KR20120081972A

KR20120081972A - 엑소좀에 기초한 암의 치료

Info

Publication number: KR20120081972A
Application number: KR1020127002892A
Authority: KR
Inventors: 수잔 가브리엘손
Original assignee: 아이티에이치 임뮨 세라피 홀딩스 에이비
Priority date: 2009-07-02
Filing date: 2010-07-02
Publication date: 2012-07-20
Also published as: JP2012531391A; IN2012DN00423A; RU2012103482A; BRPI1013957A2; CN107412755A; US8932855B2; EP2448595B1; CA2766833A1; IL217291A0; EP2448595A1; AU2010268367A1; CN102470167A; US20120183575A1; ZA201109226B; MX2011013452A; AU2010268367B2; WO2011000551A1

Abstract

환자의 암을 치료하는 방법은 엡스타인-바 바이러스에 감염된 환자로부터 수집한 B 세포들을 불멸화시키는 단계; 해당 세포들을 잠복기로 형질전환시키는 단계; 상기 세포들을 암 항원의 존재 하에 배양시키는 단계; 상기 세포들로부터 분비된 엑소좀을 수집하는 단계; 및 해당 엑소좀을 환자에게 투여하는 단계를 포함한다. 대안적으로, 상기 수집한 엑소좀에는 암 항원이 내포된다.

Description

엑소좀에 기초한 암의 치료{EXOSOME BASED TREATMENT OF CANCER}

본 발명은 예컨대 B-세포 혹은 수지상 세포(dendritic cell: DC)로부터 유래된 엑소좀의 사용에 의해 대상체에서 면역조절 반응을 일으키는 방법 및 수단에 관한 것이다. 본 발명에 따른 방법에 의하면, 엑소좀의 이용에 기초하여 환자의 암의 치료를 가능하게 한다. 특히, 본 발명은 엑소좀에 의해 환자의 암세포에 발현된 항원에 대한 면역 반응을 이끌어내는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 임의의 조직의 이식 동안 요법에 있어서 바람직할 수 있는 면역 반응을 억제하기 위하여 예컨대 B-세포에서 유래된 엑소좀의 사용에 관한 것이다.

해마다 수백만의 사람들이 암에 걸린다. 최근 수 십년 간에 걸쳐 암의 치료에 대한 상당한 진척이 행해지고 있었지만, 더 좋은 치료가 여전히 요구되고 있다.

당해 기술 분야에서, 암의 치료에 있어서 그 사용이 입증되거나 제시된 화학적 및 생물학적 제제들, 이들 중에서 인간 기원의 엑소좀들이 다수 있다.

엑소좀은 공자극성 분자들뿐만 아니라 항원을 담지(carry)할 수 있는 나노크기의 소포(vesicle)이다. 수지상 세포(DC)들은 포유류의 면역 체계에 관계되는 항원-처리 및 항원-제시 세포들이다. 항원에 의해 활성화된 상태에서, 이들은 B 세포 및 T 세포와 상호작용하여 그들의 적응성 면역 반응을 유발시킨다. 최근 십년 동안, 수지상 세포(DC) 유래 엑소좀은 악성 질환의 치료를 위하여 동물 모델 및 임상시험에서 테스트되어왔다. DC 유래 엑소좀은 시험관내(즉, 생체외) 및 생체 내에서 T 세포 활성화를 자극시켜, 쥐에서의 종양을 제거할 수 있다(Amigorena S, Anti - tumour immunotherapy using dendritic - cell - derived exosomes. Res Immunol 1998, 149(7-8): 661-662; Zitvogel L et al., Eradication of established murine tumors using a novel cell - free vaccine : dendritic cell - derived exosomes. Nat Med 1998, 4(5): 594-600). 상이한 세포 유형들이 그들의 기원 세포를 반영하는 표현형을 지니는 엑소좀을 생성한다(Johansson S M et al., Different types of in vitro generated human monocyte - derived dendritic cells release exosomes with distinct phenotypes. Immunology 2008, 123: 491-499. Segura, et al., Mature dendritic cells secrete exosomes with strong ability to induce antigen -specific effector immune responses. Blood Cells Mol Dis 2005, 35: 89-93). 현재의 도그마는, 수지상 세포 유래 엑소좀이 B 세포 유래 엑소좀에 비해서 바람직하다고 말하고 있는데, 그 이유는, 대응하는 세포인 수지상 세포가 B 세포에 비해서 천연형 T 세포를 자극시킴에 있어서 더욱 효율적이기 때문이다. 그러나, B 세포 엑소좀은 이와 관련하여 전혀 조사되지 않았다.

완전한 T 세포 반응을 일으킴에 있어서 B 세포의 역할이 제안된 바 있다(Ron Y and Sprent J, T cell priming in vivo : a major role for B cells in presenting antigen to T cells in lymph nodes. J Immunol 1987, 138(9): 2848-2856). 최근, Ding 등은 B 세포에 대한 항원의 표적화가 특정 T 세포 반응을 강화시켜 면역 내성(immune tolerance)을 파괴시킬 수 있는 것을 밝혔다(Ding C et al., Targeting of antigens to B cells augments antigen - specific T- cell responses and breaks immune tolerance to tumor - associated antigen MUCl. Blood 2008, 112(7): 2817-2825). 또, 새로운 데이터는 B 세포가 장기간 T 세포 면역성을 활성화시킴에 있어서 특히 중요하다는 것을 제시하고 있다(Whitmire J K et al., Requirement of B cells for Generating CD4 + T cell Memory. J Immunol 2009, 182(4): 1868-1876). 엑소좀이 B 세포 에피토프를 담지할 수 있고; B 세포 반응이 T 세포 증식을 위해 필요로 되고 있다(Quazi KR et al., Antigen loaded exosomes alone induce ThI type memory through a B- cell dependent mechanism. Blood 2009, 113:2673-2683). 엑소좀들이 그들 자체에 의해 T 세포들을 자극시킬 수 있는지의 여부(Admyre C et al., Direct exosome stimulation of peripheral human T cells detected by ELISPOT. Eur J Immunol 2006, 36: 1772-1781) 또는 다른 세포들이 중간체들로서 필요로 되는지의 여부(Vincent-Schneider H et al. Exosomes bearing HLA - DRl Molecules need dendritic cells to efficiently stimulate specific T cells, Int Immunol 2002, 14: 713-722)가 논의되고 있고, 항원 특이성이 엑소좀과 T 세포 간의 직접 상호작용에 영향을 미칠 수 있다(Johansson S M et al., in: Johansson S M, Exosomes - nano - vesicles in immune regulation. Thesis for doctoral degree 2008, Karolinska Instituted Stockholm, ISBN 978-91-7409-058-1).

보체 성분(complement component)(3d/엡스타인-바 바이러스(Epstein-Barr virus)) 수용체 2(CD21; 또한: CR2)는 그들의 활성 및 성숙과 관련된 B 세포의 표면 상에 있는 수용체이다.

엡스타인-바 바이러스(EBV)는 인간 림프친화 헤르페스 바이러스이다. EBV는, 1차 B 세포를 시험관 내에서 성장될 수 있는 림프아세포양 세포(lymphoblastoid cell)로 불멸화(immortalization)할 수 있다. CD21에 결합하는 EBV 당단백질 gp350은 B 세포에 대한 바이러스 유착(adhesion)을 위해 불가결하다(Young K A et al., Molecular basis of the interaction between complement receptor type 2 (CR2/CD21) and Epstein - Barr virus glycoprotein gp 350. J Virol 2008, 82: 11217-11227). EBV-형질전환된(transformed) B 세포로부터의 엑소좀은 T-세포 억제 활성을 지니는 EBV-코드화된 잠복성 막 단백질 1(latent membrane protein 1: LMP-1)을 담지하는 것으로 보고되어 있었다(Keryer-Bibens C et al., Exosomes released by EBV - infected nasopharyngeal carcinoma cells convey the viral latent membrane protein 1 and the immunomodulatory glycoprotein galectin 9. BMC Cancer 2006, 6: 283).

발명의 개요

본 발명의 발명자는 놀랍게도 EBV 형질전환된 B-세포가 엑소좀을 분비하고, 이는 구체적으로 단백질 gp350에 의해 매개된 천연형 B-세포의 CD21 수용체에 결합되어 있는 것을 발견하였다. 구체적으로, 그의 용해 단계에서 EBV를 내포하는 천연형 B-세포에 결합하는 엑소좀을 생산한다. 한편, 본 발명자는 인간의 수지상 세포 혹은 모유로부터의 엑소좀이 단핵구를 표적화하는 것을 발견하였다. 이와 같이 해서, 초기에 보고된 것과 대조적으로, 본 발명에 따른 엑소좀은 구체적으로 천연형 B-세포 혹은 단핵구를 표적화할 수 있고, 따라서 T-세포를 표적화할 수는 없다. 따라서, 본 발명의 방법에 따라 엑소좀을 생산함으로써, 엑소좀은 구체적으로 예컨대 천연형 B-세포의 CD21 수용체에 특이적으로 결합할 수 있는 단백질을 포함하고, 해당 엑소좀 내에 1종 이상의 항원을 더욱 혼입시킴으로써, 특정 면역 반응이 T-세포의 추가의 보충에 있어서 항원 제시 세포(antigen presenting cell; APC)로서 작용하는 천연형 B-세포와 상기 엑소좀을 접촉시키는 결과를 초래할 수 있다. 간단히 말하면, 본 발명에 따른 엑소좀은 천연형 B-세포 수용체에 연결되는 앵커(anchor)(단백질의 형태) 및 상기 천연형 B-세포로 이입(transfer)되는 항원을 포함하는 것임을 알 수 있다.

발명의 목적

본 발명의 목적은 엑소좀에 의해서 환자의 면역 체계를 활성화시킴으로써 환자의 암을 치료하는 방법을 제공한다.

특히, 본 발명의 목적은 B 세포에 자극 신호를 제공하도록 종양 항원을 표적화하는 것에 있다.

본 발명의 다른 중요한 목적은 환자의 암 치료를 위해 충분한 양으로 종양 항원-제시 엑소좀을 제공하는 것에 있다.

이와 같이 해서, 본 발명은 즉 예컨대 B-세포로부터 유래된 엑소좀에 관한 것으로, 여기서 엑소좀은 예컨대 B-세포 수용체에 결합할 수 있는 단백질을 담지하고 상기 엑소좀들은 또한 임의의 종류의 1종 이상의 항원을 담지한다.

또, 본 발명은 다른 B 세포, 수지상 세포, 단핵구 혹은 대식세포로부터 유래하는 엑소좀에 의해 B 세포를 표적화하는 방법에 관한 것으로, 여기서 엑소좀은 상기 표적화 B-세포에 결합한 후 면역 반응을 유발시킬 수 있는 항원 특성을 담지한다.

또한, 본 발명은 면역조절 혹은 종양 형성, 예컨대, 암에 있어서 그들의 기원을 지니는 질환의 치료에서 이용하기 위한 엑소좀에 관한 것으로, 감염, 알레르기, 자가면역 질환의 정황에서 더욱 유용할 수 있고 또한 예컨대 이식 동안의 요법에 더욱 유용하며, 여기서, 본 발명에 따른 엑소좀은 예컨대 종양 항원 등과 같은 1종 이상의 항원을 향하여 면역 반응을 유발하도록 유전공학적으로 조작될 수 있거나, 또는 대안적으로 본 발명에 따른 엑소좀은 이 예컨대 대상체의 면역 체계에 의해 거부된 이식된 조직을 지니는 것을 피하도록 이식의 정황에서 바람직한 바와 같은 면역 반응을 억제하도록 유전공학적으로 조작되어 있을 수 있다.

또한, 본 발명은 천연형 B-세포를 표적화하도록 설계된 엑소좀을 생산하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 추가의 목적은 본 발명의 이하의 개요, 다수의 도면에 의해 예시된 그의 상세한 설명 및 첨부된 특허청구범위로부터 명백해질 것이다.

도 1: 항-CD18 및 항-CD21에 의한 그리고 대응하는 동위원소 대조 항체에 의한 상호작용의 차단을 포함하는, 천연형 B 세포에 대한 EBV-형질전환된 B 세포 엑소좀(EBTB-exo) 및 버킷 림프종 세포주(Burkitt's lymphoma cell line: BJAB)의 엑소좀의 유착을 설명하는 그래프.
도 2a 및 도 2b: 1시간 및 4시간째에 유세포 분석법(flow cytometry)에 의해 PKH67⁺ 신호로서 측정된, 세 공여체(donor)로부터의 말초 혈액 단핵세포(peripheral blood mononuclear cell: PBMC) 중에서 엑소좀-양성 세포의 DC-엑소좀 퍼센트(PBMC에 대한 평균 +표준편차)를 나타낸 그래프.
도 3: 4시간째에 유세포 분석법에 의해 PKH67⁺ 신호로서 측정된, 세 공여체로부터의 말초 혈액 단핵세포(PBMC) 중에서 엑소좀-양성 세포의 EBV-엑소좀 퍼센트(PBMC에 대한 평균 +표준편차)를 나타낸 그래프;
도 4: PBMC에서의 엑소좀 표적 특이적 서브모집단(subpopulation)을 도시한 도면. PKH67 염색된, DC-엑소좀(A, D), LCL1-엑소좀(B, E) 및 모유-엑소좀(C, F)이 1시간(A 내지 C, n = 9) 및 4시간(D 내지 F, n = 8) 동안 건강한 혈액 공여체로부터의 PBMC를 이용해서 인큐베이션(incubation), 즉, 배양되었다. 5×10⁵ PBMC 당 10㎍의 엑소좀이 첨가되었다. 백그라운드 대조군으로서, 나란히 원심분리된 PKH67 염료 펠릿이 이용되었고, 이는 낮은 형광 내지 검출불가능한 형광을 보였다(데이터 표시 생략). 엑소좀의 연관은 4색 유세포 분석법에서 시료당 104 이벤트의 수집에 의해 측정되었다. 데이터는 각 서브모집단에서 세포로부터의 PKH67+ 세포 퍼센트로서 표현되었다. 바(bar)는 평균치를 나타낸다. 상이한 혈액 공여체는 개별의 심볼로 표시되어 있다.
도 5: 단핵구에 의해 엑소좀들이 주로 내재화된 반면 이들이 B 세포의 세포막에 대해 연관된다. PBMC는 PKH67 염색된, DC-엑소좀(A), LCL1-엑소좀(B) 및 모유-엑소좀(C)(5×10⁵ PBMC에 대해 10㎍의 엑소좀)으로 4시간 배양하고 나서, 적색으로 보이는 Alexa Fluor 546 표지화를 행하였다. 상기 세포들은 공초점 레이저 주사 현미경에 의해 분석되었다. 백그라운드 대조군으로서, 나란히 원심분리된 PKH67 염료 펠릿이 사용되었고, 이는 검출불가능한 형광을 보였다(데이터 표시생략). 스케일 바는 10㎛를 나타낸다. PBMC의 화상은 두 실험 중 대표적인 하나의 실험으로서 표시되어 있다. (D) ImageStream 분석은 HLA^-DR⁺CD14⁺ 세포가 주로 엑소좀을 내재화하는 것을 나타내고 있다. 일례로서, 4시간 후 HLA^-DR⁺CD14⁺ 세포와의 PKH67+ 모유 엑소좀(5×10⁵ PBMC에 대해서 10㎍의 엑소좀) 상호작용에 대한 히스토그램이 그려져 있다. 표면(<0), 또는 내부(>0) 엑소좀을 지니는 세포의 복합 화상, 즉, HLA-DR(분홍), CD14(오렌지) 및 PKH67+ 엑소좀(녹색)이 표시되어 있다. 10㎛에 대응하는 바는 왼쪽 하부의 화상에 도시되어 있다. 이 결과는 상이한 혈액 공여체를 이용한 두 실험 중 대표적인 하나의 실험으로서 표시되어 있다. 적어도 104회의 총 이벤트가 각 샘플에 대해서 수집되었다. (E)는 HLA^-DR⁺CD14⁺ 세포와 연관된 엑소좀의 퍼센트뿐만 아니라 내재화된 엑소좀을 지니는 이들 세포의 퍼센트를 표시하고 있으며, 이들은 삽입된 표에 표시된 바와 같이 내재화 특성(Internalization feature)에 의해 계산된다. 2000회의 이벤트가 내재화 특성으로 분석되었다.
도 6: LCL1-유래 엑소좀과 B 세포 간의 결합이 온도 의존성이다. PBMC는 37℃ 혹은 4℃에서 1시간 혹은 4시간 동안 DC, EBV 형질전환된 B 세포 혹은 모유로부터 PKH67 표지화된 엑소좀을 이용해서 배양하고, 도 1에 도시된 바와 같이 분석하였다. 도면에서의 바는 유세포 분석법에 의해 PKH67+ 신호로서 측정된 HLA-DR+ 세포의 각 서브모집단 내에서의 엑소좀-양성 세포의 퍼센트를 나타낸다. 세 상이한 공여체로부터의 PBMC에 대한 평균 및 표준편차가 표시되어 있다.
도 7: EBV 형질전환된 B 세포로부터 유래된 엑소좀과 B 세포 간의 상호작용은 CD21과 gp350 간의 상호작용에 의해 매개된다. PBMC 배양액은, LCL1-엑소좀(A) 혹은 BJAB-엑소좀(B)이 4시간 동안 첨가되기 전에, 항-CD21, 항-CD18 혹은 동종형-정합된 대조군(isotype-matched control)(20㎍/㎖)으로 처리되었다. (C) LCL1-엑소좀이 72A1 마우스 하이브리도마(전체 체적의 30%), 항-CD23(30㎍/㎖) 혹은 동종형-정합된 대조군으로부터 항-gp350 상청액(supernatant)으로 예비-배양되고, 이어서 정제된 B-세포에 4시간 동안 첨가되었다. 개수 퍼센트를 포함하는 대표적인 유세포 분석 도트플롯은 동종형 대조군(상부)으로 혹은 항-gp350 mAb(단클론성 항체)(하부)로 처리된 B 세포와의 LCL1-엑소좀 연관을 도시하고 있다. 분석은 도 1에 기재된 바와 같이 수행되었다. 세 상이한 공여체로부터의 PBMC에 대한 평균 및 표준편차가 (A) 내지 (C)에 도시되어 있다. (D) 유세포 분석 히스토그램은 BJAB 세포(회색)를 LCL1 세포(흑색 선)와 비교해서, gp350의 세포외- 및 세포내- 발현을 도시하고 있다. 1만개의 세포가 분석되었다. (E) LCL1-엑소좀 및 BJAB-엑소좀 제제로부터의 수크로스 구배(sucrose gradient) 분획의 펠릿이 LMPl, gp350, CD81 및 HLA-DR(하부 패널)에 대한 항체들(Abs)을 이용한 면역블롯(immunoblot)에 의해 분석되었고, 각 분획의 밀도가 굴절률 측정에 의해 구해졌으며, 세 실험 중 대표적인 하나의 실험이 표시되어 있다.
도 8: 엑소좀 신호는 바이리온(virion)으로부터가 아니라 엑소좀으로부터 유래된다. (A) 엑소좀 제제에서의 감염성 EBV의 존재를 연구하기 위하여, BJAB 및 LCL1 상청액(상청액: SN)으로부터 엑소좀 제제(100,000×g)뿐만 아니라 10,000×g 펠릿이 제대혈 단핵세포(cord blood mononuclear cell: CBMC)에 첨가되고, LCL의 증식물이 33일 후 3H-티미딘 혼입에 의해 모니터링되었다. EBV-생산 B95-8 세포로부터의 상청액은 양성 대조군으로서 역할하였고, 세포 배지 단독은 음성 대조군으로서 역할하였다. 3가지 다른 BJAB 및 LCL1 상청액 제제로부터의 10,000×g 펠릿이 하나의 CBMC 공여체에서 시험되었다. 5가지 상이한 BJAB 및 LCL1 엑소좀 제제가 평균값으로서 표시된 5개의 상이한 CBMC 공여체에서 시험되었다. (B) 세포 표면에 연관된 엑소좀의 대표적인 화상을 표시하고 있다. (C) TEM 화상은 음성 염색함으로써 처리된 LCL1 엑소좀 제제를 표시하고 있다. (B) 및 (C)에서의 화살표는 엑소좀을 나타낸다. (D) 면역 EM에 있어서, CD63(화살표 1) 및 HLA-DR(화살표 2)에 대한 단클론성 항체들(mAbs)이 LCL1 엑소좀 제제에 첨가되었고, 금-컨쥬게이트된 2차 항체에 의해 각각 10㎚ 및 15㎚에서 검출되었다. (E) LCL1-엑소좀, BJAB-엑소좀 및 EBV로부터의 제제에서의 입자크기분포의 나노사이트(NanoSight) 측정결과. 데이터는 평균값(n=3)으로서 표시되어 있고, 크기-비교를 위하여 1로 정규화되어 있다.
도 9: OVA 펄스화된(plused) 골수 DC 배양액의 상청액으로부터 엑소좀(OVAExo)을 제조하였다. OVAExo 상에 C3d를 연결하기 위하여, 링커 BS3을 C3d에 혼합하고 나서, 30분 동안 배양하였다. 미반응 시약을 겔 여과에 의해 제거하고, C3d를 함유하는 용리액을 엑소좀(C3dOVAExo)에 첨가하였다. 반응은 글라이신을 이용해서 안정화시켰다. C3d 연결된 Ova 엑소좀을 항-CD9 라텍스 비드를 이용해서 하룻밤 배양하였다. 이어서 엑소좀을 각각 PE 혹은 FITC에 컨쥬게이트된 (A) 항-MHC 제II급(class II) 혹은 (B) 항 C3d 항체로 표지화하고, FACS에 의해 분석하였다.
도 10: OVA 펄스화된 골수 DC 배양액의 상청액으로부터 엑소좀(OVAExo)을 제조하였다. OVAExo 상에 C3d를 연결하기 위하여, 링커 BS3을 C3d와 혼합하고 나서 30분간 배양하였다. 미반응 시약을 겔 여과에 의해 제거하고, C3d를 함유하는 용리액을 엑소좀(C3dOVAExo)에 첨가하였다. 반응은 글라이신을 이용해서 안정화시켰다. 생체외 증식 평가를 위하여, OVA TCR 유전자도입(transgenic) 비장세포(DO11.10)를 cfse로 표지화하고, 5일 동안 37℃에서 OVAExo 혹은 C3dOVAExo로 공-배양하였다. 증식 세포 내의 cfse 희석액이 유세포 분석법에 의해 분석하였다.
그 결과가 총 비장 세포의 세포 증식%로서 표시되어 있다.
도 11: OVA 펄스화된 골수 DC 배양액의 상청액으로부터 엑소좀(OVAExo)을 제조하였다. OVAExo 상에 C3d를 연결하기 위하여, 링커 BS3을 C3d와 혼합하고 나서 30분간 배양하였다. 미반응 시약을 겔 여과에 의해 제거하고, C3d를 함유하는 용리액을 엑소좀에 첨가하였다. 반응은 글라이신을 이용해서 안정화시켰다.
OVAexo 혹은 C3dOVAExo 25㎎을 BALB/c 마우스에 주입하고, 3일 후 FACS에 의해 비장세포를 분석하였다.
도 12: OVAExo 상에 C3d를 연결하기 위하여, 링커 BS3을 C3d와 혼합하고 나서 30분간 배양하였다. 미반응 시약을 겔 여과에 의해 제거하고, C3d를 함유하는 용리액을 엑소좀에 첨가하였다. 반응은 글라이신을 이용해서 안정화시켰다.
DO11.10 OVA 유전자도입 비장세포를 BALB/c 마우스에 적절하게 이입시키고 나서, 그 다음날 OVAexo 혹은 C3dOVAExo 25㎎을 주입하고, 3일 후 FACS에 의해 비장세포를 분석하였다.
도 13: CFSE 표지화된 OT-I 비장 세포가 야생형 C57BL/6 마우스에 이입되고 나서 다음날 OVA가 간접 내포된(indirect loaded) 엑소좀(Exo-OVA), 혹은 CD8 OVA 펩타이드가 직접 내포된 엑소좀(Exo-SIIN), 또는 대조군(Exo-BSA)이 주입되었다. 5일 후 OVA 특이적 CD8+ 세포의 증식을 위하여 FACS에 의한 CFSE 희석액에 대해 비장 세포가 분석되었다.
도 14: 도 14A는 마우스에서의 면역화 스케쥴을 예시한 것으로, 여기서 T-세포가 마우스 내로 주입되고, 그 1일 후 엑소좀이 투여되고, 면역 반응 후 4일째에 측정된다. 도 14B는 직접 내포된 엑소좀(Pep-Exo), 간접 내포된 엑소좀(OVA-exo), 미내포된 엑소좀(Exo)을 이용한 면역 반응을 도시하고 있다. PBS는 백그라운드이고, KJ1-26은 구체적으로 DOll.l0tg TCR을 특이적으로 인식하는 모노클로널 항체이다.

B-세포를 표적화하는 엑소좀을 생산하는 방법

본 발명은 B-세포를 표적화하는 특정 면역 조절용 엑소좀을 생산하는 방법을 제공하되, 이 방법은

(i) B-세포를 엡스타인-바 바이러스에 감염시키는 것과 같은 적절한 수법에 의해 B 세포를 잠복기로 형질전환(transform)시킴으로써 천연형 B-세포 수용체에 결합할 수 있는 하나 이상의 부분(moiety)을 발현시키는 단계;

(ii) 상기 (i) 단계에서의 형질전환된 B-세포를 배양시키는 단계; 및

(iii) 상기 (ii) 단계에서의 상기 형질전환된 B-세포로부터 방출된 엑소좀을 수집하는 단계를 포함하되,

상기 엑소좀은 천연형 B-세포에 결합할 수 있는 하나 이상의 부분을 포함하고, 해당 엑소좀에는 1종 이상의 항원 및/또는 면역억제제가 직접 및/또는 간접 내포된다.

위에서 나타낸 바와 같이, 상기 엑소좀에는, 상기 (ii) 단계에서의 형질전환된 B-세포를 예컨대 1종 이상의 항원과 공-배양(co-culturing)함으로써 1종 이상의 항원이 내포될 수 있다(간접 내포). 한편, 상기 방법에 의하면, 예컨대, 상기 (iii) 단계에서의 엑소좀을 수집한 후, 해당 수집된 엑소좀을 예컨대 1종 이상의 항원에 대해서 수행되는는 바와 같이, 해당 엑소좀의 직접 내포도 가능하게 한다. 직접 내포는 펩타이드 혹은 펩타이드 단편, 예컨대, 8 내지 12개의 아미노산 잔기 혹은 15 내지 24개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 단편 등과 같은 단백질 단편을 이용해서 통상 수행된다. 대안적으로, 상기 (ii) 단계에서의 간접 내포를 생략하면, (iv) 단계에서의 내포를 필요로 한다. 직접 내포는 엑소좀에 의한 1종 이상의 항원의 흡수(intake)를 촉진시키는 조건 하에 EBTB 엑소좀 혹은 DC 엑소좀을 임의의 항원(서로 독립적으로 임의의 종류의 1종 이상의 항원)과 접촉시키는 것을 포함한다. 이것은 예컨대 pH의 변이(shift)를 포함하는 조건 하일 수 있다. 이것은 적어도 pH 5, 바람직하게는 약 pH 5.2의 적절한 매체(medium)(혹은 배지, 본 명세서에서 있어서 "매체"란 "배지"를 지칭할 경우가 있음) 중에서 4℃에서 엑소좀을 현탁시킴으로써 실현될 수 있다. 펩타이드 단편을 첨가하고 나서 예컨대 TRIS-버퍼 등과 같은 완충액을 첨가하는 것은 pH를 약 pH 7.0으로 상승시킴으로써, 펩타이드 단편을 엑소좀에 혼입시킨다. 또한, pH의 변경을 필요로 하는 일 없이 직접 내포하는 기술도 있다. 그러나, 직접 내포 기술과 간접 내포 기술의 양쪽 모두를 이용하는 다수의 내포 방법이 채용될 수 있음이 상정된다. 본 발명자는 간접 내포가 특히 효과적인 것을 발견하였다.

1종 이상의 항원은 내인성/자가성(대상체 자체로부터 기인됨) 또는 외인성/동종성(다른 대상체로부터 기인됨)일 수 있거나, 또는 더 많은 항원이 엑소좀 내로/상으로 내포될 경우에는, 해당 항원은 자가성/동종성 항원들의 임의의 혼합체일 수 있다. 바람직하게는, 항원은 자가성이다. 또한, 상기 1종 이상의 항원은 예컨대 바이러스 또는 박테리아 등과 같은 임의의 기원을 지닐 수 있거나, 또는 종양 항원일 수 있고, 또한 면역자극성 혹은 면역억제성 혹은 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 방법은 엑소좀이 예컨대 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus: CMV)에 대한 항원 및 면역억제 항원을 포함할 수 있도록 1종 이상의 상이한 항원의 혼입을 허용하는 것도 상정된다. 따라서, 본 발명에 따른 엑소좀은 임의의 종류 혹은 기원의 1종 이상의 항원, 예컨대 2종 이상의 상이한 항원, 예컨대 3종 이상의 상이한 항원, 예컨대 4종 이상의 상이한 항원, 예컨대 5종 이상의 상이한 항원 또는 예컨대 6종 이상의 상이한 항원을 포함할 수 있고, 그러므로, 1종 이상의 면역자극 항원과 1종 이상의 면역억제제와의 조합일 수 있다.

또한, 본 발명에 따른 엑소좀은 유전공학적으로 조작되어, 임의의 항원(예컨대 바이러스)을 포함하여 B-세포를 백신(예컨대 바이러스 백신)으로서 사용되게끔 표적화될 수 있는 것도 상정된다. 또, 본 발명에 따른 엑소좀은 자가면역 질환, 알레르기의 정황에서, 혹은 임의의 종류의 이식을 받아 면역 반응을 일으켜 이식된 조직이 거부될 수 있는 위험이 있는 대상체를 치료하는 정황에서 이용될 수 있는 것도 상정된다. 이 양상은 엑소좀에 면역억제제를 혼입시킴으로써 실현될 수 있다.

위에서 나타낸 바와 같이, 분비된 엑소좀은 직접 및/또는 간접 내포에 의해 1종 이상의 항원 혹은 1종 이상 면역억제제 또는 이들의 임의의 조합과 함께 내포될 수 있다. 그러나, 항원 부분은 B에 화학적으로 연결될 수 있다. B-세포 결합 단백질 혹은 리간드의 화학적 연결은 단백질 또는 리간드를 예컨대 BS3(Bis-(sulfo-succinimidyl)-suberate), DSS(Disuccinimidyl suberate), DSG(Disuccinimidyl glutarate) 등과 같은 링커와 반응시킴으로써 실현될 수 있다. 링커가 예컨대 2개의 결합점을 지니는 2작용성이므로, 링커에 결합되는 단백질 또는 리간드는 이어서 더욱 반응하여 링커를 엑소좀에 결합시킴으로써 링커 분자를 개재해서 엑소좀에 결합된 단백질 또는 리간드를 지니게 된다.

면역억제가 예컨대, LMP-1, CTLA-4, PD1 또는 그의 임의의 혼합물 등과 같은 소망의 면역억제제인 경우에, 엑소좀 내로 혼입될 수 있다. 그러나, 면역억제제로서 작용할 수 있는 임의의 제제가 본 발명에 따라 이용될 수 있음은 명확히 이해할 필요가 있다.

본 발명의 다른 양상들 하에 언급되고 설명되는 상세 및 특정 사항들은 본 양상을 준용하여 적용된다.

B-세포는 예컨대 엡스타인-바 바이러스(EBV)에 의해 형질전환됨으로써 단백질 gp350을 발현할 수 있다. 그러나, 형질전환은 또한 당업계에 충분히 공지된 기타 기술에 의해 수행되어 형질전환된 B-세포가 천연형 B-세포 수용체에 결합할 수 있는 임의의 단백질을 발현시킬 수 있게 한다. 이러한 수용체는 예컨대 CD19, CD21, CD20, CD23, CD79, BAFF-R, TACI, BCMA 또는 IFN-R일 수 있다. 이러한 B-세포 수용체에 결합하는 적절한 리간드는 예컨대 BAFF, APRIL, gp350, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d 또는 IFN-알파일 수 있지만, B-세포 수용체에 결합할 수 있는 임의의 리간드는 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 결과적으로, B-세포로부터 분비된 엑소좀은 형질전환된 B-세포가 발현하는 것과 동일한 천연형 B-세포에 결합할 수 있는 부분을 발현하도록 유전공학적으로 조작될 수 있다. 본 발명의 발명자는 놀랍게도 B-세포가 EBV 발현 gp350로 감염되는 것을 발견하였다.

형질전환된 B-세포들의 배양 조건은 세포의 발현에 대한 당해 기술분야에서 잘 알려진 절차에 따를 수 있다.

예를 들어, B 세포는 적절한 매체, 즉, 배지, 예컨대, 예컨대 MEM, DMEM 혹은 완전한 RPMI 1640 배지(Invitrogen, 미국 캘리포니아주의 칼즈배드시에 소재)에서 배양될 수 있다. 이 배지는 10% 엑소좀-결핍 소 태아 혈청, 100 IU/㎖ 페니실린 스트렙토마이신, 2mM L-글루타민, 50μM β-머캅토에탄올 및 25 ug 젠타마이신 또는 이들의 임의의 조합으로 보충될 수 있다. (B-세포 이외에) 예컨대 MDDC(단핵세포 유래 수지상 세포: monocyte-derived DC) 혹은 BMDC(골수 유래 수지상 세포: marrow-derived DC)와 같은 다른 세포 유형이 배양에 이용된다면, 예컨대 GM-CSF와 같은 성장 인자가 첨가될 수 있고, IL-4가 전술한 바와 같이 배지에 부가적으로 이용될 수 있다. 배양은 5% CO₂를 지니는 가습 인큐베이터에서 37℃에서 인큐베이션 동안 6일간 통상 행해지지만, CO₂-없는 조건 동안 그리고 예컨대 약 2일, 예컨대 약 3일, 예컨대 약 4일의 보다 짧은 기간 동안 행해질 수도 있다.

형질전환된 B 세포를 배양하고 엑소좀 제조를 위한 상청액을 수집하기 위하여, 세포는 예컨대 약 48시간, 약 72시간 혹은 약 96시간 동안 배양될 수 있다. MDDC 혹은 BMDC 배양액에 대해서, 배양은 예컨대 6일 동안 수행되어, 미성숙(immature) DC를 얻은 후 또 48시간 계속되어 엑소좀 제조를 위한 상청액을 수집한다. BMDC 상에 내포되는 항원에 대해서 6일째에 세포를 하룻밤 항원에 펄스화/노출시키고 나서 세척하고 5일 동안 5% CO₂를 지니는 가습 인큐베이터 내에서 37℃에서 48시간 배양한다.

이상은 안내 지침이므로 배양 세포에 대한 당업계에 공지된 방법 내에서 변경될 수 있음은 이해될 것이다.

구체예로는 예컨대 EBV-형질전환된 B-세포주가 25㎍/㎖ 젠타마이신(Gibco), 10% 가열-불활성화된 소 태아 혈청(Hyclone, 유타주의 로간시에 소재), 2 mmol/ℓ L-글루타민, 100 IU/㎖ 페니실린(Gibco), 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(Gibco) 및 50μmol/ℓ β-머캅토에탄올(KEBO-lab, 스웨덴 스팡가시에 소재)가 보충된 RPMI-1640(Gibco; Invitrogen Corp, 영국 페이즐리시에 소재)으로 이루어진 완전 배지에서 배양될 수 있다. 이 배지는 엑소좀-결핍되어 있었다. 세포는 6% CO₂를 지니는 37℃ 가습된 인큐베이터에서 배양될 수 있다.

MDDC는 제조사의 지시의 따라서 피콜 페이크(Ficoll Paque)(Amersham Pharmacia Biotech AB, 스웨덴 웁살라시 소재) 상에서의 원심분리에 의해 단리된 말초 혈액 단핵세포(PBMC)를 배양한다. 그 후, 세포는 인산염-완충 식염수(phosphate-buffered saline: PBS)에서 세척하고, PBS, 0.5% 소 혈청 알부민(bovine serum albumin: BSA) 및 2mM 에틸렌다이아민테트라아세트산(ethylenediaminetetraacetic acid: EDTA)을 함유하는 세포 분류 완충액 중에 재현탁시키고 나서, 자동 매트릭스 보조형 세포 분류기(AutoMACS; Miltenyi Biotech)를 이용해서 단핵구의 적극적인 선택을 위하여 항-CD14 자성 비드(Miltenyi Biotech, 독일 베르키슈 글라트바흐시에 소재)로 표지화하였다. CD14+ 순도는 82% 내지 99%(평균 94%; n = 29) 범위였다. 단핵구 세포 배양액은 10% 엑소좀-결핍 소 태아 혈청(FCS; HyClone), 2mM I-글루타민(Gibco, 영국 페이즐리시에 소재), 100㎍/㎖ 스트렙토마이신(Gibco), 25㎍/㎖ 젠타마이신(Gibco), 50㎛ 2-β-머캅토에탄올(Sigma Chemical Company, 미조리주의 세인트 루이스시에 소재) 및 100 IU/㎖ 페니실린(Gibco)을 지닌 RPMI 1640(HyClone, 유타주의 로간시에 소재), 800 U/㎖ 재조합 인간(recombinant human: rh) IL-4(BioSource International, 캘리포니아주의 카마릴로시에 소재) 및 550 U/㎖ rhGM-CSF(BioSource International)를 함유하는 완전 배지에서 3일째 재공급하면서 배양 플라스크(Costar, 영국 캠브리지시 소재) 내에서 4×10⁵ 세포/㎖의 농도에서 셋업하였다. 6일째에, 보충물을 지닌 신선한 배지에 세포를 다시 파종하고 세포 밀도를 두 조건에 대해서 동일한 값으로 조정하였다. 트리판 블루 배제(trypan blue exclusion)에 의해 배양의 6일째에 세포 생존성을 구하였다. 배양 상청액을 8일째에 회수하고, 실온에서 20분간 3000g에서 원심분리 후 -80℃에서 보존하였다. 세포를 수집하여, 8일째에 유세포 분석법에 의해 표현형을 분석하였다.

BMDC 배양을 위하여: 골수 세포를 10 ng/㎖ 인터루킨-4(IL-4; Invitrogen) 및 10% 과립구 대식세포 콜로니-자극 인자 조절된 배지(Ag8653/X63 클론)의 존재 하에 완전 RPMI 1640 배지(Invitrogen, 캘리포니아주의 칼즈배드시에 소재; 10% 엑소좀-결핍 소 태아 혈청, 1mM 피루브산 나트륨, 100 IU/㎖ 페니실린 스트렙토마이신, 200mM L-글루타민, 50 μM β-머캅토에탄올)에서 배양하였다. 6일째에, 배양 상청액의 50%를 새로운 배지로 교체하고, 상청액을 48시간 후에 수집하였다.

세포는 예컨대 적어도 2일, 예컨대 적어도 3일, 예컨대 적어도 4일, 예컨대 적어도 5일, 예컨대 적어도 6일, 예컨대 적어도 7일, 예컨대 적어도 2주, 예컨대 적어도 3주, 예컨대 적어도 1개월, 예컨대 적어도 2개월, 예컨대 적어도 3개월, 예컨대 적어도 4개월, 예컨대 적어도 5개월 또는 예컨대 적어도 6개월의 기간 동안 배양될 수 있다.

본 발명에 따른 방법들에 의하면 엑소좀을 보다 높은 수득량으로 얻을 수 있어, 효과적인 치료를 가능하게 한다. 이러한 높은 수득량은 EBV-형질전환된 B-세포에서 특히 관찰된다. 세포 배양액의 상청액은 예컨대 2일마다, 예컨대 3일마다, 예컨대 4일마다, 예컨대 5일마다, 예컨대 6일마다 또는 예컨대 7일마다 수집될 수 있고, 적어도 예컨대 1개월, 예컨대 적어도 2개월, 예컨대 적어도 3개월, 예컨대 적어도 4개월, 예컨대 적어도 5개월 또는 예컨대 적어도 6개월의 기간 동안 상기 간격의 어느 하나 동안 수집될 수 있다.

본 발명에 따른 방법을 이용하는 엑소좀의 수득량은, 예를 들어 EBTB 세포의 배양이 약 48시간의 기간 동안, 예컨대 적어도 약 0.2㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.3㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.4㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.5㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.6㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.7㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.8㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.9㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 1.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 1.5㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 2.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 2.5㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 적어도 예컨대 약 3.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 5.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포 또는 예컨대 적어도 약 10.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포일 수 있다. 본 발명의 발명자는 B-세포의 EBV 형질전환에 의해, 보다 높은 수득량의 엑소좀이 관찰되며, 이는 예컨대 수지상 세포가 이용되고 동일 기간 동안 배양될 경우 통상 0.1㎍ 엑소좀/1백만 세포의 범위인 것을 확인하였다.

엑소좀의 의도된 목적 혹은 용도에 따라서, 적절한 항원이 채택되고, 즉, 예컨대 암의 치료의 정황에서 이용하기 위해 의도된 엑소좀의 경우, 1종 이상의 암 항원이 엑소좀에 혼입될 수 있는 것임을 명확히 이해할 필요가 있다. 엑소좀의 의도된 목적에 따라 예컨대 알레르기의 치료의 정황에서 1종 이상의 면역억제제가 엑소좀과 혼입되어 당해 당해 알레르기 반응을 억제시킬 필요가 있다. 이것은 예컨대 이식의 개념을 준용하여 적용한다. 또, 1종 이상의 항원이 예컨대 의도된 목적 혹은 필요에 따라서 1종 이상의 추가의 항원 또는 1종 이상의 면역억제제와 배합될 수 있는 것도 상정되는 것은 명백히 이해될 것이다.

엑소좀의 수집은 예컨대 초원심분리 혹은 분별 원심분리 혹은 이들의 임의의 조합에 의해 행해질 수 있고, 이어서 펠릿화된 엑소좀의 수집이 행해질 수 있다. 펠릿화된 엑소좀은 또한 적절한 매체, 예컨대, PBS로 세척될 수 있고, 그 후 임의선택적으로 적절한 매체 중에 재현되고 나서, 원심분리, 엑소좀의 펠릿화 및 예컨대 PBS에 의한 세척의 전체 사이클은 엑소좀의 허용가능한 순도에 도달할 때까지 반복될 수 있다.

본 발명이 예컨대 수지상 세포 혹은 난포성 수지상 세포(follicular dendritic cell: FDC) 등과 같은 다른 세포 유형을 준용하여 적용될 수 있음을 명확하게 이해할 필요가 있다.

치료방법

본 발명은 또한 질환의 치료에 이용하기 위한 엑소좀에 관한 것으로, 여기서 엑소좀은 천연형 B-세포를 표적화하고 있으며, 그 치료방법은

(i) 예컨대, 혈액 시료 등과 같은 대상체로부터 생물학적 시료(biological sample)를 획득하는 단계;

(ii) 상기 (i) 단계에서의 상기 시료로부터 B-세포를 수집하는 단계;

(iii) 상기 (ii) 단계에서 회수된 B-세포를, 예컨대 바이러스 등과 같은 적절한 수단에 의해 형질전환시켜, 해당 B-세포가 천연형 B-세포 수용체에 결합할 수 있는 단백질 또는 리간드를 발현시키도록 하는 단계;

(iv) 형질전환된 상기 B-세포를 배양하는 단계;

(v) 상기 (iv) 단계에서의 형질전환된 B-세포로부터 분비된 엑소좀을 수집하는 단계; 및

(vi) 상기 (v) 단계에서의 엑소좀을 상기 대상체 내로 도로 이입시키는 단계를 포함하되,

상기 엑소좀에는 1종 이상의 항원 및/또는 면역억제제가 직접 내포 및/또는 간접 내포된다.

형질전환될 B-세포를 수집하기 위하여 대상체로부터 수집된 시료는 말초 혈액 등과 같은 혈액 시료일 수 있거나, 또는 골수 시료 혹은 대상체의 림프계통으로부터 채취된 시료 혹은 이들의 임의의 조합물 혹은 혼합물일 수 있다.

위에서 나타낸 바와 같이, 엑소좀에는 상기 (iv) 단계에서의 형질전환된 B-세포를 공-배양함으로써 1종 이상의 항원이 내포될 수 있다(간접 내포). 한편, 상기 방법은 엑소좀의 직접 내포를 허용하며, 즉, (v) 단계에서의 엑소좀의 수집 후, 환자 내로 도로 이입되기 전에 상기 수집된 엑소좀이 예컨대 1종 이상의 항원에 대해 실시된다. 직접 내포는 통상 단백질의 단편, 펩타이드 혹은 펩타이드 단편, 예컨대 8 내지 12개의 아미노산 잔기 혹은 15 내지 24개의 아미노산 잔기를 포함하는 펩타이드 단편을 이용해서 수행된다. 대안적으로, 상기 (ii) 단계에서의 간접 내포를 생략한다면, (iv) 단계에서의 내포를 필요로 한다. 직접 내포는 엑소좀에 의한 1종 이상의 항원의 흡수를 촉진시키는 조건 하에 EBTB 엑소좀 혹은 DC 엑소좀을 임의의 항원(서로 독립적으로 임의의 종류의 1종 이상의 항원)과 접촉시키는 것을 포함한다. 이것은 예컨대 pH의 변이를 포함하는 조건 하일 수 있다. 이것은 적어도 pH 5, 바람직하게는 약 pH 5.2의 pH의 적절한 매체 중에서 4℃에서 엑소좀을 현탁시킴으로써 실현될 수 있다. 펩타이드 단편을 첨가하고 나서 예컨대 TRIS-버퍼 등과 같은 완충액을 첨가하는 것은 pH를 약 pH 7.0으로 상승시킴으로써, 펩타이드 단편을 엑소좀에 혼입시킨다. 또한, pH의 변경을 필요로 하는 일 없이 직접 내포하는 기술도 있다. 그러나, 직접 내포 기술과 간접 내포 기술의 양쪽 모두를 이용하는 다수의 내포 방법이 채용될 수 있음이 상정된다.

1종 이상의 항원은 내인성/자가성(대상체 자체로부터 기인됨) 또는 외인성/동종성(다른 대상체로부터 기인됨)일 수 있거나, 또는 1종 이상의 항원이 엑소좀 내로/상으로 내포될 경우에는, 해당 항원은 자가성/동종성 항원들의 임의의 혼합체일 수 있다. 바람직하게는 항원은 자가성이다. 또한, 상기 1종 이상의 항원은 예컨대 바이러스 또는 박테리아 등과 같은 임의의 기원을 지닐 수 있거나, 또는 종양 항원일 수 있고, 또한 면역자극성 혹은 면역억제성 혹은 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 방법은 엑소좀이 예컨대 사이토메갈로바이러스에 대한 항원 및 면역억제 항원을 포함할 수 있도록 1종 이상의 상이한 항원의 혼입을 허용하는 것도 상정된다. 따라서, 본 발명에 따른 엑소좀은 임의의 종류 혹은 기원의 1종 이상의 항원, 예컨대 2종 이상의 상이한 항원, 예컨대 3종 이상의 상이한 항원, 예컨대 4종 이상의 상이한 항원, 예컨대 5종 이상의 상이한 항원 또는 예컨대 6종 이상의 상이한 항원을 포함할 수 있고, 그러므로, 1종 이상의 면역자극 항원과 1종 이상의 면역억제제와의 조합일 수 있다.

위에서 나타낸 바와 같이, 분비된 엑소좀은 직접 및/또는 간접 내포에 의해 1종 이상의 항원 혹은 1종 이상 면역억제제 또는 이들의 임의의 조합과 함께 내포될 수 있다. 그러나, 항원 부분은 B에 화학적으로 연결될 수 있다. B-세포 결합 단백질 혹은 리간드의 화학적 연결은 단백질 또는 리간드를 예컨대 BS3, DSS, DSG 등과 같은 링커와 반응시킴으로써 실현될 수 있다. 링커가 예컨대 2개의 결합점을 지니는 2작용성이므로, 링커에 결합되는 단백질 또는 리간드는 이어서 더욱 반응하여 링커를 엑소좀에 결합시킴으로써 링커 분자를 개재해서 엑소좀에 결합된 단백질 또는 리간드를 지니게 된다.

B-세포는 예컨대 엡스타인-바 바이러스(EBV)에 의해 형질전환되어 단백질 gp350을 발현할 수 있다. 그러나, 형질전환은 또한 당업계에 충분히 공지된 기타 기술에 의해 수행되어 형질전환된 B-세포가 천연형 B-세포 수용체에 결합할 수 있는 임의의 단백질을 발현시킬 수 있게 할 수 있다. 이러한 수용체는 예컨대 CD19, CD21, CD20, CD23, CD79, BAFF-R, TACI, BCMA 또는 IFN-R일 수 있다. 이러한 B-세포 수용체에 결합하는 적절한 리간드는 예컨대 BAFF, APRIL, gp350, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d, IFN-알파일 수 있지만, B-세포 수용체에 결합할 수 있는 임의의 리간드도 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 따라서, B-세포로부터 분비된 엑소좀은 이와 같이 해서 형질전환된 B-세포가 발현하는 것과 동일한 천연형 B-세포에 결합할 수 있는 부분을 발현하도록 유전공학적으로 조작될 수 있다. 본 발명의 발명자는 놀랍게도 B-세포가 EBV 발현 gp350에 감염된 것을 발견하였다.

형질전환된 B-세포의 배양 조건은 세포의 팽창에 대한 당해 기술분야에서 충분히 공지된 절차에 따를 수 있다. 세포는 예컨대 적어도 2일, 예컨대 적어도 3일, 예컨대 적어도 4일, 예컨대 적어도 5일, 예컨대 적어도 6일, 예컨대 적어도 7일, 예컨대 적어도 2주, 예컨대 적어도 3주, 예컨대 적어도 1개월, 예컨대 적어도 2개월, 예컨대 적어도 3개월, 예컨대 적어도 4개월, 예컨대 적어도 5개월, 예컨대 적어도 6개월 등과 같은 기간 동안 배양될 수 있다.

본 발명에 따른 방법을 이용하는 엑소좀의 수득량은, EBTB 세포의 배양의 예컨대 48시간의 기간 동안, 예컨대 적어도 약 0.2㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.3㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.4㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.5㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.6㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.7㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.8㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.9㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 1.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 1.5㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 2.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 2.5㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 적어도 예컨대 약 3.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 5.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포 또는 예컨대 적어도 약 10.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포일 수 있다. 본 발명의 발명자는, B-세포의 EBV 형질전환에 의해, 보다 높은 수득량의 엑소좀이 얻어지고, 이는 예컨대 수지상 세포가 사용되고 동일한 기간 동안 배양된 경우 통상 0.1㎍ 엑소좀/1백만 세포의 범위 내인 것을 확인하였다.

본 발명의 모든 양상이 예컨대 수지상 세포 혹은 난포성 수지상 세포(FDC) 등과 같은 다른 세포 유형을 준용하여 적용될 수 있음을 명확하게 이해할 필요가 있다.

엑소좀의 투여 방식은 예컨대 비경구 투여 등과 같은 당업계에 공지된 각종 형태일 수 있고, 따라서 정맥내, 동맥내, 골내 경막내, 피부내 혹은 복강내 투여일 수 있다.

대상체 내의 효과적인 면역 반응을 위해 요구되는 엑소좀의 충분한 용량은 예컨대 적어도 0.1 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 0.2 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 0.3 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 0.4 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 0.5 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 0.75 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 0.9 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 1.0 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 3.0 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 5.0 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 7.0 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 10.0 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 15.0 ㎎/㎏일 수 있다.

엑소좀은 약 1시간, 예컨대 약 2시간, 예컨대 4시간, 예컨대 6시간의 기간 동안 예컨대 정맥내 주입으로서 투여될 수 있다. 대안적으로, 엑소좀은 약 20초, 약 30초, 약 40초, 약 1분 등의 시간 기간에 주사로서 투여될 수도 있다.

본 발명에 따른 치료방법은 단일 용량 또는 다회 용량으로서 엑소좀의 투여에 의해 이루어질 수 있다. 상기 치료방법은 질환의 중증도에 따라서 1회 혹은 반복해서 수행될 수 있다. 또, 상기 치료는 질환의 재발 시 반복될 수 있다.

상기 치료방법은 암, 알레르기, 자가면역 질환을 위하여 그리고 이식 요법 동안 의도되어 있다. 상기 치료요법은, 예컨대, 암의 정황에서 화학요법이 본 발명에 따른 치료와 병용될 수 있거나, 또는 예컨대 항히스타민제가 알레르기의 치료에 병용되거나, 또는 예컨대 항생제가 감염 등의 치료에 있어서 본 발명에 따른 방법과 병용될 수 있는 바와 같이, 다른 치료와 병용하여 혹은 보충될 수 있음은 명확히 이해될 것이다.

약제학적 조성물

엑소좀은 대상체에게 예컨대, 정맥내, 동맥내, 경막내, 피부내 혹은 복강내 투여 등과 같이, 비경구 투여를 위해 적합한 약제학적 조성물로서 조제될 수 있다.

엑소좀이 비경구 투여될 경우, 이는 등장성 매체에서, 즉, 혈액과 같은 삼투성(tonicity)을 지니는 매체에서 제제화될 수 있고, 엑소좀의 응집을 방지하는 1종 이상 물질을 추가로 포함할 수 있다. 식염수 용액은 예컨대 NaCl 약 0.91% w/v의 용액인 생리식염수(NS)를 약 300 mOsm/ℓ 이용할 수 있다. 그러나, 예컨대, 다음과 같은 다른 식염수 용액이 이용될 수 있다:

종종 "D5"(5% 덱스트로스)를 지니는 1/2-생리식염수(0.45% NaCl)는 77 mEq/ℓ의 Na 및 Cl, 그리고 50 g/ℓ의 글루코스를 함유한다.

1/4-생리식염수(0.22% NaCl)는 39 mEq/ℓ의 Na 및 Cl을 지니고, 삼투압을 이유로 5% 덱스트로스를 항상 함유한다.

예컨대 중심 정맥 카테터를 거쳐서 투여되는 2% NaCl 이상의 농도 등과 같은 고삼투 식염수(Hypertonic saline)가 또한 이용될 수 있다. 이것은 이하의 두 강도로 통상 시판된다:

3% NaCl은 513 mEq/ℓ의 Na 및 Cl을 지닌다.

5% NaCl은 856 mEq/ℓ의 Na 및 Cl을 지닌다.

상기 용액들에는 0.18% 식염수 중에 예컨대 덱스트로스(글루코스) 4% 등과 같이 덱스트로스(글루코스)가 더욱 보충될 수 있다.

추가의 첨가제는 예컨대 3%까지의 인간 혈청 알부민, 예컨대 2%까지의 인간 혈청 알부민 혹은 1%까지의 인간 혈청 알부민일 수 있다.

정맥내 투여를 위하여, 통상 투여될 상기 조성물 중의 엑소좀의 농도는 약 적어도 약 0.1㎍ 엑소좀/㎖ 매체. 예컨대 적어도 약 0.2㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.3㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.4㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.5㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.6㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.7㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.8㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.9㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 1.0㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 1.5㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 2.0㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 2.5㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 적어도 예컨대 약 3.0㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 5.0㎍ 엑소좀/매체 또는 예컨대 적어도 약 10.0㎍ 엑소좀/㎖ 매체 또는 예컨대 적어도 15.0㎍ 엑소좀/㎖ 매체 또는 예컨대 적어도 20.0㎍ 엑소좀/㎖ 매체의 범위 내에 있다.

본 발명의 기타 양상들 하에 언급되고 설명된 상세 및 특정 사항들은 본 발명의 본 양상을 준용하여 적용된다.

엑소좀

본 발명은 또한 엑소좀, 바람직하게는, B-세포 또는 수지상 세포, 난포성 수지상 세포 등으로부터 유래하는 엑소좀에 관한 것이다.

본 발명에 따른 엑소좀은 천연형 B-세포의 수용체에 결합할 수 있는 적어도 하나의 부분 혹은 제제 혹은 단백질 혹은 펩타이드 단편을 포함한다. 상기 수용체는 예컨대 CD19, CD21, CD20, CD23, CD79, BAFF-R, TACI, BCMA 또는 IFN-R일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 천연형 B-세포의 수용체에 결합할 수 있는 하나의 부분 혹은 제제 혹은 단백질 혹은 펩타이드 단편은 예컨대 BAFF, APRIL, gp350, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d 또는 IFN-알파일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 그러나, B-세포에 결합할 수 있는 리간드라면 어떠한 것이라도 본 발명에 따라서 이용될 수 있다.

또, 본 발명에 따른 엑소좀은 1종 이상의 항원을 더 포함할 수 있다. 해당 1종 이상의 항원은 내인성/자가성(대상체 자체로부터 기인됨) 또는 외인성/동종성(다른 대상체로부터 기인됨)일 수 있거나, 또는 1종 이상의 항원이 엑소좀 내로/상으로 내포될 경우에는, 해당 항원은 자가성/동종성 항원들의 임의의 혼합체일 수 있다. 바람직하게는, 항원은 자가성이다. 또한, 상기 1종 이상의 항원은 예컨대 바이러스 또는 박테리아 등과 같은 임의의 기원을 지닐 수 있거나, 또는 종양 항원일 수 있고, 또한 면역자극성 혹은 면역억제성 혹은 이들의 조합일 수 있다.

본 발명의 기타 양상들 하에 언급되고 설명된 상세 및 특정 사항들은 본 양상을 준용하여 적용된다.

또한, 본 발명에 따른 엑소좀은 유전공학적으로 조작되어, 임의의 항원(예컨대 바이러스)을 포함하여 B-세포를 백신(예컨대 바이러스 백신)으로서 사용되게끔 표적화될 수 있는 것도 상정된다. 또, 본 발명에 따른 엑소좀은 자가면역 질환, 알레르기의 정황에서, 혹은 임의의 종류의 이식을 받아 면역 반응을 일으켜 이식된 조직이 거부될 수 있는 위험이 있는 대상체를 치료하는 정황에서 이용될 수 있는 것도 상정된다. 이 양상은 엑소좀에 면역억제제를 혼입시킴으로써 실현될 수 있다. 이러한 면역억제제는 예컨대 LMP-1, CTLA-4, PD1 또는 그의 임의의 혼합물일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다. 그러나, 면역억제제로서 작용할 수 있는 임의의 제제가 본 발명에 따라 이용될 수 있음은 명확히 이해할 필요가 있다.

본 발명은 또한 대상체의 질병 혹은 병태의 치료에 이용하기 위한 엑소좀(예컨대, 그의 조성물 등)에 관한 것이다. 질병 혹은 병태는 예컨대 암, 임의의 자가면역 질환, 이식 하의 요법, 알레르기 또는 본 명세서의 설명에 대해서 준용하여 면역억제 혹은 면역자극을 필요로 하는 임의의 병태일 수 있다.

본 발명은 엡스타인-바 바이러스-형질전환된 B 세포(EBTB 세포)에 의해 분비되는 엑소좀(EBTB 엑소좀)이 CD21을 개재해서 천연형 B 세포를 표적화한다고 하는 식견에 의거하고 있다. 이러한 식견은 EBTB 세포 엑소좀과 천연형 B 세포가 항-CD21에 의해 효율적으로 차단된다고 하는 지견에 의해 지지되며, 이는 CD21과 EBV 당단백질 gp350 간 혹은 CD21, 예컨대 CD23, C3b, C3d 혹은 인터페론-알파에 대한 기타 리간드의 상호작용을 나타낸다. 본 발명에 따르면, 예컨대, BAFF, APRIL, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d 또는 IFN-알파 등과 같은 기타 리간드가 이용될 수 있다. B 세포 수용체에 결합할 수 있는 임의의 리간드 혹은 리간드들이 본 발명에 따라 이용될 수 있는 것이 상정된다. B-세포 수용체는 CD21일 수 있지만, 이것으로 제한되지 않으며, 또한 천연형 B-세포 상에 있는 기타 수용체, 예컨대, CD19, CD21, CD20, CD23, CD79, BAFF-R, TACI, BCMA 및 IFN-R일 수 있다. 따라서, 본 발명은 천연형 B-세포에 대해 결합할 수 있는 엑소좀의 외부에 대해서 리간드를 제공하고, 이어서 엑소좀 내로 혼입된 1종 이상의 항원의 후속의 이입을 제공할 수 있는 것을 알 수 있다. 이러한 예기치 않은 놀라운 지견은 이와 같이 해서 1종 이상의 항원의 더욱 효율적인 이입을 제공하고, 이에 따라 더욱 효율적이고 특이적인 면역 반응을 제공한다. 중요하게는, 엑소좀이 B-세포를 표적화하지만 T-세포는 표적화하지 않으므로, T-세포의 직접 자극에 의한 경우에서보다 더욱 강한 T-세포 반응이 얻어진다.

본 발명에 따르면, EBTB 엑소좀은 실험실에서 B 세포의 EBV 형질전환 등에 의해 유전공학적으로 조작되어 그들의 기능성 효과를 바꿀 수 있다. 천연형 B 세포를 향한 유전공학적으로 조작된 EBTB 엑소좀의 특이적 표적화는 그들의 치료적 유용성을 강화시킨다. 또한, B 세포의 EBV 형질전환은 엑소좀의 비제한적인 공급원을 부여한다.

이와 같이 해서, 본 발명에 따르면, 천연형 B 세포-표적화 단백질 및 종양 항원을 담지하는 EBTB 세포가 개시되어 있고; EBTB 세포는 천연형 B 세포-표적화 단백질 및 종양 항원을 담지하는 EBTB 엑소좀을 분비하는 것이 가능하다.

또, 본 발명에 따르면, 천연형 B 세포-표적화 단백질 및 종양 항원을 담지하는 EBTB 엑소좀이 개시되어 있다.

또한, 본 발명에 따르면, 감염성 항원(바이러스, 박테리아 혹은 마이코박테리아)으로부터 천연형 B 세포 표적화 단백질 및 예컨대 종양 항원 혹은 항원을 담지하는 수지상 세포(DC) 엑소좀이 개시되어 있다.

본 발명의 엑소좀에는 단일의 종양 항원 혹은 다수의 종양 항원이 내포되어 해당 엑소좀은 이들 단일 혹은 다수의 항원을 담지할 수 있다.

본 출원에 있어서, "형질전환"(transformation)이란 EBV(엡스타인-바 바이러스)가 B-림프구를 감염시킬 경우, 그 결과로서 불명확한 성장을 초래할 수 있는 림프아세포양 세포주가 궁극적으로 출현하는 것을 의미하도록 의도되어 있다. 이들 세포주의 성장 형질전환은 바이러스 단백질 발현의 결과이다. 얻어지는 세포주는 때로는 불멸화된 세포주라 지칭된다.

본 출원에 있어서, "항원"은 대상체에 있어서 면역 반응을 끌어낼 수 있는 물질이면 어느 것이라도 의미하도록 의도되어 있다. 이를 위하여, 항원은, 예컨대, 바이러스 항원, 박테리아 항원, 마이코박테리아 항원, 종양 항원, 혹은 예컨대 이식 동안 혹은 알레르기 반응에서 혹은 자가면역 반응 동안 조우하게 되는 바와 같이 대상체의 면역 체계가 반응하는 임의의 물질일 수 있지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 출원에 있어서, "종양 항원" 혹은 "암 항원"이란, "종양 연관 항원"(tumour associated antigen)을 포함하는 표현으로, 천연 혹은 합성 펩타이드이며, 이에 대항해서 투여되는 유기체가 항체 혹은 항원-특이적 T 세포 반응을 형성한다. 특히, 종양 항원은 항원 제시 세포(APC), 특히 B 세포, EBTB 세포 혹은 수지상 세포(DC)에 의해 제시될 수 있는 천연 혹은 합성 펩타이드이다. 그러나, 본 발명의 종양 항원은 그의 항원 효과를 발휘하기 위하여 항원 제시 세포에 의해 처리되어 제공될 필요가 없을 수 있다.

본 발명의 EBTB 엑소좀 혹은 DC 엑소좀에는 종양 항원이 직접 혹은 간접적으로 내포될 수 있다. 간접 내포는 세포에 의한 1종 이상의 항원의 흡수를 촉진시키는 조건 하에서 EBTB 세포 혹은 수지상 세포를 종양 항원으로 배양하는 단계 및 항원-내포된 세포가 항원-내포된 엑소좀을 분비시키는 단계를 포함한다. 직접 내포는 엑소좀에 의한 종양 항원의 흡수를 촉진하는 조건 하에, 특히 pH의 전이를 포함하는 조건 하에 EBTB 엑소좀 혹은 DC 엑소좀을 종양 항원과 접촉시키는 단계를 포함한다.

본 발명에 따르면, 암의 치료에 있어서 본 발명의 EBTB 세포와 EBTB 엑소좀, 그리고 수지상 세포와 DC 엑소좀의 용도가 또 개시되어 있다.

EBTB 엑소좀은 B 세포-표적화 단백질과 함께 제공될 경우 구체적으로 천연형 B 세포를 표적화하는 것이 가능하다. 이러한 B 세포-표적화에 특히 이용가능한 단백질은 gp350, CD23, C3b, CD19 및 C3d이지만, 이들로 제한되는 것은 아니다.

본 발명에 따르면, 천연형 B 세포는, 환자의 순환계로부터 채취한 혈액으로부터 단리되고, EBV에 의해 EBTB 세포로 형질전환되어 배양된다. 배양된 EBTB 세포에는 암 항원이 내포된다. 암 항원-내포된 EBTB 세포로부터 분비된 EBTB 엑소좀이 회수된다. 이 방법에서, 환자의 효과적인 암 치료를 위해 충분한 암 항원이 내포된 많은 수(양)의 EBTB 엑소좀이 생성된다. 암 항원이 내포된 본 발명의 EBTB 엑소좀은 CD21 결합 단백질을 담지한다.

대안적으로, 환자 이외의 다른 사람의 순환계로부터 채취된 혈액으로부터 단리된 천연형 B 세포들이 사용될 수 있는데, 단 이들 B 세포는 치료대상 환자의 B 세포와 면역학적으로 적합해야 한다. 본 발명의 방법은 이와 같이 해서 자기유래 B 세포 및 동종성 B 세포의 사용을 포함한다.

본 발명의 천연형 B 세포를 제공하는 자기유래/자가성 혹은 동종성 항원 및 EBV에 의한 감염에 의해 이들로부터 얻어진 EBTB 세포는 적어도 2주, 예컨대 적어도 3주, 예컨대 4주, 예컨대 5주, 예컨대 6주, 예컨대 7주, 예컨대 8주, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 예컨대 적어도 5개월 또는 예컨대 적어도 6개월 이상의 기간 동안 배지에서 팽창/증식되어 환자의 치료를 위해 충분한 다수의 엑소좀을 제공하는 것이 바람직하다. 본 발명에 따르면, EBTB 엑소좀으로 구성된, 면역 저해에 관여하는 제제, 예컨대, LMP-1은 Fab-단편 분자 등에 의해, 환자에게 투여하기 전에 중화될 수 있다.

본 발명에 따르면, CD40/IL-4-자극된 B 세포("CD40-자극 B 세포")에 의해 분비된 엑소좀을 개시하고 있다. CD40-자극 B 세포주의 장기간 배양액이 문헌[M Wiesner et al.(2008) Conditional Immortalization of Human B Cells by CD40 Ligation. Plos ONE 3(1):el464. Doi:10.1371/journal.pone.0001464]에 개시되어 있다. CD40-자극 B 세포주 및 이러한 B 세포로부터 분비된 엑소좀은 ETBT 세포주 및 ETBT 엑소좀의 것과 유사한 이용성을 지닌다. 특히, 이들에는 종양 항원이 내포될 수 있고, 또한 이들은 T 세포 및/또는 B 세포 활성화에 이용될 수 있다.

본 발명의 종양 항원은 EBTB 세포 혹은 수지상 세포를 비롯한 B 세포에 의해, 또는 대응하는 엔도좀에 의해 제시가능한 항원이다. 본 출원에 있어서, "종양 항원"은 종양 세포 혹은 그의 항원 활성 단편, 특히, T 세포를 자극할 수 있는 8 내지 12개의 아미노산 잔기 혹은 15 내지 24개의 아미노산 잔기를 포함하는 종양 항원 펩타이드 단편의 표면 상에 발현된 항원을 포함한다. "종양 항원"이란 용어는 또한 항원 제시 세포의 표면 상에 제시되는 일없이 B 세포를 자극할 수 있는 보다 큰 펩타이드 혹은 단백질을 포함한다. 이러한 보다 큰 종양 항원 펩타이드 혹은 단백질은, US 2007/0134275 A1에 기재된 것과 같이, 종양 세포 용해물(lysate)의 형태로 본 발명에서 유리하게 이용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 종양 항원은 ERBB2(HER2), BIRC5(survivin), CEACAM5(CEA), WDRK46(BING4), BAGE(BAGE1), CSAG2(TRAG-3), DCT(TRP-2), MAGED4, GAGE1, GAGE2, GAGE3, GAGE4, GAGE5, GAGE6, GAGE7, GAGE8, IL13RA2(Interleukin 13 receptor alpha). MAGEA1, MAGEA2, MAGEA3, MAGEA4, MAGEA6, MAGEA9, MAGEA10, MAGEA12, MAGEB1, MAGEB2, MAGEC2, TP53, TYR(tyrosinase), TYRP1(TRP-1), SAGE1(SAGE), SYCP1(HOM-TES-14/SCP1), SSX2(HOM-MEL-40), SSX4, KRAS, PRAME, NRAS, ACTN4(alphaactinin-4), CTNNB1, CASP8(caspase-8), CDC27, CDK4, EEF2, FN1(fibronectin), HSPA1B(Hisp70), LPGAT1(KIAA0205), ME1(malic enzyme), HHAT(MART-2), TRAPPC1(MUM-2), MUM3, MYO1B(비통상적 미오신 제1종 유전자), PAPOLG(neo-PAP), OS9, PTPRK(receptor-like protein tyrosine phosphatase kappa), TPI1(triosephosphate isomerase), ADFP(adiophilin), AFP(alpha-fetoprotein), AIM2, ANXA2(annexin II), ART4(endoplasmic reticulum-resident protein), CLCA2, CPSF1(CPSF), PPIB(cyclophilin B), EPHA2, EPHA3, FGF5(fibroblast frowth factor 5), CA9(carbonic anhydrase 9), TERT(hTERT), MGAT5(GNT-V; N-acetylglucosaminyltransferase V), CEL(intestinal carboxylesterase), F4.2, CAN(CAN-protein), ETV6(TEL1), BIRC7(livin/ML-IAP), CSF1(macrophage colony stimulating factor), OGT, MUC1(mucin), MUC2, MUM1, CTAG1A(NY-ESO-1; LAGE-2), CTAG2(NY-ES0-0RF2; LAGE-1), CTAG(CAMEL), MRPL28(melanoma antigen p15), FOLH1(prostate-specific membrane antigen), RAGE, SFMBT1(renal ubiquitous-protein 1), KAAG1(RU2AS), SART1, TSPYL1(SART-2), SART3, SOX10, TRG, WT1, TACSTD1(Ep-CAM), SILV(Pmel17; gp100), SCGB2A2(mammaglobin A), MC1R, MLANA(MART-1; Melan-A), GPR143(OA1), 0CA2(P polypeptide), KLK3(PSA; prostate-specific antigen), SUPT7L(ART-1), ARTC1, BRAF, CASP5(caspase-5), 유로플라킨(uroplakin); CDKN2A, UBXD5(C0A-1), EFTUD2(elongation factor Tu GTP binding domain containing; nSNRP116), GPNMB, NFYC, PRDX5(peroxiredoxin 5), ZUBR1(RBAF600), SIRT2, SNRPD1, HERV-K-MEL, CXorf61(KK-LC-1), CCDC110(KM-HN-1), VENTXP1(NA88A), 전립선 막 특이적 항원(prostate membrane specific antigen), SPA17(sperm protein 17), KLK4, ANKRD30A(NY-BR1), RAB38(NY-MEL-1), CCND1(cyclin D1), CYP1B1(P450 1B1), MDM2, MMP2(matrix metalloproteinase-2), 기형암종(teratocarcinom)-유래 성장인자(CRIPTO-1), ZNF395(PBF; papillomavirus biding factor), RNF43, SCRN1(secernin 1), STEAP1(STEAP), 707-AP, TGFBR2(TGF-beta receptor type MB), PXDNL(MG50), AKAP13(lymphoid blast crisis oncogene(Lbc) oncoprotein), PRTN3(proteinase 3), PSCA(prostate stem cell antigen), RHAMM(CD168), ACPP(prostatic acid phosphatase), ACRBP(OY-TES-1), LCK, RCVRN(recoverin), RPS2(ribosomal protein S2), RPL10A(ribosomal protein L10a), SLC45A3(prostein), BCL2L1(Bcl-xL), DKK1(dickkopf-1), ENAH(human mena protein), CSPG4(melanoma-associated chondroitin sulfate proteoglycan; MSCP), RGS5, BCR(breakpoint cluster region), BCR-ABL, ABL-BCR, DEK (DEK-oncogene), DEK-CAN, ETV6-AML1, LDLR-FUT, NPM1-ALK1, PML-RARA, SYT-SSX1, SYT-SSX2, FLT3(FLT1), ABL1(proto-oncogene tyrosine-protein kinase), AML1(AML), LDLR(low density lipid receptor), FUT1(GDP-L-fucose), NPM1(NPM), ALK, PML1(promyelocytic leukemia; PML), RARA(RARA alpha), SYT, SSX1, MSLN(mesothein), UBE2V1(ubiquitin-conjugating enzyme variant Kua), HNRPL, WHSC2, EIF4EBP1, WNK2, OAS3, BCL-2, MCL1, CTSH(cathepsin H), ABCC3(multidrug resistance-associated protein 3; MPR3), BST2(HM1.24), MFGE8(milk fat globule membrane protein BA46; lactadherin), TPBG(5T4 oncofetal antigen), FMOD(fibromodulin), XAGE1(XAGE antigen), RPSA(oncofetal Ag immature laminin receptor; OFA-ILR), COTL1(coactosin-like 1), CALR3(CRT2), PA2G4(ErbB3-biding protein 1), EZH2(polycomb group protein enhancer of zeste homolog 2), FMNL1(formin-related protein in leukocytes 1), HPSE(heparanase), APC, UBE2A, BCAP31, TOP2A, T0P2B, ITGB8, RPA1, ABI2, CCNI, CDC2, SEPT2, STAT1, LRP1, ADAM17, JUP, DDR1, ITPR2, HMOX1(heme oxygenase-1; HO-1), TPM4(tropomyosin-4), BAAT, DNAJC8, TAPBP, LGALS3BP(Mac-2-biding protein), PAGE4, PAK2(P21-activated serin kinase 2), CDKN1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A), PTHLH(parathyroid hormone-related protein; PTHrP), S0X2, SOX11, TRPM8(prostate-specific protein transient receptor potential-p8), TYMS(thymidylate synthase), ATIC(5'-aminoimidazole-4-carboxamide-1-beta-d-ribonucleotide transfolmylase/inosinicase), PGK1(phosphoglycerate kinase 1), S0X4, TOR3A(ATP-dependent interferon-responsive; ADIR), TRGC2(T-cell receptor gamma alternate reading frame protein; TARP), BTBD2(BTB domain containing 2), SLBP(harpin-biding protein), EGFR(epidermal growth factor receptor), IER3(immediate early response gene X-1; IEX-1), TTK(TTK protein kinase), LY6K(lymphocyte antigen B complex locus K), IGF2BP3(insulin -like growth factor(IGF)-II mRNA binding protein 3; IMP-3), GPC3(glypican-3), SLC35A4, HSMD(HMSD-v-encoded mHA), H3F3A, ALDH1A1, MFI2, MMP14, SDCBP, PARP12, MET(c-Met protein), CCNBl(cyclin B1), PAX3-FKHR, PAX3, FOXO1(FKHR), 유비퀼린-1, H0X-B6, IFI27, YB-1, KIAA0136, 오스테오넥틴(osteonectin), F-박스 온리 프로테인(box only protein) 21, ILF3, UBP3, BRAP-2; H⁺-ATPaSe, K008-1, MAIAP, Gene AS, BR-1, BR-2, KIAA0603, TPR, NOR-90, N-CAM(neuronal cell adhesion molecule), 루이스 Y 탄수화물 항원, Ep-CAM(epithelial cell adhesion 분자), MUC-1 단백질, 36P6D5, 사이알릴 Tn 탄수화물 항원, 글로보 H 탄수화물, CA 125, CA 19-9, CA 15-3, TAG-72, Her2/Neu 수용체, p97, CD20, CD21, WT1 유전자의 발현산물로 이루어진 군으로부터 선택된다.

예컨대, 문헌[DeVita et al., Eds, Biological Therapy of Cancer, 2nd Ed., Chapter 3: Biology of Tumor Agents. Lippincott Comp. 1995]에는 더욱 유용한 종양-연관 항원이 기재되어 있다.

본 발명에 있어서 유용한 인편 형상 상피세포 악성 종양 항원은 US 2007/0009501 A1에 기재되어 있다.

추가의 종양-연관 항원은 미국 특허 출원 제7,524,930호, 제7,427,660호, 제7,408,037호, 제7,432,354호, 제7,232,887호, 제7425607호 및 제7,084239호 공보에 개시되어 있다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 종양 항원 펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 개시되어 있다. 폴리뉴클레오타이드는 융합된 단백질 산물을 코딩할 수 있는 폴리뉴클레오타이드로 구성되는 것이 바람직하고, 상기 산물로부터 프로테아제에 의해 종양 항원 펩타이드가 분리될 수 있다. 상기 융합된 단백질-코딩 폴리뉴클레오타이드는 본 발명의 천연형 B 세포, 수지상 세포 혹은 EBTB 세포를 유전자 변형시켜 해당 세포가 상기 융합된 단백질을 발현하여 이를 본 발명의 종양 항원 펩타이드로 형질전환시키도록 하는데 이용될 수 있다. 이와 같이 해서, 유전자 변형된 세포는 본 발명의 종양 항원 펩타이드의 그들의 표면 상에 담지된 엑소좀을 방출할 수 있다. 그러나, 또 사이토졸(cytosol) 내에서 항원을 담지하는 엑소좀을 생산하는 기술이 있다.

본 발명에 따르면, 환자의 암세포 상에 발현된 항원에 대해서 면역 반응을 유발시킴으로써 인간의 암을 치료하는 방법으로서,

(a) 인간으로부터 말초 혈액의 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료로부터 B 세포를 단리하는 단계;

(c) 단리된 상기 B 세포를 엡스타인-바 바이러스(EBV)로 감염시키는 단계;

(d) 감염된 B 세포를 잠복기로 형질전환시키지만, 여기서 gp350이 발현되는 단계;

(e) 암 항원의 존재 하에 상기 EBV 형질전환된 B 세포를 배양하는 단계;

(f) 상기 EBV 형질전환된 B 세포로부터 분비된 엑소좀을 수집하는 단계; 및

(g) 상기 환자에게 상기 수집된 엑소좀을 투여하여 상기 면역 반응을 유발시키는 단계를 포함하는, 인간의 암 치료방법이 개시되어 있다.

대안적으로, 암 항원의 존재 하에 상기 EBV 형질전환된 B 세포를 배양하는 단계 대신에 혹은 이에 부가해서, 상기 방법은 상기 수집된 엑소좀을 암 항원과 접촉시켜 암 항원 내포된 엑소좀을 생산하는 단계를 포함한다.

(a) 인간으로부터 말초 혈액의 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료로부터 단핵구들을 단리하는 단계;

(c) 상기 단핵구들을 배양하여 수지상 세포들을 미성숙시키는 단계;

(d) 미성숙 수지상 세포들을 변성시켜 CD21-결합 부분을 발현시키는 단계;

(e) 변성된 상기 미성숙 수지상 세포들을 암 항원과 접촉시켜, 이들을 암 항원 내포된 성숙 수지상 세포들로 형질전환시키는 단계;

(f) 상기 성숙 수지상 세포들로부터 분비된 암 항원 내포된 수지상 세포 엑소좀들을 수집하는 단계; 및

(g) 상기 암 항원 내포된 수지상 세포 엑소좀들을 환자에게 투여해서 상기 면역 반응을 유발시키는 단계를 포함하는 방법이 개시되어 있다.

본 발명에 의하면, 환자의 암세포 상에 발현된 항원에 대해서 면역 반응을 유발시킴으로써 인간의 암을 치료하는 방법으로서,

(a) 인간으로부터 말초 혈액의 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료로부터 B 세포를 단리하고, 해당 B 세포를 배양하는 단계;

(c) 상기 B 세포를 변성시켜 CD21-결합 부분을 발현시키는 단계;

(d) CD21-결합 부분을 발현하는 변성된 B 세포를 암 항원과 접촉시키는 단계;

(e) 암 항원-접촉된 변성된 B 세포로부터 분비된 암 항원 내포된 엑소좀을 수집하는 단계; 및

(f) 암 항원 내포된 B 세포 엑소좀을 환자에게 투여하여 상기 면역 반응을 유발시키는 단계를 포함하는 방법이 또 개시되어 있다.

대안적으로, 변성된 B 세포를 암 항원과 접촉시키는 것 대신에 혹은 이에 부가해서, 상기 방법은 수집된 엑소좀을 암 항원과 접촉시켜 암 항원 내포된 엑소좀을 생산하는 단계를 포함한다.

본 발명에 따른 암을 치료하는 방법에 있어서, CD21-결합 단백질 부분이 gp350, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d 및 IFN-알파 중 하나 혹은 수개를 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 방법에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있는 엑소좀; 상기 엑소좀을 생산하는 방법; 상기 엑소좀을 포함하는 암 백신; 상기 엑소좀에 의해 생체외에서 자극된 T 세포; CD21-결합 부분, 특히, gp35O, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d 및 IFN-알파로 이루어진 군으로부터 선택된 CD21-결합 부분을 포함하는 수지상 세포(DC) 엑소좀 혹은 B-세포 엑소좀이 추가로 개시되어 있다.

본 발명은 특정 유형의 암의 치료로 제한되지 않는다.

그러나, 유방암, 방광암, 피부암, 전립선암, 췌장암, 난소암, 갑상선암, 위암, 두경부암 및 흑색종으로 이루어진 군으로부터 선택된 암의 치료에 대한 그의 적용이 바람직하다.

이하, 본 발명을 다수의 바람직한 실시형태를 참조해서 상세히 설명하며, 이들 중 몇몇은 도면에 예시되어 있다.

이하의 실험 부문에 있어서, 예시적인 실시예들이 본보기로서 부여된다. 그러나, 이들 실시예는 결코 제한하는 것으로 파악해서는 안된다 .

실험 부문

엑소좀의 천연형 B 세포 및 말초 혈액 단핵 세포와의 상호작용

인간 엡스타인-바 바이러스-형질전환된 B 세포주(EBTB 세포주) 및 EBV^- 버킷 림프종 세포주(BJAB 세포주)의 배양 상청액으로부터 엑소좀을 단리하였다. 이 엑소좀을 그들의 유착성에 관하여 천연형 B 세포와 비교하고(도 1a 및 도 1b) 또한 PBMC 배양액 중의 다른 세포와 비교하였다(도 2a 및 도 2b). 상기 엑소좀을 범용 멤브레인 염료인 PKH67로 직접 염색하였다(Morelli A E et al., Endocytosis , intracellular sorting , and processing of exosomes by dendritic cells . Blood 2004, 104: 3257-3266). PKH67로 염색한 후 해당 엑소좀이 그의 구조를 유지하고 있는지의 여부를 확인하기 위하여, 해당 엑소좀을 자성 항-MHC 제II급 비드에 결합시켰다(Clayton, A et al., Analysis of antigen presenting cell derived exosomes , based on immuno - magnetic isolation and flow cytometry . J Immunol Methods 2001, 247: 163-174). 유세포 분석 결과는 녹색 형광 MHC 제II급 함유 소포가 상기 비드에 포획된 것으로 판명되었고, 투과형 전자현미경(TEM)은 고유한 지질 2층을 지니는 나노-소포를 표시하였는 바, 이는 PKH67 표지화가 엑소좀 형태를 간섭하지 않는 것을 나타낸다. 상이한 엑소좀을 이어서 천연형 B 세포 혹은 인간 PBMC와 함께 4시간 공-배양하고, 다색 유세포 분석법에 의해 분석하였다. 항-CD18 혹은 항-CD21(20㎍/㎖)에 의한 천연형 B 세포의 처리는 엑소좀에 의한 배양을 진행시켰다. 10만개의 세포가 샘플당 분석되었다.

B 세포 엑소좀과 B 세포 간의 상호작용이 크게 에너지-의존적이며, 따라서 유착 분자 혹은 표면 수용체를 통해 더욱 매개되기 쉽다. EBTB 엑소좀은 B 세포 수용체를 발현하며, 이는 유착 분자, 예컨대 ICAM-1 및 인테그린(Clayton A et al., Adhesion and signaling by B cell - derived exosomes : the role of integrins. Faseb J 2004, 18: 977-979))의 상이한 패턴과 함께, EBTB 엑소좀의 관찰된 강력한 B 세포 우선권을 매개할 수도 있다. 그러나, 유착 효과는 대안적으로 혹은 부가적으로 EBTB 엑소좀의 표면 상에 발현된 EBV-형질전환에 의해 상향 조절된 회상성(reminiscent) EBV 단백질 혹은 기타 단백질에 의해 매개될 수도 있다.

EBTB 엑소좀을 표적화하는 B 세포가 다른 B 세포 엑소좀의 것과 유사했는지 혹은 EBTB 엑소좀에 대해 특이적이었는지의 여부를 조사하기 위하여, gp350를 가능하게는 연루시켜, EBTB 엑소좀의 B-세포 결합능을 EBV^- 버킷 림프종 B 세포주로부터의 엑소좀인 BJAB27(BJAB 엑소좀)의 것과 비교하였다. BJAB 엑소좀은 EBTB 엑소좀와 비교해서 천연형 B-세포에 대해서 훨씬 적은 정도로 결합한 것으로 판명되었고, 이는 결합에서의 EBV의 연루를 나타낸다(도 3). 결합의 특이성을 밝히기 위하여, 항-CD21에 의한 CD21의 차단이 시도되었다. 항-CD21은 EBTB 엑소좀과 천연형 B 세포 간의 상호작용을 효율적으로 차단한 것으로 판명되었다. 이것은 B 세포와 EBTB 엑소좀 간의 결합이 천연형 B 세포 상의 수용체 CD21과 EBTB 엑소좀 상의 리간드, 가능하게는 gp350 혹은 CD23 간의 상호작용에 기인하는 것임을 암시한다. 이 결합에 있어서 LFA-1(CD11a/CD18), Mac-1(CD11b/CD18) 및 p150,95(CD11c/CD18)로서 인테그린들의 추가의 연루를 배제하기 위하여, 이들 인테그린은 항-CD18에 의해 차단하였다. 도 3으로부터 명백한 바와 같이, 이 차단은 그러나 EBTB 엑소좀과 천연형 B 세포 간의 상호작용에 영향을 미치지 않으므로. CD21은 B 세포/B 세포 엑소좀 결합에 대해 필수적인 것으로 여겨진다.

EBTB 세포주 내에 존재할 EBV 입자들의 가능성 및 따라서 이들이 엑소좀 제제를 오염시킬 수 있는 위험성은 B 세포 결합된 PKH67 염색된 소포가 EBV 입자가 아니라 실제로 엑소좀이었던 것을 확실하게 함으로써 배제되었다. EBV⁺ B 세포로부터의 엑소좀 제제 그리고 엑소좀 및 B 세포 공-배양액으로부터의 시료는 TEM에 의해 주의해서 체크하였다. 바이러스 입자는 엑소좀 중에서도 B 세포 상에서도 전혀 검출될 수 없었다(데이터 표시 생략).

상이한 세포 유형이 그들의 기원 세포를 반영하는 표현형을 지니는 엑소좀을 생산하는 것은 공지되어 있지만, 상이한 세포 유형으로부터 엑소좀이 세포를 표적화함에 있어서 어떻게 상이한지의 문제를 규명하는 것이 남아있다. 기원과 독립적으로, 이러한 천연형 엑소좀은, 인간 말초 혈액 중에 동일한 주된 표적, 즉, HLA^-DR⁺CD14⁺ 세포를 지니는 것처럼 생각되고 이에 의해 이들은 활성적으로 식세포화된(phagocytise) 것으로 보이는 것으로 판명되었다. 그러나, EBTB 엑소좀은 HLA^-DR⁺CD14⁺ 세포로부터 천연형 B 세포를 향하여 특이적으로 변화한 엑소좀을 생산하는 것으로 밝혀졌다. 이것은 BJAB 세포주인 EBV^- B 세포주로부터의 엑소좀(BJAB 엑소좀)을 EBTB 세포주인, EBV⁺ B 세포주로부터의 엑소좀(EBTB 엑소좀)과 비교함으로써 입증되었다. EBTB 엑소좀과 천연형 B 세포 간의 높은 상호작용은 항-CD18에 의해서가 아니라 항-CD21에 의해 효율적으로 차단될 수 있었다. 표적화된 B 세포 상호소통의 이 신규한 기전은 또한 EBV 반영된 개체에 있어서 생체내의 상황을 반영할 수 있다. 이것은 EBV에 대한 장기간 면역보호에 있어서 중요한 역할을 지닐 수 있다.

방법

엑소좀 공급원(Exosome sources). 카롤린스카 대학병원의 혈액 은행에서 건강한 혈액 공여체로부터의 연막(buffy coat)을 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 피콜 페이크(Amersham Pharmacia Biotech AB, 스웨덴 웁살라시 소재) 분리에 이용하였다. 엡스타인-바 바이러스(EBV) 형질전환된 B 세포주는 오스트리아의 비엔나시에 소재한 비엔나 의대의 Dr. Barbara Bohle로부터의 일종의 기부물이었다. EBV-음성 림프종 B 세포주(BJAB)는 카롤린스카 연구소의 Michael Karlsson으로부터의 일종의 기부물이었다.

엑소좀 단리. 300×g에서 10분간 개시하여 세포를 제거하고 이어서 3,000×g에서 20분간 수행되는 분별 원심분리를 이용해서 세포 배양 상청액(B 세포주)으로부터 엑소좀을 단리하고, 그 후, 10,000×g에서 30분간 4℃에서 초원심분리(옵티마 L-100 XP 초원심분리기 내 Ti45 로터, Beckman Coulter, 미국 캘리포니아주의 풀러턴시 소재)하여 가능한 세포 지스러기의 상청액을 제거하였다. 100,000×g에서 70분간의 초원심 분리에 의해 엑소좀을 펠릿화하고, 이어서 최종 초원심분리의 반복 시 PBS로 세척하였다. 적은 용량의 PBS로 최종 세척 직후 펠릿화된 엑소좀을 재현탁시키고, 제조사의 프로토콜에 따라서 BioRad Dc assay(BioRad, 미국 캘리포니아주의 헬르쿨레스시 소재)를 이용해서 단백질 농도를 구하였다. 4개의 엑소좀 공급원의 각각으로부터 동일량의 단백질이 사용되었다.

엑소좀을 이용한 말초 혈액 단핵 세포의 공-배양. 건강한 혈액 공여체로부터의 연막을 신선하게 단리된 PBMC의 공급원으로서 이용하였다. 세포를 제조사의 지시에 따라 피콜 하이페이크(Ficoll Hypaque)(Amersham Pharmacia Biotech AB) 상에서 단리하였다. 나머지 적혈구는 ACK 용해 완충액(0.15M NH₄Cl, 10mM KHCO₃, 0.1mM Na₂EDTA, pH 7.2)을 이용해서 5분간 용해시켰다. PBMC는 37℃에서 4시간 6㎖ 관 내에 PKH67⁺ 엑소좀 10㎍/5×10⁵ 세포 농도를 지니는 CCM에서 배양하였다. 몇몇 실험은 4℃에서 수행되었다.

엑소좀 염색. 범용 멤브레인 표지화용의 녹색 형광염료 PKH67(Sigma Aldrich, 미국 캘리포니아주의 새너제이시에 소재)를 이용해서 엑소좀을 염색하였다. 이 엑소좀을 NVT90 회전기(Beckman Coulter)에서 100,000×g에서 70분간 원심분리함으로써 PBS로부터 희석제 C(Sigma) 용액으로 이전시킨다. PKH67 염색은 엑소좀 시료(희석제 C 중 300㎍/㎖)와 동일 용적으로 4μM 2× 원액으로 희석되었고, 이 원액은 작은 0.2㎛ 시린지 필터에서 여과하여 염색에 의해 형성된 잠재적인 응집체를 제거하였다. 엑소좀 시료를 이어서 PKH67 원액 용액과 1:1로 혼합할 경우 0.2㎚ 시린지 필터를 통과시키고, 1% BSA로 1분간 정지시키기 전에 실온에서 5분간 염색을 허용하였다. 엑소좀은 이어서 CCM으로 세척하고 전술한 바와 같은 NVT90 회전기에서 원심분리시켰다. 얻어진 펠릿을 주의해서 헹구어 미결합 PKH67 오염물을 제거하였다. 예비 현미경 분석 결과, 엑소좀이 염색 후 응집체를 형성한 것으로 나타났고, 이와 같이 해서, 세포에 첨가하기 직전에 CCM 내에 재현탁시키고 나서, 작은 용적의 0.2㎛ 시린지 필터를 통해 여과시켰다. 대조군으로서, 동일 농도의 PKH67을 나란히 원심분리하여 잠재적으로 펠릿화된 미결합 염색에 대한 백그라운드 대조군으로 작성하였다.

PKH67 염색된 엑소좀의 PBMC 를 이용한 공-배양. 예비-여과된 PKH67 염색된 엑소좀을 PBMC에 37℃에서 1시간 및 4시간 동안뿐만 아니라 온도 연구 동안 4℃에서 첨가하였다. 5×10⁵ PBMC 당 10㎍의 엑소좀을 첨가하였다. 백그라운드 대조군으로서 나란히 원심분리된 PKH67 염료 펠릿을 이용하였다.

투과형 전자현미경( TEM ). 항-HLA 제II급 자성 비드 상에 엑소좀을 포획하였다(Clayton, A et al., Analysis of antigen presenting cell derived exosomes , based on immuno - magnetic isolation and flow cytometry . J Immunol Methods 2001, 247: 163-174). 이 비드를 0.1M 수크로즈 및 3mM CaCl₂를 함유하는 0.1M 카코딜산 나트륨 완충액 중 2% 글루타르알데하이드에, pH 7.4, 4℃에서 하룻밤 고정시키고, 펠릿으로 원심분리하였다. 얻어진 펠릿을 3mM CaCl₂를 함유하는 0.15M 카코딜산 나트륨 완충액(pH 7.4)으로 헹구고 나서, 1.5mM CaCl₂를 함유하는 0.07M 카코딜산 나트륨 완충액 중 pH 7.4, 4℃에서 2시간 동안 2% 사산화오스뮴 내에 후속-고정시키고, 에탄올에 이어 아세톤으로 탈수시키고 나서 LX-112(Ladd, 미국 버몬트주의 버링톤시 소재) 내에 삽입하였다. 이 구역은 아세트산 우라닐에 이어서 시트르산납으로 조영하였고 이어서, Tecnai 10 투과형 전자현미경(Fei, Acht, 네덜란드에 소재)에서 80kV에서 조사되었다. Mega View III 디지탈 카메라(Soft Imaging System, GmbH, 독일 민스터시 소재)에 의해 디지털 화상을 포착하였다.

유세포 분석법. 두 상이한 마우스 단클론성 (m)Ab 패널, 즉, "APC" 항-HLA-DR(MHC 제II급) PECy5, 항-CD14"PE 및 항-CD19 퍼시픽 블루(Pacific Blue)(혹은 PE-Texas 레드) 및 "T 세포" 항-CD8 APC(혹은 PECy5), 항-CD4 PE 및 CD3 퍼시픽 블루(BD Biosciences, San Jose, CA, USA)를 이용해서 PBMC을 염색하였다. 우선, FSC/SSC 내에서 림프구/단핵구 상에 게이팅(gating)을 행하였다. 패널 APC에 대해서, HLA^-DR⁺CD14⁺ 및 HLA^-DR⁺CD14^- 모집단을 먼저 게이팅하였다. 이어서 HLA^-DR⁺CD14^- 세포 중에서 CD19⁺ 세포를 게이팅하였다. T 세포 패널에 대해서, 모집단들은 림프구/단핵구 게이트로부터 직접 CD3⁺CD4⁺ 대 CD3⁺CD8⁺로서 선택하였다. 각 서브모집단에 대해서, 대응하는 PKH67⁺ 게이트를 엑소좀 없는 시료 상에 세트하였다. 이 시료를 FACS 아리아(Aria) 유세포 분석기(BD Biosciences) 상에 유동시켰다. 단일 염색된 세포의 보상 대조군은 각 개체로부터 데이터 수집 전에 수행되었고, 보상치는 획득된 데이터의 분석을 위해 이용된 FACS Diva(BD Biosciences) 소프트웨어에 의해 자동적으로 계산되었다. 림프구/단핵구 게이트에서, 시료당 10,000개의 이벤트를 수집하였다.

공초점 레이저-주사 현미경( Confocal laser - scanning microscopy : CLSM ). PKH67+ 엑소좀을 이용해서 4℃에서 혹은 37℃에서 4시간 동안 배양을 행한 후, PBMC를 4% 포름알데하이드 중에 15분간 고정시켰다. 제조사의 지시에 따라 항-CD3, 항-CD14 혹은 항-CD19 mAb(BD Biosciences)를 이용해서 염색을 행하고 나서, PBS로 세척하였다. Alexa Fluor 546(Molecular Probes, 미국 오리건주의 유겐시에 소재)으로 표지화된 2차 염소 항-마우스 mAb가 검출용으로 이용되었다. 사이토스핀(cytospin) 후, 슬라이드에 90% 글라이세롤을 올려놓았다. 하나의 아르곤 레이저와 두 개의 HeNe 레이저를 장비한 CLSM(TCS SP2; Leica Microsystems, 독일 만하임시에 소재) 상에서 형광 화상을 획득하였다. PKH67은 490 내지 530㎚의 파장 영역에서 488-㎚ 레이저 선 검출광으로 여기시켰다. Alexa 546은 580 내지 700nm의 영역에서 검출광으로 543-nm 레이저 선으로 여기되었다.

Image Stream 분석. 유세포 분석법에 대해서 설명한 바와 같이 엑소좀을 염색하고 PBMC로 공-배양하였다. ImageStream(등록상표) 멀티스펙트럼 화상 유세포 분석기 상에 세포를 유동시키고 IDEAS(등록상표) 화상 분석 소프트웨어(Amnis Corporation, 미국 워싱톤주의 시애틀시에 소재)를 이용해서 화상을 분석하였다. 각 샘플에 대해서 10,000개의 이벤트가 수집되었고, 단일 염색된 보상 대조군은 화소 단위에 기초하여 채널 화상 간의 형광을 보상하는데 이용되었다. FACS에 대한 원리에 따라서 게이팅을 행하였다. PKH67 형광의 세포 위치는 내재화 특성을 이용해서 측정되었다. 내재화 특성은 전체 세포의 강도에 대한 세포 내부의 강도의 비로서 정의된다. 점수가 높을수록, 세포 내부의 강도의 농도가 크다. 세포의 내부는 세포막에 적합한 마스크의 부식에 의해서 정의된다. 상기 특성은 세포 크기에 대해서 변하지 않고, 집중된 밝은 영역과 작은 어두운 반점을 수용할 수 있다. 상기 비는 {-inf, inf} 사이의 값에 대한 다이내믹 영역을 증가시키도록 로그 척도로 사상된다. 1차 내부 형광을 지니는 세포는 양의 값의 점수를 지니는 반면, 작은 내재화를 보이는 세포는 음의 값의 점수를 지닌다.

차단 분석평가. PBMC(106/㎖)를 CD18(클론 MEM48), CD21(클론 B-E5) 혹은 동종형-정합된 Abs(20㎍/㎖; Nordic BioSite, Taby, Sweden)에 대해서 mAb들을 이용해서 실온에서 세포 배지에서 30분간 공-배양하고, 그 후 엑소좀이 10㎍/5×10⁵ 세포의 양으로 37℃에서 1시간 혹은 4시간 동안 첨가되기 전에 PBS로 세척하였다. FACS 분석은 앞에서 설명한 바와 같이 수행하였다. LCL1-엑소좀은 gp350/250 중화 mAb 72A1(DSMZ, 독일의 브라운슈바이크시에 소재)를 생성하는 마우스 하이브리도마 배양액으로부터 상청액(전체 체적의 30%) 혹은 항-CD23(클론 9P25, 30㎍/㎖ Beckman Coulter)으로 처리하였다. 무관한 동종형 대조군 혹은 하이브리도마 상청액을 대조군으로서 이용하였다. 실온에서 세포 배지에서 30분 후, 전처리된 LCL1-엑소좀을, FACS 분석을 행하기 전에 B 세포(10㎍/2.5×10⁵ 세포)에 4시간 동안 첨가하였다. B 세포는 B 세포 단리 키트 II(Miltenyi Biotech)를 이용해서 PBMC로부터 단리하였다.

세포내 유세포 분석 염색. LCL1 세포 및 BJAB 세포(5×10⁴)를 실온에서 4% 포름알데하이드로 고정시켰다. PBS를 이용한 3회의 세척 후, 세포를 실온에서 1% 사포닌 용액 중에서 10분간 배양하였다. 세포를 마우스 하이브리도마 배양액으로부터의 상청액을 실온에서 1시간 첨가함으로써 gp350/250에 대한 1차 mAb 72Al로 염색하였다. 0.1% 사포닌 용액으로 두 단계 세척 후, 세포를 2차 Alexa Fluor 488(Invitrogen, 미국 캘리포니아주 소재) Ab에서 실온에서 45분 배양하고, 세척 후 유세포 분석법에 의해 분석하였다.

수크로스 구배. 엑소좀 제제의 분획을 이미 앞에서 설명된 바와 같이 수크로스 구배에 의해 회수하였다(5). 이들은 유세포 분석을 위하여 항-MHC 제II급 Dynabeads(Dynal, 노르웨이의 오슬로시에 소재) 상에 직접 내포되거나, 혹은 면역 블롯 분석을 위하여 200,000×g에서 35분 동안 4℃에서 원심분리에 의해 펠릿화되었다.

면역블롯 분석. 각 펠릿화된 엑소좀 분획은 SDS-PAGE(12%)에 의해 분리하고 이불화폴리비닐리덴 막(Millipore, 미국 매사추세츠주에 소재)에 이입하였다. 막을 제조사의 지시에 따라서 LMP1(클론 CS. 1.4; DakoCytomation), gp350(클론 2L10, Millipore, 미국 매사추세츠주에 소재), CD81(클론 H-121, Santa Cruz Biotechnology, 미국 캘리포니아주에 소재) 혹은 HLA-DR(클론 TAL.1B5, DakoCytomation, 덴마크 글로스트럽시에 소재)에 대해서 mAb들로 염색하였다. 막은 ECL 어드벤스 웨스턴 블로팅 검출 키트(Advance Western Blotting Detection kit)에 의해 가시화하여 Hyperfilms(GE Healthcare, 스웨덴의 웁살라시에 소재) 상에 노출시켰다.

제대혈 형질전환 분석평가. 카롤린스카 대학병원으로부터 얻어지고 지방 윤리 위원회에서 승인된 헤파린 첨가 제대혈에 대해 피콜 페이크 밀도 원심분리를 실시하였다. 1백만개의 제대혈 단핵 세포(CBMC)를 습윤 37℃, 5% CO₂ 인큐베이터 속에서 1.5시간 동안 BJAB 혹은 LCL1 상청액으로부터의 10,000×g 펠릿으로 또는 BJAB 혹은 LCL1 엑소좀 제제 24㎍으로 배양하였다. CBMC를 세척하고 106 세포/㎖에서 완전 RPMI에 재현탁시키고, 웰/200㎕ 당 2×10⁵에서 5배로 96-웰 플레이트에 파종하였다. EBV 유도 세포 형질전환을 위한 양성 대조군으로서, CBMC를 B95-8 바이러스 함유 상청액에 노출시켰다. 배지는 음성 대조군으로서 작용하였다. CBMC에는 신선한 배지를 주마다 공급하였다. 33일째에, 전형적인 세포 응집물의 출현에 의해 그리고 티미딘 혼입 분석평가에 의해 가시적으로 형질전환체를 얻었다. 1μCi ³H-티미딘(GE Healthcare)을 배양액에 첨가하고 16시간 배양하였다. CBMC를 유리섬유 필터 상에 수집하고 섬광 계수기(1205 Betaplate, Wallac)에서 방사능을 측정하였다.

NanoSight. 고속 비디오 캡처 및 입자 트래킹 소프트웨어를 장착한 NanoSight(등록상표) LM10 시스템(NanoSight Ltd., 영국 아메스버리시 소재)을 이용해서 브라운 운동의 속도를 측정함으로써 엑소좀 제제 내의 크기 분포를 분석하였다. 대조군으로서 사용되는 EBV(균주 B95-8)는 Dr. Kerstin Falk(Department of Microbiology, Tumour and Cell Biology, Karolinska Institutet)로부터의 일종의 기부물이다. NanoSight에 의한 분석 전에, EBV를 56℃에서 20분간 가열 불활성화시켰다.

통계학적 분석. GraphPad 프리즘 소프트웨어 버전 4.03을 이용해서 군들 간의 차이를 비교하기 위하여 윌콕슨 정합쌍 테스트(Wilcoxon matched pairs test)를 이용하였다. 0.05 이하의 p-값은 유의한 것으로 간주되었다.

EBV 감염된 B 세포주의 생성. 치료를 위해 선택된 흑색종 암 환자로부터 혹은 본 발명의 방법에 의해 면역학적으로 견줄만한 공여체로부터 얻어진 말초 혈액(50㎖)으로부터 B 세포를 포함하는 단핵세포 부유액을 단리하였다. 이 부유액으로부터 EBV 감염된 B 세포주(EBTB 세포주)를 생산한 후 Tosato와 Cohen이 창안한 프로토콜(Curr Protoc Immunol 2007, 7.22.1-7.22.4)을 수행하였다.

EBTB 엑소좀의 단리. 천연형 B 세포로부터의 엑소좀에 대해서 전술한 바와 같이 주로 EBTB 세포주로부터 EBTB 엑소좀을 단리하였다.

EBTB 엑소좀 내포. 단리된 EBTB 엑소좀에는 N Chaput 등의 방법(Exosomes as potent cell - free peptide - based vaccine . II . Exosomes in CpG adjuvants efficiently prime native Tc1 lymphocytes leading to tumor rejection . J immunol 2004, 172:2137-2146) 및 D H Hsu 등의 방법(Exosomes as a tumor vaccine enhancing potency through direct loading of antigenic peptides. J Immunol 2003, 26:2137-2364)을 적합화시킴으로써 MHC 제I급 및 제II급 펩타이드 혹은 암 항원 펩타이드를 내포시켰다,

항원-내포된 ETBT 엑소좀의 정제. 항원-내포된 EBTB 엑소좀을 B. Escudier 등의 방법( Vaccination of metastatic melanoma patients with autologous dendritic (DC) derived - exosomes : results of the first phase I clinical trial . J Translat Med 2005, 3:1O)에 의해 정제하였다.

생체외 CD -40/ IL -4 자극된 B 세포주 엑소좀. 카롤린스카 대학 병원의 혈액 은행에서 건강한 혈액 공여체로부터의 연막이 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)의 피콜 페이크(Amersham Pharmacia Biotech AB, 스웨덴 웁살라시 소재) 분리에 이용되었다. 약 1?10⁵ PBMC의 각각의 이들 대응하는 3가지 배양액을 Wiesner 등(앞에서 기재됨)의 프로토콜에 따라서 확립하고 자극시켰다. 두 세포주를 70일간 유지한 반면 세번째 세포주는 약 3주 후에 증식을 중지시켰다. 이들 두 장기 CD40-자극된 B 세포주는 EBV 감염된 림프모세포 및 다른 세포 유형이 없는 것으로 확인되었다. 엑소좀은 ETBT 엑소좀에 대해서 전술한 바와 같은 방식으로 두 세포 배양액 중 하나의 상청액으로부터 단리되었다. 단리된 엑소좀이 종양 항원에 내포되고 ETBT 엑소좀을 위하여 전술한 바와 같이 정제되었다.

결과

인간 DC 및 모유로부터 유래된 엑소좀이 단핵구를 표적화하는 한편, LCL1 엑소좀은 B 세포를 우선한다.

세포를 면역시키기 위하여 상이한 엑소좀의 결합을 해명하기 위하여, 본 발명자는 PBMC에 대한 그들의 유착과 관련하여 인간 단핵구 유래 DC, EBV 형질전환된 림프아세포양 B 세포주(LCL1), 및 인간 모유(이하 간단히 "우유"라고도 칭함)로부터 단리된 엑소좀을 비교하였다. 엑소좀은 유세포 분석법에 의해 검출될 수 있는, 녹색 형광막 염료인 PKH67로 염색되었다. 엑소좀이 적절하게 표지화되었는지 그리고 그들의 구조가 PKH67로 염색된 후 유지되었는지의 여부를 확인하기 위하여, 엑소좀을 자성 항-MHC 제II급 비드에 결합시켰다. 유세포 분석 결과 녹색 형광 MHC 제II급 함유 소포가 비드에 포획된 것으로 판명되었고, TEM은 고유한 지질 2층을 지니는 나노-소포를 표시하였는 바, 이는 PKH67 표지화가 엑소좀 형태를 간섭하지 않는 것을 나타낸다. 상이한 엑소좀을 이어서 PBMC에 의해 1 혹은 4시간 공-배양하고, 다색 유세포 분석법에 의해 분석하여 세포에 대한 엑소좀의 결합 패턴을 평가하였다. 1시간 후 DC-유래 엑소좀이 주로 단핵구와 상호작용한 반면(HLA-DR⁺CD14⁺; 평균 46%), 단지 B 세포에 대해서 단지 17%가 결합되었다(HLA-DR⁺CD14^-CD19⁺; 도 4A). 이에 대해서, LCL1 엑소좀은 B 세포에 대해서 강한 우선권을 지니는 연관(즉, 결합)의 역패턴을 보였다. B 세포의 63%가 LCL1 엑소좀에 대해서 양성인 반면 평균 약 17%의 단핵구가 이들 엑소좀과 1시간에 연관되었다(도 4B). 4시간의 공-배양 후, 각 세포 모집단 내에 엑소좀 양성 세포의 퍼센트의 일반적인 증가가 있었지만, 상이한 세포 모집단에 대해서 현저한 연관 패턴이 남아있었다(도 4D 내지 도 4F). 우유 엑소좀 상호작용은 1시간의 공-배양 후에 대체적으로 낮았다(도 4C). 그러나, 4시간째에, 55%의 단핵구와 18%의 B 세포가 우유 엑소좀과 연관되었고(도 4C), 이는 1시간째에 DC 엑소좀에 대한 패턴과 유사하였다. 이전에 본 발명자는 우유 엑소좀 제제가 다른 엑소좀 유형으로부터의 펠릿에 비해서 엑소좀 펠릿에서의 총 단백질량에 관하여 엑소좀 소포의 보다 낮은 함량을 지니는 것을 발견하였다. 따라서, 우유 엑소좀의 양을 5배 증가시킨 경우(50㎍/5×10⁵ PBMC), 1시간째의 우유 엑소좀 상호작용의 레벨이 단핵구에 의해 평균 64%, B 세포에 의해 26%에 도달하였다(n = 3, 데이터 표시 생략). 이들은 10㎍/5×10⁵ PBMC에서의 DC 엑소좀을 이용해서 배양한 경우에 보여지는 것과 견줄만한 레벨로, 이는 다른 엑소좀 제제와 비교해서 우유 엑소좀 제제 중의 비엑소좀(non-exosomal) 단백질의 양이 보다 높을 것을 암시한다.

T 세포가 대다수의 PBMC(본 연구에서는 대략 70%)를 구성하고 있지만, CD4⁺ 혹은 CD8⁺ T 세포의 8% 미만이 4시간 후에 엑소좀의 어느 것과의 연관을 나타내었다(도 4). 상이한 엑소좀 유형을 지니는 CD8⁺ T 세포와 비교해서 CD4⁺에 대한 우선권에 있어서 어떠한 일관된 차이도 관찰되지 않았다.

엑소좀은 B 세포의 세포막과 주로 연관되지만 단핵구에 의해 내재화된다.

다음에, 본 발명자는 엑소좀이 상이한 세포 유형 내에 편재(localization)하고 있는 경우를 찾았다. 본 발명자는 PKH67 표지화된 엑소좀을 PBMC를 이용해서 공-배양하고 공초점 레이저-주사 현미경(CLSM)에 의해 엑소좀 연관을 분석하였다. 아마도 유세포 분석법에 비해서 CLSM에서 보다 낮은 검출 레벨로 인해, 1시간째에, 일반적으로 아무것도 없거나 단지 1주일에 엑소좀 신호가 세포와 연관하여 검출되었다(데이터 표시 생략). 4시간 후에, DC 엑소좀이 단핵구(CD14⁺)에 의해 B 세포(CD19⁺)보다 낮은 정도로 주로 내재화되었고, 이는 종종 세포막 연관된 엑소좀을 지녔다(도 5A). 이와 대조적으로, LCL1 엑소좀은 B 세포와 높은 정도로 상호작용하였고, 세포막에 주로 편재되었다(도 5B). 단핵구는 LCL1 B-세포 엑소좀에 대해서 보다 약한 신호를 보였다(도 5B). 일반적으로, 우유 엑소좀은, 유세포 분석법에서 보여지는 바와 같이, 약한 신호를 보였고, B 세포의 세포막에 연관되거나 단핵구 내에 내재화된 것으로 검출되었다(도 5C). 엑소좀과 CD3⁺ T 세포 간에 상호작용이 (대략 50개의 세포 중 1개로) 일어난 소수의 경우에, 엑소좀은 세포막 부근에 혹은 세포막과 접촉하여 주로 편재화되었다(데이터 표시 생략). 이와 같이 해서, 이들 CLSM 데이터는 본 발명자의 유세포 분석 데이터와 일치하여, EBV-형질전환된 B 세포로부터의 엑소좀이 우선적으로 B 세포를 표적화하는 반면, DC-유래 엑소좀은 단핵구와 더 많이 연관한다. 그러나, 이들 결과는 또한 엑소좀이 상이한 세포 유형과는 상이하게 상호작용하는 것을 암시하며, 여기서 엑소좀은 대부분 B 세포 및 T 세포의 세포막과 연관된 채로 있지만, 단핵구에 의해 내재화되어 있다.

다른 전형적인 접근법에 의해 면역 세포를 이용해서 상이한 엑소좀의 연관 및 편재화를 검증하기 위하여, ImageStream 시스템을 이용하기로 결정하였다. 이 시스템은 유세포 분석기와 형광 현미경이 조합된 것으로, 유동 세포를 매우 고속으로 통과하여 각 세포의 멀티스펙트럼 화상을 자동적으로 포착하여, 샘플 당 다수의 세포의 화상-기반 분석을 가능하게 한다. 내재화 특성을 이용해서, 표면 연관된 엑소좀, 내재화된 엑소좀 혹은 이들 양쪽 모두(중간: 도 5D)를 지니는 단핵구(HLA^-DR⁺CD14⁺)를 구분하였다. 기술적 이유로 인해, B 세포 데이터는 얻어지지 않았지만, 입수된 단핵구 데이터는 본 발명자의 종래의 유세포 분석법 및 CLSM 데이터와 일치하였다. ImageStream은 DC 엑소좀 및 우유 엑소좀이 단핵구와 우선적으로 연관되는 한편 LCL1 엑소좀은 그렇지 않은 것을 표시하고 있었다(도 5E). 또한, 대부분의 단핵구가 각종 엑소좀을 내재화한 것으로 보여, 본 발명자의 이전의 지견을 보강하고 있었다(도 5F). 여기서, 본 발명자는 또한 이 방법이 다수의 세포에서의 엑소좀 편재화의 정량화를 실현가능하게 하는 것도 알게 되었다.

LCL1 -유래 엑소좀과 B 세포 간의 결합은 온도 의존적이다.

상이한 엑소좀의 PBMC와의 연관이 수용체 매개되는지 활성 내재화에 의존하는지를 연구하기 위하여, PKH67⁺ 엑소좀을 PBMC를 이용해서 4℃ 및 37℃에서 공-배양하였다. 모두 3가지 엑소좀 유형에 대해서, 배양이 4℃에서 1시간 및 4시간 수행된 경우 단핵구와의 연관이 감소되었고(도 6A 내지 도 6F), 이는 이 세포 유형에 의한 활성, 가능하게는 포식성 흡수를 나타낸다. B 세포와의 DC 엑소좀 연관(도 6A 및 도 6D) 및 우유 엑소좀 연관(도 6C 및 도 6F)은 저온 조건 하에 유사하게 줄어들었다. 이에 대해서, LCL1 엑소좀과 B 세포 간의 상호작용의 단지 근소한 감소가 두 시점에 있어서 4℃에서 보였다(도 6B 및 도 6E). 이와 같이 해서, LCL1 엑소좀과 B 세포 간의 상호작용은 크게 온도-의존적이었고, 따라서 유착 분자 혹은 표면 수용체를 통해 더욱 매개되기 쉽고, 따라서 이 상호작용의 더욱 상세한 조사를 착수하였다.

LCL1 -유래 엑소좀과 B 세포 간의 결합은 B 세포 상에 발현된 CD21 에 의존한다.

B 세포가 인간 보체 수용체 2(CD21)와 같은 세포 표면 수용체를 발현하고, 이는, 유착 분자, 예컨대 ICAM-I 혹은 인테그린, 예컨대 LFA-1(CD11a/CD18), Mac-1(CD11b/CD18) 혹은 pl50,95(CD11c/CD18)의 별개의 패턴과 함께, B-세포 엑소좀의 관찰된 강력한 B-세포 우선권을 매개할 수 있다. 엑소좀 결합의 특이성을 밝히기 위하여, CD21 혹은 CD18에 대한 mAb들이 엑소좀에 의한 배양 전에 PBMC에 첨가되었다. LCL1 엑소좀과 말초 혈액 B 세포 간의 상호작용은 항-CD21에 의해 효율적으로 차단될 수 있었던 반면, 항-CD18 Ab들에 대해서는 차단 효과는 관찰되지 않았다(도 7A).

관찰된 B-세포 표적화가 B 세포의 EBV 형질전환에 의존했는지의 여부를 밝히기 위하여, EBV 음성 B 세포주인 BJAB로부터의 엑소좀과 비교하였다. 그 결과, BJAB 엑소좀이 LCL1 엑소좀에 비해서 B 세포에 10배 낮은 정도로 결합한 것으로 나타났으며, 이는 이 결합에서 EBV-유래 단백질 혹은 EBV-유도 단백질의 연루를 암시한다(도 76). 종합해보면, 이들 데이터는 LCL1 엑소좀과 B 세포 간의 결합이 LFA-1, Mac-1 혹은 pl50,95에 의존하지 않고 CD21과의 상호작용에 의존하는 것을 나타내며, 이는 EBV-형질전환된 B 세포로부터 유래된 엑소좀에 대해서 특이적이었던 선택적 B-세포 엑소좀 표적화를 암시한다.

LCL1 - 엑소좀 상의 gp350 은 B 세포에 대한 결합을 매개한다.

다음에, 본 발명자는 B 세포 상에 결합하는 CD21에 관련된 엑소좀 리간드를 해명하는 것을 목적으로 하였다. CD21에 대한 공지된 리간드는 IgE(CD23), EBV 엔빌로프 당단백질 gp350 및 보체 인자 C3d에 대한 저 친화도 수용체를 포함한다. 이것은 B 세포 및 대식세포로부터 방출된 엑소좀이 C3-단편을 포함하지만, 가열 불활성화된 소 태아 혈청(fetal calf serum: FCS)이 본 발명자의 모든 배양액에서 이용되었으므로, C3d가 여기서는 차이를 만들 가망성이 없는 것으로 판명되었다. EBV 형질전환된 B-세포주 상에 고도로 발현되는 CD23은 본 발명자의 LCL1 엑소좀 상에서 검출되었지만 BJAB 엑소좀 상에서는 검출되지 않았다. EBV 당단백질 gp350은 B 세포에 대한 바이러스 유착을 위해 필수불가결한 용해 단백질이지만, 지금까지 엑소좀 상에 존재하는 것으로 보고된 바는 없다. 그러므로, gp350 및 CD23은 엑소좀-B-세포 상호작용에 있어서 그들의 가능한 관여를 위해 연구될 본 발명자의 제1후보자였다. 이들 리간드는 항-gp350/220 혹은 항-CD23 Ab들에 의해 차단되었다. B 세포에 대한 LCL1 엑소좀의 결합은 gp350을 차단할 경우 실질적으로 저감되었지만, 흥미롭게도 CD23이 차단되었을 경우 엑소좀 결합의 저감은 보이지 않았다(도 7C). 이 관찰은 LCL1 엑소좀의 표면 상에의 gp350의 존재를 암시하며, 이 EBV 단백질은 CD23이 아니라 엑소좀 결합을 매개한다. 대조예로서, 비-중화 항-gp350 mAb(2L10)를 또 첨가하였는 바, 이는 엑소좀 결합을 차단하지 않았고(데이터 표시 생략), 따라서 중화 mAb(72A1)를 통한 gp350의 특이적 차단의 개념을 보강하는 것이다. LCL1 세포 중의 gp350의 존재는 유세포 분석법 분석에 의해 확인되었고(도 7D), 엑소좀에 대해서는 면역 블로팅에 의한 수크로스 구배에 있어서, gp350이 HLA-DR 및 CD81과 공-편재화(co-localized)되어 있었다(도 7E). 이들 마커는 또한 부분적으로 EBV-코딩된 잠복성 막 단백질 1(LMPl)과 공-편재화되었고, 이것은 엑소좀 상에서 이전에 확인된 바 있었다. 예측되는 바와 같이, gp350이나 LMP1은 어느 것도 BJAB 엑소좀에서 검출되지 않았다(도 7E).

엑소좀 신호는 엑소좀으로부터 유래되지만 바이리온으로부터는 유래되지 않는다.

LCL1 세포와 엑소좀의 양쪽 모두 상에서 gp350의 발현은, 본 발명자의 LCL1 세포들의 일부가 EBV 수명 사이클의 용해 단계에 있는지의 여부를 문제삼으며, 이는 EBV가 유리 바이러스 입자들로서 EBV 형질전환된 B-세포 배양액 중에 또한 잔존할 수 있는 것을 의미하는 것이다. 따라서, 바이리온이 본 발명자의 엑소좀 제제를 오염시킬 수 있고, 이에 따라서 본 발명자의 실험에 있어서 엑소좀에 대한 거짓된 양의 신호를 부여할 가능성이 있다. 예비 실험에 있어서, 본 발명자는 PCR에 의해 바이러스 DNA를 검출하였지만, DNA의 존재는 완전한 바이리온의 존재에 항상 대응하는 것은 아니다. 그러므로, 더욱 민감한 제대혈 분석평가는, 본 발명자의 엑소좀 제제에서 EBV 입자를 검출하기 위한 TEM 및 면역 EM 분석뿐만 아니라 감염성 EBV 바이리온의 존재를 조사하는데 이용되었다. BJAB 및 LCL1 상청액으로부터의 엑소좀 제제뿐만 아니라 10,000×g 펠릿(엑소좀 단리 절차 동안 중간 원심분리 단계 동안 얻어짐)을 제대혈 단핵 세포(CBMC)에 첨가하여 EBV 형질전환된 1차 B 세포의 증식을 모니터링하였다(도 8A). 잘 확립된 EBV-생산 마모셋(marmorset) B-림프아세포양 세포주(B95-8)로부터의 상청액을 양성 대조군으로서 이용하였다. BJAB 상청액으로부터의 혼주(pooled) 10,000×g 펠릿의 첨가는 ³H-티미딘 혼입에 의해 정량화된 바와 같이 LCL의 증식을 초래하지 않았다. 또한, 배양액의 육안 조사 결과, 형질전환된 B 세포의 어떠한 전형적인 응집물도 보이지 않았다. 이에 대해, LCL1 상청액으로부터 CBMC으로의 혼주 10,000×g 펠릿의 첨가는 LCL1 세포에 의한 감염성 바이러스 입자의 생산을 나타내는 LCL의 증식을 초래하였다. 이 지견은 LCL1 세포 상의 gp350의 관찰된 세포 표면 발현(도 7D)과 일치한다. 그러나, BJAB 및 LCL1 상청액으로부터의 엑소좀 제제(100,000×g)의 CBMC에의 첨가 후에 LCL의 증식은 관찰되지 않았으며, 이는 본 발명자의 LCL1 엑소좀 제제 내에 감염성 EBV의 부재를 나타낸다. 이와 같이 해서, LCL1에 의해 생산된 모든 바이리온은 10,000×g 원심분리 단계 동안 아래쪽으로 펠릿화된다. 또한, LCL1 세포로부터의 엑소좀 제제가 헤르페스 바이러스에 대한 일반적인 특성인 임의의 다형체 EBV 입자를 포함하는지의 여부를 TEM 및 면역 EM에 의해 조사하였다. 1차 B 세포(도 8B)에 유착된 엑소좀이나 엑소좀 제제 단독(도 8C 및 도 8D)의 어느 것도 감염성 EBV의 크기(200 nm)의 어떠한 EBV 입자 혹은 노출된 고밀도 바이러스 캡시드(capsid)를 드러내지 않았다. 대략 100㎚의 소포만이 보였고, 여기서 대다수는 CD63 및 HLA-DR로 표지화되어 있으며, 이는 엑소좀을 나타낸다(도 8C). 이들 결과는 또한 면역블롯에 의한 본 발명자의 지견과 일치하며, 여기서 gp350은 HLA-DR 및 CD81과 공-편재화하였다(도 7E). 크기 분포는 나노입자 트래킹 분석(nanoparticle tracking analysis: NTA; NanoSight)에 의해 더욱 조사되었다. 이 방법은 EBV에 비해서 평균 100㎚ 정도를 지니되 150㎚ 이상에서 정상부를 지니는(도 8E), LCL1-엑소좀 제제 및 BJAB-엑소좀 제제 내에 보다 낮은 크기 범위를 정량적으로 확인하였으며, 본 발명자의 엑소좀 제제에서 바이리온의 부재를 더욱 지지한다.

논의

상이한 세포 유형들이 그들의 세포 기원을 주로 반영하는 표현형을 지니는 엑소좀을 생산하는 것은 공지되어 있다. 여기서, 본 발명자는 엑소좀 소통 경로의 다른 쪽을 주시하여, MDDC 및 모유 양쪽으로부터 테스트된 엑소좀이 인간 말초 혈액 내의 동일 주요 표적, 즉, 단핵구를 지니는 것으로 여겨지는 것을 입증하였다. 엑소좀은, 단핵구에 도달하면, 아마도 식균 현상에 의해 활성적으로 포식성으로 되고, 이것은 또한 대식세포 등과 같은 다른 포식세포에 의한 엑소좀 흡수 기전인 것이 입증되었다. 그러나, 이것은 또한, 엑소좀 생산 세포가 병원균-특이적 분자를 담지한다면 단핵구를 표적화하는 엑소좀의 선택성이 변할 수 있는 것을 나타내며, 이는 본 발명자가 여기서 EBV 음성 세포주(BJAB)로부터의 엑소좀을 EBV 양성 B-세포주(LCL1)의 것과 비교함으로써 입증하였다. LCL1-유래 엑소좀은 B 세포를 주로 표적화하고 있지만, 이것은 BJAB 엑소좀에 대해서는 볼 수 없었다. LCL1 엑소좀과 B 세포 간의 상호작용은 B 세포 상의 CD21 또는 엑소좀 상의 gp350에 대한 Ab들에 의해 효과적으로 차단되었지만, 항-CD18에 의해서도 항-CD23에 의해서도, EBV의 연루는 입증되지 않았다. CD23이 BJAB에 비해서 LCL1 상에 더욱 풍부하더라도 항-CD23이 왜 세포-엑소좀 상호작용에 영향을 미치지 않는지는, gp350-CD21 상호작용에 비해서 CD23과 CD21 간의 상호작용의 보다 낮은 친화도에 연유할 수 있었다. 이것은 매우 높은 분자 친화도가 생체외에서(아마도 생체내에서 심지어 더욱 중요함) 엑소좀의 신속한(1시간) 결합을 위해 필요한 것을 나타낸다.

DC 및 B-세포 엑소좀이 예컨대 T 세포 상에 발현된 LFA-1에 결합하는 세포간 유착 분자(ICAM)-1를 발현하는 것으로 공지되어 있지만, 각종 엑소좀의 T 세포와의 상호작용은 오히려 낮았다(엑소좀에 대해서 양성인 T 세포의 8% 미만).

본 발명자자가 LCL1 엑소좀에 대한 gp350에 대해 가졌던 관찰은, 본 발명자의 엑소좀 제제에서의 감염성 및/또는 다형성 EBV 입자에 대해 가졌던 의문을 증가시켰고, 이는 B 세포 상에 보였던 PKH67 신호에 연유할 수 있었다. CD21에 대한 EBV의 결합은 잘 확립되어 있다. 민감한 제대혈 형질전환 분석평가뿐만 아니라 TEM 분석(도 8B 내지 도 8D)을 이용함으로써, 본 발명자는 본 발명자의 엑소좀 제제 내의 바이리온에 대한 어떠한 증거도 발견하지 못했다. 이와 같이 해서, 이는 시료가 원심분리에 의해 바이리온을 제거한 것으로 여겨지며, 따라서, 바이리온은 B 세포 상에 보여진 형광 신호의 원인일 것이라고 하는 가망성은 없는 것으로 생각된다.

gp350-내포 엑소좀을 경유한 표적화된 B-세포 상호 소통의 본 발명자의 신규한 지견은 생체내에서의 상황을 또한 반영할 수 있다. Gp350-내포 엑소좀은 EBV의 무증상성 담체에서 분비될 수 있고, 본 발명자는 엑소좀의 미감염 B 세포에 대한 결합이 바이리온 결합의 효율을 낮출 수 있고, 따라서 EBV 도입 수용체의 봉쇄에 의해 감염을 낮출 수 있는 것으로 생각하였다. 현재의 연구에서, 본 발명자는 또한 EBV 형질전환된 B 세포가 EBV 음성 B 세포에 비해서, 단백질 농도로서 측정된, 더 많은 엑소좀을 생산한 것처럼 관찰하였다. 이것은 생체내 상황을 또 반영할 수 있고, 여기서 보다 많은 수의 엑소좀이 EBV 감염의 확산을 제어하는데 기여할 수 있다. 대안적으로, 엑소좀 생산의 유도 및 gp350의 엑소좀 발현은 EBV의 면역 조절 잠재성에 기여할 수 있다.

본 발명자의 지견은 또한 엑소좀이 예컨대 gp350의 발현을 유도함으로써 어떻게 유전공학적으로 조작되어 B 세포에 대한 그들의 세포 표적화를 수정할 수 있는지를 암시하며, 이는 그들의 치료 유용성을 강화할 수 있다. 완전 T-세포 반응을 생성함에 있어서의 B 세포의 역할은 이미 80년대에 제시되어 있었다. 또한, B 세포는 장기간 T-세포 면역성을 달성함에 있어서 특히 중요하고, 최근에 본 발명자는 엑소좀이 생체내에서 항원 특이적 T-세포 반응을 발생하기 위하여 활성화된 B 세포의 지원을 필요로 하는 것을 나타내었다. 그러므로, 암 백신에서 B 세포를 표적화함으로써, 내성이 파괴될 수 있어, 더 많은 장기 지속 T 세포 면역성이 달성될 필요가 있다. 또한, CD21은 B 세포에 의해 발현될 뿐만 아니라, 난포성 수지상 세포(FDC)에 의해서도 발현된다. 이것은 표면-연관된 gp350을 지니는 엑소좀이 생체내에서 FDC를 표적화할 수도 있고, 따라서 생체내에서 가능한 면역 활성화 및 메모리를 증강시킬 수 있는 것을 의미한다.

끝으로, 본 발명자는, 모유에서 발견되고 인간 단핵구 유래 DC 및 EBV 음성 B 세포주에 의해 생산된 엑소좀들이 B 세포와 우선적으로 연관하지 않는 것을 밝혔다. 대신에, 이들은 주로 단핵구를 표적화하여, 우유 엑소좀 및 DC 엑소좀에 대해서 입증된 바와 같이, 활성적으로 엑소좀을 포식한다. 그러나, B 세포가 그의 용해 상태에서 EBV를 내포한다면, 생산된 엑소좀이 단핵구로부터 B 세포를 향하여 그들의 우선도를 변화시킴으로써, 엑소좀 연관된 gp350이 B 세포 상에서 EBV 도입 수용체인 CD21에 결합된다. EBV 형질전환된 B 세포로부터 유래된 엑소좀은 EBV 감염 동안 B-세포에 의한 바이러스 흡수를 저감시키는 역할을 한다. 또한, B 세포를 표적화하는 엑소좀들은 세포 및 호르몬 유형의 양쪽 모두의 장기간 면역 반응을 유발함에 있어서 잠재적으로 효율적일 수 있고, 따라서, 이들은 암 및 감염성 질환의 치료에서 잠재적인 도구로서 간주될 필요가 있다.

임상 프로토콜

항원-내포된 ETBT 엑소좀 혹은 항원-내포된 DC 엑소좀 혹은 항원-내포된 CD40-자극된 B 세포 엑소좀의 암 환자에의 투여는 B Escudier 등(위에 기재됨)에 의해 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.

모델 연구

본 발명에 따르면 엑소좀 상의 EBV-유래 당단백질 gp350은 생체외에서 CD21을 통해서 인간 B 세포를 특이적으로 표적화한다. 본 발명의 발명자는, 또한 마우스 모델에서, B 세포 활성화가 강력한 OVA(오브알부민) 내포된 엑소좀-유도 T 세포 반응을 위해 필요한 것을 밝혀내었다. 따라서, 모델 연구는 CD21를 통해서 gp350을 담지하는 엑소좀으로 B 세포를 표적화하는 것이 B 세포 활성화를 용이하게 할 수 있고 또한 T 세포 반응을 생체내 및 생체외에서 유발시킬 수 있는지의 여부를 테스트하기 위한 것이다. gp350은 입체 장애로 인해 마우스 CD21에 결합하지 않으므로, 대안적인 모델이 쥣과 계통에서 이용된다.

C3d는 보체 인자 C3의 35kDa 프로테아제 내성 단편이고, 보체 활성화 과정에서 생성된다. 다수의 연구에 의하면, B 세포 상의 CD21이 C3d-표적화된 항원을 결합하여 C3d이 분자 조제로서 이용될 수 있고, 이것은 CD19에 의한 BCR의 가교를 초래함으로써 B 세포 활성화의 역치를 저감시킬 뿐만 아니라 신호의 크기를 증폭시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다. CD21은 C3d의 세 복제물로 인공적으로 태그화(tagging)된 모델 항원이 미변형된 항원의 최소 면역 용량의 0.001%인 농도에서 면역성을 보이게 한다. C3d의 역할은 다음과 같이 요약할 수 있다:

C3d 태크화에 의해 항원을 CD21(CR2)에 표적화하는 것에 의해 모든 B 세포 및 FDC에서의 Ag 처리 및 Ag 제시를 증가시킨다

CD21과 BCR 간의 가교로 인해 Ag-특이적 B 세포의 전체 활성화를 가져온다

C3d-태그화된 항원은 비장 내 FDC에 의해 포획되어, 연장 기간 동안 세포 표면에 결합된 채로 있어 메모리 B 세포를 생성하여 유지한다.

C3d는 항원을 이용해서 다합체(multimer)를 형성함으로써 혹은 단백질 담체로서 작용함으로써 항원의 생체내 수명을 증가시킬 수 있다.

모델 연구의 실험절차:

BMDC 배양:

BMDC(골수 수지상 세포)를 IL-4 및 10% GM-CSF 조건조절된 배지(Ag8653/X63 클론)의 존재 하에 골수 줄기세포로부터 생성하였다. 6일째에, 배양 상청액의 50%를 새로운 배지로 교체하였다. 엑소좀 상에 OVA 내포를 위하여, 300㎍ OVA 단백질을 6일째에 DC 배양에 첨가하고 나서 하룻밤 배양하고, 이어서 1회 세척하고, 그 후 이 배양액에 LPS를 첨가하였다. 48시간 후, 배양 상청액으로부터 초원심분리에 의해 엑소좀(OVAExo)을 정제하였다.

DC(수지상 세포) 배양 상청액으로부터의 엑소좀의 제조

배양 상청액을 3,000×g에서 원심분리하고 나서 10,000×g에서 30분간 원심분리하였다. 엑소좀을 100,000×g에서 2시간 펠릿화하고, 100,000×g에서 세척하였다. 펠릿화된 엑소좀을 PBS 중에 용해시켰다. 단백질 함량은 DC 단백질 분석평가법(Biorad)에 의해 측정하였다.

FACS에 의한 엑소좀의 표현형 분석

엑소좀 10㎎을 항-CD9 항체로 사전에 피복된 알데하이드/황산염 라텍스 비드 10㎕로 배양하고, 실온에서 하룻밤 회전시켰다. 이 반응은 100mM 글라이신(Sigma) 1㎖로 정지시켰다. 엑소좀을 지닌 비드를 H-2Kd, CD9, CD54, CD80, CD81, CD86, C3d(BD Biosciences, 미국 캘리포니아주의 새너제이시에 소재) 및 대응하는 동종형 정합된 항체에 대해 특이적인 FITC 혹은 PE 컨쥬게이트된 항체의 패널로 표지화하였다.

OVAExo 상에의 C3d 연결:

OVAExo 상에 C3d를 연결하기 위하여, 링커 BS3을 C3d에 혼합한 후, 30분간 배양하였다. 미반응 시약을 겔 여과에 의해 제거하고, C3d-BS3를 함유하는 용리액을 엑소좀에 첨가하였다(C3dOVAExo). 이 반응은 글라이신을 이용해서 안정화시켰다.

DO11.10 CD4+ T 세포 단리 및 생체외 T 세포 증식 평가

DO11.10 비장세포를 5μM CFSE(Carboxy Fluoroscein Succinimidyl Ester)로 37℃에서 15분간 염색하였다. 냉 PBS/10% FCS를 첨가해서 표지화를 정지시켰다. 이어서 세포를 PBS로 3회 세척하고, Pep-Exo, OVA-Exo 및 각각의 대조군으로 1×10⁶ c세포/㎖의 농도에서 공-배양하고 나서, 5% CO₂를 지닌 가습 인큐베이터에서 37℃에서 5일간 배양하였다.

생체외 T 세포 증식 분석평가

DO11.10 마우스로부터의 비장세포를 0일째에 5.5×10⁶ 세포/마우스로 각 BALB/c 마우스에 정맥 내로 적절하게 이입하였다. 1일째에, 각 마우스에게 C3dOVAExo, OVAExo 혹은 각각의 PBS 대조군으로 정맥내 면역화시켰다. 4일째에, 마우스들을 희생시키고, 비장세포들을 OVA TCR에 대해 특이적인 항-CD4-PE 항-KJl-26+-FITC 항체와 함께 항-CD3-APC로 염색하고, KJl-26+-세포의 수를 FACS에 의해 평가하였다. 림프구 조기 활성화도 FACS에 의해 항-CD69 및 항-CD25 항체를 이용해서 체크하였다.

ELISA 에 의한 혈청 항체 레벨의 결정

특이적 항체 반응을 결정하기 위하여, 미량 역가판(microtiter plate)을 OVA 단백질 10㎍/㎖로 피복하고, 하룻밤 배양하고 나서, 혈청의 일련의 희석액으로 하룻밤 배양하였다. 반응성 항체의 동종형(즉, 아이소형)은 마우스 μ 및 γ 동종형에 대해서 특이적인 알칼리성 포스파타제-컨쥬게이트된 염소 면역글로불린으로 실온에서 2시간 배양함으로써 결정하였다. p-나이트로페닐 인산 2나트륨으로 실온에서 전개를 행하고, ELISA 리더에 의해 상이한 시점에서 405㎚에서 흡광도를 측정하였다. 통상, 치료 목적으로 공정당 생산된 엑소좀의 양은 흡착 ELISA에 의한 MHC 제II급 분자의 양으로 환산해서 평가되었다. 흡착 ELISA 분석 결과는 라지 세포(Raji cell)와 연관된 MHC 제II급 분자의 총 수 및 미성숙 7일 MDDC를 계산함으로써 각각 대략 1.0 및 5.5×10⁶ MHC 제II급 분자/세포로 되는 것으로 평가되었다. 염증성 자극은 수지상 세포 상에 MHC 제II급 복합체의 축적을 유발한다. GMP 과정에 의해 약 5×10¹⁴ 엑소좀 MHC 제II급 분자를 수집하는 것이 가능해졌다.

결론

결론적으로, 이들 결과는, C3d에 결합된 엑소좀이 쥣과 계통에서 생체내에서 C3d 없는 엑소좀에 비해서 천연형 B-세포의 활성화를 통해 T 세포 반응을 유발시킴에 있어서 더욱 효과적인 것을 나타낸다. 이것은, 인간에서, C3d와 동일한 분자를 표적화하는 gp350-발현 엑소좀이 또한 gp350를 발현하지 않는 엑소좀에 비해서 B-세포의 항원 제시를 통해 T 세포 반응을 유발시킴에 있어서 더욱 효과적일 것임을 암시한다.

본 발명의 설명 및 그의 바람직한 실시형태에 관한 모든 종래의 문헌은 참조로 본 명세서에 포함된다.

구체적인 실시형태에서, 본 발명은 또한 이하의 항목에 관한 것이다:

1. 환자의 암세포 상에 발현된 항원에 대해서 면역 반응을 유발시킴으로써 인간의 암을 치료하는 방법으로서,

(a) 인간의 말초 혈액의 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료로부터 B 세포를 단리하는 단계;

(d) 감염된 B 세포를 잠복기로 형질전환시키는 단계;

(g) 상기 환자에게 상기 수집된 엑소좀을 투여하여 상기 면역 반응을 유발시키는 단계를 포함하는, 인간의 암 치료방법.

2. 환자의 암세포 상에 발현된 항원에 대해서 면역 반응을 유발시킴으로써 인간의 암을 치료하는 방법으로서,

(a) 인간의 말초 혈액의 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료로부터 B 세포를 단리하는 단계;

(d) 감염된 B 세포를 잠복기로 형질전환시키는 단계;

(e) 상기 EBV 형질전환된 B 세포를 배양하는 단계;

(f) 상기 EBV 형질전환된 B 세포로부터 분비된 엑소좀을 수집하는 단계;

(g) 상기 수집된 엑소좀을 암 항원과 접촉시켜 항원 내포된 엑소좀을 생성하는 단계; 및

(h) 상기 환자에게 항원 내포된 엑소좀을 투여하여 상기 면역 반응을 유발시키는 단계를 포함하는, 인간의 암 치료방법.

3. 상기 엑소좀 상에 잠복성 막 단백질 1(LMP-1)을 중화시키는 단계를 포함하는 것인 상기 1항 또는 2항의 방법.

4. 중화제가 Fab-단편 분자를 포함하는 것인 상기 3항의 방법.

5. 환자의 암세포 상에 발현된 항원에 대해서 면역 반응을 유발시킴으로써 인간의 암을 치료하는 방법으로서,

(a) 인간의 말초 혈액의 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료로부터 단핵구들을 단리하는 단계;

(g) 상기 암 항원 내포된 수지상 세포 엑소좀들을 환자에게 투여해서 상기 면역 반응을 유발시키는 단계를 포함하는 방법.

6. 상기 CD21-결합 단백질 부분이 gp350, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d, IFN-알파 중 하나 혹은 수개를 포함하는 것인 상기 5항의 방법.

7. 환자의 암세포 상에 발현된 항원에 대해서 면역 반응을 유발시킴으로써 인간의 암을 치료하는 방법으로서,

(a) 인간으로부터 말초 혈액의 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료로부터 B 세포를 단리하는 단계;

(c) 상기 B 세포를 배양하는 단계;

(d) 상기 B 세포를 변성시켜, CD21-결합 부분을 발현시키는 단계;

(e) CD21-결합 부분을 발현하고 있는 상기 변성된 B 세포를 암 항원과 접촉시키는 단계;

(f) 암 항원-접촉된 변성된 B 세포로부터 분비된 암 항원 내포된 엑소좀을 수집하는 단계; 및

(g) 상기 암 항원 내포된 B 세포 엑소좀을 환자에게 투여해서 상기 면역 반응을 유발시키는 단계를 포함하는 방법.

8. 상기 CD21-결합 단백질 부분이 gp350, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d 및 IFN-알파 중 한 혹은 수개를 포함하는 것인 상기 7항의 방법.

9. 환자의 암세포 상에 발현된 항원에 대해서 면역 반응을 유발시킴으로써 인간의 암을 치료하는 방법으로서,

(a) 인간으로부터 말초 혈액의 시료를 제공하는 단계;

(b) 상기 시료로부터 B 세포를 단리하는 단계;

(c) 상기 B 세포를 배양하는 단계;

(e) CD21-결합 부분을 발현하고 있는 변성된 B 세포로부터 엑소좀을 수집하는 단계;

(f) 수집된 엑소좀을 암 항원과 접촉시켜 암 항원 내포된 엑소좀을 생성하는 단계; 및

10. 상기 CD21-결합 단백질 부분이 gp350, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d 및 IFN-알파 중 한 혹은 수개를 포함하는 것인 상기 9항의 방법.

11. 암 항원 내포된 엑소좀을 생산하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 1항의 단계 (a) 내지 단계 (f); 상기 2항의 단계 (a) 내지 단계 (g); 상기 5항의 단계 (a) 내지 단계 (f); 상기 7항의 단계 (a) 내지 단계 (f); 및 상기 9항의 단계 (a) 내지 단계 (f) 중 어느 하나를 포함하는 것인 방법.

12. 상기 11항의 방법에 의해 얻어지거나 얻어질 수 있는 엑소좀.

13. 상기 12항의 엑소좀을 포함하는 암 백신.

14. 상기 12항의 엑소좀에 의해 생체외 자극된 T 세포.

15. CD21-결합 부분을 포함하는 B-세포 혹은 수지상 세포(DC) 엑소좀.

16. 상기 CD21-결합 단백질 부분이 gp350, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d 및 IFN-알파로부터 선택되는 것인 상기 15항의 엑소좀.

Claims

특이적 면역 조절용 엑소좀을 생산하는 방법으로서,
(i) B-세포를 엡스타인-바 바이러스에 감염시키는 것과 같은 적절한 수법에 의해 B 세포를 잠복기로 형질전환(transform)시킴으로써 천연형 B-세포 수용체에 결합할 수 있는 하나 이상의 부분(moiety)을 발현시키는 단계;
(ii) 상기 (i) 단계에서의 형질전환된 B-세포를 배양시키는 단계; 및
(iii) 상기 (ii) 단계에서의 상기 형질전환된 B-세포로부터 방출된 엑소좀을 수집하는 단계를 포함하되,
상기 엑소좀은 천연형 B-세포에 결합할 수 있는 하나 이상의 부분을 포함하며; 해당 엑소좀에는 1종 이상의 항원 및/또는 면역억제제가 직접 내포(direct loading) 및/또는 간접 내포(indirect loading)되는 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제1항에 있어서, 상기 방법은 상기 엑소좀 상에 잠복성 막 단백질 1(latent membrane protein 1: LMP-1)을 중화시키는 단계를 선택적으로 더 포함하는, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제2항에 있어서, 상기 LMP-1의 중화는 Fab-단편 분자에 의해 이루어지는 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 상기 B-세포 수용체가 예컨대 CD19, CD21, CD20, CD23, CD79, BAFF-R, TACI, BCMA 또는 IFN-R인 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, B-세포 수용체에 결합할 수 있는 상기 부분이 예컨대 BAFF, APRIL, gp350, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d, IFN-알파 또는 이들의 혼합체 중 하나 이상인 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원이 예컨대 1종 이상의 암 항원, 1종 이상의 바이러스 항원, 1종 이상의 박테리아 항원, 1종 이상의 면역억제제 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제6항에 있어서, 상기 1종 이상의 암 항원은 종양 세포 혹은 해당 종양 세포의 항원 활성 단편, T 세포를 자극할 수 있는 8 내지 12개의 아미노산 잔기 혹은 15 내지 24개의 아미노산 잔기를 포함하는 종양 항원 펩타이드 단편, 종양 세포 용해물(lysate) 또는 이들의 임의의 혼합물의 표면 상에 발현된 1종 이상의 항원으로부터 선택되는 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간접 내포는 1종 이상의 항원 및/또는 1종 이상의 면역억제제의 존재 하에 상기 형질전환된 B-세포를 공-배양(co-culturing)함으로써 수행되는 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 직접 내포는 예컨대 매체(medium)의 pH를 변화시킴으로써 상기 수집된 엑소좀을 1종 이상의 항원 및/또는 1종 이상의 면역억제제와 접촉시킴으로써 수행되거나, 또는 1종 이상의 항원 및/또는 1종 이상의 면역억제제의 화학적 결합인 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 자가성(autogenic) 및/또는 동종성(allogenic)인 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 예컨대, 1종 이상의 항원, 예컨대 2종 이상의 항원, 예컨대 3종 이상의 항원, 예컨대 4종 이상의 항원, 예컨대 5종 이상의 항원 또는 예컨대 6종 이상의 항원인 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환된 세포는 예컨대 적어도 2일, 예컨대 3일, 예컨대 4일, 예컨대 5일, 예컨대 6일, 예컨대 1주, 예컨대 2주, 예컨대 적어도 3주, 예컨대 4주, 예컨대 5주, 예컨대 6주, 예컨대 7주, 예컨대 8주, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 예컨대 적어도 5개월 또는 예컨대 적어도 6개월의 기간 동안 배양되는 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀은 2일마다, 예컨대, 3일마다, 예컨대 4일마다, 예컨대 5일마다 또는 예컨대 6일마다 또는 예컨대 7일마다 수집되는 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 수득량은, EBTB 세포의 배양의 약 48시간의 기간 동안, 예컨대 적어도 약 0.2㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.3㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.4㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.5㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.6㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.7㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.8㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 0.9㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 1.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 1.5㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 2.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 2.5㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 적어도 예컨대 약 3.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포, 예컨대 적어도 약 5.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포 또는 예컨대 적어도 약 10.0㎍ 엑소좀/1백만 EBTB 세포인 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀은 예컨대 초원심분리 혹은 분별 원심분리 혹은 이들의 임의의 조합에 의해 수집 및 회수되고 이어서 펠릿화된 엑소좀이 회수되며, 선택적으로, 회수된 상기 펠릿화된 엑소좀을 적절한 매체를 이용해서 세척하는 것인, 특이적 면역 조절용 엑소좀의 생산방법.
면역 조절용 엑소좀을 포함하되, 해당 엑소좀은 천연형 B-세포 수용체에 결합할 수 있는 하나 이상의 부분을 담지(carry)하고, 또한 1종 이상의 항원 및/또는 1종 이상의 면역억제제 혹은 이들의 혼합물을 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제16항에 있어서, 상기 B-세포 수용체는 CD19, CD21, CD20, CD23, CD79, BAFF-R, TACI, BCMA 또는 IFN-R인 것인 약제학적 조성물.
제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 천연형 B-세포 수용체에 결합할 수 있는 하나 이상의 부분은 예컨대 BAFF, APRIL, gp350, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d, IFN-알파 또는 이들의 혼합체로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 1종 이상의 암 항원, 1종 이상의 바이러스 항원, 1종 이상의 박테리아 항원, 1종 이상의 면역억제제 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
제19항에 있어서, 상기 1종 이상의 암 항원은 종양 세포 혹은 해당 종양 세포의 항원 활성 단편, T 세포를 자극할 수 있는 8 내지 12개의 아미노산 잔기 혹은 15 내지 24개의 아미노산 잔기를 포함하는 종양 항원 펩타이드 단편, 종양 세포 용해물 또는 이들의 임의의 혼합물의 표면 상에 발현된 1종 이상의 항원으로부터 선택되는 것인 약제학적 조성물.
제16항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 자가성 및/또는 동종성인 것인 약제학적 조성물.
제16항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 예컨대 1종 이상의 항원, 예컨대 2종 이상의 항원, 예컨대 3종 이상의 항원, 예컨대 4종 이상의 항원, 예컨대 5종 이상의 항원 또는 예컨대 6종 이상의 항원인 것인 약제학적 조성물.
제16항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 1종 이상의 면역억제제와 선택적으로 배합되는 것인 약제학적 조성물.
제16항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 혈액과 동일한 삼투성(tonicity)을 지니는 등장성 매체를 더 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제16항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀의 응집을 방지하는 하나 의상의 물질을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제16항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 약제학적 조성물은 NaCl 약 0.91% w/v의 용액인 생리식염수(normal saline: NS)를 약 300 mOsm/ℓ 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제16항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 혈청 알부민을 3%까지, 예컨대, 인간 혈청 알부민을 2%까지 또는 인간 혈청 알부민을 1%까지 더 포함하는 약제학적 조성물.
제16항 내지 제27항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물은 약 적어도 약 0.1㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.2㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.3㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.4㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.5㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.6㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.7㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.8㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 0.9㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 1.0㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 1.5㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 2.0㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 2.5㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 적어도 예컨대 약 3.0㎍ 엑소좀/㎖ 매체, 예컨대 적어도 약 5.0㎍ 엑소좀/㎖ 매체 또는 예컨대 적어도 약 10.0㎍ 엑소좀/㎖ 매체 또는 예컨대 적어도 15.0㎍ 엑소좀/㎖ 매체 또는 예컨대 적어도 20.0㎍ 엑소좀/㎖ 매체의 범위 내를 포함하는 것인 약제학적 조성물.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어질 수 있는 엑소좀을 포함하는 약제학적 조성물.
천연형 B-세포의 수용체에 결합할 수 있는 부분 혹은 제제, 단백질 및 펩타이드 단편 중 적어도 하나를 포함하는 엑소좀.
제30항에 있어서, 상기 B-세포 수용체가 예컨대 CD19, CD21, CD20, CD23, CD79, BAFF-R, TACI, BCMA 또는 IFN-R인 것인 엑소좀.
제30항 또는 제31항에 있어서, 상기 천연형 B-세포의 수용체에 결합할 수 있는 부분 혹은 제제 혹은 단백질 혹은 펩타이드 단편이 예컨대 BAFF, APRIL, gp350, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d, IFN-알파 또는 이들의 임의의 혼합물인 것인 엑소좀.
제30항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 1종 이상의 항원을 더 포함하는 엑소좀.
제30항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 내인성/자가성 또는 외인성/동종성 또는 이들의 임의의 혼합인 것인 엑소좀.
제30항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 면역자극성 혹은 면역억제성 또는 이들의 조합인 것인 엑소좀.
제30항 내지 제35항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 예컨대 바이러스, 박테리아 또는 종양 항원과 같은 임의의 기원을 지니는 것인 엑소좀.
제36항에 있어서, 상기 1종 이상의 종양 항원은 종양 세포 혹은 해당 종양 세포의 항원 활성 단편, T 세포를 자극할 수 있는 8 내지 12개의 아미노산 잔기 혹은 15 내지 24개의 아미노산 잔기를 포함하는 종양 항원 펩타이드 단편, 종양 세포 용해물 또는 이들의 임의의 혼합물의 표면 상에 발현된 1종 이상의 항원으로부터 선택되는 것인 엑소좀.
제30항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀은 1종 이상의 항원, 예컨대 2종 이상의 상이한 항원, 예컨대 3종 이상의 상이한 항원, 예컨대 4종 이상의 상이한 항원, 예컨대 5종 이상의 상이한 항원 또는 예컨대 6종 이상의 상이한 항원을 포함하는 것인 엑소좀.
제30항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 면역억제제는 예컨대 LMP-1, CTLA-4, PD1 또는 그의 임의의 혼합물인 것인 엑소좀.
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 방법에 의해 얻어질 수 있는 엑소좀.
제30항 내지 제39항 중 어느 한 항에 있어서, 의약에 이용하기 위한 엑소좀.
치료를 필요로 하는 대상체를 치료하는 방법으로서,
(i) 예컨대, 혈액 시료 등과 같은 대상체로부터 생물학적 시료를 획득하는 단계;
(ii) 상기 (i) 단계에서의 상기 시료로부터 B-세포를 수집하는 단계;
(iii) 상기 (ii) 단계에서 수집된 B-세포를, 예컨대 바이러스 등과 같은 적절한 수단에 의해 형질전환시켜, 해당 B-세포가 천연형 B-세포 수용체에 결합할 수 있는 단백질 또는 리간드를 발현시키도록 하는 단계;
(iv) 형질전환된 상기 B-세포를 배양하는 단계;
(v) 상기 (iv) 단계에서의 형질전환된 B-세포로부터 분비된 엑소좀을 수집하는 단계; 및
(vi) 상기 (v) 단계에서의 엑소좀을 상기 대상체 내로 도로 이입(transfer)시키는 단계를 포함하되,
상기 엑소좀에는 1종 이상의 항원 및/또는 면역억제제가 직접 내포 및/또는 간접 내포되는 것인, 대상체의 치료방법.
제42항에 있어서, 상기 방법은 상기 엠소좀 상에 잠복성 막 단백질 1(LMP-1)을 중화시키는 단계를 선택적으로 더 포함하는, 대상체의 치료방법.
제43항에 있어서, 상기 LMP-1의 중화는 Fab-단편 분자에 의해 이루어지는 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제44항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B-세포 수용체는 CD19, CD21, CD20, CD23, CD79, BAFF-R, TACI, BCMA 및 IFN-R 중 하나 이상인 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 B-세포 수용체에 결합할 수 있는 부분은 BAFF, APRIL, gp350, EBV gp350/220(gp350 (470t)), CD23, C3b, iC3b, C3d, IFN-알파 또는 이들의 임의의 혼합체 중 하나 이상인 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제46항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 예컨대 1종 이상의 암 항원, 1종 이상의 바이러스 항원, 1종 이상의 박테리아 항원, 1종 이상의 면역억제제 또는 이들의 임의의 조합으로부터 선택되는 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제47항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 암 항원은 종양 세포 혹은 해당 종양 세포의 항원 활성 단편, T 세포를 자극할 수 있는 8 내지 12개의 아미노산 잔기 혹은 15 내지 24개의 아미노산 잔기를 포함하는 종양 항원 펩타이드 단편, 종양 세포 용해물 또는 이들의 임의의 혼합물의 표면 상에 발현된 1종 이상의 항원으로부터 선택되는 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 간접 내포는 1종 이상의 항원 및/또는 1종 이상의 면역억제제의 존재 하에 상기 형질전환된 B-세포를 공-배양함으로써 수행되는 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 직접 내포는 예컨대 매체의 pH를 변화시킴으로써 상기 수집된 엑소좀을 1종 이상의 항원 및/또는 1종 이상의 면역억제제와 접촉시킴으로써 수행되거나, 또는 1종 이상의 항원 및/또는 1종 이상의 면역억제제의 화학적 결합인 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 자가성 또는 동종성인 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제51항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 예컨대 1종 이상의 항원, 예컨대 2종 이상의 항원, 예컨대 3종 이상의 항원, 예컨대 4종 이상의 항원, 예컨대 5종 이상의 항원 또는 예컨대 6종 이상의 항원인 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제52항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 1종 이상의 항원은 1종 이상의 면역억제제와 선택적으로 배합되는 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제53항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 형질전환된 세포는 예컨대 적어도 2일, 예컨대 3일, 예컨대 4일, 예컨대 5일, 예컨대 6일, 예컨대 1주, 예컨대 2주, 예컨대 적어도 3주, 예컨대 4주, 예컨대 5주, 예컨대 6주, 예컨대 7주, 예컨대 8주, 적어도 3개월, 적어도 4개월, 예컨대 적어도 5개월 또는 예컨대 적어도 6개월의 기간 동안 배양되는 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제54항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 대상체로부터 수집된 시료는 말초 혈액, 골수 시료 혹은 대상체의 림프계통으로부터 채취한 시료 또는 이들의 임의의 혼합물 등과 같은 혈액 시료인 것인 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제55항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀은 예컨대 정맥내, 동맥내, 골내, 경막내(intrathecal) 또는 복강내 투여와 같은 비경구 방식으로 투여되는 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀은 단일 용량 또는 다회 용량으로서 투여되는 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀은 약 20초, 예컨대 약 30초, 약 40초, 약 1분, 혹은 1 내지 2시간 이상, 예컨대 3시간 이상, 예컨대 4시간 이상, 예컨대 5시간 이상, 또는 예컨대 6시간 이상에 걸친 시간 기간에 주입되거나 주사되는 것인 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 엑소좀은 적어도 0.1 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 0.2 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 0.3 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 0.4 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 0.5 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 0.75 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 0.9 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 1.0 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 3.0 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 5.0 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 7.0 ㎎/㎏, 예컨대 적어도 10.0 ㎎/㎏ 또는 예컨대 적어도 15.0 ㎎/㎏의 용량으로 투여되는 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제59항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료방법은 질환의 중증도에 따라 1회 또는 반복해서 수행될 수 있는 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제60항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 치료는 예컨대 암, 자가면역 질환, 이식 중의 요법, 알레르기, 또는 바이러스 박테리아 감염 동안에 대한 기타 관련된 임의의 치료를 보충하는 것인, 대상체의 치료방법.
제42항 내지 제61항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 방법은 유방암, 방광암, 피부암, 전립선암, 췌장암, 난소암, 갑상선암, 위암, 두경부암 혹은 흑색종 또는 이들의 임의의 조합의 치료에 이용되는 것인 대상체의 치료방법.