JP6981619B2

JP6981619B2 - エクソソーム産生促進剤

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Publication number: JP6981619B2
Application number: JP2017097551A
Authority: JP
Inventors: 克之向井; 耕平湯山; 靖之五十嵐
Original assignee: Daicel Corp; Hokkaido University NUC
Current assignee: Daicel Corp; Hokkaido University NUC
Priority date: 2017-03-14
Filing date: 2017-05-16
Publication date: 2021-12-15
Anticipated expiration: 2037-05-16
Also published as: WO2018212250A1; US20210177778A1; JP2018150290A

Description

本発明は、エクソソームの産生を促進することができる薬剤に関する。

現在、アルツハイマー病は、認知症の原因の半数以上を占める神経変性疾患であり、治療・予防法の確立が望まれている。これまでの研究で、アルツハイマー病の病態機序の解明が進んでおり、アルツハイマー病の予防や進行抑制、改善のために、病態機序の中心となるアミロイドβタンパク質の蓄積を抑制することが重要な点の一つであると考えられている。

アミロイドβタンパク質の蓄積を抑制する薬剤については、これまでに広く研究されている。例えば、特許文献１には、水溶性ペプチド金属錯体アレイを含むアミロイド線維の形成を抑制する抑制剤が開示されている。また、例えば、特許文献２には、シソの抽出物を有効成分とする、アミロイドβタンパク質の凝集阻害用組成物が開示されている。また、例えば、特許文献３には、Ｎ−アセチルノイラミン酸、Ｎ−アセチルマンノサミン、及びシアリルラクトースの少なくとも何れか一つを含有する、ＧＮＥ遺伝子変異に起因するアミロイドβ凝集抑制剤が開示されている。

ところで、近年の研究から、脳内アミロイドβタンパク質の代謝やアルツハイマー病の発現・進行へのエクソソームの関与が示唆されている。エクソソームは、細胞から分泌される脂質二重膜に囲まれた直径３０〜２００ｎｍの膜小胞体であり、ｍＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ等の核酸やタンパク質等を内包し、細胞間コミュニケーションの担い手として機能している。

アミロイドβタンパク質は、エクソソームを介してミクログリアに移動し、その後に分解されると考えられている。例えば、非特許文献１では、神経細胞由来エクソソームが、アミロイドβ結合性糖脂質を高発現し、アミロイドβタンパク質を捕捉する能力をもつこと、脳内の貪食細胞ミクログリアと連携してアミロイドβタンパク質を除去する作用を有することが示唆されている。また、非特許文献２では、ニューロン由来エクソソームが、その表面でアミロイドβを捕捉し、ミクログリアへ輸送することで、アミロイドβタンパク質の分解効率を高めていることが示唆されている。また、例えば、非特許文献３では、エクソソームの分泌により、ミクログリアによるアミロイドβタンパク質の除去機能が促進されることが示唆されている。また、例えば、非特許文献４では、エクソソームが、脳内のアミロイドβの代謝に関与していることが示唆されている。

このように、エクソソームは、アミロイドβタンパク質の除去・蓄積抑制に関与することが知られている。従って、エクソソームの産生を促進することは、アミロイドβタンパク質の蓄積を抑制することができ、アルツハイマー病の予防・治療にも有効であると考えられる。

しかしながら、エクソソームの産生を促進し得る薬剤については、未だ十分な検討がなされていない。また、セラミドがエクソソームの産生を促進し得ることは、これまでに知られていない。

特開２０１６−１４５１７５号公報特開２０１６−１２４８６５号公報特開２０１４−２２４１３２号公報

月刊「細胞」、ニューサイエンス社発行、2016、48(1)、第44頁〜第47頁ＤｅｍｅｎｔｉａＪａｐａｎ３０，Ｖｏｌ．３０，Ｎｏ．３，３５８−３６７（２０１６）ＹｕｙａｍａＫｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．，２８９（３５），２４４８８−９８（２０１４）ＹｕｙａｍａＫｅｔａｌ．，ＪＢｉｏｌＣｈｅｍ．，２８７（１４），１０９７７−８９（２０１２）

本発明は、前記現状に鑑みて、容易に生体内でのエクソソームの産生を促進することができる、エクソソーム産生促進剤を提供することを課題とする。

本発明者は、前記課題を解決するために鋭意研究を行ったところ、セラミドが、エクソソームの産生を促進し得ることを見出した。また、特にセラミドを構成する脂肪酸の炭素数が６〜２６である場合には、エクソソームの産生をより一層効果的に促進し得ることを見出した。本発明は、これらの知見に基づいて更に検討を重ねることにより完成したものである。

即ち、本発明は、下記に掲げる態様の発明を提供する。
項１．セラミドを有効成分とするエクソソーム産生促進剤。
項２．セラミドを構成する脂肪酸の炭素数が、６〜２６である、項１に記載のエクソソーム産生促進剤。
項３．セラミドを構成するスフィンゴイド部分の炭素数が、１８である、項１又は２に記載のエクソソーム産生促進剤。
項４．エクソソーム産生促進用飲食品である、項１〜３のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤。
項５．エクソソーム産生促進用医薬品である、項１〜３のいずれかに記載のエクソソーム産生促進剤。

本発明によれば、簡便に生体内でのエクソソームの産生を促進することができる、エクソソーム産生促進剤を提供することができる。また、本発明のエクソソーム産生促進剤は、経口投与、飲食品の形態で投与又は摂取できるので、非侵襲的で患者への負担が少なく、容易に生体内でのエクソソーム産生を促進することができる。

セラミド（Ｃｅｒ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、又はグルコシルセラミド（ＧｌｕＣｅｒ）を添加した場合の２４時間後のエクソソーム粒子数を示すグラフである。こんにゃくセラミド（ｋＣｅｒ）、又はこんにゃくグルコシルセラミド（ｋＧｌｕＣｅｒ）を、５μＭ、７．５μＭ、１０μＭ添加した場合の２４時間後のエクソソーム粒子数を示すグラフである。こんにゃくセラミド（ｋＣｅｒ）存在下、こんにゃくグルコシルセラミド（ｋＧｌｕＣｅｒ）存在下、又はスフィンゴ脂質非存在下で産生されたエクソソームと、アミロイドβタンパク質（Ａβ１−４０）とをマウスミクログリア細胞に添加し、２４時間培養後の培養上清中のアミロイドβタンパク質（Ａβ１−４０）濃度を測定した結果を示すグラフである。

本発明は、セラミドを有効成分とするエクソソーム産生促進剤である。以下、本発明のエクソソーム産生促進剤について詳述する。

セラミド
本発明のエクソソーム産生促進剤は、セラミドを有効成分として使用する。

セラミドは、スフィンゴイドに脂肪酸がアミド結合した構造を有する化合物である。本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分の構造については、特に限定されないが、セラミドを構成するスフィンゴイド部分の炭素数としては、１８が挙げられる。

本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分の構造については、具体的には、例えば４−スフィンゲニン（スフィンゴシン）、４−ヒドロキシスフィンガニン（フィトスフィンゴシン）、４−ヒドロキシ−トランス−８−スフィンゲニン、４−ヒドロキシ−シス−８−スフィンゲニン、スフィンガニン、トランス−８−スフィンゲニン、シス−８−スフィンゲニン、トランス−４−スフィンゲニン、トランス−４，トランス−８−スフィンガジエニン、トランス−４，シス−８−スフィンガジエニン、シス４−シス８−スフィンガジエニン、シス４−トランス８−スフィンガジエニン等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、トランス−４，シス−８−スフィンガジエニン、シス４−シス８−スフィンガジエニン、トランス４−トランス８−スフィンガジエニン、シス４−トランス８−スフィンガジエニン、４−ヒドロキシ−シス−８−スフィンゲニン、４−ヒドロシキ−トランス８−スフィンゲニンが挙げられる。

本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸の炭素数については、特に限定されないが、６〜２６、好ましくは６〜２４、より好ましくは６〜１８が挙げられる。また、前記脂肪酸は、飽和脂肪酸、炭素−炭素二重結合及び／又は炭素−炭素三重結合を含む不飽和脂肪酸、並びにα−ヒドロキシ脂肪酸のいずれであってもよい。

本発明で使用されるセラミドにおいて、スフィンゴイド部分に結合している脂肪酸として、具体的には、ヘキサン酸（Ｃ６：０）、オクタン酸（Ｃ８：０）、デカン酸（Ｃ１０：０）、ドデカン酸（Ｃ１２：０）、テトラデカン酸（Ｃ１４：０）、ヘキサデカン酸（Ｃ１６：０）、オクタデカン酸（Ｃ１８：０）、イコサン酸（Ｃ２０：０）、ヘネイコサン酸（Ｃ２１：０）、ドコサン酸（Ｃ２２：０）、トリコサン酸（Ｃ２３：０）、テトラドコサン酸（Ｃ２４：０）、ペンタコサン酸（Ｃ２５：０）、ヘキサドコサン酸（Ｃ２６：０）、ヘプタコサン酸（Ｃ２７：０）、オクタドコサン酸（２８：０）、シス−９−オクタデセン酸（Ｃ１８：１）等が挙げられる。なお、前記脂肪酸の括弧内に示す表記「ＣＸ：Ｙ」において、ＣＸは１分子当たりの炭素数を示し、Ｙは１分子当たりの不飽和結合の数を示し、例えば「Ｃ１６：０」とは炭素数１６且つ不飽和結合数が０の脂肪酸を表す。これらの脂肪酸の中でも、好ましくはオクタデカン酸、ドコサン酸、イコサン酸が挙げられる。

セラミドは、植物由来、動物由来のいずれであってもよいが、安全性がより一層高い点で、植物由来が好ましい。

本発明で使用されるセラミドの由来植物としては、具体的には、アーモンド、アオサ、アオノリ、アカザ、アカシア、アカネ、アカブドウ、アカマツ（松ヤニ、琥珀、コーパルを含む。以下マツ類については同じ）、アガリクス、アキノノゲシ、アケビ、アサガオ、アザレア、アジサイ、アシタバ、アズキ、アスパラガス、アセロラ、アセンヤク、アニス、アボガド、アマクサ、アマチャ、アマチャヅル、アマナツ、アマリリス、アルテア、アルニカ、アロエ、アンジェリカ、アンズ、アンコール、アンソッコウ、イグサ、イザヨイバラ、イチイ、イチジク、イチョウ、イヨカン、イランイラン、ウイキョウ、ウーロン茶、ウコン、ウスベニアオイ、ウツボグサ、ウド、ウメ、ウラジロガシ、温州ミカン、エイジツ、エシャロット、エゾウコギ、エニシダ、エノキタケ、エルダーフラワー、エンドウ、オーキッド、オウゴンカン、オオバコ、オオヒレアザミ、オオムギ、オケラ、オスマンサス、オトギリソウ、オドリコソウ、オニドコロ、オリーブ、オレガノ、オレンジ（オレンジピールを含む）、カーネーション、カカオ、カキ、カキドオシ、カクテルフルーツ、カッコン、カシワ、カタクリ、カボチャ、カミツレ、カムカム、カモミール、カラスウリ、カラマツ、カラマンダリン、カリン、ガルシニア、カルダモン、カワチバンカン、カンペイ、キイチゴ、キウイ、キキョウ、キャベツ（ケールを含む）、キャラウェイ、キュウリ、キヨミ、キンカン、ギンナン、グァバ、クコ、クズ、クチナシ、クミン、クランベリー、クルミ、グレープフルーツ、クレメンタイン、クローブ、クロマツ、クロマメ、クロレラ、ケツメイシ、ゲンノショウコ、コケモモ、コショウ、コスモス、ゴボウ、コムギ（小麦胚芽を含む）、ゴマ、コマツナ、コメ（米糠を含む）、コリアンダー、コンニャク（コンニャク芋）（こんにゃくトビ粉を含む）、コンブ、サーモンベリー、サイプレス、ザクロ、サツマ芋、サト芋、サトウキビ、サトウダイコン、サフラン、ザボン、サンザシ、サンショウ、シイタケ、シクラメン、シソ、シメジ、ジャガ芋、シャクヤク、ジャスミン、ジュズダマ、シュンギク、ショウガ、ショウブ、シラカシ、ジンチョウゲ、シンナモン、スイカ、スイトピー、スイートスプリング、スギナ、スターアニス、スターアップル、スダチ、ステビア、スモモ、セージ（サルビア）、セトカ、ゼニアオイ、セミノール、セロリ、センキュウ、センブリ、ソバ、ソラマメ、ダイコン、ダイズ（おからを含む）、ダイダイ、タイム、タケノコ、タマネギ、タモギタケ、タラゴン、タロイモ、タンカン、タンゴール、タンジン、タンゼロ、タンポポ、チコリ、ツキミソウ、ツクシ、ツバキ、ツボクサ、ツメクサ、ツルクサ、ツルナ、ツワブキ、ディル、デコポン、テンジクアオイ（ゼラニウム）、トウガ、トウガラシ、トウキ、トウチュウカソウ、トウモロコシ、ドクダミ、トコン、トチュウ、トネリコ、ナガイモ、ナズナ、ナツミ、ナツミカン、ナツメグ、ナンテン、ニガウリ、ニガヨモギ、ニラ、ニンジン、ニンニク、ネギ、ノコギリソウ、ノコギリヤシ、ノビル、バーベナ、パーム、パイナップル、ハイビスカス、ハコベ、バジル、パセリ、ハダカムギ、ハッサク、ハッカ、ハトムギ、バナナ、バナバ、バニラ、パプリカ、ハマメリス、ハルカ、ハルミ、ハレヒメ、バンペイユ、ビート、ピーマン、ヒガンバナ、ヒシ、ヒジキ、ピスタチオ、ヒソップ（ヤナギハッカ）、ヒナギク、ヒナゲシ、ヒノキ、ヒバ、ヒマシ、ヒマワリ、ヒメノツキ、ヒュウガナツ、ビワ、ファレノプシス、フェネグリーク、フキノトウ、ブラックベリー、プラム、ブルーベリー（ビルベリーを含む）、プルーン、ブンタン、ヘチマ、ベニバナ、ベニマドンナ、ベラドンナ、ベルガモット、ホウセンカ、ホウレンソウ、ホオズキ、ボダイジュ、ボタン、ホップ、ホホバ、ポンカン、マイタケ、マオウ、マカ、マカデミアンナッツ、マーコット、マタタビ、マリーゴールド、マリヒメ、マンゴー、ミツバ、ミネオラ、ミモザ、ミョウガ、ミルラ、ムラサキ、メース、メリッサ、メリロート、メロン、メン（綿実油粕を含む）、モヤシ、ヤグルマソウ、ヤマ芋、ヤマユリ、ヤマヨモギ、ユーカリ、ユキノシタ、ユズ、ユリ、ヨクイニン、ヨメナ（アスター）、ヨモギ、ライム、ライムギ、ライラック、ラズベリー、ラッカセイ、ラッキョウ、リンゴ（アップルファイバーを含む）、リンドウ、レイコウ、レイシ、レタス、レモン、レンゲソウ、レンコン、ローズヒップ、ローズマリー、ローリエ、ワケギ、ワサビ（セイヨウワサビを含む）等が挙げられる。これらの中でも、好ましくは、コムギ、コメ、トウモロコシ、ダイズ、コンニャク、マイタケ、タモギタケ、柑橘類（例えば、温州ミカン、アマナツ、イヨカン、オレンジ、カラマンダリン、キヨミ、ナツミカン、タンゴール、ハッサク、ヒュウガナツ、ブンタン等）；更に好ましくはコンニャクが挙げられる。

本発明で使用されるセラミドの由来動物としては、具体的には、ウニやヒトデ、タコ、イカなどの棘皮動物、軟体動物の組織のすべてまたは一部、ウマ、ウシなど哺乳動物の脳組織および皮膚組織、さらにはヒト、ウシ、ヤギなど哺乳動物の乳およびその発酵物などの加工品などが挙げられる。

セラミドは、前述する由来植物又は動物から公知の抽出方法によって得ることができる。また、セラミドは、スフィンゴ糖脂質の酵素処理物として得られたものであってもよい。また、セラミドは商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。

スフィンゴ糖脂質の酵素処理物としては、前述の由来植物の抽出液、その濃縮液、又は前記濃縮液を精製処理した精製物の酵素処理物などが挙げられる。

スフィンゴ糖脂質は、グルコシルセラミド又はラクトシルセラミド等の、セラミドの第１級アルコール性ヒドロキシ基に糖が結合した糖脂質である。スフィンゴ糖脂質としては、前述したセラミドが得られるのであれば、特に限定されず、セラミドに、グルコース、ガラクトース、又は糖鎖等、いずれの糖が結合したものであってもよい。スフィンゴ糖脂質は、前述する由来植物から公知の抽出方法によって得ることができる。また、スフィンゴ糖脂質は、商業的に入手可能であり、市販品を使用してもよい。

スフィンゴ糖脂質の酵素処理に使用する酵素としては、スフィンゴ糖脂質の糖鎖−セラミド間の結合を加水分解する酵素であれば特に限定されず、例えば、エンドグリコセラミダーゼ（ＥＧＣａｓｅ）が挙げられる。

ＥＧＣａｓｅは、等電点及び分子量が異なる３つの分子種（ＥＧＣａｓｅＩ、ＥＧＣａｓｅＩＩ、及びＥＧＣａｓｅＩＩＩ）が知られており、分子種に応じて基質特異性が異なることが知られている。使用するＥＧＣａｓｅの分子種は、基質となるスフィンゴ糖脂質の構造に応じて適宜設定すればよい。例えば、スフィンゴ糖脂質として、セレブロシド、特にコンニャク由来のスフィンゴ糖脂質の場合であれば、ＥＧＣａｓｅＩが好適に使用される。酵素処理の条件は、所望の酵素反応が行われるよう適宜選択するとよい。

前記抽出液の濃縮方法としては、エバポレーターのような減圧濃縮装置を用いた公知の濃縮方法が挙げられる。また精製方法としては、アルカリ処理、溶媒分画、シリカゲルクトマトグラフィーなどの公知の精製方法が挙げられる。

酵素処理後、酵素処理物そのままを用いてもよいし、酵素処理物を固液分離した残渣、固液分離した残渣を乾燥させたもの、反応物そのままを乾燥させたもの等を用いてもよい。また、酵素処理物を固液分離し、更に水を添加した後、再度固液分離することにより酵素処理物を洗浄して不純物を除去したものでもよい。

本発明のエクソソーム産生促進剤において、セラミドは、１種の構造又は由来のものを単独して使用してもよく、２種以上の構造又は由来のものを組み合わせて使用してもよい。

本発明のエクソソーム産生促進剤において「セラミドを有効成分とする」とは、エクソソームの産生を促進させる標的細胞に対してセラミドを作用させることを指しており、前記セラミド自体を有効成分として使用することに止まらず、摂取又は投与されて代謝、分解、再合成等を経た後に生体内でセラミドを生成させることによりエクソソームの産生を促進する成分も有効成分として使用できる。例えば、植物由来のセラミドは、ほとんどがグルコシド化された形態で存在するが、グルコシド化されたセラミドの経口摂取であれば、代謝、分解、再合成を経て生体内でセラミドが生成し、標的細胞に対してセラミドを作用させることができるため、本発明のエクソソーム産生促進剤において有効成分として使用できる。具体的には、グルコシド化されたセラミドは、経口摂取すると、小腸で加水分解によりグルコースが遊離し、更にスフィンゴイドと脂肪酸に分解されることがあるが、血中に入るまでにスフィンゴイドと脂肪酸が結合してセラミドに再合成され、当該セラミドが標的細胞に対してエクソソームの産生を促進させることができる。

本発明のエクソソーム産生促進剤におけるセラミドの含有量としては、生体内でエクソソームの産生を促進できる有効量であることを限度として特に限定されず、用途、剤型、投与形態等に応じて適宜調整することができる。

その他の添加成分
本発明のエクソソーム産生促進剤は、前述したセラミド以外に、本発明の効果を損なわない範囲で、剤型に応じて、他の添加成分を含有していてもよい。本発明のエクソソーム産生促進剤に含有され得る添加成分としては、例えば、水、油脂類、ロウ類、炭化水素類、脂肪酸類、高級アルコール類、エステル類、植物抽出エキス類、水溶性高分子、界面活性剤、金属石鹸、アルコール、多価アルコール、ｐＨ調整剤、酸化防止剤、紫外線吸収剤、防腐剤、香料、粉体、増粘剤、色素、キレート剤などが挙げられる。これらの添加成分は、１種単独で使用してもよく、また２種以上を組み合わせて使用してもよい。また、これらの添加成分の含有量については、使用する添加成分の種類や本発明のエクソソーム産生促進剤の剤型等に応じて適宜設定される。

剤型・製剤形態・用途
本発明のエクソソーム産生促進剤の剤型については、特に限定されず、固体状、半固体状、又は液体状のいずれであってもよく、エクソソーム産生促進剤の種類、用途、投与方法などに応じて適宜設定すればよい。

本発明のエクソソーム産生促進剤の投与方法としては、特に限定されず、適用する疾患の種類に応じて適宜選択すればよく、全身投与であっても、局所投与であってもよい。具体的には、経口、経血管内（動脈内又は静脈内）、経皮、経腸、経肺、鼻腔内投与等が挙げられる。経血管内投与には、血管内注射、持続点滴も含まれる。なかでも、投与が容易であり、且つエクソソーム産生促進効果を効果的に奏させるという観点から、経口投与、経血管内投与、鼻腔内投与が好ましい。

本発明のエクソソーム産生促進剤の製剤形態については、特に限定されず、投与方法に適した製剤形態に適宜設定することができ、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤、注射剤、点滴剤、坐剤等の任意の製剤形態を挙げることができる。例えば、本発明のエクソソーム産生促進剤の投与形態が経口投与である場合は、経口投与が可能であることを限度として特に限定されないが、具体的には、飲食品及び内服用医薬品が挙げられる。

本発明のエクソソーム産生促進剤を飲食品の製剤形態にする場合、本発明のエクソソーム産生促進剤を、そのまま又は他の食品素材や添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような飲食品としては、一般の飲食品の他、特定保健用食品、栄養補助食品、機能性食品、病者用食品等が挙げられる。これらの飲食品の形態として、特に限定されないが、具体的にはカプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、リポソーム製剤等のサプリメント；栄養ドリンク、果汁飲料、炭酸飲料、乳酸飲料等の飲料；団子、アイス、シャーベット、グミ、キャンディー等の嗜好品；等が例示される。これらの飲食品の中でも、好ましくは飲料、サプリメント、より好ましくは飲料、カプセル剤が挙げられる。

本発明のエクソソーム産生促進剤を内服用医薬品の製剤形態にする場合、本発明のエクソソーム産生促進剤を、そのまま又は他の添加成分と組み合わせて所望の形態に調製すればよい。このような内服用医薬品としては、具体的には、ドリンク剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤、ハードカプセル剤）、錠剤、顆粒剤、粉剤、ゼリー剤、シロップ剤、リポソーム製剤等が挙げられる。これらの内服用の医薬品の中でも、好ましくはカプセル剤、ドリンク剤が挙げられる。

本発明のエクソソーム産生促進剤が飲食品又は内服用医薬品の製剤形態である場合、有効成分であるセラミドの含有量としては、エクソソームの産生が促進される有効量である限り特に限定されず、製剤形態に応じて適宜設定すればよいが、例えば、１〜２０質量％等が挙げられ、好ましくは３〜１０質量％、より好ましくは６〜８質量％が挙げられる。

本発明のエクソソーム産生促進剤は、エクソソームの産生促進に基づいて、症状が軽減又は改善させる疾患に対して適用することができる。例えば、エクソソームは、アルツハイマー病の発症原因の一つであるアミロイドβタンパク質の蓄積を抑制することができるので、エクソソームの産生を促進すると、アルツハイマー病の発症を抑制したり、症状を軽減したりすることができると考えられる。つまり、本発明のエクソソーム産生促進剤は、アルツハイマー病の発症を抑制したり、症状を軽減したりすることができる。このように本発明のエクソソーム産生促進剤は、アルツハイマー病予防剤としても好適に適用することができる。

また、エクソソームの産生を促進することによって症状が改善され得る他の疾患としては、例えば、パーキンソン病、前頭側頭型変性症、ポリグルタミン病などの神経変性疾患等が挙げられる。

本発明のエクソソーム産生促進剤の適用量としては、特に限定されず、製剤形態、用途、投与対象、期待される効果等に応じて適宜設定するとよい。例えば、本発明のエクソソーム産生促進剤を経口摂取する場合、摂取量としては、セラミド換算量で成人一日当たり０．６〜１０ｍｇ、好ましくは０．６〜１．２ｍｇが挙げられる。本発明のエクソソーム産生促進剤は、一日あたりの量が前述の範囲となるように、１回又は数回に分けて投与してもよい。

以上のように、セラミドを含む本発明のエクソソーム産生促進剤は、エクソソームの産生を促進することができる。本発明のエクソソーム産生促進剤は、エクソソームの産生を促進することにより、症状が改善させる疾患の治療又は予防用途に使用することができる。具体的には、例えば、本発明のエクソソーム産生促進剤は、アルツハイマー病、パーキンソン病、前頭側頭型変性症、ポリグルタミン病などの神経変性疾患等の予防又は治療用途に使用することができる。

次に、本発明を実施例によりさらに詳細に説明するが、本発明は、これらの例によってなんら限定されるものではない。

［スフィンゴ脂質の準備・調製］
以下の実験例１〜３において使用したスフィンゴ脂質は、以下の通り準備又は調製した。

動物性セラミド（Ｃｅｒ）として、Ｃ６セラミド（ｄ１８：１／６：０、Ｎ−ヘキサノイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン）、Ｃ１８セラミド（ｄ１８：１／１８：０、Ｎ−ステアロイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン）、Ｃ２４セラミド（ｄ１８：１／２４：０、Ｎ−リグノセロイル−Ｄ−エリスロ−スフィンゴシン）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）として、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ社のＣ６スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／６：０、Ｎ−ｈｅｘａｎｏｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｃ１８スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１８：０、Ｎ−ｓｔｅａｒｏｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、及びＣ２４スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／２４：０、Ｎ−ｌｉｇｎｏｃｅｒｏｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）を使用した。これらの動物性セラミドは、いずれも、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ社製の精製脂質である。

スフィンゴミエリン（ＳＭ）として、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ社のＣ６スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／６：０、Ｎ−ｈｅｘａｎｏｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、Ｃ１８スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／１８：０、Ｎ−ｓｔｅａｒｏｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）、及びＣ２４スフィンゴミエリン（ｄ１８：１／２４：０、Ｎ−ｌｉｇｎｏｃｅｒｏｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｙｌｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌｃｈｏｌｉｎｅ）を使用した。これらのスフィンゴミエリンは、いずれも、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ社製の精製脂質である。

グルコシルセラミドとして、Ｃ１８グルコシルセラミド（ｄ１８：１／１８：０、Ｄ−ｇｌｕｃｏｓｙｌ−β−１，１’−Ｎ−ｓｔｅａｒｏｙｌ−Ｄ−ｅｒｙｔｈｒｏ−ｓｐｈｉｎｇｏｓｉｎｅ）を使用した。当該グルコシルセラミドは、ＡｖａｎｔｉＰｏｌａｒＬｉｐｉｄｓ社製の精製脂質である。

こんにゃく由来グルコシルセラミド（ｋＧｌｕＣｅｒ）として、精製脂質（ＮＳ１７０３０２Ｇｌｕｃｏｓｙｌｃｅｒａｍｉｄｅ，ｆｒｏｍＫｏｎｊａｃ，純度≧９９％（ＴＬＣ））を使用した。当該こんにゃく由来グルコシルセラミドは、株式会社長良サイエンス製である。

こんにゃく由来セラミド（ｋＣｅｒ）は、前記のこんにゃく由来グルコシルセラミドに、Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ由来エンドグリコシダーゼ（ＥＧＣａｓｅＩ）を用いて加水分解を行って、グルコースを遊離させ、精製して得たものを使用した。

なお、前記スフィンゴ脂質に関する表記「ｄｗ：ｘ／ｙ：ｚ」において、「ｄ」は、１分子当たりのセラミドのスフィンゴイド部分の水酸基の数が２であることを示し、「ｗ：ｘ」は、１分子当たりのセラミドのスフィンゴイド部分の炭素数ｗと不飽和結合の数ｘを示し、「ｙ：ｚ」は、脂肪酸部分の炭素数ｙと不飽和結合の数ｚを示す。

［実験例１］
１．実験方法
（１）培養細胞へのスフィンゴ脂質処理と培養上清からのエクソソーム回収
培養細胞として、ヒト神経芽細胞腫由来ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を使用した。細胞を、培地（５０％Ｈａｍ’ｓＦ１２／５０％Ｅ−ＭＥＭ）とともに６ウェルプレートに２．５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種し、３７℃で２４時間培養した後に、前記の動物性セラミド（Ｃｅｒ）、スフィンゴミエリン（ＳＭ）、又はグルコシルセラミド（ＧｌｕＣｅｒ）のスフィンゴ脂質をそれぞれ各ウェルに添加した。スフィンゴ脂質は、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清不含培地（５０％Ｈａｍ’ｓＦ１２／５０％Ｅ−ＭＥＭ）に懸濁し、ウェル中での濃度が１０μＭとなるように添加した。スフィンゴ脂質の添加量が０μＭの場合をコントロールとした。
スフィンゴ脂質を添加して２４時間経過後に培養上清（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）を回収し、その中のエクソソームを回収した。エクソソームの回収には遠心法を用いた。具体的には、回収した培養上清について、２，０００ｇ１０分、１０，０００ｇ３０分、１００，０００ｇ７０分の段階的な遠心を行い、沈渣としてエクソソームを回収した。

（２）エクソソーム粒子数測定
遠心法で回収したエクソソームを、ＨＥＰＥＳ／ＫＣｌバッファーに懸濁した後、ナノパーティクルアナライザーｑＮａｎｏ（Ｉｚｏｎ社）で粒子数を測定した。測定値は、ＢＣＡ法で算出した由来細胞のタンパク質量（ｍｇ）当たりの粒子数として表示した。粒子数は、測定を６回行って得られた各値の平均値である。また、得られた値について、Ｏｎｅ−ｗａｙＡＮＯＶＡ法による有意差検定（^***Ｐ＜０．００１、^**Ｐ＜０．０１、^*Ｐ＜０．０５）を行った。

２．実験結果
結果を図１に示す。図１から、セラミドを添加した場合、スフィンゴミエリン又はグルコシルセラミドを添加した場合と比べて、神経細胞株におけるエクソソーム粒子数がコントロールに対して有意に増加することが認められ、セラミドがエクソソームの産生を促進し得ることが確認された。また、セラミドのなかでも、Ｃ６セラミド、Ｃ１８セラミドを添加した場合に、エクソソームの産生がより一層促進されることが確認された。

［実験例２］
１．実験方法
スフィンゴ脂質として、前記コンニャク由来グルコシルセラミド（ｋＧｌｕＣｅｒ）又はコンニャク由来セラミド（ｋＣｅｒ）を使用し、０μＭ（コントロール）を、５μＭ、７．５μＭ、又は１０μＭの濃度となるようにそれぞれ細胞に添加したこと以外は、前記実験例１と同条件で試験を行い、エクソソーム粒子数を測定した。

２．実験結果
結果を図２に示す。図２から、コンニャク由来グルコシドセラミド（ｋＧｌｕＣｅｒ）を５〜１０μＭ添加した場合は、コントロールに対してエクソソーム粒子数の増大は認められなかったが、コンニャク由来セラミド（ｋＣｅｒ）を５〜１０μＭ添加した場合、コントロールに対してエクソソーム粒子数の増大が認められた。また、コンニャク由来セラミドの添加量に応じて、エクソソーム粒子数が有意に増大することが認められた。これらの結果から、コンニャク由来セラミドは、エクソソームの産生を促進し得ることが確認された。また、セラミドの濃度の増加に伴い、エクソソームの粒子数が増加することが確認された。

［実験例３］
１．実験方法
（１）培養細胞へのスフィンゴ脂質処理と培養上清からのエクソソーム回収
培養細胞として、ヒト神経芽細胞腫由来ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞を使用した。細胞を、培地（５０％Ｈａｍ’ｓＦ１２／５０％Ｅ−ＭＥＭ）とともに６ウェルプレートに２．５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種し、３７℃で２４時間培養した後に、前記コンニャク由来グルコシルセラミド（ｋＧｌｕＣｅｒ）又はコンニャク由来セラミド（ｋＣｅｒ）のスフィンゴ脂質をそれぞれ各ウェルに添加した。スフィンゴ脂質は、３％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を含む血清不含培地（５０％Ｈａｍ’ｓＦ１２／５０％Ｅ−ＭＥＭ）に懸濁し、添加量が１０μＭとなるように添加した。スフィンゴ脂質の添加量が０μＭの場合についても同様の操作を行った。
スフィンゴ脂質を添加して２４時間経過後に培養上清（２ｍＬ／ｗｅｌｌ）を回収し、その中のエクソソームを回収した。エクソソームの回収には遠心法を用いた。具体的には、回収した培養上清について、２，０００ｇ１０分、１０，０００ｇ３０分、１００，０００ｇ７０分の段階的な遠心を行い、沈渣としてエクソソームを回収した。

（２）ミクログリア細胞へのＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞由来エクソソームとアミロイドβタンパク質の添加、及び培養液中アミロイドβタンパク質の濃度測定
培養細胞として、マウスミクログリア細胞株ＢＶ−２細胞を使用した。培地（ＲＰＭＩ１６４０）とともに６ウェルプレートに２．５×１０⁵ｃｅｌｌｓ／ｗｅｌｌとなるよう播種し、３７℃で２４時間培養した後に、前記で得られたＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞由来エクソソーム全量（培養上清２ｍＬから回収されたエクソソームの全量）と、最終濃度１０μＭとなる量のアミロイドβタンパク質（Ａβ１−４０）を各ウェルに添加した。なお、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞由来エクソソームとアミロイドβタンパク質は、血清不含培地（ＲＰＭＩ１６４０）に懸濁又は溶解させて添加した。また、コントロールとして、ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞由来エクソソームを添加せずにアミロイドβタンパク質（Ａβ１−４０）のみを添加した場合についても、同様の操作を行った。
ＳＨ−ＳＹ５Ｙ細胞由来エクソソームとアミロイドβタンパク質を添加して２４時間経過後に培養上清を回収し、培養上清中のアミロイドβタンパク質（Ａβ１−４０）の濃度をＥＬＩＳＡ法によって測定した。

２．実験結果
結果を図３に示す。コンニャク由来グルコシドセラミド存在下で産生されたエクソソームを添加した場合には、スフィンゴ脂質非存在下で産生されたエクソソームを添加した場合に比べて、アミロイドβタンパク質の濃度が約２０％も低下していた。即ち、本結果から、コンニャク由来グルコシドセラミドによって生産が亢進されたエクソソームであっても、アミロイドβタンパク質との結合能、ミクログリア細胞への反応性を有しており、エクソソームの産生量の増大によりアミロイドβタンパク質の分解能が向上することが確認された。

Claims

セラミドを有効成分とし、
前記セラミドのスフィンゴイド部分の構造が、トランス−４，シス−８−スフィンガジエニン、トランス−４，トランス−８−スフィンガジエニン、４−ヒドロキシ−シス−８−スフィンゲニン、又は４−ヒドロキシ−トランス−８−スフィンゲニンである、エクソソーム産生促進剤。
前記セラミドのスフィンゴイド部分の構造が、トランス−４，シス−８−スフィンガジエニンである、請求項１に記載のエクソソーム産生促進剤。
エクソソーム産生促進用飲食品である、請求項１又は２に記載のエクソソーム産生促進剤。
エクソソーム産生促進用医薬品である、請求項１又は２に記載のエクソソーム産生促進剤。
アルツハイマー病予防剤である、請求項１又は２に記載のエクソソーム産生促進剤。