PT2983721T - Vesículas de entrega terapêutica - Google Patents

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Description

Em contrapartida, outro tipo de vesículas extracelulares, nomeadamente microvesícuias, são produzidas diretamente através do surgimento para fora e fissão de vesículas de membrana a partir da membrana plasmática e, logo, os seus marcadores de superfície são amplamente dependentes da composição da membrana de origem. Além disso, as mesmas tendem a constituir uma população maior e mais heterogénea de vesículas extracelulares, que variam a partir de 150 a 1.000 nm em diâmetro. Contudo, ambos os tipos de vesícula mostraram entregar mRNA, miRNA e proteínas funcionais às células recipientes. Ei Andalousi et ai., 2013, Adv Drug Deliv Rev, 65(3), 391 a 397, descreve como os exossomas podem ser utilizados para entrega de siRNA direcionada em todas as barreiras biológicas.
Para manter um equilibro fisiológico na resposta e sinalização de recetor, diversos recetores existem tanto numa forma ligada à membrana como numa forma solúvel. A forma de membrana tem normalmente capacidade de sinalização, enquanto a forma solúvel não tem sinalização. A forma solúvel ocorre muitas vezes como a parte extracelular da forma ligada à membrana. A parte solúvel é gerada de duas maneiras diferentes: (1) excisão-reparação alternativa do pré-mRNA e (2) por clivagem das proteases extracelulares (muitas vezes, metaloproteases) . A forma solúvel liga o seu ligante e, desse modo, sequestra o ligante, inibindo a sua ligação com a forma ligada à membrana, que significa que a sinalização geral a partir daquele percurso irá diminuir. A forma solúvel diminui muitas vezes, quando o percurso de sinalização é muito ativo. Por exemplo, as formas solúveis dos dois recetores do fator de necrose tumoral alfa(TNFRas) aumenta em afeções patológicas, tais como septicemia e inflamação, de modo a reduzir o processo inflamatório.
Os recetores armadilha receberam interesse substancial a partir de pontos de vista terapêuticos, uma vez que os mesmos fornecem uma abordagem altamente especifica e adaptada para diminuir a concentração fisiológica de uma proteína de interesse. A modalidade terapêutica é dependente da administração de recetores armadilha, de modo a diminuir a atividade de um percurso de sinalização particular. Os recetores armadilha são muitas vezes fundidos com a Fc-parte de um anticorpo para aumentar a sua meia-vida e para aumentar a avidez dos recetores, quando dois se aproximam um do outro. Um exemplo dessa estratégia é o Etanercept, que é o sTNFR2 fundido com um Fc-fragmento. 0 Etanercept é clinicamente aprovado para tratar a artrite reumatoide, artrite psoriática, espondilite anquilosante e artrite idiopática juvenil poliarticular moderada ou gravemente ativa e mostrou ser seguro e eficaz ao longo dos últimos 19 anos, desde a sua aprovação inicial. Diversas outras proteínas de fusão do recetor armadilha estão em ensaios clínicos direcionados, por exemplo, a VEGF, EGF, FGF e angiopoietina.
Apesar de aplicados com sucesso em vários contextos terapêuticos e para um número grande de enfermidades, os recetores armadilha e outros produtos biológicos (biofarmacêuticos) sofrem de diversas desvantagens relacionadas com, por exemplo, farmacocinética, toxicidade, farmacodinâmica e eficácia terapêutica.
Sumário da Invenção
Logo, é um objetivo da presente invenção superar os problemas acima identificados, associados à utilização de produtos biológicos e, especificamente, recetores armadilha e satisfazer as necessidades existentes no âmbito da arte, nomeadamente, fornecer eficácia terapêutica otimizada, farmacocinética significativamente melhorada, bem como efeitos secundários reduzidos dos polipéptidos biofarmacêuticos, tais como recetores armadilha e produtos biológicos (biofarmacêuticos), no geral.
Assim, a presente invenção fornece, num primeiro aspeto, um exossoma de entrega terapêutica que tem um constructo de polipéptido fixado à sua membrana, em que o constructo de polipéptido compreende, pelo menos, um polipéptido transportador fundido com, pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico presente, pelo menos, parcialmente no exterior do exossoma de entrega e em que, o pelo menos recetor armadilha de polipéptido terapêutico não tem sinalização, isto é, não tem capacidade de transmitir sinais que transmitiria sob circunstâncias normais. Normalmente, o recetor armadilha liga-se e sequestra um ligante de circulação ou um ligante que pode, na verdade, estar também presente dentro de uma célula alvo e/ou na superfície de uma célula alvo. Sem desejar estar ligado a qualquer teoria, é depreendido que um recetor armadilha de polipéptido terapêutico, presente na superfície de um exossoma de entrega terapêutica, sequestra o seu parceiro (ou parceiros) de interação, isto é, o alvo e/ou ligante, virtualmente da mesma maneira que o recetor armadilha de polipéptido terapêutico livre, embora com uma meia-vida significativamente melhorada, depuração reduzida, efeitos secundários diminuídos e, geralmente, farmacocinética significativamente intensificada e eficácia terapêutica, em virtude da sua fixação num exossoma. 0 pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico, presente no exossoma de entrega terapêutica, pode ser parcial ou completamente desprovido do seu domínio de sinalização, de modo a tornar o mesmo um recetor de polipéptido terapêutico sem sinalização e o domínio de sinalização pode ser parcial ou completamente substituído pelo polipéptido transportador, mas a incapacidade de contribuir para a sinalização podem também derivar a partir de alterações na sequência de polipéptidos. Por exemplo, em várias modalidades da presente invenção, pode ser suficiente substituir certos aminoácidos para prestar o recetor de polipéptido terapêutico sem sinalização e/ou o recetor de polipéptido terapêutico pode ser prestado sem sinalização, meramente ao fixar o recetor armadilha ao polipéptido transportador (com a utilização de tecnologia recombinante) , que porta o constructo de polipéptido inteiro para a superfície da vesícula extracelular.
Mais importante, os exossomas podem ter, por si, atividades terapêuticas. Por exemplo, as vesículas derivadas a partir de, por exemplo, células estaminais mesenquimais, mas também a partir de outras células, são conhecidas por serem imunossupressoras de modo inato, à medida que transportam diversos miRNAs, proteínas e lípidos bioativos que, por exemplo, suprimem células T citotóxicas e acionam a expansão de células T regulatórias. 0 efeito repressivo no sistema imunitário é um pré-requisito também para a regeneração de tecido subsequente, seguido da lesão de tecido. Logo, por exemplo, escolher uma fonte apropriada de células para derivação de exossomas irá fornecer uma vantagem terapêutica adicional, conforme comparado com a utilização de recetores armadilha/anticorpos monoclonais (tais como etanercept e infliximab) apenas.
Em aspetos adicionais, a presente invenção fornece exossomas de entrega terapêutica e composições farmacêuticas que compreendem exossomas, em conformidade com a presente invenção, para utilização na medicina e, mais especificamente, para utilização no tratamento, alivio, e/ou profilaxia de várias doenças e distúrbios que podem ser tratados com a utilização de produtos terapêuticos biofarmacêuticos (biológicos).
Assim, a presente invenção refere-se essencialmente à utilização de exossomas como veículos de administração ou entrega para produtos biofarmacêuticos, especificamente, produtos biológicos com base em polipéptidos e, mais especificamente, recetores armadilha (também conhecidos como recetores supressivos). A presente invenção também se refere à utilização de exossomas que compreendem vários polipéptidos, conforme definido no presente documento, no tratamento de um grande número de doenças e distúrbios, conforme divulgado no presente documento.
Em aspetos adicionais, a presente invenção refere-se a métodos de produção de exossomas de entrega terapêutica da presente invenção. Num segundo aspeto, é fornecido um método para purificar exossomas de entrega terapêutica, de acordo com o primeiro aspeto, que compreende as etapas de: (i) expor uma amostra que compreende, pelo menos, um exossoma de entrega terapêutica, de acordo com a ultrafiltração; (ii) expor a amostra obtida a partir da etapa (i) à cromatografia líquida por exclusão de tamanho.
Em aspetos adicionais, a presente invenção fornece métodos para aumentar o rendimento de exossomas, de acordo com o primeiro aspeto, que compreende expor células (que são a fonte dos exossomas) a inibidores de autofagia. A presente invenção fornece, assim, exossomas, métodos e composições, bem como vários outros aspetos e modalidades para melhorar a entrega, administração e características, por exemplo, de agentes de polipéptido biofarmacêuticos. A presente invenção resulta em eficácia terapêutica otimizada (por exemplo, devido à polivalência do recetor armadilha de polipéptido terapêutico e os efeitos terapêuticos regenerativos inerentes de exossomas, por si), farmacocinética significativamente melhorada (por exemplo, por meio de depuração renal reduzida) , biodistribuição melhorada a certos órgãos, tais como cérebro, bem como efeitos secundários reduzidos de polipéptidos biofarmacêuticos (por exemplo, por meio de fusão com células recipientes para conferir proteção celular direta)), tais como recetores armadilha e outros tipos de produtos biológicos.
Breve Descrição dos Desenhos A Figura 1 mostra eficácia de tratamento, num modelo de colite de ratinho, de exossomas que compreende um recetor armadilha de polipéptido terapêutico sem sinalização, que é compreendido de um recetor do fator de necrose tumoral solúvel sem sinalização 1 (sTNFRl) (que pode ser um de sTNFR IA (SEQ ID No 30) ou sTNFR IB (SEQ ID No 31)), fundido com o polipéptido transportador CD63 (SEQ ID No 14) . Os exossomas que exibem STNFR1-CD63 sem sinalização tratam com sucesso a colite induzida (linha preta continua) com apenas uma perda inicial minima no peso corporal. Os exossomas com sinalização (linha cinzenta de tracejado curto) mostram eficácia anti-terapêutica clara, uma vez que os mesmos entregam mais recetores de sinalização às células, enquanto os ratinhos tratados por simulação (linha pontilhada) não exibiram qualquer eficácia clinicamente relevante. Os exossomas não modificados (isto é, exossomas desprovidos de quaisquer constructos de polipéptido artificialmente introduzidos) (linha cinzenta de tracejado longo) também induziram remissão de colite moderada, provavelmente devido aos seus efeitos anti-inflamatórios inerentes. A Figura 2 mostra, por método de Western blot, confirmação da presença do polipéptido de CD63-STNFR1 utilizado para o tratamento de colite da Figura 1, na superfície exossomal. A Figura 3 mostra a atividade de neutralização dos exossomas armadilha de sTNFRl da Figura 1, em citotoxicidade mediada por TNFa. Os exossomas que exibem STNFR1-CD63 sem sinalização revelam boa neutralização de TNFa de uma maneira dependente de dosagem (linha preta contínua) e os exossomas que contêm STNFR1-CD63 com sinalização estão, conforme na Figura 1, a agravar a resposta (linha cinzenta de tracejado curto). Os exossomas não modificados (linha cinzenta de tracejado longo) mostram também um efeito moderado, devido às suas propriedades anti-inflamatórias. A Figura 4 mostra um gráfico sobre os efeitos inibitórios tumorais de exossomas que exibem ou o recetor de fator de crescimento endotelial vascular solúvel sem sinalização (sVEGFR) (SEQ ID No 17) , fundido com CD63 (linha preta contínua) ou o sVEGFR fundido com sindecano (SEQ ID NO 23 a 26) (linha preta tracejada). Os ratinhos tratados com exossomas, que compreendem os constructos de polipéptido acima mencionados, tiveram um pós-tratamento de massa total tumoral consideravelmente reduzido, enquanto o tratamento com exossomas que compreendem polipéptido de sVEGFR com sinalização exibe um resultado pior, comparado com o controlo (linha cinzenta de tracejado curto). A Figura 5 mostra uma eficácia de tratamento em ratinhos MDX de exossomas que compreendem a activina do recetor de polipéptido armadilha terapêutico (SEQ ID No 40 a 43) fundida ou com o sindecano de proteínas transportadoras (linha preta contínua) ou com sinaptotagmina (SEQ ID No 27) (linha cinzenta de tracejado longo). O tratamento quinzenal com os exossomas de entrega terapêutica acima mencionados resultou num aumento de peso corporal consideravelmente maior do que o tratamento com exossomas não modificados e tratamento de simulação. A Figura 6 mostra as sequências de aminoácidos de vários constructos de polipéptido, consoante a presente invenção. Alguns dos constructos compreendem etiquetas His (para purificação facilitada), enquanto outros constructos compreendem EGFP (para facilitar a deteção), mas os constructos podem ser naturalmente aplicados com e sem as referidas porções químicas/sequências adicionais. A Figura 7 ilustra a eficácia terapêutica aumentada, observada quando se utiliza exossomas (que compreende um polipéptido terapêutico, que compreende um recetor do fator de necrose tumoral solúvel 1 (sTNFRl) fundido com o polipéptido transportador CD63) obtidos por meio de purificação por cromatografia líquida-ultrafiltração (UF-LC) (linha preta contínua), comparada com os mesmos exossomas obtidos por meio de um processo de ultracentrifugação convencional (UC) (linha preta contínua com cruzes). A eficácia terapêutica aumentada é muito provavelmente devido à estabilidade biofísica melhorada dos exossomas obtidos por meio de UF-LC que, por sua vez, resulta em menos acumulação no tecido pulmonar. A Figura 8 mostra inibição de autofagia, que resultou em rendimentos exossomais aumentados. 0 gráfico exibe, da esquerda para a direita, células tratadas com meios de cultura apenas (como um controlo de linha de base), meios suplementados por fator de crescimento (por exemplo, suplementados com IGF-1), meio que compreendem inibidores de autofagia (3-metiladenina e bafilomicina) ou meios que compreendem ativadores de autofagia (rapamicina). 0 tratamento com inibidores de autofagia resulta num aumento forte no rendimento exossomal, que pode ser explorado na produção de exossomas, consoante a presente invenção. A Figura 9 mostra como ratinhos EAE, tratados com exossomas que compreendem exibir recetores armadilha terapêuticos sem sinalização para IL6 (SEQ ID No 1 a 2), IL-Ιβ (SEQ ID No 3 a 5) e TNFa (linha preta continua e linhas pretas continuas com círculos, quadrados e losangos) exibem uma manifestação de doença muito moderada, comparado com o controlo tratado por simulação (linha pontilhada) , enquanto ratinhos tratados com exossomas com sinalização (TNFRl com sinalização) exibiram, na verdade, uma doença pior (linha cinzenta tracejada). A Figura 10 ilustra os efeitos de condições induzidas por stress no enriquecimento de proteínas anti-apoptóticas e metabolicamente ativas, de acordo com GO-termos (GO-termos: tradução, processos metabólicos, glicólise e proteínas ribossómicas). Conforme comparado com células cultivadas sob condições normais, os exossomas obtidos a partir de células cultivadas sob condições induzidas por stress (por exemplo, inanição de soro e/ou privação de oxigénio) são enriquecidos em proteínas para processos metabólicos e de sobrevivência, o que é benéfico para aplicações de medicina regenerativa.
Descrição Detalhada da Invenção A presente invenção fornece, num primeiro aspeto, um exossoma de entrega terapêutica que tem um constructo de polipéptido fixado à sua membrana, em que o constructo de polipéptido compreende, pelo menos, um polipéptido transportador fundido com, pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico presente, pelo menos, parcialmente no exterior do exossoma de entrega e em que, o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico não tem sinalização. Em aspetos adicionais, a presente invenção fornece exossomas de entrega e composições farmacêuticas, em conformidade com a presente invenção, para utilização em medicina, bem como métodos de produção de exossomas de entrega.
Quando atributos, modalidades ou aspetos da presente invenção são descritos em termos de grupos Markush, uma pessoa versada na arte irá reconhecer que a invenção também é, desse modo, descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush. A pessoa versada na arte irá adicionalmente reconhecer que a invenção é também, desse modo, descrita em termos de qualquer combinação de membros individuais ou subgrupos de membros de grupos Markush. Adicionalmente, deve ser notado que as modalidades e atributos descritos em conjunto com um dos aspetos e/ou modalidades da presente invenção também se aplicam após devidas alterações a todos os outros aspetos e/ou modalidades da invenção. Por exemplo, o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico, descrito em conjunto com os exossomas de entrega terapêutica, é para ser entendido como sendo potencialmente relevante/aplicável/presente também no contexto dos métodos de produzir exossomas de entrega ou no contexto das composições farmacêuticas, consoante a presente invenção. Além disso, certas modalidades descritas em conjunto com certos aspetos, por exemplo, as vias de administração dos exossomas de entrega terapêutica, conforme descrito em relação aos aspetos que se referem ao tratamento de certas indicações médicas, podem também ser naturalmente relevantes em conjunto com outros aspetos e/ou modalidade, tais como aspetos/modalidades que se referem às composições farmacêuticas da presente invenção. Como observação geral, os recetores armadilha de polipéptido terapêuticos e os polipéptidos transportadores, em conformidade com a presente invenção, podem ser livremente combinados em quaisquer e todas as combinações possíveis, sem se desviarem do âmbito e da essência da invenção e as sequências podem desviar-se fortemente a partir das sequências originais, desde que qualquer dado polipéptido transportador retenha a sua capacidade de transportar o recetor armadilha de polipéptido terapêutico para a superfície de um exossoma e desde que qualquer dado recetor armadilha de polipéptido terapêutico retenha a sua capacidade de ligar o seu alvo de uma maneira terapeuticamente eficaz. Desde que as suas propriedades biológicas sejam retidas, as sequências de polipéptidos podem desviar-se tanto quanto 50% (calculado com a utilização, por exemplo de um BLAST ou ClustalW), conforme comparado com o polipéptido nativo, apesar de uma identidade de sequência, que é tão superior quanto possível, ser preferencial. A combinação (fusão) do transportador e dos polipéptidos do recetor armadilha implica que certos segmentos dos respetivos polipéptidos podem ser substituídos e/ou modificados, o que significa que o desvio a partir da sequência nativa pode ser grande, desde que as propriedades fundamentais sejam conservadas.
Para conveniência e clareza, certos termos empregues no presente documento são recolhidos e descritos abaixo. Salvo definido em contrário, todos os termos técnicos e científicos utilizados no presente documento têm o mesmo significado, conforme comummente entendido por aquele de habilidade comum na arte, ao qual esta invenção pertence. 0 termo "exossoma" pode significar qualquer vesícula derivada a partir do percurso endolissomal. 0 termo "fixado à sua membrana" deve ser entendido como fixado no sentido de como um polipéptido biológico é normalmente fixado a uma membrana vesicular, isto é, predominantemente por meio de interações não covalentes, mas possivelmente também por meio de vínculos covalentes. A fixação à membrana pode compreender fixação dentro do exossoma, na membrana do exossoma, no exterior do exossoma ou qualquer combinação dos mesmos. Um exemplo típico de um polipéptido a ser "fixado" à membrana de um exossoma é um polipéptido transmembranar que abrange a membrana vesicular de bicamada de um exossoma, a partir do espaço de fora intra-exossomal através da membrana exossomal para o meio extra-exossomal. 0 termo "constructo de polipéptido" (ou "constructo de polipéptido terapêutico" de modo intercambiável) deve ser entendido que se refere a qualquer polipéptido que compreende um "polipéptido transportador", conforme definido no presente documento e um "recetor armadilha de polipéptido terapêutico", conforme definido no presente documento. 0 constructo de polipéptido pode ser fixado à membrana do exossoma de entrega, em conformidade com a presente invenção, preferencialmente, de uma maneira transmembranar (isto é, com o constructo de polipéptido que se estende do interior do exossoma, através da membrana de exossoma de entrega, para o exterior do exossoma de entrega). Quando o recetor armadilha de polipéptido terapêutico está a ter uma configuração transmembranar, pode ser preferencial se o polipéptido transportador está presente no interior do exossoma de entrega, enquanto o recetor armadilha de polipéptido terapêutico está presente, pelo menos, parcialmente no exterior do exossoma de entrega, para poder exercer o seu efeito terapêutico. 0 termo "sem sinalização" devem ser entendido como não tendo capacidade de transmitir sinais bioquímicos, isto é, um polipéptido que não tem sinalização está meramente a ligar o seu parceiro de interação extracelular, mas, aquando da ligação, nenhuns sinais (isto é, não intracelular, não intravesicular ou não extracelular) estão a ser gerados ou transmitidos. Por exemplo, no caso do TNFR solúvel(sTNFR), mesmo se transferido para células imunitárias, um TNFR sem sinalização não pode exercer uma resposta biológica, uma vez que carece de componentes de sinalização cruciais. De modo semelhante, as mímicas do EGFR (SEQ ID No 18) podem carecer do domínio transmembranar, que proíbe a inserção na membrana das células recipientes que, desso modo, não têm capacidade para transmitir sinais biológicos, por exemplo, no caso de uma transferência para uma célula recipiente. Mais importante, num contexto clínico, no caso de TNFr, a transferência de um recetor sem sinalização para células recipientes oferece outra camada de proteção, uma vez que então a mesma protege diretamente as células de sinalização de TNF excessiva ao competir por uma ligação de ligante. Para clareza, tanto o recetor armadilha de polipéptido terapêutico e/ou todo o constructo de polipéptido pode não ter sinalização. Por exemplo, o recetor armadilha de polipéptido terapêutico pode ser prestado sem sinalização através de, por exemplo, uma mutação especifica de sitio, mas o recetor de polipéptido terapêutico com sinalização pode ser convertido a sem sinalização através de uma substituição e/ou fixação ao seu domínio de sinalização por um polipéptido transportador. 0 termo "polipéptido transportador" deve ser entendido no sentido que se refere a qualquer polipéptido que pode ser utilizado para transportar um constructo de polipéptido para uma localização exossomal adequada. Mais especificamente, o termo "polipéptido transportador" deve ser entendido no sentido que compreende qualquer polipéptido que proporciona o transporte ou lançamento de um constructo de polipéptido (que referido "polipéptido transportador" forma parte) para, pelo menos parcialmente a membrana do exossoma e, pelo menos parcialmente, o lado extra-exossomal (por exemplo, a superfície) de um exossoma de entrega, em conformidade com a presente invenção. Os exemplos de polipéptidos transportadores são, por exemplo, Lamp2b (SEQ ID No 22), CD9 (SEQ ID No 12), CD81 (SEQ ID No 13), CD63, sindecano, ALIX (SEQ ID No 28), sintenina (SEQ ID No 29) e sinaptotagmina, mas numerosos outros polipéptidos com capacidade para transportar um constructo de polipéptido, pelo menos, parcialmente para o lado extra-exossomal de exossomas de entrega são compreendidos no âmbito da presente invenção.
Os termos "recetor armadilha de polipéptido terapêutico", "recetor armadilha de polipéptido" e "recetor armadilha" são utilizados de modo intercambiável no presente documentos e devem ser entendidos como referentes a qualquer polipéptido (muitas vezes denominado de recetor armadilha ou supressivo), que pode ser utilizado para propósitos terapêuticos através do sequestro (ligação) de um alvo e/ou ligante adequado (normalmente, um ligante de circulação ou um ligante presente numa célula que está por si mesma em circulação, mas potencialmente qualquer ligante na superfície e/ou dentro de uma célula alvo) que, desse modo, exerce o seu efeito terapêutico. 0 recetor armadilha liga e/ou sequestra o seu alvo que, essencialmente, inibe o alvo de realizar a sua função que pode contribuir para o tratamento de uma doença e/ou distúrbio. Os processos de transdução de sinal das classes de recetor principais são descritos em algum detalhe abaixo para exemplifica certos recetores armadilha de polipéptido terapêuticos, em conformidade com a presente invenção. Contudo, conforme acima mencionado, os recetores armadilha da presente invenção são preferencialmente sem sinalização para assegurar a eficácia terapêutica e segurança.
Os termos "ligante" e "alvo", no contexto da presente invenção, devem ser entendidos por compreenderem qualquer molécula que é ligada (normalmente com uma afinidade elevada, por exemplo, um Kd menor que 100 μΜ, mas preferencialmente abaixo de 1 mM ou, mais preferencialmente, abaixo de 100 μΜ ou, ainda mais preferencialmente, abaixo de 100 nM) pelos recetores armadilha de polipéptido terapêuticos, de acordo com a presente invenção. O ligante (que pode ser qualquer polipéptido ou hidrato de carbono/polissacárido, ou essencialmente qualquer molécula, por exemplo, presente na superfície de uma célula) está normalmente a circular livremente no sangue ou em qualquer outro fluido corporal (TNFa é um exemplo de tal ligante de polipéptido que circula livremente para o recetor de TNFa), mas também pode ser um polipéptido ou qualquer outro tipo de molécula presente numa célula e/ou dentro de uma célula, que circula num fluido corporal, por exemplo, sangue. Um exemplo de um alvo ligado a uma célula pode ser CD19, que está presente em células B de circulação que podem ser ligadas por um recetor de polipéptido terapêutico, tal como um rituximab comercialmente disponível. 0 termo "ligante" deve, assim, ser entendido por compreender ambas as moléculas de polipéptido e de não polipéptido (por exemplo, hidratos de carbono ou qualquer outro tipo de molécula). A frase "liga-se a um ligante/alvo" deve ser entendida como o recetor armadilha de polipéptido terapêutico que tem a capacidade de se ligar a um ligante e/ou um alvo no corpo humano e/ou animal, o que significa que o recetor armadilha pode ligar-se e sequestrar o seu ligante para exercer um efeito terapêutico, ao inibir o ligante/alvo a partir da realização da sua função fisiológica normal. Normalmente, o ligante/alvo está a circular na corrente sanguínea ou está exposto ao ambiente extracelular, através da presença na superfície de uma célula alvo.
Normalmente, a transdução de sinal ocorre in vivo, quando um ligante extracelular se liga a um recetor de superfície celular e ativa a mesma. Por sua vez, o recetor muda proteínas/moléculas intracelulares que iniciam um percurso de sinalização. Existem dois grupos de recetor principais; recetores extracelulares e recetores intracelulares. Os recetores extracelulares podem ser adicionalmente divididos em diferentes classes: 1. Recetores acoplados a G-proteína (7-TM) 2. Tirosina e histidina quinases 3. Integrinas 4. Recetores de barreira do tipo Toll 5. Canal de iões de barreira de ligante
Os recetores de 7-TM têm 7 regiões transmembranares e estão unidos a uma G-proteína heterotrimérica. Aquando da ligação de ligante, o recetor é submetido a uma mudança de conformação e a G-proteína torna-se ativa. As subunidades de G proteína ativadas separam-se do recetor e iniciam uma sinalização por meio de muitas proteínas efetoras a jusantes, tais como fosfolipases e canais de iões. Os recetores adrenérgicos e de quimiocina pertencem a essa família. Os recetores de 7-TM podem ser sem sinalização, ao remover o sítio de ligação para as G-proteínas. Por exemplo, substituir o sítio de ligação intracelular de G-proteínas por o sítio de ligação de sintenina de Sindecanos iria direcionar um recetor sem sinalização para um exossoma.
Recetores de tirosina quinase (RTKs) são proteínas transmembranares com um domínio quinase intracelular e um domínio de ligação de ligante extracelular. Os exemplos de ligantes são fatores de crescimento, insulina, etc. Para induzir um sinal, é necessário que os RTKs formem dímeros na membrana plasmática. Quando um dímero é formado, a interação entre os domínios intracelulares inicia auto-fosforilação dos resíduos de tirosina, que provocam uma mudança de conformação no recetor. Os domínios quinase dos recetores são subsequentemente ativados e fosforilam as moléculas de sinalização a jusantes que criam uma cascata de sinalização.
Os recetores de tirosina podem ser tornados como não tendo sinalização, ao remover ou submeter a mutação o domínio quinase ou o domínio de tirosina. Isso pode ser feito de uma maneira semelhante, conforme com os recetores de 7-TM. Além disso, o domínio extracelular de recetores de tirosina pode ser fundido com uma proteína exossomal, tal como CD63, Lamp2b, etc.
As integrinas são proteínas transmembranares que são importantes para a fixação de células a outras células, bem como para a matriz extracelular. As integrinas também participai na transdução de sinais a partir das proteínas de matriz extracelular, tais como fibronectina e colagénio. As integrinas mudam a sua conformação aquando da ligação de ligante; as integrinas carecem de um domínio quinase, o que significa que as integrinas necessitam de moléculas adaptadoras para transmitir o sinal para a célula. Existem diversas moléculas adaptadoras e quinases unidas a integrinas. As integrinas podem existir em duas conformações diferentes: uma forma inativa e uma forma ativa. A forma inativa é comum em leucócitos não ativados; quando os leucócitos são ativados, a célula muda as suas integrinas para um estado ativo. As integrinas não têm sinalização sem as suas moléculas adaptadoras, por isso, os sítios de ligação para as moléculas adaptadoras e quinases podem ser removidos para prestar os recetores sem sinalização.
Os recetores do tipo Toll têm quatro moléculas adaptadoras conhecidas que são ativadas aquando da ligação de ligante. Essas quatro moléculas adaptadoras, Myd88, TIRAP, TRIF e TRAM, ativam subsequentemente moléculas intracelulares e os recetores do tipo Toll inibem ou ativam milhares de genes, quando ativados. Os recetores do tipo Toll podem ser tornados como não tendo sinalização através da remoção do sitio de ligação e/ou dos sítios de interação para as moléculas adaptadoras.
Os vários polipéptidos mencionados no presente pedido (por exemplo, polipéptidos transportadores, tais como Lamp2b ou CD63 e recetores armadilha de polipéptido terapêuticos, tais como sTNFR ou VEGFR , etc.) devem ser entendidos como referentes também a polipéptidos homólogos que têm identidades de sequência para o polipéptido em questão, preferencialmente, acima de 50%, mais preferencialmente, acima de 60%, mais preferencialmente, acima de 70%, mais preferencialmente, acima de 80% e, mais preferencialmente, acima de 90%.
Num primeiro aspeto, a presente invenção refere-se a um exossoma de entrega terapêutica que tem um constructo de polipéptido fixado à sua membrana, em que o constructo de polipéptido compreende, pelo menos, um polipéptido transportador fundido, pelo menos, a um recetor armadilha de polipéptido terapêutico presente, pelo menos, parcialmente no exterior da vesícula de entrega e em que o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico não tem sinalização para proporcionar a ligação e o sequestro da sua molécula alvo, sem a geração e/ou transmissão de quaisquer sinais. Numa modalidade preferencial, o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico liga-se a um ligante de circulação, mas também se pode ligar naturalmente a uma molécula alvo presente numa célula alvo. O constructo de polipéptido terapêutico pode compreender, pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico (denominado de modo intercambiável de "recetor armadilha", mas os referidos recetores armadilha de polipéptido terapêuticos podem também referir-se a polipéptidos terapêuticos não necessariamente classificados como recetores armadilha, como tal) que não tem sinalização (ou, de modo alternativo em algumas modalidades, com sinalização), fundido a um polipéptido transportador. Naturalmente, um exossoma de entrega único pode compreender mais de um constructo de polipéptido (isto é, uma pluralidade de constructos estão presentes num único exossoma) e também mais do que um tipo de constructo de polipéptido (um único exossoma pode, por exemplo, compreende uma pluralidade de (1) constructos que compreendem o recetor de VEGF, como o recetor armadilha e um polipéptido transportador, tal como Lamp2b e de (2) constructos que compreende o recetor de EGF, como o recetor armadilha e o polipéptido transportador CD63). Os inventores aperceberam-se inesperadamente que utilizar exossomas como veículos de entrega para recetores armadilha de polipéptido terapêuticos (por exemplo, biofarmacêuticos) resulta, não apenas em farmacocinéticos intensificados, mas aumenta também inesperadamente a eficácia dos recetores armadilha de polipéptido terapêuticos, possivelmente como um resultado de efeitos regenerativos exercidos por exossomas, por si. Adicionalmente, empregar exossomas como vetores de entrega para polipéptidos terapêuticos não facilita apenas a produção em comparação com os produtos biológicos clássicos, mas o facto de que cada exossoma de entrega compreende potencialmente uma pluralidade considerável de constructos terapêuticos (que, por sua vez, podem compreender uma pluralidade de recetores armadilha de polipéptido terapêuticos), leva potencialmente a uma polivalência de recetor que intensifica a eficácia terapêutica e melhora os resultados do tratamento.
Em modalidades preferenciais, o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico pode ser parcial ou completamente desprovido do seu domínio de sinalização, para torná-lo sem sinalização. Isso pode ser conseguido por meio de truncação ou mutação do polinucleótido que codifica o domínio de sinalização ou por meio de remover completamente o referido polinucleótido, de modo a bloquear qualquer sinalização a partir do recetor armadilha de polipéptido terapêutico. Numa modalidade adicional, o domínio de sinalização de recetor armadilha de polipéptido terapêutico pode ser parcial ou completamente substituído pelo polipéptido transportador, para possivelmente minimizar o tamanho do constructo de polipéptido.
Os inventores aperceberam-se de que é surpreendentemente, em algumas circunstâncias, preferencial utilizar os recetores armadilha de polipéptido terapêuticos que não têm sinalização, de modo a evitar feral sinais que, de outro modo, podem negativamente afetar a eficácia terapêutica.
Numa modalidade, consoante a presente invenção, o polipéptido transportador pode ser localizados parcialmente dentro do exossoma de entrega terapêutica e/ou parcialmente na membrana do exossoma de entrega terapêutica e/ou parcialmente no exterior do exossoma de entrega terapêutica. Numa modalidade preferencial, o polipéptido transportador está presente substancialmente dentro do exossoma de entrega ou na sua membrana, enquanto o recetor armadilha de polipéptido terapêutico está presente, pelo menos, parcialmente no exterior do exossoma de entrega, para poder ter a capacidade de exercer o seu efeito terapêutico. Assim, o constructo de polipéptido pode preferencialmente estar presente em forma transmembranar (isto é, um constructo de polipéptido transmembranar) com o polipéptido transportador presente substancialmente dentro ou na membrana de exossoma e o recetor armadilha de polipéptido terapêutico presente substancialmente no exterior do exossoma de entrega (e tanto o polipéptido transportador e/ou o recetor armadilha de polipéptido terapêutico se estende através da membrana do exossoma de entrega) . Numa modalidade, mais do que um polipéptido transportador pode ser utilizado, de modo a melhorar a expressão do recetor armadilha de polipéptido terapêutico na superfície (exterior) do exossoma de entrega terapêutica. A localização do polipéptido transportador na membrana pode variar, dependendo da aplicação e do polipéptido terapêutico em questão; sendo que a consideração primária é a de que o recetor armadilha de polipéptido terapêutico tem capacidade de interagir com o seu parceiro de ligação, normalmente, um ligante de circulação, que está normalmente presente de modo extracelular, por exemplo, no sangue ou em qualquer outro fluido corporal, ou numa célula alvo de circulação. Em modalidades adicionais, o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico pode ser fundido com o polipéptido transportador por meio de um vínculo químico selecionado a partir do grupo que compreende um vínculo de péptido (amida) , uma ligação de tioéter, uma ponte de dissulfureto e uma interação biotina-estreptavidina. A formação de um vínculo de péptido (amida) pode naturalmente ser conseguida por meio de uma tecnologia recombinante (isto é, por meio de expressão de um polinucleótido adequado numa célula com capacidade para produzir vesículas de entrega adequadas), mas tal vínculo pode também ser gerado com a utilização de várias estratégias de conjugação, comummente empregues na arte, por exemplo, conjugação mediada por EDC/NHS, conjugação sulfo-NHS ou qualquer outro tipo de abordagem de conjugação de amida (péptido). Contudo, outras metodologias para acoplar o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico e o pelo menos um polipéptido transportador podem compreender formar uma ponte de dissulfureto entre, por exemplo, dois resíduos de cisteina ou utilizar a interação natural entre biotina e estreptavidina, para conectar o recetor armadilha de polipéptido terapêutico e o polipéptido transportador. Uma alternativa à utilização de constructos de fusão e formação de vinculo químico é colocar uma etiqueta de lípidos no recetor armadilha de polipéptido terapêutico e revestir não covalentemente a superfície do exossoma de entrega com o recetor armadilha de polipéptido terapêutico por meio de intercalação de lípidos simples.
Tais etiquetas de lípidos incluem colesterilo, estearilo, di-estearilo, miristoil, palmitoil, decanoil e outros lípidos adequados conhecidos por uma pessoa versada na arte. 0 polipéptido transportador pode ser selecionado a partir do grupo que compreende Lamp2b, CD63, sindecano, sinaptotagmina, domínio de ALIX (CHAMP 4), domínio de ligação de sintenina-ALIX, ESCRT-proteínas, PDGF, sintenina-PDZ, domínio P6 e P9, CD81, CD9 e qualquer combinação dos mesmos. Novamente, a consideração primária por detrás de um polipéptido transportador apropriado refere-se à sua capacidade de eficientemente transportar o recetor armadilha de polipéptido terapêutico para uma localização exossomal apropriada (normalmente, a sua superfície ou, pelo menos, para uma parte da membrana do exossoma de entrega terapêutica que proporciona a interação do recetores armadilha de polipéptido terapêuticos e liga-se ao ligante, isto é, ao seu parceiro de interação, para exercer o seu efeito terapêutico). Adicionalmente, em conformidade com a presente invenção, o polipéptido transportador pode compreender a parte citoplasmática de sindecano. A parte citoplasmática de sindecano tem um domínio de ligação de PDZ que liga o complexo de sintenina-ALIX e o complexo de Sintenina-ALIX forma subsequentemente um exossoma (o domínio de PDZ iria, portanto, essencialmente guiar o recetor para o exossoma). 0 pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico, consoante a presente invenção, pode ser selecionado a partir do grupo que compreende recetores, por exemplo, a partir das seguintes famílias de recetor: insulina, PDGF (SEQ ID No 15 a 16), FGF (SEQ ID No 36 a 39), EGF, NGF (SEQ ID No 32), VEGF, HGF, TRK, EPH, AXL, LTK, TIE, ROR, DDR, RET, KLG, RYK, MuSK, TGF do Tipo I e Tipo II (SEQ ID No 33 a 35), activina e TNF, PTCHl (SEQ ID No 44), interleucinas (IL) 1, 6, 12, 17, 23 e outras (SEQ ID No 1 a 11), angiopoietina, ligantes de ligação de péptidos de exibição de fago HER para os recetores acima (e, possivelmente, também a exibição de fago em relação a recetores, de modo a ocupar o espaço de ligação por meio de obstáculo alostérico), recetores de 7-TM, integrinas, selectinas (por exemplo, selectinas E, P e L (SEQ ID No 19 a 21), ligantes de anticorpos ligados a membrana de integrinas/selectinas recetores de células T. recetores de células NK, recetores do tipo Toll, PAMP, etc.
Além disso, recetores manipulados que ligam diversos ligantes, tais como ambos VEGF e angiopoietina (DAAP), estão em conformidade com a presente invenção e, adicionalmente, com todas a famílias de recetores acima mencionadas e recetores específicos estão em linha com a presente invenção.
Adicionalmente, em conformidade com a presente invenção, o constructo de polipéptido fixado a exossomas de entrega terapêutica pode compreender mais do que um recetor armadilha de polipéptido terapêutico e também mais do que um polipéptido transportador, de modo a otimizar, por exemplo, os efeitos terapêuticos ou o transporte do recetor armadilha de polipéptido terapêutico para a membrana do exossoma de entrega (ou sua superfície). 0 constructo de polipéptido, consoante a presente invenção, pode consequentemente ser formado a partir de qualquer combinação de o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico e o pelo menos um polipéptido transportador. As modalidades exemplificativas compreende, por exemplo, (i) pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico a partir da família de TNF (por exemplo, TNFRl) combinado com um polipéptido transportador selecionado a partir de CD63 (SEQ ID No 14) , Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina ou qualquer outro polipéptido transportador adequado com capacidade de portar o pelo menos recetor armadilha de polipéptido terapêutico para a superfície (ou essencialmente qualquer localização adequada num exossoma de entrega terapêutica), (ii) pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico a partir da família de VEGF (por exemplo, VEGFR)combinado com um polipéptido transportador selecionado a partir de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina ou qualquer outro polipéptido transportador adequado com capacidade para portar o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico para a superfície (ou essencialmente qualquer localização adequada num exossoma de entrega terapêutica), (iii) pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico a partir da família de FGF combinado com um polipéptido transportador selecionado a partir de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina ou qualquer outro polipéptido transportador adequado com capacidade de portar o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico para a superfície (ou essencialmente qualquer localização adequada num exossoma de entrega terapêutica), (iv) pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico a partir da família de EGF combinado com um polipéptido transportador selecionado a partir de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina ou qualquer outro polipéptido transportador adequado com capacidade para portar o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico para a superfície (ou essencialmente qualquer localização adequada num exossoma de entrega terapêutica), (v) pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico a partir da família de activina combinado com um polipéptido transportador selecionado a partir de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina, (vi) pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico a partir da família de recetor de interleucina (por exemplo, IL6R (SEQ ID No 1) ou IL12R beta 1 (SEQ ID No 4) ou ILlR do Tipo 1 (SEQ ID No 3)) combinado com um polipéptido transportador selecionado a partir de, por exemplo, CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina, ou qualquer outro polipéptido transportador adequado com capacidade para portar o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico para a superfície (ou essencialmente qualquer localização adequada num exossoma de entrega terapêutica), ou qualquer outro polipéptido transportador adequado com capacidade para portar o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico para superfície (ou essencialmente qualquer localização adequada num exossoma de entrega terapêutica).
Ainda noutra modalidade vantajosa da presente invenção, um polipéptido transportador adequado (tal como CD63, Lamp2b, CD9, CD81, sinaptotagmina ou sindecano, etc.) é fundido com PTCHl, que cria um constructo de polipéptido com capacidade para sequestrar uma "sonic hedgehog" (SHH) , que é uma molécula de sinalização importante implicada em vários cancros. Os inventores observaram de modo experimental uma massa total tumoral diminuída em ratinhos tratados com exossomas, que compreendem vários polipéptidos transportadores acoplados a PTCHl e a um domínio de ligação de SHH especificamente selecionado de PTCHl. Por exemplo, na configuração experimental relatada na Figura 4, os exossomas que compreendem constructos de polipéptido que compreendem CD63 ou Lamp2b como o polipéptido transportador e PTCHl como o recetor armadilha de polipéptido terapêutico mostraram uma eficácia anti-tumoral semelhante como os constructos de sindecano-VEGFR, mostrados no gráfico em questão.
Em modalidades adicionais, o exossoma de entrega terapêutica, em conformidade com a presente invenção, pode adicionalmente compreender, pelo menos, uma entidade de direcionamento presente. A referida entidade de direcionamento está, normalmente, pelo menos parcialmente presente no exterior do exossoma de entrega, de modo a proporcionar o direcionamento dos exossomas para tecidos, tipos de células ou órgãos de interesse, por exemplo, para aumentar a concentração de exossomas de entrega localmente no sítio em que a eficácia terapêutica necessita de estar tão elevada quanto possível. A entidade de direcionamento pode ser um péptido ou um polipéptido (por exemplo, um anticorpo ou um fragmento de anticorpo), mas também pode ser uma molécula pequena (tal como uma vitamina), um hidrato de carbono, um ácido nucleico (tal como um aptâmero) ou qualquer outro tipo de molécula que pode conferir propriedades de direcionamento a exossomas de entrega terapêutica.
Geralmente, a presente invenção fornece exossomas de entrega, consoante a presente invenção, para utilização em medicina e, mais especificamente, a presente invenção refere-se à utilização na profilaxia e/ou alivio e/ou tratamento de doenças e distúrbios selecionados a partir do grupo que compreende a doença de Crohn, colite ulcerosa, artrite reumatoide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática, psoriase, sindrome periódica associada ao recetor do fator de necrose tumoral (TNF) (TRAPS) , deficiência do antagonista recetor de interleucina-1 (DIRA), endometriose, hepatite autoimune, esclerodermia, miosite, acidente vascular cerebral, lesão aguda da medula espinhal, vasculite, sindrome de Guillain-Barré, enfarte do miocárdio agudo, ARDS, septicemia, meningite, encefalite, insuficiência do fígado, insuficiência renal, doença do enxerto versus hospedeiro, distrofia muscular de Duchenne e outras doenças musculares e doença neurodegenerativa, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntingtons, ALS, caquexia induzida por cancro, anorexia, diabetes melitus do tipo 2 e cancros (por exemplo, cancros sensíveis a EGF, VEGF, FGF) . Alguns dos tipos de cancro de relevância para a presente invenção compreendem, por exemplo, Leucemia linfoblástica aguda (ALL), Leucemia mieloide aguda, Carcinoma adrenocortical, cancros relacionados com SIDA, linfoma relacionado com SIDA, Cancro anal, Cancro do apêndice, Astrocitoma, cerebelar ou cerebral, Carcinoma de célula basal, Cancro da via biliar, Cancro da bexiga, Cancro dos ossos, glioma do tronco cerebral, Cancro do cérebro, Tumor cerebral (astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmico primitivos supratentoriais, percurso visual e glioma hipotalâmico), Cancro da mama, adenomas brônquicos/carcinoides, linfoma de Burkitt, Tumor Carcinoide (infância, gastrointestinal) , Carcinoma de primário desconhecido, Linfoma do sistema nervoso central, astrocitoma cerebelar/Glioma maligno, Cancro do colo do útero, Leucemina linfocítica crónica, Leucemia mielógena crónica, Distúrbios mieloproliferativos crónicos, Cancro do cólon, Linfoma de Células T cutâneo, Tumor desmoplásico de células redondas pequenas, Cancro endometrial, Ependimoma, cancro do esófago, Tumor de célula germinativa extracraniano, Tumor de célula germinativa extragonadal, Cancro da via biliar extrahepático, Cancro do olho (melanoma intraocular, Retinoblastoma), Cancro da vesícula biliar, Cancro gástrico (estômago) , Tumor carcinoide gastrointestinal, tumor de estroma gastrointestinal (GIST), Tumor de célula germinativa (extracraniano, extragonadal ou do ovários), Tumor trofoblástico gestacional, Glioma (glioma do tronco cerebral, Astrocitoma Cerebral, Percurso visual e Glioma hipotalâmico), Carcinoide gástrico, Leucemia de células pilosas , Cancro da cabeça e pescoço, Cancro do coração, Cancro hepatocelular (fígado), linfoma de Hodgkin, Cancro da hipofaringe, Melanoma Intraocular, Carcinoma de células ilhotas (Pâncreas endócrino), Sarcoma de Kaposi, Cancro dos rins (cancro de células renais), Cancro laríngeo, Leucemias ((linfoblástico agudo (também denominado de leucemia linfocítica aguda), mieloide agudo (também denominado de leucemia mieloide aguda), linfocítico crónico (também denominado de leucemia linfocítica crónica), mieloide crónico (também denominado de leucemia mieloide crónica), leucemia de células pilosas)), Cancro de cavidade oral e lábios, Lipossarcoma, Cancro do fígado (Primário),
Cancro dos pulmões (Células não pequenas, células pequenas), Linfomas ((linfoma relacionado com SIDA, Linfoma de Burkitt, Linfoma de células T cutâneo, Linfoma de Hodgkin, Linfoma de classificação não Hodgkin (uma antiga classificação de todos os linfomas, exceto os de Hodgkin), Linfoma do sistema nervoso central primário)), Meduloblastoma, Carcinoma de célula de, Mesotelioma, Cancro do pescoço escamoso metastático com Primário Oculto, Cancro da boca, Síndrome de neoplasia endócrina múltipla, Mieloma múltiplo/Neoplama da célula plasmática, Micose fungoide, doenças mielodisplásica /Mieloproliferativas, Leucemia mieloide, Leucemia Mieloide Crónica (Aguda, Crónica), Mieloma, cancro do seio paranasal e cavidade nasal, carcinoma nasofaríngeo, Neuroblastoma, Cancro oral, Cancro orofaríngeo, Histiocitoma fibroso de osteossarcoma/maligno do osso, Cancro dos ovários, Cancro epitelial dos ovários (Tumor do estroma epitelial de superfície), Tumor de célula germinativa dos ovários, Tumor dos ovários de baixo potencial maligno, Cancro pancreático, cancro de células ilhotas pancreático, Cancro paratiroide, Cancro peniano, Cancro da faringe, Feocromocitoma, Astrocitoma pineal, Germinoma pineal, Pineoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, adenoma pituitário, Blastoma pleuropulmonar, Cancro da próstata, Cancro do reto, Carcinoma da célula renal (Cancro dos rins), Retinoblastoma, rabdomiossarcoma , Cancro das glândulas salivares, Sarcoma (família de Ewing de tumores sarcoma, Sarcoma de Kaposi, sarcoma de tecido mole, sarcoma uterino), Síndrome de Sézary, Cancro da pele (não melanoma, melanoma), Cancro do intestino delgado, Célula escamosa, Cancro do pescoço escamoso, Cancro do estômago, Tumor neuroedoctérmico primitivo, Cancro dos testículos, Cancro da garganta, Timoma e carcinoma tímico, Cancro da tiroide, Cancro da célula transicional da bacia renal e uretra, Cancro uretral, Cancro uterino, Sarcoma uterino, Cancro da vagina, Cancro vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom e/ou Tumor de Wilm (Cancro dos rins).
Além disso, a presente invenção fornece composições farmacêuticas que compreendem exossomas de entrega terapêutica, consoante a presente invenção, normalmente formulados com, pelo menos, um excipiente farmaceuticamente aceitável. 0 pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável pode ser selecionado a partir do grupo que compreende qualquer material, composição ou veiculo farmaceuticamente aceitável, por exemplo, uma carga liquida ou sólida, um diluente, um excipiente, um transportador, um solvente ou um material de encapsulação, que pode estar envolvido, por exemplo, em suspender, manter a atividade ou transportar ou portar os exossomas de entrega terapêutica a partir de um órgão ou porção do corpo para outro órgão ou porção do corpo (por exemplo, a partir do sangue para qualquer tecido e/ou órgão e/ou parte do corpo de interesse). A presente invenção também se refere a aplicações cosméticas dos exossomas de entrega. Assim, as modalidades da presente invenção podem referir-se a produtos de cuidado da pele, tais como cremes, loções, géis, emulsões, pomadas, pastas, pós, linimentos, protetores solares, champôs, etc., que compreendem os exossomas de entrega, de modo a melhorar e/ou aliviar sintomas e problemas, tais como pele seca, rugas, dobras, saliências e/ou sulcos na pele. Os exossomas de entrega podem exibir efeitos benéficos, sem o constructo de polipéptido que está presente, mas a presença de um constructo de polipéptido adequado pode intensificar adicionalmente a eficácia cosmética. Numa modalidade, os exossomas de entrega, consoante a presente invenção, podem compreender toxina de botulina (por exemplo, botox, por exemplo, toxina de botulina de tipo A-G) como o recetor armadilha de polipéptido terapêutico (toxinas de botulina podem não ser utilizadas necessariamente apenas para aplicações cosméticas, mas podem também ser aplicadas, por exemplo, para tratamento de dores de cabeça de enxaqueca e distonia). Numa modalidade preferencial, os exossomas a partir de células produtoras de exossoma adequadas são compreendidos num creme cosmético, loção ou gel para utilização no tratamento (que é normalmente para propósitos cosméticos) de rugas, linhas, dobras, saliências e/ou sulcos de pele.
Os exossomas, em conformidade com a presente invenção, compreendem um constructo de polipéptido terapêutico.
Os exossomas que compreendem um constructo de polipéptido terapêutico podem mediar efeitos anti-inflamatórios, anti-apoptóticos e proliferativos de células que podem intensificar a cicatrização de feridas e regeneração da pele. As experiências realizadas com a utilização de (i) exossomas, sem qualquer constructo de polipéptido terapêutico (ii) e exossomas que compreendem um constructo de polipéptido terapêutico de VEGFRl (com CD63 ou Lamp2b, como o polipéptido transportador) mostram que ambas as estratégias exibem uma potência cosmética forte no alivio, por exemplo, de telangiectasia (pequenos vasos sanguíneos dilatados localizados perto da pele). Os exossomas desprovidos de polipéptidos terapêuticos mostraram também aliviar problemas de cosmética, tais como pele seca, rugas, erupções cutâneas, etc. e, adicionalmente, os exossomas que compreendem, por exemplo, polipéptidos terapêuticos que contêm TNFR são altamente potentes no tratamento de erupções cutâneas, descamação e, potencialmente, psoríase e problemas relacionados com psoríase.
Em modalidades adicionais, os exossomas de entrega, em conformidade com a presente invenção, podem compreender recetores armadilha de polipéptido terapêuticos, tais como colagénio, lamininas (por exemplo, lamininas 111, 211, 511 e/ou 521) e/ou péptidos penetradores de células (CPPs).
Opcionalmente, glicosaminoglicanos (GAGs) e/ou outros tipos de hidratos de carbono podem ser incluídos nos exossomas de entrega, para aumentar adicionalmente os efeitos relacionados com manutenção da integridade estrutural da pele.
Num aspeto, consoante a presente invenção, o constructo de polipéptido pode compreender um constructo de polipéptido que compreende virtualmente qualquer recetor armadilha de polipéptido terapêutico, que se pode ligar a um ligante de circulação fundido virtualmente com qualquer polipéptido transportador.
As composições farmacêuticas, consoante a presente invenção, são naturalmente adequadas para utilização em medicina e, especificamente em profilaxia e/ou alívio e/ou tratamento se doenças e distúrbios selecionados a partir do grupo que consiste na doença de Crohn, colite ulcerosa, artrite reumatoide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática, psoríase, síndrome periódica associada ao recetor do fator de necrose tumoral (TNF) (TRAPS), deficiência do antagonista recetor de interleucina-1 (DIRA), endometriose, hepatite autoimune, esclerodermia, miosite, acidente vascular cerebral, lesão aguda da medula espinhal, vasculite, síndrome de Guillain-Barré, enfarte do miocárdio agudo, ARDS, septicemia, meningite, encefalite, insuficiência do fígado, insuficiência renal, doença do enxerto versus hospedeiro, distrofia muscular de Duchenne e outras doenças musculares, caquexia induzida por cancro, anorexia, diabetes melitus do tipo 2 e cancro (por exemplo, cancros sensíveis a EGF, VEGF, FGF) .
Os exossomas de entrega terapêutica, consoante a presente invenção, podem ser administrados a um sujeito ser humano ou animal por meio de várias vias diferentes, por exemplo, administração auricular (ótico), bucal, conjuntival, cutânea, dental, eletro-osmose, endocervical, endossinusal, endotraqueal, entérica, epidural, extra-amniótica, extracorporal, hemodiálise, infiltração, intersticial, intra-abdominal, intra-amniótica, intra-arterial, intra-articular, intrabiliar, intrabronquial, intrassinovial, intracardíaca, intracartilaginoso, intracaudal, intracavernoso, intracavitário, intracerebral, intracisternal, intracorneal, intracoronal (dental), intracoronária, intracorpos cavernosos, intradérmica, intradiscal, intradutal, intraduodenal, intradural, intraepidérmica, intraesofágica, intragástrica, intragengival, intraileal, intralesional, intraluminar, intralinfática, intramedular, intrameníngeo, intramuscular, intraocular, intraovários, intrapericárdico, intraperitoneal, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrassinal, intraespinal, intrassinuvial, intratendinoso, intratesticular, intratecal, intratoráxico, intratubular, intratumor, intratimpânico, intrauterino, intravascular, intravenosa, bólus intravenoso, gota intravenosa, intraventricular, intravesical, intravítrea, iontoforese, irrigação, técnica de preparação oclusiva laringea, nasal, nasogátrica, oftálmica, oral, orofaringea, outra, parentérica, percutânea, periarticular, peridural, perineural, periodontal, retal, respiratória (inalação) , retrobulbar, tecido mole, subaracnoide, subconjuntival, subcutânea, sublingual, submucosa, tópica, transdérmica, transmucosa, transplacentária, transtraqueal, transtimpânica, ureteral, uretral e/ou vaginal, e/ou qualquer combinação da vias de administração acima mencionadas.
Num aspeto adicional, a presente invenção refere-se a um método de produzir um exossoma de entrega terapêutica, que compreende as etapas de (i) fornecer, pelo menos, um constructo de polinucleótido que codifica, pelo menos, um constructo de polipéptido, em que o constructo de polipéptido compreende, pelo menos, um polipéptido transportador fundido com, pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico que liga um ligante de circulação,(ii) introduzir o referido pelo menos um constructo de polinucleótido numa célula com capacidade para produzir exossomas de entrega adequados (através da translação do constructo de polinucleótido para o constructo de polipéptido correspondente) , e (iii) recolher, pelo menos, um exossoma de entrega produzido pela célula de cada etapa (ii). 0 método pode adicionalmente compreender uma etapa de purificação, em que o exossoma de entrega terapêutica é purificado através de um procedimento selecionado a partir do grupo que compreende cromatografia liquida (LC) , cromatografia liquida de alto desempenho (HPLC), filtração por rotação, filtração de fluxo tangencial, centrifugação, imunoprecipitação, etc. ou qualquer combinação dos mesmos.
Surpreendentemente, os inventores aperceberam-se que aplicar uma combinação sequencial de filtração (preferencialmente, ultrafiltração (UF)) e cromatografia liquida por exclusão de tamanho (LC) resulta numa purificação otimizada que, por sua vez, leva a uma eficácia terapêutica superior. Adicionalmente, conforme comparado com a ultracentrifugação (UC) , que é empregue de modo rotineiro para purificar os exossomas, a ultrafiltração sequencial-cromatografia liquida (UF-LC) é consideravelmente mais rápida e possível de nivelar para volumes de fabrico superiores, que é uma desvantagem significativa da metodologia de UC atual. Contudo, conforme será descrito em maior detalhe abaixo, a implicação mais vantajosa da utilização de UF-LC, em vez de UC, é o facto de que os exossomas (e outras vesículas extracelulares às quais UF-LC é aplicado) retêm as suas propriedades biológicas e biofísicas, que resultam em menos acumulação no tecido dos pulmões, aquando da administração in vivo e, portanto, melhora a eficácia terapêutica.
De acordo com a análise por microscopia eletrónica (EM), as vesículas a partir de ambas as preparações de UF e UC exibiram uma morfologia em formato de copo ou arredondada. Na maioria dos casos, o diâmetro da vesícula foi medido à volta de 100 nm e isso foi em conformidade com os resultados obtidos por meio de análise de rastreio de nanopartícuias (NTA). Contudo, é de destacar que uma fração de vesículas na amostra de UC foi claramente distorcida (ou prejudicada ou fundida para formar vesículas ligeiramente maiores) e tais vesículas não foram observadas nas amostras de UF. Logo, esses resultados indicam que a metodologia de UC teve um impacto negativo na integridade vesicular.
Para verificar a presença de agregados de vesícula em amostras de UC, os inventores examinaram a seguir exossomas rotulados de HEK293T CD63-EGFP, diretamente por microscopia de fluorescência. Semelhante aos resultados de FCS, apenas as amostras de UC exibiram agregados grandes visíveis no canal de fluorescência, que não foram vistos com as amostras de UF. Isso foi confirmados com a utilização de exossomas rotulados por marcador fluorescente DÍ0C6. Assim, o método de isolamento de UF resulta numa preservação das propriedades biofísicas inerentes de vesículas, comparado com UC, que resulta na agregação/fusão e disrupção de vesículas.
As experiências de UF, em conformidade com a presente invenção, foram desempenhadas primeiramente com a utilização de filtros com um peso molecular de valor limite de 100-kDa, 250-kDa e/ou 500-kDa, ou qualquer combinação sequencial dos mesmos. Em modalidades preferenciais, o valor limite de 100-kDa é preferencial, mas dado o número de biomoléculas com peso molecular superior, é possível que os componentes secretados por meio/célula diferentes dos exossomas sejam aprisionados nos filtros e o protocolo de UF foi, portanto, refinado adicionalmente com a utilização de cromatografia líquida por exclusão de tamanho altamente não convencional. As amostras de UF foram carregadas, entre outras, numa coluna de LC por exclusão de tamanho de Sephacryl S-300 ou Sephacryl S-500, em que duas frações distintas foram recolhidas com base na absorvância de célula de fluxo UV a 280 nm. A NTA revelou que 98% das partículas foram recuperadas na fração 1, em que o tamanho de partícula de modo foi consistente em todas as três réplicas de UF-LC. O mancheamento de proteína total subsequente em SDSPAGE confirmou que muitas das proteínas de contaminação originalmente vistas na amostra de UF foram eluídas na fração 2, enquanto a fração 1 não teve quaisquer níveis detetáveis de proteína. Ao utilizar o método de Western Blot (WB), os marcadores exossomais, tais como Alix e CD9 foram apenas detetados na fração 1 e não na fração 2, o que indicou que a fração 1 conteve exossomas puros. Além do mais, a taxa de recuperação de vesícula, seguido do fracionamento de LC foi de 70 +/- 19%, logo, a LC não dificultou o ganho no rendimento de partícula alcançado pela UF sozinha. O método de WB confirmou esses dados, uma vez que os marcadores exossomais foram fortemente mais expressos na fração 1 de LC, comparado com amostras purificadas por UC. Além disso, a proteína por rácio de vesícula foi muito mais inferior para UF-LC, comparado com as amostras de UC. EM também foi desempenhada na fração 1 e 2, em que vesículas de formato em copo intactas foram detetadas apenas na fração 1, enquanto os agregados de proteína foram vistos na fração2. Além disso, quando os exossomas rotulados de HEK293T CD63-EGFP, purificados com UF-LC, foram visualizados na microscopia de fluorescência, as vesículas positivas de EGFP pareceram semelhantes às vesículas purificadas de UF, o que indicou que a LC não afetou as propriedades biofísicas das vesículas. Assim, os inventores constataram que a utilização de um método de duas etapas, que combina UF com LC subsequente, permitiu surpreendentemente um isolamento altamente eficiente de rendimentos elevados de exossomas biofisicamente intactos livres de contaminação de proteínas. O campo de exossomas atualmente depende completamente da eficácia sentida do método de UC, que os presentes inventores provaram ser altamente não fiável. O método de purificação de UF-LC da presente invenção e o método de UC convencional isolou vesículas com teores de proteína semelhantes, conforme evidenciado pela boa sobreposição proteómica entre os dois métodos. Contudo, mais importante, o método de UF-LC resulta em purificação de alto rendimento de vesículas desprovidas de contaminação não exossomal.
Apesar dos perfis proteómicos semelhantes de exossomas isolados pelo método de UF-LC da presente invenção e os métodos de UC convencionais, os inventores colocaram a hipótese de que as diferenças distintas na integridade de exossomas entre os métodos de purificação (agregação da vesícula e fusão, seguido da purificação de UC) pode influencias as suas propriedades in vivo. Dado que é bem estabelecido que as partículas agregadas tipicamente mostram acumulação nos pulmões, seguido da injeção intravenosa (IV), os inventores especularam que os exossomas purificados por UC podem preferencialmente distribuir para tecidos pulmonares, comparado com as vesículas purificadas por UF-LC. Para investigar isso, o mesmo número de exossomas rotulados por marcador fluorescente quase infravermelho (DiR) (com base em cálculos de NTA) foi injetado por meio da veia da cauda em ratinhos Balb/c adultos e a biodistribuição foi analisada com a utilização de imagiologia de IVIS, 24 horas após a injeção. Conforme postulado, os exossomas purificados por UC mostraram um sinal 4,6 vezes (p<0,0001) mais forte nos pulmões, comparado com vesículas purificadas por UF-LC. 0 sinal a partir do fígado foi esperado ser superior no grupo de UF-LC (p<0,0001), uma vez que a fluorescência total injetada difere apenas por 6%. Assim, as vesículas isoladas com a utilização de métodos de UF-LC altamente vantajosos são biofisicamente intactas, não acumulam preferencialmente nos pulmões e, portanto, são mais adequadas para aplicações terapêutica in vivo.
Conforme pode ser visto a partir da descrição acima, o método de UF-LC é geralmente aplicável à purificação de qualquer tipo de vesículas (tais como exossomas, lipossomas, etc.) e podem compreender expor qualquer tipo de preparação de vesícula adequada, que necessita de ser purificada, ao UF-LC. Contudo, a presente invenção refere-se à obtenção de exossomas a partir de uma fonte adequada (por exemplo, exossomas produzidos pelos métodos da presente invenção, que podem opcionalmente compreender constructos de polipéptido que, por sua vez, compreendem polipéptidos transportadores e recetores armadilha terapêuticos), que expõe os exossomas (que estão normalmente presente num meio que compreende também vários outros componentes, tais como proteínas e péptidos) a uma etapa de ultrafiltração, seguido de uma etapa de cromatografia líquida por exclusão de tamanho (LC).
Além disso, numa modalidade preferencial, a presente invenção refere-se a um método de produção de um exossoma de entrega terapêutica, que compreende as etapas de (i) fornecer, pelo menos, um constructo de polinucleótido que codifica, pelo menos, um constructo de polipéptido, em que o constructo de polipéptido compreende, pelo menos, um polipéptido transportador fundido com, pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico que liga um ligante de circulação, (ii) introduzir o referido pelo menos um constructo de polinucleótido numa célula com capacidade para produzir exossomas de entrega adequados (através da translação do constructo de polinucleótido para o constructo de polipéptido correspondente), e (iii) purificar os exossomas de entrega da etapa (ii) com a utilização de ultrafiltração (UF), seguido da cromatografia líquida por exclusão de tamanho (LC). Os exossomas de entrega obtidos com a utilização da referida metodologia podem, portanto, exibir propriedades biológicas e estabilidade biofísica significativamente melhoradas, mais do que exossomas obtidos por meio da metodologia convencional de UC. Numa modalidade adicional, pelo menos, um filtro pode ser utilizado para a etapa de UF e o filtro (ou filtros) podem ter os mesmos ou diferentes valores limite, por exemplo, pode-se inicialmente desempenhar uma primeira etapa com um valor limite de 100 kDa e, numa segunda etapa, um filtro com um valor limite de 200 kDa. Naturalmente, o filtro pode ser selecionado para ter qualquer valor limite apropriado, por exemplo, de 100 kDa, 200 kDa, 500 kDa, etc. Além disso, em modalidades adicionais, a coluna utilizada para a etapa de LC pode ter essencialmente qualquer tamanho de poro adequado. S-300, S-500 e S-1000 de uma coluna da Sephacryl funcionaram igualmente bem, produzindo consistentemente dois picos bem definidos, sendo que um dos picos é a fração que contém a vesícula.
Numa modalidade adicional da presente invenção, a produção de exossomas pode ser aumentada ao incluir inibidores de autofagia no meio de cultura de células, quando se cultiva as células produtoras de exossomas. Conforme representado na Figura 8, tratar células com inibidores de autofagia resultou num aumento surpreendente do rendimento exossomal. Várias substâncias podem ser utilizadas para inibir a diferentes fases do percurso de autofagia, por exemplo, incluindo, mas sem limitação, Bafilomicina A e cloroquina (que inibe a fusão do autofagossoma com o lisossoma) e/ou 3-metiladenina (que é um inibidor de PI3K que prejudique a formação de pré-fases do autofagossoma). Assim, a presente invenção refere-se adicionalmente à utilização de inibidores de autofagia para aumentar o rendimento de exossomas em cultura de células. As substâncias que inibem a autofagia, consoante a presente invenção, podem incluir inibidores de beclina-1, inibidores de PI3K (por exemplo, 3-metiladenina) e inibidores da fusão entre autofagossoma e lisossoma (por exemplo, Bafilomicina A e cloroquina). Assim, num aspeto geral, a presente invenção refere-se ao aumento do rendimento de exossomas, ao tratar a células (ou células) produtoras de exossomas com, pelo menos um inibidor de autofagia.
Um método de produção de um exossoma de entrega terapêutica, consoante a presente invenção, pode compreender as etapas de (i) fornecer, pelo menos, um constructo de polinucleótido que codifica, pelo menos, um constructo de polipéptido, (ii) introduzir o referido pelo menos um constructo de polinucleótido numa célula com capacidade para produzir exossomas que compreende o constructo de polipéptido transladado a partir do constructo de polinucleótido, (iii) cultivar as referidas células na presença de, pelo menos, um inibidor de autofagia, (iv) purificar os exossomas de entrega obtidos a partir das referidas células com a utilização de purificação de UF-LC. 0 método de produção de um exossoma de entrega terapêutica pode, de modo alternativo, compreender as etapas de (i) fornecer (a) , pelo menos, um constructo de polinucleótido que codifica, pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico e (b) , pelo menos, um constructo de polinucleótido que codifica, pelo menos, um polipéptido transportador, (ii) introduzir, pelo menos, um dos constructos de polinucleótido (a) e pelo menos, um dos constructos de polinucleótido (b) numa célula com capacidade para produzir exossomas de entrega e (iii) recolher, pelo menos, um exossoma de entrega produzido pela célula da etapa (ii) . Quando se emprega esse método, o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico e o pelo menos um polipéptido transportador podem formar um constructo de polipéptido único, através da formação de, por exemplo, uma ponte de dissulfureto entre o polipéptidos transportador e o recetor armadilha de polipéptido terapêutico ou através da formação de uma interação de biotina- estreptavidina, ou através da formação de qualquer outro tipo de vinculo químico, que inclui a formação de um complexo de sindecano-sontenina-ALIX de vínculo químico, que inclua formação de um complexo sindecano-sintenina-ALIX.
Em ainda outro aspeto, a presente invenção refere-se a um constructo de polipéptido que compreende, pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico que liga uma molécula alvo fundida, pelo menos, a um polipéptido transportador. 0 referido constructo de polipéptido pode, em modalidades exemplificativas, compreender, por exemplo, (i) pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico a partir da família de TNF combinado com um polipéptido transportador selecionado a partir de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina (ou quaisquer derivados ou análogos dos mesmos), ou qualquer outro polipéptido transportador adequado com capacidade para portar o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico para a superfície (ou essencialmente qualquer localização adequada num exossoma de entrega terapêutica), (ii) pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico a partir da família de VEGF combinado com um polipéptido transportador selecionado a partir de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina (ou quaisquer derivados ou análogos dos mesmos) ou qualquer outro polipéptido transportador adequado com capacidade para portar o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico para a superfície (ou essencialmente qualquer localização adequada num exossoma de entrega terapêutica), (iii) pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico a partir da família de FGF combinado com um polipéptido transportador selecionado a partir de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina (ou quaisquer derivados ou análogos dos mesmos), ou qualquer outro polipéptido transportador adequado com capacidade para transportar o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico para a superfície (ou essencialmente qualquer localização adequada num exossoma de entrega terapêutica), (iv) pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico a partir da família de EGF combinado com um polipéptido transportador selecionado a partir da CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina (ou quaisquer derivados ou análogos dos mesmos), ou qualquer outro polipéptido transportador adequado com capacidade para portar o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico para a superfície (ou essencialmente qualquer localização adequada num exossoma de entrega terapêutica), (v) pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico a partir da família de activina combinado com um polipéptido transportador selecionado a partir de CD63, Lamp2b, sindecano, sinaptotagmina (ou quaisquer derivados ou análogos dos mesmos), ou qualquer outro polipéptido transportador adequado com capacidade de portar o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico para a superfície (ou essencialmente qualquer localização adequada num exossoma de entrega terapêutica).
Além do mais, a presente invenção pode, em aspetos adicionais, referir-se a um constructo de polinucleótido que codifica, pelo menos, um polipéptido terapêutico, em conformidade com a presente invenção, e num aspeto adicional uma célula que compreende, pelo menos, um constructo de polinucleótido e/ou, pelo menos, um constructo de polipéptido. Num aspeto adicional, a presente invenção refere-se a um exossoma de entrega terapêutica obtido pelos métodos, consoante a presente invenção. As células que podem ser utilizadas para os propósitos da presente invenção compreendem, por exemplo, células mesenquimais, células estaminais adultas (por exemplo, mioblastos) , células estaminais pluripotentes induzidas (iPS) , células estaminais de sangue umbilical, células estaminais embrionárias e/ou células estaminais amnióticas, células derivadas de sangue (por exemplo, células B, macrófagos, células DC, células T, células NK, plaquetas, etc.), células eucarióticas imortalizadas ou linhas celulares (por exemplo, células de neuroblastoma NSC34, N2a e SHSY5Y, células de HEK, células estaminais neuronais C17.2, células neuroendoteliais bEND3, células de HeLa, células de U20S, etc.), ou qualquer combinação dessas fontes de células.
Os inventores aperceberam-se inesperadamente que o proteoma de vesículas extracelulares obtidas a partir de células expostas a condições de cultura induzidas por stress (tais como inanição de soro e privação de oxigénio) é intensificado em termos de GO positivo, conforme comparado com o proteoma de vesículas extracelulares a partir de células cultivas sob condições de controlo normais. As vesículas extracelulares (tais como exossomas) a partir de células expostas a inanição de soro e/ou privação de oxigénio (isto é, abastecimento de oxigénio reduzido) foram analisadas com o estado da arte LC/MS/MS (proteómicas), para examinar as mudanças em proteoma que as diferentes condições de cultura fazem surgir. Surpreendentemente, as condições induzidas por stress enriqueceram proteínas anti-apoptóticas e metabolicamente ativas a uma grande medida, maior do que as condições de cultura normais, de acordo com os termos de GO (Figura 10) (termos de GO: tradução, processos metabólicos, glicólise e proteínas ribossómicas). Logo, a inanição de soro e/ou privação de oxigénio enriquecem proteínas para processos de sobrevivência e metabólicos nos exossomas, o que seria um benefício para propósitos regenerativos. Os termos GO foram normalizados para o proteoma de exossomas a partir de uma célula de controlo de referência e o enriquecimento é expresso à medida que aumenta em vezes ao longo do valor esperado, a partir da célula de referência. Assim, num aspeto aplicável geralmente adicional, a presente invenção refere-se à utilização de condições induzidas por stress para enriquecer o proteoma de um exossoma para proteínas metabolicamente ativas e/ou proteínas anti-apoptóticas, isto é, termos GO positivos, tais como tradução, processos metabólicos, glicólise e/ou proteínas ribossómicas. Numa modalidade adicional, o método para obter exossomas de entrega, de acordo com a presente invenção, pode compreender uma etapa em que as células, a partir das quais os exossomas são obtidos, são expostas a condições induzidas por stress (por exemplo, mas sem limitação, privação de oxigénio e/ou inanição de soro) , de modo a induzir o enriquecimento de proteínas metabolicamente ativas e/ou proteínas anti-apoptóticas para intensificar os efeitos regenerativos dos exossomas. Quando se compara as vesículas de controlo (sem qualquer polipéptido terapêutico) cultivadas sob condições por indução de stress com vesículas de controlo (sem qualquer polipéptido terapêutico) cultivadas sob condições normais, a vesículas extracelulares expostas por stress geram um efeito terapêutico claramente intensificado em vários modelos inflamatórios, que indica que as capacidades regenerativas das vesículas extracelulares (notavelmente exossomas) aumentou, devido a condições de cultura por indução de stress.
Um aspeto particularmente vantajoso da presente invenção refere-se à exposição de células, a partir das quais os exossomas são para serem obtidos, para uma combinação de ambos os inibidores de autofagia e condições por indução de stress, de modo a (1) aumentar o rendimento de exossomas e (2) aumentar a capacidade regenerativa dos exossomas assim produzidos. Os Exossomas obtidos por meio dessa abordagem combinatória podem ser purificados com a utilização do protocolo de UF-LC vantajoso da presente invenção, para verdadeiramente assegurar que a eficácia terapêutica dos exossomas é otimizada.
Além disso, a presente invenção refere-se a um método de tratamento que compreende administrar uma quantidade terapeuticamente eficaz de exossomas de entrega terapêutica a um sujeito que necessite da mesma, em que o método tem a finalidades de melhorar, aliviar e/ou prevenir doenças, tais como a doença de Crohn, colite ulcerosa, artrite reumatoide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática, psoríase, sindrome periódica associada ao recetor do fator de necrose tumoral (TNF) (TRAPS), deficiência do antagonista recetor de interleucina-1 (DIRA), endometriose, hepatite autoimune, esclerodermia, miosite, acidente vascular cerebral, lesão aguda da medula espinhal, vasculite, sindrome de Guillain-Barré, enfarte do miocárdio agudo, ARDS, septicemia, meningite, encefalite, insuficiência do fígado, insuficiência renal, doença do enxerto versus hospedeiro, distrofia muscular de Duchenne e outras doenças musculares e doença neurodegenerativa, incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntingtons, caquexia induzida por cancro, anorexia, diabetes melitus do tipo 2 e cancros (por exemplo, cancros sensíveis a EGF, VEGF, FGF) . Alguns dos tipos de cancro de relevância para a presente invenção compreendem, por exemplo, Leucemia linfoblástica aguda (ALL), Leucemia mieloide aguda, Carcinoma adrenocortical, cancros relacionados com SIDA, linfoma relacionado com SIDA, Cancro anal, Cancro do apêndice, Astrocitoma, cerebelar ou cerebral, Carcinoma de célula basal, Cancro da via biliar, Cancro da bexiga, Cancro dos ossos, glioma do tronco cerebral, Cancro do cérebro, Tumor cerebral (astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmico primitivos supratentoriais, percurso visual e glioma hipotalâmico), Cancro da mama, adenomas brônquicos/carcinoides, linfoma de Burkitt, Tumor Carcinoide (infância, gastrointestinal), Carcinoma de primário desconhecido, Linfoma do sistema nervoso central, astrocitoma cerebelar/Glioma maligno, Cancro do colo do útero, Leucemina linfocítica crónica, Leucemia mielógena crónica, Distúrbios mieloproliferativos crónicos, Cancro do cólon, Linfoma de Células T cutâneo, Tumor desmoplásico de células redondas pequenas, Cancro endometrial, Ependimoma, cancro do esófago, Tumor de célula germinativa extracraniano, Tumor de célula germinativa extragonadal, Cancro da via biliar extrahepático, Cancro do olho (melanoma intraocular, Retinoblastoma), Cancro da vesícula biliar, Cancro gástrico (estômago), Tumor carcinoide gastrointestinal, tumor de estroma gastrointestinal (GIST), Tumor de célula germinativa (extracraniano, extragonadal ou do ovários), Tumor trofoblástico gestacional, Glioma (glioma do tronco cerebral, Astrocitoma Cerebral, Percurso visual e Glioma hipotalâmico), Carcinoide gástrico, Leucemia de células pilosas , Cancro da cabeça e pescoço, Cancro do coração, Cancro hepatocelular (fígado), linfoma de Hodgkin, Cancro da hipofaringe, Melanoma Intraocular, Carcinoma de células ilhotas (Pâncreas endócrino), Sarcoma de Kaposi, Cancro dos rins (cancro de células renais), Cancro laríngeo, Leucemias ( (linfoblástico agudo (também denominado de leucemia linfocítica aguda), mieloide agudo (também denominado de leucemia mieloide aguda), linfocítico crónico (também denominado de leucemia linfocítica crónica), mieloide crónico (também denominado de leucemia mieloide crónica), leucemia de células pilosas)), Cancro de cavidade oral e lábios, Lipossarcoma, Cancro do fígado (Primário), Cancro dos pulmões (Células não pequenas, células pequenas) , Linfomas ( (linfoma relacionado com SIDA, Linfoma de Burkitt, Linfoma de células T cutâneo, Linfoma de Hodgkin, Linfoma de classificação não Hodgkin (uma antiga classificação de todos os linfomas, exceto os de Hodgkin) , Linfoma do sistema nervoso central primário)), Meduloblastoma, Carcinoma de célula de, Mesotelioma, Cancro do pescoço escamoso metastático com Primário Oculto, Cancro da boca, Síndrome de neoplasia endócrina múltipla, Mieloma múltiplo/Neoplama da célula plasmática, Micose fungoide, doenças mielodisplásica /Mieloproliferativas, Leucemia mieloide, Leucemia Mieloide Crónica (Aguda, Crónica), Mieloma, cancro do seio paranasal e cavidade nasal, carcinoma nasofaríngeo, Neuroblastoma, Cancro oral, Cancro orofaríngeo, Histiocitoma fibroso de osteossarcoma/maligno do osso, Cancro dos ovários, Cancro epitelial dos ovários (Tumor do estroma epitelial de superfície), Tumor de célula germinativa dos ovários, Tumor dos ovários de baixo potencial maligno, Cancro pancreático, cancro de células ilhotas pancreático, Cancro paratiroide, Cancro peniano, Cancro da faringe, Feocromocitoma, Astrocitoma pineal, Germinoma pineal, Pineoblastoma e tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, adenoma pituitário, Blastoma pleuropulmonar, Cancro da próstata, Cancro do reto, Carcinoma da célula renal (Cancro dos rins), Retinoblastoma, rabdomiossarcoma , Cancro das glândulas salivares, Sarcoma (família de Ewing de tumores sarcoma, Sarcoma de Kaposi, sarcoma de tecido mole, sarcoma uterino), Síndrome de Sézary, Cancro da pele (não melanoma, melanoma), Cancro do intestino delgado, Célula escamosa, Cancro do pescoço escamoso, Cancro do estômago, Tumor neuroedoctérmico primitivo, Cancro dos testículos, Cancro da garganta, Timoma e carcinoma tímico, Cancro da tiroide, Cancro da célula transicional da bacia renal e uretra, Cancro uretral, Cancro uterino, Sarcoma uterino, Cancro da vagina, Cancro vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom e/ou Tumor de Wilm (Cancro dos rins).
Ao contrário de muitas outras terapias, os exossomas e outras vesículas extracelulares têm o potencial de cruzar a barreira de sangue-cérebro (BBB). Os exossomas de entrega terapêuticos que compreendem recetores armadilha sem sinalização, por exemplo, IL6, Ιύΐβ e TNFa podem, assim, modular os vários distúrbios do sistema nervoso central (CNS) e, especificamente, várias formas de neuro-inflamação. A neuro-inflamação é a inflamação do sistema nervoso, que inclui o sistema nervoso central (CNS). A neuro-inflamação pode ser aguda, por exemplo, acontecimentos traumáticos ou infeciosos ou crónica, por exemplo, doenças neurodegenerativas (incluindo a doença de Alzheimer, doença de Parkinson e doenças desmielinizantes, tais como a esclerose múltipla (MS)). No CNS, as células gliais, que incluem microgliais e astrócitos, têm um papel importante na imunidade inata. Essas células, entre outros tipos de células no cérebro, podem produzir citocinas e quimiocinas que atuam como neuro-moduladores. As citocinas mais comuns na neuro-inflamação de CNS incluem IL6, IL-Ιβ e TNFa. A produção dessas citocinas pró-inflamatórias pode provocar neurotoxicidade e pode comprometer a integridade da barreia sangue-cérebro (BBB).
Num modelo in vivo de encefalomielite autoimune experimental (EAE), ratinhos tratados com exossomas de entrega terapêutica que compreendem vários recetores armadilha de polipéptido terapêutico(s) (conforme acima descrito) exibiram um fenótipo de doença marcadamente melhorado, conforme ilustrado na Figura 9. Assim, num aspeto adicional, a presente invenção refere-se à entrega de qualquer recetor adequado (por exemplo, IL-6R, TNFRl, IL-lpR, e/ou qualquer combinação dos mesmos) para o CNS, para tratar essencialmente qualquer neuro-inflamação.
Além disso, a presente invenção refere-se adicionalmente a reagentes, kits, meios de células e processos de cultura de células. Por exemplo, os processos de cultura de células que utilizam os métodos para produzir os exossomas de entrega terapêutica da presente invenção podem ser empregues numa variedade de linhas celulares adequadas produtoras de exossoma, tais como células mesenquimais, células estaminais de adulto (por exemplo, mioblastos), células estaminais pluripotentes induzidas (iPS), células estaminais de sangue umbilical, células estaminais embrionárias e/ou células estaminais amnióticas, células derivadas de sangue (por exemplo, células B, macrófagos, células DC, células T, células NK, plaquetas, etc.), células eucarióticas imortalizadas ou linhas celulares (por exemplo, células de neuroblastoma NSC34, N2a e SHSY5Y, células de HEK, células estaminais neuronais C17.2, células neuroendoteliais bEND3, células de HeLa, células de U20S, etc.), ou qualquer combinação dessas fontes de células. Em modalidades adicionais, a presente invenção refere-se a um meio de cultura de células, qualquer reagente adequado para a utilização in vitro e/ou um kit de partes que compreendem exossomas de entrega terapêutica. Particularmente, os kits vantajosos podem compreender, opcionalmente em recipientes separados, meios de células para cultivar células produtoras de exossoma e inibidores de autofagia, para aumentar o rendimento de produção de exossomas. 0 meio de cultura de células, consoante a presente invenção, pode ser adaptado para conter muito pouco ou nenhum soro, de modo a assegurar que os exossomas produzidos pelas células expressam quantidades superiores de proteínas anto-apo ptóticas e metabolicamente ativas, para aumentar a sua capacidade regenerativa inerente. Por exemplo, numa modalidade preferencial, a presente invenção refere-se a um kit que compreende (i) meios de cultura para a cultura de células sob condições de inanição de soro, para aumentar os efeitos regenerativos dos exossomas produzidos, (ii) inibidores de autofagia, tais como cloroquina, bafilomicina A e/ou 3-metiladenina, ou qualquer combinação dos mesmos, para aumentar o rendimento de produção dos exossomas e células adequadas para a produção de exossomas.
Deve ser entendido que os aspetos exemplificativos acima descritos, modalidades e alternativas e variantes podem ser modificados, sem o afastamento do âmbito da invenção, entre outros, em relação aos constituintes e componentes descritos (por exemplo, os recetores armadilha de polipéptido terapêuticos e os polipéptidos transportadores, etc.), materiais (por exemplo, tipos de célula, etc.) e parâmetros de métodos (por exemplo, técnicas de purificação, abordagens de conjugação, etc.) aplicados. A invenção será agora adicionalmente exemplificada com os exemplos anexados, que naturalmente também podem ser modificados, sem se afastarem do âmbito da invenção.
Exemplos
Produção de vesícula de entrega com base em células
Um tipo de célula que produz uma vesícula de entrega terapêutica adequada, tal como um exossoma, uma micro sícula ou qualquer outro tipo de estrutura derivada de células é colocado em placas/inoculado com uma densidade apropriada num meio de células. No cado de produção de exossomas, um tipo de célula produtora de exossoma é colocado em placas/inoculado com uma densidade apropriada num meio de células. 0 meio de células é removido após 24 horas e a placa é lavada com PBS, 3 vezes. Novos meios frescos pobres em exossoma ou meios sem soro são adicionados. Os exossomas são purificados a partir do meio condicionado. 0 tempo de incubação, antes do meio ser retirado das células, normalmente varia a partir 48 a 72 horas, dependendo do tipo de células e pode, contudo, ser aumentado ou diminuído sob certas circunstâncias. 0 meio em que as células são cultivadas está sempre empobrecido em exossomas estranhos e micropartícuias por ultracentrifugação a 110.000 g, durante a noite, antes da incubação com as células. De modo alternativo, o meio sem soro é aplicado no seu lugar, tais como OptiMEM ou DMEM. O meio condicionado por de ser purificado com diferentes técnicas; ultrafiltração com LC sequencial ou purificação por cromatografia de alto desempenho, ultracentrifugação ou kits comercialmente disponíveis. Antes da ultrafiltração ou ultracentrifugação, o meio condicionado é libertado das células e restos de células, ao girar o meio a 300 g durante 5 minutos. O sobrenadante é subsequentemente girado a 1.500 g durante 15 minutos e passado por um filtro de 0,2 micrómetros. O meio condicionado é, assim, libertado de vesículas e agregados ao longo de 200 nanómetros em tamanho. A filtração de 0,2 micrómetros pode ser alterada para uma rotação de 15.000 g durante 30 minutos. O meio condicionado é concentrado por ultrafiltração ou fluxo tangencial. O limite de MWCO está em ambos os métodos utilizados e é 100 kDa. O meio concentrado é adicionalmente purificado por LC ou HPLC, com a utilização de uma coluna adequada, tal como uma Sephacryl S-300. A primeira fração da LC/HPLC contém os exossomas. O meio concentrado é girado por ultracentrifugação a 110.000 g durante 70 minutos, o sobrenadante é descartado e o pélete é ressuspenso em PBS e, uma vez mais, centrifugado a 110.000 g durante 70 minutos. O sobrenadante é descartado e o pélete é ressuspenso em PBS. Para purificar adicionalmente os exossomas, a segunda etapa do processo de purificação pode ser feita com uma almofada de sacarose de 30%. A almofada aprisiona os exossomas. Os exossomas são eluídos a partir da almofada de sacarose por outra etapa de centrifugação em PBS a llO.OOOg durante 70 minutos e, depois, o pélete é ressuspenso em PBS. A amostra de exossoma pode ser analisada pelo método de Western Blot, ELISA, NTA e microscopia eletrónica. A quantidade de recetores armadilha em cada amostra pode ser determinada por ELISA em relação a um polipéptido de interesse. A dose dada é então calculada como quantidade de polipéptido dado a partir da concentração obtida a partir de ELISA.
Produção de vesícula artificial
Lipossomas, estrutura do tipo lípidos, lipidoides e outros tipos de vesículas de entrega com base em lípidos artificialmente produzidas podem também ser utilizados. Essas vesículas podem ser produzidas por técnicas conhecidas na arte e o constructo de polipéptido que compreende o polipéptido transportador e o recetor armadilha de polipéptido terapêutico pode ser carregado em vesículas com a utilização de tecnologia padrão, por exemplo, etiquetamento de lípidos, etc.
Validação de protocolo de purificação de UF-LC Cultura Celular
NSC-34, uma fusão de um neurónio motor enriqueceu células da medula espinhal de ratinho com neuroblastoma de ratinho, N2a, uma linha celular de neuroblastoma de ratinho, B16F10, uma linha celular de melanoma de ratinho e células de rins embrionários humanas (HEK293T) foram cultivadas a 37°C com 5% de CO2 num meio completo compreendido por meio de Eagle modificado com solução Dulbecco (DMEM, Invitrogen), suplementado com 10% de soro bovino fetal (FBS, Cellgro) e penicilina/estreptomicina (pen/estrep, 5.000 pg/mL, Cellgro) . Para o isolamento de exossoma, os meios foram mudados 24 horas, após a inoculação para um meio pré-giratório ou OptiMEM. O meio pré-giratório é DMEM suplementado com 10% de FBS que foi pré-girado a 120.000g durante 70 minutos, antes de constituir o meio desprovido de vesícula. Tanto o OptiMEM como o meio pré-giratório foram suplementados com pen/estrep. O meio condicionado foi então recolhido para isolamento do exossoma 48 horas após a incubação. Para experiências de grande escala, o meio concentrado recolhido a partir de múltiplos frascos foi agrupado antes do isolamento dos exossomas.
Transfeção de células HEK293T 6 milhões de células foram inoculadas um dia antes da transfeção, num prato de cultura de 15 cm com meio completo de DMEM. A transfecção de plasmídeo de CD63-EGFP foi feita com a utilização de polietilenoimina (PEI) a um rácio de 1:4 pDNA:PEI. Brevemente, 25 yg de plasmídeo e 100 yg de PEI foram diluídos em 500 yg de OptiMEM em tubos separados. Após 5 minutos de incubação a temperatura ambiente (RT), as soluções de pDNA e PEI foram combinadas e incubadas durante 30 minutos adicionais a RT para formar os complexos de DNA/PEI. Os complexos foram então adicionados gota a gota às células. Após 4 horas, o meio de crescimento das células que contém os complexos foi removido; as células foram lavadas com salina tamponada de fosfato (PBS) e OptiMEM fresco, a suplementação com antibióticos P/S foi adicionada às células. Após 48h de incubação, o meio concentrado foi recolhido para isolamento do exossoma.
Ultracentrifugação (UC) para isolamento de exossomas A isolação de exossomas por UC foi desempenhada conforme abaixo descrito. Brevemente, o protocolo 1 envolve duas rotações de velocidade inferior 300 g durante 5 minutos, seguido de 1.200g durante 10 minutos, para desfazer-se de restos de células e partículas maiores. O sobrenadante foi subsequentemente filtrado através de um filtro de seringa de 0. 22 pm, antes da etapa de ultracentrifugação final a 120.000g durante 70 minutos. O Protocolo 2 segue o protocolo 1, mas inclui uma lavagem com PBS adicional a 120.000g durante 70 minutos. Brevemente, o meio concentrado foi submetido a uma rotação inicial de velocidade inferior a 300g durante 5 minutos, seguido de uma rotação de 10.000 g durante 30 minutos. O sobrenadante foi então ultracentrifugado a 120.000 g durante 70 minutos. O protocolo 4 é semelhante ao protocolo 1, mas carece da etapa de filtração por seringa de 0,22 pm.
Ultra filtração (UF) para isolamento dos exossomas O protocolo de UF envolve as mesmas rotações iniciais de velocidade inferior, como aquela do protocolo de UC. Em vez de uma ultracentrifugação de alta velocidade na etapa final, os sobrenadantes de cultura de células foram girados num valor limite de 100-kDa com o filtro de rotação de Amicon Ultra-15 (Millipore), enquanto perfusados placentários foram girados num filtro de valor limite de 300-kDa (Vivaspin, Sartorius Stedim) a 3.500 g durante 15 minutos. PBS foi então adicionado aos filtros e girado para baixo para lavar as amostras.
Fracionamento por cromatografia líquida de amostras de UF (UF-LC) a partir de cultura de células
As amostras de UF, preparadas conforme acima descritas, foram carregadas para uma coluna da Sephacryl S-300 HR HiPrep 16/60, para amostras recolhidas a partir de um meio condicionado de OptiMEM e uma coluna S-500 HR 26/60 para amostras recolhidas a partir de um meio concentrado pré-girado (GE Healthcare), conectadas a um ÃKTA prime (GE healthcare) equipado com uma célula de fluxo UV. Cada fração individual foi recolhida, de acordo com a absorvância de UV. As frações recolhidas foram então concentradas com a utilização de um filtro de rotação da Amicon Ultra-15 com valor limite de 30-kDa (Millipore) para 300 a 400 pL e armazenadas a -80°C, até análise adicional.
Fração de cromatografia liquida de amostras UF (UF-LC) a partir de perfusões placentárias 1 mL da amostra de STBM por UF foi carregado numa coluna Sephacryl S-1000 XK16/70 (GE Healthcare), conectada ao coletor de fração (RediFrac, Pharmacia). Uma velocidade de bomba de 2 mL/minuto foi utilizada e 4 mL de frações foram recolhidos. As frações recolhidas foram então concentradas num filtro de rotação a 30-kDa (Vivaspin, Sartorius Stedim), diluídas para 300 a 400 pL e armazenadas a -80°C, até análise adicional. Método de western blotting O método de western blotting foi desempenhado com a utilização de uma célula Tetra da Βίο-Rad® Mini-PROTEAN® ou do sistema iBlot® (Invitrogen, Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante. Para fazer uma comparação cruzada dos rendimentos de exossomas, procedeu-se ao carregamento de volumes iguais do pélete de exossoma ressuspenso ou filtrado no gel.
Para o sistema de Bio-Rad, 15 pL de amostras de exossoma com 15 yL de 2X de tampão de amostra de Laemilli (Βίο-Rad) que continham 5% de β-mercaptoetanol foram misturados e aquecidos a 100°C durante 10 minutos. As amostras foram então carregadas em 1,5 mm, 10% de gel de SDS-poliacrilamida de Tris/Glicina e executadas a 170 V durante 60 a 70 minutos, num tampão de migração, até a parte frontal tingida alcançar o fundo do tanque. A proteínas no gel foram transferidas para uma membrana de fluorinato de polivinilidina (PVDF) (Millipore) a 100 V durante 60 a 70 minutos num tampão de transferência, que contém 20% de metanol. As membranas foram então incubadas num tampão de bloqueio (5% de leite sem gordura numa salina tamponada de Tris com 0,1% de Tween-20 (TBS-T), durante 60 minutos a temperatura ambiente (RT) com uma sacudidela suave.
Para o sistema de iBlot®, 30 pL de amostra foram misturados com um tampão de amostra que contém 0,5 M de ditiotreitol (DTT), 0,4 M de carbonato de sódio (Na2C03) , 8% de SDS e 10% de glicerol e aquecidos a 65 °C durante 5 minutos. As amostras foram então carregadas num gel de Bis-Tris 4 a 12% Gel da NuPAGE® Novex® e executadas a 12 0 V num tampão de migração, até a parte frontal tingida alcançar o fundo do gel. As proteínas no gel foram transferidas para uma membrana de nitrocelulose de iBlot (Invitrogen) durante 7 minutos, com o sistema de iBlot. As membranas foram manchadas com o fingimento de Ponceau S, que foi mais tarde lavado com PBS, antes do bloqueio com um tampão de bloqueio da Odyssey, durante 60 minutos a RT com uma sacudidela suave.
Após a etapa de bloqueio, a membrana foi incubada com uma solução de anticorpo primária recentemente preparada (anti-CD9, anti-PDC6l (Alix), anti-TsglOl e anti-calnexina; todos numa diluição de 1:1.000 da Abeam, Cambridge UK), durante a noite a 4°C ou2 horas a RT. As membranas foram lavadas três vexes, 10 minutos cada, com a utilização de um tampão de lavagem (TBS-T) com uma sacudidela vigorosa, antes da adição da solução de anticorpo secundária (IgG de anti-ratinho em DyLight-800 em diluição de 1:10.000 se detetado o Alix; IgG de anti-coelho em DyLight-800 em diluição de 1:10.000 para detetar CD9, TsglOl e Calnexina) e incubadas durante 1 hora arruela RT. Após a incubação do anticorpo secundário, as membranas foram lavadas três vezes, 10 minutos cada, e visualizadas pelo varrimento de ambos os canais de 700 e 800 nm no sistema de imagiologia de infravermelhos da LI-COR Odyssey CLx. Para a sondagem subsequente de outras proteínas na mesma membrana, a membrana foi lavada três vezes, 10 minutos cada, antes de reincubação com o próximo anticorpo primário.
Análise do rastreio de nanoparticulas
Para a determinação do tamanho de partículas, a análise do rastreio de nanoparticulas (NTA) foi desempenhada com um instrumento da NanoSight NS500, equipado com o software analítico de NTA 2.3. Para todos os nossos registos, utilizou-se um nível de câmara de 13 ou 15 e função automática para todas as configurações de pós-captura: desfocagem e tamanho de partícula mínimo esperado, exceto no limiar de deteção, em que foi regulada para 5. As amostras foram descongeladas em gelo e diluídas em PBS entre 1:500 a 1:20.000 para conseguir uma contagem de partículas entre 2 x 108 e 2 x 109 por mL. Assim que a diluição da amostra foi determinada, a amostra foi carregada na câmara de amostra e a focagem da câmara foi ajustada para fazer as partículas aparecerem como pontos acentuados de luz. Com a utilização da função de controlo de guião, foram registados 30 ou 60 segundos de vídeos para cada amostra; com a incorporação de uma amostra e, avanço e 5 segundos de atraso entre cada registo. Para exossomas positivos de GFP, foi utilizada a mesma configuração com uma pequena alteração, que foi a de que a amostra esteve sob fluxo constante na câmara de amostras, para não branquear o sinal de GFP. Essas medições foram então analisadas com a utilização de uma função de processos de lote e os resultados foram exportados para o Microsoft Excel, para uma análise adicional.
Quantificação de proteínas e RNA em exossomas
As quantidades de proteínas em exossomas foram quantificadas com a utilização de um kit de ensaio da microBCA (Thermo Scientific) e os níveis de RNA foram medidos com a utilização de um kit de ensaio de RNA da Quant-iT ™ RiboGreen® (Life Technologies), de acordo com as instruções do fabricante.
Microscopia eletrónica 5 pL de suspensão de exossoma foram diluídos em 1:1 com PBS e adicionados em grelhas de microscopia eletrónica revestidas por formvar-carbono, durante 20 minutos. A grelha foi submetida a blotting com um papel de filtro e 15 pL de 2% de acetato de uranilo (UA) foram adicionados à grelha, durante 1 minuto. Em seguida, o UA foi removido e 15 pL de água destilada foram adicionados durante 1 minuto. As gotículas de água foram então removidas e a grelha foi deixada a secar ao ar durante 15 minutos. As grelhas foram então visualizadas no microscópio eletrónico.
Microscopia por fluorescência
Os exossomas positivos de CD63-EGFP foram gerados conforme acima descrito. As partículas foram quantificadas por NTA e as amostras de UF-LC e UC foram diluídas para a mesma concentração de partículas/mL. Antes de quaisquer medições, os exossomas foram ressuspensos com uma agulha 27G. As amostras foram posicionadas numa lâmina de microscópio e cobertas com uma lamínula e a Microscopia analisada foi desempenhada com a utilização de um microscópio invertido da Olympus IX-81 (Olympus America, Center Valley PA, EUA) equipado com uma objetiva de 20X. A seguinte configuração de filtros de fluorescência (Chroma Technology Corp., Bellows Falls, VT, EUA) foi utilizada com o comprimento de onda centra e largura de banda dos filtros de emissão e excitação, conforme indicado: GFP (Ex. 470/40 nm; Em. 525/50 nm)
Cromatografia liquida-espetrometria de massa sequencial (LC-MS/MS) de exossomas
Os Exossomas a partir de UC e UF-LC foram concentrados por Speedvac e lisados com 1% de SDS, 25 mM de HEPES, 1 mM de DTT. Os lisados foram aquecidos a 95°C durante 5 minutos, seguido da sonicação durante 1 minuto e centrifugação a 14.000 g durante 15 minutos. O sobrenadante foi misturado com 1 mM de DTT, 8 M de ureia, 25 mM de HEPES, pH a 7, 6 e transferido para uma unidade filtragem de centrifugação com valor limite de 10-kDa (Pall, Nanosep®) e centrifugado a 14.000 g durante 15 minutos, seguido da adição de 8 M de tampão de ureia e centrifugação, novamente. As proteínas foram alquiladas por 50 mM de iodoacetamida (IAA) em 8 M de ureia, 25 mM de HEPES durante 10 minutos. As proteínas foram então centrifugadas a 14.000g durante 15 minutos, seguindo de mais 2 adições e centrifugações com 8 M de ureia, 25 mM de HEPES. Tripsina (Promega) em 250 mM de ureia e 50 mM de HEPES foi adicionada ao lisado de célula, num rácio de 1:50 tripsina:proteína e incubada durante a noite a 37°C. As unidades de filtro foram centrifugadas a 14.000 g durante 15 minutos, seguido de outra centrifugação com MQ e o fluxo saturado foi recolhido. Os péptidos foram limpos por um cartuxo da strata-XC (Phenomenex).
Antes da análise no Q Exactive (Thermo Fischer Scientific, San Jose, CA, EUA), os péptidos foram separados com a utilização de um sistema de nano-LC da Agilent 1200. As amostras foram aprisionadas num Zorbax 300SB-C18 e separadas numa coluna NTCC360/100-5-153 (Nikkyo Technos., Ltd) com a utilização de um gradiente de A (3% de ACN, 0,1% de FA) e B (95% de ACN, 0,1% de FA), que variou a partir de 7% a 40% de B em 240 minutos com um fluxo de 0,4 yL/minuto. O Q Exactive foi operado de uma maneira dependente de dados, que selecionou 5 precursores de topo para a fragmentação por HCD. O varrimento de inspeção foi desempenhado a uma resolução de 70.000 a partir de 300 a 1.700 m/z, com a utilização de uma massa de travamento com m/z de 445.120025, com um tempo de injeção máximo de 100 ms e alvo de 1 x 106 iões. Para a geração de espetros de fragmentação de HCD, um tempo de injeção máximo de iões de 500 ms e AGC de 1 x 105 foi utilizado, antes da fragmentação a 30% de energia de colisão normalizada, 17.500 de resolução. Os precursores foram isolados com uma largura de 2 m/z e colocados na lista de exclusão durante 70 segundos. Os estados de carga não atribuídos e únicos foram rejeitos a partir da seleção do precursor. A constatação do proteoma 1,3 com sequestro-percolação foi utilizada para a identificação da proteína. A tolerância de massa de precursor foi configurada para 10 ppm e para fragmentos foi de 0,02 Da. A metionina oxidada foi configurada como modificação dinâmica e a carbamidometilação como modificação estática. Os espetros foram compatíveis para uma base de dados do ensemble 72 de mus musculus e bos taurus e os resultados foram filtrados para 1% de FDR. A identificação em bos taurus foi considerada originar a partir de FBS e removida. A análise de enriquecimento do termo GO foi feita com a utilização de um Panther.
Biodistribuição de exossoma em ratinhos
Os sobrenadantes de células condicionadas foram filtrados através de um filtro de seringa de 0,22 ym e incubados com 1 μΜ DiR (iodeto de 1,1'- Dioctadecil-3,3,3' , 3' -Tetrametilindotricarbocianina) (Invitrogen) . O meio concentrado com DiR foi então ultracentrifugado a 110.000 g durante 70 minutos ou concentrado com um filtro de rotação de 100 kDa da Amicon Ultra (Millipore). O pélete de UC foi ressuspenso e girado outra vez em PBS para purificar DiR não ligado ou LC fracionado, conforme acima descrito. Os exossomas purificados foram quantificados com NTA e quantidades iguais de partículas a partir de ambas as preparações de UC e LC foram injetadas na veia da cauda de ratinhos Balb/c (n=5). 24 horas após a injeção, os órgãos foram recolhidos e submetidos a imagiologia no Espetro do Sistema de Imagiologia in vivo (IVIS) (Caliper). O IVIS foi configurado para registar a fluorescência durante 2 segundos (excitação 710, emissão 760) e os dados obtidos foram então analisados com o software de IVIS. Todas as experiências de animais foram aprovadas pelo The Swedish Local Board for Laboratory Animals. As experiências foram desempenhadas em conformidade com a permissão ética e concebidas para minimizar o sofrimento e dor dos animais.
Tratamento da colite com a utilização de exossomas que exibem CD63-STNFR1 sem sinalização 0 modelo de colite induzido por TNBS bem estudo em ratinhos foi utilizado, simulando a tempestade de citocina, a diarreia, diminuição de peso e inflamação do intestino vistos em pacientes de IBD. 24 ratinhos foram divididos em quatro grupos de tratamento com 6 ratinhos por grupo. Os ratinhos foram pré-sensibilizados ao aplicar 150 pL com uma solução de acetato-óleo de azeitona com 2% de TNBS na pele, 1 semana antes da indução de colite. A colite foi então induzida ao dar uma infusão retal de 100 pL de solução, que contém 1,5% de TNBS em 40% de etanol. Imediatamente após a indução de colite, 30 pg de exossomas em 200 pL foram administrados por via intravenosa na veia da cauda. Aos ratinhos foi dado exossomas de TNFR1-CD63 armadilha sem sinalização, exossomas não modificados, exossomas de TNFR1-CD63 com sinalização ou PBS como um tratamento de simulação, dependendo do grupo de tratamento atribuído. O peso corporal foi registado diariamente.
Conforme pode ser visto a partir da Figura 2, a administração de exossomas que compreendem o recetor armadilha, consoante a presente invenção, leva ao tratamento bem-sucedido de colite em ratinhos. Os exossomas armadilha sem sinalização tratam com sucesso a colite induzida dentre de poucos dias, com menos perda no peso corporal, enquanto os exossomas não modificados mostram um efeito moderado. De facto, os recetores armadilha com sinalização agravam a condição. Método de western blot de CD63-STNFR1 na superfície exossomal 0 método de western Blot foi realizado em relação à parte extracelular de TNFRl, para verificar a presença do constructo de polipéptido de CD63- sTNFRl em superfície exossomal. 0 peso molecular previsto para o constructo de CD63-TNFR1 é de 38,52 kDa, que podem ser vistos na proximidade da banda de referência de 37 kDa, ambos em amostra de lisado de célula e na amostra de exossoma. A proteína de fusão é carregada para os exossomas com grande eficiência, uma vez que a banda é tão forte na fração de exossoma (a banda com cerca de 15 kDa é uma banda não específica irrelevante).
Neutralização de toxicidade mediada por TNFa A atividade de neutralização de exossomas de CD63-TNFR1 sem sinal, exossomas de CD63-TNFR1 com sinal e exossomas a partir de células N2a contra o TNF-α humano foi medida na linha celular WEHI 164 de ratinho tratado com actinomicina D, conforme anteriormente descrito (Austgulen et al. , 1986; Khabar et al., 1995), de modo a verificar a afinidade de ligação para TNFa. Sucintamente, as células de WHEI 164 foram inoculadas em triplicado a 1 3 104 células/poço numa placa de 96 poços e cultivadas em meio de RPMI 1640 suplementado com 10% de (v/v) FBS durante 20 horas. Subsequentemente, exossomas diluídos em série (concentração final: 0,5 a 100 ug/mL) no meio que contém 2 yg/mL de actinomicina D foram adicionado à cultura de células em conjunto com 0,1 ng/mL de TNF-α humano. As células foram incubadas durante umas 20 horas adicionais, a uma temperatura de 37 graus centígrados e a viabilidade de células foi analisada com a utilização de um kit de Determinação de Crescimento Celular com base em MTT colorimétrico (Sigma, St. Louis, MO). O valor de ED50 foi calculado por análise de regressão não linear sigmoide de complexo com a utilização de um software de representação gráfica Sigma (Systat software, Inc. Richmond, CA).
Eficácia anti-tumoral de exossomas e lipossomas que exibem sindecano/CD63-sVEGFRl sem sinalização 30 ratinhos forma implantados com células de melanoma de lxlO6 B16/F10 no flanco, no dia zero. Os ratinhos foram então divididos em cinco grupos de tratamento, com 6 ratinhos por grupo. Após uma semana (dia 7), os ratinhos receberam injeções intravenosas de 30 yg de exossomas em 200 yL, que foram repetidas a cada dois dias, durante duas semanas. Aos ratinhos foram dados exossomas que compreendem sindecano-sVEGFRl, sem sinalização, exossomas de CD63-SVEGFR1 sem sinalização, exossomas não modificados e exossomas que compreendem CD63-SVEGFR1 com sinalização ou PBS como um tratamento de simulação, dependendo do grupo de tratamento atribuído. O volume do tumor foi medido a cada dois dias. A seta na Figura 4 indica o início do tratamento (dia 7) . Os ratinhos tratados com exossomas de sVEGFRl armadilha sem sinalização (sindecano-sVEGFRl EXO e CD63-SVEGFR1 EXO) exibiram a massa total tumoral mais baixa, após o tratamento. O tratamento com exossomas não modificados teve um efeito moderado no tamanho do tumor, enquanto o tratamento com exossomas que compreendem CD63-SVEGFR1 com sinalização resultou numa condição agravada, comparado com o grupo de controlo tratado por simulação.
As experiências acima foram também repetidas com lipossomas que compreendem o mesmo conjunto de recetores armadilha de polipéptido e resultados semelhantes foram obtidos.
Tratamento de ratinhos de MDX
As células de N2a foram inoculadas a 3 milhões por frasco de 150 cm2 e cultivadas em DMEM com 10% de FBS. Após 24 horas, as células foram transfetadas com PEI com plasmídeos que codificam a activina-sindecano sem sinalização ou activina-sinaptotagmina sem sinalização. 4 horas após a transfeção, o meio foi mudado para OptiMEM. 72 horas após a mudança de meio, os exossomas produzidos pelas células de N2a foram recolhidos por ultrafiltração e purificação de LC sequencial. Os exossomas foram utilizados imediatamente ou armazenados a -20°. Os ratinhos de MDX foram obtidos da Charles River com um peso de cerca de 18 a 19 gramas. Os ratinhos foram alocados em 4 grupos com 6 ratinhos em cada grupo. Os ratinhos receberam injeções de exossomas ou PBS duas vezes por semana, durante 12 semanas. O peso foi registado antes de cada injeção. A Figura 5 mostra uma eficácia de tratamento em ratinhos de MDX de exossomas que compreendem a activina do recetor de polipéptido armadilha terapêutico fundida ou com o sindecano de proteínas transportadoras (linha preta contínua) ou com sinaptotagmina (linha cinzenta de tracejado longo). O tratamento quinzenal com os exossomas de entrega terapêutica acima mencionados resultou num aumento de peso corporal consideravelmente maior do que o tratamento com exossomas não modificados e tratamento de simulação.
As experiências acima foram também repetidas com quilomícrons e resultados semelhantes foram obtidos.
Tratamento de neuro-inflamação
Num modelo in vivo de encefalomielite autoimune experimental (EAE), ratinhos tratados com exossomas armadilha (conforme acima descrito) exibiram um fenótipo de doença marcadamente melhorado, Figura X3. A EAE foi induzida por imunização de ratinhos com neuro-antigénio (proteína básica de mielina, MBP) e adjuvante de Freund completo (que contém tuberculose M.), seguido da injeção da toxina pertússis, para produzir uma EAE grave e fiável. A progressão da doença com sintomas clínicos foi registada diariamente a partir do início da doença (dia 12 a 28). Os sintomas foram pontuados com base na gravidade (0=ratinho normal; sem sinais explícitos da doença; l=cauda flácida ou fraqueza dos membros posteriores, mas não ambos; 2=cauda flácida ou fraqueza dos membros posteriores; 3=paralisia parcial dos membros posteriores; 4=paralisia completa dos membros posteriores; 5=estado moribundo; morte por EAE: sacrifício por razões humanas), que resultou numa pontuação clínica média utilizada para examinar o estado de doença. É notável que ratinhos com ou sem EAE induzida, tratados com exossomas derivados a partir de origem neural, resultaram em espasmos e morte subsequente, comparado com o tratamento de exossomas a partir de outras origens de células, em que esse fenómeno não esteve presente. A Figura 9 ilustra a eficácia dos seguintes exossomas de entrega: • Exossomas armadilha que compreendem IL6R +TNFR1
• Exossomas armadilha que compreendem IL6R • Exossomas armadilha que compreendem TNFRl
• Exossomas armadilha que compreendem IL-lpR • Exossomas não modificados • Controlo não tratado
Conforme pode ser visto a partir da Figura 9, os ratinhos com EAE tratados com exossomas armadilha que exibem recetores sem sinalização para IL6, IL-Ιβ e TNFa, exibem uma manifestação de doença muito moderada, comparado com o controlo tratado por simulação, enquanto ratinhos tratados com exossoma que contém o recetor de polipéptido terapêutico com sinalização (TNFRl com sinalização) exibiram uma doença pior.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110> Ei Andaloussi, Samir Nordin, Joel wiklander, Oscar Grinnemo, Karl-Henrik Simonson, Oscar Smith, Edvard <120> Vesículas de entrega terapêutica <130> PCT1 <160> 44 <170> Patentln versão 3.5
<210> 1 <211> 468 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 1
Met Leu Ala Val Gly Cys Ala Leu Leu Ala Ala Leu Leu Ala Ala Pro 15 10 15
Gly Ala Ala Leu Ala Pro Arg Arg cys Pro Ala Gin Glu val Ala Arg 20 25 30
Gly val Leu Thr ser Leu Pro Gly Asp ser val Thr Leu Thr cys Pro 35 40 45
Gly Val Glu Pro Glu Asp Asn Ala Thr val His Trp Val Leu Arg Lys 50 55 60
Pro Ala Ala Gly Ser His Pro Ser Arg Trp Ala Gly Met Gly Arg Arg 65 70 75 80
Leu Leu Leu Arg Ser val Gin Leu His Asp Ser Gly Asn Tyr Ser Cys 85 90 95
Tyr Arg Ala Gly Arg pro Ala Gly Thr val His Leu Leu Val Asp val 100 105 110
Pro Pro Glu Glu Pro Gin Leu Ser Cys Phe Arg Lys Ser Pro Leu Ser 115 120 125
Asn val val Cys Glu Trp Gly Pro Arg Ser Thr pro Ser Leu Thr Thr 130 135 140
Lys Ala val Leu Leu val Arg Lys Phe Gin Asn Ser Pro Ala Glu Asp 145 150 155 160
Phe Gin Glu Pro Cys Gin Tyr Ser Gin Glu Ser Gin Lys Phe Ser Cys 165 170 175
Gin Leu Ala Val Pro Glu Gly Asp Ser Ser phe Tyr lie val ser Met 180 185 190 cys val Ala ser ser val Gly Ser Lys Phe ser Lys Thr Gin Thr Phe 195 200 205
Gin Gly Cys Gly lie Leu Gin Pro Asp Pro Pro Ala Asn lie Thr Val 210 215 220
Thr Ala Val Ala Arg Asn Pro Arg Trp Leu Ser Val Thr Trp Gin Asp 225 230 235 240
Pro His Ser Trp Asn Ser Ser Phe Tyr Arg Leu Arg Phe Glu Leu Arg 245 250 255
Tyr Arg Ala Glu Arg Ser Lys Thr Phe Thr Thr Trp Met Val Lys Asp 260 265 270
Leu Gin His His Cys Val lie His Asp Ala Trp Ser Gly Leu Arg His 275 280 285 val val Gin Leu Arg Ala Gin Glu Glu Phe Gly Gin Gly Glu Trp ser 290 295 300
Glu Trp ser Pro Glu Ala Met Gly Thr Pro Trp Thr Glu Ser Arg Ser 305 310 315 320
Pro Pro Ala Glu Asn Glu val Ser Thr Pro Met Gin Ala Leu Thr Thr 325 330 335
Asn Lys Asp Asp Asp Asn lie Leu Phe Arg Asp ser Ala Asn Ala Thr 340 345 350
Ser Leu Pro Val Gin Asp Ser Ser Ser Val Pro Leu Pro Thr Phe Leu 355 360 365
Val Ala Gly Gly Ser Leu Ala Phe Gly Thr Leu Leu Cys lie Ala lie 370 375 380 val Leu Arg Phe Lys Lys Thr Trp Lys Leu Arg Ala Leu Lys Glu Gly 385 390 395 400
Lys Thr Ser Met His Pro Pro Tyr Ser Leu Gly Gin Leu val Pro Glu 405 410 415
Arg Pro Arg Pro Thr Pro val Leu val Pro Leu lie Ser Pro Pro val 420 425 430
Asp Ala Arg Asp Pro Arg Ser Pro TyrAsp He Ser Asn Thr Asp Tyr 450 455 460
Phe Phe Pro Arg 465
<210> 2 <211> 857 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 2
Met Leu Thr Leu Gin Thr Trp Leu val Gin Ala Leu Phe lie Phe Leu 15 10 15
Thr Thr Glu Ser Thr Gly Glu Leu Leu Asp Pro Cys Gly Tyr lie Ser 20 25 30
Pro Glu Ser Pro Val Val Gin Leu His Ser Asn Phe Thr Ala val Cys 35 40 45 val Leu Lys Glu Lys Cys Met Asp Tyr Phe His val Asn Ala Asn Tyr 50 55 60 lie Val Trp Lys Thr Asn His Phe Thr lie Pro Lys Glu Gin Tyr Thr 65 70 75 80 lie lie Asn Arg Thr Ala Ser Ser val Thr Phe Thr Asp lie Ala Ser 85 90 95
Leu Asn lie Gin Leu Thr Cys Asn lie Leu Thr Phe Gly Gin Leu Glu 100 105 110
Gin Asn Val Tyr Gly lie Thr lie lie Ser Gly Leu Pro Pro Glu Lys 115 120 125
Pro Lys Asn Leu Ser Cys lie Val Asn Glu Gly Lys Lys Met Arg Cys 130 135 140
Glu Trp Asp Gly Gly Arg Glu Thr His Leu Glu Thr Asn Phe Thr Leu 145 150 155 160
Lys Ser Glu Trp Ala Thr His Lys Phe Ala Asp cys Lys Ala Lys Arg 165 170 175
Asp Thr Pro Thr Ser Cys Thr Val Asp Tyr Ser Thr Val Tyr Phe Val 180 185 190
Asn lie Glu val Trp Val Glu Ala Glu Asn Ala Leu Gly Lys val Thr 195 200 205
Ser Asp His lie Asn Phe Asp Pro val Tyr Lys val Lys Pro Asn Pro 210 215 220
Pro His Asn Leu Ser val lie Asn ser Glu Glu Leu Ser ser lie Leu 225 230 235 240
Lys Leu Thr Trp Thr Asn Pro Ser lie Lys ser val lie lie Leu Lys 245 250 255
Tyr Asn lie Gin Tyr Arg Thr Lys Asp Ala ser Thr Trp ser Gin lie 260 265 270
Pro Pro Glu Asp Thr Ala ser Thr Arg Ser Ser Phe Thr Val Gin Asp 275 280 285
Leu Lys Pro Phe Thr Glu Tyr val Phe Arg lie Arg Cys Met Lys Glu 290 295 300
Asp Gly Lys Gly Tyr Trp Ser Asp Trp Ser Glu Glu Ala ser Gly lie 305 310 315 320
Thr Tyr Glu Asp Arg Pro ser Lys Ala Pro Ser Phe Trp Tyr Lys lie 325 330 335
Asp Pro Ser His Thr Gin Gly Tyr Arg Thr val Gin Leu val Trp Lys 340 345 350
Thr Leu Pro Pro Phe Glu Ala Asn Gly Lys lie Leu Asp Tyr Glu val 355 360 365
Thr Leu Thr Arg Trp Lys ser His Leu Gin Asn Tyr Thr val Asn Ala 370 375 380
Thr Lys Leu Thr val Asn Leu Thr Asn Asp Arg Tyr Leu Ala Thr Leu 385 390 395 400
Thr val Arg Asn Leu val Gly Lys Ser Asp Ala Ala val Leu Thr lie 405 410 415
Pro Ala Cys Asp Phe Gin Gly Asn Leu Ala Glu Ser Lys Cys Tyr Leu 420 425 430 lie Thr val Thr Pro Val Tyr Ala Asp Gly Pro Gly Ser Pro Glu Ser 435 440 445 lie Lys Ala Tyr Leu Lys Gin Ala Pro Pro Ser Lys Gly Pro Thr Val 450 455 460
Arg Thr Lys Lys Val Gly Lys Asn Glu Ala Val Leu Glu Trp Asp Gin 465 470 475 480 485 490 495
Tyr Arg Thr lie lie Gly Asn Glu Thr Ala val Asn val Asp Ser Ser 500 505 510
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Phe Thr Phe Thr Thr Pro Lys Phe Ala Gin Gly Glu lie Glu Ala lie 545 550 555 560 val val Pro val cys Leu Ala Phe Leu Leu Thr Thr Leu Leu Gly val 565 570 575
Leu Phe cys Phe Asn Lys Arg Asp Leu lie Lys Lys His lie Trp Pro 580 585 590
Asn val Pro Asp Pro Ser Lys ser His lie Ala Gin Trp ser Pro His 595 600 605
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Val Arg Leu Lys Gin Gin lie Ser Asp His lie ser Gin ser cys Gly 785 790 795 800
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Leu Trp Phe val Pro Ala Lys val Glu Asp Ser Gly His Tyr Tyr Cys 85 90 95 val val Arg Asn ser Ser Tyr Cys Leu Arg lie Lys lie Ser Ala Lys 100 105 110
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Tyr Lys Asp Cys Lys Pro Leu Leu Leu Asp Asn lie His Phe Ser Gly 165 170 175 val Lys Asp Arg Leu lie val Met Asn Val Ala Glu Lys His Arg Gly 180 185 190
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Gly Ser Gin lie Gin Leu lie cys Asn val Thr Gly Gin Leu ser Asp 245 250 255 lie Ala Tyr Trp Lys Trp Asn Gly ser val lie Asp Glu Asp Asp Pro 260 265 270
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His Met lie Gly lie cys val Thr Leu Thr val lie lie val Cys ser 340 345 350 val Phe lie Tyr Lys lie Phe Lys lie Asp lie val Leu Trp Tyr Arg 355 360 365
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<210> 4 <211> 660 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4
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Thr lie Phe Ala Ser Ala His Pro Glu Lys Leu Thr Leu Trp Ser Thr 420 425 430 val Leu ser Thr Tyr His Phe Gly Gly Asn Ala Ser Ala Ala Gly Thr 435 440 445 pro His His val Ser val Lys Asn His ser Leu Asp ser val ser val 450 455 460
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Thr Leu Phe val cys Lys Leu Ala cys lie Asn ser Asp Glu lie Gin 100 105 110 lie cys Gly Ala Glu lie Phe val Gly val Ala Pro Glu Gin pro Gin 115 120 125
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<210> 6 <211> 832 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 6
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<210> 7 <211> 502 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7
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<210> 8 <211> 707 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8
Met Pro val Pro Trp Phe Leu Leu Ser Leu Ala Leu Gly Arg ser Pro 15 10 15 val val Leu Ser Leu Glu Arg Leu val Gly Pro Gin Asp Ala Thr His 20 25 30
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Arg Gly Pro Gin Asp Asn Arg Ser Leu Cys Ala Leu Glu Pro Ser Gly 405 410 415
Cys Thr Ser Leu Pro Ser Lys Ala Ser Thr Arg Ala Ala Arg Leu Gly 420 425 430
Glu Tyr Leu Leu Gin Asp Leu Gin Ser Gly Gin Cys Leu Gin Leu Trp 435 440 445
Asp Asp Asp Leu Gly Ala Leu Trp Ala Cys Pro Met Asp Lys Tyr lie 450 455 460
His Lys Arg Trp Ala Leu val Trp Leu Ala Cys Leu Leu Phe Ala Ala 465 470 475 480
Ala Leu Ser Leu lie Leu Leu Leu Lys Lys Asp His Ala Lys Ala Ala 485 490 495
Ala Arg Gly Arg Ala Ala Leu Leu Leu Tyr Ser Ala Asp Asp Ser Gly 500 505 510
Phe Glu Arg Leu Val Gly Ala Leu Ala Ser Ala Leu Cys Gin Leu Pro 515 520 525
Leu Arg Val Ala Val Asp Leu Trp Ser Arg Arg Glu Leu Ser Ala Gin 530 535 540
Gly Pro val Ala Trp Phe His Ala Gin Arg Arg Gin Thr Leu Gin Glu 545 550 555 560
Gly Gly Val Val Val Leu Leu Phe Ser Pro Gly Ala Val Ala Leu Cys 565 570 575
Ser Glu Trp Leu Gin Asp Gly Val Ser Gly Pro Gly Ala His Gly Pro 580 585 590
His Asp Ala Phe Arg Ala ser Leu ser Cys val Leu Pro Asp Phe Leu 595 600 605
Gin Gly Arg Ala Pro Gly Ser Tyr Val Gly Ala Cys Phe Asp Arg Leu 610 615 620
Leu His Pro Asp Ala val Pro Ala Leu Phe Arg Thr Val Pro Val Phe 625 630 635 640
Thr Leu pro Ser Gin Leu Pro Asp Phe Leu Gly Ala Leu Gin Gin Pro 645 650 655
Arg Ala pro Arg Ser Gly Arg Leu Gin Glu Arg Ala Glu Gin Val ser 660 665 670
Arg Ala Leu Gin Pro Ala Leu Asp ser Tyr Phe His Pro Pro Gly Thr 675 680 685
Pro Ala Pro Gly Arg Gly val Gly Pro Gly Ala Gly Pro Gly Ala Gly 690 695 700
Asp Gly Thr 705
<210> 9 <211> 711 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9
Met Lys Ala Ala Ala Arg Pro Arg Leu Cys val Ala Asn Glu Gly val 15 10 15
Gly Pro Ala Ser Arg Asn ser Gly Leu Tyr Asn lie Thr Phe Lys Tyr 20 25 30
Asp Asn cys Thr Thr Tyr Leu Asn pro val Gly Lys His val lie Ala 35 40 45
Asp Ala Gin Asn lie Thr lie ser Gin Tyr Ala cys His Asp Gin val 50 55 60
Ala val Thr lie Leu Trp Ser Pro Gly Ala Leu Gly lie Glu Phe Leu 65 70 75 80
Lys Gly Phe Arg Val lie Leu Glu Glu Leu Lys Ser Glu Gly Arg Gin 85 90 95
Cys Gin Gin Leu lie Leu Lys Asp Pro Lys Gin Leu Asn Ser Ser Phe 100 105 110
Lys Arg Thr Gly Met Glu Ser Gin Pro Phe Leu Asn Met Lys Phe Glu 115 120 125
Thr Asp Tyr Phe val Lys val val Pro Phe Pro ser lie Lys Asn Glu 130 135 140
Ser Asn Tyr His Pro Phe Phe Phe Arg Thr Arg Ala Cys Asp Leu Leu 145 150 155 160
Leu Gin Pro Asp Asn Leu Ala Cys Lys Pro Phe Trp Lys Pro Arg Asn 165 170 175
Leu Asn lie ser Gin His Gly ser Asp Met Gin val ser Phe Asp His 180 185 190
Ala Pro His Asn Phe Gly Phe Arg Phe Phe Tyr Leu His Tyr Lys Leu 195 200 205
Lys His Glu Gly Pro Phe Lys Arg Lys Thr Cys Lys Gin Glu Gin Thr 210 215 220
Thr Glu Thr Thr Ser Cys Leu Leu Gin Asn Val Ser Pro Gly Asp Tyr 225 230 235 240 lie lie Glu Leu Val Asp Asp Thr Asn Thr Thr Arg Lys val Met His 245 250 255
Tyr Ala Leu Lys Pro val His Ser Pro Trp Ala Gly Pro lie Arg Ala 260 265 270
Val Ala lie Thr val Pro Leu val Val lie Ser Ala Phe Ala Thr Leu 275 280 285
Phe Thr val Met Cys Arg Lys Lys Gin Gin Glu Asn lie Tyr Ser His 290 295 300
Leu Asp Glu Glu Ser ser Glu ser ser Thr Tyr Thr Ala Ala Leu Pro 305 310 315 320
Arg Glu Arg Leu Arg Pro Arg Pro Lys val Phe Leu Cys Tyr ser Ser 325 330 335
Lys Asp Gly Gin Asn His Met Asn valval Gin cys Phe Ala Tyr Phe 340 345 350
Leu Gin Asp Phe cys Gly Cys Glu val Ala Leu Asp Leu Trp Glu Asp 355 360 365
Phe ser Leu Cys Arg Glu Gly Gin Arg Glu Trp Val lie Gin Lys lie 370 375 380
His Glu Ser Gin Phe lie lie val val cys ser Lys Gly Met Lys Tyr 385 390 395 400
Phe val Asp Lys Lys Asn Tyr Lys His Lys Gly Gly Gly Arg Gly Ser 405 410 415
Gly Lys Gly Glu Leu Phe Leu Val Ala Val Ser Ala lie Ala Glu Lys 420 425 430
Leu Arg Gin Ala Lys Gin Ser ser ser Ala Ala Leu Ser Lys Phe lie 435 440 445
Ala val Tyr Phe Asp Tyr Ser Cys Glu Gly Asp val Pro Gly lie Leu 450 455 460
Asp Leu Ser Thr Lys Tyr Arg Leu Met Asp Asn Leu Pro Gin Leu cys 465 470 475 480
Ser His Leu His Ser Arg Asp His Gly Leu Gin Glu Pro Gly Gin His 485 490 495
Thr Arg Gin Gly ser Arg Arg Asn Tyr Phe Arg Ser Lys Ser Gly Arg 500 505 510
Ser Leu Tyr Val Ala lie Cys Asn Met His Gin Phe lie Asp Glu Glu 515 520 525
Pro Asp Trp Phe Glu Lys Gin Phe val Pro Phe His Pro Pro Pro Leu 530 535 540
Arg Tyr Arg Glu Pro val Leu Glu Lys Phe Asp Ser Gly Leu Val Leu 545 550 555 560
Asn Asp Val Met Cys Lys Pro Gly Pro Glu Ser Asp Phe Cys Leu Lys 565 570 575 val Glu Ala Ala val Leu Gly Ala Thr Gly Pro Ala Asp ser Gin His 580 585 590
Glu ser Gin His Gly Gly Leu Asp Gin Asp Gly Glu Ala Arg Pro Ala 595 600 605
Leu Asp Gly Ser Ala Ala Leu Gin Pro Leu Leu His Thr Val Lys Ala 610 615 620
Gly Ser Pro ser Asp Met Pro Arg Asp Ser Gly lie Tyr Asp ser ser 625 630 635 640 val Pro ser ser Glu Leu ser Leu Pro Leu Met Glu Gly Leu ser Thr 645 650 655
Asp Gin Thr Glu Thr Ser Ser Leu Thr Glu Ser Val Ser Ser Ser Ser 660 665 670
Gly Leu Gly Glu Glu Glu Pro Pro Ala Leu Pro Ser Lys Leu Leu Ser 675 680 685
Ser Gly Ser Cys Lys Ala Asp Leu Gly Cys Arg ser Tyr Thr Asp Glu 690 695 700
Leu His Ala val Ala Pro Leu 705 710
<210> 10 <211> 667 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 10
Met Gly ser ser Arg Leu Ala Ala Leu Leu Leu Pro Leu Leu Leu lie 15 10 15 val lie Asp Leu ser Asp Ser Ala Gly lie Gly Phe Arg His Leu Pro 20 25 30
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Thr Gly Ser ser Ala Tyr lie Pro Cys Arg Thr Trp Trp Ala Leu Phe 50 55 60
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Cys Gin His Leu Leu Ser Gly Gly Ser Gly Leu Gin Arg Gly Leu Phe 85 90 95
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Arg His Leu Ser Glu Lys Ser His His lie Ser lie Pro Ser Pro Asp 130 135 140 lie Ser His Lys Gly Leu Arg ser Lys Arg Thr Gin Pro Ser Asp Pro 145 150 155 160
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Thr lie Ser Ser Gly Pro Glu val Ser Val Arg Leu Cys His Gin Trp 195 200 205
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Thr Phe Ser Ala Ala Trp ser Leu Pro Gly Leu Gly Gin Asp Thr Leu 385 390 395 400 405 410 415
Ser Leu Asp Leu lie lie Pro Phe Leu Arg Pro Gly Cys Cys Val Leu 420 425 430 val Trp Arg Ser Asp val Gin Phe Ala Trp Lys His Leu Leu cys Pro 435 440 445
Asp Val Ser Tyr Arg His Leu Gly Leu Leu lie Leu Ala Leu Leu Ala 450 455 460
Leu Leu Thr Leu Leu Gly Val Val Leu Ala Leu Thr Cys Arg Arg Pro 465 470 475 480
Gin Ser Gly Pro Gly Pro Ala Arg Pro val Leu Leu Leu His Ala Ala 485 490 495
Asp Ser Glu Ala Gin Arg Arg Leu val Gly Ala Leu Ala Glu Leu Leu 500 505 510
Arg Ala Ala Leu Gly Gly Gly Arg Asp val lie val Asp Leu Trp Glu 515 520 525
Gly Arg His Val Ala Arg Val Gly Pro Leu Pro Trp Leu Trp Ala Ala 530 535 540
Arg Thr Arg Val Ala Arg Glu Gin Gly Thr val Leu Leu Leu Trp ser 545 550 555 560
Gly Ala Asp Leu Arg Pro val ser Gly Pro Asp Pro Arg Ala Ala Pro 565 570 575
Leu Leu Ala Leu Leu His Ala Ala Pro Arg Pro Leu Leu Leu Leu Ala 580 585 590
Tyr Phe Ser Arg Leu Cys Ala Lys Gly Asp lie Pro Pro Pro Leu Arg 595 600 605
Ala Leu Pro Arg Tyr Arg Leu Leu Arg Asp Leu Pro Arg Leu Leu Arg 610 615 620
Ala Leu Asp Ala Arg Pro Phe Ala Glu Ala Thr Ser Trp Gly Arg Leu 625 630 635 640
Gly Ala Arg Gin Arg Arg Gin Ser Arg Leu Glu Leu Cys Ser Arg Leu 645 650 655
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<210> 11 <211> 629 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 11
Met Asn Gin val Thr lie Gin Trp Asp Ala val lie Ala Leu Tyr lie 15 10 15
Leu Phe ser Trp Cys His Gly Gly lie Thr Asn lie Asn Cys Ser Gly 20 25 30
His lie Trp val Glu Pro Ala Thr lie Phe Lys Met Gly Met Asn lie 35 40 45
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Leu lie Cys Gly Lys Asp lie ser ser Gly Tyr Pro Pro Asp lie Pro 115 120 125
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Gin Leu Gin lie His Leu Asp Asp lie val lie Pro Ser Ala Ala Val 210 215 220 lie ser Arg Ala Glu Thr lie Asn Ala Thr val Pro Lys Thr lie lie 225 230 235 240
Tyr Trp Asp ser Gin Thr Thr lie Glu Lys val ser Cys Glu Met Arg 245 250 255
Tyr Lys Ala Thr Thr Asn Gin Thr Trp Asn val Lys Glu Phe Asp Thr 260 265 270
Asn Phe Thr Tyr val Gin Gin Ser Glu Phe Tyr Leu Glu Pro Asn lie 275 280 285
Lys Tyr val Phe Gin Val Arg Cys Gin Glu Thr Gly Lys Arg Tyr Trp 290 295 300
Gin Pro Trp Ser Ser Leu Phe Phe His Lys Thr Pro Glu Thr Val Pro 305 310 315 320
Gin Val Thr Ser Lys Ala Phe Gin His Asp Thr Trp Asn ser Gly Leu 325 330 335
Thr val Ala Ser lie Ser Thr Gly His Leu Thr ser Asp Asn Arg Gly 340 345 350
Asp lie Gly Leu Leu Leu Gly Met lie val Phe Ala val Met Leu Ser 355 360 365 lie Leu Ser Leu lie Gly lie Phe Asn Arg ser Phe Arg Thr Gly lie 370 375 380
Lys Arg Arg lie Leu Leu Leu lie Pro Lys Trp Leu Tyr Glu Asp lie 385 390 395 400
Pro Asn Met Lys Asn ser Asn Val val Lys Met Leu Gin Glu Asn Ser 405 410 415
Glu Leu Met Asn Asn Asn Ser Ser Glu Gin Val Leu Tyr val Asp Pro 420 425 430
Met lie Thr Glu lie Lys Glu lie Phe lie Pro Glu His Lys Pro Thr 435 440 445
Asp Tyr Lys Lys Glu Asn Thr Gly Pro Leu Glu Thr Arg Asp Tyr pro 450 455 460
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Asn Thr Gly Tyr Lys Pro Gin lie ser Asn Phe Leu Pro Glu Gly Ser 485 490 495
His Leu Ser Asn Asn Asn Glu lie Thr Ser Leu Thr Leu Lys Pro Pro 500 505 510
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Asn Phe Ala Phe ser vai ser Ser vai Asn Ser Leu Ser Asn Thr lie 530 535 540
Phe Leu Gly Glu Leu Ser Leu Ile Leu Asn Gin Gly Glu Cys Ser Ser 545 550 555 560
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Asn Asp Ser Pro Ser Glu Thr lie Pro Glu Gin Thr Leu Leu Pro Asp 580 585 590
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Asn Thr Tyr Phe Pro Gin Asn Ile Leu Glu ser His Phe Asn Arg Ile 610 615 620
Ser Leu Leu Glu Lys 625
<210> 12 <211> 228 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 12
Met Pro val Lys Gly Gly Thr Lys Cys lie Lys Tyr Leu Leu Phe Gly 15 10 15
Phe Asn Phe lie Phe Trp Leu Ala Gly lie Ala val Leu Ala lie Gly 20 25 30
Leu Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gin Thr Lys Ser lie Phe Glu Gin Glu 35 40 45
Thr Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr lie Leu lie 50 55 60
Gly Ala Gly Ala Leu Met Met Leu val Gly Phe Leu Gly Cys cys Gly 65 70 75 80
Ala val Gin Glu ser Gin cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu 85 90 95
Leu val lie Phe Ala lie Glu lie Ala Ala Ala lie Trp Gly Tyr ser 100 105 110
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Ala lie His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu 145 150 155 160
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Phe Gly Met lie Phe ser Met lie Leu cys cys Ala lie Arg Arg Asn 210 215 220
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<211> 236 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 13
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Phe Asn Phe val Phe Trp Leu Ala Gly Gly val lie Leu Gly val Ala 20 25 50
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Leu Gly Asp Lys Pro Ala Pro Asn Thr Phe Tyr val Gly lie Tyr lie 50 55 60
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Phe val Asn Lys Asp Gin lie Ala Lys Asp val Lys Gin Phe Tyr Asp 115 120 125
Gin Ala Leu Gin Gin Ala val val Asp Asp Asp Ala Asn Asn Ala Lys 130 135 140
Ala val val Lys Thr Phe His Glu Thr Leu Asp Cys Cys Gly Ser Ser 145 150 155 160
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Ser Gly Ser Asn lie lie ser Asn Leu Phe Lys Glu Asp Cys His Gin 180 185 190
Lys lie Asp Asp Leu Phe ser Gly Lys Leu Tyr Leu lie Gly lie Ala 195 200 205
Ala lie Val Val Ala Val lie Met lie Phe Glu Met lie Leu Ser Met 210 215 220 val Leu Cys cys Gly lie Arg Asn ser ser val Tyr 225 230 235
<210> 14 <211> 238 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 14
Met Ala val Glu Gly Gly Met Lys Cys val Lys Phe Leu Leu Tyr val 15 10 15
Leu Leu Leu Ala Phe cys Ala Cys Ala val Gly Leu lie Ala val Gly 20 25 30 val Gly Ala Gin Leu val Leu ser Gin Thr lie lie Gin Gly Ala Thr 35 40 45
Pro Gly Ser Leu Leu Pro Val Val lie lie Ala Val Gly Val Phe Leu 50 55 60
Phe Leu Val Ala Phe Val Gly Cys Cys Gly Ala Cys Lys Glu Asn Tyr 65 70 75 80
Cys Leu Met lie Thr Phe Ala lie Phe Leu ser Leu lie Met Leu val 85 90 95
Glu val Ala Ala Ala lie Ala Gly Tyr val Phe Arg Asp Lys Val Met 100 105 110
Ser Glu Phe Asn Asn Asn Phe Arg Gin Gin Met Glu Asn Tyr Pro Lys 115 120 125
Asn Asn His Thr Ala Ser lie Leu Asp Arg Met Gin Ala Asp Phe Lys 130 135 140
Cys Cys Gly Ala Ala Asn Tyr Thr Asp Trp Glu Lys lie Pro Ser Met 145 150 155 160
Ser Lys Asn Arg val pro Asp ser Cys Cys lie Asn val Thr val Gly 165 170 175
Cys Gly lie Asn Phe Asn Glu Lys Ala lie His Lys Glu Gly cys val 180 185 190
Glu Lys lie Gly Gly Trp Leu Arg Lys Asn Val Leu Val Val Ala Ala 195 200 205
Ala Ala Leu Gly lie Ala Phe val Glu val Leu Gly lie val Phe Ala 210 215 220
Cys Cys Leu Val Lys Ser lie Arg Ser Gly Tyr Glu Val Met 225 230 235
<210> 15 <211> 1106 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 15
Met Arg Leu Pro Gly Ala Met Pro Ala Leu Ala Leu Lys Gly Glu Leu 15 10 15
Leu Leu Leu Ser Leu Leu Leu Leu Leu Glu Pro Gin lie ser Gin Gly 20 25 30
Leu val val Thr Pro pro Gly Pro Glu Leu val Leu Asn val Ser ser 35 40 45
Thr Phe val Leu Thr cys Ser Gly ser Ala Pro val val Trp Glu Arg 50 55 60
Met Ser Gin Glu Pro Pro Gin Glu Met Ala Lys Ala Gin Asp Gly Thr 65 70 75 80
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Arg sly phe ser Gly lie Phe Glu Asp Arg Ser Tyr lie Cys Lys Thr 180 185 ISO
Thr lie Gly Asp Arg Glu val Asp Ser Asp Ala Tyr Tyr val Tyr Arg 19s 200 205
Leu Gin Val Ser Ser lie Asn Val Ser Val Asp Ala Val Gin Thr Val 210 215 220
Val Arg Gin Gly Glu Asrs lie Thr Leu Met Cys lie Val lie Gly Asn 225 230 235 240
Glu val val asp Phe Glu xrp Thr Tyr Pro Arg Lys Glu ser Gly Arg 245 25Õ 255
Leu val Glu Pro val Thr Asp Phe Leu Leu Asp Met Pro Tyr His lie 260 265 270
Arg ser lie Leu His lie Pro Ser Ala Glu Leu Glu Asp Ser Gly Thr 275 2S0 285
Tyr Thr cys Asn val Thr Glu Ser val Asn Asp His Gin Asp Glu Lys 290 295 300
Ala lie A$A lie Thr val val Glu Ser Gly Tyr val Arg Leu Leu Gly 305 310 315 320
Glu val Gly Thr Leu Gin Phe Ala Glu Leu His Arg Ser Arg Thr Leu 325 330 335
Gin val val Phe Glu Ala Tyr Pro Pro Pro Thr val Leu Trp Phe Lys 340 345 350
Asp Asn Arg Thr Leu Gly Asp Ser Ser Ala Gly Glu lie Ala Leu Ser 355 360 365
Thr Arg Asn val ser Glu Thr Arg Tyr val ser Glu Leu Thr Leu val 370 375 380
Arg val Lys Val Ala Glu Ala Gly His Tyr Thr Met Arg Ala Phe His 385 390 395 400
Glu Asp Ala Glu val Gin Leu ser Phe Gin Leu Gin lie Asn val Pro 405 410 415 vai Arg Vai Leu Glu Leu Ser Glu Ser His Pro Asp Ser Gly Glu Gin 420 425 430
Thr Vai Arg Cys Arg Gly Arg Gly Met Pro Gin Pro Asn lie lie Trp 435 440 445
Ser Ala Cys Arg Asp Leu Lys Arg Cys Pro Arg Glu Leu Pro Pro Thr 450 455 460
Leu Leu Gly Asn Ser Ser Glu Glu Glu Ser Gin Leu Glu Thr Asn val 465 470 475 480
Thr Tyr Trp Glu Glu Glu Gin Glu Phe Glu val Val Ser Thr Leu Arg 485 490 495
Leu Gin His Val Asp Arg Pro Leu Ser Val Arg Cys Thr Leu Arg Asn 500 505 510
Ala Val Gly Gin Asp Thr Gin Glu Val lie Val Val Pro His Ser Leu 515 520 525
Pro Phe Lys Val val Val lie Ser Ala lie Leu Ala Leu Val Val Leu 530 535 540
Thr lie lie ser Leu lie lie Leu lie Met Leu Trp Gin Lys Lys Pro 545 550 555 560
Arg Tyr Glu lie Arg Trp Lys val lie Glu ser val Ser ser Asp Gly 565 570 575
His Glu Tyr lie Tyr val Asp Pro Met Gin Leu Pro Tyr Asp Ser Thr 580 585 590
Trp Glu Leu Pro Arg Asp Gin Leu Val Leu Gly Arg Thr Leu Gly Ser 595 600 605
Gly Ala Phe Gly Gin Val Val Glu Ala Thr Ala His Gly Leu Ser His 610 615 620
Ser Gin Ala Thr Met Lys val Ala val Lys Met Leu Lys ser Thr Ala 625 630 635 640
Arg Ser Ser Glu Lys Gin Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys lie Met Ser 645 650 655
His Leu Gly Pro His Leu Asn val val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr 660 665 670
Lys Gly Gly Pro lie Tyr lie lie Thr Glu Tyr cys Arg Tyr Gly Asp 675 680 685
Leu val Asp Tyr Leu His Arg Asn Lys His Thr Phe Leu Gin His His 690 695 700
Ser Asp Lys Arg Arg Pro Pro Ser Ala Glu Leu Tyr ser Asn Ala Leu 705 710 715 720
Pro val Gly Leu Pro Leu Pro ser His val ser Leu Thr Gly Glu ser 725 730 735
Asp Gly Gly Tyr Met Asp Met Ser Lys Asp Glu Ser Val Asp Tyr Val 740 745 750
Pro Met Leu Asp Met Lys Gly Asp val Lys Tyr Ala Asp lie Glu Ser 755 760 765
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Arg Thr Cys Arg Ala Thr Leu lie Asn Glu Ser pro Val Leu Ser Tyr 785 790 795 800
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Leu lie Cys Glu Gly Lys Leu val Lys lie Cys Asp Phe Gly Leu Ala 835 840 845
Arg Asp lie Met Arg Asp Ser Asn Tyr lie Ser Lys Gly Ser Thr Phe 850 855 860
Leu Pro Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Ser lie Phe Asn Ser Leu Tyr 865 870 875 880
Thr Thr Leu Ser Asp val Trp Ser Phe Gly lie Leu Leu Trp Glu lie 885 890 895
Phe Thr Leu Gly Gly Thr Pro Tyr Pro Glu Leu Pro Met Asn Glu Gin 900 905 910
Phe Tyr Asn Ala lie Lys Arg Gly Tyr Arg Met Ala Gin Pro Ala His 915 920 925
Ala ser Asp Glu lie Tyr Glu lie Met Gin Lys Cys Trp Glu Glu Lys 930 935 940
Phe Glu lie Arg Pro Pro Phe Ser Gin Leu val Leu Leu Leu Glu Arg 945 950 955 960
Leu Leu Gly Glu Gly Tyr Lys Lys Lys Tyr Gin Gin val Asp Glu Glu 965 970 975 phe Leu Arg Ser Asp His Pro Ala lie Leu Arg Ser Gin Ala Arg Leu 980 985 990
Pro Gly Phe His Gly Leu Arg ser Pro Leu Asp Thr ser ser val Leu 995 1000 1005
Tyr Thr Ala Val Gin Pro Asn Glu Gly Asp Asn Asp Tyr lie lie 1010 1015 1020
Pro Leu Pro Asp Pro Lys Pro Glu val Ala Asp Glu Gly Pro Leu 1025 1030 1035
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Thr Ser Ser Thr lie Ser Cys Asp Ser Pro Leu Glu Pro Gin Asp 1055 1060 1065
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<212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 16
Met Gly Thr ser His Pro Ala Phe Leu val Leu Gly Cys Leu Leu Thr 15 10 15
Gly Leu Ser Leu lie Leu Cys Gin Leu ser Leu Pro Ser lie Leu pro 20 25 30
Asn Glu Asn Glu Lys val val Gin Leu Asn ser ser Phe ser Leu Arg 35 40 45
Cys Phe Gly Glu ser Glu val ser Trp Gin Tyr Pro Met ser Glu Glu 50 55 60
Glu Ser ser Asp val Glu lie Arg Asn Glu Glu Asn Asn ser Gly Leu 65 70 75 80
Phe vai Thr vai Leu Glu vai Ser ser Ala ser Ala Ala His Thr Gly 85 90 95
Leu Tyr Thr cys Tyr Tyr Asn His Thr Gin Thr Glu Glu Asn Glu Leu 100 105 110
Glu Gly Arg His lie Tyr lie Tyr Vai Pro Asp Pro Asp Vai Ala Phe 115 120 125 val Pro Leu Gly Met Thr Asp Tyr Leu val lie val Glu Asp Asp Asp 130 135 140 ser Ala lie lie Pro Cys Arg Thr Thr Asp Pro Glu Thr Pro val Thr 145 150 155 160
Leu His Asn Ser Glu Gly Val val Pro Ala Ser Tyr Asp Ser Arg Gin 165 170 175
Gly Phe Asn Gly Thr Phe Thr val Gly Pro Tyr lie Cys Glu Ala Thr 180 185 190 val Lys Gly Lys Lys Phe Gin Thr lie Pro Phe Asn val Tyr Ala Leu 195 200 205
Lys Ala Thr ser Glu Leu Asp Leu Glu Met Glu Ala Leu Lys Thr val 210 215 220
Tyr Lys Ser Gly Glu Thr lie Val val Thr Cys Ala Val Phe Asn Asn 225 230 235 240
Glu val val Asp Leu Gin Trp Thr Tyr Pro Gly Glu val Lys Gly Lys 245 250 255
Gly lie Thr Met Leu Glu Glu lie Lys val Pro Ser lie Lys Leu Val 260 265 270
Tyr Thr Leu Thr Val Pro Glu Ala Thr Val Lys Asp Ser Gly Asp Tyr 275 280 285
Glu Cys Ala Ala Arg Gin Ala Thr Arg Glu Val Lys Glu Met Lys Lys 290 295 300 val Thr lie Ser Val His Glu Lys Gly Phe lie Glu lie Lys Pro Thr 305 310 315 320
Phe Ser Gin Leu Glu Ala val Asn Leu His Glu val Lys His Phe val 325 330 335 val Glu val Arg Ala Tyr Pro Pro Pro Arg lie ser Trp Leu Lys Asn 340 345 350
Asn Leu Thr Leu lie Glu Asn Leu Thr Glu ile Thr Thr Asp vai Glu 355 360 365
Lys lie Gin Glu lie Arg Tyr Arg ser Lys Leu Lys Leu lie Arg Ala 370 375 380
Lys Glu Glu Asp Ser Gly His Tyr Thr lie Vai Ala Gin Asn Glu Asp 385 390 395 400
Ala vai Lys Ser Tyr Thr Phe Glu Leu Leu Thr Gin vai Pro ser ser 405 410 415 lie Leu Asp Leu vai Asp Asp His His Gly ser Thr Gly Gly Gin Thr 420 425 430 vai Arg cys Thr Ala Glu Gly Thr Pro Leu Pro Asp lie Glu Trp Met 435 440 445 lie Cys Lys Asp lie Lys Lys Cys Asn Asn Glu Thr Ser Trp Thr lie 450 455 460
Leu Ala Asn Asn Vai Ser Asn lie lie Thr Glu Ile His Ser Arg Asp 465 470 475 480
Arg ser Thr vai Glu Gly Arg Vai Thr Phe Ala Lys vai Glu Glu Thr 485 490 495 lie Ala vai Arg cys Leu Ala Lys Asn Leu Leu Gly Ala Glu Asn Arg 500 505 510
Glu Leu Lys Leu vai Ala Pro Thr Leu Arg ser Glu Leu Thr vai Ala 515 520 525
Ala Ala vai Leu vai Leu Leu vai lie vai lie ile ser Leu ile vai 530 535 540
Leu Vai vai lie Trp Lys Gin Lys Pro Arg Tyr Glu Ile Arg Trp Arg 545 550 555 560 val ile Glu ser ile ser Pro Asp Gly His Glu Tyr lie Tyr vai Asp 565 570 575
Pro Met Gin Leu Pro Tyr Asp Ser Arg Trp Glu Phe Pro Arg Asp Gly 580 585 590
Leu val Leu Gly Arg val Leu Gly ser Gly Ala Phe Gly Lys val val 595 600 605
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Ala val Lys Met Leu Lys Pro Thr Ala Arg ser Ser Glu Lys Gin Ala 625 650 635 640
Leu Met Ser Glu Leu Lys lie Met Thr His Leu Gly Pro His Leu Asn 645 650 655 lie Val Asn Leu Leu Gly Ala Cys Thr Lys Ser Gly Pro lie Tyr lie 660 665 670 lie Thr Glu Tyr Cys Phe Tyr Gly Asp Leu Val Asn Tyr Leu His Lys 675 680 685
Asn Arg Asp Ser Phe Leu Ser His His Pro Glu Lys Pro Lys Lys Glu 690 695 700
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Val lie Leu Ser Phe Glu Asn Asn Gly Asp Tyr Met Asp Met Lys Gin 725 730 735
Ala Asp Thr Thr Gin Tyr val Pro Met Leu Glu Arg Lys Glu val ser 740 745 750
Lys Tyr ser Asp lie Gin Arg ser Leu Tyr Asp Arg Pro Ala Ser Tyr 755 760 765
Lys Lys Lys Ser Met Leu Asp ser Glu val Lys Asn Leu Leu ser Asp 770 775 780
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Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn Val Leu Leu Ala Gin Gly Lys lie Val 820 825 830
Lys lie cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp lie Met His Asp ser Asn 835 840 845
Tyr Val Ser Lys Gly Ser Thr Phe Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro 850 855 860
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His Leu Ser Glu lie Val Glu Asn Leu Leu Pro Gly Gin Tyr Lys Lys 945 950 955 960
Ser Tyr Glu Lys lie His Leu Asp Phe Leu Lys Ser Asp His Pro Ala 965 970 975 val Ala Arg Met Arg val Asp Ser Asp Asn Ala Tyr lie Gly val Thr 980 985 990
Tyr Lys Asn Glu Glu Asp Lys Leu Lys Asp Trp Glu Gly Gly Leu Asp 995 1000 1005
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<212> PRT <213> Homo sapiens <4 Ο 0> 17
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Arg Leu Ser lie Gin Lys Asp lie Leu Thr lie Lys Ala Asn Thr Thr 35 40 45
Leu Gin lie Thr Cys Arg Gly Gin Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro 50 55 60
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Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr lie Pro Lys val lie Gly Asn 85 90 95
Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala ser 100 105 110
Val lie Tyr val Tyr val Gin Asp Tyr Arg ser Pro Phe lie Ala Ser 115 120 125 val ser Asp Gin His Gly val val Tyr lie Thr Glu Asn Lys Asn Lys 130 135 140
Thr val val lie Pro cys Leu Gly ser lie ser Asn Leu Asn val ser 145 150 155 160
Leu cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe val Pro Asp Gly Asn Arg 165 170 175 lie Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr He Pro Ser Tyr Met lie 180 185 190
Ser Tyr Ala Gly Met val Phe Cys Glu Ala Lys lie Asn Asp Glu Ser 195 200 205
Tyr Gin Ser lie Met Tyr lie Val Val Val Val Gly Tyr Arg lie Tyr 210 215 220
Asp Val val Leu Ser Pro Ser His Gly lie Glu Leu Ser val Gly Glu 225 230 235 240
Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn val Gly lie 245 250 255
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Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gin Ser Gly ser Glu Met Lys Lys Phe 275 280 285
Leu Ser Thr Leu Thr lie Asp Gly Val Thr Arg ser Asp Gin Gly Leu 290 295 300
Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr 305 310 315 320
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Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg lie Pro Ala 340 345 350
Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu lie Lys Trp Tyr Lys Asn Gly 355 360 365 lie Pro Leu Glu ser Asn His Thr lie Lys Ala Gly His val Leu Thr 370 375 380 lie Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr val lie Leu 385 390 395 400
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Lys Cys Glu Ala val Asn Lys val Gly Arg Gly Glu Arg val lie Ser 530 535 540
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Leu lie Met Glu Leu Lys Asn Ala ser Leu Gin Asp Gin Gly Asp Tyr 625 650 635 640 val cys Leu Ala Gin Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His cys val val 645 650 655
Arg Gin Leu Thr val Leu Glu Arg val Ala Pro Thr lie Thr Gly Asn 660 665 670
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Asn Leu Thr lie Arg Arg val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr 725 730 735
Cys Gin Ala Cys Ser val Leu Gly Cys Ala Lys val Glu Ala Phe Phe 740 745 750 lie lie Glu Gly Ala Gin Glu Lys Thr Asn Leu Glu lie lie lie Leu 755 760 765 val Gly Thr Ala val lie Ala Met Phe Phe Trp Leu Leu Leu val lie 770 775 780 lie Leu Arg Thr val Lys Arg Ala Asn Gly Gly Glu Leu Lys Thr Gly 785 790 795 800
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Ala Leu Met Ser Glu Leu Lys lie Leu lie His lie Gly His His Leu 885 890 895
Asn val Val Asn Leu Leu Gly Ala cys Thr Lys Pro Gly Gly Pro Leu 900 905 910
Met val lie Val Glu Phe Cys Lys Phe Gly Asn Leu Ser Thr Tyr Leu 915 920 925
Arg Ser Lys Arg Asn Glu Phe val Pro Tyr Lys Thr Lys Gly Ala Arg 930 935 940
Phe Arg Gin Gly Lys Asp Tyr val Gly Ala lie Pro val Asp Leu Lys 945 950 955 960
Arg Arg Leu Asp Ser lie Thr ser Ser Gin ser Ser Ala Ser Ser Gly 965 970 975
Phe Val Glu Glu Lys Ser Leu Ser Asp Val Glu Glu Glu Glu Ala Pro 980 985 990
Glu Asp Leu Tyr Lys Asp Phe Leu Thr Leu Glu His Leu lie Cys Tyr 995 1000 1005 ser Phe Gin val Ala Lys Gly Met Glu Phe Leu Ala Ser Arg Lys 1010 1015 1020
Cys lie His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn lie Leu Leu Ser Glu 1025 1030 1035
Lys Asn Val val Lys lie Cys Asp Phe Gly Leu Ala Arg Asp lie 1040 1045 1050
Tyr Lys Asp Pro Asp Tyr val Arg Lys Gly Asp Ala Arg Leu Pro 1055 1060 1065
Leu Lys Trp Met Ala Pro Glu Thr lie Phe Asp Arg val Tyr Thr 1070 1075 1080 lie Gin ser Asp val Trp ser Phe Gly val Leu Leu Trp Glu lie 1085 1090 1095
Phe ser Leu Gly Ala ser Pro Tyr Pro Gly val Lys lie Asp Glu 1100 1105 1110
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Pro Pro val
<210> 18 <211> 1210 <212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 18
Met Arg Pro ser Gly Thr Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Leu Leu Ala 15 10 15
Ala Leu Cys Pro Ala Ser Arg Ala Leu Glu Glu Lys Lys Val Cys Gin 20 25 30
Gly Thr Ser Asn Lys Leu Thr Gin Leu Gly Thr Phe Glu Asp His Phe 35 40 45
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Thr lie Gin Glu val Ala Gly Tyr val Leu lie Ala Leu Asn Thr val 85 90 95
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Tyr Glu Asn ser Tyr Ala Leu Ala val Leu ser Asn Tyr Asp Ala Asn 115 120 125
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Lys Leu Thr Lys lie lie Cys Ala Gin Gin Cys Ser Gly Arg Cys Arg 210 215 220
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Cys Asn Gly lie Gly lie Gly Glu Phe Lys Asp ser Leu ser lie Asn 340 345 350
Ala Thr Asn lie Lys His Phe Lys Asn cys Thr ser lie ser Gly Asp 355 360 365
Leu His lie Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser Phe Thr His Thr 370 375 380
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His Gly Gin Phe Ser Leu Ala val val ser Leu Asn lie Thr ser Leu 435 440 445
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Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr lie Asn Trp Lys Lys Leu 465 470 475 480
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Leu Leu vai Vai Ala Leu Gly lie Gly Leu Phe Met Arg Arg Arg His 660 665 670 lie Vai Arg Lys Arg Thr Leu Arg Arg Leu Leu Gin Glu Arg Glu Leu 675 680 685 val Glu Pro Leu Thr Pro ser Gly Glu Ala Pro Asn Gin Ala Leu Leu 690 695 700
Arg lie Leu Lys Glu Thr Glu Phe Lys Lys lie Lys val Leu Gly ser 705 710 715 720
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Gly Leu Gin Ser cys Pro lie tys Glu Asp ser Phe Leu Gin Arg 1055 1060 1065
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<212> PRT <213> Homo sapiens <4 0 0> 19
Met lie Ala Ser Gin Phe Leu ser Ala Leu Thr Leu val Leu Leu lie 15 10 15
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Ser Gly Asn Trp Asp Asn Glu Lys Pro Thr Cys Lys Ala Val Thr Cys 290 295 300
Arg Ala val Arg Gin Pro Gin Asn Gly ser val Arg Cys ser His ser 305 310 315 320
Pro Ala Gly Glu Phe Thr Phe Lys ser ser Cys Asn Phe Thr cys Glu 325 330 335
Glu Gly Phe Met Leu Gin Gly Pro Ala Gin val Glu cys Thr Thr Gin 340 345 350
Gly Gin Trp Thr Gin Gin lie Pro val Cys Glu Ala Phe Gin cys Thr 355 360 365
Ala Leu Ser Asn Pro Glu Arg Gly Tyr Met Asn cys Leu Pro ser Ala 370 375 380
Ser Gly Ser Phe Arg Tyr Gly Ser Ser Cys Glu Phe Ser Cys Glu Gin 385 390 395 400
Gly Phe val Leu Lys Gly Ser Lys Arg Leu Gin cys Gly Pro Thr Gly 405 410 415
Glu Trp Asp Asn Glu Lys Pro Thr Cys Glu Ala Val Arg Cys Asp Ala 420 425 430 val His Gin Pro Pro Lys Gly Leu val Arg cys Ala His Ser Pro lie 435 440 445
Gly Glu Phe Thr Tyr Lys Ser Ser Cys Ala Phe Ser Cys Glu Glu Gly 450 455 460
Phe Glu Leu His Gly ser Thr Gin Leu Glu Cys Thr ser Gin Gly Gin 465 470 475 480
Trp Thr Glu Glu val Pro ser Cys Gin val val Lys Cys ser ser Leu 485 490 495
Ala val Pro Gly Lys lie Asn Met Ser Cys Ser Gly Glu Pro val Phe 500 505 510
Gly Thr val Cys Lys Phe Ala Cys Pro Glu Gly Trp Thr Leu Asn Gly 515 520 525
Ser Ala Ala Arg Thr Cys Gly Ala Thr Gly His Trp Ser Gly Leu Leu 530 535 540
Pro Thr Cys Glu Ala Pro Thr Glu Ser Asn lie Pro Leu Val Ala Gly 545 550 555 560
Leu Ser Ala Ala Gly Leu Ser Leu Leu Thr Leu Ala Pro Phe Leu Leu 565 570 575
Trp Leu Arg Lys Cys Leu Arg Lys Ala Lys Lys Phe Val Pro Ala Ser 580 585 590
Ser Cys Gin Ser Leu Glu Ser Asp Gly Ser Tyr Gin Lys Pro Ser Tyr 595 600 605 lie Leu 610
<210> 20 <211> 830 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20
Met Ala Asn cys Gin lie Ala lie Leu Tyr Gin Arg Phe Gin Arg val 15 10 15
Val Phe Gly lie Ser Gin Leu Leu Cys Phe Ser Ala Leu lie Ser Glu 20 25 30
Leu Thr Asn Gin Lys Glu Val Ala Ala Trp Thr Tyr His Tyr Ser Thr 35 40 45
Lys Ala Tyr ser Trp Asn lie ser Arg Lys Tyr cys Gin Asn Arg Tyr 50 55 60
Thr Asp Leu Val Ala lie Gin Asn Lys Asn Glu lie Asp Tyr Leu Asn 65 70 75 80
Lys val Leu Pro Tyr Tyr ser ser Tyr Tyr Trp lie Gly lie Arg Lys 85 90 95
Asn Asn Lys Thr Trp Thr Trp val Gly Thr Lys Lys Ala Leu Thr Asn 100 105 110
Glu Ala Glu Asn Trp Ala Asp Asn Glu Pro Asn Asn Lys Arg Asn Asn 115 120 125
Glu Asp Cys Val Glu lie Tyr lie Lys Ser Pro Ser Ala Pro Gly Lys 130 135 140
Trp Asn Asp Glu His Cys Leu Lys Lys Lys His Ala Leu Cys Tyr Thr 145 150 155 160
Ala Ser Cys Gin Asp Met Ser Cys Ser Lys Gin Gly Glu Cys Leu Glu 165 170 175
Thr lie Gly Asn Tyr Thr Cys Ser Cys Tyr Pro Gly Phe Tyr Gly Pro 180 185 190
Glu Cys Glu Tyr val Arg Glu Cys Gly Glu Leu Glu Leu Pro Gin His 195 200 205 val Leu Met Asn cys Ser His Pro Leu Gly Asn Phe ser Phe Asn ser 210 215 220
Gin Cys Ser phe His cys Thr Asp Gly Tyr Gin val Asn Gly Pro ser 225 230 235 240
Lys Leu Glu cys Leu Ala ser Gly lie Trp Thr Asn Lys Pro Pro Gin 245 250 255
Cys Leu Ala Ala Gin Cys Pro Pro Leu Lys lie Pro Glu Arg Gly Asn 260 265 270
Met Thr Cys Leu His Ser Ala Lys Ala Phe Gin His Gin ser Ser Cys 275 280 285
Ser phe Ser Cys Glu Glu Gly Phe Ala Leu Val Gly Pro Glu Val val 290 295 300
Gin Cys Thr Ala Ser Gly Val Trp Thr Ala Pro Ala Pro Val Cys Lys 305 310 315 320
Ala val Gin cys Gin His Leu Glu Ala Pro ser Glu Gly Thr Met Asp 325 330 335
Cys Val His Pro Leu Thr Ala Phe Ala Tyr Gly Ser Ser Cys Lys Phe 340 345 350
Glu cys Gin Pro Gly Tyr Arg val Arg Gly Leu Asp Met Leu Arg Cys 355 360 365 lie Asp Ser Gly His Trp ser Ala Pro Leu Pro Thr cys Glu Ala lie 370 375 380
Ser cys Glu Pro Leu Glu ser Pro val His Gly ser Met Asp Cys Ser 385 390 395 400
Pro ser Leu Arg Ala Phe Gin Tyr Asp Thr Asn Cys Ser Phe Arg Cys 405 410 415
Ala Glu Gly Phe Met Leu Arg Gly Ala Asp lie val Arg cys Asp Asn 420 425 430
Leu Gly Gin Trp Thr Ala Pro Ala Pro Val Cys Gin Ala Leu Gin Cys 435 440 445
Gin Asp Leu Pro Val Pro Asn Glu Ala Arg Val Asn Cys Ser His Pro 450 455 460
Phe Gly Ala Phe Arg Tyr Gin Ser Val Cys Ser Phe Thr Cys Asn Glu 465 470 475 480
Gly Leu Leu Leu val Gly Ala Ser Val Leu Gin Cys Leu Ala Thr Gly 485 490 495
Asn Trp Asn ser val Pro Pro Glu cys Gin Ala lie Pro cys Thr Pro 500 505 510
Leu Leu Ser Pro Gin Asn Gly Thr Met Thr cys val Gin Pro Leu Gly 515 520 525
Ser Ser Ser Tyr Lys Ser Thr Cys Gin Phe lie Cys Asp Glu Gly Tyr 530 535 540
Ser Leu Ser Gly Pro Glu Arg Leu Asp Cys Thr Arg Ser Gly Arg Trp 545 550 555 560
Thr Asp Ser Pro Pro Met Cys Glu Ala lie Lys Cys Pro Glu Leu Phe 565 570 575
Ala Pro Glu Gin Gly Ser Leu Asp Cys Ser Asp Thr Arg Gly Glu Phe 580 585 590
Asn val Gly ser Thr Cys His Phe Ser cys Asp Asn Gly Phe Lys Leu 595 600 605
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Gin Cys Pro Ala Leu Thr Thr Pro Gly Gin Gly Thr Met Tyr cys Arg 645 650 655
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Asn Ala Gly Phe Thr Leu lie Gly Asp Ser Thr Leu ser Cys Arg Pro 675 680 685
Ser Gly Gin Trp Thr Ala Val Thr Pro Ala Cys Arg Ala val Lys Cys 690 695 700
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Gly Gin Leu Leu Asn Gly Ser Ala Gin Thr Ala Cys Gin Glu Asn Gly 740 745 750
His Trp Ser Thr Thr val Pro Thr Cys Gin Ala Gly Pro Leu Thr lie 755 760 765
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Leu lie Met Gly Gly Thr Leu Leu Ala Leu Leu Arg Lys Arg Phe Arg 785 790 795 800
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<210> 21 <211> 385 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21
Met Gly cys Arg Arg Thr Arg Glu Gly Pro Ser Lys Ala Met lie Phe 15 10 15
Pro Trp Lys Cys Gin Ser Thr Gin Arg Asp Leu Trp Asn lie Phe Lys 20 25 30
Leu Trp Gly Trp Thr Met Leu Cys Cys Asp Phe Leu Ala His His Gly 35 40 45
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Arg Ala Arg Arg Phe Cys Arg Asp Asn Tyr Thr Asp Leu val Ala lie 65 70 75 80
Gin Asn Lys Ala Glu lie Glu Tyr Leu Glu Lys Thr Leu Pro Phe Ser 85 90 95
Arg ser Tyr Tyr Trp lie Gly lie Arg Lys lie Gly Gly lie Trp Thr 100 105 110
Trp val Gly Thr Asn Lys ser Leu Thr Glu Glu Ala Glu Asn Trp Gly 115 120 125
Asp Gly Glu Pro Asn Asn Lys Lys Asn Lys Glu Asp Cys val Glu lie 130 135 140
Tyr lie Lys Arg Asn Lys Asp Ala Gly Lys Trp Asn Asp Asp Ala cys 145 150 155 160
His Lys Leu Lys Ala Ala Leu Cys Tyr Thr Ala Ser Cys Gin Pro Trp 165 170 175
Ser cys ser Gly His Gly Glu Cys val Glu lie lie Asn Asn Tyr Thr 180 185 190
Cys Asn cys Asp Val Gly Tyr Tyr Gly Pro Gin Cys Gin Phe Val lie 195 200 205
Gin cys Glu Pro Leu Glu Ala Pro Glu Leu Gly Thr Met Asp cys Thr 210 215 220
His Pro Leu Gly Asn Phe ser Phe ser ser Gin cys Ala Phe ser cys 225 230 235 240
Ser Glu Gly Thr Asn Leu Thr Gly lie Glu Glu Thr Thr Cys Gly Pro 245 250 255
Phe Gly Asn Trp Ser Ser Pro Glu Pro Thr Cys Gin Val lie Gin Cys 260 265 270
Glu Pro Leu ser Ala Pro Asp Leu Gly lie Met Asn cys Ser His Pro 275 280 285
Leu Ala Ser Phe Ser Phe Thr Ser Ala Cys Thr phe lie Cys Ser Glu 290 295 300
Gly Thr Glu Leu lie Gly Lys Lys Lys Thr lie Cys Glu Ser Ser Gly 305 310 315 320 lie Trp ser Asn Pro ser Pro lie cys Gin Lys Leu Asp Lys Ser Phe 325 330 335 ser Met lie Lys Glu Gly Asp Tyr Asn Pro Leu Phe lie Pro val Ala 340 345 350
Val Met val Thr Ala Phe Ser Gly Leu Ala Phe lie lie Trp Leu Ala 355 360 365
Arg Arg Leu Lys Lys Gly Lys Lys Ser Lys Arg Ser Met Asn Asp Pro 370 375 380
Tyr 385
<210> 22 <211> 411 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 22
Met val cys Phe Arg Leu Phe Pro Val Pro Gly ser Gly Leu val Leu 15 10 15
val cys Leu val Leu Gly Ala val Arg Ser Tyr Ala Leu Glu Leu Asn 20 25 BO
Leu Thr Asp Ser Glu Asn Ala Thr Cys Leu Tyr Ala Lys Trp Gin Met 35 40 45
Asn Phe Thr val Arg Tyr Glu Thr Thr Asn Lys Thr Tyr Lys Thr val 50 55 60
Thr lie ser Asp His Gly Thr val Thr Tyr Asn Gly ser lie cys Gly 65 70 75 80
Asp Asp Gin Asn Gly Pro Lys lie Ala Val Gin Phe Gly Pro Gly Phe 85 90 95
Ser Trp lie Ala Asn Phe Thr Lys Ala Ala Ser Thr Tyr Ser lie Asp 100 105 110
Ser Val Ser Phe Ser Tyr Asn Thr Gly Asp Asn Thr Thr Phe Pro Asp 115 120 125
Ala Glu Asp Lys Gly lie Leu Thr val Asp Glu Leu Leu Ala lie Arg 130 135 140 lie Pro Leu Asn Asp Leu Phe Arg Cys Asn ser Leu ser Thr Leu Glu 145 150 155 160
Lys Asn Asp Val Val Gin His Tyr Trp Asp Val Leu Val Gin Ala Phe 165 170 175
Val Gin Asn Gly Thr Val Ser Thr Asn Glu Phe Leu Cys Asp Lys Asp 180 185 190
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Asn Thr Thr His Ser Thr Gly Ser Cys Arg Ser His Thr Ala Leu Leu 260 265 270
Arg Leu Asn ser ser Thr lie Lys Tyr Leu Asp Phe val Phe Ala val 275 280 285
Lys Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Leu Lys Glu val Asn lie ser Met Tyr 290 295 300 305 310 315 320
Trp Asp Ala Pro Leu Gly ser ser Tyr Met Cys Asn Lys Glu Gin Thr 325 330 335
Val Ser val Ser Gly Ala Phe Gin lie Asn Thr Phe Asp Leu Arg val 340 345 350
Gin Pro Phe Asn Val Thr Gin Gly Lys Tyr Ser Thr Ala Glu Glu Cys 355 360 365
Ser Ala Asp ser Asp Leu Asn Phe Leu lie Pro val Ala val Gly val 370 375 380
Ala Leu Gly Phe Leu lie lie Val Val Phe lie Ser Tyr Met lie Gly 385 390 395 400
Arg Arg Lys ser Arg Thr Gly Tyr Gin ser val 405 410
<210> 23 <211> 310 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23
Met Arg Arg Ala Ala Leu Trp Leu Trp Leu cys Ala Leu Ala Leu ser 15 10 15
Leu Gin Pro Ala Leu Pro Gin lie val Ala Thr Asn Leu Pro Pro Glu 20 25 30
Asp Gin Asp Gly ser Gly Asp Asp Ser Asp Asn Phe ser Gly ser Gly 35 40 45
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Glu Asp Gly Ala Ser Ser Gin Leu Pro Ala Ala Glu Gly Ser Gly Glu 195 200 205
Gin Asp Phe Thr Phe Glu Thr ser Gly Glu Asn Thr Ala val val Ala 210 215 220 val Glu Pro Asp Arg Arg Asn Gin Ser Pro val Asp Gin Gly Ala Thr 225 230 235 240
Gly Ala Ser Gin Gly Leu Leu Asp Arg Lys Glu Val Leu Gly Gly Val 245 250 255 lie Ala Gly Gly Leu val Gly Leu lie Phe Ala val Cys Leu val Gly 260 265 270
Phe Met Leu Tyr Arg Met Lys Lys Lys Asp Glu Gly Ser Tyr Ser Leu 275 280 285
Glu Glu Pro Lys Gin Ala Asn Gly Gly Ala Tyr Gin Lys Pro Thr Lys 290 295 300
Gin Glu Glu Phe Tyr Ala 305 310
<210> 24 <211> 172 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24
Met Tyr Leu Asp Asn Ser ser lie Glu Glu Ala Ser Gly Val Tyr Pro 15 10 15 lie Asp Asp Asp Asp Tyr Ala ser Ala Ser Gly ser Gly Ala Asp Glu 20 25 30
Asp val Glu Ser Pro Glu Leu Thr Thr ser Arg Pro Leu Pro Lys lie 35 40 45
Leu Leu Thr Ser Ala Ala Pro Lys val Glu Thr Thr Thr Leu Asn lie 50 55 60
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Glu Lys Val His Leu Ser Asp Ser Glu Arg Lys Met Asp Pro Ala Glu 85 90 95
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Arg Thr Glu val Leu Ala Ala val lie Ala Gly Gly val lie Gly Phe 115 120 125
Leu Phe Ala lie Phe Leu lie Leu Leu Leu Val Tyr Arg Met Arg Lys 130 135 140
Lys Asp Glu Gly Ser Tyr Asp Leu Gly Glu Arg Lys Pro Ser Ser Ala 145 150 155 160
Ala Tyr Gin Lys Ala Pro Thr Lys Glu Phe Tyr Ala 165 170
<210> 25 <211> 442 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25
Met Lys Pro Gly Pro Pro His Arg Ala Gly Ala Ala His Gly Ala Gly 15 10 15
Ala Gly Ala Gly Ala Ala Ala Gly Pro Gly Ala Arg Gly Leu Leu Leu 20 25 30
Pro Pro Leu Leu Leu Leu Leu Leu Ala Gly Arg Ala Ala Gly Ala Gin 35 40 45
Arg Trp Arg Ser Glu Asn Phe Glu Arg pro val Asp Leu Glu Gly ser 50 55 60
Gly Asp Asp Asp Ser Phe Pro Asp Asp Glu Leu Asp Asp Leu Tyr Ser 65 70 75 80
Gly Ser Gly ser Gly Tyr Phe Glu Gin Glu ser Gly lie Glu Thr Ala 85 90 95
Met Arg Phe Ser Pro Asp Val Ala Leu Ala Val Ser Thr Thr Pro Ala 100 105 110 val Leu Pro Thr Thr Asn lie Gin pro val Gly Thr Pro Phe Glu Glu 115 120 125
Leu Pro Ser Glu Arg Pro Thr Leu Glu Pro Ala Thr Ser Pro Leu Val 130 135 140
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Thr Thr Met Ala Thr Thr Ala Ala Thr Ser Thr Gly Asp Pro Thr Val 165 170 175
Ala Thr Val Pro Ala Thr Val Ala Thr Ala Thr Pro Ser Thr Pro Ala 180 185 190
Ala Pro Pro Phe Thr Ala Thr Thr Ala val lie Arg Thr Thr Gly val 195 200 205
Arg Arg Leu Leu Pro Leu Pro Leu Thr Thr Val Ala Thr Ala Arg Ala 210 215 220
Thr Thr Pro Glu Ala Pro Ser Pro pro Thr Thr Ala Ala val Leu Asp 225 230 235 240
Thr Glu Ala Pro Thr Pro Arg Leu val Ser Thr Ala Thr Ser Arg Pro 245 250 255
Arg Ala Leu Pro Arg Pro Ala Thr Thr Gin Glu Pro Asp lie Pro Glu 260 265 270
Arg Ser Thr Leu Pro Leu Gly Thr Thr Ala Pro Gly Pro Thr Glu Val 275 280 285
Ala Gin Thr Pro Thr Pro Glu Thr Phe Leu Thr Thr lie Arg Asp Glu 290 295 300 pro Glu val Pro val ser Gly Gly pro ser Gly Asp Phe Glu Leu Pro 305 310 315 320
Glu Glu Glu Thr Thr Gin pro Asp Thr Ala Asn Glu val val Ala val 325 330 335
Gly Gly Ala Ala Ala Lys Ala ser ser Pro Pro Gly Thr Leu Pro Lys 340 345 350
Gly Ala Arg Pro Gly Pro Gly Leu Leu Asp Asn Ala lie Asp Ser Gly 355 360 365
Ser Ser Ala Ala Gin Leu Pro Gin Lys Ser lie Leu Glu Arg Lys Glu 370 375 380 val Leu val Ala Val lie val Gly Gly val val Gly Ala Leu Phe Ala 385 390 395 400
Ala Phe Leu Val Thr Leu Leu lie Tyr Arg Met Lys Lys Lys Asp Glu 405 410 415
Gly Ser Tyr Thr Leu Glu Glu Pro Lys Gin Ala Ser Val Thr Tyr Gin 420 425 430
Lys Pro Asp Lys Gin Glu Glu Phe Tyr Ala 435 440
<210> 26 <211> 198 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26
Met Ala Pro Ala Arg Leu Phe Ala Leu Leu Leu Phe Phe val Gly Gly 15 10 15
Val Ala Glu Ser lie Arg Glu Thr Glu Val lie Asp Pro Gin Asp Leu 20 25 30
Leu Glu Gly Arg Tyr Phe ser Gly Ala Leu Pro Asp Asp Glu Asp val 35 40 45 val Gly Pro Gly Gin Glu ser Asp Asp Phe Glu Leu Ser Gly ser Gly 50 55 60
Asp Leu Asp Asp Leu Glu Asp Ser Met lie Gly Pro Glu val val His 65 70 75 80
Pro Leu Val Pro Leu Asp Asn His lie Pro Glu Arg Ala Gly Ser Gly 85 90 95
Ser Gin val Pro Thr Glu Pro Lys Lys Leu Glu Glu Asn Glu val lie 100 105 110
Pro Lys Arg lie Ser Pro val Glu Glu Ser Glu Asp val Ser Asn Lys 115 120 125 val ser Met Ser Ser Thr val Gin Gly Ser Asn lie Phe Glu Arg Thr 130 135 140
Glu Val Leu Ala Ala Leu lie Val Gly Gly lie val Gly lie Leu Phe 145 150 155 160
Ala Val Phe Leu lie Leu Leu Leu Met Tyr Arg Met Lys Lys Lys Asp 165 170 175
Glu Gly Ser Tyr Asp Leu Gly Lys Lys Pro lie Tyr Lys Lys Ala pro 180 185 190
Thr Asn Glu Phe Tyr Ala
<210> 27 <211> 419 <212> PRT <213> Homo sapiens <4Ο0> 27
Met Arg Asn lie Phe Lys Arg Asn Gin Glu Pro lie val Ala Pro Ala 15 10 15
Thr Thr Thr Ala Thr Met Pro lie Gly Pro val Asp Asn Ser Thr Glu 20 25 30
Ser Gly Gly Ala Gly Glu Ser Gin Glu Asp Met Phe Ala Lys Leu Lys 35 40 45
Glu Lys Leu Phe Asn Glu lie Asn Lys lie Pro Leu Pro Pro Trp Ala 50 55 60
Leu lie Ala lie Ala Val Val Ala Gly Leu Leu Leu Leu Thr Cys Cys 65 70 75 80
Phe Cys lie Cys Lys Lys cys Cys cys Lys Lys Lys Lys Asn Lys Lys 85 90 95
Glu Lys Gly Lys Gly Met Lys Asn Ala Met Asn Met Lys Asp Met Lys 100 105 110
Gly Gly Gin Asp Asp Asp Asp Ala Glu Thr Gly Leu Thr Glu Gly Glu 115 120 125
Gly Glu Gly Glu Glu Glu Lys Glu Pro Glu Asn Leu Gly Lys Leu Gin 130 135 140
Phe Ser Leu Asp Tyr Asp Phe Gin Ala Asn Gin Leu Thr Val Gly Val 145 150 155 160
Leu Gin Ala Ala Glu Leu Pro Ala Leu Asp Met Gly Gly Thr Ser Asp 165 170 175
Pro Tyr val Lys val Phe Leu Leu Pro Asp Lys Lys Lys Lys Tyr Glu 180 185 190
Thr Lys val His Arg Lys Thr Leu Asn Pro Ala Phe Asn Glu Thr Phe 195 200 205
Thr Phe Lys val Pro Tyr Gin Glu Leu Gly Gly Lys Thr Leu val Met 210 215 220
Ala lie Tyr Asp Phe Asp Arg Phe Ser Lys His Asp lie lie Gly Glu 225 230 235 240 vai Lys vai Pro Met Asn Thr val Asp Leu Gly Gin Pro lie Glu Glu 245 250 255
Trp Arg Asp Leu Gin Gly Gly Glu Lys Glu Glu Pro Glu Lys Leu Gly 260 265 270
Asp lie Cys Thr Ser Leu Arg Tyr Val Pro Thr Ala Gly Lys Leu Thr 275 280 285
Val Cys lie Leu Glu Ala Lys Asn Leu Lys Lys Met Asp val Gly Gly 290 295 BOO
Leu Ser Asp Pro Tyr Val Lys lie His Leu Met Gin Asn Gly Lys Arg 305 310 315 320
Leu Lys Lys Lys Lys Thr Thr Val Lys Lys Lys Thr Leu Asn Pro Tyr 325 330 335
Phe Asn Glu ser Phe Ser Phe Glu lie Pro Phe Glu Gin lie Gin Lys 340 345 350 val Gin val val val Thr val Leu Asp Tyr Asp Lys Leu Gly Lys Asn 355 360 365
Glu Ala lie Gly Lys lie Phe Val Gly Ser Asn Ala Thr Gly Thr Glu 370 375 380
Leu Arg His Trp Ser Asp Met Leu Ala Asn Pro Arg Arg Pro lie Ala 385 390 395 400
Gin Trp His Ser Leu Lys Pro Glu Glu Glu val Asp Ala Leu Leu Gly 405 410 415
Lys Asn Lys
<210> 28 <211> 873 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28
Met Ala Thr Phe lie Ser val Gin Leu Lys Lys Thr ser Glu val Asp 15 10 15
Leu Ala Lys Pro Leu Val Lys Phe lie Gin Gin Thr Tyr Pro Ser Gly 20 25 30
Gly Glu Glu Gin Ala Gin Tyr Cys Arg Ala Ala Glu Glu Leu Ser Lys 35 40 45
Leu Arg Arg Ala Ala Val Gly Arg Pro Leu Asp Lys His Glu Gly Ala 50 55 60
Leu Glu Thr Leu Leu Arg Tyr Tyr Asp Gin lie Cys Ser lie Glu Pro 65 70 75 80
Lys Phe Pro Phe ser Glu Asn Gin lie cys Leu Thr Phe Thr Trp Lys 85 90 95
Asp Ala Phe Asp Lys Gly Ser Leu Phe Gly Gly Ser Val Lys Leu Ala 100 105 110
Leu Ala Ser Leu Gly Tyr Glu Lys Ser Cys Val Leu Phe Asn Cys Ala 115 120 125
Ala Leu Ala ser Gin lie Ala Ala Glu Gin Asn Leu Asp Asn Asp Glu 130 135 140
Gly Leu Lys lie Ala Ala Lys His Tyr Gin Phe Ala ser Gly Ala Phe 145 150 155 160
Leu His lie Lys Glu Thr val Leu Ser Ala Leu ser Arg Glu Pro Thr 165 170 175 val Asp lie ser Pro Asp Thr val Gly Thr Leu Ser Leu lie Met Leu 180 185 190
Ala Gin Ala Gin Glu val Phe Phe Leu Lys Ala Thr Arg Asp Lys Met 195 200 205
Lys Asp Ala lie lie Ala Lys Leu Ala Asn Gin Ala Ala Asp Tyr Phe 210 215 220
Gly Asp Ala Phe Lys Gin cys Gin Tyr Lys Asp Thr Leu Pro Lys Tyr 225 230 235 240
Phe Tyr Phe Gin Glu val Phe Pro val Leu Ala Ala Lys His Cys lie 245 250 255
Met Gin Ala Asn Ala Glu Tyr His Gin Ser He Leu Ala Lys Gin Gin 260 265 270
Lys Lys Phe Gly Glu Glu lie Ala Arg Leu Gin His Ala Ala Glu Leu 275 280 285 lie Lys Thr Val Ala Ser Arg Tyr Asp Glu Tyr Val Asn val Lys Asp 290 295 300
Phe ser Asp Lys lie Asn Arg Ala Leu Ala Ala Ala Lys Lys Asp Asn 305 310 315 320
Asp Phe lie Tyr His Asp Arg val Pro Asp Leu Lys Asp Leu Asp Pro 325 330 335 lie Gly Lys Ala Thr leu val Lys Ser Thr Pro val Asn val Pro lie 340 345 350
Ser Gin Lys Phe Thr Asp Leu Phe Glu Lys Met val Pro val Ser val 355 360 365
Gin Gin Ser Leu Ala Ala Tyr Asn Gin Arg Lys Ala Asp Leu val Asn 370 375 380
Arg Ser lie Ala Gin Met Arg Glu Ala Thr Thr Leu Ala Asn Gly val 385 390 395 400
Leu Ala Ser Leu Asn Leu Pro Ala Ala lie Glu Asp val ser Gly Asp 405 410 415
Thr val Pro Gin Ser lie Leu Thr Lys Ser Arg ser val lie Glu Gin 420 425 430
Gly Gly lie Gin Thr val Asp Gin Leu lie Lys Glu Leu Pro Glu Leu 435 440 445
Leu Gin Arg Asn Arg Glu lie Leu Asp Glu ser Leu Arg Leu Leu Asp 450 455 460
Glu Glu Glu Ala Thr Asp Asn Asp Leu Arg Ala Lys Phe Lys Glu Arg 465 470 475 480
Trp Gin Arg Thr Pro Ser Asn Glu Leu Tyr Lys Pro Leu Arg Ala Glu 485 490 495
Gly Thr Asn Phe Arg Thr val Leu Asp Lys Ala Val Gin Ala Asp Gly 500 505 510
Gin val Lys Glu Cys Tyr Gin Ser His Arg Asp Thr lie val Leu Leu 515 520 525
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Leu ser Asn Leu Asp Glu val Lys Lys Glu Arg Glu Gly Leu Glu Asn 565 570 575
Asp Leu Lys Ser val Asn Phe Asp Met Thr Ser Lys Phe Leu Thr Ala 580 585 590
Leu Ala Gin Asp Gly val lie Asn Glu Glu Ala Leu ser val Thr Glu 595 600 605
Leu Asp Arg val Tyr Gly Gly Leu Thr Thr Lys val Gin Glu Ser Leu 610 615 620
Lys Lys Gin Glu Gly Leu Leu Lys Asn lie Gin val Ser His Gin Glu 625 630 635 640
Phe Ser Lys Met Lys Gin Ser Asn Asn Glu Ala A$n Leu Arg Glu Glu 645 650 655 val Leu Lys Asn Leu Ala Thr Ala Tyr Asp Asn Phe val Glu Leu val 660 665 670
Ala Asn Leu Lys Glu Gly Thr Lys Phe Tyr Asn Glu Leu Thr Glu lie 675 680 685
Leu val Arg Phe Gin Asn Lys Cys Ser Asp lie val Phe Ala Arg Lys 690 695 700
Thr Glu Arg Asp Glu Leu Leu Lys Asp Leu Gin Gin ser lie Ala Arg 705 710 715 720
Glu Pro ser Ala Pro ser lie Pro Thr Pro Ala Tyr Gin Ser Ser Pro 725 730 735
Ala Gly Gly His Ala Pro Thr Pro Pro Thr Pro Ala Pro Arg Thr Met 740 745 750
Pro Pro Thr Lys Pro Gin Pro Pro Ala Arg Pro Pro Pro Pro val Leu 755 760 765
Pro Ala Asn Arg Ala Pro ser Ala Thr Ala Pro ser Pro val Gly Ala 770 775 780
Gly Thr Ala Ala Pro Ala Pro Ser Gin Thr Pro Gly Ser Ala Pro Pro 785 790 795 800
Pro Gin Ala Gin Gly Pro Pro Tyr Pro Thr Tyr Pro Gly Tyr Pro Gly 805 810 815
Tyr cys Gin Met Pro Met Pro Met Gly Tyr Asn Pro Tyr Ala Tyr Gly 820 825 830
Gin Tyr Asn Met Pro Tyr Pro Pro val Tyr His Gin Ser Pro Gly Gin 835 840 845
Ala Pro Tyr Pro Gly Pro Gin Gin Pro ser Tyr Pro Phe Pro Gin Pro 850 855 860
Pro Gin Gin Ser Tyr Tyr Pro Gin Gin 865 870
<210> 29 <211> 298 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29
Met ser Leu Tyr Pro ser Leu Glu Asp Leu Lys val Asp Lys val lie 15 10 15
Gin Ala Gin Thr Ala Phe Ser Ala Asn Pro Ala Asn Pro Ala lie Leu 20 25 30
Ser Glu Ala Ser Ala Pro lie Pro His Asp Gly Asn Leu Tyr Pro Arg 35 40 45
Leu Tyr Pro Glu Leu Ser Gin Tyr Met Gly Leu Ser Leu Asn Glu Glu 50 55 60
Glu lie Arg Ala Ser val Ala val val ser Gly Ala Pro Leu Gin Gly 65 70 75 80
Gin Leu val Ala Arg pro Ser ser lie Asn Tyr Met val Ala Pro val 85 90 95
Thr Gly Asn Asp val Gly lie Arg Arg Ala Glu lie Lys Gin Gly lie 100 105 110
Arg Glu val lie Leu Cys Lys Asp Gin Asp Gly Lys lie Gly Leu Arg 115 120 125
Leu Lys Ser lie Asp Asn Gly lie Phe val Gin Leu val Gin Ala Asn 130 135 140
Ser Pro Ala ser Leu val Gly Leu Arg Phe Gly Asp Gin val Leu Gin 145 150 155 160 lie Asn Gly Glu Asn Cys Ala Gly Trp ser ser Asp Lys Ala His Lys 165 170 175 val Leu Lys Gin Ala Phe Gly Glu Lys lie Thr Met Thr lie Arg Asp 180 185 190
Arg Pro Phe Glu Arg Thr lie Thr Met His Lys Asp Ser Thr Gly His 195 200 205
Val Gly Phe lie Phe Lys Asn Gly Lys lie Thr Ser lie Val Lys Asp 210 215 220
Ser Ser Ala Ala Arg Asn Gly Leu Leu Thr Glu His Asn lie Cys Glu 225 230 235 240 lie Asn Gly Gin Asn vai lie Gly Leu Lys Asp Ser Gin lie Ala Asp 245 250 255 lie Leu Ser Thr Ser Gly Thr Vai vai Thr lie Thr lie Met Pro Ala 260 265 270
Phe lie Phe Glu His lie lie Lys Arg Met Ala Pro Ser lie Met Lys 275 280 285
Ser Leu Met Asp His Thr lie Pro Glu Val 290 295
<210> 30 <211> 455 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30
Met Gly Leu ser Thr val Pro Asp Leu Leu Leu Pro Leu val Leu Leu 15 10 15
Glu Leu Leu val Gly lie Tyr Pro ser Gly val lie Gly Leu val Pro 20 25 30
His Leu Gly Asp Arg Glu Lys Arg Asp ser val Cys Pro Gin Gly Lys 35 40 45
Tyr lie His Pro Gin Asn Asn Ser lie Cys Cys Thr Lys Cys His Lys 50 55 60
Gly Thr Tyr Leu Tyr Asn Asp Cys Pro Gly Pro Gly Gin Asp Thr Asp 65 70 75 80
Cys Arg Glu Cys Glu Ser Gly Ser Phe Thr Ala ser Glu Asn His Leu 85 90 95
Arg His Cys Leu Ser cys ser Lys cys Arg Lys Glu Met Gly Gin val 100 105 110
Glu lie Ser Ser Cys Thr val Asp Arg Asp Thr Val Cys Gly Cys Arg 115 120 125
Lys Asn Gin Tyr Arg His Tyr Trp Ser Glu Asn Leu Phe Gin Cys Phe 130 135 140
Asn cys Ser Leu cys Leu Asn Gly Thr val His Leu ser Cys Gin Glu 145 150 155 160
Lys Gin Asn Thr val Cys Thr Cys His Ala Gly Phe Phe Leu Arg Glu 165 170 175
Asn Glu Cys vai Ser Cys Ser Asn Cys Lys Lys Ser Leu Glu Cys Thr 180 185 190
Lys Leu Cys Leu Pro Gin lie Glu Asn vai Lys Gly Thr Glu Asp ser 195 200 205
Gly Thr Thr Vai Leu Leu Pro Leu vai Ile Phe Phe Gly Leu Cys Leu 210 215 220
Leu ser Leu Leu Phe lie Gly Leu Met Tyr Arg Tyr Gin Arg Trp Lys 225 230 235 240
Ser Lys Leu Tyr Ser Ile Vai Cys Gly Lys Ser Thr Pro Glu Lys Glu 245 250 255
Gly Glu Leu Glu Gly Thr Thr Thr Lys Pro Leu Ala Pro Asn Pro ser 260 265 270
Phe Ser Pro Thr Pro Gly Phe Thr Pro Thr Leu Gly Phe Ser Pro Vai 275 280 285
Pro Ser Ser Thr Phe Thr Ser Ser ser Thr Tyr Thr Pro Gly Asp Cys 290 295 300
Pro Asn Phe Ala Ala Pro Arg Arg Glu Vai Ala Pro Pro Tyr Gin Gly 305 310 315 320
Ala Asp Pro ile Leu Ala Thr Ala Leu Ala ser Asp Pro lie pro Asn 325 330 335
Pro Leu Gin Lys Trp Glu Asp Ser Ala His Lys Pro Gin Ser Leu Asp 340 345 350
Thr Asp Asp Pro Ala Thr Leu Tyr Ala vai vai Glu Asn vai Pro Pro 355 360 365
Leu Arg Trp Lys Glu Phe vai Arg Arg Leu Gly Leu ser Asp His Glu 370 375 380 ile Asp Arg Leu Glu Leu Gin Asn Gly Arg cys Leu Arg Glu Ala Gin 385 390 395 400
Tyr Ser Met Leu Ala Thr Trp Arg Arg Arg Thr Pro Arg Arg Glu Ala 405 410 415
Thr Leu Glu Leu Leu Gly Arg vai Leu Arg Asp Met Asp Leu Leu Gly 420 425 430
Cys Leu Glu Asp lie Glu Glu Ala Leu Cys Gly Pro Ala Ala Leu Pro 435 440 445
Pro Ala Pro ser Leu Leu Arg 450 455
<210> 31 <211> 461 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31
Met Ala Pro val Ala val Trp Ala Ala Leu Ala val Gly Leu Glu Leu 15 10 15
Trp Ala Ala Ala His Ala Leu Pro Ala Gin Val Ala Phe Thr Pro Tyr 20 25 BO
Ala Pro Glu Pro Gly Ser Thr Cys Arg Leu Arg Glu Tyr Tyr Asp Gin 35 40 45
Thr Ala Gin Met Cys cys Ser Lys cys Ser pro Gly Gin His Ala Lys 50 55 60 val Phe Cys Thr Lys Thr Ser Asp Thr Val Cys Asp Ser Cys Glu Asp 65 70 75 80
Ser Thr Tyr Thr Gin Leu Trp Asn Trp val Pro Glu Cys Leu Ser Cys 85 90 95
Gly ser Arg Cys Ser ser Asp Gin val Glu Thr Gin Ala cys Thr Arg 100 105 110
Glu Gin Asn Arg lie cys Thr cys Arg Pro Gly Trp Tyr cys Ala Leu 115 120 125
Ser Lys Gin Glu Gly Cys Arg Leu Cys Ala Pro Leu Arg Lys Cys Arg 1B0 135 140
Pro Gly Phe Gly Val Ala Arg Pro Gly Thr Glu Thr Ser Asp Val Val 145 150 155 160
Cys Lys Pro Cys Ala Pro Gly Thr Phe Ser Asn Thr Thr ser ser Thr 165 170 175
Asp lie Cys Arg Pro His Gin lie Cys Asn Val val Ala lie Pro Gly 180 185 190
Asn Ala Ser Met Asp Ala val Cys Thr Ser Thr Ser Pro Thr Arg Ser 195 200 205
Met Ala Pro Gly Ala val His Leu Pro Gin Pro Val Ser Thr Arg Ser 210 215 220
Gin His Thr Gin Pro Thr Pro Glu Pro ser Thr Ala Pro Ser Thr Ser 225 230 235 240
Phe Leu Leu Pro Met Gly Pro ser Pro Pro Ala Glu Gly ser Thr Gly 245 250 255
Asp Phe Ala Leu Pro val Gly Leu lie val Gly val Thr Ala Leu Gly 260 265 270
Leu Leu lie lie Gly val Val Asn Cys val lie Met Thr Gin Val Lys 275 280 285
Lys Lys Pro Leu Cys Leu Gin Arg Glu Ala Lys val Pro His Leu Pro 290 295 300
Ala Asp Lys Ala Arg Gly Thr Gin Gly Pro Glu Gin Gin His Leu Leu 305 310 315 320 lie Thr Ala Pro Ser ser ser Ser ser ser Leu Glu Ser ser Ala ser 325 330 335
Ala Leu Asp Arg Arg Ala Pro Thr Arg Asn Gin Pro Gin Ala Pro Gly 340 345 350
Val Glu Ala ser Gly Ala Gly Glu Ala Arg Ala Ser Thr Gly Ser ser 355 360 365
Asp Ser Ser Pro Gly Gly His Gly Thr Gin Val Asn Val Thr Cys lie 370 375 380
Val Asn Val Cys Ser ser Ser Asp His Ser Ser Gin Cys Ser Ser Gin 385 390 395 400
Ala Ser Ser Thr Met Gly Asp Thr Asp Ser Ser Pro Ser Glu Ser Pro 405 410 415
Lys Asp Glu Gin Val Pro Phe Ser Lys Glu Glu Cys Ala Phe Arg Ser 420 425 430
Gin Leu Glu Thr Pro Glu Thr Leu Leu Gly Ser Thr Glu Glu Lys Pro 435 440 445
Leu Pro Leu Gly val pro Asp Ala Gly Met Lys Pro Ser 450 455 460
<210> 32 <211> 427 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32
Met Gly Ala Gly Ala Thr Gly Arg Ala Met Asp Gly Pro Arg Leu Leu 15 10 15
Leu Leu Leu Leu Leu Gly val ser Leu Gly Gly Ala Lys Glu Ala Cys 20 25 30
Pro Thr Gly Leu Tyr Thr His Ser Gly Glu Cys cys Lys Ala Cys Asn 35 40 45
Leu Gly Glu Gly val Ala Gin Pro Cys Gly Ala Asn Gin Thr Val Cys 50 55 60
Glu Pro Cys Leu Asp ser val Thr Phe ser Asp val val ser Ala Thr 65 70 75 80
Glu Pro cys Lys Pro cys Thr Glu cys val Gly Leu Gin ser Met ser 85 90 95
Ala Pro Cys val Glu Ala Asp Asp Ala val Cys Arg Cys Ala Tyr Gly 100 105 110
Tyr Tyr Gin Asp Glu Thr Thr Gly Arg cys Glu Ala Cys Arg val Cys 115 120 125
Glu Ala Gly Ser Gly Leu Val Phe Ser Cys Gin Asp Lys Gin Asn Thr 130 135 140 val cys Glu Glu Cys Pro Asp Gly Thr Tyr ser Asp Glu Ala Asn His 145 150 155 160 val Asp Pro cys Leu Pro Cys Thr val cys Glu Asp Thr Glu Arg Gin 165 170 175
Leu Arg Glu Cys Thr Arg Trp Ala Asp Ala Glu Cys Glu Glu lie Pro 180 185 190
Gly Arg Trp lie Thr Arg ser Thr Pro Pro Glu Gly Ser Asp Ser Thr 195 200 205
Ala Pro ser Thr Gin Glu Pro Glu Ala Pro Pro Glu Gin Asp Leu lie 210 215 220
Ala Ser Thr val Ala Gly val Val Thr Thr val Met Gly Ser Ser Gin 225 230 235 240
Pro Val val Thr Arg Gly Thr Thr Asp Asn Leu lie Pro val Tyr cys 245 250 255
Ser lie Leu Ala Ala Val val Val Gly Leu Val Ala Tyr lie Ala Phe 260 265 270
Lys Arg Trp Asn ser cys Lys Gin Asn Lys Gin Gly Ala Asn ser Arg 275 280 285
Pro val Asn Gin Thr Pro Pro Pro Glu Gly Glu Lys Leu His Ser Asp 290 295 300
Ser Gly lie Ser Val Asp Ser Gin Ser Leu His Asp Gin Gin Pro His 305 310 315 320
Thr Gin Thr Ala Ser Gly Gin Ala Leu Lys Gly Asp Gly Gly Leu Tyr 325 330 335
Ser Ser Leu Pro Pro Ala Lys Arg Glu Glu Val Glu Lys Leu Leu Asn 340 345 350
Gly Ser Ala Gly Asp Thr Trp Arg His Leu Ala Gly Glu Leu Gly Tyr 355 360 365
Gin Pro Glu His lie Asp ser Phe Thr His Glu Ala Cys Pro val Arg 370 375 380
Ala Leu Leu Ala ser Trp Ala Thr Gin Asp ser Ala Thr Leu Asp Ala 385 390 395 400
Leu Leu Ala Ala Leu Arg Arg lie Gin Arg Ala Asp Leu val Glu Ser 405 410 415
Leu Cys Ser Glu Ser Thr Ala Thr Ser Pro val 420 425
<210> 33 <211> 426 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33
Met Glu Ala Ala val Ala Ala Pro Arg Pro Arg Leu Leu Leu Leu val 15 10 15
Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Pro Gly Ala Thr 20 25 30
Ala Leu Gin Cys Phe Cys His Leu Cys Thr Lys Asp Asn Phe Thr Cys 35 40 45 val Thr Asp Gly Leu cys Phe val Ser Val Thr Glu Thr Thr Asp Lys 50 55 60
Val lie His Asn Ser Met Cys lie Ala Glu lie Asp Leu lie Pro Arg 65 70 75 80
Asp Aro Pro Phe Val Cys Ala Pro Ser ser Lys Thr Gly Ser Val Thr 85 90 95
Thr Thr Tyr Cys cys Asn Gin Asp His Cys A$n lvs lie Glu l@u Pro 100 105 110
Thr Thr Gly Leu pro Leu Leu val Gin Arg Thr lie Ala Arg Thr lie 115 120 125
Val Leu Gin Glu Ser lie Gly Lys Gly Arg Phe Gly Glu Val Trp Arg 130 135 140
Gly Lys Trp Arg Gly Glu Glu val Ala val Lys lie Phe ser ser Arg 145 150 155 160
Glu Glu Arg ser Trp Phe Arg Glu Ala Glu He Tyr Gin Thr Val Met 165 170 175
Leu Arg His Glu Asrt He Leu Gly Phe lie Ala Ala Asp asp Lys Asp ISO 185 190
Asrt Gly Thr Trp Thr Gin Leu Trp Leu val Ser Asp Tyr His Glu His 135 200 205
Gly Ser Leu phe Asp Tyr Leu Asπ Arg Tyr Thr Val Thr Val Glu Gly 210 215 220
Met lie Lys Leu Ala Leu Ser Thr Ala Ser Gly L.eu Ala his Leu His 225 230 235 240
Met Glu lie Val Gly Thr Gin Gly Lys Pro Ala lie Ala His Arg Asp 245 250 255
Leu Lys ser Lys Asn lie Leu Val Lys Lys Asn Gly Thr Cys cys lie 260 265 270
Ala Asp Leu Gly Leu Ala val Arg His Asp ser Ala Thr Asp Thr He 275 280 2S5
Asp lie Ala Pro Asn His Arg Val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro 290 295 300
Glu Val Leu Asp Asp Ser lie Asn Met Lys His Phe Glu Ser Phe Lys 305 310 315 320
Arg Ala Asp lie Tyr Ala Met Gly Leu val Phe Trp Glu lie Ala Arg 325 330 335
Arg Cys Ser 1¼ Gly Gly lie His Glu Asp Tyr Gin Leu Pro Tyr Tyr 340 345 350
Asp Leu val pro Ser Asp Pro Ser Val Glu Glu Met Arg Lys Val val 355 360 365 cys Glu Gin Lys Leu Arg Pro Asrs lie Pro Aso Arg Trp Girt ser Cys 370 375 380
Glu Ala Leu Arg val Met Ala Lys lie Met Arg Glu Cys Trp Tyr Ala 385 390 395 400
Asn Gly Ala Ala Arg Ley Tftr Ala Leu Arg lie Lys Lys Thr Leu Ser 405 410 415
Girt Leu ser Gin Gin Gly Gly lie Lys Met 420 425
<210> 34 <211> 592 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 wet Gly Arg Gly Leu Leu Arg Gly Leu Trp Pro teu His He val Leu 1 5 10 15
Trp Thr Arg lie Ala Ser Thr lie Pro Pro His val Gin tys ser Asp 20 25 30 val Glu Met Glu Ala Gin Lys Asp Glu He lie Cys Pro ser Cys A$n 35 40 45
Arg Thr Ala His Pro Leu Arg His lie asp Asn Asp Met lie val Thr 50 55 60
Asp Asn Asn Gly Ala val tys Phe Pro Gin Ley Cys Lys Phe Cys Asp
65 70 75 SO val Arg Phe ser Thr cys Asp Asn Gin Lys ser Cys Met ser Asn cys S5 90 95 ser lie Thr ser lie Cys Glu Lys Pro Gin Glu Val Cys Val Ala Val 100 105 110
Trp Arg Lys Asn Asp Glu Asn lie Thr Ley Glu Thr val Cys His Asp 115 120 125
Pro Lys Leu Pro Tyr His Asp Phe lie Leu Glu Asp Ala Ala ser pro 130 135 140
Lys Cys tie Met Lys Glu tys tys Lys Pro Gly Glu Thr Phe Phe Net 145 150 155 160
Cys Ser Cys Ser Ser Asp Glu Cys Asn Asp Asn lie lie Phe Ser Glu
165 170 17 S
Glu Tyr Asn Thr Ser Asn Pro Asp Leu Leu Leu val lie Phe Gin val 180 185 190
Thr Gly lie Ser Ley Leu Pro Pro leu Gly Val Ala lie Ser val lie 195 200 205 lie lie Phe Tyr tvs Tyr Arg Val Asn Arg Gin Gin Lys Leu ser Ser 210 215 220
Thr Trp Glu Thr Gly Lys Thr Arg Lys Leu Met Glu Phe Ser Gly His 225 230 235 240
Cys Ala lie lie Ley Glu Asp Asp Arg Ser Asp lie Ser Ser Thr cys 245 250 255
Ala Asn Asn lie A$n His Asn Thr Glu Leu Leu pro lie Glu teu Asp 260 265 270
Thr Ley val Gly Lys Gly Arg Phe Ala Glu val Tyr Lys Ala Lys Leu 275 280 285
Lys Gin Asn Thr ser Gly Gin Phe Glu Thr val Ala val Lys lie Phe 290 295 300
Pro Tyr Glu Glu Tyr Ala ser Trp Lys Thr Glu Lys Asp lie Phe Ser 305 310 315 320
Asp lie Asn Leu Lys His Glu aso lie ueu Gin Phe Leu Thr Ala Glu 325 330 335
Glu Arg Lys Thr Glu Leu sly Lys Gin Tyr Trp Leu lie Thr Ala Phe 340 345 350
His Ala Lys Gly ash Leu Gin Glu Tyr Leu Thr Arg His val lie ser 355 360 365
Trp Glu Asp Leu Arg Lys teu Gly Ser ser Leu Ala Arg Gly lie Ala 370 375 380
His Leu His Ser Asp His Thr pro cys Gly Arg pro Lys wet Pro lie 385 390 395 400
Val His Arg Asp Leu Lys Ser Ser Asn lie Leu Val Lys Asn Asp Leu 405 410 415
Thr Cys Cys Leu Cys Asp Phe Gly Leu Ser Leu Arg Leu Asp Pro Thr 420 '425 430
Leu ser val Asp Asp Leu Ala Asn ser Gly Gin val Gly Thr Ala Arg 435 440 445
Tyr Net Ala Pro Glu Val Leu Glu Ser Arg Met Asn Leu Glu Asn Val 450 455 460
Glu ser Phe Lys Girt Thr Asp val Tyr ser Met Ala Leu val Leu Trp 465 470 475 480
Glu Met Thr ser Arg Cys Asn Ala val Gly Glu val Lys Asp Tyr Glu 485 490 495
Pro Pro Phe Gly ser Lys val Arg Glu His Pro Cys val Glu Ser Met 500 505 510
Lys Asp Asn val Leu Arg Asp Arg Gly Arg Pro Glu lie Pro ser Phe 515 520 525
Trp Leu Asn His Gin Gly lie Gin Met Val Cys Glu Thr Leu Thr Glu 530 535 540
Cys Trp Asp his Asp Pro Glu Ala Arg Leu Thr Ala Gin cys val Ala 545 550 555 560
Glu Arg Phe Ser Glu Leu Glu His Leu Asp Arg Leu Ser Gly Arg Ser 565 570 575
Cys Ser Glu Glu Lys lie Pro Glu Asp Gly Ser Leu Asn Thr Thr Lys 580 585 590
<210> 35 <211> 850 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35
Met Thr ser His Tyr val lie Ala lie Phe Ala Leu Met Ser ser cvs
I 5 10 IS teu Ala Thr Ala sly Pro· Gly Pro Gly Ala Leu Cys Glu Leu ser Pro 20 25 30
Val ser Ala Ser His Pro Val Gin Ala Leu Met Glu Ser Phe Thr Val 35 40 45
Leu ser Gly Cys Ala Ser Arg Gly Thr Thr Gly Leu Pro Gin Glu Val 50 55 60
His val Leu asji Leu Arg Thr Ala Gly Gin Gly Pro Gly Gin Leu Gin 65 70 75 80
Arg Glu val Thr Leu His Leu Asn Pro lie Ser Ser Val His lie His 85 90 95
His Lys ser vai vai Phe Leu Ley Asn Ser Pro His Pro Leu val Trp 100 105 110
His Leu Lys Thr Glu Arg Ley Ala Thr Gly val ser Arg Leu Phe Leu 115 120 125 val Ser Glu Gly Ser val val Gin Phe Ser Ser Ala Asp Phe ser Leu 130 135 140
Thr Ala Glu Thr Glu Glu Arg Asn Phe Pro His Gly Asn Glu His Leu 145 150 155 160
Leu Asn rrp Ala Arg Lys Glu lyr Gly Ala val Thr ser Phe Thr Glu 165 170 175
Leu Lys lie Ala Arg Asn He Tyr rle Lys val Gly Glu Asp Gin val 180 185 190
Phe Pro Pro Lys Cys Asn lie Gly Lys Asn Phe Leu Ser Leu Asn Tyr 195 200 205
Leu Ala Glu Tyr Leu Gin Pro Lys Ala Ala Glu Gly Cys val Met ser 210 215 220
Ser Gin Pro Gin Asn Glu Glu val His lie lie Glu Leu lie Thr Pro 225 230 235 240
Asn Ser Asm Pro Tyr Ser Ala Phe Gin Val Asp lie Thr lie Asp lie 245 250 255
Arg Pro ser Gin Glu Asp Leu Glu val val lys Asn Leu He Leu He 260 265 270
Leu Lys cys Lys Lys ser val Asn Trp val rle Lys ser Phe Asp val 275 280 285
Lys Gly Ser Leu Lys He He Ala Pro Asn Ser He Gly Phe Gly Lys 290 295 300
Glu Ser Glu Arg Ser Met Thr Met Thr Lys Ser lie Arg Asp Asp lie 305 310 315 320
Pro Ser Thr Gin Gly Asn Leu val Lys Trp Ala Leu Asp Asn Gly Tyr 325 330 335
Ser Pro He Thr Ser Tyr Thr Met Ala Pro Val Ala Asn Arg phe his 340 345 350
Leu Arg Leu Glu Asn Asn Glu Glu Met Gly Asp Glu Glu val his Thr 355 360 365 lie Pro Pro Glu Ley Arg lie leu Leu A$p pro Gly Ala Leu Pro Ala 370 375 380
Leu Gin Asn Pro Pro lie Arg Gly Gly Glu Gly Gin Asn Gly Gly Leu 385 390 395 400 pro Phe pro phe Pro Asp lie ser Arg Arg val Trp Asn Gly Glu Gly 405 410 415
Glu Asp Gly Leu Pro Arg Pro t.ys Asp Pro val lie Pro ser lie Gin 420 425 430
Leu Phe pro Gly Leu Arg Glu Pro Glu Glu val Gin Gly ser val Asp 435 440 445 lie Ala Leu Ser val Lys Cys Asp Asn Glu Lys Met lie val Ala val 4S0 455 460
Glu Lys Asp Ser Phe Gin Ala Ser Gly Tyr Ser Gly Met Asp val Thr 465 470 475 400
Leu Leu Asp Pro Thr Cys Lys Ala Lys Met Aso Gly Thr His Phe val 485 490 495
Leu Glu ser pro Leu Asn Gly Cys Gly Thr Arg Pro Arg Trp Ser Ala 500 505 510
Leu Asp Gly Val Val Tyr Tyr Asn Ser lie Val lie Gin val Pro Ala 515 520 525
Leu Gly Asp ser ser Gly Trp pro asp Gly Tyr Glu A$p teu Glu ser 530 535 540
Gly Asp Asn Gly Phe Pro Gly Asp Met Asp Glu Gly Asp Ala ser Leu 545 550 555 560
Phe Thr Arg pro Glu He Val val Phe Asn Cys ser Leu Gin Gin val 565 570 575
Arg Asn Pro Ser Ser Phe Gin Glu Gin Pro His Gly Asn lie Thr Phe 580 5S5 590
Asn Met Glu Leu Tyr Asn Thr Asp Leu Phe Leu val Pro Ser Gin Gly 595 600 605 val Phe ser val pro Glu ash Gly His val Tyr val Glu val ser val 610 615 620
Thr Lys Ala Glu Gin Glu Leu Gly Phe Ala lie Gin Thr cys Phe lie 625 630 €35 640 ser Pro Tyr ser Asrt Pro Asp Arg Met Ser His Tyr Thr lie lie Glu 645 ' 650 655
Asn lie cys Pro Lys Asp Glu ser val Lys Phe Tyr Ser Pro lys Arg 660 665 670 val His Phe pro He pro Gin Ala Asp Met Asp Lys Lys Arg Phe ser 675 6S0 685
Phe val Phe Lys Pro val Phe Asn Thr Ser Leu Leu Phe Leu Gin cys §90 695 700
Glu Leu Thr Ley Cys Thr Lys Met Glu Lys His Pro Gin Lys Ley Pro 705 7IÔ 715 720
Lys Cys val Pro Pro Asp Glu Ala Cys Thr ser Leu Asp Ala Ser lie 725 730 735
He Trp Ala Met Met Gin Asrt Lys Lys Thr Phe Thr Lys Pro Leu Ala 740 745 750 val lie His His Glu Ala Glu ser Lys Glu Lys Gly Pro ser Met Lys 755 760 765
Glu Pro Asn pro lie ser pro pro lie Phe His Gly teu Asp Thr Leu 770 775 780
Thr val Met Gly lie Ala Phe Ala Ala Phe val lie Gly Ala Leu Leu 78$ 790 795 800
Thr Gly Ala Leu Trp Tyr He Tyr ser His Thr Gly Glu Thr Ala Gly 805 810 815
Arg Gin Gin Val Pro Thr Ser Pro pro Ala Ser Glu Asn Ser Ser Ala 820 825 830
Ala His Ser He Gly Ser Thr Gin Ser Thr Pro Cys Ser Ser Ser ser 835 840 845
Thr Ala 850
<210> 36 <211> 820 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Γ Trp Ser Trp Lys c.yS L,u L*U Phe Trp *U V», L.u V»! Thr
Thr Leu cys Thr Ala Arg pro Ser Pro Thr Leu Pro Gly Gin Ala Gin 20 25 30
Pro Trp Gly Ala Pro val Glu val Glu ser Phe Leu val His Pro Gly 35 40 45
Asp Leu Leu Gin Leu Arg Cys Arg Leu Arg Asp Asp Val Gin ser lie 50 55 60
Asn Trp Leu Arg Asp Gly val Gin Leu Ala Glu Ser Asn Arg Thr Arg
65 70 75 SO lie Thr Gly Glu Glu Val Glu Val Gin Asp Ser Val Pro Ala Asp Ser 85 90 95
Gly Leu Tyr Ala Cys val Thr Ser ser Pro Ser Gly ser Asp Thr Thr 100 105 110
Tyr phe ser val A$n val $er asp Ala Leu pro Ser ser Glu Asp asp 115 120 125
Asp Asp Asp Asp Asp Ser Ser Ser Glu Glu Lys Glu Thr Asp Asn Thr 130 135 140
Lys Pro Asn Arg Met Pro val Ala Pro Tyr Trp Thr Ser Pro Glu Lys 145 150 155 160
Met Glu Lys Lys Leu His Ala val Pro Ala Ala Lys Thr val Lys Phe 165 170 175
Lys cys pro ser ser Gly Thr pro asp Pro Thr teu Arg Trp Leu Lys 180 185 190 ASP Gly Lys Glu Phe Lys Pro Asp His Arg lie Gly Gly Tyr Lys Val 195 200 205
Arg Tyr Ala Thr Trp Ser lie lie Met Asp ser val val pro ser asp 210 215 220
Lys Gly Asn Tyr Thr Cys lie Val Glu Asn Glu Tyr Gly ser lie Asn 225 230 235 240
His Thr Tyr Gin Leu Asp Val val Glu Arg Ser Pro His Arg Pro lie 245 250 ‘ 255
Leu Gin Ala Gly Ley Pro Ala Asn Lys Thr val Ala Leu Gly ser Asn 260 265 270
Val Glu Phe Met Cys Lys Val Tyr ser Asp Pro Gin Pro His lie Gin 275 280 285
Trp Ley Lys His lie Glu vai Asn Gly Ser Lys lie Gly Pro Asp Asn 290 295 300 lou Pro Tyr val Gin lie Leu Lys Thr Ala Gly val Asn Thr Thr Asp 305 310 315 320 tys Glu Met Glu val Leu His Leu Arg Asn val ser Phe Glu Asp Ala 325 330 335
Gly Glu Tyr Thr Cys Leu Ala Gly Asn Ser lie Gly Leu ser His His 340 345 330 ser Ala Trp Leu Thr val Leu Glu Ala Leu Glu Glu Arg Pro Ala val 355 360 365
Met Thr ser Pro Leu Tyr Leu Glu Tie lie lie Tyr cys Thr Gly Ala 370 375 380
Phe Leu He ser cys wet val Gly Ser val lie val Tyr Lys Met Lys 385 390 395 400
Ser Gly Thr Lys Lys ser Asp Phe His Ser Gin Met Ala val His Lys 405 410 415
Leu Ala Lys Ser lie pro Leu Arg Arg Gin Val Ser Ala Asp ser ser 420 425 430
Ala Ser Met Asn Ser Gly val Leu Leu val Arg Pro Ser Arg Leu ser 435 440 445
Ser Ser Gly Thr Pro Met Leu Ala Gly Val Ser Glu Tyr Glu Leu pro 450 455 460
Glu Asp Pro Arg Trp Glu Leu Pro Arg Asp Arg Leu val Leu Gly tys 465 470 475 480
Pro Leu Gly Glu Gly Cys Phe Gly Gin val Val Leu Ala Glu Ala He 485 490 495
Gly Leu Asp Lys Asp Lys Pro Asn Arg val Thr Lys val Ala Val Lys 500 505 510
Met Leu Lys ser Asp Ala Thr Glu Lys Asp Leu ser Asp Leu lie Ser 515 520 525
Glu Met Glu Met Met Lys Met He Gly Lys His Lys Asn He He Asn 530 535 ‘ 540
Leu Leu Gly Ala cys Thr Gin Asp Gly Pro Leu Tyr val lie val Glu 345 550 555 560
Tyr Ala ser tys Gly Asn Leu Arg Glu Tyr Leu Gin Ala Arg Arg Pro 565 570 57Ϊ
Pro Gly Leu Glu Tyr Cys Tyr Asn Pro Ser His Asn Pro Glu Glu Gin 580 585 590
Leu Ser Ser tys Asp Leu val ser cys Ala Tyr Gin val Ala Arg Gly 59S 600 605
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Gly Leu Ala Arg Asp lie His His lie Asp Tyr Tyr Lys t.ys Thr Thr 645 650 655 asp Gly Arg Leu Pro Val Lys Trp Met Ala Pro Glu Ala Leu Phe Asp 660 665 670
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<210> 37 <211> 821 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 mt vai Ser jrp Gly Arg Phe lie cys Ley vai vai vai Thr mt Ala 1 5 10 15
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Asp pro Met Pro Tyr Glu Pro cys Leu Pro Gin Tyr Pro His lie Asn 805 810 815
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<210> 38 <211> 806 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38
Met Gly Ala Pro Ala cys Ala Ley Ala Ley Cys val Ala val Ala lie 1 5 10 15 val Ala sly Ala ser ser Glu ser Leu Gly Thr sly Gin Are val val 20 25 30
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Lys Lys Leu Leu Ala Val Pro Ala Ala Asn Thr Val Arg Phe Arg Cys 165 170 175 pro Ala Ala Gly Asn pro Thr Pro ser lie ser Trp Leu Lys Asn Gly ISO 185 190
Arg Glu Phe Arg Gly Glu His Arg lie Gly Gly lie Lys Leu Arg His 195 200 203
Gin Gin Trp ser Leu val wet Glu ser val val Pro ser Asp Arg Gly 210 215 220 A$n Tyr Thr cys val val Glu Asn Lys Phe Gly ser lie Arg Gin rhr 225 230 235 240
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370 375 3SO
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Gly Asn Leu Arg Glu Phe Leu Arg Ala Arg Arg pro pro Gly Leu Asp 565 570 575
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<210> 39 <211> 802 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39
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<210> 40 <211> 509 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40
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Gly Ser Gly Leu Pro Phe Leu Val Gin Arg Thr Val Ala Arg Girt lie 195 200 205
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Gly Ser Trp Gin Gly Gly Asn val Ala val Lys He Phe Ser Ser Arg 225 230 235 240
Asp Glu Lys Ser Tfp Phe Arg Glu Thr Glu Leu Tyr Asn Thr val Net 245 250 255
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Lys lie Asp Asn ser Leu Asp Lys Leu Lys Thr Asp cys 500 505
<210> 41 <211> 505 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41
Met Ala Glu ser Ala sly Ala ser ser Phe Phe Pro Ley val val Leu 1 5 10 15
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Gly lie lie Ala Gly Pro val Phe Leu Leu Phe Leu lie lie lie lie 130 135 140 val Phe Leu val tie Asn Tyr His Gin Arg val Tyr His Asn Arg Gln 145 150 155 160
Arg Leu ASp Met Glu Asp Pro Ser CvS Glu Met tys Leu Ser Lys Asp 165 170 175
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Ser Gly Leu Pro Leu Phe Val Gin Arg Thr Val Ala Arg Thr lie Val 195 200 205
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325 330 33S
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Asp Leu Gly Leu Ala val Arg His Asp Ala val Thr Asp Thr lie Asp 355 360 365 lie Ala Pro Asn Gin Arg val Gly Thr Lys Arg Tyr Met Ala Pro Glu 370 375 ' 380 val Leu Asp Glu Thr lie Asn Met Lys His Phe Asp Ser Phe Lys Cys 385 390 395 400
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Gly Ala Ala Arg Leu Thr Ala Leu Arg lie Lys Lys Thr Leu Ser Gin 485 490 495
Leu Ser Vai Gin Glu Asp vai Lys lie 500 5Ô5
<210> 42 <211> 513 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42
Met Gly Ala Ala Ala Lys Ley Ala Phe Ala val Piie Leu lie ser cys
I S 10 IS ser ser sly Ala lie ley sly Arg ser sly Thr sin Glu cys Leu Phe 20 25 30
Phe Asn Ala Asm Trp Glu lys Asp Are Thr Asn sin Thr sly val Glu 35 40 45 pro cys Tyr sly asp Lys Asp Lys Arp Arg His cys Phe Ala Thr rrp 50 55 60
Lys Asrs lie ser Sly Ser lie Sly lie Val lys sin Sly cys Trp Leu 65 70 75 80
Asp Asp He Asn Cys Tyr Asp Arg Thr Asp Cys Val Slu Lys Lys Asp 85 90 95
Ser Pro Glu Val Tyr Phe Cys Cys Cys Glu Gly Asn Met Cys Asn Glu 100 105 110
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Tyr Arg His His Lys Met Ala tyr pro Pro val Leu val Pro Thr Gin 165 170 175
Asp Pro Gly Pro Pro Pro Pro Ser Pro Leu Leu Gly Leu Lys Pro Leu 180 185 190
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Ala Gin Leu Leu A$n Glu Tyr val Ala val Lys lie Phe Pro lie Gin 210 215 220
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Leu Arg His Trp Leu Leu Leu Phe lie Ser val val Leu Ala cys 1025 1030 1035
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Gly lie lie Val Net Val Leu Ala Leu Net Thr val Glu Leu Phe 1055 1060 1065
Gly Net Met Gly Leu lie Gly lie tvs Leu Ser Ala Val Pro Val 1070 1075 1080 val lie Leu lie Ala Ser Val Gly lie Gly Val Glu Phe Thr val 10S5 1090 1095
His Val Ala Leu Ala Phe Leu Thr Ala lie Sly Asp Lys Asn Arg 1100 1105 1110
Arg Ala val Leu Ala Leu Glu His Net Phe Ala Pro val Leu Asp 1115 1120 1125
Gly Ala Val Ser Thr Leu Leu Gly Val Leu Net Leu Ala Gly Ser 1130 1135 1140
Glu Phe Asp Phe lie val Arg Tyr Phe Phe Ala Val Lee Ala He 1145 1150 1155
Leu Thr lie Leu Gly val Leu asp Gly Leu val Leu Leu pro val 1160 1165 1170
Leu Leu Ser Phe Phe Gly Pro Tyr Pro Glu Val Ser Pro Ala Asm 1175 1180 1185
Gly Leu Asn Arg Leu Pro Thr Pro ser Pro Glu Pro Pro Pro Ser 1190 1195 1200
Val val Arg Phe Ala Met Pro Pro Gly His Thr His ser Gly ser 1205 1210 1215
REIVINDICAÇÕES 1. Exossoma de entrega terapêutica caracterizado por compreender um constructo de polipéptido fixado à sua membrana, em que o constructo de polipéptido compreende, pelo menos, um polipéptido transportador fundido com, pelo menos, um recetor armadilha de polipéptido terapêutico presente, pelo menos, parcialmente no exterior do exossoma de entrega e em que o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico não tem sinalização. 2. Exossoma de entrega terapêutica, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o constructo de polipéptido ser um constructo de polipéptido transmembranar. 3. Exossoma de entrega terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico ser fundido com o polipéptido transportador por meio de uma ligação química selecionada a partir do grupo que compreende uma ligação de péptido (amida), uma ligação de tioéter, uma ponte de dissulfureto, uma interação biotina-estreptavidina e qualquer combinação das mesmas. 4. Exossoma de entrega terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o pelo menos um polipéptido transportador ser selecionado a partir de Lamp2b, CD9, CD81, CD63, sindecano, sinaptotagmina, ALIX, sintenina e qualquer combinação dos mesmos. 5. Exossoma de entrega terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizado por o pelo menos um recetor armadilha de polipéptido terapêutico ser

Claims (7)

  1. selecionado a partir do grupo que compreende recetores a partir das seguintes famílias de recetor: insulina, PDGF, FGF, EGF, VEGF, HGF, TRK, EPH, AXL, LTK, TIE, ROR, DDR, RET, KLG, PTCHl, RYK, MuSK, activina, TGF do Tipo I, TGF do Tipo II e TNF, interleucina (IL) e qualquer combinação das mesmas.
  2. 6. Exossoma de entrega terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser para utilização na medicina.
  3. 7. Exossoma de entrega terapêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por ser para utilização no tratamento e/ou profilaxia de doença de Crohn, colite ulcerosa, artrite reumatoide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistémico, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática, psoríase, síndrome periódica associada ao recetor do fator de necrose tumoral (TRAPS)(TNF), deficiência do antagonista recetor de interleucina-1 (DIRA), endometriose, hepatite autoimune, esclerodermia, miosite, acidente vascular cerebral, lesão aguda da medula espinhal, vasculite, síndrome de Guillain-Barré, enfarte do miocárdio agudo, ARDS, septicemia, meningite, encefalite, insuficiência do fígado, insuficiência renal, doença do enxerto versus hospedeiro, distrofia muscular de Duchenne e outras doenças musculares, caquexia induzida por cancro, anorexia, diabetes mellitus, doenças e/ou distúrbios neuro-inflamatórios, cancro (por exemplo, cancro sensível a EGF, VEGF, FGF), cancro do cólon, cancro da mama e glioma.
  4. 8. Composição farmacêutica caracterizada por compreender um exossoma de entrega terapêutica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, e pelo menos um excipiente farmaceuticamente aceitável.
  5. 9. Método para purificar exossomas de entrega terapêutica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender as etapas de: (i) expor uma amostra que compreende, pelo menos, um exossoma de entrega terapêutica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, à ultrafiltração; (ii) expor a amostra obtida a partir da etapa (i) para cromatografia liquida por exclusão de tamanho.
  6. 10. Método para aumentar o rendimento de produção de exossomas de entrega terapêutica, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado por compreender expor células de produção na vesícula, a partir das quais os exossomas de entrega terapêutica são para serem obtidos para, pelo menos, um inibidor de autofagia.
  7. 11. Método, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por o pelo menos um inibidor de autofagia ser selecionado a partir do grupo que compreende inibidores de beclina-1, inibidores de PI3K (por exemplo, 3-metiladenina), inibidores de fusão entre autofagossoma e lisossoma (por exemplo, Bafilomicina A e cloroquina) e qualquer combinação dos mesmos.
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