのリン酸イオンの生産によって測定されたことを示す図である。 Ｈ９Ｃ２細胞を一晩血清飢餓とし、次いで、１ｍＭのテオフィリンを含むまたは含まない培地と共に１時間インキュベートしたことを示す図である。細胞を次に、５０μＭのＡＭＰ、０．１μｇ／ｍｌのエキソソーム、またはＡＭＰおよびエキソソームと共に３０分間プレインキュベートした培地に５分間曝露した。細胞を次に採取し、溶解した。１０μｇの全タンパク質を、１：２０００希釈のウサギ抗ｐＥＲＫ１／２、１：２０００希釈のウサギ抗ＥＲＫ１／２、１：５００希釈のウサギ抗ｐＡＫＴ、または１：５００希釈のウサギ抗ＡＫＴを用いてイムノブロットした。 エキソソームが膜侵襲複合体（ＭＡＣ）の形成を阻害したことを示す図である。 ＣＤ５９特異的抗体を用いる、ＭＳＣ馴化培地（ＣＭ）およびエキソソーム（Ｅｘｏ）のウェスタンブロット分析を示す図である。 ＳＲＢＣを洗浄し、次いで、エキソソームの存在下または不存在下で、Ｃ５ｂ６およびＣ７を有するＰＢＳ内に再懸濁した。混合物を３７℃で１５分間インキュベートし、その後、Ｃ８およびＣ９を、ブロックＣＤ５９抗体を伴ってまたは伴わずに添加して、さらに３０分間インキュベートした。細胞を遠心分離し、上清内の、溶解したＳＲＢＣによって放出されたヘモグロビンの量を、４１５ｎｍでの吸光度によって測定した。陽性対照（全溶血）は、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で完全に溶解した細胞からの上清であった。陰性対照は、補体成分を添加していない試料である。陽性対照の吸光値を１００％に対して正規化した。^＊ｐ＝２．８Ｅ−０６、^＊＊ｐ＝３．５１Ｅ−０８。 ＭＳＣエキソソームがＴＬＲリガンドを有することを示す図である。 ＭＳＣエキソソームがＴＬＲ２を活性化させないことを示す図である。 ＭＳＣエキソソームがＴＬＲ４を活性化させることを示す図である。 ＭＳＣエキソソームがＴＨＰ−１細胞による炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの生産を誘発することを示す図である。 Ｔｒｅｇ細胞（ａ）またはＴｈ１７細胞（ｂ）へのＣＤ４＋マウスＴ細胞の分化を誘発することを示す図である。 自然免疫を介する適応免疫の調節を示す図である。 エキソソームについてのコンカナバリンＡで活性化したリンパ球の増殖アッセイを示す図である。

哺乳動物細胞は、タンパク質およびＲＮＡを含有するエキソソームを分泌する。仮定上
は、これらのエキソソームは、健康な細胞から採取および精製することができ、罹患細胞
またはストレスを受けた細胞における細胞資源を補充および強化するために用いられ、こ
れらの細胞に回復および修復を開始させ得る。例えば、本発明者らは、ヒト胚性幹細胞由
来の間葉系幹細胞からのエキソソームが急性心筋虚血再かん流傷害後の細胞死から心筋細
胞を救い得ることを実証している。ここで、本発明者らは、これらのエキソソームの生化
学的特性を説明する。これらの特性は、罹患細胞またはストレスを受けた細胞の治療にお
ける治療的能力についてエキソソーム調製物を同定、選択、または評価するために用いる
ことができる。

傷害または疾患の結果ストレスを受けている細胞は、類似の細胞機能障害を有している
ことが多い。これらは、ミトコンドリアの膜浸透性が増大しており、その結果、ＡＴＰお
よびＮＡＤＨの生産が低減し、ＲＯＳレベルが増大し、そしてＮａ、Ｃａ、Ｋ、およびＣ
ｌを含むイオンホメオスタシスを喪失している。また、ＥＲストレスおよび封入体の形成
および過剰な自然免疫応答をもたらす、変性タンパク質の蓄積も存在する。回復および修
復のプロセスを開始するためには、細胞はこれらの細胞機能障害をまず修正しなくてはな
らない。エキソソームは、タンパク質およびＲＮＡを含有する分泌型のリン脂質小胞であ
るため、これらの細胞機能障害を修正するために必要な細胞活性を迅速に開始し得る酵素
およびＲＮＡを送達する能力を有し得る。

ここで、本発明者らは、治療用エキソソームの生化学的特性を説明する。これらの生化
学的特性には、
ａ．補体活性の阻害（以下の表Ｄ１）
ｂ．変性タンパク質を分解するためのプロテアソーム活性（以下の表Ｄ２）
ｃ．ＡＴＰおよびＮＡＤＨを生成するための糖分解酵素（以下の表Ｄ３）
ｄ．ＮＡＤＰＨを生成するためのペントースリン酸経路酵素
ｅ．抗酸化活性（以下の表Ｄ４）
ｆ．ＭＭＰ／ＴＩＭＰ活性（以下の表Ｄ５）
ｇ．生存シグナル伝達経路を活性化させるためのＣＤ７３エクト−５’−エクトヌクレオ
チダーゼ活性（以下の表Ｄ６）
ｈ．イオンホメオスタシス、例えばカルシウム、ナトリウム、プロトン、カリウム、およ
び塩化物のチャネルを回復させるためのＡＴＰａｓｅ膜チャネルまたは輸送体（以下の表
Ｄ７）
ｉ．タンパク質の構造的完全性を維持するためのシャペロン活性（以下の表Ｄ８）
が含まれる。

潜在的な治療用のエキソソームは、これらの生化学的活性のためのタンパク質を有する
だけではなく、タンパク質が酵素的に活性ではなくてはならない。これらのタンパク質の
酵素活性は、したがって、エキソソーム調製物の治療的有効性についての代替マーカーで
あり得る。

本発明者らは、したがって、治療用エキソソームを規定、同定、および評価するための
多くの生化学的アッセイを提供する。

＜治療用エキソソームについてのアッセイ＞
本発明者らは、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）から由来可能である粒子、例えばエキソソーム
の、生物学的特性、特に生化学的特性を記載する。

本明細書において記載される方法および組成によれば、（ａ）補体阻害活性、（ｂ）プ
ロテアソーム活性、（ｃ）糖分解酵素活性、（ｄ）抗酸化活性、（ｅ）細胞外マトリクス
（ＥＣＭ）修飾活性、（ｆ）ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダー
ゼ活性、（ｇ）イオンホメオスタシス活性、（ｈ）シャペロン活性の１つまたは複数を含
むエキソソームは、治療的活性および（ｉ）免疫調節活性を含み得る。

このような特性を含むエキソソームは、以下に記載されるように、多くの疾患に対して
治療的な性質であり得、言い換えると、治療用エキソソームであり得る。用語「エキソソ
ーム」が本明細書において用いられる場合、文脈から可能である場合、「治療用エキソソ
ーム」も含むことが理解されよう。

エキソソームは、いくつかの手段のいずれかによって、例えば、ＭＳＣからの分泌、出
芽、または分散によって、ＭＳＣから由来可能であり得る。例えば、エキソソームは、Ｍ
ＳＣから生産、滲出、放出、流出され得る。ＭＳＣが細胞培養物内にある場合、エキソソ
ームは、細胞培養培地内に分泌され得る。

エキソソームは、小胞を特に含み得る。本明細書において記載される治療用エキソソー
ムは、本明細書において記載されるエキソソームの特性のいずれか１つまたは複数を含み
得る。

エキソソームは、脂質二重層によって限定された小胞または平坦な球体を含み得る。エ
キソソームは、４０〜１００ｎｍの直径を含み得る。エキソソームは、エンドソーム膜の
内側への出芽によって形成され得る。エキソソームは、約１．１３〜１．１９ｇ／ｍｌの
密度を有し得、ショ糖勾配で浮遊し得る。エキソソームは、コレステロールおよびスフィ
ンゴミエリン、ならびにＧＭ１、ＧＭ３、フロチリン、およびｓｒｃタンパク質キナーゼ
Ｌｙｎなどの脂質ラフトマーカーに富んでいる可能性がある。エキソソームは、間葉系幹
細胞または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）内に存在する１つまたは複数のタンパ
ク質、例えばＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭに特徴的または特異的なタンパク質を含み得る。

本発明者らは、ＭＳＣまたはＭＳＣ培養物によって馴化された培地において見られる１
つまたは複数の遺伝子を含み、かつ治療的活性を含む、エキソソームを提供する。このよ
うな治療用エキソソームは、（ａ）補体阻害活性、（ｂ）プロテアソーム活性、（ｃ）糖
分解酵素活性、（ｄ）抗酸化活性、（ｅ）細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性、（ｆ）
ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性、（ｇ）イオンホメオ
スタシス活性、（ｈ）シャペロン活性、および（ｉ）免疫調節活性からなる群から選択さ
れる１つまたは複数の活性を示すエキソソームを検出することによって同定することがで
きる。

エキソソームは、ＭＳＣによって分泌される分子を含み得る。このようなエキソソーム
、および、特にタンパク質またはポリペプチドを含む、エキソソームに含まれるいずれか
の分子の組み合わせは、例えば疾患の治療または予防の目的で、ＭＳＣもしくはＭＳＣに
よって馴化された培地の活性を補うために、またはＭＳＣもしくはＭＳＣによって馴化さ
れた培地の代わりに、用いることができる。

エキソソームは、細胞骨格において見られる細胞質性のタンパク質、例えばチューブリ
ン、アクチン、およびアクチン結合タンパク質、細胞内の膜融合体および膜輸送、例えば
アネキシンおよびｒａｂタンパク質、シグナル伝達タンパク質、例えばタンパク質キナー
ゼ、１４−３−３、およびヘテロ三量体Ｇタンパク質、代謝酵素、例えばペルオキシダー
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、脂質キナーゼ、およびエノラーゼ−１、ならびにテトラスパニ
ンファミリー、例えばＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ８２を含み得る。特に、
エキソソームは、１つまたは複数のテトラスパニンを含み得る。エキソソームは、ｍＲＮ
Ａおよび／またはマイクロＲＮＡを含み得る。

本明細書において用いられる用語「粒子」は、エキソソームを含むものであるが、個別
の実体を意味するために用いられ得る。粒子は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）または間葉系幹
細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）から単離されるものであり得る。粒子は、少なくともＭＳ
ＣまたはＭＳＣ−ＣＭの活性に関与し得る。粒子は、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭの機能の
実質的にほとんどまたは全てに関与し得、それを実行し得る。例えば、粒子は、ＭＳＣま
たはＭＳＣ−ＣＭの代替物（または生物学的代替物）であり得る。

用語「粒子」が本明細書において用いられる場合（かつ、文脈から可能である場合）、
エキソソームと同義語を含むと理解されよう。

エキソソームは、ＭＳＣまたはＭＳＣ−ＣＭが使用され得る治療的目的のいずれかに用
いることができる。

エキソソームは、好ましくは、治療的特性などの、間葉系幹細胞の少なくとも１つの特
性を有する。エキソソームは、生物学的活性などの生物学的特性を有し得る。エキソソー
ムは、ＭＳＣの生物学的活性のいずれかを有し得る。エキソソームは、例えば、ＭＳＣの
治療的活性または回復活性を有し得る。

ＭＳＣによって馴化された培地（例えば、以下に記載されるような、間葉系幹細胞馴化
培地またはＭＳＣ−ＣＭ）は、ＭＳＣの生物学的活性を含むことが知られており、ＭＳＣ
自体を代替し得る。例えば、ＷＯ２００９／１０５０４４を参照されたい。ＭＳＣの生物
学的特性または生物学的活性は、したがって、間葉系幹細胞馴化培地の生物学的特性また
は生物学的活性に対応し得る。したがって、エキソソームは、間葉系幹細胞馴化培地（Ｍ
ＳＣ−ＣＭ）の１つまたは複数の生物学的特性または生物学的活性を含み得る。

本明細書において記載される治療用エキソソームは、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−
ＣＭ）から単離することができ、（ａ）補体阻害活性、（ｂ）プロテアソーム活性、（ｃ
）糖分解酵素活性、（ｄ）抗酸化活性、（ｅ）細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性、（
ｆ）ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性、（ｇ）イオンホ
メオスタシス活性、（ｈ）シャペロン活性、および（ｉ）免疫調節活性の１つまたは複数
の存在について試験することができる。

＜活性の検出＞
上記の活性のそれぞれは、当技術分野において知られている多くの手段によって治療用
エキソソームにおいて検出することができる。例えば、関連する活性は、治療用エキソソ
ームにおける活性に関与するタンパク質またはポリペプチドの存在の検出によって検出す
ることができる。これは、例えば、同族抗体の使用、ならびに当技術分野において知られ
ているような免疫アッセイおよびウェスタンブロットなどによる抗体とタンパク質との間
の結合の検出によって行うことができる。

全体を通して、１単位（Ｕ）の酵素活性は、１分当たり１μモルの生成物の生産に必要
な活性であると規定される。

＜活性の検出のためのウェスタンブロットプロトコル＞
タンパク質またはポリペプチドを介する活性を検出するためのウェスタンブロットハイ
ブリダイゼーションを用いる例示的なプロトコルを以下に記載する。

１２μｇのエキソソームを４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニ
トロセルロース膜上にエレクトロブロットした。膜をＳＮＡＰ ｉ．ｄ．系（Ｍｉｌｌｉ
ｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の膜ホルダーに移し、ブロックし、そして、マウ
ス抗ＧＡＰＤＨ（１：１００希釈）、マウス抗ＰＧＫ（１：６０）、マウス抗ＰＧＤ（１
：６０）、ウサギ抗ＰＦＫＦＢ３（１：６０）、マウス抗ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ、１
：２００）、マウス抗２０Ｓプロテアソームα１〜７（１：２００）、マウス抗ＣＤ７３
（１：６０）、およびマウス抗ＣＤ５９（１：２００）を含む一次抗ヒト抗体と共にイン
キュベートした。ブロットを次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体と
共にインキュベートした。用いた二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１２５０）また
はロバ抗ウサギＩｇＧ（１：１２５０）であった。全ての抗体は、Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ．
、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから入手したマウス抗ＰＫを除いて、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ
Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡから入手した。ブロットを
次に、ＨＲＰで増強した化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃｉｅｎｔｉｆ
ｉｃ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と共にインキュベートし、次いで、Ｘ線フィル
ムに曝露した。

液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）または質量分析（ＭＳ）
質量分析などの他の方法もまた、エキソソームにおけるタンパク質またはポリペプチド
の存在を検出するために用いることができる。ＬＣ−ＭＳは、ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃ
ｈｅｍ．ａｇｉｌｅｎｔ．ｃｏｍ／Ｌｉｂｒａｒｙ／Ｓｕｐｐｏｒｔ／Ｄｏｃｕｍｅｎｔ
ｓ／ａ０５２９６．ｐｄｆにある文献「Ｂａｓｉｃｓ ｏｆ ＬＣ／ＭＳ Ｐｒｉｍｅｒ
」（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において詳細に記載されている。

液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）または質量分析（ＭＳ）を用いる例示
的なプロトコルを以下に記載する。

文献（２０）に記載されているように、２ｍｌの透析されたエキソソームにおけるタン
パク質を還元し、アルキル化し、そしてトリプシン消化した。試料を次に、消化された混
合物を、馴化されたＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ−１８ ＳＰＥカートリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍ
ｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に通すことによって脱塩し、３％アセトニトリル（ＡＣＮ
）（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）および０．１％ギ酸（ＦＡ）
の緩衝液で２回洗浄し、そして７０％ＡＣＮおよび０．１％ＦＡの緩衝液で溶出した。溶
出された試料を次に、真空遠心分離機において有機溶媒を除去することによって、その最
初の容積の約１０％まで乾燥させた。試料の複雑性を低減させるために、オフラインペプ
チド分画を、Ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｅｔｈｙｌ ＳＣＸカラム（２００ｍｍ×４．６ｍｍ）
（ＰｏｌｙＬＣ、ＵＳＡ）を通すＨＰＬＣ系（株式会社島津製作所、日本）で行った。１
ｍｌ／分での、移動相Ａ（５ｍＭのＫＨ４ＰＯ４＋３０％アセトニトリル）および移動相
Ｂ（５ｍＭのＫＨ４ＰＯ４＋３０％アセトニトリル＋３５０ｍＭのＫＣｌ）。８つの画分
を回収し、真空遠心分離機で乾燥させた。分画された試料を、ナノスプレー源を取り付け
たＬＴＱ−ＦＴ Ｕｌｔｒａリニアイオントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃ
ｔｒｏｎ、Ｂｒｅｍｅｍ、Ｇｅｒｍａｎｙ）にオンラインで繋いだ株式会社島津製作所の
マイクロＨＰＬＣ系の自動サンプラー内にロードした。注入されたペプチドを、Ｚｏｒｖ
ａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８濃縮カラム（５ｍｍ×０３ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で捕捉および脱塩し、そしてナノレベルの穴を有す
るＣ１８パックカラム（７５μｍ×１００Å、Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ
ｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）内に溶出した。２００ｎｌ／分の２０の有効流速の一定流速で
の１分勾配へのスプリッターでの９０ｌ／分を用いて、ペプチドを質量分析計内に溶出し
た。ＦＴＭＳにおける各ＭＳスキャンから得られる最も強いピークの８つについてＭＳ／
ＭＳスキャンを行うことによって、ＬＴＱをデータ依存モードで操作した。各実験で、８
つのＳＣＸ画分のＭＳ／ＭＳ（ｄｔａ）スペクトルを、自作のプログラムによるシングル
マスコットジェネリックファイル内に組み合わせた。タンパク質の同定は、社内のＭａｓ
ｃｏｔサーバ（バージョン２．２．０４、Ｍａｔｒｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）を介し
て、組み合わされたデータをＩＰＩヒトタンパク質データベース（バージョン３．３４、
６９１６４の配列、２９０６４８２５の残基）に対してサーチすることによって行った。
サーチパラメータは、トリプシンを用いる切断の失敗が最大で２カ所であること；固定さ
れた修飾がシステインのカルバミノメチル化であり、可変の修飾がメチオニンの酸化であ
ること、であった。質量許容差は、ペプチド前駆体および断片イオンについてそれぞれ１
０ｐｐｍおよび０．８Ｄａに設定した。タンパク質の同定は、２つの異なるペプチドがホ
モロジースコアよりも大きなスコアを有することが明らかになった場合に、真陽性である
と認められた。

＜補体阻害活性＞
補体阻害活性は、表Ｄ１に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまたは
複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、そ
れらを治療用エキソソームと同定することができる。

あるいは、またはそれに加えて、補体介在性細胞溶解活性を、以下に記載するアッセイ
を行うことによって検出することができる。

＜補体介在性細胞溶解アッセイ＞
簡潔に述べると、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を購入し（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ、Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ、ＭＩ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗
浄し、その後、ＰＢＳ１ｍｌ当たり１×１０^８個の細胞で再懸濁した。精製補体成分、Ｃ
５ｂ６、Ｃ８、およびＣ９は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）から
購入し、Ｃ７はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。
ＳＲＢＣへのインタクトＣ５ｂ−９の会合を、最終濃度が０．１μｇ／ｍｌのエキソソー
ムの存在下または不存在下で、それぞれ１ｍｌのＣ５ｂ６（０．１μｇ／ｍｌ）およびＣ
７（０．４μｇ／ｍｌ）と共に１５分間インキュベーションすること（３７℃）によって
開始させた。ＳＲＢＣを次に洗浄し、最終濃度が０．０５μｇ／ｍｌのブロックＣＤ５９
抗体を含むまたは含まない、それぞれ１ｍｌのＣ８（０．４μｇ／ｍｌ）にＣ９（０．４
μｇ／ｍｌ）を加えたものと共にさらに３０分間インキュベートした。その後、ＳＲＢＣ
を遠心分離し、上清内の溶解ＳＲＢＣによって放出されたヘモグロビンの量を、４１５ｎ
ｍでの吸光度によって測定した。全（１００％）溶血を、１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００で細胞を処理することによって得た。

＜プロテアソーム活性＞
プロテアソーム活性は、表Ｄ２に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つ
または複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによっ
て、それらを治療用エキソソームと同定することができる。

あるいは、またはそれに加えて、プロテアソーム活性を、以下に記載するアッセイを行
うことによって検出することができる。

＜２０Ｓプロテアソームアッセイ＞
プロテアソーム活性を、特異的２０Ｓプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンの存
在下または不存在下で、２０Ｓプロテアソームによる標識された基質ＬＬＶＹ−ＡＭＣか
らの切断後のフルオロフォア７−アミノ−４メチルクマリン（ＡＭＣ）を検出することに
基づく、２０Ｓプロテアソーム活性アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて測定
した。簡潔に述べると、４μｇのエキソソームを、２５μＭのラクタシスチンの存在下ま
たは不存在下で、ＬＬＶＹ−ＡＭＣを含有する反応緩衝液と共にインキュベートした。試
料およびＡＭＣ標準を３７℃でインキュベートし、Ｅｘ／Ｅｍ＝３８０／４６０ｎｍでの
蛍光強度を２時間モニタリングした。

＜単位活性の規定＞
２０Ｓコア粒子の１単位の酵素活性は、１分当たり１μモルの生成物の生産に必要な活
性であると規定される。

エキソソームは、タンパク質１μｇ当たり５．０μＵの２０Ｓコア粒子活性を含有する
ことが分かる。

＜糖分解酵素活性＞
糖分解酵素活性は、表Ｄ３に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまた
は複数の検出によってエキソソームにおいて検出することができ、それによって、それら
を治療用エキソソームと同定することができる。

^＊ＡＴＰおよびＮＡＤＨはタンパク質ではないことが理解される。これらは、しかし、
エキソソームにおける糖分解酵素活性を検出するために検出することができ、したがって
、エキソソームが治療用エキソソームであるかどうかを決定するために用いることができ
る。同様に、細胞におけるＡＴＰおよびＮＡＤＨの還元（または両方）の検出を用いるこ
とができる（上記を参照されたい）。

したがって、本明細書の文脈において、用語「タンパク質」または「ポリペプチド」が
ＡＴＰおよびＮＡＤＨなどの低分子を含み得ることが理解されよう。実体がタンパク質で
はないが実際は何らかの他のタイプの実体、例えば低分子である場合、このような表（ま
たは本明細書の他の箇所）における表見出し「タンパク質」の下にある実体の検出につい
てのこのような言及には、不都合な重要性を持たせるべきではない。したがって、本明細
書（例えば表Ｄ３）におけるいくつかの表見出しおよび他の言及は、「タンパク質」に言
及する便宜のためのものであり得るが、（実際にはタンパク質ではなくとも）ＡＴＰ、Ｎ
ＡＤＨなどへの言及も含み得る。これらは、上記のように、治療用エキソソームの決定の
ために検出することができる。

さらに、糖分解酵素活性は、エキソソームに曝露された細胞内に移され、その結果、Ａ
ＴＰおよびＮＡＤＨの生産を増大させ得るため、細胞によるＡＴＰまたはＮＡＤＨの生産
（または両方）の検出を、生産されたエキソソームにおける糖分解酵素活性を検出する手
段として用いることができ、それによって、それを治療用エキソソームと同定することが
できる。

＜ピルビン酸キナーゼアッセイ＞
５μｇのエキソソーム（１２μｌ内）を、細胞抽出キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｍｏ
ｕｎｔａｉｎ ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて溶解した。溶解されたエキソソームの抽出物を
、市販されているＰＫアッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）の５０μｌの反応ミックス
と共にインキュベートした。このアッセイにおいて、ＰＫによって生産されたピルビン酸
をピルビン酸キシダーゼによって酸化して、蛍光を生じさせた（Ｅｘ／Ｅｍ＝５３５／５
８７ｎｍ）。蛍光強度の増大は、したがって、生産されたピルビン酸の量に比例する。

＜ＧＡＰＤＨおよびＰＧＫアッセイ＞
ＧＡＰＤＨおよびＰＧＫの活性を、２つの市販されているキット、すなわちＫＤａｌｅ
ｒｔ ＧＡＰＤＨアッセイキット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およ
びＡｐｏＳＥＮＳＯＲ ＡＤＰ／ＡＴＰ比率アッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を用
いて、その下流生成物、すなわち糖分解反応におけるＡＴＰに基づいて測定した。簡潔に
述べると、エキソソームを、細胞抽出キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を用いて溶解した。
ＧＡＰＤＨ活性を測定するために、１０μｇの溶解したエキソソームを、Ｄ−グリセルア
ルデヒド−３−ホスフェート、ＮＡＤ＋、およびＰｉを含有するＫＤａｌｅｒｔ反応緩衝
液に添加して、１，３−ビスホスホグリセレート＋ＮＡＤＨ＋Ｈ＋を形成させた。２５０
Ｕ／ｍｌのＰＧＫおよび６０μＭのＡＤＰを次に添加して、１，３−ビスホスホグリセレ
ートおよびＡＤＰを３−ホスホグリセレートおよびＡＴＰに変換した。ＧＡＰＤＨ活性に
比例する生産されたＡＴＰの量を次に、ＡＴＰルシフェラーゼアッセイを用いて測定した
。ＰＧＫ活性を測定するために、１０μｇの溶解したエキソソームを、上記のアッセイか
ら生産された１，３−ビスホスホグリセレートに添加した。ＡＤＰを添加して、ＡＴＰを
形成させた。ＰＧＫ活性に比例するＡＴＰの量を次に、ＡＴＰルシフェラーゼアッセイを
用いて定量した。

＜糖分解細胞に基づくアッセイ＞
Ｈ９Ｃ２心筋細胞を、ウェル当たり３００００個細胞で（ポリリジン被覆された）９６
ウェルプレート上に平板培養した。５時間後、細胞をタイロード緩衝液で２回洗浄し、そ
の後、２０μｍｏｌのオリゴマイシン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、６ｍｍｏｌのグ
ルコースを含有し、０．１μｇ／ｍｌのエキソソームを含むまたは含まないタイロード緩
衝液内で１５分、３０分、および６０分間インキュベートした。細胞のＡＴＰ濃度を、Ａ
ＴＰｌｉｔｅ １ステップ発光ＡＴＰ検出アッセイ系（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｚａｖ
ｅｎｔｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて測定した。

＜単位活性の規定＞
ＧＡＰＤＨ（ＡＦ２６１０８５．１）の１単位の酵素活性は、１分当たり１μモルの生
成物の生産に必要な活性であると規定される。

エキソソームは、タンパク質１μｇ当たり１．１μＵのＧＡＰＤＨ活性、タンパク質１
μｇ当たり３．５９μＵのＰＧＫ（Ｌ００１５９．１）活性、およびタンパク質１μｇ当
たり５．５μＵのＰＫｍ２（Ｍ２３７２５．１）活性を含有することが分かる。

＜抗酸化活性＞
抗酸化活性は、表Ｄ４に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまたは複
数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それ
らを治療用エキソソームと同定することができる。

＜細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性＞
細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性は、表Ｄ５に示すようなタンパク質またはその活
性のいずれか１つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することが
でき、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。

＜ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性＞
ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性は、表Ｄ６に示すよ
うなタンパク質またはその活性のいずれか１つまたは複数の検出によって治療用エキソソ
ームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定す
ることができる。

さらに、細胞をＡＭＰの存在下でＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオ
チダーゼ活性に曝露すると、ＡＫＴおよびＥＲＫ１／２のリン酸化が誘発され、エキソソ
ーム内のまたはエキソソームの、リン酸化されたＡＫＴ（すなわち、リン酸化されたＡＫ
Ｔ１、リン酸化されたＡＫＴ２、またはリン酸化されたＡＫＴ３）またはリン酸化された
ＥＲＫ１もしくはリン酸化されたＥＲＫ２（またはこれらのあらゆる組み合わせ）の検出
を、エキソソームにおけるＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ
酵素活性を検出する手段として用いることができ、それによって、それを治療用エキソソ
ームと同定することができる。

＜ＣＤ７３アッセイ＞
エキソソームにおけるＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）酵素活性を、５０μＭのＡＭＰ（Ｓｉｇｍ
ａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する１００μｌのＴｒｉｓ緩衝液
（ｐＨ７．４）内で２．５μｇのエキソソームをインキュベートすることによって決定し
た。ＡＭＰの加水分解から放出されたリン酸イオンの量を次に、製造者の指示通りに、Ｃ
ｏｌｏｒｌｏｃｋ Ｇｏｌｄキット（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂ
ｒｉｄｇｅ、ＵＫ）によって決定した。

＜単位活性の規定＞
１単位のエクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ酵素活性は、１分当たり１μモルの生
成物の生産に必要な活性であると規定される。

エキソソームは、タンパク質１μｇ当たり２２．０４μＵのエクト−５’−エクトヌク
レオチダーゼ活性を含有することが分かる。

＜イオンホメオスタシス活性＞
イオンホメオスタシス活性は、表Ｄ７に示すようなタンパク質またはその活性のいずれ
か１つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それ
によって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。

＜シャペロン活性＞
シャペロン活性は、表Ｄ８に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまた
は複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、
それらを治療用エキソソームと同定することができる。

＜免疫調節活性＞
治療用エキソソームは免疫調節活性を示し得る。

＜自然免疫細胞による適応免疫の調節（概説１〜３）＞
免疫系は、非自己細胞または非自己組織を破壊すること、感染性物質または毒性物質を
中和すること、および細胞残屑、例えば死滅細胞または死滅しかけている細胞を除去する
ことによって、生物を疾患から保護するために主に存在する。脊椎動物において、免疫系
は、自然免疫系および適応免疫系からなる。自然免疫細胞には、樹状細胞、マクロファー
ジ、および好中球が含まれ、これらの細胞は、感染性／毒性物質、ストレスシグナル、死
滅／死滅しかけている細胞、または非自己細胞の不変の特徴を認識するように遺伝的にプ
ログラムされている。これは進化的に保存されており、防御の第一線を提供する。適応免
疫細胞は、Ｔリンパ球およびＢリンパ球である。これらは、それぞれの外来の、毒性の、
または非自己の作用物質に、これらの物質に対して特異的な受容体をデノボで生成してそ
れらを中和または破壊のために標的化することによって適合する。他方、自然免疫細胞は
、Ｔｏｌｌ様受容体（ＴＬＲ）、レチノイン酸誘導性遺伝子１様ＲＮＡヘリカーゼ、ヌク
レオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体、およびＣ型レクチン受容体を含むような、
生殖細胞系列にコードされたパターン認識受容体（ＰＰＲ）を介して、病原体関連分子パ
ターンおよびストレスシグナルと一般に呼ばれている微生物病原体内の保存された分子署
名を認識する。感染性作用物質または毒性作用物質に対する特異的受容体を生成するため
の適応免疫細胞の活性化は、複雑であり、自然免疫細胞によって調節される。ＰＰＲの中
でも、ＴＬＲは、ＩｇＭ抗体、ＩｇＧ抗体、およびＩｇＡ抗体の生産、ならびにＴ_Ｈ１細
胞、Ｔ_Ｈ１７ＣＤ４^＋細胞、およびＣＤ８^＋Ｔ細胞の活性化などの適応免疫応答の調節に
関して最も特徴付けされたＰＰＲである。

ＴＬＲは、高度に保存された１型内在性膜糖タンパク質である。ヒトにおいて、１０の
ＴＬＲがこれまでに同定されている。ＴＬＲ３を除く全てのＴＬＲは、直接的にまたはＴ
ＩＲＡＰと組み合わせて、ＭｙＤ８８依存性経路を介してシグナル伝達し、最終的には、
ＮＦκＢの活性化および核移行をもたらすか、タンパク質１（ＡＰ１）を活性化するか、
またはこれらの両方をもたらして、炎症性サイトカインの生産をもたらす。ＴＬＲ３およ
びＴＬＲ４は、ＭｙＤ８８依存性でＴＲＩＦ依存性シグナル伝達経路を開始させ、ＮＦκ
ＢまたはＩＲＦ３の活性化および核移行をもたらして、炎症性サイトカインおよび１型イ
ンターフェロンをそれぞれ生産する。異なるＴＬＲは、異なるクラスの病原体関連分子パ
ターンを認識し、例えば、ＴＬＲ４は細菌細胞表面リポ多糖を認識し、ＴＬＲ１およびＴ
ＬＲ２はペプチドグリカンを認識し、ＴＬＲ２およびＴＬＲ６はリポタンパク質を認識し
、ＴＬＲ３はウイルス二本鎖ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ７およびＴＬＲ８はウイルス一本鎖
ＲＮＡを認識し、ＴＬＲ９は細菌およびウイルスのＣｐＧを認識し、ＴＬＲ５はフラジェ
リンを認識する。

＜ＴＬＲの内因性リガンド（概説４）＞
感染性作用物質およびそれらの生成物に対する宿主免疫の仲介におけるＴＬＲの非常な
重要性にもかかわらず、無菌性炎症応答を引き起こすための内因性リガンドによるＴＬＲ
シグナル伝達の活性化は、ＴＬＲの重要な機能であるとますます考えられている。これま
で、異なるＴＬＲについて多くの内因性リガンドが同定されている（以下の表Ｄ９）。Ｔ
ＬＲは、虚血および再かん流傷害、組織の修復および再生、自己免疫疾患、ならびに腫瘍
形成および腫瘍進行に関与している。

＜ＭＳＣの免疫調節活性＞
ＭＳＣは、アロ抗原、マイトジェン、およびＣＤ３ライゲーションによって誘発される
Ｔ細胞増殖の阻害などのインビトロでの免疫調節特性を示し、Ｂ細胞の増殖およびナチュ
ラルキラー細胞の活性を阻害する^５。ヒトＧＶＨＤ^６およびクローン病^７についてのＭＳ
Ｃに基づいた介入の治療的有効性を試験する臨床試験が奨励されている。しかし、ＭＳＣ
の免疫調節特性の根底にあるメカニズムは、依然としてほとんど理解されていない。次第
に、これらの特性はＭＳＣからのパラクリン分泌によって仲介されていると考えられてい
る^８。

２００８年に、本発明者らのグループは、ヒト胚性幹細胞由来ＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳ
Ｃ）によって馴化された培養培地が虚血／再かん流傷害のブタモデルおよびマウスモデル
において相対的な梗塞サイズを低減させること^９、ならびに慢性虚血のブタモデルにおい
て心臓機能を向上させること^１０を実証し、活性成分は、５０〜２００ｎｍの推定直径を
有する。この成分は、その後ＨＰＬＣによって精製され、エキソソームとして同定された
^１１。プロテオミクス分析によって、これらのエキソソームがＴＬＲ２およびＴＬＲ４の
内因性リガンドを含有することが明らかになった（表１）。したがって、ＭＳＣエキソソ
ームは、ＴＬＲ２およびＴＬＲ４を活性化させる能力を有し、ＭＳＣの免疫調節活性に寄
与する。

免疫調節活性は、表Ｄ１０に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか１つまた
は複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、
それらを治療用エキソソームと同定することができる。

＜間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）＞
間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）などの馴化細胞培養培地は、細胞培養培地にお
いて間葉系幹細胞（ＭＳＣ）、その子孫、またはそれに由来する細胞株を培養すること、
および細胞培養培地を単離することによって得ることができる。間葉系幹細胞は、胚性幹
（ＥＳ）細胞コロニーを分散させることによって細胞を得ることを含むプロセスによって
生産することができる。細胞またはその子孫は、ＦＧＦ２を含む無血清培地において、共
培養物の不存在下で増殖し得る。

エキソソームは、多くの方法で生産または単離することができる。このような方法は、
間葉系幹細胞（ＭＳＣ）からエキソソームを単離することを含み得る。このような方法は
、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）からエキソソームを単離することを含み得る。
エキソソームは、例えば、エキソソームのあらゆる特性に基づいて非関連成分から分離す
ることによって、単離することができる。例えば、エキソソームは、分子量、サイズ、形
状、組成、または生物学的活性に基づいて単離することができる。例えば、本明細書の他
の箇所の分子量アッセイにおいて記載されているような、適切な分子量カットオフまたは
サイズカットオフを有する膜での濾過を用いることができる。エキソソームの１つまたは
複数の生物学的活性を、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の分画の間のその活性を
追跡するために用いることができる。

＜免疫調節活性アッセイ＞
エキソソームの免疫調節活性は、ＴＨＰ−１細胞および遺伝子修飾されたＴＨＰ細胞株
／ＨＥＫレポーター細胞株を用いて評価することができる。このような細胞株は、以下の
実施例において記載されている。

エキソソームの免疫調節活性は、サイトカイン生産を誘発するエキソソームの能力をア
ッセイすることによって、未修飾ＴＨＰ−１を用いて評価することができる。これは、以
下の実施例２３において詳細に記載されている。あるいは、サイトカイン生産は、実施例
において記載されているような代替レポーター細胞株を用いて評価することができる。例
えば、実施例１９において記載されているように、ＮＦｋＢプロモーターの転写制御下に
ある安定的にトランスフェクトされた分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポ
ーター遺伝子を有するＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ、またはＭｙＤ８８活性が欠損しているＴＨ
Ｐ１−ＸＢｌｕｅ−ｄｅｆＭＹＤを用いることができる。

エキソソームの免疫調節活性はまた、コンカナバリンＡで活性化されたリンパ球の増殖
を阻害するそれらの能力によってアッセイすることができる。これは、実施例２８におい
て詳細に記載されている。

エキソソームの免疫調節活性をアッセイする他の方法を用いることができる。これらに
は、ＣＤ４＋Ｔ細胞をエキソソーム処理した単球、例えばＴＨＰ−１に曝露して、これら
がＴｒｅｇｓまたはＴｈ１７の生産を増強させるかどうかを決定することが含まれる。こ
れは、実施例２６において詳細に記載されている。

＜エキソソーム特性＞
間葉系幹細胞の特性は、間葉系幹細胞によって馴化された培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の特性
を含み得る。このような間葉系幹細胞馴化培地を生産する方法は、当技術分野において知
られており、例えばＷＯ２００９／１０５０４４の実施例１において記載されている。

特性は、生物学的活性などの生物学的特性を含み得る。生物学的活性の例には、心保護
、酸化ストレスの低減、および梗塞サイズの低減が含まれる。

＜心保護＞
エキソソーム、特に治療用エキソソームは、心保護を含む間葉系幹細胞および／または
間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の特性を有し得る。心保護は、虚血および／また
は再かん流の間の心臓機能の回復または維持を含み得る。

＜心保護についてのアッセイ＞
心保護は、例えば、ＷＯ２００９／１０５０４４の実施例５、１０、１４、および２０
において記載されている方法のいずれか１つまたは複数を用いてアッセイすることができ
る。

酸化ストレス
エキソソーム、特に治療用エキソソームは、酸化ストレスを低減させる能力（または細
胞保護）を含む間葉系幹細胞および／または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の特
性を有し得る。

＜酸化ストレスについてのアッセイ＞
酸化ストレスの低減は、例えば、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）誘発性の細胞死のインビトロ
アッセイを用いてアッセイすることができる。要約すると、過酸化水素（Ｈ_２Ｏ_２）介在
性の酸化ストレスはヒト白血病性ＣＥＭ細胞において誘発され、細胞の生存能力はトリパ
ンブルー排除によってモニタリングされる。ヒト白血病性ＣＥＭ細胞を、エキソソーム、
馴化培地、または間葉系幹細胞（生理食塩水を対照とする）と共にインキュベートし、５
０μＭのＨ_２Ｏ_２で処理して、酸化ストレスを誘発させる。細胞の生存能力を、Ｈ_２Ｏ_２
処理の１２、２４、３６、および４８時間後にトリパンブルー排除を用いて評価する。

酸化ストレスの低減はさらに、ＤＮＡ酸化のインビボアッセイを用いてアッセイするこ
とができる。インビボでの酸化ストレスはまた、以下のようにアッセイすることができる
。ブタをエキソソーム、馴化培地、または間葉系幹細胞で処理する（生理食塩水を対照と
する）。ブタ心臓の組織切片を得る。処理されたおよび未処理のブタの組織切片における
核酸化ストレスを、酸化ＤＮＡについて８−ＯＨｄＧ免疫染色によって定量する。組織切
片を、ＤＮＡ酸化および酸化ストレスの指標である強力な核染色についてアッセイする。

＜梗塞サイズ＞
エキソソーム、特に治療用エキソソームは、梗塞サイズを低減させる能力を含む間葉系
幹細胞および／または間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）の特性を有し得る。

＜梗塞サイズについてのアッセイ＞
梗塞サイズは、例えば、ＷＯ２００９／１０５０４４の実施例６および１３において記
載されている方法のいずれか１つまたは複数を用いてアッセイすることができる。

＜エキソソームサイズ＞
エキソソームは、１００ｋＤａを超える分子量を有し得る。エキソソームは、５００ｋ
Ｄａを超える分子量を有し得る。例えば、エキソソームは、１０００ｋＤａを超える分子
量を有し得る。

分子量は、様々な手段によって決定することができる。原則的に、分子量は、関連する
分子量カットオフを有する膜を介するサイズ分画および濾過によって決定することができ
る。エキソソームサイズは、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの成分タンパク質の追跡分離ま
たは生物学的アッセイによって決定することができる。

＜ＨＰＬＣ動的光散乱によるエキソソームサイズのアッセイ＞
機器の設定は、株式会社島津製作所（京都、日本）のＣｌａｓｓ ＶＰソフトウェアに
よって操作される、バイナリポンプ、自動注入器、恒温カラムオーブン、およびＵＶ可視
検出器を備えた液体クロマトグラフィー系から構成された。用いたクロマトグラフィーカ
ラムは、東ソー株式会社（東京、日本）のＴＳＫ ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ、６×４０
ｍｍ、およびＴＳＫゲルＧ４０００ ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍであった。Ｄａｗｎ
８（光散乱）、Ｏｐｔｉｌａｂ（屈折率）、およびＱＥＬＳ（動的光散乱）という検出
器を、ＵＶ可視検出器の後に順に接続した。最後の３つの検出器は、Ｗｙａｔｔ Ｔｅｃ
ｈｎｏｌｏｇｙ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ、ＵＳＡ）のものであ
り、ＡＳＴＲＡソフトウェアによって操作した。試料の成分をサイズ排除によって分離し
、すなわち、大きめの分子を小さめの分子よりも先に溶出させる。用いた溶離液緩衝液は
、ｐＨ７．２の、１５０ｍＭのＮａＣｌを有する２０ｍＭのリン酸緩衝液であった。この
緩衝液を０．１μｍの孔サイズを介して濾過し、使用する前に１５分間脱気した。クロマ
トグラフィー系を、Ｄａｗｎ８におけるシグナルがおよそ０．３の検出器圧力単位で安定
化するまで、０．５ｍｌ／分の流速で平衡化した。ＵＶ可視検出器を２２０ｎｍで設定し
、カラムを２５℃にオーブン平衡化した。溶出モードはアイソクラチックであり、実行時
間は４０分であった。注入した試料の容積は、５０から１００ｍｌの範囲であった。エキ
ソソームピークと全ての他のピークとの領域％を、ＵＶ可視検出器から積分した。流体力
学的半径Ｒｈを、ＱＥＬＳ検出器およびＤａｗｎ８検出器によって計算した。ピーク頂点
での最高計数率（Ｈｚ）をＲｈとして得た。２２０ｎｍで視覚化された、分離した成分の
ピークを、さらなる特徴付け研究のための画分として回収した。

＜ＳＤＳ−ＰＡＧＥによる分子量のアッセイ＞
エキソソームは、１００ｋＤａを超える分子量を有し得る。例えば、エキソソームは、
濾過すると、１００ｋＤａ未満の分子量を有するエキソソームのほとんどのタンパク質が
１００ｋＤａの分子量を超える残りの画分に分離されるようなものであり得る。同様に、
５００ｋＤａのカットオフを有する膜での濾過を行うと、５００ｋＤａの分子量未満を有
するエキソソームのほとんどのタンパク質は、５００ｋＤａの分子量を超える残りの画分
に分離され得る。このことは、エキソソームが５００ｋＤａを超える分子量を有し得るこ
とを示す。

＜生物学的活性による分子量のアッセイ＞
エキソソームは、１０００ｋＤａを超える分子量を有し得る。例えば、エキソソームは
、１０００ｋＤａの分子量カットオフを有する膜での濾過を行うと、関連する生物学的活
性が実質的にまたは主に残りの画分に残るようなものであり得る。あるいは、またはそれ
に加えて、生物学的活性は、濾液画分内に存在しない可能性がある。生物学的活性は、本
明細書の他の箇所に記載されるエキソソームの生物学的活性のいずれかを含み得る。

＜梗塞サイズによる分子量のアッセイ＞
例えば、生物学的活性は、心筋虚血および再かん流傷害のあらゆる適切なモデルにおい
てアッセイされるような、梗塞サイズの低減を含み得る。例えば、生物学的活性は、ＷＯ
２００９／１０５０４４の実施例において記載されているように、マウスモデルまたはブ
タモデルにおいてアッセイすることができる。

要約すると、心筋虚血を、縫合糸結紮による３０分の左冠動脈（ＬＣＡ）閉塞によって
誘発し、再かん流を、縫合糸の除去によって開始させる。マウスを、再かん流の５分前に
、エキソソーム（未分画ＭＳＣ−ＣＭなど）、濾液（＜１００または１０００ｋＤの画分
など）、残り部分（＞１０００ｋＤの残り部分など）を含有する液体、または生理食塩水
で、尾静脈を介して静脈内で処理した。２４時間後、心臓を切除した。切除の前に、ＬＣ
Ａを再連結し、大動脈を介してエバンスブルーをかん流させることによって、虚血領域（
ＡＡＲ）を決定する。

ＡＡＲは、染料によって染色されていない領域と規定され、左心室壁領域に対するパー
センテージとして表される。梗塞サイズは、エバンスブルーおよびＴＴＣを用いて２４時
間後に評価する。相対的な梗塞サイズが、生理食塩水と比較して、間葉系幹細胞馴化培地
（ＭＳＣ−ＣＭ）および残りの（＞１０００ｋＤなど）画分で処理した動物において有意
に低減している場合、このことは、エキソソームが膜の関連するカットオフよりも高い分
子量（例えば、１０００ｋＤａ超）を有することを示す。

＜エキソソームの分子量＞
エキソソームは、２ｎｍを超えるサイズを有し得る。エキソソームは、５ｎｍ、１０ｎ
ｍ、２０ｎｍ、３０ｎｍ、４０ｎｍ、または５０ｎｍを超えるサイズを有し得る。エキソ
ソームは、１００ｎｍを超えるサイズ、例えば１５０ｎｍを超えるサイズを有し得る。エ
キソソームは、ほぼ２００ｎｍ以上のサイズを有し得る。

１つまたは複数のエキソソームは、様々なサイズ、例えば２ｎｍから２０ｎｍ、２ｎｍ
から５０ｎｍ、２ｎｍから１００ｎｍ、２ｎｍから１５０ｎｍ、または２ｎｍから２００
ｎｍの間のサイズを有し得る。１つまたは複数のエキソソームは、２０ｎｍから５０ｎｍ
、２０ｎｍから１００ｎｍ、２０ｎｍから１５０ｎｍ、または２０ｎｍから２００ｎｍの
間のサイズを有し得る。１つまたは複数のエキソソームは、５０ｎｍから１００ｎｍ、５
０ｎｍから１５０ｎｍ、または５０ｎｍから２００ｎｍの間のサイズを有し得る。１つま
たは複数のエキソソームは、１００ｎｍから１５０ｎｍまたは１００ｎｍから２００ｎｍ
の間のサイズを有し得る。１つまたは複数のエキソソームは、１５０ｎｍから２００ｎｍ
の間のサイズを有し得る。

サイズは、様々な手段によって決定することができる。原則的に、サイズは、関連する
サイズカットオフを有する膜を介するサイズ分画および濾過によって決定することができ
る。エキソソームサイズは、次いで、ＳＤＳ−ＰＡＧＥでの成分タンパク質の追跡分離ま
たは生物学的アッセイによって決定することができる。

サイズはまた、ＷＯ２００９／１０５０４４の実施例２１において記載されているよう
に、電子顕微鏡法によって決定することができる。

＜組成＞
エキソソームは、間葉系幹細胞によって分泌される１つまたは複数のタンパク質を含み
得る。エキソソームは、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）内に存在する１つまたは
複数のタンパク質を含み得る。

例えば、エキソソームは、１０％以上、２０％以上、３０％以上、４０％以上、５０％
以上、６０％以上、または７０％以上のこれらのタンパク質を含み得る。エキソソームは
、ほぼ約７５％のこれらのタンパク質を含み得る。タンパク質は、遺伝子リストのタンパ
ク質または遺伝子産物のリストを参照することによって規定され得る。

エキソソーム内に含まれ得るタンパク質および遺伝子産物は、例えばＷＯ２００９／１
０５０４４において記載されている。

＜エキソソーム＞
再かん流傷害に対する心保護を付与するエキソソームなどの、分泌物中の活性成分は、
当技術分野において知られている手段、および例えばＷＯ２００９／１０５０４４におい
て記載されている手段によって単離することができる。活性成分は、間葉系幹細胞（ＭＳ
Ｃ）によって分泌されるエキソソームを含み得る。

エキソソームは、後期エンドサイトーシス区画（多小胞体）内に形成される小さな膜小
胞であり、これは、１９８３年に網状赤血球によって分泌されることが最初に記載され、
その後、様々な造血細胞、造血由来または非造血由来の腫瘍、および上皮細胞を含む、多
くの細胞型によって分泌されることが明らかになった。これらは、同様にエキソソームと
呼ばれる、さらに最近記載された「リボヌクレアーゼ複合体」とは異なる実体である。

エキソソームは、形態学的パラメータおよび生化学的パラメータによって規定すること
ができる。したがって、本明細書において記載されるエキソソームは、これらの形態学的
パラメータまたは生化学的パラメータの１つまたは複数を含み得る。

エキソソームは、４０〜１００ｎｍの直径を有する脂質二重層によって限定された「ソ
ーサー様」小胞または平坦な球体として従来規定されており、エンドソーム膜の内側への
出芽によって形成される。全ての脂質小胞のように、そしてアポトーシス細胞によって放
出されるタンパク質凝集物またはヌクレオソーム断片とは異なり、エキソソームは、約１
．１３〜１．１９ｇ／ｍｌの密度を有し、ショ糖勾配で浮遊する。エキソソームは、コレ
ステロールおよびスフィンゴミエリン、ならびにＧＭ１、ＧＭ３、フロチリン、およびｓ
ｒｃタンパク質キナーゼＬｙｎなどの脂質ラフトマーカーに富んでおり、このことは、そ
れらの膜が脂質ラフトに富んでいることを示唆している。

異なる細胞型に由来する、種が異なるエキソソームの分子組成が調べられている。通常
、エキソソームは、細胞型特異的な全てのエキソソームおよびタンパク質に共通であると
考えられている遍在的タンパク質を含有する。また、同一の細胞型に由来するが種が異な
るエキソソームにおけるタンパク質は、高度に保存されている。遍在的なエキソソーム関
連タンパク質には、細胞骨格において見られる細胞質タンパク質、例えばチューブリン、
アクチン、およびアクチン結合タンパク質、細胞内の膜融合体および膜輸送、例えばアネ
キシンおよびｒａｂタンパク質、シグナル伝達タンパク質、例えばタンパク質キナーゼ、
１４−３−３、およびヘテロ三量体Ｇタンパク質、代謝酵素、例えばペルオキシダーゼ、
ピルビン酸キナーゼ、脂質キナーゼ、およびエノラーゼ−１、ならびにテトラスパニンフ
ァミリー、例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３、ＣＤ８１、およびＣＤ８２が含まれる。テトラス
パニンはエキソソームにおいて非常に富んでおり、大きな分子複合体および膜サブドメイ
ンの組織化に関与することが知られている。

エキソソームにおける細胞型特異的なタンパク質の例は、ＭＨＣクラスＩＩ発現細胞か
らのエキソソームにおけるＭＨＣクラスＩＩ分子、樹状細胞由来エキソソームにおけるＣ
Ｄ８６、Ｔ細胞由来エキソソーム上のＴ細胞受容体などである。特に、エキソソームは、
核、ミトコンドリア、小胞体、またはゴルジ体由来のタンパク質を含有しない。また、非
常に富んだ原形質膜タンパク質はエキソソーム内には存在せず、このことは、これらが単
純に原形質膜の断片であるわけではないことを示唆している。報告されている遍在的なエ
キソソーム関連タンパク質の多くはまた、ｈＥＳＣ−ＭＳＣ分泌物のプロテオミクスプロ
ファイルにおいて存在する。

エキソソームはまた、別の細胞に送達され得、この新たな位置で機能的であり得る、ｍ
ＲＮＡおよびマイクロＲＮＡを含有することが知られている。エキソソームの生理学的機
能は、依然としてあまり規定されていない。これは、古いタンパク質を完全に無くすこと
、タンパク質を再利用すること、プリオンおよびウイルスなどの感染性粒子の伝達を仲介
すること、補体耐性を誘発すること、免疫細胞の細胞伝達を促進すること、ならびに細胞
シグナル伝達を行うことを促進すると考えられている。エキソソームは、がん治療のため
の免疫療法において用いられている。

＜間葉系幹細胞からの治療用エキソソームの使用＞
治療用エキソソームを含むエキソソームは、上記および下記のように、ＭＳＣまたはＭ
ＳＣ−ＣＭの代替物として用いることができる。

具体的には、治療用エキソソームは、ＭＳＣもしくはＭＳＣ−ＣＭを現在使用している
かまたは将来使用することができる治療目的のいずれかに用いることができる。

本明細書において記載される方法および組成が間葉系幹細胞からの治療用エキソソーム
の生産を可能にすることが明白となろう。したがって、間葉系幹細胞のあらゆる使用は、
間葉系幹細胞からの治療用エキソソームに等しく付随する。

本明細書において記載される方法および組成によって生産される間葉系幹細胞および分
化細胞は、疾患の治療に用いることができるか、または疾患の治療のための医薬組成物の
調製に用いることができる。このような疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、変
性疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病など、およびがんを含む、再
生治療によって治療可能な疾患を含み得る。したがって、ＭＳＣからの治療用エキソソー
ムは、このような疾患を治療するために用いることができる。

本明細書において記載される方法および組成に従って作製されるもののような、間葉系
幹細胞からの治療用エキソソームは、様々な商業的に重要な調査、診断、および治療の目
的で用いることができる。

間葉系幹細胞からの治療用エキソソームは、特に、疾患の治療のための医薬組成物の調
製に用いることができる。このような疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、変性
疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病など、およびがんを含む、再生
治療によって治療可能な疾患を含み得る。

本明細書において記載される方法および組成によって作製される間葉系幹細胞は、骨髄
由来の間葉系幹細胞（ＢＭ−ＭＳＣ）に類似または同一の特性を有する。したがって、間
葉系幹細胞およびこれらから作製されたあらゆる分化細胞、ならびにそれに由来する治療
用エキソソームは、ＢＭ−ＭＳＣが使用されることが知られている適用、またはＢＭ−Ｍ
ＳＣを用いることが可能な適用のいずれかにおいて用いることができる。

＜間葉系幹細胞からのエキソソームによって治療可能な疾患＞
ＭＳＣのプロテオームの分析は、発現するタンパク質が、代謝、防御応答、ならびに血
管化、造血、および骨格の発生を含む組織の分化という３つの生物学的プロセスに関与す
ることを示す。したがって、本明細書において記載されるＭＳＣからの治療用エキソソー
ムは、その機能がこれらの生物学的プロセスのいずれか１つもしくは複数における役割を
有し得る疾患、またはその修復もしくは治療にこれらの生物学的プロセスのいずれか１つ
もしくは複数が関与する疾患を治療するために用いることができる。同様に、単独で、ま
たは組み合わせて、好ましくは本明細書において記載される治療用エキソソームの形態に
より、ＭＳＣによって発現されるタンパク質は、このような疾患を例えば治療または予防
する目的で、ＭＳＣもしくはＭＳＣによって馴化された培地の活性を補うために、または
ＭＳＣもしくはＭＳＣによって馴化された培地に代わって、用いることができる。

ＭＳＣによって発現される２０１の遺伝子産物は、Ｊａｋ−ＳＴＡＴ、ＭＡＰＫ、Ｔｏ
ｌｌ様受容体、ＴＧＦ−βシグナル伝達経路、およびｍＴＯＲシグナル伝達経路などの、
心血管生物学、骨の発生、および造血における重要なシグナル伝達経路を活性化すること
が示されている。したがって、ＭＳＣなどからの治療用エキソソームは、これらのシグナ
ル伝達経路のいずれかが関与している疾患、またはその原因論がこれらのシグナル伝達経
路のいずれか１つもしくは複数における１つもしくは複数の不具合を伴う疾患を予防また
は治療するために用いることができる。

したがって、このような治療用エキソソームは、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、
および変性疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびがんを治療
するために用いることができる。

このような治療用エキソソームはまた、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚障害、皮膚病変、皮
膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚がん、アトピー性皮膚炎、ベ
ーチェット病、慢性的肉芽腫性疾患、皮膚Ｔ細胞リンパ腫、潰瘍、線維症および機能喪失
を含む慢性的な組織リモデリングをもたらす炎症および免疫異常調節を誘発する初期の傷
害を特徴とする病的状態、腎臓虚血性傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎および鼻炎、または
整形外科的疾患を治療するために用いることができる。

治療用エキソソームは、個体における創傷治癒、瘢痕の低減、骨形成、骨移植、または
骨髄移植を促進するために用いることができる。

文脈から別段のことが示されない限り、用語「馴化培地」は、ＭＳＣに曝露された細胞
培養培地だけではなく、馴化培地内に存在する１つまたは複数の、好ましくはほぼ全ての
ポリペプチドを含むこのような組成物も含むものであると解釈されるべきである。

治療用エキソソームはまた、ＭＳＣによって分泌または発現されるタンパク質のいずれ
かのための由来源として用いることができる。本発明者らは、したがって、治療用エキソ
ソームに含まれるポリペプチドを生産する方法を提供し、本方法は、記載されたように治
療用エキソソームを得ること、および治療用エキソソームからポリペプチドを単離するこ
とを含む。

＜治療用エキソソームの送達＞
本明細書において記載される治療用エキソソームは、あらゆる適切な手段によってヒト
または動物の体に送達することができる。

本発明者らは、したがって、本明細書において記載されている治療用エキソソームを標
的である細胞、組織、器官、動物の体、またはヒトの体に送達するための送達系、および
治療用エキソソームを標的に送達するために送達系を使用するための方法を記載する。

送達系は、治療用エキソソームの由来源、例えば治療用エキソソームを含有する容器を
含み得る。送達系は、治療用エキソソームを標的に分配するためのディスペンサーを含み
得る。

したがって、本発明者らは、本明細書において記載されている治療用エキソソームの由
来源と、治療用エキソソームを標的に送達するために機能可能なディスペンサーとを含む
、治療用エキソソームを送達するための送達系を提供する。

本発明者らはさらに、治療用エキソソームを標的に送達する方法におけるこのような送
達系の使用を提供する。

流体を体内に送達するための送達系は、当技術分野において知られており、米国特許第
６，１３９，５２４号において記載されているもののような、注射、外科的点滴、カテー
テル（かん流カテーテルを含む）、例えば、米国特許７，１２２，０１９号において記載
されているもののような薬剤送達カテーテルを含む。

鼻腔内送達を含む、肺または鼻の管への送達は、例えば、当技術分野において知られて
いる（例えば、米国意匠第Ｄ５４４，９５７号において示されている）経鼻スプレー、噴
出器、吸入器などを用いて行うことができる。

腎臓への送達は、米国特許第７，２４１，２７３号において記載されているもののよう
な、大動脈内腎臓送達カテーテルを用いて行うことができる。

当然のことながら、特定の送達が、最適な治療を行うために、所要の量の治療用エキソ
ソームを適切な間隔で送達するために、設定可能でなければならない。

治療用エキソソームは、例えば、アテローム性動脈硬化症を治療または予防するために
用いることができる。ここで、治療用エキソソームのかん流を、アテローム動脈硬化性プ
ラークを安定化させるためまたはプラークにおける炎症を低減させるために静脈内で行う
ことができる。治療用エキソソームは、静脈内かん流による敗血性ショックを治療または
予防するために用いることができる。

治療用エキソソームは、心不全を治療または予防するために用いることができる。これ
は、リモデリングを遅らせるためまたは心不全を遅らせるための治療用エキソソームの長
期的な冠動脈内または心筋内のかん流によって達成することができる。治療用エキソソー
ムは、鼻腔内送達による肺の炎症を治療または予防するために用いることができる。

治療用エキソソームは、皮膚の症状、例えば乾癬を治療または予防するために用いるこ
とができる。治療用エキソソームの長期間の送達を、症状がなくなるまで、経皮マイクロ
インジェクション針を用いて行うことができる。

当然のことながら、送達方法は、治療用エキソソームが送達される特定の器官に応じ、
当業者であれば、どの手段を採用するかをそれに応じて決定することができる。

例えば、心臓の炎症の治療では、治療用エキソソームは、例えば、胸壁を介する直接的
な冠動脈内注射によって、または、心筋などの組織への直接的な注射のための、もしくは
体腔内に挿入されたステントもしくはカテーテルから阻害剤を注入するための、蛍光透視
による誘導下での標準的な経皮的カテーテルに基づく方法を用いて、心臓組織（すなわち
、心筋、心膜、または心内膜）に送達することができる。

あらゆる様々な冠動脈カテーテルまたはかん流カテーテルを、化合物を投与するために
用いることができる。あるいは、治療用エキソソームは、冠状血管内に置かれるステント
上に被覆または含浸させることができる。

＜組織の再生＞
本明細書において記載される方法および組成に従って作製された間葉系幹細胞および分
化細胞、ならびにそれに由来する治療用エキソソームはまた、それを必要とするヒト患者
における組織の再構成または再生に用いることができる。細胞は、その細胞を意図した組
織部位に移植すること、および機能が欠損している領域を再構成または再生することを可
能にする様式で投与される。

例えば、本明細書において記載される方法および組成は、幹細胞の分化を調節するため
に用いることができる。間葉系幹細胞および分化細胞、ならびにそれに由来する治療用エ
キソソームは、皮膚移植片の成長などのための組織の操作に用いることができる。幹細胞
の分化の調節は、人工の器官もしくは組織のバイオエンジニアリングに、またはステント
などの人工装具に用いることができる。

＜がん＞
本明細書において記載される方法および組成によって作製される間葉系幹細胞および分
化細胞、ならびにそれに由来する治療用エキソソームは、癌の治療に用いることができる
。

用語「がん」および「がん性」は、調節されていない細胞の成長を典型的に特徴とする
、哺乳動物における生理学的状態を言うか、それを説明するものである。がんの例には、
限定はしないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれる。

このようながんのさらに特定の例には、扁平上皮細胞がん、小細胞肺がん、非小細胞肺
がん、胃がん、膵臓がん、グリア細胞腫、例えば膠芽腫および神経線維腫症、子宮頸がん
、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内
膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓がん、腎臓部のがん、前立腺がん、外陰部のがん、甲状腺がん
、肝臓癌腫、ならびに様々なタイプの頭頚部がんが含まれる。さらなる例は、結腸がん、
乳がん、肺がん、および前立腺がんを含む充実性腫瘍がん、白血病およびリンパ腫を含む
造血器悪性腫瘍、ホジキン病、再生不良性貧血、皮膚がん、ならびに家族性腺腫性ポリポ
ージスである。さらなる例には、脳新生物、結腸直腸新生物、乳房新生物、子宮頚部新生
物、眼の新生物、肝臓新生物、肺新生物、膵臓新生物、卵巣新生物、前立腺新生物、皮膚
新生物、精巣新生物、新生物、骨新生物、栄養膜新生、卵管新生物、直腸新生物、結腸新
生物、腎臓新生物、胃新生物、および副甲状腺新生物が含まれる。乳がん、前立腺がん、
膵臓がん、結腸直腸がん、肺がん、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫、卵巣がん、子宮頸が
ん、および胆道癌腫もまた含まれる。

本明細書において記載される方法および組成に従って作製される間葉系幹細胞および分
化細胞はまた、エンドスタチンおよびアンジオスタチンなどの抗癌物質、または細胞傷害
物質、または化学療法物質と組み合わせて用いることができる。例えば、薬剤、例えばア
ドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチナム、エトポシド、タキソール、タキソテ
ール、およびアルカロイド、例えばビンクリスチン、ならびに代謝拮抗物質、例えばメト
トレキサート。本明細書において用いられる用語「細胞傷害物質」は、細胞の機能を阻害
もしくは予防する、および／または細胞の破壊を生じさせる物質を言う。この用語は、放
射性同位体（例えば、Ｉ、Ｙ、Ｐｒ）、化学療法物質、および毒素、例えば細菌、真菌、
植物、または動物に由来する酵素的に活性な毒素、またはその断片を含むことが意図され
る。

また、この用語には、ＷＯ９４／２２８６７において開示されている二環式アンサマイ
シンなどのがん遺伝子産物／チロシンキナーゼ阻害剤、ＥＰ６００８３２において開示さ
れている１，２−ビス（アリールアミノ）安息香酸誘導体、ＥＰ６００８３１において開
示されている６，７−ジアミノ−フタラジン−１−オン誘導体、ＥＰ５１６５９８におい
て開示されている４，５−ビス（アリールアミノ）−フタルイミド誘導体、またはＳＨ２
含有基質タンパク質へのチロシンキナーゼの結合を阻害するペプチド（例えば、ＷＯ９４
／０７９１３を参照されたい）が含まれる。「化学療法物質」は、がんの治療において有
用な化学的化合物である。化学療法物質の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、
５−フルオロウラシル（５−ＦＵ）、シトシンアラビノシド（Ａｒａ−Ｃ)、シクロホス
ファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキサート、シ
スプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファ
ミド、マイトマイシンＣ、ミトキサントロン、ビンクリスチン、ＶＰ−１６、ビノレルビ
ン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン
、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ニコチンアミド、エスペラマイシン（米国特許第
４，６７５，１８７号を参照されたい）、メルファラン、および他の関連するナイトロジ
ェンマスタード、ならびに内分泌療法（例えば、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）
、タモキシフェン、ＬＨＲＨ拮抗薬剤、プロゲスチン、抗プロゲスチンなど）が含まれる
。

＜間葉系幹細胞（ＭＳＣ）の獲得＞
本明細書において記載される、治療用エキソソームを含むエキソソームは、間葉系幹細
胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）から単離または生産することができる。馴化培地およびエキ
ソソームの生産における使用に適したＭＳＣは、当技術分野において知られているあらゆ
る方法によって作製することができる。

特に、ＭＳＣは、胚性幹（ＥＳ）細胞コロニーまたはその子孫を、ＦＧＦ２を含む無血
清培地内で共培養物の不存在下で分散させることによって得られた細胞を増殖させること
によって作製することができる。これは、以下の節において詳細に記載される。

間葉系幹細胞（ＭＳＣ）またはＭＳＣ様細胞をｈＥＳＣから得る先行技術の方法は、分
化中のｈＥＳＣへのヒトテロメラーゼ逆転写酵素（ｈＴＥＲＴ）遺伝子のトランスフェク
ション（Ｘｕら、２００４）、またはマウスＯＰ９細胞株との共培養（Ｂａｒｂｅｒｉら
、２００５）を伴う。これらの誘導プロトコルにおける外因性遺伝物質およびマウス細胞
の使用は、腫瘍形成性または人獣共通感染性物質感染の受け入れ難いリスクを生じさせる
。

エキソソームは、したがって、分化中のｈＥＳＣから類似のまたは同一の（例えば均質
な）ＭＳＣ集団を単離するための臨床的に関連するおよび再現可能なプロトコルの使用に
よって誘導されるＭＳＣから作製することができる。通常、この方法は、胚性幹（ＥＳ）
細胞コロニーを細胞内に分散させることを含む。細胞を次いで、平板培養し、増殖させる
。細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を得るために、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を
含む無血清培地内で共培養物の不存在下で増殖させる。

したがって、プロトコルは、血清、マウス細胞の使用、または遺伝子操作を必要とせず
、操作および時間をあまり必要とせず、したがって非常に拡張可能である。このプロトコ
ルは、２つの異なるｈＥＳＣ系であるＨｕＥＳ９およびＨ−１、ならびにまた第３の系で
あるＨｅｓ−３からのＭＳＣの単離に用いることができる。本明細書において記載される
方法および組成によって得られるヒトＥＳ細胞由来のＭＳＣ（ｈＥＳＣ−ＭＳＣ）は、骨
髄由来のＭＳＣ（ＢＭ−ＭＳＣ）に著しく類似している。

胚性幹細胞培養物は、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）培養物を含み得る。

１つの実施形態において、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を生成する方法は、ＦＧＦ２および
場合によってＰＤＧＦ ＡＢを補った培地においてフィーダーサポートを伴わずにｈＥＳ
Ｃをトリプシン処理し、増殖させ、その後ＣＤ１０５＋ＣＤ２４−細胞を選別することを
含む。

本方法は、ＦＧＦ２を補った培地におけるフィーダー無しの増殖の１週間後に、トリプ
シン処理したｈＥＳＣからＣＤ１０５＋ＣＤ２４−細胞を選別することを含み得、場合に
よって、少なくともいくつかの、例えばほぼ全てのまたは全ての細胞が互いに類似してい
るかまたは同一（例えば均質）であるｈＥＳＣ−ＭＳＣ細胞培養物を生成するために、Ｐ
ＤＧＦ ＡＢが生成される。

この方法によって生産されるＭＳＣは、エキソソームがそれから単離され得る間葉系幹
細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）を生産するために用いることができる。

＜胚性幹細胞コロニーの分離＞
間葉系幹細胞を生産する１つの方法は、胚性幹細胞コロニーを細胞に分散または分離さ
せることを含み得る。

胚性幹細胞コロニーは、ｈｕＥＳ９コロニー（Ｃｏｗａｎ ＣＡ、Ｋｌｉｍａｎｓｋａ
ｙａ Ｉ、ＭｃＭａｈｏｎ Ｊ、Ａｔｉｅｎｚａ Ｊ、Ｗｉｔｍｙｅｒ Ｊら、（２００
４）Ｄｅｒｉｖａｔｉｏｎ ｏｆ ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ ｓｔｅｍ−ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ
ｓ ｆｒｏｍ ｈｕｍａｎ ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ３５
０：１３５３〜１３５６）またはＨ１ ＥＳＣコロニー（Ｔｈｏｍｓｏｎ ＪＡ、Ｉｔｓ
ｋｏｖｉｔｚ−Ｅｌｄｏｒ Ｊ、Ｓｈａｐｉｒｏ ＳＳ、Ｗａｋｎｉｔｚ ＭＡ、Ｓｗｉ
ｅｒｇｉｅｌ ＪＪら、（１９９８）Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｌｉｎ
ｅｓ Ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ Ｈｕｍａｎ Ｂｌａｓｔｏｃｙｓｔｓ．Ｓｃｉｅｎｃ
ｅ ２８２：１１４５〜１１４７．）を含み得る。

コロニー内の細胞は、かなり、すなわち少なくとも塊に、分離または分散させることが
できる。コロニーは、コロニー内の全ての細胞が単独になる程度、すなわちコロニーが完
全に分離する程度まで、分離または分散させることができる。

分離は、分散剤を用いて行うことができる。

分散剤は、コロニー内の少なくともいくつかの胚性幹細胞を互いに離し得るあらゆるも
のであり得る。分散剤は、コロニー内の細胞間の接着、または細胞と基質との間の接着、
またはその両方を妨害する試薬を含み得る。分散剤は、プロテアーゼを含み得る。

分散剤は、トリプシンを含み得る。トリプシンでの処理は、例えば、３７℃で３分間ほ
ど続けることができる。細胞は次いで、中和、遠心分離、および培地内に再懸濁し、その
後、取り出して平板培養することができる。

本方法は、ヒト胚性幹細胞のコンフルエントなプレートをトリプシンで分散させ、細胞
を取り出して平板培養することを含み得る。

分離は、以下の一連のステップの少なくともいくつかを含み得る。吸引、すすぎ、トリ
プシン処理、インキュベーション、取り外し、失活、再播種、およびアリコート化。以下
のプロトコルは、Ｈｅｄｒｉｃｋ Ｌａｂ、ＵＣ Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ（ｈｔｔｐ：／／
ｈｅｄｒｉｃｋｌａｂ．ｕｃｓｄ．ｅｄｕ／Ｐｒｏｔｏｃｏｌ／ＣＯＳＣｅｌｌ．ｈｔｍ
ｌ）からの出典である。

吸引ステップにおいて、培地は、フラスコなどの容器から吸引されるかまたは全体的に
取り出される。すすぎステップにおいて、細胞は、ある容積、例えば５〜１０ｍｌの、Ｃ
ａ^２＋およびＭｇ^２＋を含まなくてもよい緩衝培地ですすがれる。例えば、細胞は、カル
シウムおよびマグネシウムを含まないＰＢＳですすぐことができる。トリプシン処理ステ
ップにおいて、緩衝液内のある量の分散剤が容器に添加され、容器は回転させられて、表
面がだんだんと分散剤溶液で被覆される。例えば、ハンクスＢＳＳ内のトリプシン１ｍｌ
をフラスコに添加することができる。

インキュベーションステップにおいて、細胞は、一定温度である程度の時間放置される
。例えば、細胞は、３７℃で数分間（例えば２から５分間）放置することができる。取り
外しステップにおいて、細胞は、機械的作用によって、例えば解体することによって、ま
たは容器の側面を手で叩くことによって、取り外すことができる。細胞はシート内に落下
し、表面を滑り落ちる。

失活ステップにおいて、ある容積の培地がフラスコに添加される。培地は、分散剤の作
用を停止させるための中和物質を含み得る。例えば、分散剤がトリプシンなどのプロテア
ーゼである場合、培地は、プロテアーゼの活性を停止させる血清タンパク質などのタンパ
ク質を含有し得る。特定の実施例において、３ｍｌの血清を含有する細胞培養培地をフラ
スコに添加して、全部で４ｍｌとする。細胞をピペッティングして、細胞を取り外すかま
たは分散させることができる。

再播種ステップにおいて、細胞は、新たな培養容器内に再播種され、新鮮な培地が添加
される。多くの再播種は、異なるスプリット比で行うことができる。例えば、細胞は、１
／１５希釈および１／５希釈で再播種することができる。特定の実施例において、細胞は
、１滴の細胞を２５ｃｍ^２のフラスコに添加し、３滴を、培養物を再播種するための別の
フラスコに添加することによって、再播種することができ、７〜８ｍｌの培地を次に各フ
ラスコに添加して、例えば７５ｃｍ^２のフラスコから１／１５希釈および１／５希釈を得
る。アリコート化ステップにおいて、細胞は、新たな皿にアリコート化することができる
か、または、どのようなスプリット比が望ましくても、培地が添加される。

具体的な実施形態において、本方法は、以下のステップを含む：ヒトＥＳ細胞を非接着
様式で懸濁させてまず成長させて、胚様体（ＥＢ）を形成させる。５〜１０日齢のＥＢを
次にトリプシン処理し、その後、ゼラチンで被覆した組織培養プレート上で接着細胞とし
て平板培養する。

＜細胞培養物としての維持＞
分離した細胞は、平板培養し、細胞培養物として維持することができる。

細胞は、ゼラチン化されたプレートなどの培養容器または基質上に平板培養することが
できる。重要なことに、細胞は、共培養物の存在を伴わずに、例えばフィーダー細胞の不
存在下で、成長および増殖させる。

細胞培養物内の細胞は、例えば５ｎｇ／ｍｌの線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）およ
び場合によって血小板由来増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ ＡＢ）などの１つまたは複数の増殖
因子を補った無血清培地内で成長させることができる。細胞培養物内の細胞は、トリプシ
ン、洗浄、再平板培養での処理によって、コンフルエントである場合には１：４でスプリ
ットまたは二次培養することができる。

＜共培養物の不存在＞
細胞は、共培養物の不存在下で培養することができる。用語「共培養物」は、共に成長
させられる２つ以上の異なる種類の細胞の混合物、例えば間質性フィーダー細胞を言う。

したがって、典型的なＥＳ細胞培養物において、培養皿の内部表面は通常、分裂しない
ように処理されているマウス胚皮膚細胞のフィーダー層で被覆されている。フィーダー層
によって、ＥＳ細胞の付着および成長を可能にするための接着表面が提供される。さらに
、フィーダー細胞は、ＥＳ細胞の成長に必要な栄養を培養培地内に放出する。本明細書に
おいて記載される方法および組成において、ＥＳ細胞およびＭＳＣ細胞は、このような共
培養の不存在下で培養することができる。

細胞は、単層として、またはフィーダー細胞の不存在下で培養することができる。胚性
幹細胞は、間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を確立させるために、フィーダー細胞の不存在下で培
養することができる。

解離または分離した胚性幹細胞は、培養基質上に直接的に平板培養することができる。
培養基質は、ペトリ皿などの組織培養容器を含み得る。容器は前処理することができる。
細胞は、ゼラチン化された組織培養プレート上に平板培養することができるか、またはゼ
ラチン化された組織培養プレート上で成長させることができる。

皿のゼラチン被覆についての例示的なプロトコルを以下に示す。蒸留水中の０．１％ゼ
ラチン溶液を作製し、オートクレーブにかける。これは室温で保存することができる。組
織培養皿の底をゼラチン溶液で被覆し、５〜１５分間インキュベートする。ゼラチンを除
去すると、プレートが使えるようになる。培地は、低張の溶解を避けるために、細胞を添
加する前に添加すべきである。

＜無血清培地＞
解離または分離した胚性幹細胞は、無血清培地を含み得る培地内で培養することができ
る。

用語「無血清培地」は、血清タンパク質、例えばウシ胎児血清を含まない細胞培養培地
を含み得る。無血清培地は、当技術分野において知られており、例えば米国特許第５，６
３１，１５９号および米国特許第５，６６１，０３４号において記載されている。無血清
培地は、例えばＧｉｂｃｏ−ＢＲＬ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）から市販されている。

無血清培地は、タンパク質、加水分解物、および組成が未知の成分を欠いている可能性
があるという点で、無タンパク質であり得る。無血清培地は、全ての成分の化学構造が分
かっている化学的規定培地を含み得る。化学的規定無血清培地は、再現可能性の向上およ
びさらに一貫性のある性能を可能にする可変性を排除し、偶発的な作用物質による汚染物
質の可能性を減少させる、完全に規定された系を提供するため、有利である。

無血清培地は、Ｋｎｏｃｋｏｕｔ ＤＭＥＭ培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃｏ
、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）を含み得る。

無血清培地には、例えば５％、１０％、１５％などの濃度で、血清置換培地などの１つ
または複数の成分を補うことができる。無血清培地は、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−Ｇｉｂｃ
ｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）の１０％血清置換培地を含み得るか
、補うことができる。

＜増殖因子＞
解離または分離した胚性幹細胞を培養する無血清培地は、１つまたは複数の増殖因子を
含み得る。ＰＤＧＦ、ＥＧＦ、ＴＧＦ−ａ、ＦＧＦ、ＮＧＦ、エリスロポエチン、ＴＧＦ
−ｂ、ＩＧＦ−Ｉ、およびＩＧＦ−ＩＩを含む多くの増殖因子が、当技術分野において知
られている。

増殖因子は、線維芽細胞増殖因子２（ＦＧＦ２）を含み得る。培地はまた、血小板由来
増殖因子ＡＢ（ＰＤＧＦ ＡＢ）などの他の増殖因子を含有し得る。これらの増殖因子の
両方は、当技術分野において知られている。本方法は、ＦＧＦ２およびＰＤＧＦ ＡＢの
両方を含む培地において細胞を培養することを含み得る。

あるいは、またはそれに加えて、培地は、上皮増殖因子（ＥＧＦ）を含み得るかまたは
さらに含み得る。ＥＧＦの使用によって、ＭＳＣの成長が増強し得る。ＥＧＦは、あらゆ
る適切な濃度、例えば５〜１０ｎｇ／ｍｌのＥＧＦで用いることができる。ＥＧＦは、Ｐ
ＤＧＦの代わりに用いることができる。ＥＧＦは、当技術分野において周知のタンパク質
であり、記号ＥＧＦ、Ａｌｔ．記号ＵＲＧ、Ｅｎｔｒｅｚ １９５０、ＨＵＧＯ ３２２
９、ＯＭＩＭ １３１５３０、参照配列ＮＭ＿００１９６３、ＵｎｉＰｒｏｔ Ｐ０１１
３３と呼ばれる。

したがって、本発明者らは、（ｉ）ＦＧＦ２、（ｉｉ）ＦＧＦ２およびＰＤＧＦ、なら
びに（ｉｉｉ）ＦＧＦ２およびＥＧＦ、ならびに他の組み合わせを含む培地の使用を開示
する。

ＦＧＦ２は、多くの組織および細胞型において低レベルで発現し、脳および下垂体で高
濃度に達する、広範なマイトジェン性の、血管形成性の、および神経栄養性の因子である
。ＦＧＦ２は、四肢の発生、血管新生、創傷治癒、および腫瘍成長を含む多数の生理学的
および病理学的なプロセスに関与している。ＦＧＦ２は、例えばＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ−
Ｇｉｂｃｏ（Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ）から商業的に入手すること
ができる。

血小板由来増殖因子（ＰＤＧＦ）は、線維芽細胞、平滑筋、および結合組織を含む広範
な細胞型にとっての強力なマイトジェンである。Ａ鎖およびＢ鎖と呼ばれる２つの鎖の二
量体からなるＰＤＧＦは、ＡＡもしくはＢＢホモ二量体として、またはＡＢヘテロ二量体
として存在し得る。ヒトＰＤＧＦ−ＡＢは、１３．３ｋＤａのＡ鎖および１２．２のＢ鎖
から構成される２５．５ｋＤａのホモ二量体タンパク質である。ＰＤＧＦ ＡＢは、例え
ばＰｅｐｒｏｔｅｃｈ（Ｒｏｃｋｙ Ｈｉｌｌ、Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ）から商業的に入
手することができる。

ＦＧＦ２および場合によってＰＤＧＦ−ＡＢなどの（１つまたは複数の）増殖因子は、
約１００ｐｇ／ｍｌの濃度、例えば約５００ｐｇ／ｍｌ、例えば約１ｎｇ／ｍｌ、例えば
約２ｎｇ／ｍｌ、例えば約３ｎｇ／ｍｌ、例えば約４ｎｇ／ｍｌ、例えば約５ｎｇ／ｍｌ
で培地内に存在し得る。いくつかの実施形態において、培地は、約５ｎｇ／ｍｌのＦＧＦ
２を含有する。培地はまた、約５ｎｇ／ｍｌなどのＰＤＧＦ ＡＢを含有し得る。

＜スプリット細胞＞
培養物内の細胞は通常、接触阻止によって細胞の分裂および成長が停止するコンフルエ
ンスとなるまで、成長し続ける。このような細胞は次に、基質またはフラスコから解離さ
せ、組織培養培地への希釈および再平板培養によって「スプリット」、二次培養、または
継代することができる。

本明細書において記載される方法および組成は、したがって、継代、または培養の間の
スプリットを含み得る。細胞培養物内の細胞は、１：２以上、例えば１：３、例えば１：
４、１：５、またはそれ以上の比でスプリットすることができる。用語「継代」は、細胞
株のコンフルエントな培養物のアリコートを得ること、新鮮な培地に接種すること、およ
び細胞株をコンフルエンスまたは飽和が得られるまで培養することから構成されるプロセ
スを指す。

＜選択、スクリーニング、または選別ステップ＞
本方法はさらに、間葉系幹細胞をさらに単離または選択するための選択または選別ステ
ップを含み得る。

選択または選別ステップは、１つまたは複数の表面抗原マーカーを用いて細胞培養物か
ら間葉系幹細胞（ＭＳＣ）を選択することを含み得る。選択または選別ステップの使用は
さらに、ＭＳＣについての選別特異性および選択特異性のストリンジェンシーをさらに増
強させ、さらに、胚性幹細胞からの考えられる汚染物質、例えば出発材料からのｈＥＳＣ
および他のｈＥＳＣ誘導体を低減させる能力を有する。このことは次に、奇形腫形成のリ
スクをさらに低減させ、本発明者らが記載するプロトコルの臨床的妥当性をさらに増大さ
せる。

抗原の発現に基づく選択または選別のために多くの方法が知られており、これらのいず
れも、本明細書において記載される選択または選別ステップにおいて用いることができる
。選択または選別は、蛍光活性化細胞選別（ＦＡＣＳ）を用いて行うことができる。した
がって、当技術分野において知られているように、ＦＡＣＳは、細胞を、細胞によって発
現された抗原に結合しそれを標識する標識抗体などのレポーターに曝露させることを伴う
。抗体を生産し、それを標識してレポーターを形成する方法は、当技術分野において知ら
れており、例えばＨａｒｌｏｗおよびＬａｎｅにおいて記載されている。細胞を次いで、
標識に基づいて細胞を互いに選別するＦＡＣＳ機器の中に通す。あるいは、またはそれに
加えて、細胞を選別するために磁気細胞選別（ＭＡＣＳ）を用いることができる。

本発明者らは、多くの候補表面抗原、例えばＣＤ１０５、ＣＤ７３、ＡＮＰＥＰ、ＩＴ
ＧＡ４（ＣＤ４９ｄ）、ＰＤＧＦＲＡが、ＭＳＣに関連することが知られているが、ＭＳ
Ｃ関連表面抗原のいくつか、例えばＣＤ２９およびＣＤ４９はまた、ｈＥＳＣなどのＥＳ
細胞においても高度に発現されること、ならびにそれらの発現がＦＡＣＳ分析によって検
証されることに気付いた。表面抗原とＭＳＣとの関連は、抗原をｈＥＳＣなどのＥＳ細胞
からＭＳＣを単離するための選択マーカーとみなすためには十分ではない可能性がある。
したがって、選択または選別ステップは、ＭＳＣとＥＳ細胞との間で差次的に発現してい
る抗原を採用し得る。

本発明者らの方法の選択または選別ステップは、抗原の発現に基づいて間葉系幹細胞に
ついて正の選択をすることができる。このような抗原は、例えば、ｈＥＳＣおよびｈＥＳ
ＣＭＳＣの遺伝子発現プロファイルを比較することによって同定することができる。特定
の実施形態において、選択または選別は、以下の表Ｅ１ＡおよびＥ１Ｂに示される抗原の
いずれかを具体的に用い得る。

本発明者らの方法の選択または選別ステップは、ＭＳＣ上で発現するがｈＥＳＣなどの
ＥＳ細胞上では発現しないと同定される抗原の発現に基づいて、間葉系幹細胞について正
の選択をすることができる。

ＣＤ７３はＭＳＣ上で高度に発現されるが、ｈＥＳＣ上では高度に発現されない。ＣＤ
７３およびＣＤ１０５の両方は、ＭＳＣにおける高度に発現する表面抗原であり、ｈＥＳ
Ｃと比較してｈＥＳＣ−ＭＳＣにおいて最も高度に発現する２０の表面抗原に含まれ、Ｃ
Ｄ７３またはＣＤ１０５（または両方）を推定ＭＳＣについての選択マーカーとして用い
ることは、分化中のｈＥＳＣによって生成した推定ＭＳＣについての選別において等しく
効果的である。

あるいは、またはそれに加えて、選択または選別ステップは、ｈＥＳＣなどの胚性幹細
胞（ＥＳ細胞）上で表面抗原として高度に発現するが例えばｈＥＳＣ−ＭＳＣなどの間葉
系幹細胞では高度に発現しない表面抗原に基づいて、抗原に対して負の選択をし得る。選
択または選別は、既知のまたは以前に同定されたｈＥＳＣ特異的な表面抗原、例えばＭＩ
ＢＰ、ＩＴＧＢ１ＢＰ３およびＰＯＤＸＬ、ならびにＣＤ２４に基づき得る。

ＦＡＣＳ分析によって、ＣＤ２４がｈＥＳＣ上では発現するがｈＥＳＣ−ＭＳＣ上では
発現しないことが確認される。したがって、ＣＤ２４は、それ自体で、または分化中のｈ
ＥＳＣの培養物から推定ＭＳＣを単離するための正の選択マーカーであるＣＤ１０５と組
み合わせて、負の選択マーカーまたは選別マーカーとして用いることができる。
［実施例］

＜材料および方法−エキソソームの調製＞
エキソソームを、先に記載されたようにＨＰＬＣを用いて、ｈｕＥＳ９．Ｅ１由来のＭ
ＳＣ馴化培地（ＣＭ）から精製した。簡潔に述べると、ＭＳＣ培養物から回収したＣＭを
、１００ｋＤａのＭＷＣＯ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、Ｇｏｅｔｔｉｎｇｅｎ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）を有する膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過（ＴＦＦ）によって、５０倍に濃縮
した。

その後、ＣＭを、クロマトグラフィーカラム（ＴＳＫ ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ、６
×４０ｍｍ、およびＴＳＫゲルＧ４０００ ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍ、東ソー株式
会社、東京、日本）に通した。

エキソソームを溶出の第１のピークから回収し、１００ｋＤａのＭＷＣＯフィルター（
Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を用いて濃縮した。エキソソームを、保存または使用する前に、０
．２２μｍのフィルターで濾過した。

材料および方法−ＬＣ／ＭＳ／ＭＳ
記載されているように、２ｍｌの透析されたエキソソーム内のタンパク質を還元し、ア
ルキル化し、そしてトリプシン消化した（２０）。

試料を次に、消化された混合物を、馴化されたＳｅｐ−Ｐａｋ Ｃ−１８ ＳＰＥカー
トリッジ（Ｗａｔｅｒｓ、Ｍｉｌｆｏｒｄ、ＭＡ、ＵＳＡ）に通すことによって脱塩し、
３％アセトニトリル（ＡＣＮ）（ＪＴ Ｂａｋｅｒ、Ｐｈｉｌｌｉｐｓｂｕｒｇ、ＮＪ）
および０．１％ギ酸（ＦＡ）の緩衝液で２回洗浄し、そして７０％ＡＣＮおよび０．１％
ＦＡの緩衝液で溶出した。

溶出された試料を次に、真空遠心分離機において有機溶媒を除去することによって、そ
の最初の容積の約１０％まで乾燥させた。

試料の複雑性を低減させるために、オフラインペプチド分画を、Ｐｏｌｙｓｕｌｆｏｅ
ｔｈｙｌ ＳＣＸカラム（２００ｍｍ×４．６ｍｍ）（ＰｏｌｙＬＣ、ＵＳＡ）を通すＨ
ＰＬＣ系（株式会社島津製作所、日本）で行った。

１ｍｌ／分での、移動相Ａ（５ｍＭのＫＨ４ＰＯ４＋３０％アセトニトリル）および移
動相Ｂ（５ｍＭのＫＨ４ＰＯ４＋３０％アセトニトリル＋３５０ｍＭのＫＣｌ）。

８つの画分を回収し、真空遠心分離機で乾燥させた。

分画された試料を、ナノスプレー源を取り付けたＬＴＱ−ＦＴ Ｕｌｔｒａリニアイオ
ントラップ質量分析計（Ｔｈｅｒｍｏ Ｅｌｅｃｔｒｏｎ、Ｂｒｅｍｅｍ、Ｇｅｒｍａｎ
ｙ）にオンラインで繋いだ株式会社島津製作所のマイクロＨＰＬＣ系の自動サンプラー内
にロードした。

注入されたペプチドを、Ｚｏｒｖａｘ ３００ＳＢ−Ｃ１８濃縮カラム（５ｍｍ×０３
ｍｍ、Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｅｒｍａｎｙ）内で捕捉および脱
塩し、そしてナノレベルの穴を有するＣ１８パックされたカラム（７５μｍ×１００Å、
Ｍｉｃｈｒｏｍ Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅｓ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ）内に溶出した。

有効流速２００ｎｌ／分へのスプリッターを用いる一定流速２０μｌ／分での９０分の
勾配を用いて、ペプチドを質量分析計内に溶出した。

ＦＴＭＳにおける各ＭＳスキャンから得られる最も強いピークの８つについてＭＳ／Ｍ
Ｓスキャンを行うことによって、ＬＴＱをデータ依存モードで操作した。

各実験で、８つのＳＣＸ画分のＭＳ／ＭＳ（ｄｔａ）スペクトルを、自作のプログラム
によるシングルマスコットジェネリックファイル内に組み合わせた。

タンパク質の同定は、社内のＭａｓｃｏｔサーバ（バージョン２．２．０４、Ｍａｔｒ
ｉｘ Ｓｃｉｅｎｃｅ、ＵＫ）を介して、組み合わされたデータをＩＰＩヒトタンパク質
データベース（バージョン３．３４、６９１６４の配列、２９０６４８２５の残基）に対
してサーチすることによって行った。

サーチパラメータは、トリプシンを用いる切断の失敗が最大で２ヶ所であること；固定
された修飾がシステインのカルバミノメチル化であり、可変の修飾がメチオニンの酸化で
あること、であった。

質量許容差は、ペプチド前駆体および断片イオンについてそれぞれ１０ｐｐｍおよび０
．８Ｄａに設定した。

タンパク質の同定は、２つの異なるペプチドがホモロジースコアよりも大きなスコアを
有することが明らかになった場合に、真陽性であると認められた。

＜材料および方法−抗体アレイ＞
５００μｌの非馴化培地および３つの独立した調製物からのエキソソームを、製造者の
指示に従って（ＲａｙＢｉｏ、Ｎｏｒｃｒｏｓｓ、ＧＡ）、ＲａｙＢｉｏ（登録商標）Ｂ
ｉｏｔｉｎ Ｌａｂｅｌ−ｂａｓｅｄ Ｈｕｍａｎ Ａｎｔｉｂｏｄｙ Ａｒｒａｙ Ｉ
を用いて、サイトカインおよび他のタンパク質の存在についてアッセイした。

シグナル強度が非馴化培地よりも２倍高い（ｐ＜０．０５）場合に、サイトカインおよ
び他のタンパク質がエキソソーム内に存在するとみなした。

＜材料および方法−ウェスタンブロットハイブリダイゼーション＞
１２μｇのエキソソームを、４〜１２％ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、
ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。

膜をＳＮＡＰ ｉ．ｄ．系（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｂｉｌｌｅｒｉｃａ、ＭＡ）の膜ホ
ルダーに移し、ブロックし、そして、マウス抗ＧＡＰＤＨ（１：１００希釈）、マウス抗
ＰＧＫ（１：６０）、マウス抗ＰＧＤ（１：６０）、ウサギ抗ＰＦＫＦＢ３（１：６０）
、マウス抗ピルビン酸キナーゼ（ＰＫ、１：２００）、マウス抗２０Ｓプロテアソームα
１〜７（１：２００）、マウス抗ＣＤ７３（１：６０）、およびマウス抗ＣＤ５９（１：
２００）を含む一次抗ヒト抗体と共にインキュベートした。

ブロットを次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体と共にインキュベ
ートした。

用いた二次抗体は、ヤギ抗マウスＩｇＧ（１：１２５０）またはロバ抗ウサギＩｇＧ（
１：１２５０）であった。

全ての抗体は、Ａｂｃａｍ Ｉｎｃ．、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡから入手したマウス
抗ＰＫを除いて、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃ
ｒｕｚ、ＣＡから入手した。

ブロットを次に、ＨＲＰで増強した化学発光基質（Ｔｈｅｒｍｏ Ｆｉｓｈｅｒ Ｓｃ
ｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｉｎｃ．、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）と共にインキュベートし、次いで
、Ｘ線フィルムに曝露した。

＜材料および方法−酵素アッセイ−ピルビン酸キナーゼアッセイ＞
５μｇのエキソソーム（１２μｌ内）を、細胞抽出キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ、Ｍｏ
ｕｎｔａｉｎ ｖｉｅｗ、ＣＡ）を用いて溶解した。

溶解されたエキソソームの抽出物を、市販されているＰＫアッセイキット（Ｂｉｏｖｉ
ｓｉｏｎ）の５０μｌの反応ミックスと共にインキュベートした。

このアッセイにおいて、ＰＫによって生産されたピルビン酸を、ピルビン酸キシダーゼ
によって酸化して、蛍光を生じさせた（Ｅｘ／Ｅｍ＝５３５／５８７ｎｍ）。

蛍光強度の増大は、したがって、生産されたピルビン酸の量に比例する。

＜材料および方法−酵素アッセイ−ＧＡＰＤＨおよびＰＧＫアッセイ＞
ＧＡＰＤＨおよびＰＧＫの活性を、２つの市販されているキット、すなわちＫＤａｌｅ
ｒｔ ＧＡＰＤＨアッセイキット（Ａｍｂｉｏｎ Ｉｎｃ．、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ）およ
びＡｐｏＳＥＮＳＯＲ ＡＤＰ／ＡＴＰ比率アッセイキット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を用
いて、その下流生成物、すなわち糖分解反応におけるＡＴＰに基づいて測定した。

簡潔に述べると、エキソソームを、細胞抽出キット（Ｂｉｏｖｉｓｉｏｎ）を用いて溶
解した。

ＧＡＰＤＨ活性を測定するために、１０μｇの溶解したエキソソームを、Ｄ−グリセル
アルデヒド−３−ホスフェート、ＮＡＤ^＋、およびＰ_ｉを含有するＫＤａｌｅｒｔ反応緩
衝液に添加して、１，３−ビスホスホグリセレート＋ＮＡＤＨ＋Ｈ^＋を形成させた。

２５０Ｕ／ｍｌのＰＧＫおよび６０μＭのＡＤＰを次に添加して、１，３−ビスホスホ
グリセレートおよびＡＤＰを３−ホスホグリセレートおよびＡＴＰに変換した。

ＧＡＰＤＨ活性に比例する生産されたＡＴＰの量を次に、ＡＴＰルシフェラーゼアッセ
イを用いて測定した。

ＰＧＫ活性を測定するために、１０μｇの溶解したエキソソームを、上記のアッセイか
ら生産された１，３−ビスホスホグリセレートに添加した。

ＡＤＰを添加して、ＡＴＰを形成させた。

ＰＧＫ活性に比例するＡＴＰの量を次に、ＡＴＰルシフェラーゼアッセイを用いて定量
した。

＜材料および方法−酵素アッセイ−２０Ｓプロテアソームアッセイ＞
プロテアソーム活性を、特異的２０Ｓプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンの存
在下または不存在下で、２０Ｓプロテアソームによる標識された基質ＬＬＶＹ−ＡＭＣか
らの切断後のフルオロフォア７−アミノ−４メチルクマリン（ＡＭＣ）を検出することに
基づく、２０Ｓプロテアソーム活性アッセイキット（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を用いて測定
した。

簡潔に述べると、４μｇのエキソソームを、２５μＭのラクタシスチンの存在下または
不存在下で、ＬＬＶＹ−ＡＭＣを含有する反応緩衝液と共にインキュベートした。

試料およびＡＭＣ標準を３７℃でインキュベートし、Ｅｘ／Ｅｍ＝３８０／４６０ｎｍ
での蛍光強度を２時間モニタリングした。

＜材料および方法−酵素アッセイ−ＣＤ７３アッセイ＞
エキソソームにおけるＣＤ７３（ＮＴ５Ｅ）酵素活性を、５０μＭのＡＭＰ（Ｓｉｇｍ
ａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含有する１００μｌのＴｒｉｓ緩衝液
（ｐＨ７．４）内で２．５μｇのエキソソームをインキュベートすることによって決定し
た。

ＡＭＰの加水分解から放出されたリン酸イオンの量を次に、製造者の指示通りに、Ｃｏ
ｌｏｒｌｏｃｋ Ｇｏｌｄキット（Ｉｎｎｏｖａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｃａｍｂｒ
ｉｄｇｅ、ＵＫ）によって決定した。

＜材料および方法−細胞アッセイ−糖分解＞
Ｈ９Ｃ２心筋細胞を、ウェル当たり３０，０００個細胞で９６ウェルプレート（ポリリ
ジン被覆された）上に平板培養した。

５時間後、細胞をタイロード緩衝液で２回洗浄し、その後、２０μｍｏｌのオリゴマイ
シン（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、６ｍｍｏｌのグルコースを含有し、０．１μｇ／
ｍｌのエキソソームを含むまたは含まないタイロード緩衝液内で１５分、３０分、および
６０分間インキュベートした。

細胞のＡＴＰ濃度を、ＡＴＰｌｉｔｅ−１ステップ発光ＡＴＰ検出アッセイ系（Ｐｅｒ
ｋｉｎＥｌｍｅｒ、Ｚａｖｅｎｔｅｍ、Ｂｅｌｇｉｕｍ）を用いて測定した。

＜材料および方法−細胞アッセイ−アデノシン介在性のシグナル伝達＞
Ｈ９Ｃ２心筋細胞を、ウェル当たり２００，０００個細胞で６ウェルプレート上で平板
培養し、一晩血清飢餓とした。

細胞を次に、１ｍＭのテオフィリンを含むまたは含まない新鮮な無血清培地と共にさら
に１時間インキュベートした。

その間に、２シリーズの無血清培地を調製した。

一方のシリーズは、補足物なし、５０μＭのＡＭＰのみ、０．１μｇ／ｍｌのエキソソ
ームのみ、または５０μＭのＡＭＰおよび０．１μｇ／ｍｌのエキソソームの組み合わせ
を含有していた。

第２のシリーズは、培地が１ｍＭのテオフィリンを含有していたことを除いて、第１の
シリーズに類似していた。

両シリーズを、３７℃で３０分間インキュベートした。

第１のシリーズを用いて、無血清培地のみで培養された細胞の培地を置換し、第２のシ
リーズを用いて、テオフィリン含有培地において培養された細胞の培地を置換した。

５分後、細胞を採取し、プロテアーゼおよびホスファターゼ阻害剤カクテル１（Ｓｉｇ
ｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）の存在下で、市販されている哺乳動物細胞抽出キット（ＢｉｏＶ
ｉｓｉｏｎ）を用いて溶解した。

タンパク質濃度を、標準的なブラッドフォードアッセイによって決定した。

１０μｇの全タンパク質を、１：２０００希釈のウサギ抗ｐＥＲＫ１／２（Ｃｅｌｌ
Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ、９１０１Ｓ）、１：２０００希釈のウサギ抗ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ Ｓ
ｉｇｎａｌｉｎｇ、９２７１Ｓ）、１：５００希釈のウサギ抗ＥＲＫ１（Ｓａｎｔａ Ｃ
ｒｕｚ、ｓｃ−９４）、および１：５００希釈のウサギ抗ＡＫＴ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａ
ｌｉｎｇ、９２７２Ｓ）を用いて、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションによって
分析した。

＜材料および方法−細胞アッセイ−補体介在性細胞溶解＞
簡潔に述べると、ヒツジ赤血球（ＳＲＢＣ）を購入し（Ｉｎｎｏｖａｔｉｖｅ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ、Ｓｏｕｔｈｆｉｅｌｄ、ＭＩ）、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で３回洗
浄し、その後、ＰＢＳ１ｍｌ当たり１×１０^８個細胞で再懸濁した。

精製補体成分、Ｃ５ｂ６、Ｃ８、およびＣ９は、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ（Ｓａｎ Ｄｉ
ｅｇｏ、ＣＡ）から購入し、Ｃ７はＳｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ、Ｍ
Ｏ）から購入した。

インタクトなＣ５ｂ−９のＳＲＢＣへの会合を、最終濃度が０．１μｇ／ｍｌのエキソ
ソームの存在下または不存在下で、それぞれ１ｍｌのＣ５ｂ６（０．１μｇ／ｍｌ）およ
びＣ７（０．４μｇ／ｍｌ）と共に１５分間インキュベーションすること（３７℃）によ
って開始させた。

ＳＲＢＣを次に洗浄し、最終濃度が０．０５μｇ／ｍｌのブロックＣＤ５９抗体を含む
または含まない、それぞれ１ｍｌのＣ８（０．４μｇ／ｍｌ）にＣ９（０．４μｇ／ｍｌ
）を加えたものと共にさらに３０分間インキュベートした。

その後、ＳＲＢＣを遠心分離し、上清内の溶解したＳＲＢＣによって放出されたヘモグ
ロビンの量を、４１５ｎｍでの吸光度によって測定した。

全（１００％）溶血を、１％（ｗ／ｖ）Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００で細胞を処理するこ
とによって得た。

＜結果−エキソソームのプロテオミクスプロファイリング＞
エキソソームを、以前に記載されているように、ＨＰＬＣによって^９，１０、ヒトＥＳ
Ｃ由来の間葉系幹細胞であるＨｕＥＳ９．Ｅ１^１３によって馴化された培養培地から精製
した。質量分析および抗体アプローチを用いるプロテオミクスプロファイリングを、以前
に記載されているように^９−１１、ＨＰＬＣ精製されたエキソソームの３つの独立して調
製されたバッチに対して行った。全部で８６６のタンパク質を検出し、分析を容易にする
ためにこれらのタンパク質をその遺伝子記号によって示した（表Ｅ１）。これらのうち、
３１８の遺伝子産物が、分画されていない馴化培地において先に同定された７３９のタン
パク質において見られた^９，１０（図１）。

培養細胞および生体液から精製されたエキソソームに対して行われた１５のプロテオミ
クス分析のデータ分析に基づいて、Ｔｈｅｒｙらは、約１７のタンパク質、すなわちグリ
セルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ピルビン酸キナーゼ
（ＰＫ）、真核生物翻訳伸長因子１Ａ１（ＥＥＦ１Ａ１）、乳脂肪球ＥＧＦ因子８タンパ
ク質（ＭＦＧＥ８）、テトラスパニン、１４−３−３タンパク質、Ｇαタンパク質、クラ
スリン、Ａｌｉｘ（ＰＤＣＤ６ＩＰ）、ＭＨＣクラス１、アネキシン（ＡＮＸ）、Ｒａｂ
タンパク質、エズリン（ＶＩＬ２）、ラジキシン（ＲＤＸ）およびモエシン（ＭＳＮ）（
ＥＲＭ）、アクチン、チューブリン、ＨＳＰ７０およびＨＳＰ９０の組み合わせが、特徴
付けされたエキソソームの少なくとも５０％において見られることを観察した^２。予想通
り、これらのタンパク質のほとんどはまた、ＨＰＬＣ精製されたＭＳＣエキソソームのプ
ロテオームにおいても見られた（表Ｅ１）。エンドソーム由来のエキソソームとも一致し
て、本発明者らは、Ａｌｉｘ（ＰＤＣＤ６ＩＰ）およびＲａｂ（表Ｅ１）などのエンドソ
ーム関連タンパク質の存在を検出した。

＜結果−エキソソームプロテオームの計算分析＞
エキソソームにおけるタンパク質の生物学的有意性をさらに良く理解するために、生物
学的プロセスへの８６６のタンパク質の機能的クラスター化を、ＰＡＮＴＨＥＲ（進化的
関係を介するタンパク質分析）分析ソフトウェアを用いて行った^{１４，１５}。各生物学的
プロセスにおけるエキソソームプロテオームからの観察された遺伝子頻度を、その生物学
的プロセスについてのＮＣＢＩデータベースにおける参照遺伝子頻度と比較した。８６６
の遺伝子産物を、出現頻度の高かった（ｐ＜０．００１）３２の生物学的プロセスおよび
出現頻度の低かった（ｐ＜０．００１）３つの生物学的プロセスにクラスター化すること
ができた（図２）。

これらの生物学的プロセスをさらに、エキソソーム生物学、例えば伝達、細胞の運動性
、炎症、およびエキソソーム生合成に関連するいくつかの活性にさらに分類することがで
きた。エキソソームは全体として、細胞間伝達およびモルフォゲンシグナル伝達^４，１６
ならびに免疫活性のメディエーター^２の媒体として機能すると仮定されるため、シグナル
伝達経路、細胞構造、細胞の運動性、および免疫応答におけるエキソソームタンパク質の
関与は当然のことであった。本発明者らが「エキソソーム生合成」と暫定的に呼ぶ、第４
のクラスのプロセスは、エンドソームの関与、ＥＳＣＲＴ介在性の選別および多小胞体の
形成、ならびに原形質膜との融合を介する、エキソソームの生合成および放出を基本的に
反映していた。したがって、トランスゴルジネットワーク、細胞内のタンパク質輸送、一
般的な小胞輸送、エンドサイトーシス、受容体介在性のエンドサイトーシス、他のタンパ
ク質の標的化および局在化、ならびにエキソサイトーシスに関与するもののようなタンパ
ク質は、当然のことながらエキソソームにおいて富んでいる。組織の修復および再生とし
て本発明者らが分類した他の生物学的プロセスには、骨格の発生および血管新生を含む中
胚様性および外肺葉性の組織の発生および分化に関与するプロセスが含まれる。これらの
生物学的プロセスは、間葉系幹細胞^１７の分化能力に一致し、エキソソームが細胞由来で
あることを反映していた。本発明者らの代謝分類において、本発明者らは、成長および再
生のためのエネルギーおよび構成成分を生産する、異化作用性または同化作用性の代謝に
関与するプロセスを含めた。血液凝固もまた、本発明者らが組織傷害の改善において重要
であり得ると仮定した、有意に出現頻度の高い生物学的プロセスであった。３つの出現頻
度の低い生物学的プロセスの全ては、当然のことながら、転写レベルでの遺伝子発現の調
節に関与していた。これらのプロセスに関与するほとんどのタンパク質は、核内に効率的
に輸送されて、エキソソームとあまり関連しないようになる傾向がある。本発明者らはま
た、馴化培地（ＣＭ）において見られる４２１のタンパク質がエキソソーム内に存在しな
いこと（図１）およびこれらのタンパク質が１１の出現頻度の高い生物学的プロセスおよ
び２つの出現頻度の低い生物学的プロセスに機能的にクラスター化され得ることを観察し
た。出現頻度の高いプロセスのうち、６つは、エキソソームにおいて見られる８６６のタ
ンパク質のクラスター化においても見られたが、残りの５つ、すなわちアミノ酸活性化、
タンパク質のフォールディング、染色体のパッケージングおよびリモデリング、タンパク
質複合体の会合、ならびにｍＲＮＡのスプライシングは見られなかった。２つの出現頻度
の低い生物学的プロセスはまた、エキソソームタンパク質については出現頻度が低いこと
が分かった。ＭＳＣエキソソームにおける多種多様なタンパク質は、これらが広範な生化
学的活性および細胞的活性に関与する能力を有することを示した。この仮説を試験するた
めに、本発明者らは、タンパク質を選択し、当該タンパク質は、その生化学的および細胞
的活性を試験するためのアッセイが利用可能なものであり、このアッセイは、組み合わせ
て、エキソソームにおける広範な活性の指標を提供するものである。

＜結果−エキソソームは糖分解を介する細胞ＡＴＰ生産を増強させた＞
エキソソームプロテオームの１つの顕著な特徴は、糖分解（図３Ａ）のＡＴＰ生成段階
における５つの酵素の全て、すなわち、グリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ（ＧＡＰＤＨ）、ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）、ホスホグルコムターゼ
（ＰＧＭ）、エノラーゼ（ＥＮＯ）、およびピルビン酸キナーゼｍ２アイソフォーム（Ｐ
Ｋｍ２）の存在であった。これらのうち、ＡＴＰまたはＮＡＤＨを生成する３つの酵素、
すなわちＧＡＰＤＨ、ＰＧＫ、およびＰＫｍ２は、イムノブロッティングによって存在す
ることがさらに確認された（図３Ｂ）。その酵素の活性は、１単位（Ｕ）の酵素活性が１
分当たり１μモルの生成物の生産に必要な活性であると規定される場合に、タンパク質１
μｇ当たりそれぞれ１．１μＵ、３．５９μＵ、および５．５μＵであることが決定され
た（図３Ｃ）。

さらに、エキソソームは、フルクトース６−ホスフェートをフルクトース２，６−ビス
ホスフェートに変換するＰＦＫＦＢ３を含有する。ＰＦＫＦＢ３は、４つの異なる遺伝子
によってコードされる４つのＰＦＫＦＢアイソフォームであるＰＦＫＦＢ１、２、３、お
よび４の１つである。ＰＦＫＦＢは、糖分解への関与を触媒する、ホスホフルクトキナー
ゼの強力なアロステリック活性化剤であるフルクトース−２，６−ビスホスフェート^１８
の細胞レベルを維持することに関与する。これらは、がん細胞における高い糖分解率また
は「ワールブルク効果」に関与すると考えられている^１９。ＰＦＫＦＢ３のキナーゼ活性
は、ｃＡＭＰ依存性のタンパク質キナーゼおよびタンパク質キナーゼＣなどのタンパク質
キナーゼによるリン酸化によって上方調節される。質量分析によって、エキソソームにお
けるＰＦＫＦＢ３の存在が明らかになり、イムノブロッティングによって、この酵素がリ
ン酸化されたことがさらに実証された（図３Ａ）。

エキソソームにおける、ＡＴＰを生成する糖分解酵素およびリン酸化されたＰＦＫＦＢ
３の存在によって、エキソソームへの細胞の曝露が糖分解フラックスおよびＡＴＰ生産を
増大させ得ることが予測された。これを試験するために、本発明者らは、これらのエキソ
ソームがオリゴマイシン処理されたＨ９Ｃ２細胞においてＡＴＰ合成を増大させ得るかを
決定した。オリゴマイシンはミトコンドリアＡＴＰａｓｅを阻害するため^２０、オリゴマ
イシン処理した細胞は、糖分解をその主要な細胞ＡＴＰ源として利用しなくてはならない
。糖分解酵素およびＰＦＫＦＢ３の存在、ならびに本発明者らによる、Ｈ９Ｃ２細胞がＭ
ＳＣエキソソームを取り込み得るという以前の実証^１２と一致して、エキソソームは、オ
リゴマイシン処理した細胞において、それぞれエキソソームに１５から３０分曝露させる
と、糖分解の増大を介して、ＡＴＰレベルを７５．５±２８．８％または５５．８±１６
．５％増大させた。

＜結果−エキソソームにおける２０Ｓプロテアソームは酵素的に活性である＞
ＭＳＣエキソソームの質量分析は、２０Ｓコア粒子の７つのα−サブユニット（ＰＭＳ
Ａ１〜７）の全ておよび７つのβ−サブユニット（ＰＭＳＢ１〜７）の全ての存在を検出
しただけではなく、「免疫プロテアソーム」の３つのβ−サブユニットであるＰＭＳＢ８
（β５ｉまたはＬＭＰ７）、ＰＭＳＢ９（β１ｉまたはＬＭＰ２）、ＰＭＳＢ１０（β２
ｉまたはＬＭＰ１０）遺伝子産物も検出した^２１。２０Ｓプロテアソームペプチドのいく
つかの存在は、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションによってさらに確認された（
図４Ａ）。２０Ｓコア粒子の７つのα−サブユニットの全ておよび７つのβ−サブユニッ
トの全ての存在は、ＭＳＣエキソソームが無傷の２０Ｓプロテアソーム複合体を含有し、
したがって、２０Ｓプロテアソーム酵素活性を潜在的に有することを示唆する。

これと一致して、ＭＳＣエキソソームは、５．００μＵ／μｇのタンパク質の酵素活性
を有する短い蛍光発生ペプチドを分解し得、この分解は、特異的プロテアソーム阻害剤で
あるラクタシスチンによって阻害された（図４Ｂ）。本発明者らはまた、上記の糖分解酵
素アッセイとは異なり、エキソソームにおける２０Ｓプロテアソーム活性が、エキソソー
ムの溶解を伴わずに検出され得ることを観察した。このことは、２０Ｓプロテアソームが
エキソソームの内腔ではなく表面上に存在し得ることを示唆した。

２０Ｓプロテアソームがホスファチジルイノシトール脂質単層、ＥＲ、およびゴルジ脂
質フィルム^２２上の「エンドオン」立体構造に優先的に会合し、その結果２０Ｓプロテア
ソームへの入り口が膜に垂直となることが、以前に観察された。したがって、これと本発
明者らの所見とを組み合わせると、エキソソーム内の２０Ｓプロテアソームが外部膜表面
に付着し、その入り口がエキソソーム膜に垂直であったことを示唆している。

＜結果−エキソソームはＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼを
介してＥＲＫおよびＡＫＴをリン酸化した＞
エクト−５'−ヌクレオチダーゼ（ＮＴ５ＥまたはＣＤ７３）は、エクトアピラーゼ（
ＣＤ３９）と共に、前駆ヌクレオチドをアデノシンに酵素的に変換する。細胞の傷害の間
、細胞はＡＴＰおよびＡＤＰを放出する^２３。ＣＤ３９は、細胞外ＡＴＰおよびＡＤＰを
ＡＭＰに加水分解し、これは次に、エクト−５'−ヌクレオチダーゼによってアデノシン
に分解される。

アデノシンは、ヒト血液において１０秒の半減期を有する。これは、強力な血管拡張物
質であるが、作用が非常に短いため、血管拡張物質として臨床的には用いられていない。
これは、上室性頻拍症の迅速な治療に用いられる。アデノシンは、４つの既知のアデノシ
ン受容体サブタイプ（Ａ１、Ａ２Ａ、Ａ２Ｂ、およびＡ３）を介して多くの生理学的プロ
セスを仲介する内因性プリンヌクレオシドである^２４。

ＮＴ５Ｅは、質量分析によってＭＳＣエキソソームに存在することが明らかになり、イ
ムノブロッティングによって確認された（図５Ａ）。それらの酵素活性は、タンパク質１
μｇ当たり２２．０４μＵであると決定された。エキソソームがＡＭＰのＣＤ７３介在性
の加水分解を介して細胞内のアデノシンシグナル伝達を活性化し得るかを決定するために
、Ｈ９Ｃ２心筋細胞を一晩血清不足とし、次に、エキソソームおよびＡＭＰに曝露した。
細胞溶解物を次に、ＥＲＫ１／２およびＡＫＴのリン酸化について分析した（図５Ｂ、図
５Ｃ）。

一晩血清不足とした後、エキソソームおよびＡＭＰへの曝露によって、ＥＲＫ１／２お
よびＡＫＴのリン酸化が誘発された。ＥＲＫ１／２およびＡＫＴのリン酸化は、非選択的
なアデノシン受容体アンタゴニストであるテオフィリン、拮抗されたＡ１、Ａ２Ａ、Ａ２
Ｂ、およびＡ３受容体の存在下で消失した^２５。

＜結果−エキソソームは膜侵襲複合体の形成を阻害した＞
補体系は、抗体の機能を補う、自然免疫系の一部である。活性化すると、生化学的カス
ケードが開始して、いくつかの鍵となる生成物、すなわち、病原体の表面に結合しこれら
の病原体の食作用を増強させるＣ３ｂ、走化性による炎症細胞の動員を助けるＣ５ａ、な
らびにＣ５ｂ、Ｃ６、Ｃ７、Ｃ８、およびポリマー性Ｃ９からなるＭＡＣの形成を開始さ
せるＣ５ｂを生成する。標的細胞上に堆積したＭＡＣは膜貫通チャネルを形成し、これに
よってその後の細胞溶解が生じる。補体経路の異常な活性化は、虚血再かん流傷害におい
て有害な役割を有すると考えられる^２６。

ＭＳＣエキソソームは、質量分析によってＣＤ５９を含有することが明らかになり、こ
のことは、イムノブロッティングによって確認された（図６Ａ）。ＣＤ５９はＭＡＣの形
成を阻害するため^２７、このことは、エキソソームが補体活性化およびその後の補体介在
性の細胞溶解を阻害し得ることを示唆した。この仮説と一致して、エキソソームは、ヒツ
ジ赤血球（ＳＲＢＣ）の補体介在性の溶解を阻害した（図６Ｂ）。この阻害は、ＣＤ５９
ブロッキング抗体をエキソソームの前処理に用いた場合に無効となり、このことは、エキ
ソソームのＣＤ５９が補体溶解の阻害に直接的に関与することを示す。

＜考察（実施例１から１７について）＞
この報告において、本発明者らは、独立して調製された３種類の、ＨＰＬＣ精製された
ＥＳＣ由来のＭＳＣエキソソームのプロテオームを、質量分析およびサイトカインアレイ
を用いてプロファイリングし、８６６のタンパク質を同定した。これらのタンパク質は、
他のエキソソームにおいて共通して見られる多くのタンパク質を含んでいた。

その機能に従った、これらのタンパク質クラスター化によって、エキソソームが多くの
生物学的プロセスを駆動する能力を有することが示唆された。この仮説的な生物学的能力
を評価するために、本発明者らは、その生化学的活性および細胞的活性についてのアッセ
イが利用可能であること、ならびにグループとしてそれらが広範な活性多様性を説明する
ことに基づいて選択されたタンパク質セットを試験した。さらに重要なことに、これらの
選択されたタンパク質の生化学的活性および細胞的活性は、急性心筋虚血／再かん流傷害
における組織傷害を改善する能力を有し得る。

ＭＳＣエキソソームのプロテオームは、多様なタンパク質を含有していた。重要な画分
は、生合成経路およびエンドサイトーシス経路を介する高度に調節され複雑な細胞内膜輸
送および選別に関与するタンパク質であり^２８、これらのタンパク質の存在は、おそらく
、多くの細胞型によって分泌される基本的に小さな脂質二重膜小胞であるエキソソームの
生合成の反映である。異なる細胞源からのエキソソームが共通のタンパク質セットを有し
、その多くがそれらの生合成を反映することが以前に観察された^２９。エキソソームの生
合成ならびにタンパク質およびＲＮＡカーゴのロードの選択的ロードにおける複雑性は、
細胞資源の多くが用いられること、およびこのような関与が重要な生理学的機能によって
支えられているに違いないことを示唆する。

エキソソームは発見されて３０年を超えるが、エキソソームの生物学的重要性は、明ら
かにされ始めたばかりである。エキソソームは、ますます多くの重要な生理学的および病
理学的プロセス、例えば不要なタンパク質の処分^１、抗原提示^３０、遺伝子交換^３１、免
疫応答^{３２，３３}、および腫瘍の転移^{３２−３７}に関与している。総合すると、これらの
所見は、グループで、または個別に、エキソソームが多くの生物学的プロセスを調節し得
ることを示唆する。後者の可能性は、エキソソームにおいて見られている広範なタンパク
質およびＲＮＡによって裏付けられる^{１２，３８}。上記に列挙したエキソソームの機能に
加えて、本発明者らは、最近、ＭＳＣによって分泌されるエキソソームが急性心筋虚血／
再かん流傷害のマウスモデルにおいて梗塞サイズを低減させ得ることを観察した^９。根底
にある分子メカニズムを調べ、解明するために、本発明者らは、ＭＳＣエキソソームの体
系的なプロテオミクスの疑問に着手して、これらのエキソソームの細胞的能力および生化
学的能力を明らかにし、急性心筋虚血／再かん流傷害における組織傷害を改善し得る候補
生物学的活性を同定した^９。

本発明者らはまず、ＡＴＰおよびＮＡＤＨの生成に関与する糖分解酵素^１８がエキソソ
ーム内に存在するだけではなく生化学的にも活性であることを決定した。さらに、エキソ
ソームはまた、ホスホフルクトキナーゼの強力なアロステリック活性化剤であるフルクト
ース−２，６−ビスホスフェートの形成を触媒する活性なリン酸化形態のＰＦＫＢ３を含
有していた。これらの所見は、ＭＳＣエキソソームが、ミトコンドリア機能に依存せずに
、糖分解を介して細胞ＡＴＰおよびＮＡＤＨを回復させる能力を有することを示した。Ａ
ＴＰ生産の主要な部位である上に、ミトコンドリアはまた、細胞死の調節における主要な
オルガネラである^３９。ミトコンドリアの機能の喪失およびその後のＡＴＰの枯渇は、通
常、急性心筋虚血／再かん流傷害などの病的状態の間の細胞死をもたらすカスケードにお
ける初期のステップに相当する。細胞生存能力の主要な指標であるＡＴＰの欠如は、ミト
コンドリアの機能障害の鍵となる結果である。ＭＳＣエキソソームは細胞によって取り込
まれ得るため^１２、エキソソームは、ミトコンドリアが損傷した細胞における糖分解酵素
またはリン酸化ＰＦＫＢ３の細胞含有量を増大させることによって細胞ＡＴＰレベルを回
復させる能力を有する。実際、Ｈ９Ｃ２細胞におけるミトコンドリアのＡＴＰａｓｅがオ
リゴマイシンによって阻害されると、エキソソームは、これらの細胞においてＡＴＰ生産
を増大させ得る。

２０Ｓプロテアソームを共に構成する７つのαサブユニットおよびβサブユニットの全
ての存在、ならびにエキソソームにおける２０Ｓプロテアソーム酵素活性のその後の検証
は、ＭＳＣエキソソームの治療的活性が２０Ｓプロテアソームの存在に部分的に起因し得
ることを示唆した。２０Ｓプロテアソームは、細胞内の酸化的に損傷したタンパク質の全
ての約９０％の分解の原因であり^４０、プロテアソーム活性の低減は、加齢に関連する神
経変性疾患、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病^{４１，４２}または心血管疾患
^{４３−４５}の発症の要因であると仮定されている。

ＣＤ７３によってＡＭＰをアデノシンに加水分解し、その後、アデノシン受容体を介し
てＡＫＴおよびＥＲＫ１／２のリン酸化を誘発する、ＭＳＣエキソソームの生化学的能力
によって、ストレスを受けた細胞および刺激された生存シグナル伝達経路によって放出さ
れるＡＭＰを加水分解する、ＭＳＣエキソソームの能力が説明された。Ｅｕｒｏｐｅａｎ
Ｓｏｃｉｅｔｙ ｏｆ Ｃａｒｄｉｏｌｏｇｙの最近の方針書は、アデノシン受容体の
活性化およびプロ生存キナーゼ、例えばＰＩ３キナーゼであるＡＫＴおよびＥＲＫ１／２
のリン酸化を、再かん流傷害を限定する役割を有する可能性があると協調していた^４６。
したがって、心保護性であることが示されているアデノシン受容体の活性化^{４６，４７}は
また、エキソソームによる再かん流傷害の改善を仲介する分子メカニズムであり得る。

エキソソーム上のＣＤ５９による赤血球の補体介在性の溶解の阻害は、エキソソームの
心保護効果のさらに別の候補メカニズムに相当する。補体活性化は、腸、心臓、および腎
臓などの組織における虚血／再かん流傷害の既知のメディエーターであり、その減衰また
は阻害は、組織傷害を改善することが示されている^{４８−５０}。

要約すると、エキソソームプロテオームについての本発明者らの疑問および生化学的検
証は、広範な生化学的活性および細胞的活性を明らかにし、エキソソームの心保護効果の
ためのいくつかの候補経路を同定した。これらの候補経路の１つまたは複数が急性心筋傷
害の治療における再かん流傷害の低減におけるＭＳＣエキソソームの有効性に寄与したか
を決定するためには、適切な動物モデルにおけるさらなる検証研究が必要である^５１。Ｍ
ＳＣエキソソームにおける多くの生化学的能力は、２つ以上の組織傷害メディエーターを
同時に標的化し、組み合わせ薬剤療法において観察されるものと類似の治療的相乗効果を
潜在的に誘発する可能性を提供する。複数の傷害メディエーターを標的化し得るというこ
の可能性は、これらの標的化活性を駆動するための酵素の使用によってさらに増強される
。酵素活性は、その微小環境、例えば基質の濃度またはｐＨによって決定されるため、エ
キソソームの酵素に基づく治療的活性は、疾患促進微小環境の程度に比例して活性化され
得るかまたは弱められ得る。結果として、エキソソームに基づく治療の有効性は、疾患促
進微小環境に非常に応答性であり得、当該環境によってさらに限定され得る。総合すると
、これらの特徴は、エキソソームに基づく治療を、本質的に安全でさらに有効なものとし
得る。

＜結果−ＭＳＣエキソソームによるＴＬＲの活性化＞
ＭＳＣエキソソームを、ヒトＴＬＲのほとんどを発現することが知られているヒト急性
単球性白血病細胞株であるＴＨＰ−１に由来する２つの細胞株を用いて、ＴＬＲを活性化
する能力についてまず評価した。第１の株は、ＮＦ−ｋＢプロモーターの転写制御下にあ
る安定的にトランスフェクトされた分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポー
ター遺伝子を有するＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅである。第２の株は、ＭｙＤ８８活性が欠損し
ているＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ−ｄｅｆＭＹＤであり、その結果、ＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅの
活性化およびＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅ−ｄｅｆＭＹＤの非活性化は、ＴＬＲリガンドの存在
を示す。０．１μｇ／ｍｌでは、ＭＳＣエキソソームは、０．０１μｇ／ｍｌのＬＰＳと
同程度までＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅを活性化させ、この活性化は、ＬＰＳの活性化とは異な
り、ポリミキシンＢによって消失せず、これによって、ＭＳＣエキソソーム調製物におけ
るＬＰＳ汚染は除外された。ＭＳＣエキソソームおよびＬＰＳの両方は、ＴＨＰ１−ＸＢ
ｌｕｅ−ｄｅｆＭＹＤを活性化できず、このことは、ＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅの活性化がＴ
ＨＰ−１細胞上に存在するＴＬＲのいくつかの活性化によってのみ仲介されたことを示す
（図６）。

ＭＳＣエキソソームはＴＬＲ２およびＴＬＲ４の推定リガンドを含有するため、これら
を、ヒトＴＬＲ２またはＴＬＲ４で安定的にトランスフェクトされたＨＥＫレポーター細
胞株、およびＳＥＡＰレポーター系を用いて、これらの受容体を活性化させる能力につい
て試験した（図７および図８）。ＭＳＣエキソソームはＴＬＲ２およびＴＬＲ４の両方の
内因性リガンドを含有していたが、ＴＬＲ４のみが０．１μｇ／ｍｌのエキソソームで活
性化した。１．０μｇ／ｍｌのエキソソームでは、ある程度の小さな、しかし有意な（ｐ
＜０．０１）ＴＬＲ２活性化が存在し、このことは、ＭＳＣエキソソームによるＴＬＲ２
活性化の能力が少なくとも１０倍低かったことを示す。エキソソームによるＴＬＲ４活性
化はポリミキシンＢによって消失しなかったため、このことによって、ＭＳＣエキソソー
ム調製物におけるＬＰＳ汚染は除外された。したがって、ＭＳＣエキソソームは、ＴＬＲ
４を活性化し得るが、ＴＬＲ２は活性化し得ない。

＜ＭＳＣエキソソームはＴＬＲリガンドを有する−方法＞
ＭＳＣエキソソーム上のＴＬＲリガンドの存在を、ヒトＴＬＲのほとんどを発現するこ
とが知られているヒト急性単球性白血病細胞株であるＴＨＰ−１に由来する２つの細胞株
を用いて決定した。第１の株は、ＮＦ−ｋＢプロモーターの転写制御下にある安定的にト
ランスフェクトされた分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ）レポーター遺伝子を
有するＴＨＰ１−ＸＢｌｕｅである。第２の株は、ＭｙＤ８８活性が欠損しているＴＨＰ
１−ＸＢｌｕｅ−ｄｅｆＭＹＤである。ウェル当たり１０^５個の細胞を９６ウェルプレー
ト内に播種し、ＬＰＳを結合および不活化する抗生物質であるポリミキシンＢを有するか
または有さない１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ ０２６：Ｂ６、Ｓｉｇｍａ）ま
たは０．１μｇ／ｍｌのＭＳＣ由来のエキソソーム（ＭＳＣ−Ｅｘｏ）と共に２４時間イ
ンキュベートした。ＳＥＡＰレベルを、アルカリホスファターゼの蛍光基質であるＱｕａ
ｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いてアッセイした。

結果を図７に示す。

＜ＭＳＣエキソソームはＴＬＲ２を活性化しない−方法＞
ＭＳＣエキソソームのＴＬＲ２活性化能力を、ヒトＴＬＲ２、ＭＤ２、およびＣＤ１４
で安定的にコトランスフェクトされている市販のＨＥＫ２９３細胞株、ならびにＮＦ−κ
Ｂプロモーターの制御下にある最適化された分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ
）レポーター遺伝子を用いて評価した。この細胞株、すなわちＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ｈＴＬ
Ｒ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をウェル当たり１０^４個細胞で９６ウェルプレートに播種
し、１０μｇ／ｍｌのリポタイコ酸（ＬＴＡ、Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅ
ｕｓ、Ｓｉｇｍａ）または０．１、０．５、および１．０μｇ／ｍｌのＭＳＣ由来エキソ
ソーム（ＭＳＣ−Ｅｘｏ）と共に２４時間インキュベートした。ＳＥＡＰレベルを、アル
カリホスファターゼの蛍光基質であるＱｕａｎｔｉ−Ｂｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を
用いてアッセイした。

結果を図８に示す。

＜ＭＳＣエキソソームはＴＬＲ４を活性化する−方法＞
ＭＳＣエキソソームのＴＬＲ４活性化能力を、ヒトＴＬＲ２、ＭＤ２、およびＣＤ１４
で安定的にコトランスフェクトされている市販のＨＥＫ２９３細胞株、ならびにＮＦ−κ
Ｂプロモーターの制御下にある最適化された分泌型胚アルカリホスファターゼ（ＳＥＡＰ
）レポーター遺伝子を用いて評価した。この細胞株、すなわちＨＥＫ−Ｂｌｕｅ−ｈＴＬ
Ｒ４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）をウェル当たり１０^４個細胞で９６ウェルプレートに播種
し、ＬＰＳを結合および不活性化する抗生物質であるポリミキシンＢを有するかまたは有
さない１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳ（Ｅ．ｃｏｌｉ ０２６：Ｂ６、Ｓｉｇｍａ）または０．
１μｇ／ｍｌのＭＳＣ由来エキソソーム（ＭＳＣ−Ｅｘｏ）と共に２４時間インキュベー
トした。ＳＥＡＰレベルを、アルカリホスファターゼの蛍光基質であるＱｕａｎｔｉ−Ｂ
ｌｕｅ（ＩｎｖｉｖｏＧｅｎ）を用いてアッセイした。

結果を図９に示す。

＜ＭＳＣエキソソームはＴＨＰ−１細胞による炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイト
カインの生産を誘発する＞
＜方法＞
ＴＨＰ−１細胞を１×１０^６個細胞／ｍｌの濃度で２４ウェル培養プレートに播種し、
１０ｎｇ／ｍｌのＬＰＳまたは０．１μｇ／ｍｌのＭＳＣ−Ｅｘｏで０．５、１、３、６
、１２、２４、４８、７２、９６、および１２０時間刺激した。細胞を採取し、リアルタ
イム定量的ＲＴ−ＰＣＲによってサイトカイン生産について分析した。全ＲＮＡを、ＲＮ
ｅａｓｙ Ｍｉｎｉキット（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出し、Ｈｉｇｈ Ｃａｐａｃｉｔ
ｙ ｃＤＮＡ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＡＢＩ Ｐ／Ｎ
．４３６８８１３）を用いて逆転写した。ＰＣＲを、１０μｌの２×Ｆａｓｔ ＳＹＢＲ
（登録商標）Ｇｒｅｅｎ Ｍａｓｔｅｒ Ｍｉｘ（ＡＢＩ、Ｐ／Ｎ ４３８５６１２）反
応緩衝液、１μｌのｃＤＮＡ、および１μｌのオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で
、２０μｌの全容積で、ＳｔｅｐＯｎｅＰｌｕｓ（商標）Ｒｅａｌ−Ｔｉｍｅ ＰＣＲ
Ｓｙｓｔｅｍｓ（ＡＢＩ Ｐ／Ｎ．４３７６５９２）で行い、最初の変性ステップは９５
℃で１０分間であり、その後、９５℃で３秒での変性、６０℃で３０秒のアニーリングお
よび伸長を４０サイクル行った。用いたプライマーは、ＩＬ−１β（ＦＷ：５’−ＣＣＴ
ＧＴＣＣＴＧＣＧＴＧＴＴＧＡＡＡＧＡ−３’；ＲＶ：５’−ＧＧＧＡＡＣＴＧＧＧＣＡ
ＧＡＣＴＣＡＡＡ−３’）、ＴＮＦ−α（ＦＷ：５’−ＣＣＣＣＡＧＧＧＡＣＣＴＣＴＣ
ＴＣＴＡＡＴＣ−３’；ＲＶ：５’−ＧＧＴＴＴＧＣＴＡＣＡＡＣＡＴＧＧＧＣＴＡＣＡ
−３’）、ＩＬ−６（ＦＷ：５’−ＴＣＧＡＧＣＣＣＡＣＣＧＧＧＡＡＣＧＡＡ−３’；
ＲＶ：５’−ＧＣＡＡＣＴＧＧＡＣＣＧＡＡＧＧＣＧＣＴ−３’）、ＩＬ−１２ｐ４０（
ＦＷ：５’−ＣＡＴＧＧＴＧＧＡＴＧＣＣＧＴＴＣＡ−３’；ＲＶ：５’−ＡＣＣＴＣＣ
ＡＣＣＴＧＣＣＧＡＧＡＡＴ−３’）、ＩＬ−１０（ＦＷ：５’−ＧＴＧＡＴＧＣＣＣＣ
ＡＡＧＣＴＧＡＧＡ−３’；ＲＶ：５’−ＣＡＣＧＧＣＣＴＴＧＣＴＣＴＴＧＴＴＴＴ−
３’）、ＴＧＦ−β１（ＦＷ：５’−ＣＡＧＣＡＡＣＡＡＴＴＣＣＴＧＧＣＧＡＴＡ−３
’；ＲＶ：５’−ＡＡＧＧＣＧＡＡＡＧＣＣＣＴＣＡＡＴＴＴ−３’）、ＧＡＰＤＨ（Ｆ
Ｗ：５’−ＧＴＣＴＴＣＡＣＣＡＣＣＡＴＧＧＡＧＡＡＧＧＣＴ−３’；ＲＶ：５’−Ｃ
ＡＴＧＣＣＡＧＴＧＡＧＣＴＴＣＣＣＧＴＴＣＡ−３’）であった。各試料で、ｍＲＮＡ
の含有量をヒトＧＡＰＤＨ ｍＲＮＡの含有量に対して正規化し、未処理対照と比較して
ｎ倍の発現であると記載する。各試料を３回ずつ試験した。データは、製造者の指示に従
って、比較ΔＣＴ法およびＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ ＳｔｅｐＯｎｅソフ
トウェアバージョン２．０．１を用いて、分析した。

＜結果＞
＜ＴＨＰ−１細胞によるサイトカイン生産に対するＭＳＣエキソソームの影響＞

ＴＬＲは、自然免疫の活性化を調節する受容体の主要なクラスであるため、そしてＭＳ
Ｃエキソソームは、ヒト単球細胞においてＴＬＲを活性化し得るため、本発明者らは、こ
の活性化によってサイトカインが生産されるかを決定した（図１０）。

ＭＳＣエキソソームは、それぞれ３および７２〜９６時間でピークとなる、炎症性サイ
トカインおよび抗炎症性サイトカインの二相性の生産を誘発した。

＜ＭＳＣエキソソームによる適応免疫の調節＞
ＭＳＣエキソソームによるＴＬＲの活性化ならびに炎症性サイトカインおよび抗炎症性
サイトカインの誘発は、ＭＳＣエキソソームが適応免疫を調節し得ることを示唆する。具
体的には、本発明者らは、ＭＳＣエキソソームがＴｒｅｇまたはＴｈ１７の分化に対する
何らかの影響を有するかを試験した。Ｔｒｅｇは、調節性Ｔ細胞またはサプレッサーＴ細
胞として知られているＴ細胞亜集団を言う^１２。これらは免疫系を下方調節し、自己抗原
に対する耐性を維持する。これらの細胞は、アレルギーおよびぜんそくなどの免疫疾患、
糖尿病、移植拒絶反応などに対する免疫療法において用いられている１３ １４。Ｔｈ１
７細胞はＣＤ４＋記憶Ｔ細胞であり、ＩＬ−１７サイトカインの特徴的な分泌によって規
定される。これらは、自己免疫疾患の発症にとって重要であると考えられる^１５。

Ｔｒｅｇ細胞またはＴｈ１７細胞へのＣＤ４＋マウスＴ細胞の分化に対するＭＳＣエキ
ソソームの影響を試験するために、ＣＤ４＋マウス細胞をＭＳＣエキソソームと共にイン
キュベートした。陽性対照として、ＣＤ４＋マウス細胞を、ＴＧＦ−β１によってＴｒｅ
ｇ細胞に分化するように、そしてＩＬ−６およびＴＧＦ−β１によってＴｈ１７細胞に分
化するように誘発し、いずれも、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｆｏｘｐ３Ｌ＋ＴｒｅｇまたはＴｈ
１７細胞へのＣＤ４＋マウスＴ細胞の分化に対する影響を与えなかった（図１１）。

Ｔｒｅｇ細胞（ａ）またはＴｈ１７細胞（ｂ）へのＣＤ４＋マウスＴ細胞の分化の誘発
マウス脾細胞を、以前に記載されているように、６から８週齢のＢＡＬＢ／Ｃマウスか
ら調製した^１６。簡潔に述べると、マウス脾臓を取り出し、細かく刻み、漉した。赤血球
を次に溶解させた。ＣＤ４＋細胞を、ＦＩＴＣにコンジュゲートしたラット抗マウスＣＤ
４抗体をＥａｓｙＳｅｐ ＦＩＴＣ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＳｔｅｍＣｅｌｌ
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）と共に用いて採取し、純度を、フローサイトメトリーによっ
て＞９５％であることを検証した。精製したＣＤ４^＋Ｔ細胞を、抗ＣＤ３ｍＡｂおよび５
μｇ／ｍｌの抗ＣＤ２８ｍＡｂを用いて活性化させた。

ａ）Ｔｒｅｇの分化については、培養培地に１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＧＦ−β１または
０．１μｇ／ｍｌのＭＳＣ−Ｅｘｏを補った。６日後、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、
およびマウスＦｏｘｐ３＋細胞として規定されるＴｒｅｇ細胞の数を、標準的な抗体染色
技術を用いてＦＡＣＳによって決定した。

ｂ）Ｔｈ１７の分化については、培養培地に２０ｎｇ／ｍｌのｒＩＬ−６および１ｎｇ
／ｍｌのｒｈＴＧＦ−β１または０．１μｇ／ｍｌのＭＳＣ−Ｅｘｏを補った。６日後、
ＣＤ４＋細胞、ＩＬ１７ａ＋細胞として規定されるＴｈ１７細胞の数を、標準的な抗体染
色技術を用いてＦＡＣＳによって決定した。

ａおよびｂにおけるＴｒｅｇ細胞およびＴｈ１７細胞を、未処理細胞に対して正規化し
た。

＜ＭＳＣエキソソームによる適応免疫の調節＞
ＭＳＣエキソソームはＴＨＰ−１細胞に対する大規模な活性化効果を与え、自然免疫は
適応免疫応答の調節において重要な役割を有するため、本発明者らは、エキソソームが自
然免疫に対するその影響を介して適応免疫を調節し得ると仮定した。この仮説を試験する
ために、本発明者らは、ある程度の修正を加えて、図１１において記載されている実験を
反復した。Ｔｒｅｇ細胞またはＴＨ１７細胞へのＣＤ４＋Ｔ細胞の分化の間、Ｔ細胞を、
６日間エキソソームに曝露されたＴＨＰ−１細胞と共にインキュベートした（図１２）。
陽性対照として、Ｔ細胞を、それぞれＴＧＦ−β１またはｒＩＬ−６＋ＴＧＦ−β１と共
にインキュベートした。ＭＳＣエキソソームに４８時間曝露されたＴＨＰ−１細胞は、Ｔ
ｒｅｇ細胞へのＴ細胞の分化を誘発したが、ＴＨ１７細胞への分化は誘発せず、このこと
は、ＭＳＣエキソソームが、免疫抑制性であるが炎症性ではないＴ細胞応答を誘発し得る
ことを示唆している。

＜自然免疫を介する適応免疫の調節＞
ＣＤ４^＋マウスＴ細胞を、図１１において記載されているように精製および活性化した
。

ａ）Ｔｒｅｇの分化については、培養培地に１０ｎｇ／ｍｌのｒｈＴＧＦ−β１、ＴＨ
Ｐ−１細胞、または０．１μｇ／ｍｌのＭＳＣエキソソームに４８時間曝露されたＴＨＰ
−１細胞を補った。ＴＨＰ−１細胞は、１０００のＣＤ４^＋マウスＴ細胞に対して１のＴ
ＨＰ−１の割合で添加した。６日後、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、およびマウスＦｏ
ｘｐ３＋細胞として規定されるＴｒｅｇ細胞の数を、標準的な抗体染色技術を用いてＦＡ
ＣＳによって決定した。

ｂ）Ｔｈ１７の分化については、培養培地に２０ｎｇ／ｍｌのｒＩＬ−６および１ｎｇ
／ｍｌのｒｈＴＧＦ−β１、または０．１μｇ／ｍｌのＭＳＣエキソソームに４８時間曝
露されたＴＨＰ−１細胞を補った。ＴＨＰ−１細胞は、１０００のＣＤ４^＋マウスＴ細胞
に対して１のＴＨＰ−１の割合で添加した。６日後、ＣＤ４＋細胞、ＩＬ１７ａ＋細胞と
して規定されるＴｈ１７細胞の数を、標準的な抗体染色技術を用いてＦＡＣＳによって決
定した。

ａおよびｂにおけるＴｒｅｇ細胞およびＴｈ１７細胞を、未処理細胞に対して正規化し
た。

＜ＭＳＣエキソソームのコンカナバリンＡで活性化されたリンパ球の増殖アッセイ＞
ＭＳＣエキソソームを、コンカナバリンＡで活性化されたリンパ球の増殖を阻害する能
力によって評価することができる。図１３を参照されたい。

マウス脾細胞を単離し、カルボキシフルオレセインスクシンイミジルエステル（ＣＦＳ
Ｅ）で標識した。ＣＦＳＥ標識した脾細胞を、５μｇ／ｍｌのコンカナバリンＡ（Ｃｏｎ
Ａ）の存在下または不存在下で、異なる濃度のＭＳＣエキソソーム（０．１、０．５、１
、および４μｇ／ｍｌ）と共に３日間インキュベートした。

ＭＳＣエキソソームを、以前に記載されているように調製した（以下のＬａｉら）。各
治療群の蛍光細胞数を、ＦＡＣＳによって定量した。データを未処理対照に対して正規化
し、３組の試料の平均（±ＳＤ）として表した。

ＭＳＣ−Ｅｘｏは脾細胞の増殖に影響せず（ｐ＞０．０５）、４．０μｇ／ｍｌのＭＳ
Ｃ−Ｅｘｏは、ＣｏｎＡで刺激された脾細胞の増殖を有意に阻害した（^＊ｐ＜０．０１）
。

Ｒ．Ｃ．Ｌａｉ、Ｆ．Ａｒｓｌａｎ、Ｍ．Ｍ．Ｌｅｅ、Ｎ．Ｓ．Ｓｚｅ、Ａ．Ｃｈｏｏ
、Ｔ．Ｓ．Ｃｈｅｎ、Ｍ．Ｓａｌｔｏ−Ｔｅｌｌｅｚ、Ｌ．Ｔｉｍｍｅｒｓ、Ｃ．Ｎ．Ｌ
ｅｅ、Ｒ．Ｍ．Ｅｌ Ｏａｋｌｅｙ、Ｇ．Ｐａｓｔｅｒｋａｍｐ、Ｄ．Ｐ．ｄｅ Ｋｌｅ
ｉｊｎ、Ｓ．Ｋ．Ｌｉｍ、Ｅｘｏｓｏｍｅ ｓｅｃｒｅｔｅｄ ｂｙ ＭＳＣ ｒｅｄｕ
ｃｅｓ ｍｙｏｃａｒｄｉａｌ ｉｓｃｈｅｍｉａ／ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ ｉｎｊｕ
ｒｙ、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ、４（２０１０）２１４〜２２２を参照されたい。

＜結論（実施例１９から２８について）＞
ＭＳＣエキソソームは、炎症性および抗炎症性の自然免疫応答を活性化し得るが、抑制
適応免疫応答を、自然免疫系を介して間接的にのみ誘発し得る。これらは、炎症性適応免
疫応答を直接的にも間接的にも活性化しない。

したがって、ＭＳＣエキソソームは、自己免疫疾患、例えばＧＶＨＤ、クローン病、Ｓ
ＬＥ、１型糖尿病、多発性硬化症、ＡＬＳにおいて、組織の修復を増強させるため、およ
び疾患の進行を阻害するために用いることができる。

［参考文献（実施例１９から２９について）］

［参考文献］

出願手続き中の出願および特許のそれぞれ（「出願引用文献」）を含む、本明細書にお
いて言及される各出願および特許、ならびに上記の各出願および特許において引用または
参照される各文献、ならびに各出願および特許といずれかの出願引用文献とにおいて引用
または言及されるあらゆる製品についてのあらゆる製造者の指示またはカタログは、参照
により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書において引用される全ての文献、本明
細書において引用される文献において引用または参照される全ての文献、および本明細書
において引用または言及されるあらゆる製品についてのあらゆる製造者の指示またはカタ
ログは、参照により本明細書に組み込まれる。

本発明の記載された方法および系の様々な修正および変更は、本発明の範囲および趣旨
から逸脱することなく、当業者に明らかとなろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に
関して記載されているが、特許請求の範囲に記載された発明が、このような特定の実施形
態に不当に限定されるべきではないことが理解されよう。実際、分子生物学または関連す
る分野の当業者に自明の、本発明を実施するための記載された態様の様々な修正は、本発
明の範囲内にあることが意図される。

Claims (16)

1. （ａ）免疫調節活性、（ｂ）補体阻害活性、（ｃ）プロテアソーム活性、（ｄ）糖分解
   酵素活性、（ｅ）抗酸化活性、（ｆ）細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性、（ｇ）ＮＴ
   ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性、（ｈ）イオンホメオスタ
   シス活性、および（ｉ）シャペロン活性からなる群から選択されるエキソソームの活性を
   検出するステップを含む、治療用エキソソームを検出する方法。
2. 前記活性が免疫調節活性を含み、前記免疫調節活性が、表Ｄ１０に示されるタンパク質
   の活性の検出によって検出される、請求項１に記載の方法。
3. 前記活性が補体阻害活性を含み、前記補体阻害活性が、表Ｄ１に示されるタンパク質の
   活性の検出によって検出される、請求項１に記載の方法。
4. 前記活性がプロテアソーム活性を含み、前記プロテアソーム活性が、表Ｄ２に示される
   １つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項
   １に記載の方法。
5. 前記活性が糖分解酵素活性を含み、前記糖分解酵素活性が、表Ｄ３に示される１つまた
   は複数、好ましくは全てのタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項１に記載
   の方法。
6. 前記活性が抗酸化活性を含み、前記抗酸化活性が、表Ｄ４に示される１つまたは複数、
   好ましくは全てのタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項１に記載の方法。
7. 前記活性が細胞外マトリクス（ＥＣＭ）修飾活性を含み、前記細胞外マトリクス（ＥＣ
   Ｍ）修飾活性が、表Ｄ５に示される１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性
   の検出によって検出される、請求項１に記載の方法。
8. 前記活性がＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性を含み、
   前記ＮＴ５Ｅ（ＣＤ７３）エクト−５’−エクトヌクレオチダーゼ活性が、表Ｄ６に示さ
   れる１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性の検出によって検出される、請
   求項１に記載の方法。
9. 前記活性がイオンホメオスタシス活性を含み、前記イオンホメオスタシス活性が、表Ｄ
   ７に示される１つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性の検出によって検出さ
   れる、請求項１に記載の方法。
10. 前記活性がシャペロン活性を含み、前記シャペロン活性が、表Ｄ８に示される１つまた
    は複数、好ましくは全てのタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項１に記載
    の方法。
11. 活性が検出される場合、前記エキソソームは、（ｉ）補体介在性の細胞溶解を阻害し得
    るか、または（ｉｉ）例えば心筋虚血および再かん流傷害のマウスモデルもしくはブタモ
    デルにおいて測定されたとき、梗塞サイズを低減させ得るか、もしくは、例えば過酸化水
    素（Ｈ_２Ｏ_２）誘発性の細胞死のインビトロアッセイにおいて測定されたとき、酸化スト
    レスを低減させ得るか、または（ｉ）および（ｉｉ）の両方であり得る可能性が高い、請
    求項１〜１０のいずれか１項に記載の方法。
12. 治療的活性が心保護活性を含む、請求項１１に記載の方法。
13. 治療的活性が、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、および変性疾患、例えば糖尿病、
    アルツハイマー病、パーキンソン病、がん、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚障害、皮膚病変、
    皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚がん、アトピー性皮膚炎、
    ベーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚のＴ細胞リンパ腫、潰瘍、線維症および機能喪
    失を含む慢性的な組織リモデリングをもたらす炎症および免疫異常調節を誘発する初期の
    傷害を特徴とする病的状態、腎臓虚血性傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎および鼻炎、また
    は整形外科的疾患からなる群から選択される１つまたは複数の疾患に対するものである、
    請求項１１に記載の方法。
14. （ａ）分子量、サイズ、形状、組成、または生物学的活性に基づいて他の成分からエキ
    ソソームを分離することを場合によって含む、間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）か
    らエキソソームを単離するステップと、（ｂ）好ましくは請求項２〜９のいずれか１項に
    記載の１つまたは複数のタンパク質の活性を検出することによって、前記単離されたエキ
    ソソームにおいて請求項１に記載の活性を検出するステップとを含む方法。
15. エキソソームを生産する方法であって、（ａ）間葉系幹細胞馴化培地（ＭＳＣ−ＣＭ）
    を得るステップと、（ｂ）例えば＞１０００ｋＤａの膜上での限外濾過によって、前記間
    葉系幹細胞馴化培地を濃縮するステップと、（ｃ）前記濃縮された間葉系幹細胞馴化培地
    を、ＴＳＫ ＧｕａｒｄカラムＳＷＸＬ、６×４０ｍｍ、またはＴＳＫゲルＧ４０００
    ＳＷＸＬ、７．８×３００ｍｍカラムを用いるような、サイズ排除クロマトグラフィーに
    かけるステップと、（ｄ）準弾性光散乱（ＱＥＬＳ）によって検出されるもののような動
    的光散乱を示す、例えば２２０ｎｍでのＵＶ吸光画分を選択するステップとを含み、ステ
    ップ（ｄ）が、例えば、１１〜１３分、例えば１２分の保持時間で溶出する画分を回収す
    るステップと、好ましくは請求項２〜９のいずれか１項に記載の１つまたは複数のタンパ
    ク質の活性を検出することによって、前記エキソソームにおける請求項１に記載の活性を
    検出するステップとを含む、方法。
16. 実質的に、添付の図面の図１〜１３を参照してこれまでに記載されている、および添付
    の図面の図１〜１３において示されている方法。
    

Images