JP2014507140A - 治療用エキソソームを検出する方法 - Google Patents
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Abstract
Description
a.補体活性の阻害(以下の表D1)
b.変性タンパク質を分解するためのプロテアソーム活性(以下の表D2)
c.ATPおよびNADHを生成するための糖分解酵素(以下の表D3)
d.NADPHを生成するためのペントースリン酸経路酵素
e.抗酸化活性(以下の表D4)
f.MMP/TIMP活性(以下の表D5)
g.生存シグナル伝達経路を活性化させるためのCD73エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性(以下の表D6)
h.イオンホメオスタシス、例えばカルシウム、ナトリウム、プロトン、カリウム、および塩化物のチャネルを回復させるためのATPase膜チャネルまたは輸送体(以下の表D7)
i.タンパク質の構造的完全性を維持するためのシャペロン活性(以下の表D8)
が含まれる。
本発明者らは、間葉系幹細胞(MSC)から由来可能である粒子、例えばエキソソームの、生物学的特性、特に生化学的特性を記載する。
上記の活性のそれぞれは、当技術分野において知られている多くの手段によって治療用エキソソームにおいて検出することができる。例えば、関連する活性は、治療用エキソソームにおける活性に関与するタンパク質またはポリペプチドの存在の検出によって検出することができる。これは、例えば、同族抗体の使用、ならびに当技術分野において知られているような免疫アッセイおよびウェスタンブロットなどによる抗体とタンパク質との間の結合の検出によって行うことができる。
タンパク質またはポリペプチドを介する活性を検出するためのウェスタンブロットハイブリダイゼーションを用いる例示的なプロトコルを以下に記載する。
質量分析などの他の方法もまた、エキソソームにおけるタンパク質またはポリペプチドの存在を検出するために用いることができる。LC−MSは、http://www.chem.agilent.com/Library/Support/Documents/a05296.pdfにある文献「Basics of LC/MS Primer」(Agilent Technologies)において詳細に記載されている。
補体阻害活性は、表D1に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか1つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
簡潔に述べると、ヒツジ赤血球(SRBC)を購入し(Innovative Research、Southfield、MI)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、その後、PBS1ml当たり1×108個の細胞で再懸濁した。精製補体成分、C5b6、C8、およびC9は、Calbiochem(San Diego、CA)から購入し、C7はSigma−Aldrich(St Louis、MO)から購入した。SRBCへのインタクトC5b−9の会合を、最終濃度が0.1μg/mlのエキソソームの存在下または不存在下で、それぞれ1mlのC5b6(0.1μg/ml)およびC7(0.4μg/ml)と共に15分間インキュベーションすること(37℃)によって開始させた。SRBCを次に洗浄し、最終濃度が0.05μg/mlのブロックCD59抗体を含むまたは含まない、それぞれ1mlのC8(0.4μg/ml)にC9(0.4μg/ml)を加えたものと共にさらに30分間インキュベートした。その後、SRBCを遠心分離し、上清内の溶解SRBCによって放出されたヘモグロビンの量を、415nmでの吸光度によって測定した。全(100%)溶血を、1%(w/v)Triton X−100で細胞を処理することによって得た。
プロテアソーム活性は、表D2に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか1つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
プロテアソーム活性を、特異的20Sプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンの存在下または不存在下で、20Sプロテアソームによる標識された基質LLVY−AMCからの切断後のフルオロフォア7−アミノ−4メチルクマリン(AMC)を検出することに基づく、20Sプロテアソーム活性アッセイキット(Millipore)を用いて測定した。簡潔に述べると、4μgのエキソソームを、25μMのラクタシスチンの存在下または不存在下で、LLVY−AMCを含有する反応緩衝液と共にインキュベートした。試料およびAMC標準を37℃でインキュベートし、Ex/Em=380/460nmでの蛍光強度を2時間モニタリングした。
20Sコア粒子の1単位の酵素活性は、1分当たり1μモルの生成物の生産に必要な活性であると規定される。
糖分解酵素活性は、表D3に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか1つまたは複数の検出によってエキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
5μgのエキソソーム(12μl内)を、細胞抽出キット(Biovision、Mountain view、CA)を用いて溶解した。溶解されたエキソソームの抽出物を、市販されているPKアッセイキット(Biovision)の50μlの反応ミックスと共にインキュベートした。このアッセイにおいて、PKによって生産されたピルビン酸をピルビン酸キシダーゼによって酸化して、蛍光を生じさせた(Ex/Em=535/587nm)。蛍光強度の増大は、したがって、生産されたピルビン酸の量に比例する。
GAPDHおよびPGKの活性を、2つの市販されているキット、すなわちKDalert GAPDHアッセイキット(Ambion Inc.、Austin、TX)およびApoSENSOR ADP/ATP比率アッセイキット(Biovision)を用いて、その下流生成物、すなわち糖分解反応におけるATPに基づいて測定した。簡潔に述べると、エキソソームを、細胞抽出キット(Biovision)を用いて溶解した。GAPDH活性を測定するために、10μgの溶解したエキソソームを、D−グリセルアルデヒド−3−ホスフェート、NAD+、およびPiを含有するKDalert反応緩衝液に添加して、1,3−ビスホスホグリセレート+NADH+H+を形成させた。250U/mlのPGKおよび60μMのADPを次に添加して、1,3−ビスホスホグリセレートおよびADPを3−ホスホグリセレートおよびATPに変換した。GAPDH活性に比例する生産されたATPの量を次に、ATPルシフェラーゼアッセイを用いて測定した。PGK活性を測定するために、10μgの溶解したエキソソームを、上記のアッセイから生産された1,3−ビスホスホグリセレートに添加した。ADPを添加して、ATPを形成させた。PGK活性に比例するATPの量を次に、ATPルシフェラーゼアッセイを用いて定量した。
H9C2心筋細胞を、ウェル当たり30000個細胞で(ポリリジン被覆された)96ウェルプレート上に平板培養した。5時間後、細胞をタイロード緩衝液で2回洗浄し、その後、20μmolのオリゴマイシン(Sigma−Aldrich)、6mmolのグルコースを含有し、0.1μg/mlのエキソソームを含むまたは含まないタイロード緩衝液内で15分、30分、および60分間インキュベートした。細胞のATP濃度を、ATPlite 1ステップ発光ATP検出アッセイ系(PerkinElmer、Zaventem、Belgium)を用いて測定した。
GAPDH(AF261085.1)の1単位の酵素活性は、1分当たり1μモルの生成物の生産に必要な活性であると規定される。
抗酸化活性は、表D4に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか1つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
細胞外マトリクス(ECM)修飾活性は、表D5に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか1つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
NT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性は、表D6に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか1つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
エキソソームにおけるCD73(NT5E)酵素活性を、50μMのAMP(Sigma−Aldrich、St Louis、MO)を含有する100μlのTris緩衝液(pH7.4)内で2.5μgのエキソソームをインキュベートすることによって決定した。AMPの加水分解から放出されたリン酸イオンの量を次に、製造者の指示通りに、Colorlock Goldキット(Innova Biosciences、Cambridge、UK)によって決定した。
1単位のエクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ酵素活性は、1分当たり1μモルの生成物の生産に必要な活性であると規定される。
イオンホメオスタシス活性は、表D7に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか1つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
シャペロン活性は、表D8に示すようなタンパク質またはその活性のいずれか1つまたは複数の検出によって治療用エキソソームにおいて検出することができ、それによって、それらを治療用エキソソームと同定することができる。
治療用エキソソームは免疫調節活性を示し得る。
免疫系は、非自己細胞または非自己組織を破壊すること、感染性物質または毒性物質を中和すること、および細胞残屑、例えば死滅細胞または死滅しかけている細胞を除去することによって、生物を疾患から保護するために主に存在する。脊椎動物において、免疫系は、自然免疫系および適応免疫系からなる。自然免疫細胞には、樹状細胞、マクロファージ、および好中球が含まれ、これらの細胞は、感染性/毒性物質、ストレスシグナル、死滅/死滅しかけている細胞、または非自己細胞の不変の特徴を認識するように遺伝的にプログラムされている。これは進化的に保存されており、防御の第一線を提供する。適応免疫細胞は、Tリンパ球およびBリンパ球である。これらは、それぞれの外来の、毒性の、または非自己の作用物質に、これらの物質に対して特異的な受容体をデノボで生成してそれらを中和または破壊のために標的化することによって適合する。他方、自然免疫細胞は、Toll様受容体(TLR)、レチノイン酸誘導性遺伝子1様RNAヘリカーゼ、ヌクレオチド結合オリゴマー化ドメイン様受容体、およびC型レクチン受容体を含むような、生殖細胞系列にコードされたパターン認識受容体(PPR)を介して、病原体関連分子パターンおよびストレスシグナルと一般に呼ばれている微生物病原体内の保存された分子署名を認識する。感染性作用物質または毒性作用物質に対する特異的受容体を生成するための適応免疫細胞の活性化は、複雑であり、自然免疫細胞によって調節される。PPRの中でも、TLRは、IgM抗体、IgG抗体、およびIgA抗体の生産、ならびにTH1細胞、TH17CD4+細胞、およびCD8+T細胞の活性化などの適応免疫応答の調節に関して最も特徴付けされたPPRである。
感染性作用物質およびそれらの生成物に対する宿主免疫の仲介におけるTLRの非常な重要性にもかかわらず、無菌性炎症応答を引き起こすための内因性リガンドによるTLRシグナル伝達の活性化は、TLRの重要な機能であるとますます考えられている。これまで、異なるTLRについて多くの内因性リガンドが同定されている(以下の表D9)。TLRは、虚血および再かん流傷害、組織の修復および再生、自己免疫疾患、ならびに腫瘍形成および腫瘍進行に関与している。
MSCは、アロ抗原、マイトジェン、およびCD3ライゲーションによって誘発されるT細胞増殖の阻害などのインビトロでの免疫調節特性を示し、B細胞の増殖およびナチュラルキラー細胞の活性を阻害する5。ヒトGVHD6およびクローン病7についてのMSCに基づいた介入の治療的有効性を試験する臨床試験が奨励されている。しかし、MSCの免疫調節特性の根底にあるメカニズムは、依然としてほとんど理解されていない。次第に、これらの特性はMSCからのパラクリン分泌によって仲介されていると考えられている8。
間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)などの馴化細胞培養培地は、細胞培養培地において間葉系幹細胞(MSC)、その子孫、またはそれに由来する細胞株を培養すること、および細胞培養培地を単離することによって得ることができる。間葉系幹細胞は、胚性幹(ES)細胞コロニーを分散させることによって細胞を得ることを含むプロセスによって生産することができる。細胞またはその子孫は、FGF2を含む無血清培地において、共培養物の不存在下で増殖し得る。
エキソソームの免疫調節活性は、THP−1細胞および遺伝子修飾されたTHP細胞株/HEKレポーター細胞株を用いて評価することができる。このような細胞株は、以下の実施例において記載されている。
間葉系幹細胞の特性は、間葉系幹細胞によって馴化された培地(MSC−CM)の特性を含み得る。このような間葉系幹細胞馴化培地を生産する方法は、当技術分野において知られており、例えばWO2009/105044の実施例1において記載されている。
エキソソーム、特に治療用エキソソームは、心保護を含む間葉系幹細胞および/または間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)の特性を有し得る。心保護は、虚血および/または再かん流の間の心臓機能の回復または維持を含み得る。
心保護は、例えば、WO2009/105044の実施例5、10、14、および20において記載されている方法のいずれか1つまたは複数を用いてアッセイすることができる。
エキソソーム、特に治療用エキソソームは、酸化ストレスを低減させる能力(または細胞保護)を含む間葉系幹細胞および/または間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)の特性を有し得る。
酸化ストレスの低減は、例えば、過酸化水素(H2O2)誘発性の細胞死のインビトロアッセイを用いてアッセイすることができる。要約すると、過酸化水素(H2O2)介在性の酸化ストレスはヒト白血病性CEM細胞において誘発され、細胞の生存能力はトリパンブルー排除によってモニタリングされる。ヒト白血病性CEM細胞を、エキソソーム、馴化培地、または間葉系幹細胞(生理食塩水を対照とする)と共にインキュベートし、50μMのH2O2で処理して、酸化ストレスを誘発させる。細胞の生存能力を、H2O2処理の12、24、36、および48時間後にトリパンブルー排除を用いて評価する。
エキソソーム、特に治療用エキソソームは、梗塞サイズを低減させる能力を含む間葉系幹細胞および/または間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)の特性を有し得る。
梗塞サイズは、例えば、WO2009/105044の実施例6および13において記載されている方法のいずれか1つまたは複数を用いてアッセイすることができる。
エキソソームは、100kDaを超える分子量を有し得る。エキソソームは、500kDaを超える分子量を有し得る。例えば、エキソソームは、1000kDaを超える分子量を有し得る。
機器の設定は、株式会社島津製作所(京都、日本)のClass VPソフトウェアによって操作される、バイナリポンプ、自動注入器、恒温カラムオーブン、およびUV可視検出器を備えた液体クロマトグラフィー系から構成された。用いたクロマトグラフィーカラムは、東ソー株式会社(東京、日本)のTSK GuardカラムSWXL、6×40mm、およびTSKゲルG4000 SWXL、7.8×300mmであった。Dawn 8(光散乱)、Optilab(屈折率)、およびQELS(動的光散乱)という検出器を、UV可視検出器の後に順に接続した。最後の3つの検出器は、Wyatt Technology Corporation(California、USA)のものであり、ASTRAソフトウェアによって操作した。試料の成分をサイズ排除によって分離し、すなわち、大きめの分子を小さめの分子よりも先に溶出させる。用いた溶離液緩衝液は、pH7.2の、150mMのNaClを有する20mMのリン酸緩衝液であった。この緩衝液を0.1μmの孔サイズを介して濾過し、使用する前に15分間脱気した。クロマトグラフィー系を、Dawn8におけるシグナルがおよそ0.3の検出器圧力単位で安定化するまで、0.5ml/分の流速で平衡化した。UV可視検出器を220nmで設定し、カラムを25℃にオーブン平衡化した。溶出モードはアイソクラチックであり、実行時間は40分であった。注入した試料の容積は、50から100mlの範囲であった。エキソソームピークと全ての他のピークとの領域%を、UV可視検出器から積分した。流体力学的半径Rhを、QELS検出器およびDawn8検出器によって計算した。ピーク頂点での最高計数率(Hz)をRhとして得た。220nmで視覚化された、分離した成分のピークを、さらなる特徴付け研究のための画分として回収した。
エキソソームは、100kDaを超える分子量を有し得る。例えば、エキソソームは、濾過すると、100kDa未満の分子量を有するエキソソームのほとんどのタンパク質が100kDaの分子量を超える残りの画分に分離されるようなものであり得る。同様に、500kDaのカットオフを有する膜での濾過を行うと、500kDaの分子量未満を有するエキソソームのほとんどのタンパク質は、500kDaの分子量を超える残りの画分に分離され得る。このことは、エキソソームが500kDaを超える分子量を有し得ることを示す。
エキソソームは、1000kDaを超える分子量を有し得る。例えば、エキソソームは、1000kDaの分子量カットオフを有する膜での濾過を行うと、関連する生物学的活性が実質的にまたは主に残りの画分に残るようなものであり得る。あるいは、またはそれに加えて、生物学的活性は、濾液画分内に存在しない可能性がある。生物学的活性は、本明細書の他の箇所に記載されるエキソソームの生物学的活性のいずれかを含み得る。
例えば、生物学的活性は、心筋虚血および再かん流傷害のあらゆる適切なモデルにおいてアッセイされるような、梗塞サイズの低減を含み得る。例えば、生物学的活性は、WO2009/105044の実施例において記載されているように、マウスモデルまたはブタモデルにおいてアッセイすることができる。
エキソソームは、2nmを超えるサイズを有し得る。エキソソームは、5nm、10nm、20nm、30nm、40nm、または50nmを超えるサイズを有し得る。エキソソームは、100nmを超えるサイズ、例えば150nmを超えるサイズを有し得る。エキソソームは、ほぼ200nm以上のサイズを有し得る。
エキソソームは、間葉系幹細胞によって分泌される1つまたは複数のタンパク質を含み得る。エキソソームは、間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)内に存在する1つまたは複数のタンパク質を含み得る。
再かん流傷害に対する心保護を付与するエキソソームなどの、分泌物中の活性成分は、当技術分野において知られている手段、および例えばWO2009/105044において記載されている手段によって単離することができる。活性成分は、間葉系幹細胞(MSC)によって分泌されるエキソソームを含み得る。
治療用エキソソームを含むエキソソームは、上記および下記のように、MSCまたはMSC−CMの代替物として用いることができる。
MSCのプロテオームの分析は、発現するタンパク質が、代謝、防御応答、ならびに血管化、造血、および骨格の発生を含む組織の分化という3つの生物学的プロセスに関与することを示す。したがって、本明細書において記載されるMSCからの治療用エキソソームは、その機能がこれらの生物学的プロセスのいずれか1つもしくは複数における役割を有し得る疾患、またはその修復もしくは治療にこれらの生物学的プロセスのいずれか1つもしくは複数が関与する疾患を治療するために用いることができる。同様に、単独で、または組み合わせて、好ましくは本明細書において記載される治療用エキソソームの形態により、MSCによって発現されるタンパク質は、このような疾患を例えば治療または予防する目的で、MSCもしくはMSCによって馴化された培地の活性を補うために、またはMSCもしくはMSCによって馴化された培地に代わって、用いることができる。
本明細書において記載される治療用エキソソームは、あらゆる適切な手段によってヒトまたは動物の体に送達することができる。
本明細書において記載される方法および組成に従って作製された間葉系幹細胞および分化細胞、ならびにそれに由来する治療用エキソソームはまた、それを必要とするヒト患者における組織の再構成または再生に用いることができる。細胞は、その細胞を意図した組織部位に移植すること、および機能が欠損している領域を再構成または再生することを可能にする様式で投与される。
本明細書において記載される方法および組成によって作製される間葉系幹細胞および分化細胞、ならびにそれに由来する治療用エキソソームは、癌の治療に用いることができる。
本明細書において記載される、治療用エキソソームを含むエキソソームは、間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)から単離または生産することができる。馴化培地およびエキソソームの生産における使用に適したMSCは、当技術分野において知られているあらゆる方法によって作製することができる。
間葉系幹細胞を生産する1つの方法は、胚性幹細胞コロニーを細胞に分散または分離させることを含み得る。
分離した細胞は、平板培養し、細胞培養物として維持することができる。
細胞は、共培養物の不存在下で培養することができる。用語「共培養物」は、共に成長させられる2つ以上の異なる種類の細胞の混合物、例えば間質性フィーダー細胞を言う。
解離または分離した胚性幹細胞は、無血清培地を含み得る培地内で培養することができる。
解離または分離した胚性幹細胞を培養する無血清培地は、1つまたは複数の増殖因子を含み得る。PDGF、EGF、TGF−a、FGF、NGF、エリスロポエチン、TGF−b、IGF−I、およびIGF−IIを含む多くの増殖因子が、当技術分野において知られている。
培養物内の細胞は通常、接触阻止によって細胞の分裂および成長が停止するコンフルエンスとなるまで、成長し続ける。このような細胞は次に、基質またはフラスコから解離させ、組織培養培地への希釈および再平板培養によって「スプリット」、二次培養、または継代することができる。
本方法はさらに、間葉系幹細胞をさらに単離または選択するための選択または選別ステップを含み得る。
[実施例]
エキソソームを、先に記載されたようにHPLCを用いて、huES9.E1由来のMSC馴化培地(CM)から精製した。簡潔に述べると、MSC培養物から回収したCMを、100kDaのMWCO(Sartorius、Goettingen、Germany)を有する膜を用いるタンジェンシャルフロー濾過(TFF)によって、50倍に濃縮した。
記載されているように、2mlの透析されたエキソソーム内のタンパク質を還元し、アルキル化し、そしてトリプシン消化した(20)。
500μlの非馴化培地および3つの独立した調製物からのエキソソームを、製造者の指示に従って(RayBio、Norcross、GA)、RayBio(登録商標)Biotin Label−based Human Antibody Array Iを用いて、サイトカインおよび他のタンパク質の存在についてアッセイした。
12μgのエキソソームを、4〜12%SDS−ポリアクリルアミドゲル上で分離し、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。
5μgのエキソソーム(12μl内)を、細胞抽出キット(Biovision、Mountain view、CA)を用いて溶解した。
GAPDHおよびPGKの活性を、2つの市販されているキット、すなわちKDalert GAPDHアッセイキット(Ambion Inc.、Austin、TX)およびApoSENSOR ADP/ATP比率アッセイキット(Biovision)を用いて、その下流生成物、すなわち糖分解反応におけるATPに基づいて測定した。
プロテアソーム活性を、特異的20Sプロテアソーム阻害剤であるラクタシスチンの存在下または不存在下で、20Sプロテアソームによる標識された基質LLVY−AMCからの切断後のフルオロフォア7−アミノ−4メチルクマリン(AMC)を検出することに基づく、20Sプロテアソーム活性アッセイキット(Millipore)を用いて測定した。
エキソソームにおけるCD73(NT5E)酵素活性を、50μMのAMP(Sigma−Aldrich、St Louis、MO)を含有する100μlのTris緩衝液(pH7.4)内で2.5μgのエキソソームをインキュベートすることによって決定した。
H9C2心筋細胞を、ウェル当たり30,000個細胞で96ウェルプレート(ポリリジン被覆された)上に平板培養した。
H9C2心筋細胞を、ウェル当たり200,000個細胞で6ウェルプレート上で平板培養し、一晩血清飢餓とした。
簡潔に述べると、ヒツジ赤血球(SRBC)を購入し(Innovative Research、Southfield、MI)、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)で3回洗浄し、その後、PBS1ml当たり1×108個細胞で再懸濁した。
エキソソームを、以前に記載されているように、HPLCによって9,10、ヒトESC由来の間葉系幹細胞であるHuES9.E113によって馴化された培養培地から精製した。質量分析および抗体アプローチを用いるプロテオミクスプロファイリングを、以前に記載されているように9−11、HPLC精製されたエキソソームの3つの独立して調製されたバッチに対して行った。全部で866のタンパク質を検出し、分析を容易にするためにこれらのタンパク質をその遺伝子記号によって示した(表E1)。これらのうち、318の遺伝子産物が、分画されていない馴化培地において先に同定された739のタンパク質において見られた9,10(図1)。
エキソソームにおけるタンパク質の生物学的有意性をさらに良く理解するために、生物学的プロセスへの866のタンパク質の機能的クラスター化を、PANTHER(進化的関係を介するタンパク質分析)分析ソフトウェアを用いて行った14,15。各生物学的プロセスにおけるエキソソームプロテオームからの観察された遺伝子頻度を、その生物学的プロセスについてのNCBIデータベースにおける参照遺伝子頻度と比較した。866の遺伝子産物を、出現頻度の高かった(p<0.001)32の生物学的プロセスおよび出現頻度の低かった(p<0.001)3つの生物学的プロセスにクラスター化することができた(図2)。
エキソソームプロテオームの1つの顕著な特徴は、糖分解(図3A)のATP生成段階における5つの酵素の全て、すなわち、グリセルアルデヒド3−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(GAPDH)、ホスホグリセレートキナーゼ(PGK)、ホスホグルコムターゼ(PGM)、エノラーゼ(ENO)、およびピルビン酸キナーゼm2アイソフォーム(PKm2)の存在であった。これらのうち、ATPまたはNADHを生成する3つの酵素、すなわちGAPDH、PGK、およびPKm2は、イムノブロッティングによって存在することがさらに確認された(図3B)。その酵素の活性は、1単位(U)の酵素活性が1分当たり1μモルの生成物の生産に必要な活性であると規定される場合に、タンパク質1μg当たりそれぞれ1.1μU、3.59μU、および5.5μUであることが決定された(図3C)。
MSCエキソソームの質量分析は、20Sコア粒子の7つのα−サブユニット(PMSA1〜7)の全ておよび7つのβ−サブユニット(PMSB1〜7)の全ての存在を検出しただけではなく、「免疫プロテアソーム」の3つのβ−サブユニットであるPMSB8(β5iまたはLMP7)、PMSB9(β1iまたはLMP2)、PMSB10(β2iまたはLMP10)遺伝子産物も検出した21。20Sプロテアソームペプチドのいくつかの存在は、ウェスタンブロットハイブリダイゼーションによってさらに確認された(図4A)。20Sコア粒子の7つのα−サブユニットの全ておよび7つのβ−サブユニットの全ての存在は、MSCエキソソームが無傷の20Sプロテアソーム複合体を含有し、したがって、20Sプロテアソーム酵素活性を潜在的に有することを示唆する。
エクト−5'−ヌクレオチダーゼ(NT5EまたはCD73)は、エクトアピラーゼ(CD39)と共に、前駆ヌクレオチドをアデノシンに酵素的に変換する。細胞の傷害の間、細胞はATPおよびADPを放出する23。CD39は、細胞外ATPおよびADPをAMPに加水分解し、これは次に、エクト−5'−ヌクレオチダーゼによってアデノシンに分解される。
補体系は、抗体の機能を補う、自然免疫系の一部である。活性化すると、生化学的カスケードが開始して、いくつかの鍵となる生成物、すなわち、病原体の表面に結合しこれらの病原体の食作用を増強させるC3b、走化性による炎症細胞の動員を助けるC5a、ならびにC5b、C6、C7、C8、およびポリマー性C9からなるMACの形成を開始させるC5bを生成する。標的細胞上に堆積したMACは膜貫通チャネルを形成し、これによってその後の細胞溶解が生じる。補体経路の異常な活性化は、虚血再かん流傷害において有害な役割を有すると考えられる26。
この報告において、本発明者らは、独立して調製された3種類の、HPLC精製されたESC由来のMSCエキソソームのプロテオームを、質量分析およびサイトカインアレイを用いてプロファイリングし、866のタンパク質を同定した。これらのタンパク質は、他のエキソソームにおいて共通して見られる多くのタンパク質を含んでいた。
MSCエキソソームを、ヒトTLRのほとんどを発現することが知られているヒト急性単球性白血病細胞株であるTHP−1に由来する2つの細胞株を用いて、TLRを活性化する能力についてまず評価した。第1の株は、NF−kBプロモーターの転写制御下にある安定的にトランスフェクトされた分泌型胚アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子を有するTHP1−XBlueである。第2の株は、MyD88活性が欠損しているTHP1−XBlue−defMYDであり、その結果、THP1−XBlueの活性化およびTHP1−XBlue−defMYDの非活性化は、TLRリガンドの存在を示す。0.1μg/mlでは、MSCエキソソームは、0.01μg/mlのLPSと同程度までTHP1−XBlueを活性化させ、この活性化は、LPSの活性化とは異なり、ポリミキシンBによって消失せず、これによって、MSCエキソソーム調製物におけるLPS汚染は除外された。MSCエキソソームおよびLPSの両方は、THP1−XBlue−defMYDを活性化できず、このことは、THP1−XBlueの活性化がTHP−1細胞上に存在するTLRのいくつかの活性化によってのみ仲介されたことを示す(図6)。
MSCエキソソーム上のTLRリガンドの存在を、ヒトTLRのほとんどを発現することが知られているヒト急性単球性白血病細胞株であるTHP−1に由来する2つの細胞株を用いて決定した。第1の株は、NF−kBプロモーターの転写制御下にある安定的にトランスフェクトされた分泌型胚アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子を有するTHP1−XBlueである。第2の株は、MyD88活性が欠損しているTHP1−XBlue−defMYDである。ウェル当たり105個の細胞を96ウェルプレート内に播種し、LPSを結合および不活化する抗生物質であるポリミキシンBを有するかまたは有さない10ng/mlのLPS(E.coli 026:B6、Sigma)または0.1μg/mlのMSC由来のエキソソーム(MSC−Exo)と共に24時間インキュベートした。SEAPレベルを、アルカリホスファターゼの蛍光基質であるQuanti−Blue(InvivoGen)を用いてアッセイした。
MSCエキソソームのTLR2活性化能力を、ヒトTLR2、MD2、およびCD14で安定的にコトランスフェクトされている市販のHEK293細胞株、ならびにNF−κBプロモーターの制御下にある最適化された分泌型胚アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子を用いて評価した。この細胞株、すなわちHEK−Blue−hTLR2(Invitrogen)をウェル当たり104個細胞で96ウェルプレートに播種し、10μg/mlのリポタイコ酸(LTA、Staphylococcus aureus、Sigma)または0.1、0.5、および1.0μg/mlのMSC由来エキソソーム(MSC−Exo)と共に24時間インキュベートした。SEAPレベルを、アルカリホスファターゼの蛍光基質であるQuanti−Blue(InvivoGen)を用いてアッセイした。
MSCエキソソームのTLR4活性化能力を、ヒトTLR2、MD2、およびCD14で安定的にコトランスフェクトされている市販のHEK293細胞株、ならびにNF−κBプロモーターの制御下にある最適化された分泌型胚アルカリホスファターゼ(SEAP)レポーター遺伝子を用いて評価した。この細胞株、すなわちHEK−Blue−hTLR4(Invitrogen)をウェル当たり104個細胞で96ウェルプレートに播種し、LPSを結合および不活性化する抗生物質であるポリミキシンBを有するかまたは有さない10ng/mlのLPS(E.coli 026:B6、Sigma)または0.1μg/mlのMSC由来エキソソーム(MSC−Exo)と共に24時間インキュベートした。SEAPレベルを、アルカリホスファターゼの蛍光基質であるQuanti−Blue(InvivoGen)を用いてアッセイした。
<方法>
THP−1細胞を1×106個細胞/mlの濃度で24ウェル培養プレートに播種し、10ng/mlのLPSまたは0.1μg/mlのMSC−Exoで0.5、1、3、6、12、24、48、72、96、および120時間刺激した。細胞を採取し、リアルタイム定量的RT−PCRによってサイトカイン生産について分析した。全RNAを、RNeasy Miniキット(QIAGEN)を用いて抽出し、High Capacity cDNA Reverse Transcription Kit(ABI P/N.4368813)を用いて逆転写した。PCRを、10μlの2×Fast SYBR(登録商標)Green Master Mix(ABI、P/N 4385612)反応緩衝液、1μlのcDNA、および1μlのオリゴヌクレオチドプライマーの存在下で、20μlの全容積で、StepOnePlus(商標)Real−Time PCR Systems(ABI P/N.4376592)で行い、最初の変性ステップは95℃で10分間であり、その後、95℃で3秒での変性、60℃で30秒のアニーリングおよび伸長を40サイクル行った。用いたプライマーは、IL−1β(FW:5’−CCTGTCCTGCGTGTTGAAAGA−3’;RV:5’−GGGAACTGGGCAGACTCAAA−3’)、TNF−α(FW:5’−CCCCAGGGACCTCTCTCTAATC−3’;RV:5’−GGTTTGCTACAACATGGGCTACA−3’)、IL−6(FW:5’−TCGAGCCCACCGGGAACGAA−3’;RV:5’−GCAACTGGACCGAAGGCGCT−3’)、IL−12p40(FW:5’−CATGGTGGATGCCGTTCA−3’;RV:5’−ACCTCCACCTGCCGAGAAT−3’)、IL−10(FW:5’−GTGATGCCCCAAGCTGAGA−3’;RV:5’−CACGGCCTTGCTCTTGTTTT−3’)、TGF−β1(FW:5’−CAGCAACAATTCCTGGCGATA−3’;RV:5’−AAGGCGAAAGCCCTCAATTT−3’)、GAPDH(FW:5’−GTCTTCACCACCATGGAGAAGGCT−3’;RV:5’−CATGCCAGTGAGCTTCCCGTTCA−3’)であった。各試料で、mRNAの含有量をヒトGAPDH mRNAの含有量に対して正規化し、未処理対照と比較してn倍の発現であると記載する。各試料を3回ずつ試験した。データは、製造者の指示に従って、比較ΔCT法およびApplied Biosystems StepOneソフトウェアバージョン2.0.1を用いて、分析した。
<THP−1細胞によるサイトカイン生産に対するMSCエキソソームの影響>
MSCエキソソームによるTLRの活性化ならびに炎症性サイトカインおよび抗炎症性サイトカインの誘発は、MSCエキソソームが適応免疫を調節し得ることを示唆する。具体的には、本発明者らは、MSCエキソソームがTregまたはTh17の分化に対する何らかの影響を有するかを試験した。Tregは、調節性T細胞またはサプレッサーT細胞として知られているT細胞亜集団を言う12。これらは免疫系を下方調節し、自己抗原に対する耐性を維持する。これらの細胞は、アレルギーおよびぜんそくなどの免疫疾患、糖尿病、移植拒絶反応などに対する免疫療法において用いられている13 14。Th17細胞はCD4+記憶T細胞であり、IL−17サイトカインの特徴的な分泌によって規定される。これらは、自己免疫疾患の発症にとって重要であると考えられる15。
マウス脾細胞を、以前に記載されているように、6から8週齢のBALB/Cマウスから調製した16。簡潔に述べると、マウス脾臓を取り出し、細かく刻み、漉した。赤血球を次に溶解させた。CD4+細胞を、FITCにコンジュゲートしたラット抗マウスCD4抗体をEasySep FITC Selection Kit(StemCell Technologies)と共に用いて採取し、純度を、フローサイトメトリーによって>95%であることを検証した。精製したCD4+T細胞を、抗CD3mAbおよび5μg/mlの抗CD28mAbを用いて活性化させた。
MSCエキソソームはTHP−1細胞に対する大規模な活性化効果を与え、自然免疫は適応免疫応答の調節において重要な役割を有するため、本発明者らは、エキソソームが自然免疫に対するその影響を介して適応免疫を調節し得ると仮定した。この仮説を試験するために、本発明者らは、ある程度の修正を加えて、図11において記載されている実験を反復した。Treg細胞またはTH17細胞へのCD4+T細胞の分化の間、T細胞を、6日間エキソソームに曝露されたTHP−1細胞と共にインキュベートした(図12)。陽性対照として、T細胞を、それぞれTGF−β1またはrIL−6+TGF−β1と共にインキュベートした。MSCエキソソームに48時間曝露されたTHP−1細胞は、Treg細胞へのT細胞の分化を誘発したが、TH17細胞への分化は誘発せず、このことは、MSCエキソソームが、免疫抑制性であるが炎症性ではないT細胞応答を誘発し得ることを示唆している。
CD4+マウスT細胞を、図11において記載されているように精製および活性化した。
MSCエキソソームを、コンカナバリンAで活性化されたリンパ球の増殖を阻害する能力によって評価することができる。図13を参照されたい。
MSCエキソソームは、炎症性および抗炎症性の自然免疫応答を活性化し得るが、抑制適応免疫応答を、自然免疫系を介して間接的にのみ誘発し得る。これらは、炎症性適応免疫応答を直接的にも間接的にも活性化しない。
Claims (16)
- (a)免疫調節活性、(b)補体阻害活性、(c)プロテアソーム活性、(d)糖分解酵素活性、(e)抗酸化活性、(f)細胞外マトリクス(ECM)修飾活性、(g)NT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性、(h)イオンホメオスタシス活性、および(i)シャペロン活性からなる群から選択されるエキソソームの活性を検出するステップを含む、治療用エキソソームを検出する方法。
- 前記活性が免疫調節活性を含み、前記免疫調節活性が、表D10に示されるタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記活性が補体阻害活性を含み、前記補体阻害活性が、表D1に示されるタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記活性がプロテアソーム活性を含み、前記プロテアソーム活性が、表D2に示される1つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記活性が糖分解酵素活性を含み、前記糖分解酵素活性が、表D3に示される1つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記活性が抗酸化活性を含み、前記抗酸化活性が、表D4に示される1つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記活性が細胞外マトリクス(ECM)修飾活性を含み、前記細胞外マトリクス(ECM)修飾活性が、表D5に示される1つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記活性がNT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性を含み、前記NT5E(CD73)エクト−5’−エクトヌクレオチダーゼ活性が、表D6に示される1つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記活性がイオンホメオスタシス活性を含み、前記イオンホメオスタシス活性が、表D7に示される1つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項1に記載の方法。
- 前記活性がシャペロン活性を含み、前記シャペロン活性が、表D8に示される1つまたは複数、好ましくは全てのタンパク質の活性の検出によって検出される、請求項1に記載の方法。
- 活性が検出される場合、前記エキソソームは、(i)補体介在性の細胞溶解を阻害し得るか、または(ii)例えば心筋虚血および再かん流傷害のマウスモデルもしくはブタモデルにおいて測定されたとき、梗塞サイズを低減させ得るか、もしくは、例えば過酸化水素(H2O2)誘発性の細胞死のインビトロアッセイにおいて測定されたとき、酸化ストレスを低減させ得るか、または(i)および(ii)の両方であり得る可能性が高い、請求項1〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 治療的活性が心保護活性を含む、請求項11に記載の方法。
- 治療的活性が、心不全、骨髄疾患、皮膚疾患、火傷、および変性疾患、例えば糖尿病、アルツハイマー病、パーキンソン病、がん、心筋梗塞、皮膚創傷、皮膚障害、皮膚病変、皮膚炎、乾癬、コンジローマ、疣贅、血管腫、ケロイド、皮膚がん、アトピー性皮膚炎、ベーチェット病、慢性肉芽腫性疾患、皮膚のT細胞リンパ腫、潰瘍、線維症および機能喪失を含む慢性的な組織リモデリングをもたらす炎症および免疫異常調節を誘発する初期の傷害を特徴とする病的状態、腎臓虚血性傷害、嚢胞性線維症、副鼻腔炎および鼻炎、または整形外科的疾患からなる群から選択される1つまたは複数の疾患に対するものである、請求項11に記載の方法。
- (a)分子量、サイズ、形状、組成、または生物学的活性に基づいて他の成分からエキソソームを分離することを場合によって含む、間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)からエキソソームを単離するステップと、(b)好ましくは請求項2〜9のいずれか1項に記載の1つまたは複数のタンパク質の活性を検出することによって、前記単離されたエキソソームにおいて請求項1に記載の活性を検出するステップとを含む方法。
- エキソソームを生産する方法であって、(a)間葉系幹細胞馴化培地(MSC−CM)を得るステップと、(b)例えば>1000kDaの膜上での限外濾過によって、前記間葉系幹細胞馴化培地を濃縮するステップと、(c)前記濃縮された間葉系幹細胞馴化培地を、TSK GuardカラムSWXL、6×40mm、またはTSKゲルG4000 SWXL、7.8×300mmカラムを用いるような、サイズ排除クロマトグラフィーにかけるステップと、(d)準弾性光散乱(QELS)によって検出されるもののような動的光散乱を示す、例えば220nmでのUV吸光画分を選択するステップとを含み、ステップ(d)が、例えば、11〜13分、例えば12分の保持時間で溶出する画分を回収するステップと、好ましくは請求項2〜9のいずれか1項に記載の1つまたは複数のタンパク質の活性を検出することによって、前記エキソソームにおける請求項1に記載の活性を検出するステップとを含む、方法。
- 実質的に、添付の図面の図1〜13を参照してこれまでに記載されている、および添付の図面の図1〜13において示されている方法。
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