JP6444963B2 - 治療用エキソソームを検出する方法 - Google Patents
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Description
医薬の分野に関する。
考えられていた1。しかし、エキソソームは次第に、特に細胞伝達において重要な生理学
的機能を有していると考えられてきている。
である2。これらは、分泌された細胞生産物の分類に属し、全ての分泌された膜小胞を広
く含む微粒子として知られている。エキソソーム以外に、微粒子には、微小胞(100〜
1000nm)、エクトソーム(50〜200nm)、膜粒子(50〜80nm)、エキ
ソソーム様小胞(20〜50nm)、およびアポトーシス小胞(50〜500nm)が含
まれる。これらの異なるクラスの微粒子を区別するための主要なパラメータは、それらの
サイズであり、最も明確に定義されている分類はエキソソームである。
ショ糖密度を有し、スフィンゴミエリン、セラミド、脂質ラフト、および曝露したホスフ
ァチジルセリンを含有する、コレステロールに富んだ脂質膜を有する。エキソソーム生合
成のプロセスは複雑であり、生合成経路およびエンドサイトーシス経路を介する複雑な細
胞内膜輸送およびカーゴ選別を伴う。この複雑な生合成の証拠として、エキソソームの顕
著な特徴に、小胞体のおよびAlixタンパク質、Tsg101タンパク質、Rabタン
パク質などのエンドソームのマーカーがある。エキソソームは、多小胞体(MVB)と原
形質膜との融合を介する放出の前は、多小胞体内に保存されている。
されている3−8。最近、本発明者らは、この機能を、組織修復を含むまでに拡張し、そ
の際、本発明者らは、心筋虚血再かん流(MI/R)傷害のマウスモデルにおいて、ヒト
ESC由来のMSCによって分泌されるエキソソームが梗塞サイズを約50%低減させる
ことを報告した9,10。これらのエキソソームは、HPLCでのサイズ排除によって直
径が約50〜100nmの均質なサイズの微粒子の集団として精製され、これらは、タン
パク質負荷およびRNA負荷の両方を有している9,11,12。
メカニズムは、依然として解明されていない。その理由の一部は、本発明者によるエキソ
ソームの生物学的能力の理解が全体として欠如していることに起因し得る。様々な細胞型
および生体液からのエキソソームの広範囲なプロテオミクスおよびRNAプロファイリン
グにも関わらず、エキソソームにおけるタンパク質およびRNAの生物学的能力は、依然
としてほとんど調査されていない。生物学的能力についてのこれまでのほとんどの研究は
、免疫細胞、特に樹状細胞からのエキソソームによって引き起こされる免疫応答に限定さ
れているが2、これらの生物学的応答の分子的または生化学的基礎は、依然として解明さ
れていない。
なプロテオミクスプロファイリングを行って、これらのエキソソーム内に存在するタンパ
ク質をまず同定し、次いで、これらのタンパク質を用いて、エキソソームにおける生物学
的活性または生物学的能力のタイプを予測した。これを次に、生化学的または細胞的アッ
セイによって立証した。
プロセスに機能的にクラスター化することができ、このことは、エキソソームが、広範な
生化学的または細胞的影響を及ぼす能力を有することを示す。この能力を評価するために
、本発明者らはタンパク質を選択し、当該タンパク質は、その生化学的および/または細
胞的活性を評価するためのアッセイが利用可能なものであり、このアッセイは、組み合わ
せて、エキソソームにおける広範な生化学的および細胞的能力を実証し、MSCエキソソ
ームの心保護特性のための候補分子メカニズムを提供するものである。
Hを生成するための糖分解酵素、糖分解を増大させるPFKB3、アデノシン受容体を介
してシグナル伝達カスケードを活性化し得るアデノシンにAMPを加水分解するCD73
、膜侵襲複合体(MAC)の形成を阻害するCD59、ならびに20Sプロテアソームが
含まれる。
供する。本方法は、エキソソームの活性を検出するステップを含み得る。本方法は、免疫
調節活性を含み得る。これは、補体阻害活性を含み得る。これは、プロテアソーム活性を
含み得る。これは、糖分解酵素活性を含み得る。これは、抗酸化活性を含み得る。これは
、細胞外マトリクス(ECM)修飾活性を含み得る。これは、NT5E(CD73)エク
ト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性を含み得る。これは、イオンホメオスタシス活性
を含み得る。これは、シャペロン活性を含み得る。これは、上記のいずれか1つまたは複
数を含み得る。
活性を検出することによって検出することができる。
性を検出することによって検出することができる。
つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出すること
ができる。
複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる
。
ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。
)修飾活性は、表D5に示される1つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を
検出することによって検出することができる。
。NT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性は、表D6に示され
る1つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出する
ことができる。
に示される1つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって
検出することができる。
複数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる
。
数、好ましくは全てのタンパク質の活性を検出することによって検出することができる。
あり得る。これはまた、あるいは、またはそれに加えて、例えば心筋虚血および再かん流
傷害のマウスモデルもしくはブタモデルにおいて測定されたとき、梗塞サイズを低減させ
得るか、または、例えば過酸化水素(H2O2)誘発性の細胞死のインビトロアッセイに
おいて測定されたとき、酸化ストレスを低減させ得る。これは、上記の活性の両方を有し
得る。
む可能性があり得る。
アルツハイマー病、パーキンソン病、がん、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚障害、皮膚病変、
皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚癌、アトピー性皮膚炎、ベ
ーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚のT細胞リンパ腫、潰瘍、線維症および機能喪失
を含む慢性的な組織リモデリングをもたらす炎症および免疫異常調節を誘発する初期の傷
害を特徴とする病的状態、腎臓虚血性傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎および鼻炎、または
整形外科的疾患からなる群から選択される1つまたは複数の疾患に対するものであり得る
。
性に基づいて他の成分からエキソソームを分離することを場合によって含む、間葉系幹細
胞馴化培地(MSC−CM)からエキソソームを単離するステップ、および(b)上記に
記載されるような1つまたは複数のタンパク質の活性を好ましくは検出することによって
、単離されたエキソソームにおいて上記に記載されるような活性を検出するステップを含
む方法が提供される。
本方法は、(a)間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)を得るステップと、(b)例え
ば>1000kDaの膜上での限外濾過によって、間葉系幹細胞馴化培地を濃縮するステ
ップと、(c)濃縮された間葉系幹細胞馴化培地を、TSK GuardカラムSWXL
、6×40mm、またはTSKゲルG4000 SWXL、7.8×300mmカラムを
用いるような、サイズ排除クロマトグラフィーにかけるステップと、(d)準弾性光散乱
(QELS)によって検出されるもののような動的光散乱を示す、例えば220nmでの
UV吸光画分を選択するステップとを含み、ステップ(d)は、例えば、11〜13分、
例えば12分の保持時間で溶出する画分を回収すること、および、上記に記載されるよう
な1つまたは複数のタンパク質の活性を好ましくは検出することによって、エキソソーム
における上記に記載されるような活性を検出することを含む。
が提供され、本方法は、上記に記載されるような酵素活性を検出することを含み、ここで
、酵素活性が検出される場合、エキソソームは治療的活性を含む。
、および免疫学の従来の技術を採用し、これらは当業者の能力の範囲内である。このよう
な技術は、文献において説明されている。例えば、J.Sambrook、E.F.Fr
itsch、およびT.Maniatis、1989、Molecular Cloni
ng:A Laboratory Manual、第2版、第1〜3巻、Cold Sp
ring Harbor Laboratory Press;Ausubel,F.M
.ら(1995および定期的な増補、Current Protocols in Mo
lecular Biology、チャプター9、13、および16、John Wil
ey & Sons、New York、N.Y.);B.Roe、J.Crabtre
e、およびA.Kahn、1996、DNA Isolation and Seque
ncing:Essential Techniques、John Wiley &
Sons;J.M.PolakおよびJames O’D.McGee、1990、In
Situ Hybridization:Principles and Pract
ice、Oxford University Press、M.J.Gait(編)、
1984、Oligonucleotide Synthesis:A Practic
al Approach、Irl Press;D.M.J.LilleyおよびJ.E
.Dahlberg、1992、Methods of Enzymology:DNA
Structure Part A:Synthesis and Physical
Analysis of DNA Methods in Enzymology、A
cademic Press、Using Antibodies:A Laborat
ory Manual:Portable Protocol NO.I by Edw
ard Harlow、David Lane、Ed Harlow(1999、Col
d Spring Harbor Laboratory Press、ISBN 0−
87969−544−7);Antibodies:A Laboratory Man
ual by Ed Harlow(編者)、David Lane(編者)(1988
、Cold Spring Harbor Laboratory Press、ISB
N 0−87969−314−2)、1855.Handbook of Drug S
creening、Ramakrishna Seethala、Prabhavath
i B.Fernandes編(2001、New York、NY、Marcel D
ekker、ISBN 0−8247−0562−9);ならびにLab Ref:A
Handbook of Recipes,Reagents,and Other R
eference Tools for Use at the Bench、Jane
RoskamsおよびLinda Rodgers編、2002、Cold Spri
ng Harbor Laboratory、ISBN 0−87969−630−3を
参照されたい。これらの一般的なテキストのそれぞれは、参照することによって本明細書
に組み込まれる。
は、これらのエキソソームは、健康な細胞から採取および精製することができ、罹患細胞
またはストレスを受けた細胞における細胞資源を補充および強化するために用いられ、こ
れらの細胞に回復および修復を開始させ得る。例えば、本発明者らは、ヒト胚性幹細胞由
来の間葉系幹細胞からのエキソソームが急性心筋虚血再かん流傷害後の細胞死から心筋細
胞を救い得ることを実証している。ここで、本発明者らは、これらのエキソソームの生化
学的特性を説明する。これらの特性は、罹患細胞またはストレスを受けた細胞の治療にお
ける治療的能力についてエキソソーム調製物を同定、選択、または評価するために用いる
ことができる。
ことが多い。これらは、ミトコンドリアの膜浸透性が増大しており、その結果、ATPお
よびNADHの生産が低減し、ROSレベルが増大し、そしてNa、Ca、K、およびC
lを含むイオンホメオスタシスを喪失している。また、ERストレスおよび封入体の形成
および過剰な自然免疫応答をもたらす、変性タンパク質の蓄積も存在する。回復および修
復のプロセスを開始するためには、細胞はこれらの細胞機能障害をまず修正しなくてはな
らない。エキソソームは、タンパク質およびRNAを含有する分泌型のリン脂質小胞であ
るため、これらの細胞機能障害を修正するために必要な細胞活性を迅速に開始し得る酵素
およびRNAを送達する能力を有し得る。
学的特性には、
a.補体活性の阻害(以下の表D1)
b.変性タンパク質を分解するためのプロテアソーム活性(以下の表D2)
c.ATPおよびNADHを生成するための糖分解酵素(以下の表D3)
d.NADPHを生成するためのペントースリン酸経路酵素
e.抗酸化活性(以下の表D4)
f.MMP/TIMP活性(以下の表D5)
g.生存シグナル伝達経路を活性化させるためのCD73エクト−5’−エクトヌクレオ
チダーゼ活性(以下の表D6)
h.イオンホメオスタシス、例えばカルシウム、ナトリウム、プロトン、カリウム、およ
び塩化物のチャネルを回復させるためのATPase膜チャネルまたは輸送体(以下の表
D7)
i.タンパク質の構造的完全性を維持するためのシャペロン活性(以下の表D8)
が含まれる。
だけではなく、タンパク質が酵素的に活性ではなくてはならない。これらのタンパク質の
酵素活性は、したがって、エキソソーム調製物の治療的有効性についての代替マーカーで
あり得る。
多くの生化学的アッセイを提供する。
本発明者らは、間葉系幹細胞(MSC)から由来可能である粒子、例えばエキソソーム
の、生物学的特性、特に生化学的特性を記載する。
ロテアソーム活性、(c)糖分解酵素活性、(d)抗酸化活性、(e)細胞外マトリクス
(ECM)修飾活性、(f)NT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダー
ゼ活性、(g)イオンホメオスタシス活性、(h)シャペロン活性の1つまたは複数を含
むエキソソームは、治療的活性および(i)免疫調節活性を含み得る。
治療的な性質であり得、言い換えると、治療用エキソソームであり得る。用語「エキソソ
ーム」が本明細書において用いられる場合、文脈から可能である場合、「治療用エキソソ
ーム」も含むことが理解されよう。
芽、または分散によって、MSCから由来可能であり得る。例えば、エキソソームは、M
SCから生産、滲出、放出、流出され得る。MSCが細胞培養物内にある場合、エキソソ
ームは、細胞培養培地内に分泌され得る。
ムは、本明細書において記載されるエキソソームの特性のいずれか1つまたは複数を含み
得る。
キソソームは、40〜100nmの直径を含み得る。エキソソームは、エンドソーム膜の
内側への出芽によって形成され得る。エキソソームは、約1.13〜1.19g/mlの
密度を有し得、ショ糖勾配で浮遊し得る。エキソソームは、コレステロールおよびスフィ
ンゴミエリン、ならびにGM1、GM3、フロチリン、およびsrcタンパク質キナーゼ
Lynなどの脂質ラフトマーカーに富んでいる可能性がある。エキソソームは、間葉系幹
細胞または間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)内に存在する1つまたは複数のタンパ
ク質、例えばMSCまたはMSC−CMに特徴的または特異的なタンパク質を含み得る。
つまたは複数の遺伝子を含み、かつ治療的活性を含む、エキソソームを提供する。このよ
うな治療用エキソソームは、(a)補体阻害活性、(b)プロテアソーム活性、(c)糖
分解酵素活性、(d)抗酸化活性、(e)細胞外マトリクス(ECM)修飾活性、(f)
NT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性、(g)イオンホメオ
スタシス活性、(h)シャペロン活性、および(i)免疫調節活性からなる群から選択さ
れる1つまたは複数の活性を示すエキソソームを検出することによって同定することがで
きる。
、および、特にタンパク質またはポリペプチドを含む、エキソソームに含まれるいずれか
の分子の組み合わせは、例えば疾患の治療または予防の目的で、MSCもしくはMSCに
よって馴化された培地の活性を補うために、またはMSCもしくはMSCによって馴化さ
れた培地の代わりに、用いることができる。
ン、アクチン、およびアクチン結合タンパク質、細胞内の膜融合体および膜輸送、例えば
アネキシンおよびrabタンパク質、シグナル伝達タンパク質、例えばタンパク質キナー
ゼ、14−3−3、およびヘテロ三量体Gタンパク質、代謝酵素、例えばペルオキシダー
ゼ、ピルビン酸キナーゼ、脂質キナーゼ、およびエノラーゼ−1、ならびにテトラスパニ
ンファミリー、例えばCD9、CD63、CD81、およびCD82を含み得る。特に、
エキソソームは、1つまたは複数のテトラスパニンを含み得る。エキソソームは、mRN
Aおよび/またはマイクロRNAを含み得る。
の実体を意味するために用いられ得る。粒子は、間葉系幹細胞(MSC)または間葉系幹
細胞馴化培地(MSC−CM)から単離されるものであり得る。粒子は、少なくともMS
CまたはMSC−CMの活性に関与し得る。粒子は、MSCまたはMSC−CMの機能の
実質的にほとんどまたは全てに関与し得、それを実行し得る。例えば、粒子は、MSCま
たはMSC−CMの代替物(または生物学的代替物)であり得る。
エキソソームと同義語を含むと理解されよう。
いることができる。
性を有する。エキソソームは、生物学的活性などの生物学的特性を有し得る。エキソソー
ムは、MSCの生物学的活性のいずれかを有し得る。エキソソームは、例えば、MSCの
治療的活性または回復活性を有し得る。
培地またはMSC−CM)は、MSCの生物学的活性を含むことが知られており、MSC
自体を代替し得る。例えば、WO2009/105044を参照されたい。MSCの生物
学的特性または生物学的活性は、したがって、間葉系幹細胞馴化培地の生物学的特性また
は生物学的活性に対応し得る。したがって、エキソソームは、間葉系幹細胞馴化培地(M
SC−CM)の1つまたは複数の生物学的特性または生物学的活性を含み得る。
CM)から単離することができ、(a)補体阻害活性、(b)プロテアソーム活性、(c
)糖分解酵素活性、(d)抗酸化活性、(e)細胞外マトリクス(ECM)修飾活性、(
f)NT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性、(g)イオンホ
メオスタシス活性、(h)シャペロン活性、および(i)免疫調節活性の1つまたは複数
の存在について試験することができる。
上記の活性のそれぞれは、当技術分野において知られている多くの手段によって治療用
エキソソームにおいて検出することができる。例えば、関連する活性は、治療用エキソソ
ームにおける活性に関与するタンパク質またはポリペプチドの存在の検出によって検出す
ることができる。これは、例えば、同族抗体の使用、ならびに当技術分野において知られ
ているような免疫アッセイおよびウェスタンブロットなどによる抗体とタンパク質との間
の結合の検出によって行うことができる。
な活性であると規定される。
タンパク質またはポリペプチドを介する活性を検出するためのウェスタンブロットハイ
ブリダイゼーションを用いる例示的なプロトコルを以下に記載する。
トロセルロース膜上にエレクトロブロットした。膜をSNAP i.d.系(Milli
pore、Billerica、MA)の膜ホルダーに移し、ブロックし、そして、マウ
ス抗GAPDH(1:100希釈)、マウス抗PGK(1:60)、マウス抗PGD(1
:60)、ウサギ抗PFKFB3(1:60)、マウス抗ピルビン酸キナーゼ(PK、1
:200)、マウス抗20Sプロテアソームα1〜7(1:200)、マウス抗CD73
(1:60)、およびマウス抗CD59(1:200)を含む一次抗ヒト抗体と共にイン
キュベートした。ブロットを次に、ホースラディッシュペルオキシダーゼ結合二次抗体と
共にインキュベートした。用いた二次抗体は、ヤギ抗マウスIgG(1:1250)また
はロバ抗ウサギIgG(1:1250)であった。全ての抗体は、Abcam Inc.
、Cambridge、MAから入手したマウス抗PKを除いて、Santa Cruz
Biotechnology、Santa Cruz、CAから入手した。ブロットを
次に、HRPで増強した化学発光基質(Thermo Fisher Scientif
ic Inc.、Waltham、MA)と共にインキュベートし、次いで、X線フィル
ムに曝露した。
質量分析などの他の方法もまた、エキソソームにおけるタンパク質またはポリペプチド
の存在を検出するために用いることができる。LC−MSは、http://www.c
hem.agilent.com/Library/Support/Document
s/a05296.pdfにある文献「Basics of LC/MS Primer
」(Agilent Technologies)において詳細に記載されている。
的なプロトコルを以下に記載する。
パク質を還元し、アルキル化し、そしてトリプシン消化した。試料を次に、消化された混
合物を、馴化されたSep−Pak C−18 SPEカートリッジ(Waters、M
ilford、MA、USA)に通すことによって脱塩し、3%アセトニトリル(ACN
)(JT Baker、Phillipsburg、NJ)および0.1%ギ酸(FA)
の緩衝液で2回洗浄し、そして70%ACNおよび0.1%FAの緩衝液で溶出した。溶
出された試料を次に、真空遠心分離機において有機溶媒を除去することによって、その最
初の容積の約10%まで乾燥させた。試料の複雑性を低減させるために、オフラインペプ
チド分画を、Polysulfoethyl SCXカラム(200mm×4.6mm)
(PolyLC、USA)を通すHPLC系(株式会社島津製作所、日本)で行った。1
ml/分での、移動相A(5mMのKH4PO4+30%アセトニトリル)および移動相
B(5mMのKH4PO4+30%アセトニトリル+350mMのKCl)。8つの画分
を回収し、真空遠心分離機で乾燥させた。分画された試料を、ナノスプレー源を取り付け
たLTQ−FT Ultraリニアイオントラップ質量分析計(Thermo Elec
tron、Bremem、Germany)にオンラインで繋いだ株式会社島津製作所の
マイクロHPLC系の自動サンプラー内にロードした。注入されたペプチドを、Zorv
ax 300SB−C18濃縮カラム(5mm×03mm、Agilent Techn
ologies、Germany)内で捕捉および脱塩し、そしてナノレベルの穴を有す
るC18パックカラム(75μm×100Å、Michrom Bioresource
s、Auburn、CA)内に溶出した。200nl/分の20の有効流速の一定流速で
の1分勾配へのスプリッターでの90l/分を用いて、ペプチドを質量分析計内に溶出し
た。FTMSにおける各MSスキャンから得られる最も強いピークの8つについてMS/
MSスキャンを行うことによって、LTQをデータ依存モードで操作した。各実験で、8
つのSCX画分のMS/MS(dta)スペクトルを、自作のプログラムによるシングル
マスコットジェネリックファイル内に組み合わせた。タンパク質の同定は、社内のMas
cotサーバ(バージョン2.2.04、Matrix Science、UK)を介し
て、組み合わされたデータをIPIヒトタンパク質データベース(バージョン3.34、
69164の配列、29064825の残基)に対してサーチすることによって行った。
サーチパラメータは、トリプシンを用いる切断の失敗が最大で2カ所であること;固定さ
れた修飾がシステインのカルバミノメチル化であり、可変の修飾がメチオニンの酸化であ
ること、であった。質量許容差は、ペプチド前駆体および断片イオンについてそれぞれ1
0ppmおよび0.8Daに設定した。タンパク質の同定は、2つの異なるペプチドがホ
モロジースコアよりも大きなスコアを有することが明らかになった場合に、真陽性である
と認められた。
補体阻害活性は、表D1に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか1つまたは
複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、そ
れらを治療用エキソソームと同定することができる。
を行うことによって検出することができる。
簡潔に述べると、ヒツジ赤血球(SRBC)を購入し(Innovative Res
earch、Southfield、MI)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗
浄し、その後、PBS1ml当たり1×108個の細胞で再懸濁した。精製補体成分、C
5b6、C8、およびC9は、Calbiochem(San Diego、CA)から
購入し、C7はSigma−Aldrich(St Louis、MO)から購入した。
SRBCへのインタクトC5b−9の会合を、最終濃度が0.1μg/mlのエキソソー
ムの存在下または不存在下で、それぞれ1mlのC5b6(0.1μg/ml)およびC
7(0.4μg/ml)と共に15分間インキュベーションすること(37℃)によって
開始させた。SRBCを次に洗浄し、最終濃度が0.05μg/mlのブロックCD59
抗体を含むまたは含まない、それぞれ1mlのC8(0.4μg/ml)にC9(0.4
μg/ml)を加えたものと共にさらに30分間インキュベートした。その後、SRBC
を遠心分離し、上清内の溶解SRBCによって放出されたヘモグロビンの量を、415n
mでの吸光度によって測定した。全(100%)溶血を、1%(w/v)Triton
X−100で細胞を処理することによって得た。
プロテアソーム活性は、表D2に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか1つ
または複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによっ
て、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
うことによって検出することができる。
プロテアソーム活性を、特異的20Sプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンの存
在下または不存在下で、20Sプロテアソームによる標識された基質LLVY−AMCか
らの切断後のフルオロフォア7−アミノ−4メチルクマリン(AMC)を検出することに
基づく、20Sプロテアソーム活性アッセイキット(Millipore)を用いて測定
した。簡潔に述べると、4μgのエキソソームを、25μMのラクタシスチンの存在下ま
たは不存在下で、LLVY−AMCを含有する反応緩衝液と共にインキュベートした。試
料およびAMC標準を37℃でインキュベートし、Ex/Em=380/460nmでの
蛍光強度を2時間モニタリングした。
20Sコア粒子の1単位の酵素活性は、1分当たり1μモルの生成物の生産に必要な活
性であると規定される。
ことが分かる。
糖分解酵素活性は、表D3に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか1つまた
は複数の検出によってエキソソームにおいて検出することができ、それによって、それら
を治療用エキソソームと同定することができる。
エキソソームにおける糖分解酵素活性を検出するために検出することができ、したがって
、エキソソームが治療用エキソソームであるかどうかを決定するために用いることができ
る。同様に、細胞におけるATPおよびNADHの還元(または両方)の検出を用いるこ
とができる(上記を参照されたい)。
ATPおよびNADHなどの低分子を含み得ることが理解されよう。実体がタンパク質で
はないが実際は何らかの他のタイプの実体、例えば低分子である場合、このような表(ま
たは本明細書の他の箇所)における表見出し「タンパク質」の下にある実体の検出につい
てのこのような言及には、不都合な重要性を持たせるべきではない。したがって、本明細
書(例えば表D3)におけるいくつかの表見出しおよび他の言及は、「タンパク質」に言
及する便宜のためのものであり得るが、(実際にはタンパク質ではなくとも)ATP、N
ADHなどへの言及も含み得る。これらは、上記のように、治療用エキソソームの決定の
ために検出することができる。
TPおよびNADHの生産を増大させ得るため、細胞によるATPまたはNADHの生産
(または両方)の検出を、生産されたエキソソームにおける糖分解酵素活性を検出する手
段として用いることができ、それによって、それを治療用エキソソームと同定することが
できる。
5μgのエキソソーム(12μl内)を、細胞抽出キット(Biovision、Mo
untain view、CA)を用いて溶解した。溶解されたエキソソームの抽出物を
、市販されているPKアッセイキット(Biovision)の50μlの反応ミックス
と共にインキュベートした。このアッセイにおいて、PKによって生産されたピルビン酸
をピルビン酸キシダーゼによって酸化して、蛍光を生じさせた(Ex/Em=535/5
87nm)。蛍光強度の増大は、したがって、生産されたピルビン酸の量に比例する。
GAPDHおよびPGKの活性を、2つの市販されているキット、すなわちKDale
rt GAPDHアッセイキット(Ambion Inc.、Austin、TX)およ
びApoSENSOR ADP/ATP比率アッセイキット(Biovision)を用
いて、その下流生成物、すなわち糖分解反応におけるATPに基づいて測定した。簡潔に
述べると、エキソソームを、細胞抽出キット(Biovision)を用いて溶解した。
GAPDH活性を測定するために、10μgの溶解したエキソソームを、D−グリセルア
ルデヒド−3−ホスフェート、NAD+、およびPiを含有するKDalert反応緩衝
液に添加して、1,3−ビスホスホグリセレート+NADH+H+を形成させた。250
U/mlのPGKおよび60μMのADPを次に添加して、1,3−ビスホスホグリセレ
ートおよびADPを3−ホスホグリセレートおよびATPに変換した。GAPDH活性に
比例する生産されたATPの量を次に、ATPルシフェラーゼアッセイを用いて測定した
。PGK活性を測定するために、10μgの溶解したエキソソームを、上記のアッセイか
ら生産された1,3−ビスホスホグリセレートに添加した。ADPを添加して、ATPを
形成させた。PGK活性に比例するATPの量を次に、ATPルシフェラーゼアッセイを
用いて定量した。
H9C2心筋細胞を、ウェル当たり30000個細胞で(ポリリジン被覆された)96
ウェルプレート上に平板培養した。5時間後、細胞をタイロード緩衝液で2回洗浄し、そ
の後、20μmolのオリゴマイシン(Sigma−Aldrich)、6mmolのグ
ルコースを含有し、0.1μg/mlのエキソソームを含むまたは含まないタイロード緩
衝液内で15分、30分、および60分間インキュベートした。細胞のATP濃度を、A
TPlite 1ステップ発光ATP検出アッセイ系(PerkinElmer、Zav
entem、Belgium)を用いて測定した。
GAPDH(AF261085.1)の1単位の酵素活性は、1分当たり1μモルの生
成物の生産に必要な活性であると規定される。
μg当たり3.59μUのPGK(L00159.1)活性、およびタンパク質1μg当
たり5.5μUのPKm2(M23725.1)活性を含有することが分かる。
抗酸化活性は、表D4に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか1つまたは複
数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それ
らを治療用エキソソームと同定することができる。
細胞外マトリクス(ECM)修飾活性は、表D5に示すようなタンパク質またはその活
性のいずれか1つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することが
でき、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
NT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性は、表D6に示すよ
うなタンパク質またはその活性のいずれか1つまたは複数の検出によって治療用エキソソ
ームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定す
ることができる。
チダーゼ活性に曝露すると、AKTおよびERK1/2のリン酸化が誘発され、エキソソ
ーム内のまたはエキソソームの、リン酸化されたAKT(すなわち、リン酸化されたAK
T1、リン酸化されたAKT2、またはリン酸化されたAKT3)またはリン酸化された
ERK1もしくはリン酸化されたERK2(またはこれらのあらゆる組み合わせ)の検出
を、エキソソームにおけるNT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ
酵素活性を検出する手段として用いることができ、それによって、それを治療用エキソソ
ームと同定することができる。
エキソソームにおけるCD73(NT5E)酵素活性を、50μMのAMP(Sigm
a−Aldrich、St Louis、MO)を含有する100μlのTris緩衝液
(pH7.4)内で2.5μgのエキソソームをインキュベートすることによって決定し
た。AMPの加水分解から放出されたリン酸イオンの量を次に、製造者の指示通りに、C
olorlock Goldキット(Innova Biosciences、Camb
ridge、UK)によって決定した。
1単位のエクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ酵素活性は、1分当たり1μモルの生
成物の生産に必要な活性であると規定される。
レオチダーゼ活性を含有することが分かる。
イオンホメオスタシス活性は、表D7に示すようなタンパク質またはその活性のいずれ
か1つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それ
によって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
シャペロン活性は、表D8に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか1つまた
は複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、
それらを治療用エキソソームと同定することができる。
治療用エキソソームは免疫調節活性を示し得る。
免疫系は、非自己細胞または非自己組織を破壊すること、感染性物質または毒性物質を
中和すること、および細胞残屑、例えば死滅細胞または死滅しかけている細胞を除去する
ことによって、生物を疾患から保護するために主に存在する。脊椎動物において、免疫系
は、自然免疫系および適応免疫系からなる。自然免疫細胞には、樹状細胞、マクロファー
ジ、および好中球が含まれ、これらの細胞は、感染性/毒性物質、ストレスシグナル、死
滅/死滅しかけている細胞、または非自己細胞の不変の特徴を認識するように遺伝的にプ
ログラムされている。これは進化的に保存されており、防御の第一線を提供する。適応免
疫細胞は、Tリンパ球およびBリンパ球である。これらは、それぞれの外来の、毒性の、
または非自己の作用物質に、これらの物質に対して特異的な受容体をデノボで生成してそ
れらを中和または破壊のために標的化することによって適合する。他方、自然免疫細胞は
、Toll様受容体(TLR)、レチノイン酸誘導性遺伝子1様RNAヘリカーゼ、ヌク
レオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体、およびC型レクチン受容体を含むような、
生殖細胞系列にコードされたパターン認識受容体(PPR)を介して、病原体関連分子パ
ターンおよびストレスシグナルと一般に呼ばれている微生物病原体内の保存された分子署
名を認識する。感染性作用物質または毒性作用物質に対する特異的受容体を生成するため
の適応免疫細胞の活性化は、複雑であり、自然免疫細胞によって調節される。PPRの中
でも、TLRは、IgM抗体、IgG抗体、およびIgA抗体の生産、ならびにTH1細
胞、TH17CD4+細胞、およびCD8+T細胞の活性化などの適応免疫応答の調節に
関して最も特徴付けされたPPRである。
TLRがこれまでに同定されている。TLR3を除く全てのTLRは、直接的にまたはT
IRAPと組み合わせて、MyD88依存性経路を介してシグナル伝達し、最終的には、
NFκBの活性化および核移行をもたらすか、タンパク質1(AP1)を活性化するか、
またはこれらの両方をもたらして、炎症性サイトカインの生産をもたらす。TLR3およ
びTLR4は、MyD88依存性でTRIF依存性シグナル伝達経路を開始させ、NFκ
BまたはIRF3の活性化および核移行をもたらして、炎症性サイトカインおよび1型イ
ンターフェロンをそれぞれ生産する。異なるTLRは、異なるクラスの病原体関連分子パ
ターンを認識し、例えば、TLR4は細菌細胞表面リポ多糖を認識し、TLR1およびT
LR2はペプチドグリカンを認識し、TLR2およびTLR6はリポタンパク質を認識し
、TLR3はウイルス二本鎖RNAを認識し、TLR7およびTLR8はウイルス一本鎖
RNAを認識し、TLR9は細菌およびウイルスのCpGを認識し、TLR5はフラジェ
リンを認識する。
感染性作用物質およびそれらの生成物に対する宿主免疫の仲介におけるTLRの非常な
重要性にもかかわらず、無菌性炎症応答を引き起こすための内因性リガンドによるTLR
シグナル伝達の活性化は、TLRの重要な機能であるとますます考えられている。これま
で、異なるTLRについて多くの内因性リガンドが同定されている(以下の表D9)。T
LRは、虚血および再かん流傷害、組織の修復および再生、自己免疫疾患、ならびに腫瘍
形成および腫瘍進行に関与している。
MSCは、アロ抗原、マイトジェン、およびCD3ライゲーションによって誘発される
T細胞増殖の阻害などのインビトロでの免疫調節特性を示し、B細胞の増殖およびナチュ
ラルキラー細胞の活性を阻害する5。ヒトGVHD6およびクローン病7についてのMS
Cに基づいた介入の治療的有効性を試験する臨床試験が奨励されている。しかし、MSC
の免疫調節特性の根底にあるメカニズムは、依然としてほとんど理解されていない。次第
に、これらの特性はMSCからのパラクリン分泌によって仲介されていると考えられてい
る8。
C)によって馴化された培養培地が虚血/再かん流傷害のブタモデルおよびマウスモデル
において相対的な梗塞サイズを低減させること9、ならびに慢性虚血のブタモデルにおい
て心臓機能を向上させること10を実証し、活性成分は、50〜200nmの推定直径を
有する。この成分は、その後HPLCによって精製され、エキソソームとして同定された
11。プロテオミクス分析によって、これらのエキソソームがTLR2およびTLR4の
内因性リガンドを含有することが明らかになった(表1)。したがって、MSCエキソソ
ームは、TLR2およびTLR4を活性化させる能力を有し、MSCの免疫調節活性に寄
与する。
は複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、
それらを治療用エキソソームと同定することができる。
間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)などの馴化細胞培養培地は、細胞培養培地にお
いて間葉系幹細胞(MSC)、その子孫、またはそれに由来する細胞株を培養すること、
および細胞培養培地を単離することによって得ることができる。間葉系幹細胞は、胚性幹
(ES)細胞コロニーを分散させることによって細胞を得ることを含むプロセスによって
生産することができる。細胞またはその子孫は、FGF2を含む無血清培地において、共
培養物の不存在下で増殖し得る。
間葉系幹細胞(MSC)からエキソソームを単離することを含み得る。このような方法は
、間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)からエキソソームを単離することを含み得る。
エキソソームは、例えば、エキソソームのあらゆる特性に基づいて非関連成分から分離す
ることによって、単離することができる。例えば、エキソソームは、分子量、サイズ、形
状、組成、または生物学的活性に基づいて単離することができる。例えば、本明細書の他
の箇所の分子量アッセイにおいて記載されているような、適切な分子量カットオフまたは
サイズカットオフを有する膜での濾過を用いることができる。エキソソームの1つまたは
複数の生物学的活性を、間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)の分画の間のその活性を
追跡するために用いることができる。
エキソソームの免疫調節活性は、THP−1細胞および遺伝子修飾されたTHP細胞株
/HEKレポーター細胞株を用いて評価することができる。このような細胞株は、以下の
実施例において記載されている。
ッセイすることによって、未修飾THP−1を用いて評価することができる。これは、以
下の実施例23において詳細に記載されている。あるいは、サイトカイン生産は、実施例
において記載されているような代替レポーター細胞株を用いて評価することができる。例
えば、実施例19において記載されているように、NFkBプロモーターの転写制御下に
ある安定的にトランスフェクトされた分泌型胚アルカリホスファターゼ(SEAP)レポ
ーター遺伝子を有するTHP1−XBlue、またはMyD88活性が欠損しているTH
P1−XBlue−defMYDを用いることができる。
を阻害するそれらの能力によってアッセイすることができる。これは、実施例28におい
て詳細に記載されている。
は、CD4+T細胞をエキソソーム処理した単球、例えばTHP−1に曝露して、これら
がTregsまたはTh17の生産を増強させるかどうかを決定することが含まれる。こ
れは、実施例26において詳細に記載されている。
間葉系幹細胞の特性は、間葉系幹細胞によって馴化された培地(MSC−CM)の特性
を含み得る。このような間葉系幹細胞馴化培地を生産する方法は、当技術分野において知
られており、例えばWO2009/105044の実施例1において記載されている。
、酸化ストレスの低減、および梗塞サイズの低減が含まれる。
エキソソーム、特に治療用エキソソームは、心保護を含む間葉系幹細胞および/または
間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)の特性を有し得る。心保護は、虚血および/また
は再かん流の間の心臓機能の回復または維持を含み得る。
心保護は、例えば、WO2009/105044の実施例5、10、14、および20
において記載されている方法のいずれか1つまたは複数を用いてアッセイすることができ
る。
エキソソーム、特に治療用エキソソームは、酸化ストレスを低減させる能力(または細
胞保護)を含む間葉系幹細胞および/または間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)の特
性を有し得る。
酸化ストレスの低減は、例えば、過酸化水素(H2O2)誘発性の細胞死のインビトロ
アッセイを用いてアッセイすることができる。要約すると、過酸化水素(H2O2)介在
性の酸化ストレスはヒト白血病性CEM細胞において誘発され、細胞の生存能力はトリパ
ンブルー排除によってモニタリングされる。ヒト白血病性CEM細胞を、エキソソーム、
馴化培地、または間葉系幹細胞(生理食塩水を対照とする)と共にインキュベートし、5
0μMのH2O2で処理して、酸化ストレスを誘発させる。細胞の生存能力を、H2O2
処理の12、24、36、および48時間後にトリパンブルー排除を用いて評価する。
とができる。インビボでの酸化ストレスはまた、以下のようにアッセイすることができる
。ブタをエキソソーム、馴化培地、または間葉系幹細胞で処理する(生理食塩水を対照と
する)。ブタ心臓の組織切片を得る。処理されたおよび未処理のブタの組織切片における
核酸化ストレスを、酸化DNAについて8−OHdG免疫染色によって定量する。組織切
片を、DNA酸化および酸化ストレスの指標である強力な核染色についてアッセイする。
エキソソーム、特に治療用エキソソームは、梗塞サイズを低減させる能力を含む間葉系
幹細胞および/または間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)の特性を有し得る。
梗塞サイズは、例えば、WO2009/105044の実施例6および13において記
載されている方法のいずれか1つまたは複数を用いてアッセイすることができる。
エキソソームは、100kDaを超える分子量を有し得る。エキソソームは、500k
Daを超える分子量を有し得る。例えば、エキソソームは、1000kDaを超える分子
量を有し得る。
分子量カットオフを有する膜を介するサイズ分画および濾過によって決定することができ
る。エキソソームサイズは、次いで、SDS−PAGEでの成分タンパク質の追跡分離ま
たは生物学的アッセイによって決定することができる。
機器の設定は、株式会社島津製作所(京都、日本)のClass VPソフトウェアに
よって操作される、バイナリポンプ、自動注入器、恒温カラムオーブン、およびUV可視
検出器を備えた液体クロマトグラフィー系から構成された。用いたクロマトグラフィーカ
ラムは、東ソー株式会社(東京、日本)のTSK GuardカラムSWXL、6×40
mm、およびTSKゲルG4000 SWXL、7.8×300mmであった。Dawn
8(光散乱)、Optilab(屈折率)、およびQELS(動的光散乱)という検出
器を、UV可視検出器の後に順に接続した。最後の3つの検出器は、Wyatt Tec
hnology Corporation(California、USA)のものであ
り、ASTRAソフトウェアによって操作した。試料の成分をサイズ排除によって分離し
、すなわち、大きめの分子を小さめの分子よりも先に溶出させる。用いた溶離液緩衝液は
、pH7.2の、150mMのNaClを有する20mMのリン酸緩衝液であった。この
緩衝液を0.1μmの孔サイズを介して濾過し、使用する前に15分間脱気した。クロマ
トグラフィー系を、Dawn8におけるシグナルがおよそ0.3の検出器圧力単位で安定
化するまで、0.5ml/分の流速で平衡化した。UV可視検出器を220nmで設定し
、カラムを25℃にオーブン平衡化した。溶出モードはアイソクラチックであり、実行時
間は40分であった。注入した試料の容積は、50から100mlの範囲であった。エキ
ソソームピークと全ての他のピークとの領域%を、UV可視検出器から積分した。流体力
学的半径Rhを、QELS検出器およびDawn8検出器によって計算した。ピーク頂点
での最高計数率(Hz)をRhとして得た。220nmで視覚化された、分離した成分の
ピークを、さらなる特徴付け研究のための画分として回収した。
エキソソームは、100kDaを超える分子量を有し得る。例えば、エキソソームは、
濾過すると、100kDa未満の分子量を有するエキソソームのほとんどのタンパク質が
100kDaの分子量を超える残りの画分に分離されるようなものであり得る。同様に、
500kDaのカットオフを有する膜での濾過を行うと、500kDaの分子量未満を有
するエキソソームのほとんどのタンパク質は、500kDaの分子量を超える残りの画分
に分離され得る。このことは、エキソソームが500kDaを超える分子量を有し得るこ
とを示す。
エキソソームは、1000kDaを超える分子量を有し得る。例えば、エキソソームは
、1000kDaの分子量カットオフを有する膜での濾過を行うと、関連する生物学的活
性が実質的にまたは主に残りの画分に残るようなものであり得る。あるいは、またはそれ
に加えて、生物学的活性は、濾液画分内に存在しない可能性がある。生物学的活性は、本
明細書の他の箇所に記載されるエキソソームの生物学的活性のいずれかを含み得る。
例えば、生物学的活性は、心筋虚血および再かん流傷害のあらゆる適切なモデルにおい
てアッセイされるような、梗塞サイズの低減を含み得る。例えば、生物学的活性は、WO
2009/105044の実施例において記載されているように、マウスモデルまたはブ
タモデルにおいてアッセイすることができる。
誘発し、再かん流を、縫合糸の除去によって開始させる。マウスを、再かん流の5分前に
、エキソソーム(未分画MSC−CMなど)、濾液(<100または1000kDの画分
など)、残り部分(>1000kDの残り部分など)を含有する液体、または生理食塩水
で、尾静脈を介して静脈内で処理した。24時間後、心臓を切除した。切除の前に、LC
Aを再連結し、大動脈を介してエバンスブルーをかん流させることによって、虚血領域(
AAR)を決定する。
センテージとして表される。梗塞サイズは、エバンスブルーおよびTTCを用いて24時
間後に評価する。相対的な梗塞サイズが、生理食塩水と比較して、間葉系幹細胞馴化培地
(MSC−CM)および残りの(>1000kDなど)画分で処理した動物において有意
に低減している場合、このことは、エキソソームが膜の関連するカットオフよりも高い分
子量(例えば、1000kDa超)を有することを示す。
エキソソームは、2nmを超えるサイズを有し得る。エキソソームは、5nm、10n
m、20nm、30nm、40nm、または50nmを超えるサイズを有し得る。エキソ
ソームは、100nmを超えるサイズ、例えば150nmを超えるサイズを有し得る。エ
キソソームは、ほぼ200nm以上のサイズを有し得る。
から50nm、2nmから100nm、2nmから150nm、または2nmから200
nmの間のサイズを有し得る。1つまたは複数のエキソソームは、20nmから50nm
、20nmから100nm、20nmから150nm、または20nmから200nmの
間のサイズを有し得る。1つまたは複数のエキソソームは、50nmから100nm、5
0nmから150nm、または50nmから200nmの間のサイズを有し得る。1つま
たは複数のエキソソームは、100nmから150nmまたは100nmから200nm
の間のサイズを有し得る。1つまたは複数のエキソソームは、150nmから200nm
の間のサイズを有し得る。
サイズカットオフを有する膜を介するサイズ分画および濾過によって決定することができ
る。エキソソームサイズは、次いで、SDS−PAGEでの成分タンパク質の追跡分離ま
たは生物学的アッセイによって決定することができる。
に、電子顕微鏡法によって決定することができる。
エキソソームは、間葉系幹細胞によって分泌される1つまたは複数のタンパク質を含み
得る。エキソソームは、間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)内に存在する1つまたは
複数のタンパク質を含み得る。
以上、60%以上、または70%以上のこれらのタンパク質を含み得る。エキソソームは
、ほぼ約75%のこれらのタンパク質を含み得る。タンパク質は、遺伝子リストのタンパ
ク質または遺伝子産物のリストを参照することによって規定され得る。
05044において記載されている。
再かん流傷害に対する心保護を付与するエキソソームなどの、分泌物中の活性成分は、
当技術分野において知られている手段、および例えばWO2009/105044におい
て記載されている手段によって単離することができる。活性成分は、間葉系幹細胞(MS
C)によって分泌されるエキソソームを含み得る。
胞であり、これは、1983年に網状赤血球によって分泌されることが最初に記載され、
その後、様々な造血細胞、造血由来または非造血由来の腫瘍、および上皮細胞を含む、多
くの細胞型によって分泌されることが明らかになった。これらは、同様にエキソソームと
呼ばれる、さらに最近記載された「リボヌクレアーゼ複合体」とは異なる実体である。
ができる。したがって、本明細書において記載されるエキソソームは、これらの形態学的
パラメータまたは生化学的パラメータの1つまたは複数を含み得る。
ーサー様」小胞または平坦な球体として従来規定されており、エンドソーム膜の内側への
出芽によって形成される。全ての脂質小胞のように、そしてアポトーシス細胞によって放
出されるタンパク質凝集物またはヌクレオソーム断片とは異なり、エキソソームは、約1
.13〜1.19g/mlの密度を有し、ショ糖勾配で浮遊する。エキソソームは、コレ
ステロールおよびスフィンゴミエリン、ならびにGM1、GM3、フロチリン、およびs
rcタンパク質キナーゼLynなどの脂質ラフトマーカーに富んでおり、このことは、そ
れらの膜が脂質ラフトに富んでいることを示唆している。
、エキソソームは、細胞型特異的な全てのエキソソームおよびタンパク質に共通であると
考えられている遍在的タンパク質を含有する。また、同一の細胞型に由来するが種が異な
るエキソソームにおけるタンパク質は、高度に保存されている。遍在的なエキソソーム関
連タンパク質には、細胞骨格において見られる細胞質タンパク質、例えばチューブリン、
アクチン、およびアクチン結合タンパク質、細胞内の膜融合体および膜輸送、例えばアネ
キシンおよびrabタンパク質、シグナル伝達タンパク質、例えばタンパク質キナーゼ、
14−3−3、およびヘテロ三量体Gタンパク質、代謝酵素、例えばペルオキシダーゼ、
ピルビン酸キナーゼ、脂質キナーゼ、およびエノラーゼ−1、ならびにテトラスパニンフ
ァミリー、例えば、CD9、CD63、CD81、およびCD82が含まれる。テトラス
パニンはエキソソームにおいて非常に富んでおり、大きな分子複合体および膜サブドメイ
ンの組織化に関与することが知られている。
らのエキソソームにおけるMHCクラスII分子、樹状細胞由来エキソソームにおけるC
D86、T細胞由来エキソソーム上のT細胞受容体などである。特に、エキソソームは、
核、ミトコンドリア、小胞体、またはゴルジ体由来のタンパク質を含有しない。また、非
常に富んだ原形質膜タンパク質はエキソソーム内には存在せず、このことは、これらが単
純に原形質膜の断片であるわけではないことを示唆している。報告されている遍在的なエ
キソソーム関連タンパク質の多くはまた、hESC−MSC分泌物のプロテオミクスプロ
ファイルにおいて存在する。
RNAおよびマイクロRNAを含有することが知られている。エキソソームの生理学的機
能は、依然としてあまり規定されていない。これは、古いタンパク質を完全に無くすこと
、タンパク質を再利用すること、プリオンおよびウイルスなどの感染性粒子の伝達を仲介
すること、補体耐性を誘発すること、免疫細胞の細胞伝達を促進すること、ならびに細胞
シグナル伝達を行うことを促進すると考えられている。エキソソームは、がん治療のため
の免疫療法において用いられている。
治療用エキソソームを含むエキソソームは、上記および下記のように、MSCまたはM
SC−CMの代替物として用いることができる。
かまたは将来使用することができる治療目的のいずれかに用いることができる。
の生産を可能にすることが明白となろう。したがって、間葉系幹細胞のあらゆる使用は、
間葉系幹細胞からの治療用エキソソームに等しく付随する。
化細胞は、疾患の治療に用いることができるか、または疾患の治療のための医薬組成物の
調製に用いることができる。このような疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、変
性疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病など、およびがんを含む、再
生治療によって治療可能な疾患を含み得る。したがって、MSCからの治療用エキソソー
ムは、このような疾患を治療するために用いることができる。
幹細胞からの治療用エキソソームは、様々な商業的に重要な調査、診断、および治療の目
的で用いることができる。
製に用いることができる。このような疾患は、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、変性
疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病など、およびがんを含む、再生
治療によって治療可能な疾患を含み得る。
由来の間葉系幹細胞(BM−MSC)に類似または同一の特性を有する。したがって、間
葉系幹細胞およびこれらから作製されたあらゆる分化細胞、ならびにそれに由来する治療
用エキソソームは、BM−MSCが使用されることが知られている適用、またはBM−M
SCを用いることが可能な適用のいずれかにおいて用いることができる。
MSCのプロテオームの分析は、発現するタンパク質が、代謝、防御応答、ならびに血
管化、造血、および骨格の発生を含む組織の分化という3つの生物学的プロセスに関与す
ることを示す。したがって、本明細書において記載されるMSCからの治療用エキソソー
ムは、その機能がこれらの生物学的プロセスのいずれか1つもしくは複数における役割を
有し得る疾患、またはその修復もしくは治療にこれらの生物学的プロセスのいずれか1つ
もしくは複数が関与する疾患を治療するために用いることができる。同様に、単独で、ま
たは組み合わせて、好ましくは本明細書において記載される治療用エキソソームの形態に
より、MSCによって発現されるタンパク質は、このような疾患を例えば治療または予防
する目的で、MSCもしくはMSCによって馴化された培地の活性を補うために、または
MSCもしくはMSCによって馴化された培地に代わって、用いることができる。
ll様受容体、TGF−βシグナル伝達経路、およびmTORシグナル伝達経路などの、
心血管生物学、骨の発生、および造血における重要なシグナル伝達経路を活性化すること
が示されている。したがって、MSCなどからの治療用エキソソームは、これらのシグナ
ル伝達経路のいずれかが関与している疾患、またはその原因論がこれらのシグナル伝達経
路のいずれか1つもしくは複数における1つもしくは複数の不具合を伴う疾患を予防また
は治療するために用いることができる。
および変性疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、およびがんを治療
するために用いることができる。
膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚がん、アトピー性皮膚炎、ベ
ーチェット病、慢性的肉芽腫性疾患、皮膚T細胞リンパ腫、潰瘍、線維症および機能喪失
を含む慢性的な組織リモデリングをもたらす炎症および免疫異常調節を誘発する初期の傷
害を特徴とする病的状態、腎臓虚血性傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎および鼻炎、または
整形外科的疾患を治療するために用いることができる。
骨髄移植を促進するために用いることができる。
培養培地だけではなく、馴化培地内に存在する1つまたは複数の、好ましくはほぼ全ての
ポリペプチドを含むこのような組成物も含むものであると解釈されるべきである。
かのための由来源として用いることができる。本発明者らは、したがって、治療用エキソ
ソームに含まれるポリペプチドを生産する方法を提供し、本方法は、記載されたように治
療用エキソソームを得ること、および治療用エキソソームからポリペプチドを単離するこ
とを含む。
本明細書において記載される治療用エキソソームは、あらゆる適切な手段によってヒト
または動物の体に送達することができる。
的である細胞、組織、器官、動物の体、またはヒトの体に送達するための送達系、および
治療用エキソソームを標的に送達するために送達系を使用するための方法を記載する。
含み得る。送達系は、治療用エキソソームを標的に分配するためのディスペンサーを含み
得る。
来源と、治療用エキソソームを標的に送達するために機能可能なディスペンサーとを含む
、治療用エキソソームを送達するための送達系を提供する。
達系の使用を提供する。
6,139,524号において記載されているもののような、注射、外科的点滴、カテー
テル(かん流カテーテルを含む)、例えば、米国特許7,122,019号において記載
されているもののような薬剤送達カテーテルを含む。
いる(例えば、米国意匠第D544,957号において示されている)経鼻スプレー、噴
出器、吸入器などを用いて行うことができる。
な、大動脈内腎臓送達カテーテルを用いて行うことができる。
ソームを適切な間隔で送達するために、設定可能でなければならない。
用いることができる。ここで、治療用エキソソームのかん流を、アテローム動脈硬化性プ
ラークを安定化させるためまたはプラークにおける炎症を低減させるために静脈内で行う
ことができる。治療用エキソソームは、静脈内かん流による敗血性ショックを治療または
予防するために用いることができる。
は、リモデリングを遅らせるためまたは心不全を遅らせるための治療用エキソソームの長
期的な冠動脈内または心筋内のかん流によって達成することができる。治療用エキソソー
ムは、鼻腔内送達による肺の炎症を治療または予防するために用いることができる。
とができる。治療用エキソソームの長期間の送達を、症状がなくなるまで、経皮マイクロ
インジェクション針を用いて行うことができる。
当業者であれば、どの手段を採用するかをそれに応じて決定することができる。
な冠動脈内注射によって、または、心筋などの組織への直接的な注射のための、もしくは
体腔内に挿入されたステントもしくはカテーテルから阻害剤を注入するための、蛍光透視
による誘導下での標準的な経皮的カテーテルに基づく方法を用いて、心臓組織(すなわち
、心筋、心膜、または心内膜)に送達することができる。
用いることができる。あるいは、治療用エキソソームは、冠状血管内に置かれるステント
上に被覆または含浸させることができる。
本明細書において記載される方法および組成に従って作製された間葉系幹細胞および分
化細胞、ならびにそれに由来する治療用エキソソームはまた、それを必要とするヒト患者
における組織の再構成または再生に用いることができる。細胞は、その細胞を意図した組
織部位に移植すること、および機能が欠損している領域を再構成または再生することを可
能にする様式で投与される。
に用いることができる。間葉系幹細胞および分化細胞、ならびにそれに由来する治療用エ
キソソームは、皮膚移植片の成長などのための組織の操作に用いることができる。幹細胞
の分化の調節は、人工の器官もしくは組織のバイオエンジニアリングに、またはステント
などの人工装具に用いることができる。
本明細書において記載される方法および組成によって作製される間葉系幹細胞および分
化細胞、ならびにそれに由来する治療用エキソソームは、癌の治療に用いることができる
。
、哺乳動物における生理学的状態を言うか、それを説明するものである。がんの例には、
限定はしないが、癌腫、リンパ腫、芽細胞腫、肉腫、および白血病が含まれる。
がん、胃がん、膵臓がん、グリア細胞腫、例えば膠芽腫および神経線維腫症、子宮頸がん
、卵巣がん、肝臓がん、膀胱がん、肝臓がん、乳がん、結腸がん、結腸直腸がん、子宮内
膜癌腫、唾液腺癌腫、腎臓がん、腎臓部のがん、前立腺がん、外陰部のがん、甲状腺がん
、肝臓癌腫、ならびに様々なタイプの頭頚部がんが含まれる。さらなる例は、結腸がん、
乳がん、肺がん、および前立腺がんを含む充実性腫瘍がん、白血病およびリンパ腫を含む
造血器悪性腫瘍、ホジキン病、再生不良性貧血、皮膚がん、ならびに家族性腺腫性ポリポ
ージスである。さらなる例には、脳新生物、結腸直腸新生物、乳房新生物、子宮頚部新生
物、眼の新生物、肝臓新生物、肺新生物、膵臓新生物、卵巣新生物、前立腺新生物、皮膚
新生物、精巣新生物、新生物、骨新生物、栄養膜新生、卵管新生物、直腸新生物、結腸新
生物、腎臓新生物、胃新生物、および副甲状腺新生物が含まれる。乳がん、前立腺がん、
膵臓がん、結腸直腸がん、肺がん、悪性黒色腫、白血病、リンパ腫、卵巣がん、子宮頸が
ん、および胆道癌腫もまた含まれる。
化細胞はまた、エンドスタチンおよびアンジオスタチンなどの抗癌物質、または細胞傷害
物質、または化学療法物質と組み合わせて用いることができる。例えば、薬剤、例えばア
ドリアマイシン、ダウノマイシン、シスプラチナム、エトポシド、タキソール、タキソテ
ール、およびアルカロイド、例えばビンクリスチン、ならびに代謝拮抗物質、例えばメト
トレキサート。本明細書において用いられる用語「細胞傷害物質」は、細胞の機能を阻害
もしくは予防する、および/または細胞の破壊を生じさせる物質を言う。この用語は、放
射性同位体(例えば、I、Y、Pr)、化学療法物質、および毒素、例えば細菌、真菌、
植物、または動物に由来する酵素的に活性な毒素、またはその断片を含むことが意図され
る。
シンなどのがん遺伝子産物/チロシンキナーゼ阻害剤、EP600832において開示さ
れている1,2−ビス(アリールアミノ)安息香酸誘導体、EP600831において開
示されている6,7−ジアミノ−フタラジン−1−オン誘導体、EP516598におい
て開示されている4,5−ビス(アリールアミノ)−フタルイミド誘導体、またはSH2
含有基質タンパク質へのチロシンキナーゼの結合を阻害するペプチド(例えば、WO94
/07913を参照されたい)が含まれる。「化学療法物質」は、がんの治療において有
用な化学的化合物である。化学療法物質の例には、アドリアマイシン、ドキソルビシン、
5−フルオロウラシル(5−FU)、シトシンアラビノシド(Ara−C)、シクロホス
ファミド、チオテパ、ブスルファン、サイトキシン、タキソール、メトトレキサート、シ
スプラチン、メルファラン、ビンブラスチン、ブレオマイシン、エトポシド、イホスファ
ミド、マイトマイシンC、ミトキサントロン、ビンクリスチン、VP−16、ビノレルビ
ン、カルボプラチン、テニポシド、ダウノマイシン、カルミノマイシン、アミノプテリン
、ダクチノマイシン、マイトマイシン、ニコチンアミド、エスペラマイシン(米国特許第
4,675,187号を参照されたい)、メルファラン、および他の関連するナイトロジ
ェンマスタード、ならびに内分泌療法(例えば、ジエチルスチルベストロール(DES)
、タモキシフェン、LHRH拮抗薬剤、プロゲスチン、抗プロゲスチンなど)が含まれる
。
本明細書において記載される、治療用エキソソームを含むエキソソームは、間葉系幹細
胞馴化培地(MSC−CM)から単離または生産することができる。馴化培地およびエキ
ソソームの生産における使用に適したMSCは、当技術分野において知られているあらゆ
る方法によって作製することができる。
清培地内で共培養物の不存在下で分散させることによって得られた細胞を増殖させること
によって作製することができる。これは、以下の節において詳細に記載される。
化中のhESCへのヒトテロメラーゼ逆転写酵素(hTERT)遺伝子のトランスフェク
ション(Xuら、2004)、またはマウスOP9細胞株との共培養(Barberiら
、2005)を伴う。これらの誘導プロトコルにおける外因性遺伝物質およびマウス細胞
の使用は、腫瘍形成性または人獣共通感染性物質感染の受け入れ難いリスクを生じさせる
。
な)MSC集団を単離するための臨床的に関連するおよび再現可能なプロトコルの使用に
よって誘導されるMSCから作製することができる。通常、この方法は、胚性幹(ES)
細胞コロニーを細胞内に分散させることを含む。細胞を次いで、平板培養し、増殖させる
。細胞は、間葉系幹細胞(MSC)を得るために、線維芽細胞増殖因子2(FGF2)を
含む無血清培地内で共培養物の不存在下で増殖させる。
、操作および時間をあまり必要とせず、したがって非常に拡張可能である。このプロトコ
ルは、2つの異なるhESC系であるHuES9およびH−1、ならびにまた第3の系で
あるHes−3からのMSCの単離に用いることができる。本明細書において記載される
方法および組成によって得られるヒトES細胞由来のMSC(hESC−MSC)は、骨
髄由来のMSC(BM−MSC)に著しく類似している。
場合によってPDGF ABを補った培地においてフィーダーサポートを伴わずにhES
Cをトリプシン処理し、増殖させ、その後CD105+CD24−細胞を選別することを
含む。
シン処理したhESCからCD105+CD24−細胞を選別することを含み得、場合に
よって、少なくともいくつかの、例えばほぼ全てのまたは全ての細胞が互いに類似してい
るかまたは同一(例えば均質)であるhESC−MSC細胞培養物を生成するために、P
DGF ABが生成される。
細胞馴化培地(MSC−CM)を生産するために用いることができる。
間葉系幹細胞を生産する1つの方法は、胚性幹細胞コロニーを細胞に分散または分離さ
せることを含み得る。
ya I、McMahon J、Atienza J、Witmyer Jら、(200
4)Derivation of embryonic stem−cell line
s from human blastocysts.N Engl J Med 35
0:1353〜1356)またはH1 ESCコロニー(Thomson JA、Its
kovitz−Eldor J、Shapiro SS、Waknitz MA、Swi
ergiel JJら、(1998)Embryonic Stem Cell Lin
es Derived from Human Blastocysts.Scienc
e 282:1145〜1147.)を含み得る。
できる。コロニーは、コロニー内の全ての細胞が単独になる程度、すなわちコロニーが完
全に分離する程度まで、分離または分散させることができる。
のであり得る。分散剤は、コロニー内の細胞間の接着、または細胞と基質との間の接着、
またはその両方を妨害する試薬を含み得る。分散剤は、プロテアーゼを含み得る。
ど続けることができる。細胞は次いで、中和、遠心分離、および培地内に再懸濁し、その
後、取り出して平板培養することができる。
を取り出して平板培養することを含み得る。
プシン処理、インキュベーション、取り外し、失活、再播種、およびアリコート化。以下
のプロトコルは、Hedrick Lab、UC San Diego(http://
hedricklab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.htm
l)からの出典である。
取り出される。すすぎステップにおいて、細胞は、ある容積、例えば5〜10mlの、C
a2+およびMg2+を含まなくてもよい緩衝培地ですすがれる。例えば、細胞は、カル
シウムおよびマグネシウムを含まないPBSですすぐことができる。トリプシン処理ステ
ップにおいて、緩衝液内のある量の分散剤が容器に添加され、容器は回転させられて、表
面がだんだんと分散剤溶液で被覆される。例えば、ハンクスBSS内のトリプシン1ml
をフラスコに添加することができる。
。例えば、細胞は、37℃で数分間(例えば2から5分間)放置することができる。取り
外しステップにおいて、細胞は、機械的作用によって、例えば解体することによって、ま
たは容器の側面を手で叩くことによって、取り外すことができる。細胞はシート内に落下
し、表面を滑り落ちる。
用を停止させるための中和物質を含み得る。例えば、分散剤がトリプシンなどのプロテア
ーゼである場合、培地は、プロテアーゼの活性を停止させる血清タンパク質などのタンパ
ク質を含有し得る。特定の実施例において、3mlの血清を含有する細胞培養培地をフラ
スコに添加して、全部で4mlとする。細胞をピペッティングして、細胞を取り外すかま
たは分散させることができる。
される。多くの再播種は、異なるスプリット比で行うことができる。例えば、細胞は、1
/15希釈および1/5希釈で再播種することができる。特定の実施例において、細胞は
、1滴の細胞を25cm2のフラスコに添加し、3滴を、培養物を再播種するための別の
フラスコに添加することによって、再播種することができ、7〜8mlの培地を次に各フ
ラスコに添加して、例えば75cm2のフラスコから1/15希釈および1/5希釈を得
る。アリコート化ステップにおいて、細胞は、新たな皿にアリコート化することができる
か、または、どのようなスプリット比が望ましくても、培地が添加される。
様式で懸濁させてまず成長させて、胚様体(EB)を形成させる。5〜10日齢のEBを
次にトリプシン処理し、その後、ゼラチンで被覆した組織培養プレート上で接着細胞とし
て平板培養する。
分離した細胞は、平板培養し、細胞培養物として維持することができる。
できる。重要なことに、細胞は、共培養物の存在を伴わずに、例えばフィーダー細胞の不
存在下で、成長および増殖させる。
び場合によって血小板由来増殖因子AB(PDGF AB)などの1つまたは複数の増殖
因子を補った無血清培地内で成長させることができる。細胞培養物内の細胞は、トリプシ
ン、洗浄、再平板培養での処理によって、コンフルエントである場合には1:4でスプリ
ットまたは二次培養することができる。
細胞は、共培養物の不存在下で培養することができる。用語「共培養物」は、共に成長
させられる2つ以上の異なる種類の細胞の混合物、例えば間質性フィーダー細胞を言う。
ように処理されているマウス胚皮膚細胞のフィーダー層で被覆されている。フィーダー層
によって、ES細胞の付着および成長を可能にするための接着表面が提供される。さらに
、フィーダー細胞は、ES細胞の成長に必要な栄養を培養培地内に放出する。本明細書に
おいて記載される方法および組成において、ES細胞およびMSC細胞は、このような共
培養の不存在下で培養することができる。
幹細胞は、間葉系幹細胞(MSC)を確立させるために、フィーダー細胞の不存在下で培
養することができる。
培養基質は、ペトリ皿などの組織培養容器を含み得る。容器は前処理することができる。
細胞は、ゼラチン化された組織培養プレート上に平板培養することができるか、またはゼ
ラチン化された組織培養プレート上で成長させることができる。
ラチン溶液を作製し、オートクレーブにかける。これは室温で保存することができる。組
織培養皿の底をゼラチン溶液で被覆し、5〜15分間インキュベートする。ゼラチンを除
去すると、プレートが使えるようになる。培地は、低張の溶解を避けるために、細胞を添
加する前に添加すべきである。
解離または分離した胚性幹細胞は、無血清培地を含み得る培地内で培養することができ
る。
を含み得る。無血清培地は、当技術分野において知られており、例えば米国特許第5,6
31,159号および米国特許第5,661,034号において記載されている。無血清
培地は、例えばGibco−BRL(Invitrogen)から市販されている。
があるという点で、無タンパク質であり得る。無血清培地は、全ての成分の化学構造が分
かっている化学的規定培地を含み得る。化学的規定無血清培地は、再現可能性の向上およ
びさらに一貫性のある性能を可能にする可変性を排除し、偶発的な作用物質による汚染物
質の可能性を減少させる、完全に規定された系を提供するため、有利である。
、Grand Island、New York)を含み得る。
または複数の成分を補うことができる。無血清培地は、Invitrogen−Gibc
o(Grand Island、New York)の10%血清置換培地を含み得るか
、補うことができる。
解離または分離した胚性幹細胞を培養する無血清培地は、1つまたは複数の増殖因子を
含み得る。PDGF、EGF、TGF−a、FGF、NGF、エリスロポエチン、TGF
−b、IGF−I、およびIGF−IIを含む多くの増殖因子が、当技術分野において知
られている。
増殖因子AB(PDGF AB)などの他の増殖因子を含有し得る。これらの増殖因子の
両方は、当技術分野において知られている。本方法は、FGF2およびPDGF ABの
両方を含む培地において細胞を培養することを含み得る。
さらに含み得る。EGFの使用によって、MSCの成長が増強し得る。EGFは、あらゆ
る適切な濃度、例えば5〜10ng/mlのEGFで用いることができる。EGFは、P
DGFの代わりに用いることができる。EGFは、当技術分野において周知のタンパク質
であり、記号EGF、Alt.記号URG、Entrez 1950、HUGO 322
9、OMIM 131530、参照配列NM_001963、UniProt P011
33と呼ばれる。
びに(iii)FGF2およびEGF、ならびに他の組み合わせを含む培地の使用を開示
する。
濃度に達する、広範なマイトジェン性の、血管形成性の、および神経栄養性の因子である
。FGF2は、四肢の発生、血管新生、創傷治癒、および腫瘍成長を含む多数の生理学的
および病理学的なプロセスに関与している。FGF2は、例えばInvitrogen−
Gibco(Grand Island、New York)から商業的に入手すること
ができる。
な細胞型にとっての強力なマイトジェンである。A鎖およびB鎖と呼ばれる2つの鎖の二
量体からなるPDGFは、AAもしくはBBホモ二量体として、またはABヘテロ二量体
として存在し得る。ヒトPDGF−ABは、13.3kDaのA鎖および12.2のB鎖
から構成される25.5kDaのホモ二量体タンパク質である。PDGF ABは、例え
ばPeprotech(Rocky Hill、New Jersey)から商業的に入
手することができる。
約100pg/mlの濃度、例えば約500pg/ml、例えば約1ng/ml、例えば
約2ng/ml、例えば約3ng/ml、例えば約4ng/ml、例えば約5ng/ml
で培地内に存在し得る。いくつかの実施形態において、培地は、約5ng/mlのFGF
2を含有する。培地はまた、約5ng/mlなどのPDGF ABを含有し得る。
培養物内の細胞は通常、接触阻止によって細胞の分裂および成長が停止するコンフルエ
ンスとなるまで、成長し続ける。このような細胞は次に、基質またはフラスコから解離さ
せ、組織培養培地への希釈および再平板培養によって「スプリット」、二次培養、または
継代することができる。
スプリットを含み得る。細胞培養物内の細胞は、1:2以上、例えば1:3、例えば1:
4、1:5、またはそれ以上の比でスプリットすることができる。用語「継代」は、細胞
株のコンフルエントな培養物のアリコートを得ること、新鮮な培地に接種すること、およ
び細胞株をコンフルエンスまたは飽和が得られるまで培養することから構成されるプロセ
スを指す。
本方法はさらに、間葉系幹細胞をさらに単離または選択するための選択または選別ステ
ップを含み得る。
ら間葉系幹細胞(MSC)を選択することを含み得る。選択または選別ステップの使用は
さらに、MSCについての選別特異性および選択特異性のストリンジェンシーをさらに増
強させ、さらに、胚性幹細胞からの考えられる汚染物質、例えば出発材料からのhESC
および他のhESC誘導体を低減させる能力を有する。このことは次に、奇形腫形成のリ
スクをさらに低減させ、本発明者らが記載するプロトコルの臨床的妥当性をさらに増大さ
せる。
れも、本明細書において記載される選択または選別ステップにおいて用いることができる
。選択または選別は、蛍光活性化細胞選別(FACS)を用いて行うことができる。した
がって、当技術分野において知られているように、FACSは、細胞を、細胞によって発
現された抗原に結合しそれを標識する標識抗体などのレポーターに曝露させることを伴う
。抗体を生産し、それを標識してレポーターを形成する方法は、当技術分野において知ら
れており、例えばHarlowおよびLaneにおいて記載されている。細胞を次いで、
標識に基づいて細胞を互いに選別するFACS機器の中に通す。あるいは、またはそれに
加えて、細胞を選別するために磁気細胞選別(MACS)を用いることができる。
GA4(CD49d)、PDGFRAが、MSCに関連することが知られているが、MS
C関連表面抗原のいくつか、例えばCD29およびCD49はまた、hESCなどのES
細胞においても高度に発現されること、ならびにそれらの発現がFACS分析によって検
証されることに気付いた。表面抗原とMSCとの関連は、抗原をhESCなどのES細胞
からMSCを単離するための選択マーカーとみなすためには十分ではない可能性がある。
したがって、選択または選別ステップは、MSCとES細胞との間で差次的に発現してい
る抗原を採用し得る。
ついて正の選択をすることができる。このような抗原は、例えば、hESCおよびhES
CMSCの遺伝子発現プロファイルを比較することによって同定することができる。特定
の実施形態において、選択または選別は、以下の表E1AおよびE1Bに示される抗原の
いずれかを具体的に用い得る。
ES細胞上では発現しないと同定される抗原の発現に基づいて、間葉系幹細胞について正
の選択をすることができる。
73およびCD105の両方は、MSCにおける高度に発現する表面抗原であり、hES
Cと比較してhESC−MSCにおいて最も高度に発現する20の表面抗原に含まれ、C
D73またはCD105(または両方)を推定MSCについての選択マーカーとして用い
ることは、分化中のhESCによって生成した推定MSCについての選別において等しく
効果的である。
胞(ES細胞)上で表面抗原として高度に発現するが例えばhESC−MSCなどの間葉
系幹細胞では高度に発現しない表面抗原に基づいて、抗原に対して負の選択をし得る。選
択または選別は、既知のまたは以前に同定されたhESC特異的な表面抗原、例えばMI
BP、ITGB1BP3およびPODXL、ならびにCD24に基づき得る。
発現しないことが確認される。したがって、CD24は、それ自体で、または分化中のh
ESCの培養物から推定MSCを単離するための正の選択マーカーであるCD105と組
み合わせて、負の選択マーカーまたは選別マーカーとして用いることができる。
[実施例]
エキソソームを、先に記載されたようにHPLCを用いて、huES9.E1由来のM
SC馴化培地(CM)から精製した。簡潔に述べると、MSC培養物から回収したCMを
、100kDaのMWCO(Sartorius、Goettingen、German
y)を有する膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過(TFF)によって、50倍に濃縮
した。
×40mm、およびTSKゲルG4000 SWXL、7.8×300mm、東ソー株式
会社、東京、日本)に通した。
Sartorius)を用いて濃縮した。エキソソームを、保存または使用する前に、0
.22μmのフィルターで濾過した。
記載されているように、2mlの透析されたエキソソーム内のタンパク質を還元し、ア
ルキル化し、そしてトリプシン消化した(20)。
トリッジ(Waters、Milford、MA、USA)に通すことによって脱塩し、
3%アセトニトリル(ACN)(JT Baker、Phillipsburg、NJ)
および0.1%ギ酸(FA)の緩衝液で2回洗浄し、そして70%ACNおよび0.1%
FAの緩衝液で溶出した。
の最初の容積の約10%まで乾燥させた。
thyl SCXカラム(200mm×4.6mm)(PolyLC、USA)を通すH
PLC系(株式会社島津製作所、日本)で行った。
動相B(5mMのKH4PO4+30%アセトニトリル+350mMのKCl)。
ントラップ質量分析計(Thermo Electron、Bremem、German
y)にオンラインで繋いだ株式会社島津製作所のマイクロHPLC系の自動サンプラー内
にロードした。
mm、Agilent Technologies、Germany)内で捕捉および脱
塩し、そしてナノレベルの穴を有するC18パックされたカラム(75μm×100Å、
Michrom Bioresources、Auburn、CA)内に溶出した。
勾配を用いて、ペプチドを質量分析計内に溶出した。
Sスキャンを行うことによって、LTQをデータ依存モードで操作した。
によるシングルマスコットジェネリックファイル内に組み合わせた。
ix Science、UK)を介して、組み合わされたデータをIPIヒトタンパク質
データベース(バージョン3.34、69164の配列、29064825の残基)に対
してサーチすることによって行った。
された修飾がシステインのカルバミノメチル化であり、可変の修飾がメチオニンの酸化で
あること、であった。
.8Daに設定した。
有することが明らかになった場合に、真陽性であると認められた。
500μlの非馴化培地および3つの独立した調製物からのエキソソームを、製造者の
指示に従って(RayBio、Norcross、GA)、RayBio(登録商標)B
iotin Label−based Human Antibody Array I
を用いて、サイトカインおよび他のタンパク質の存在についてアッセイした。
び他のタンパク質がエキソソーム内に存在するとみなした。
12μgのエキソソームを、4〜12%SDS−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、
ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。
ルダーに移し、ブロックし、そして、マウス抗GAPDH(1:100希釈)、マウス抗
PGK(1:60)、マウス抗PGD(1:60)、ウサギ抗PFKFB3(1:60)
、マウス抗ピルビン酸キナーゼ(PK、1:200)、マウス抗20Sプロテアソームα
1〜7(1:200)、マウス抗CD73(1:60)、およびマウス抗CD59(1:
200)を含む一次抗ヒト抗体と共にインキュベートした。
ートした。
1:1250)であった。
抗PKを除いて、Santa Cruz Biotechnology、Santa C
ruz、CAから入手した。
ientific Inc.、Waltham、MA)と共にインキュベートし、次いで
、X線フィルムに曝露した。
5μgのエキソソーム(12μl内)を、細胞抽出キット(Biovision、Mo
untain view、CA)を用いて溶解した。
sion)の50μlの反応ミックスと共にインキュベートした。
によって酸化して、蛍光を生じさせた(Ex/Em=535/587nm)。
GAPDHおよびPGKの活性を、2つの市販されているキット、すなわちKDale
rt GAPDHアッセイキット(Ambion Inc.、Austin、TX)およ
びApoSENSOR ADP/ATP比率アッセイキット(Biovision)を用
いて、その下流生成物、すなわち糖分解反応におけるATPに基づいて測定した。
解した。
アルデヒド−3−ホスフェート、NAD+、およびPiを含有するKDalert反応緩
衝液に添加して、1,3−ビスホスホグリセレート+NADH+H+を形成させた。
グリセレートおよびADPを3−ホスホグリセレートおよびATPに変換した。
イを用いて測定した。
ら生産された1,3−ビスホスホグリセレートに添加した。
した。
プロテアソーム活性を、特異的20Sプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンの存
在下または不存在下で、20Sプロテアソームによる標識された基質LLVY−AMCか
らの切断後のフルオロフォア7−アミノ−4メチルクマリン(AMC)を検出することに
基づく、20Sプロテアソーム活性アッセイキット(Millipore)を用いて測定
した。
不存在下で、LLVY−AMCを含有する反応緩衝液と共にインキュベートした。
での蛍光強度を2時間モニタリングした。
エキソソームにおけるCD73(NT5E)酵素活性を、50μMのAMP(Sigm
a−Aldrich、St Louis、MO)を含有する100μlのTris緩衝液
(pH7.4)内で2.5μgのエキソソームをインキュベートすることによって決定し
た。
lorlock Goldキット(Innova Biosciences、Cambr
idge、UK)によって決定した。
H9C2心筋細胞を、ウェル当たり30,000個細胞で96ウェルプレート(ポリリ
ジン被覆された)上に平板培養した。
シン(Sigma−Aldrich)、6mmolのグルコースを含有し、0.1μg/
mlのエキソソームを含むまたは含まないタイロード緩衝液内で15分、30分、および
60分間インキュベートした。
kinElmer、Zaventem、Belgium)を用いて測定した。
H9C2心筋細胞を、ウェル当たり200,000個細胞で6ウェルプレート上で平板
培養し、一晩血清飢餓とした。
に1時間インキュベートした。
ームのみ、または50μMのAMPおよび0.1μg/mlのエキソソームの組み合わせ
を含有していた。
シリーズに類似していた。
リーズを用いて、テオフィリン含有培地において培養された細胞の培地を置換した。
ma Aldrich)の存在下で、市販されている哺乳動物細胞抽出キット(BioV
ision)を用いて溶解した。
Signaling、9101S)、1:2000希釈のウサギ抗AKT(Cell S
ignaling、9271S)、1:500希釈のウサギ抗ERK1(Santa C
ruz、sc−94)、および1:500希釈のウサギ抗AKT(Cell Signa
ling、9272S)を用いて、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションによって
分析した。
簡潔に述べると、ヒツジ赤血球(SRBC)を購入し(Innovative Res
earch、Southfield、MI)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗
浄し、その後、PBS1ml当たり1×108個細胞で再懸濁した。
ego、CA)から購入し、C7はSigma−Aldrich(St Louis、M
O)から購入した。
ソームの存在下または不存在下で、それぞれ1mlのC5b6(0.1μg/ml)およ
びC7(0.4μg/ml)と共に15分間インキュベーションすること(37℃)によ
って開始させた。
または含まない、それぞれ1mlのC8(0.4μg/ml)にC9(0.4μg/ml
)を加えたものと共にさらに30分間インキュベートした。
ロビンの量を、415nmでの吸光度によって測定した。
とによって得た。
エキソソームを、以前に記載されているように、HPLCによって9,10、ヒトES
C由来の間葉系幹細胞であるHuES9.E113によって馴化された培養培地から精製
した。質量分析および抗体アプローチを用いるプロテオミクスプロファイリングを、以前
に記載されているように9−11、HPLC精製されたエキソソームの3つの独立して調
製されたバッチに対して行った。全部で866のタンパク質を検出し、分析を容易にする
ためにこれらのタンパク質をその遺伝子記号によって示した(表E1)。これらのうち、
318の遺伝子産物が、分画されていない馴化培地において先に同定された739のタン
パク質において見られた9,10(図1)。
クス分析のデータ分析に基づいて、Theryらは、約17のタンパク質、すなわちグリ
セルアルデヒド3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)、ピルビン酸キナーゼ
(PK)、真核生物翻訳伸長因子1A1(EEF1A1)、乳脂肪球EGF因子8タンパ
ク質(MFGE8)、テトラスパニン、14−3−3タンパク質、Gαタンパク質、クラ
スリン、Alix(PDCD6IP)、MHCクラス1、アネキシン(ANX)、Rab
タンパク質、エズリン(VIL2)、ラジキシン(RDX)およびモエシン(MSN)(
ERM)、アクチン、チューブリン、HSP70およびHSP90の組み合わせが、特徴
付けされたエキソソームの少なくとも50%において見られることを観察した2。予想通
り、これらのタンパク質のほとんどはまた、HPLC精製されたMSCエキソソームのプ
ロテオームにおいても見られた(表E1)。エンドソーム由来のエキソソームとも一致し
て、本発明者らは、Alix(PDCD6IP)およびRab(表E1)などのエンドソ
ーム関連タンパク質の存在を検出した。
エキソソームにおけるタンパク質の生物学的有意性をさらに良く理解するために、生物
学的プロセスへの866のタンパク質の機能的クラスター化を、PANTHER(進化的
関係を介するタンパク質分析)分析ソフトウェアを用いて行った14,15。各生物学的
プロセスにおけるエキソソームプロテオームからの観察された遺伝子頻度を、その生物学
的プロセスについてのNCBIデータベースにおける参照遺伝子頻度と比較した。866
の遺伝子産物を、出現頻度の高かった(p<0.001)32の生物学的プロセスおよび
出現頻度の低かった(p<0.001)3つの生物学的プロセスにクラスター化すること
ができた(図2)。
、炎症、およびエキソソーム生合成に関連するいくつかの活性にさらに分類することがで
きた。エキソソームは全体として、細胞間伝達およびモルフォゲンシグナル伝達4,16
ならびに免疫活性のメディエーター2の媒体として機能すると仮定されるため、シグナル
伝達経路、細胞構造、細胞の運動性、および免疫応答におけるエキソソームタンパク質の
関与は当然のことであった。本発明者らが「エキソソーム生合成」と暫定的に呼ぶ、第4
のクラスのプロセスは、エンドソームの関与、ESCRT介在性の選別および多小胞体の
形成、ならびに原形質膜との融合を介する、エキソソームの生合成および放出を基本的に
反映していた。したがって、トランスゴルジネットワーク、細胞内のタンパク質輸送、一
般的な小胞輸送、エンドサイトーシス、受容体介在性のエンドサイトーシス、他のタンパ
ク質の標的化および局在化、ならびにエキソサイトーシスに関与するもののようなタンパ
ク質は、当然のことながらエキソソームにおいて富んでいる。組織の修復および再生とし
て本発明者らが分類した他の生物学的プロセスには、骨格の発生および血管新生を含む中
胚様性および外肺葉性の組織の発生および分化に関与するプロセスが含まれる。これらの
生物学的プロセスは、間葉系幹細胞17の分化能力に一致し、エキソソームが細胞由来で
あることを反映していた。本発明者らの代謝分類において、本発明者らは、成長および再
生のためのエネルギーおよび構成成分を生産する、異化作用性または同化作用性の代謝に
関与するプロセスを含めた。血液凝固もまた、本発明者らが組織傷害の改善において重要
であり得ると仮定した、有意に出現頻度の高い生物学的プロセスであった。3つの出現頻
度の低い生物学的プロセスの全ては、当然のことながら、転写レベルでの遺伝子発現の調
節に関与していた。これらのプロセスに関与するほとんどのタンパク質は、核内に効率的
に輸送されて、エキソソームとあまり関連しないようになる傾向がある。本発明者らはま
た、馴化培地(CM)において見られる421のタンパク質がエキソソーム内に存在しな
いこと(図1)およびこれらのタンパク質が11の出現頻度の高い生物学的プロセスおよ
び2つの出現頻度の低い生物学的プロセスに機能的にクラスター化され得ることを観察し
た。出現頻度の高いプロセスのうち、6つは、エキソソームにおいて見られる866のタ
ンパク質のクラスター化においても見られたが、残りの5つ、すなわちアミノ酸活性化、
タンパク質のフォールディング、染色体のパッケージングおよびリモデリング、タンパク
質複合体の会合、ならびにmRNAのスプライシングは見られなかった。2つの出現頻度
の低い生物学的プロセスはまた、エキソソームタンパク質については出現頻度が低いこと
が分かった。MSCエキソソームにおける多種多様なタンパク質は、これらが広範な生化
学的活性および細胞的活性に関与する能力を有することを示した。この仮説を試験するた
めに、本発明者らは、タンパク質を選択し、当該タンパク質は、その生化学的および細胞
的活性を試験するためのアッセイが利用可能なものであり、このアッセイは、組み合わせ
て、エキソソームにおける広範な活性の指標を提供するものである。
エキソソームプロテオームの1つの顕著な特徴は、糖分解(図3A)のATP生成段階
における5つの酵素の全て、すなわち、グリセルアルデヒド3−ホスフェートデヒドロゲ
ナーゼ(GAPDH)、ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)、ホスホグルコムターゼ
(PGM)、エノラーゼ(ENO)、およびピルビン酸キナーゼm2アイソフォーム(P
Km2)の存在であった。これらのうち、ATPまたはNADHを生成する3つの酵素、
すなわちGAPDH、PGK、およびPKm2は、イムノブロッティングによって存在す
ることがさらに確認された(図3B)。その酵素の活性は、1単位(U)の酵素活性が1
分当たり1μモルの生成物の生産に必要な活性であると規定される場合に、タンパク質1
μg当たりそれぞれ1.1μU、3.59μU、および5.5μUであることが決定され
た(図3C)。
ホスフェートに変換するPFKFB3を含有する。PFKFB3は、4つの異なる遺伝子
によってコードされる4つのPFKFBアイソフォームであるPFKFB1、2、3、お
よび4の1つである。PFKFBは、糖分解への関与を触媒する、ホスホフルクトキナー
ゼの強力なアロステリック活性化剤であるフルクトース−2,6−ビスホスフェート18
の細胞レベルを維持することに関与する。これらは、がん細胞における高い糖分解率また
は「ワールブルク効果」に関与すると考えられている19。PFKFB3のキナーゼ活性
は、cAMP依存性のタンパク質キナーゼおよびタンパク質キナーゼCなどのタンパク質
キナーゼによるリン酸化によって上方調節される。質量分析によって、エキソソームにお
けるPFKFB3の存在が明らかになり、イムノブロッティングによって、この酵素がリ
ン酸化されたことがさらに実証された(図3A)。
3の存在によって、エキソソームへの細胞の曝露が糖分解フラックスおよびATP生産を
増大させ得ることが予測された。これを試験するために、本発明者らは、これらのエキソ
ソームがオリゴマイシン処理されたH9C2細胞においてATP合成を増大させ得るかを
決定した。オリゴマイシンはミトコンドリアATPaseを阻害するため20、オリゴマ
イシン処理した細胞は、糖分解をその主要な細胞ATP源として利用しなくてはならない
。糖分解酵素およびPFKFB3の存在、ならびに本発明者らによる、H9C2細胞がM
SCエキソソームを取り込み得るという以前の実証12と一致して、エキソソームは、オ
リゴマイシン処理した細胞において、それぞれエキソソームに15から30分曝露させる
と、糖分解の増大を介して、ATPレベルを75.5±28.8%または55.8±16
.5%増大させた。
MSCエキソソームの質量分析は、20Sコア粒子の7つのα−サブユニット(PMS
A1〜7)の全ておよび7つのβ−サブユニット(PMSB1〜7)の全ての存在を検出
しただけではなく、「免疫プロテアソーム」の3つのβ−サブユニットであるPMSB8
(β5iまたはLMP7)、PMSB9(β1iまたはLMP2)、PMSB10(β2
iまたはLMP10)遺伝子産物も検出した21。20Sプロテアソームペプチドのいく
つかの存在は、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションによってさらに確認された(
図4A)。20Sコア粒子の7つのα−サブユニットの全ておよび7つのβ−サブユニッ
トの全ての存在は、MSCエキソソームが無傷の20Sプロテアソーム複合体を含有し、
したがって、20Sプロテアソーム酵素活性を潜在的に有することを示唆する。
を有する短い蛍光発生ペプチドを分解し得、この分解は、特異的プロテアソーム阻害剤で
あるラクタシスチンによって阻害された(図4B)。本発明者らはまた、上記の糖分解酵
素アッセイとは異なり、エキソソームにおける20Sプロテアソーム活性が、エキソソー
ムの溶解を伴わずに検出され得ることを観察した。このことは、20Sプロテアソームが
エキソソームの内腔ではなく表面上に存在し得ることを示唆した。
質フィルム22上の「エンドオン」立体構造に優先的に会合し、その結果20Sプロテア
ソームへの入り口が膜に垂直となることが、以前に観察された。したがって、これと本発
明者らの所見とを組み合わせると、エキソソーム内の20Sプロテアソームが外部膜表面
に付着し、その入り口がエキソソーム膜に垂直であったことを示唆している。
介してERKおよびAKTをリン酸化した>
エクト−5'−ヌクレオチダーゼ(NT5EまたはCD73)は、エクトアピラーゼ(
CD39)と共に、前駆ヌクレオチドをアデノシンに酵素的に変換する。細胞の傷害の間
、細胞はATPおよびADPを放出する23。CD39は、細胞外ATPおよびADPを
AMPに加水分解し、これは次に、エクト−5'−ヌクレオチダーゼによってアデノシン
に分解される。
質であるが、作用が非常に短いため、血管拡張物質として臨床的には用いられていない。
これは、上室性頻拍症の迅速な治療に用いられる。アデノシンは、4つの既知のアデノシ
ン受容体サブタイプ(A1、A2A、A2B、およびA3)を介して多くの生理学的プロ
セスを仲介する内因性プリンヌクレオシドである24。
ムノブロッティングによって確認された(図5A)。それらの酵素活性は、タンパク質1
μg当たり22.04μUであると決定された。エキソソームがAMPのCD73介在性
の加水分解を介して細胞内のアデノシンシグナル伝達を活性化し得るかを決定するために
、H9C2心筋細胞を一晩血清不足とし、次に、エキソソームおよびAMPに曝露した。
細胞溶解物を次に、ERK1/2およびAKTのリン酸化について分析した(図5B、図
5C)。
よびAKTのリン酸化が誘発された。ERK1/2およびAKTのリン酸化は、非選択的
なアデノシン受容体アンタゴニストであるテオフィリン、拮抗されたA1、A2A、A2
B、およびA3受容体の存在下で消失した25。
補体系は、抗体の機能を補う、自然免疫系の一部である。活性化すると、生化学的カス
ケードが開始して、いくつかの鍵となる生成物、すなわち、病原体の表面に結合しこれら
の病原体の食作用を増強させるC3b、走化性による炎症細胞の動員を助けるC5a、な
らびにC5b、C6、C7、C8、およびポリマー性C9からなるMACの形成を開始さ
せるC5bを生成する。標的細胞上に堆積したMACは膜貫通チャネルを形成し、これに
よってその後の細胞溶解が生じる。補体経路の異常な活性化は、虚血再かん流傷害におい
て有害な役割を有すると考えられる26。
のことは、イムノブロッティングによって確認された(図6A)。CD59はMACの形
成を阻害するため27、このことは、エキソソームが補体活性化およびその後の補体介在
性の細胞溶解を阻害し得ることを示唆した。この仮説と一致して、エキソソームは、ヒツ
ジ赤血球(SRBC)の補体介在性の溶解を阻害した(図6B)。この阻害は、CD59
ブロッキング抗体をエキソソームの前処理に用いた場合に無効となり、このことは、エキ
ソソームのCD59が補体溶解の阻害に直接的に関与することを示す。
この報告において、本発明者らは、独立して調製された3種類の、HPLC精製された
ESC由来のMSCエキソソームのプロテオームを、質量分析およびサイトカインアレイ
を用いてプロファイリングし、866のタンパク質を同定した。これらのタンパク質は、
他のエキソソームにおいて共通して見られる多くのタンパク質を含んでいた。
生物学的プロセスを駆動する能力を有することが示唆された。この仮説的な生物学的能力
を評価するために、本発明者らは、その生化学的活性および細胞的活性についてのアッセ
イが利用可能であること、ならびにグループとしてそれらが広範な活性多様性を説明する
ことに基づいて選択されたタンパク質セットを試験した。さらに重要なことに、これらの
選択されたタンパク質の生化学的活性および細胞的活性は、急性心筋虚血/再かん流傷害
における組織傷害を改善する能力を有し得る。
は、生合成経路およびエンドサイトーシス経路を介する高度に調節され複雑な細胞内膜輸
送および選別に関与するタンパク質であり28、これらのタンパク質の存在は、おそらく
、多くの細胞型によって分泌される基本的に小さな脂質二重膜小胞であるエキソソームの
生合成の反映である。異なる細胞源からのエキソソームが共通のタンパク質セットを有し
、その多くがそれらの生合成を反映することが以前に観察された29。エキソソームの生
合成ならびにタンパク質およびRNAカーゴのロードの選択的ロードにおける複雑性は、
細胞資源の多くが用いられること、およびこのような関与が重要な生理学的機能によって
支えられているに違いないことを示唆する。
かにされ始めたばかりである。エキソソームは、ますます多くの重要な生理学的および病
理学的プロセス、例えば不要なタンパク質の処分1、抗原提示30、遺伝子交換31、免
疫応答32,33、および腫瘍の転移32−37に関与している。総合すると、これらの
所見は、グループで、または個別に、エキソソームが多くの生物学的プロセスを調節し得
ることを示唆する。後者の可能性は、エキソソームにおいて見られている広範なタンパク
質およびRNAによって裏付けられる12,38。上記に列挙したエキソソームの機能に
加えて、本発明者らは、最近、MSCによって分泌されるエキソソームが急性心筋虚血/
再かん流傷害のマウスモデルにおいて梗塞サイズを低減させ得ることを観察した9。根底
にある分子メカニズムを調べ、解明するために、本発明者らは、MSCエキソソームの体
系的なプロテオミクスの疑問に着手して、これらのエキソソームの細胞的能力および生化
学的能力を明らかにし、急性心筋虚血/再かん流傷害における組織傷害を改善し得る候補
生物学的活性を同定した9。
ーム内に存在するだけではなく生化学的にも活性であることを決定した。さらに、エキソ
ソームはまた、ホスホフルクトキナーゼの強力なアロステリック活性化剤であるフルクト
ース−2,6−ビスホスフェートの形成を触媒する活性なリン酸化形態のPFKB3を含
有していた。これらの所見は、MSCエキソソームが、ミトコンドリア機能に依存せずに
、糖分解を介して細胞ATPおよびNADHを回復させる能力を有することを示した。A
TP生産の主要な部位である上に、ミトコンドリアはまた、細胞死の調節における主要な
オルガネラである39。ミトコンドリアの機能の喪失およびその後のATPの枯渇は、通
常、急性心筋虚血/再かん流傷害などの病的状態の間の細胞死をもたらすカスケードにお
ける初期のステップに相当する。細胞生存能力の主要な指標であるATPの欠如は、ミト
コンドリアの機能障害の鍵となる結果である。MSCエキソソームは細胞によって取り込
まれ得るため12、エキソソームは、ミトコンドリアが損傷した細胞における糖分解酵素
またはリン酸化PFKB3の細胞含有量を増大させることによって細胞ATPレベルを回
復させる能力を有する。実際、H9C2細胞におけるミトコンドリアのATPaseがオ
リゴマイシンによって阻害されると、エキソソームは、これらの細胞においてATP生産
を増大させ得る。
ての存在、ならびにエキソソームにおける20Sプロテアソーム酵素活性のその後の検証
は、MSCエキソソームの治療的活性が20Sプロテアソームの存在に部分的に起因し得
ることを示唆した。20Sプロテアソームは、細胞内の酸化的に損傷したタンパク質の全
ての約90%の分解の原因であり40、プロテアソーム活性の低減は、加齢に関連する神
経変性疾患、例えばアルツハイマー病およびパーキンソン病41,42または心血管疾患
43−45の発症の要因であると仮定されている。
てAKTおよびERK1/2のリン酸化を誘発する、MSCエキソソームの生化学的能力
によって、ストレスを受けた細胞および刺激された生存シグナル伝達経路によって放出さ
れるAMPを加水分解する、MSCエキソソームの能力が説明された。European
Society of Cardiologyの最近の方針書は、アデノシン受容体の
活性化およびプロ生存キナーゼ、例えばPI3キナーゼであるAKTおよびERK1/2
のリン酸化を、再かん流傷害を限定する役割を有する可能性があると協調していた46。
したがって、心保護性であることが示されているアデノシン受容体の活性化46,47は
また、エキソソームによる再かん流傷害の改善を仲介する分子メカニズムであり得る。
心保護効果のさらに別の候補メカニズムに相当する。補体活性化は、腸、心臓、および腎
臓などの組織における虚血/再かん流傷害の既知のメディエーターであり、その減衰また
は阻害は、組織傷害を改善することが示されている48−50。
証は、広範な生化学的活性および細胞的活性を明らかにし、エキソソームの心保護効果の
ためのいくつかの候補経路を同定した。これらの候補経路の1つまたは複数が急性心筋傷
害の治療における再かん流傷害の低減におけるMSCエキソソームの有効性に寄与したか
を決定するためには、適切な動物モデルにおけるさらなる検証研究が必要である51。M
SCエキソソームにおける多くの生化学的能力は、2つ以上の組織傷害メディエーターを
同時に標的化し、組み合わせ薬剤療法において観察されるものと類似の治療的相乗効果を
潜在的に誘発する可能性を提供する。複数の傷害メディエーターを標的化し得るというこ
の可能性は、これらの標的化活性を駆動するための酵素の使用によってさらに増強される
。酵素活性は、その微小環境、例えば基質の濃度またはpHによって決定されるため、エ
キソソームの酵素に基づく治療的活性は、疾患促進微小環境の程度に比例して活性化され
得るかまたは弱められ得る。結果として、エキソソームに基づく治療の有効性は、疾患促
進微小環境に非常に応答性であり得、当該環境によってさらに限定され得る。総合すると
、これらの特徴は、エキソソームに基づく治療を、本質的に安全でさらに有効なものとし
得る。
MSCエキソソームを、ヒトTLRのほとんどを発現することが知られているヒト急性
単球性白血病細胞株であるTHP−1に由来する2つの細胞株を用いて、TLRを活性化
する能力についてまず評価した。第1の株は、NF−kBプロモーターの転写制御下にあ
る安定的にトランスフェクトされた分泌型胚アルカリホスファターゼ(SEAP)レポー
ター遺伝子を有するTHP1−XBlueである。第2の株は、MyD88活性が欠損し
ているTHP1−XBlue−defMYDであり、その結果、THP1−XBlueの
活性化およびTHP1−XBlue−defMYDの非活性化は、TLRリガンドの存在
を示す。0.1μg/mlでは、MSCエキソソームは、0.01μg/mlのLPSと
同程度までTHP1−XBlueを活性化させ、この活性化は、LPSの活性化とは異な
り、ポリミキシンBによって消失せず、これによって、MSCエキソソーム調製物におけ
るLPS汚染は除外された。MSCエキソソームおよびLPSの両方は、THP1−XB
lue−defMYDを活性化できず、このことは、THP1−XBlueの活性化がT
HP−1細胞上に存在するTLRのいくつかの活性化によってのみ仲介されたことを示す
(図6)。
を、ヒトTLR2またはTLR4で安定的にトランスフェクトされたHEKレポーター細
胞株、およびSEAPレポーター系を用いて、これらの受容体を活性化させる能力につい
て試験した(図7および図8)。MSCエキソソームはTLR2およびTLR4の両方の
内因性リガンドを含有していたが、TLR4のみが0.1μg/mlのエキソソームで活
性化した。1.0μg/mlのエキソソームでは、ある程度の小さな、しかし有意な(p
<0.01)TLR2活性化が存在し、このことは、MSCエキソソームによるTLR2
活性化の能力が少なくとも10倍低かったことを示す。エキソソームによるTLR4活性
化はポリミキシンBによって消失しなかったため、このことによって、MSCエキソソー
ム調製物におけるLPS汚染は除外された。したがって、MSCエキソソームは、TLR
4を活性化し得るが、TLR2は活性化し得ない。
MSCエキソソーム上のTLRリガンドの存在を、ヒトTLRのほとんどを発現するこ
とが知られているヒト急性単球性白血病細胞株であるTHP−1に由来する2つの細胞株
を用いて決定した。第1の株は、NF−kBプロモーターの転写制御下にある安定的にト
ランスフェクトされた分泌型胚アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子を
有するTHP1−XBlueである。第2の株は、MyD88活性が欠損しているTHP
1−XBlue−defMYDである。ウェル当たり105個の細胞を96ウェルプレー
ト内に播種し、LPSを結合および不活化する抗生物質であるポリミキシンBを有するか
または有さない10ng/mlのLPS(E.coli 026:B6、Sigma)ま
たは0.1μg/mlのMSC由来のエキソソーム(MSC−Exo)と共に24時間イ
ンキュベートした。SEAPレベルを、アルカリホスファターゼの蛍光基質であるQua
nti−Blue(InvivoGen)を用いてアッセイした。
MSCエキソソームのTLR2活性化能力を、ヒトTLR2、MD2、およびCD14
で安定的にコトランスフェクトされている市販のHEK293細胞株、ならびにNF−κ
Bプロモーターの制御下にある最適化された分泌型胚アルカリホスファターゼ(SEAP
)レポーター遺伝子を用いて評価した。この細胞株、すなわちHEK−Blue−hTL
R2(Invitrogen)をウェル当たり104個細胞で96ウェルプレートに播種
し、10μg/mlのリポタイコ酸(LTA、Staphylococcus aure
us、Sigma)または0.1、0.5、および1.0μg/mlのMSC由来エキソ
ソーム(MSC−Exo)と共に24時間インキュベートした。SEAPレベルを、アル
カリホスファターゼの蛍光基質であるQuanti−Blue(InvivoGen)を
用いてアッセイした。
MSCエキソソームのTLR4活性化能力を、ヒトTLR2、MD2、およびCD14
で安定的にコトランスフェクトされている市販のHEK293細胞株、ならびにNF−κ
Bプロモーターの制御下にある最適化された分泌型胚アルカリホスファターゼ(SEAP
)レポーター遺伝子を用いて評価した。この細胞株、すなわちHEK−Blue−hTL
R4(Invitrogen)をウェル当たり104個細胞で96ウェルプレートに播種
し、LPSを結合および不活性化する抗生物質であるポリミキシンBを有するかまたは有
さない10ng/mlのLPS(E.coli 026:B6、Sigma)または0.
1μg/mlのMSC由来エキソソーム(MSC−Exo)と共に24時間インキュベー
トした。SEAPレベルを、アルカリホスファターゼの蛍光基質であるQuanti−B
lue(InvivoGen)を用いてアッセイした。
カインの生産を誘発する>
<方法>
THP−1細胞を1×106個細胞/mlの濃度で24ウェル培養プレートに播種し、
10ng/mlのLPSまたは0.1μg/mlのMSC−Exoで0.5、1、3、6
、12、24、48、72、96、および120時間刺激した。細胞を採取し、リアルタ
イム定量的RT−PCRによってサイトカイン生産について分析した。全RNAを、RN
easy Miniキット(QIAGEN)を用いて抽出し、High Capacit
y cDNA Reverse Transcription Kit(ABI P/N
.4368813)を用いて逆転写した。PCRを、10μlの2×Fast SYBR
(登録商標)Green Master Mix(ABI、P/N 4385612)反
応緩衝液、1μlのcDNA、および1μlのオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で
、20μlの全容積で、StepOnePlus(商標)Real−Time PCR
Systems(ABI P/N.4376592)で行い、最初の変性ステップは95
℃で10分間であり、その後、95℃で3秒での変性、60℃で30秒のアニーリングお
よび伸長を40サイクル行った。用いたプライマーは、IL−1β(FW:5’−CCT
GTCCTGCGTGTTGAAAGA−3’;RV:5’−GGGAACTGGGCA
GACTCAAA−3’)、TNF−α(FW:5’−CCCCAGGGACCTCTC
TCTAATC−3’;RV:5’−GGTTTGCTACAACATGGGCTACA
−3’)、IL−6(FW:5’−TCGAGCCCACCGGGAACGAA−3’;
RV:5’−GCAACTGGACCGAAGGCGCT−3’)、IL−12p40(
FW:5’−CATGGTGGATGCCGTTCA−3’;RV:5’−ACCTCC
ACCTGCCGAGAAT−3’)、IL−10(FW:5’−GTGATGCCCC
AAGCTGAGA−3’;RV:5’−CACGGCCTTGCTCTTGTTTT−
3’)、TGF−β1(FW:5’−CAGCAACAATTCCTGGCGATA−3
’;RV:5’−AAGGCGAAAGCCCTCAATTT−3’)、GAPDH(F
W:5’−GTCTTCACCACCATGGAGAAGGCT−3’;RV:5’−C
ATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCA−3’)であった。各試料で、mRNA
の含有量をヒトGAPDH mRNAの含有量に対して正規化し、未処理対照と比較して
n倍の発現であると記載する。各試料を3回ずつ試験した。データは、製造者の指示に従
って、比較ΔCT法およびApplied Biosystems StepOneソフ
トウェアバージョン2.0.1を用いて、分析した。
<THP−1細胞によるサイトカイン生産に対するMSCエキソソームの影響>
Cエキソソームは、ヒト単球細胞においてTLRを活性化し得るため、本発明者らは、こ
の活性化によってサイトカインが生産されるかを決定した(図10)。
トカインおよび抗炎症性サイトカインの二相性の生産を誘発した。
MSCエキソソームによるTLRの活性化ならびに炎症性サイトカインおよび抗炎症性
サイトカインの誘発は、MSCエキソソームが適応免疫を調節し得ることを示唆する。具
体的には、本発明者らは、MSCエキソソームがTregまたはTh17の分化に対する
何らかの影響を有するかを試験した。Tregは、調節性T細胞またはサプレッサーT細
胞として知られているT細胞亜集団を言う12。これらは免疫系を下方調節し、自己抗原
に対する耐性を維持する。これらの細胞は、アレルギーおよびぜんそくなどの免疫疾患、
糖尿病、移植拒絶反応などに対する免疫療法において用いられている13 14。Th1
7細胞はCD4+記憶T細胞であり、IL−17サイトカインの特徴的な分泌によって規
定される。これらは、自己免疫疾患の発症にとって重要であると考えられる15。
ソソームの影響を試験するために、CD4+マウス細胞をMSCエキソソームと共にイン
キュベートした。陽性対照として、CD4+マウス細胞を、TGF−β1によってTre
g細胞に分化するように、そしてIL−6およびTGF−β1によってTh17細胞に分
化するように誘発し、いずれも、CD4+CD25+Foxp3L+TregまたはTh
17細胞へのCD4+マウスT細胞の分化に対する影響を与えなかった(図11)。
マウス脾細胞を、以前に記載されているように、6から8週齢のBALB/Cマウスか
ら調製した16。簡潔に述べると、マウス脾臓を取り出し、細かく刻み、漉した。赤血球
を次に溶解させた。CD4+細胞を、FITCにコンジュゲートしたラット抗マウスCD
4抗体をEasySep FITC Selection Kit(StemCell
Technologies)と共に用いて採取し、純度を、フローサイトメトリーによっ
て>95%であることを検証した。精製したCD4+T細胞を、抗CD3mAbおよび5
μg/mlの抗CD28mAbを用いて活性化させた。
0.1μg/mlのMSC−Exoを補った。6日後、CD4+細胞、CD25+細胞、
およびマウスFoxp3+細胞として規定されるTreg細胞の数を、標準的な抗体染色
技術を用いてFACSによって決定した。
/mlのrhTGF−β1または0.1μg/mlのMSC−Exoを補った。6日後、
CD4+細胞、IL17a+細胞として規定されるTh17細胞の数を、標準的な抗体染
色技術を用いてFACSによって決定した。
た。
MSCエキソソームはTHP−1細胞に対する大規模な活性化効果を与え、自然免疫は
適応免疫応答の調節において重要な役割を有するため、本発明者らは、エキソソームが自
然免疫に対するその影響を介して適応免疫を調節し得ると仮定した。この仮説を試験する
ために、本発明者らは、ある程度の修正を加えて、図11において記載されている実験を
反復した。Treg細胞またはTH17細胞へのCD4+T細胞の分化の間、T細胞を、
6日間エキソソームに曝露されたTHP−1細胞と共にインキュベートした(図12)。
陽性対照として、T細胞を、それぞれTGF−β1またはrIL−6+TGF−β1と共
にインキュベートした。MSCエキソソームに48時間曝露されたTHP−1細胞は、T
reg細胞へのT細胞の分化を誘発したが、TH17細胞への分化は誘発せず、このこと
は、MSCエキソソームが、免疫抑制性であるが炎症性ではないT細胞応答を誘発し得る
ことを示唆している。
CD4+マウスT細胞を、図11において記載されているように精製および活性化した
。
P−1細胞、または0.1μg/mlのMSCエキソソームに48時間曝露されたTHP
−1細胞を補った。THP−1細胞は、1000のCD4+マウスT細胞に対して1のT
HP−1の割合で添加した。6日後、CD4+細胞、CD25+細胞、およびマウスFo
xp3+細胞として規定されるTreg細胞の数を、標準的な抗体染色技術を用いてFA
CSによって決定した。
/mlのrhTGF−β1、または0.1μg/mlのMSCエキソソームに48時間曝
露されたTHP−1細胞を補った。THP−1細胞は、1000のCD4+マウスT細胞
に対して1のTHP−1の割合で添加した。6日後、CD4+細胞、IL17a+細胞と
して規定されるTh17細胞の数を、標準的な抗体染色技術を用いてFACSによって決
定した。
た。
MSCエキソソームを、コンカナバリンAで活性化されたリンパ球の増殖を阻害する能
力によって評価することができる。図13を参照されたい。
E)で標識した。CFSE標識した脾細胞を、5μg/mlのコンカナバリンA(Con
A)の存在下または不存在下で、異なる濃度のMSCエキソソーム(0.1、0.5、1
、および4μg/ml)と共に3日間インキュベートした。
治療群の蛍光細胞数を、FACSによって定量した。データを未処理対照に対して正規化
し、3組の試料の平均(±SD)として表した。
C−Exoは、ConAで刺激された脾細胞の増殖を有意に阻害した(*p<0.01)
。
、T.S.Chen、M.Salto−Tellez、L.Timmers、C.N.L
ee、R.M.El Oakley、G.Pasterkamp、D.P.de Kle
ijn、S.K.Lim、Exosome secreted by MSC redu
ces myocardial ischemia/reperfusion inju
ry、Stem Cell Res、4(2010)214〜222を参照されたい。
MSCエキソソームは、炎症性および抗炎症性の自然免疫応答を活性化し得るが、抑制
適応免疫応答を、自然免疫系を介して間接的にのみ誘発し得る。これらは、炎症性適応免
疫応答を直接的にも間接的にも活性化しない。
LE、1型糖尿病、多発性硬化症、ALSにおいて、組織の修復を増強させるため、およ
び疾患の進行を阻害するために用いることができる。
いて言及される各出願および特許、ならびに上記の各出願および特許において引用または
参照される各文献、ならびに各出願および特許といずれかの出願引用文献とにおいて引用
または言及されるあらゆる製品についてのあらゆる製造者の指示またはカタログは、参照
により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書において引用される全ての文献、本明
細書において引用される文献において引用または参照される全ての文献、および本明細書
において引用または言及されるあらゆる製品についてのあらゆる製造者の指示またはカタ
ログは、参照により本明細書に組み込まれる。
から逸脱することなく、当業者に明らかとなろう。本発明は、特定の好ましい実施形態に
関して記載されているが、特許請求の範囲に記載された発明が、このような特定の実施形
態に不当に限定されるべきではないことが理解されよう。実際、分子生物学または関連す
る分野の当業者に自明の、本発明を実施するための記載された態様の様々な修正は、本発
明の範囲内にあることが意図される。
Claims (12)
- NT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性を含むエキソソームの活性を検出するステップを含む、治療的活性を有するエキソソームを検出する方法。
- 前記NT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性が、表D6に示される1つまたは複数のタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記NT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性が、表D6に示される全てのタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記NT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性が検出される場合、前記エキソソームは、(i)補体介在性の細胞溶解を阻害し得るか、または(ii)心筋虚血および再かん流傷害のマウスモデルもしくはブタモデルにおいて測定されたとき、梗塞サイズを低減させ得るか、もしくは、過酸化水素(H2O2)誘発性の細胞死のインビトロアッセイにおいて測定されたとき、酸化ストレスを低減させ得るか、または(i)および(ii)の両方であり得る可能性が高い、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 治療的活性が心保護活性を含む、請求項4に記載の方法。
- 治療的活性が、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、変性疾患、がん、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚障害、皮膚病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚がん、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚のT細胞リンパ腫、潰瘍、線維症および機能喪失を含む慢性的な組織リモデリングをもたらす炎症および免疫異常調節を誘発する初期の傷害を特徴とする病的状態、腎臓虚血性傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎および鼻炎、または整形外科的疾患からなる群から選択される1つまたは複数の疾患に対するものである、請求項4に記載の方法。
- 前記変性疾患が、糖尿病、アルツハイマー病またはパーキンソン病である、請求項6に記載の方法。
- (a)分子量、サイズ、形状、組成、または生物学的活性に基づいて他の成分からエキソソームを分離することを含む、間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)からエキソソームを単離するステップと、(b)前記単離されたエキソソームにおいて請求項1に記載の活性を検出するステップとを含む方法。
- エキソソームを生産する方法であって、(a)間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)を得るステップと、(b)前記間葉系幹細胞馴化培地を濃縮するステップと、(c)前記濃縮された間葉系幹細胞馴化培地を、サイズ排除クロマトグラフィーにかけるステップと、(d)動的光散乱を示すUV吸光画分を選択するステップと、ここで、ステップ(d)が、11〜13分の保持時間で溶出する画分を回収するステップを含み、前記エキソソームにおける請求項1に記載の活性を検出するステップとを含む、方法。
- 前記(b)の濃縮が、>1000kDa膜での限外ろ過によるものである、請求項9に記載の方法。
- 前記(c)のサイズ排除クロマトグラフィーが、TSK GuardカラムSWXL、6×40mm(商標名)またはTSKゲルG4000 SWXL、7.8×300mmカラム(商標名)を使用するものである、請求項9に記載の方法。
- 前記(d)のUVが220nmであり、動的光散乱が準弾性光散乱(QELS)によって検出されるものである、請求項9に記載の方法。
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