BR112020006960A2 - exossomas compreendendo terapêuticos de rna - Google Patents

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Lorenzo Errichelli
Dhanu GUPTA
Justin Hean
Joel NORDIN
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Evox Therapeutics Ltd
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Abstract

A presente invenção diz respeito a agentes terapêuticos de vesícula extracelular (EV), em que as EVs compreendem agentes terapêuticos a base de ácido nucleico (NA) tais como moléculas de mRNAs, RNAs circulares, miRNAs, sh RNAs, RNA e/ou DNA circular. Os agentes terapêuticos NA são carregados em EVs usando proteína geneticamente modificada e estratégias inventivas de modificação genética de NA para intensificar o carregamento em EVs e facilitar a liberação nas moléculas cargas de NA dentro das células alvos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para: “EXOSSOMAS COMPREENDENDO TERAPÊUTICOS DE RNA” Campo Técnico
[001] A presente invenção diz respeito a agentes terapêuticos de vesícula extracelular (EV), em que as EVs compreendem agentes terapêuticos de RNA endogenamente carregados tais como mMRNAs, RNAs circulares, miRNAs, SshRNAs e vários outros agentes terapêuticos de RNA.
Fundamentos da invenção
[002] Agentes terapêuticos a base de ácido nucleico estão se aproximando de utilidade clínica a um passo rápido. Terapias genéticas, terapias a base de mRNA, agentes terapêuticos a base de oligonucleotídeo curto e SiRNA são apenas alguns exemplos na pletora de modalidades no cenário de agentes terapêuticos de RNA. Como ácidos nucleicos nus, tipicamente RNA, são difíceis de administrar in vivo por causa da rápida depuração, atividade de nuclease, falta de distribuição específica de órgão, e baixa eficácia de captação celular, veículos de administração especializados são normalmente obrigatórios como um meio de atingir administração bioativa. Isto é especialmente o caso para alvos não hepáticos e para agentes terapêuticos de RNA de alto peso molecular tais como terapia de mRNA e gene.
[003] Vesículas extracelulares (tais como exossomas) são tipicamente vesículas de dimensões nanométricas produzidas pela maioria dos tipos de células e funcionando como o sistema de transporte natural do corpo para proteínas, ácidos nucleicos, peptídeos, lipídios, e várias outras moléculas entre células. EVs contendo RNA têm inúmeros usos terapêuticos potenciais e já estão sendo investigados como veículos de administração para terapia gênica, administração de mRNA, e administração de ácidos nucleicos curtos em vários ambientes. WO2010/119256 representa a invenção fundamental no campo de administração de ácido nucleico usando exossomas e o dito pedido preceitua a utilidade de exossomas para administração de diversos tipos de carga de ácido nucleico. O pedido não publicado PCT/GB2017/051479 preceitua métodos melhorados para carregamento endógeno de vários tipos de agentes terapêuticos de RNA com a ajuda de proteínas de ligação de RNA, que arrastam RNA de interesse para EVs que formam nas células parentais US14/502.494 representa um outro método para utilizar proteínas de ligação de RNA para carregar certas espécies de RNA, utilizando o assim chamado sistema de Carregamento de Exossoma Alvejado e Modular (TAMEL).
[004] Entretanto, a despeito desses avanços, existe ainda ambiente significante na técnica para melhor carregamento de grandes e pequenas cargas de RNA em EVs de uma maneira específica e eficaz. Além disso, a real administração bioativa em células alvo é um aspecto chave de qualquer sistema de administração e a técnica anterior tem ambiente para melhoria também a este respeito.
[005] O sistema de carregamento TAMEL descrito em US14/502.494 e a referência de literatura correspondente (Hung and Leonard, Journal of Vesicle Extracellular 2016, 5:31027) tem inúmeras desvantagens que a presente invenção tenta superar. A principal desvantagem do sistema TAMEL é que ele é incapaz de alcançar a administração funcional de MRNA, isto é, o MmMRNA carregado nos exossomas pelo sistema TAMEL não é traduzido pelas células quando células são expostas a esses exossomas. O presente pedido alcança administração bioativa do mMRNA da carga.
[006] Tutuccei et al (um sistema MS2 melhorado para reportagem precisa o ciclo de vida de mRNA. Nat Methods 2018 Jan; 15(1): 81 -89) discutem o uso da proteína MS2 para estudar localização de RNA e ciclo de vida e indica que a proteína MS2 como usada pelo sistema TAMEL se liga com afinidade muito alta ao RNA. Essa ligação firme é reportada por esse trabalho por ser problemático para o estudo de regulação de mMRNA. Supomos que nesse contexto de carregamento de EV essa ligação de alta afinidade é novamente problemática em virtude de a ligação firme de MS2 significar que nenhum RNA/ácido nucleico que é carregado será liberado. Liberação preventiva de mRNA prevenirá tradução normal e isso explicaria por que nenhuma tradução do mRNA é observada em US14/502.94.
[007] O sistema TAMEL parece não carregar todos os exossomas com ácidos nucleicos e os que são carregados são carregados com números muito pequenos de ácidos nucleicos (desvantagens desse nível de carregamento variável e baixo são discutidos em detalhe a seguir). Esses níveis variáveis e baixos de carregamento combinados com o fato de que pouco ácido nucleico que é carregado provavelmente é então liberado e, portanto, não bioativo significa que o sistema TAMEL tem muitas desvantagens. O sistema TAMEL não é adequado para carregamento e administração de quantidades clinicamente relevantes de ácidos nucleicos bioativos. A presente invenção supera essas desvantagens significantes.
[008] Uma outra desvantagem do sistema TAMEL é que ele emprega proteínas de bacteriófago que podem elicitar respostas imunológicas indesejáveis quando as EVs produzidas são administradas a pacientes. A presente invenção supera essa desvantagem também.
Sumário da invenção
[009] É consequentemente um objetivo da presente invenção superar os problemas identificados anteriormente associados com carregamento e administração mediada por EV subsequente de agentes terapêuticos a base de ácido nucleico (NA) nas células alvos, e satisfazer as necessidades existentes na técnica, por exemplo, permitir alcançar o correto compartimento intracelular com um agente terapêutico de NA em questão.
[0010] A presente invenção alcança isso utilizando tecnologia de modificação genética de EV inédita para carregar e liberar carga de NA. Isso é alcançado por modificação genética avançada de construto de polipeptídeo e polinucleotídeo para possibilitar não apenas carregamento altamente eficiente nas EVs, mas também liberação eficaz do NA em questão. Em um primeiro aspecto, isso é alcançado provendo uma vesícula extracelular (EV) compreendendo pelo menos um polipeptídeo de fusão compreendendo pelo menos um domínio de ligação de ácido nucleico (NA) e pelo menos um polipeptídeo exossômico, em que pelo menos um domínio de ligação de NA é uma ou mais de homologia de proteína Pumilio e FBF (PUF), Cas6, e/ou um domínio de ligação de aptâmero de NA, ou quaisquer derivados e/ou domínios e/ou análogos dos mesmos. O domínio de ligação de NA pode vantajosamente estar presente em diversas cópias, e cada molécula carga de NA pode também estar presente em múltiplas cópias com toda e qualquer cópia tendo uma pluralidade de sítios de ligação para o domínio de ligação de NA. Importantemente, os domínios de ligação de NA que formam parte do polipeptídeo de fusão e que são responsáveis pela interação com a molécula carga de NA são domínios de ligação de NA liberáveis, significando que sua ligação da molécula carga de NA é uma interação liberável, reversível. A natureza liberável da ligação entre o domínio de ligação de NA e a molécula carga de NA é particularmente vantajosa uma vez que os presentes inventores perceberam que sobre-expressão da molécula carga de NA em células produtoras de EV permite concentrações locais suficientemente altas para possibilitar interação entre o domínio de ligação de NA e a molécula carga de NA, enquanto a menor concentração da molécula de ligação de NA localização alvo (tal como dentro de um célula alvo) permite liberação eficaz da molécula de NA, permitindo sua administração bioativa.
[0011] A presente invenção também se refere a construtos de polipeptídeo de fusão inventivos per se, e também construtos de polinucleotídeo que codificam para tais polipeptídeos. Além disso, a presente invenção se refere a construtos de polinucleotídeo que codificam para os construtos de polipeptídeo em questão, bem como polinucleotídeos de carga de NA que são modificados geneticamente para estabilidade e potência intensificada.
[0012] Em aspectos adicionais, a presente invenção se refere a populações de EVs compreendendo os construtos de polipeptídeo de fusão e moléculas cargas de NA, bem como composições farmacêuticas de EVs, populações de EV, construtos de polinucleotídeo e/ou polipeptídeo, e/ou células e/ou outros vetores (tal como vírus como adenovírus, AAVs, os lentivírus, HSV, RSV, etc.) contendo qualquer uma das biomacromoléculas anteriores.
[0013] Ainda em um outro aspecto, a presente invenção se refere a métodos para produzir EVs como pela invenção. Tais métodos podem compreender pelo menos as etapas de (i) introduzir em uma célula produtora de EV pelo menos um construto de polinucleotídeo adequado, (ii) expressar na célula produtora de EV pelo menos um construto de polipeptídeo codificado por pelo menos um construto de polinucleotídeo, e (iii) coletar da célula produtora de EV EVs compreendendo o polipeptídeo obtenível por meio da etapa (ii). Adicionalmente, a presente invenção também se refere a um método in vitro para administração intracelular de pelo menos uma molécula carga de RNA, em que o dito método compreende colocar uma célula alvo (tipicamente uma população de célula alvo) em contato com pelo menos uma EV e/ou pelo menos uma população de EVs.
[0014] Em resumo, a presente invenção provê a estratégias de carregamento e liberação inéditas para administração mediada por EV de uma pluralidade de cargas de agentes terapêuticos de NA. Vantajosamente, a presente invenção usa proteínas que são todas altamente conservadas dentre os eucariotos e são, portanto, prováveis de causar respostas imunes adversas quando administradas aos pacientes.
Breve descrição das figuras
[0015] Figura 1: Ilustração esquemática de uma EV carregada com uma molécula carga de NA usando os construtos de polipeptídeo de fusão como pela presente invenção.
[0016] Figura 2: Gráfico mostrando carregamento, em EVs derivadas de MSC, de moléculas cargas de mRNA que codificam NanoLuc (RTM) e p2l, usando construtos de polipeptídeo de fusão compreendendo CD63 como o polipeptídeo exossômico e PUF (nesse caso o domínio PUF de ligação de NA é obtido da proteína PUM1I humana) ou Cas6 como os domínios de ligação de NA. O experimento também incluiu números variados de sítios de ligação para os domínios de ligação de NA, a saber, O, 3 e 6 sítios de ligação. A expressão apenas do polipeptídeo exossômico CD63 não resultou em carregamento de nenhum mRNA nas EVs (direita). Expressão de polipeptídeos de fusão compreendendo PUF (conjunto a esquerda das colunas: dois domínios de PUFs flanqueando CD63 tanto N terminalmente quanto C terminalmente, isto é, 4 construtos de PUF no total) (segundo conjunto de colunas da esquerda: um domínio PUF flanqueando CD63 tanto N terminalmente quanto C terminalmente) e Cas6 mutado (segundo da direita) não resultaram em carregamento de mRNA significante tanto de NanoLuc (RTM) quanto de mRNAs p21 mediante expressão nas células da fonte de EV. O carregamento de NanoLuc (RTM) foi no geral mais eficaz que o carregamento de p21, com até cerca de 45 cópias de mMRNA por EV.
[0017] Figura 3: Silenciamento de expressão genética in vitro em células alvo mediante administração mediada por EV de um ShRNA alvejando huntingtina As células amnióticas foram modificadas geneticamente para expressar o ShRNA e construtos de polipeptídeo de fusão compreendendo como domínio de ligação tanto de PUF de NA (obtido de proteína PUM de humano) quanto Cas6, combinados com CD63 ou CD81 como os polipeptídeos de EV, respectivamente. As AE- EVs foram coletadas da cultura celular e adicionadas às células alvos in vitro. O eixo geométrico Y mostra como o nível de expressão de huntingtina é diminuído com números crescentes de sítios de ligação na molécula carga de NA, resultando em aproximadamente 80% de eliminação usando um polipeptídeo de fusão compreendendo PUF-CD63-PUF para carregar o ShRNA anti-huntingtina.
[0018] Figura 4: Expressão de NanoLuc (RTM) como um sistema repórter em células Huh7 alvo após administração de HEK mediada por EV de um mRNA NanoLuc (RTM). A molécula de NanoLuc (RTM) da carga de RNA foi modificada geneticamente para compreender 0, 3, ou 6 sítios de ligação para os domínios de ligação de NA compreendendo os construtos de polipeptídeo de fusão, nesse caso PUFx2-CD63-PUFx2 (dois polipeptídeos de ligação de NA em PUF inseridos tanto N terminalmente quanto C terminalmente do polipeptídeo exossêmico CD63), PUF-CD63-PUF, e Cas6-CD9-Cas6. O eixo geométrico Y mostra unidades de brilho relativo (luminescência) (RLU) normalizadas sobre pg de proteína, indicando administração e/ou tradução intensificada com números crescentes de sítios de ligação PUM1I de humano e também uma PUF de ligação de NA obtida da proteína Pumilio de D melanogaster foi avaliada nesse ensaio.
Figura 5: Sequências de SEQ ID No's 1 a 6 Descrição detalhada da invenção
[0019] A presente invenção se refere a carregamento melhorado, liberação controlada, e eficácia intensificada de agentes terapêuticos de NA administrados em EV, usando abordagens de modificação genética inéditas para introduzir e administrar carga de NA em uma maneira bioativa em células alvo in vitro e/ou in vivo.
[0020] Por conveniência e clareza, certos termos empregados aqui são coletados e descritos a seguir. A menos que de outra forma definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado comumente entendido pelos versados na técnica aos quais essa invenção diz respeito.
[0021] Onde recursos, aspectos, modalidades, ou alternativas da presente invenção são descritos em termos de grupos Markush, um versado na técnica perceberá que a invenção é também por meio disso descrita em termos de qualquer membro individual ou subgrupo de membros do grupo Markush.
Versados na técnica perceberão adicionalmente que a invenção é também por meio disso descrita em termos de qualquer combinação de membros individuais ou subgrupos de membros de grupos Markush.
Adicionalmente, deve-se notar que modalidades e recursos descritos com relação a um dos aspectos e/ou modalidades da presente invenção também se aplicam mutatis mutandis a todos os outros aspectos e/ou modalidades da invenção.
Por exemplo, deve-se entender que os polipeptídeos de fusão descritos aqui com relação às EVs são revelados, relevantes e compatíveis com todos os outros aspectos, preceitos e modalidades aqui, por exemplo, aspectos e/ou modalidades relacionados aos métodos para produção ou às EVs, ou relacionados aos construtos de polinucleotídeo correspondentes descritos aqui.
Além disso, certas modalidades descritas com relação a certos aspectos, por exemplo, as vias de administração das EVs compreendendo os polipeptídeos de fusão e opcionalmente a molécula carga de fármaco de NA, como descrito em relação aos aspectos relativos ao tratamento de certas indicações médicas, podem naturalmente também ser relevantes com relação a outros aspectos e/ou modalidade tal como os relativos a composições farmacêuticas.
Além disso, todos os polipeptídeos e proteínas identificados aqui podem ser livremente combinados em proteínas de fusão usando estratégias convencionais para fundir polipeptídeos.
Como exemplo não limitante, domínios de ligação de NA (que são de origens de polipeptídeo) descritos aqui podem ser livremente combinados em qualquer combinação com um ou mais polipeptídeos exossomais, opcionalmente combinados com todos os outros domínios de polipeptídeo, regiões, sequências, peptídeos, grupos aqui, por exemplo, quaisquer domínios de multimerização, domínios de liberação, e/ou peptídeos de alvejamento.
Também, polipeptídeos exossomais e/ou domínios de ligação de NA podem ser combinados um com o outro para gerar construtos compreendendo mais que um polipeptídeo exossômico e/ou mais que um domínio de ligação de NA.
Além do mais, todo e qualquer recurso (por exemplo, todo e qualquer membro de um grupo Markush) pode ser livremente combinado com todo e qualquer outro recurso (por exemplo, todo e qualquer membro de qualquer outro grupo Markush), por exemplo, qualquer domínio de ligação de NA pode ser combinado com qualquer polipeptídeo exossômico.
Além disso, quando preceitos aqui se referirem a EVs no singular e/ou a EVs como vesículas tipo nanopartícula naturais discretas, deve-se entender que todos os tais preceitos são igualmente relevantes e aplicáveis a uma pluralidade de EVs e populações de EVs.
Como uma observação geral, os domínios de ligação de NA, os polipeptídeos exossomais, as fontes de célula produtora de EV, os domínios e peptídeos adicionais, a molécula carga de NA, e todos os outros aspectos, modalidades, e alternativas de acordo com a presente invenção podem ser livremente combinados em todo e qualquer combinações possíveis sem desviar do escopo e da essência da invenção.
Além disso, qualquer polipeptídeo ou Ppolinucleotídeo ou quaisquer sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos (sequências de aminoácidos ou sequências de nucleotídeos respectivamente) da presente invenção podem desviar consideravelmente dos polipeptídeos, polinucleotídeos e sequências originais desde que qualquer dada molécula retenha a capacidade de realizar o efeito técnico desejado associado com a mesma.
Desde que suas propriedades biológicas sejam mantidas, as sequências de polipeptídeo e/ou polinucleotídeos de acordo com o presente pedido podem desviar no máximo 50% (calculado usando, por exemplo, BLAST ou ClustalW) comparadas com a sequência nativa, embora uma identidade de sequência que é tão alta quanto possível seja preferível (por exemplo, 60%, 70%, 80%, ou por exemplo, 90% ou mais). A combinação (fusão), por exemplo, de diversos polipeptídeos implica que certos segmentos dos respectivos polipeptídeos podem ser substituídos e/ou modificados e/ou que as sequências podem ser interrompidas por inserção de outros trechos de aminoácido, significando que o desvio da sequência nativa pode ser considerável, desde que as propriedades chaves (por exemplo, ligação de NA, tráfico para EVs, capacidades de alvejamento, etc.) sejam conservadas.
Raciocínio similar assim naturalmente se aplica às sequências de polinucleotídeos que codificam para tais polipeptídeos.
Quaisquer números de acesso ou SEQ ID NOs mencionados aqui com relação aos peptídeos, polipeptídeos e proteínas devem ser vistos apenas como exemplos e apenas para informação, e todos os peptídeos, polipeptídeos e proteínas devem ter seu significado ordinário como os versados na técnica os entenderiam.
Assim, como mencionado anteriormente, os versados na técnica também entenderão que a presente invenção engloba não meramente a SEQ ID NOs e/ou números de acesso específicos referidos “aqui, mas também variantes e derivados dos mesmos.
Todos os números de acesso referidos aqui são números de acesso de UniProtKB, e todas as proteínas, polipeptídeos, peptídeos, nucleotídeos e polinucleotídeos mencionados aqui devem ser considerados de acordo com seu significado convencional como entendido por versados na técnica.
[0022] Deve-se entender que as expressões "vesícula extracelular" ou "EV" ou "exossoma" são usadas indiferentemente aqui e se relacionam a qualquer tipo de vesícula que seja obtenível de uma célula em qualquer forma, por exemplo, uma microvesícula (por exemplo, qualquer vesícula desprendida da membrana plasmática de uma célula), um exossoma (por exemplo, qualquer vesícula derivada do trajeto endo-lisossomal), um corpo apoptótico (por exemplo, obtenível de células apoptóticas), uma micropartícula (que pode ser derivada de, por exemplo, plaquetas), um ectossoma (derivável de, por exemplo, neutrófilos e monócitos em soro), prostatossoma (por exemplo, obtenível de células de câncer de próstata), ou um cardiossoma (por exemplo, derivável de células cardíacas), etc.
Os tamanhos de EVs podem variar consideravelmente, mas uma EV tipicamente tem um diâmetro hidrodinâmico de dimensão nanométrica, isto é, um diâmetro abaixo de 1.000 nm.
Claramente, EVs podem ser derivadas de qualquer tipo de célula, in vivo, ex vivo, e in vitro.
As EVs preferidas incluem exossomas e microvesículas, mas outras EVs podem também ser vantajosas em várias circunstâncias.
Além disso, deve-se entender também que os ditos termos se referem a miméticos de vesícula extracelular, vesículas a base de membrana de célula obtidas através de, por exemplo, extrusão de membrana, sonicação, ou outras técnicas, etc.
Ficará claro aos versados na técnica que, durante a descrição de usos médicos de científicos e aplicações das EVs, a presente invenção normalmente se refere a uma pluralidade de EVs, isto é, uma população de EVs que pode compreender milhares, milhões, bilhões ou ainda trilhões de EVs Como pode-se ver pela seção experimental a seguir, EVs podem estar presentes em concentrações tais como 105< 108%, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1018, 1025,1030 EVsS (frequentemente denominadas "partículas") por unidade de volume (por exemplo, por mL), ou qualquer outro número maior, menor ou qualquer entre eles.
Na mesma veia, deve-se entender que o termo "população", que pode, por exemplo, se referir a uma EV compreendendo um certo polipeptídeo de fusão entre um polipeptídeo exossômico e um domínio de ligação de NA que por sua vez pode ser ligação em molécula carga de NA de interesse, deve englobar uma pluralidade de entidades constituindo uma população como essa.
Em outras palavras, EVs individuais quando presentes em uma pluralidade constituem uma população de EV.
Assim, naturalmente, a presente invenção se refere tanto a EVs individuais quanto populações compreendendo EVs, como ficará claro aos versados na técnica.
As dosagens de EVs quando aplicadas in vivo podem naturalmente variar consideravelmente dependendo da doença a ser tratada, da via de administração, da atividade terapêutica, efeitos, e potência da molécula carga de NA, quaisquer frações de alvejamento presentes nas EVs, da formulação farmacêutica, etc.
Além disso, as EVs da presente invenção podem também compreender “agentes terapêuticos adicionais, além da molécula carga de NA.
Em algumas modalidades, o agente terapêutico adicional pode ser pelo menos um fármaco terapêutico de molécula pequena.
Em algumas modalidades, o fármaco terapêutico de molécula pequena pode ser selecionado do grupo que consiste em agentes prejudiciais ao DNA, agentes que inibem síntese de DNA, microtúbulo e agentes de ligação de tubulina, antimetabólitos, indutores de dano oxidante, antiangiogênicos, terapias endócrinas, antiestrógenos, imunomoduladores tais como agonistas ou antagonistas do receptor tipo Toll, inibidores de histona deacetilase, inibidores de transdução de sinal tais como inibidores de quinases, inibidores de proteínas de choque térmico, retinoides, inibidores de receptores do fator de crescimento, compostos antimitóticos, anti-inflamatórios, reguladores de ciclo celular, inibidores de fator de transcrição, e indutores de apoptose, e qualquer combinação dos mesmos.
Em modalidades adicionais, o agente terapêutico adicional pode ser um agente a base de ácido nucleico terapêutico adicional.
Tais agentes terapêuticos a base de ácido nucleico adicionais podem ser selecionados do grupo compreendendo RNA ou DNA de fita única, RNA ou DNA de fita dupla, oligonucleotídeos tal como siRNA, RNA de montagem- comutação, fitas guias CRISPR, RNA em gancho curto (shRNA), mMiRNA, oligonucleotídeos —antissentido, polinucleotídeos tais como mMRNA, plasmídeos, ou qualquer outro vetor de RNA ou DNA.
De particular interesse são agentes a base de ácido nucleico que são quimicamente sintetizados e/ou que compreendem nucleotídeos quimicamente modificados tais como 2'-O-Me, 2'-O-Alila, 2'-O-MOE, 2'-F, 2'-CE, 2'-EA 2'-FANA, LNA, CLNA, ENA, PNA, fosforotioatos, triciclo-DNA, etc.
Ainda em modalidades adicionais, as EVs como pela presente invenção podem compreender agentes terapêuticos adicionais que podem ser proteínas e/ou peptídeos.
Tais proteínas e/ou peptídeos podem estar presentes dentro das EVs, inseridas na membrana de EV ou em associação com a membrana de EV, ou podem estar se salientando da EV para a ambiente extravesicular.
Tais agentes terapêuticos de proteína e/ou peptídeo podem ser selecionados de um grupo de exemplos não limitantes incluindo: anticorpos, intracorpos, fragmentos variáveis de cadeia única (scFv), aficorpos, anticorpos bi e multiespecíficos ou ligantes, aficorpos, darpinas, receptores, ligantes, enzimas para, por exemplo, terapia de reposição de enzima ou edição genômica, supressores de tumor (exemplos não limitantes incluem p53, p21, pVHL, APC, CD95, ST5, YPEL3, ST7, e/ou ST15) inibidores virais ou bacterianos, proteínas de componente celular, proteínas de ligação de DNA e/ou RNA, inibidores de reparo de DNA, nucleases, proteinases, integrases, fatores de transcrição, fatores de crescimento, inibidores e indutores de apoptose, toxinas (por exemplo, exotoxinas pseudomonas), proteínas estruturais, fatores neurotróficos tal como NT3/4, fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e fator de crescimento do nervo (NGF) e suas subunidades individuais tal como a subunidade 258 beta, canais de íon, transportadores de membrana, fatores de proteostase, proteínas envolvidas em sinalização celular, proteínas relacionadas a tradução e transcrição, proteínas de ligação de nucleotídeo, proteínas de ligação de proteína, proteínas de ligação de lipídio, glicosaminoglicanos (GAGs) e proteínas de ligação de GAG, proteínas metabólicas, proteínas regulatórias de estresse celular, proteínas regulatórias de inflamação e sistema imune, proteínas mitocondriais, e proteínas de choque térmico, etc.
[0023] Deve-se entender que as expressões "polipeptídeo exossômico", "proteína exossômica", "proteína carreadora exossômico", "proteína de EV" e "polipeptídeo de EV " são usadas indiferentemente e se referem a qualquer polipeptídeo que pode ser utilizado para transportar um construto de polipeptídeo (que tipicamente compreende, além do polipeptídeo exossômico, um domínio de ligação de NA, por exemplo, um polipeptídeo compreendendo um domínio de ligação de NA) para uma estrutura vesicular adequada, isto é, a uma EV adequada.
Mais especificamente, deve-se entender que esses termos compreendem qualquer polipeptídeo que possibilita transporte, tráfico ou vai e vem de um construto de proteína de fusão para uma estrutura vesicular, tal como uma EV.
Exemplos de tais polipeptídeos exossomais são, por exemplo, CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71 (também conhecido como o receptor de transferrina) e seu domínio de classificação endossomal, isto é, o domínio do receptor de transferrina de classificação endossomal, CD133, CD138 (sindecan-1l), CD235a, ALIX, AARDCl, Sintenina-l, Sintenina-2, Lamp2b, sindecan-2, sindecan-3, sindecan-4, TSPAN8, TSPAN1I4, CD37, CD82, CD1I51, CD231, CD1I02, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCHA4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CDlla, CDllb, CDllc, CDI8/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, receptores de Fc, receptores “de interleucina tais como TNFR e gpl30, imunoglobulinas, componentes de MHC-I ou MHC-II, CD2, CD3 epsilon, CD3 zeta, CD1l3, CDI8, CDl19, CD30, TSG101, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CDl11, CD115, CD1l17, CD1l25, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COLG6Al, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, LICAM, LAMBl, LAMC1, LFA-l, LGALS3BP, Mac-l alfa, Mac-l beta, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTIl A,
VTIl B, outros polipeptídeos exossomais, e quaisquer combinações ou derivados dos mesmos, mas inúmeros outros polipeptídeos capazes de transportar um construto de polipeptídeo para uma EV são compreendidos no escopo da presente invenção. Em diversas modalidades da presente invenção, pelo menos um polipeptídeo exossômico é fundido no domínio de ligação de NA, a fim de formar uma proteína de fusão presente em uma EV para ajudar no carregamento da molécula carga de NA. Tais proteínas de fusão podem também compreender vários outros componentes para otimizar suaí(s) função(ões), incluindo ligantes, domínios transmembranas, domínios citosólicos, domínios de multimerização, etc.
[0024] As expressões "domínio de ligação de NA" ou "polipeptídeo de ligação de NA" ou "proteína de ligação de NA" são usadas indiferentemente aqui e se referem a qualquer domínio que é capaz de se ligar a um trecho de nucleotídeos. Os domínios de ligação de NA podem se ligar a RNA, DNA, oligômeros mistos de RNA e DNA, tipos particulares de NAs tais como sShRNA, miRNA, mRNA, gRNA, Ppri-miRNA, pre-miRNA, RNA circular, piRNA, tRNA, rRNA, SnRNA, IncRNA, ribozimas, DNA minicírculo, DNA de plasmídeo, etc. Além disso, o(s) domínio(s) de ligação de NA pode(m) também se ligar a nucleotídeos quimicamente modificados tais como 2'-O-Me, 2'-O-Alila, 2'-O-MOE, 2'-F, 2'-CE, 2'-EA 2'-FANA, LNA, CLNA, ENA, PNA, fosforotioatos,
triciclo-DNA, etc.
Além disso, os domínios de ligação de NA podem também se ligar tanto a sequências particulares de NAs, a domínios tais como repetições, quanto a motivos de NA, tal como tipo alça de haste ou grampo de cabelo.
Tais sítios de ligação para os domínios de ligação de NA podem ser de ocorrência natural na molécula carga de NA de interesse e/ou podem ser modificados geneticamente na molécula carga de NA para intensificar adicionalmente carregamento de EV e administração bioativa.
A afinidade de ligação do domínio de ligação de NA para o ácido nucleico é de maneira tal que o ácido nucleico seja ligado com afinidade alta o bastante para ser transportado para os exossomas, mas que a afinidade de ligação não seja tão alta a fim de prevenir a liberação subsequente do ácido nucleico na célula alvo de maneira tal que o ácido nucleico fique bioativo uma vez administrado à célula alvo.
Assim, importantemente e completamente contrário à técnica anterior, a presente invenção se refere a EVs carregadas com moléculas cargas de NA com a ajuda de domínios de ligação de NA liberáveis, em que os ditos domínios de ligação de NA formam parte de polipeptídeos de fusão com polipeptídeos exossomais.
Os domínios de ligação de NA da presente invenção foram selecionados para permitir afinidade programável, modificável entre o domínio de ligação de NA e a molécula carga de NA, possibilitando a produção de EVs compreendendo polipeptídeos de fusão compreendendo o domínio de ligação de NA e pelo menos uma molécula carga de NA, em que o domínio de ligação de NA do construto de polipeptídeo de fusão interage em um modo programável, reversível, modificável com a molécula carga de NA, permitindo tanto carregamento nas EVs quanto a liberação da molécula carga de NA, tanto em EVs e/ou em ou com relação às células alvos. Isso é completamente contrário à técnica anterior, que permite meramente carregamento de moléculas de mRNA em exossomas usando a proteína MS2, mas em que a proteína MS2 permanece ligada ao MRNA, inibindo sua liberação e tradução subsequente.
[0025] A presente invenção se refere basicamente a três grupos de domínios de ligação de NA, a saber, proteínas PUF, polipeptídeos associados a CRISPR (Cas) e especificamente Cas6 e Casl3, e vários tipos de aptâmeros de ligação de NA. A presente invenção usa a expressão proteínas PUF para englobar todas as proteínas relacionadas e domínios de tais proteínas (que podem também ser denominadas proteínas PUM), por exemplo, homólogo 1 de Pumilio de humano (PUM1l), PUMx2 ou PUFx2 que são duplicatas de PUM1I, etc., ou quaisquer domínios de ligação de NA obteníveis de quaisquer proteínas PUF (PUM). Proteínas PUF são tipicamente caracterizadas pela presença de oito repetições de PUF consecutivas, cada qual de aproximadamente 40 aminoácidos, frequentemente flanqueadas por duas sequências relacionadas, Cspl e Csp2. Cada repetição tem um 'consenso de núcleo' contendo resíduos aromáticos e básicos.
Todo o agrupamento de repetições de PUF é exigido para ligação de RNA.
Notavelmente, essa mesma região também interage com proteína correguladores, e é suficiente para resgatary/ a uma grande extensão, OS defeitos de um mutante de proteína PUF, que torna as proteínas PUF altamente adequadas para mutações usadas na presente invenção.
Além disso, proteínas PUF são exemplos altamente preferidos de domínios de ligação de NA liberáveis que se ligam com afinidade adequada às moléculas cargas de NA, por meio disso possibilitando uma fixação liberável, reversível da proteína PUF na carga de NA.
As proteínas PUF são encontradas na maioria dos eucariotos e são envolvidas em embriogênese e desenvolvimento.
PUFs têm um domínio que liga RNA que é composto de 8 repetições geralmente contendo 36 aminoácidos, que é o domínio tipicamente utilizado para ligação de RNA nesse pedido de patente.
Cada repetição liga um nucleotídeo específico e é comumente o aminoácido na posição 12 e 16 que confere a especificidade com uma interação de empilhamento a partir do aminoácido 13. Os PUFs de ocorrência natural podem se ligar os nucleotídeos adenosina, uracila e guanosina, e PUFs modificadas geneticamente podem também se ligar o nucleotídeo citosina.
Consequentemente, o sistema é modular e a sequência de 8 nucleotídeos que o domínio PUF liga pode ser mudado comutando a especificidade de ligação dos domínios de repetição.
Consequentemente, as proteínas PUF como pela presente invenção podem ser naturais ou modificadas geneticamente para se ligarem em qualquer lugar em uma molécula de RNA, ou, alternativamente, pode-se escolher proteínas PUF com diferentes afinidades de ligação para sequências diferentes e modificar a molécula de RNA para conter a dita sequência.
Existe além disso domínios PUF modificados geneticamente e/ou duplicados que ligam 16- nucleotídeos de uma maneira específica da sequência, que podem também ser utilizados para aumentar a especificidade para a molécula carga de NA adicional.
Consequentemente, o domínio PUF pode ser modificado para ligar qualquer sequência, com diferente afinidade e comprimento de sequência, que torna o sistema altamente modular e adaptável para qualquer molécula carga de RNA como pela presente invenção.
Proteínas PUF e regiões e derivados das mesmas que podem ser usados como domínios de ligação de NA como pela presente invenção incluem a seguinte lista não limitante de proteínas PUF: FBF, FBF/PUF-8/PUF-6,-7,-10, todas do [o elegans; Pumilio de D melanogaster; Puf5p/Mpt5p/Uth4p, Puf4p/YgI014wp/YgI023p, Puf5p/Mpt5p/Uth4p, Puf5p/Mpt5p/Uth4p, Puf3p, todos de S cerevisiae; PufA de Dictyostelium; PUM1 de humano (Pumilio 1, às vezes conhecido também como PUF-8R) e quaisquer domínios dos mesmos, polipeptídeos compreendendo domínios de ligação de NA de pelo menos duas PUMl, quaisquer proteínas PUF truncadas ou modificadas ou modificadas geneticamente, tais como por exemplo, PUF-6R, PUF-9R, PUF- 10R, PUF-12R, e PUF-l16R ou derivados dos mesmos; e X-Pufl de Xenopus. PUF de ligação de NAs particularmente adequada como pela presente invenção inclui o seguinte: PUF 531 (como exemplo não limitante ilustrado por SEQ ID NO 1), PUF MRNA loc (às vezes denominada PUFengineered ou PUFeng) (como exemplo não limitante ilustrado por SEQ ID NO 2), e/ou PUFX2 (como exemplo não limitante ilustrado por SEQ ID NO 3), e qualquer derivados, domínios, e/ou regiões dos mesmos. As proteínas PUF/PUM são altamente vantajosas uma vez que elas podem ser selecionadas para ser de origem humana. As sequências de SEQ ID NO's 1 a 3 são representadas na Figura 5
[0026] Proteínas de origem humana, sem ser as de origem bacteriófaga tal como a proteína MS2 usada em US14/502.494, são benéficas em virtude de elas serem menos prováveis de elicitar uma resposta imune adversa. Além disso, MS2 interage com uma haste alça de origem bacteriófaga, que, diferente das proteínas PUF, implica que uma sequência e motivo de NA procariótico precisam ser introduzidos na molécula de NA de escolha. Claramente, essa inserção de uma estrutura haste alça de origem bacteriófaga e a estrutura podem interferir na tradução de mRNA, resultando em moléculas cargas de mMRNA não funcionais, ou mesmo desencadear imunotoxicidade.
[0027] Assim, em modalidades vantajosas, a presente invenção se refere a proteínas de ligação de NA eucariótico fundidas nas proteínas exossomais. Em uma modalidade preferida, o(s) domínio(s) de ligação de NA é(são) da família PUF de proteínas, por exemplo, PUF531, PUFengineered, e/ou PUFx2. Importantemente, proteínas PUF são preferivelmente usadas na administração mediada por EV de mRNA ou ShRNA, que, devido à especificidade de sequência das proteínas PUF, possibilita o carregamento altamente controlado e específico da carga de fármaco de NA. Em modalidades preferidas, aís) proteína(s) PUF é/são vantajosamente combinada (s) tanto com proteínas transmembranas quanto exossomais solúveis. Os construtos de proteína de fusão vantajosos incluem os seguintes exemplos não limitantes: CD63-PUF531, CD63-PUFx2, CD63- PUFengineered, CD81 -PUF531, CD81 -PUFx2, CD81 - PUFengineered, CD9-PUF53l1, CD9-PUx2, CDS9-PUFengineered, e outra proteínas de fusão a base de transmembrana, preferivelmente com base em proteínas exossomais tetraspanina fundidas a uma, duas ou mais proteínas PUF. As proteínas de fusão vantajosas compreendendo proteínas PUF e pelo menos uma proteína exossômica solúvel incluem os seguintes exemplos não limitantes: sintenina-PUF531, sintenina-PUx2, sintenina-PUFengineered, sindecan-PUF531, sindecan-PUx2, sindecan-PUFengineered, Alix-PUF531, Alix- PUx2, Alix-PUFengineered, bem como qualquer outra proteína de exossoma solúvel fundida a uma proteína PUF.
[0028] O fato de que as proteínas PUF têm especificidade de sequência modificável para a molécula carga de NA alvo as torna domínios de ligação de NA ideais para fundir em parceiro(s) de polipeptídeo exossômico, Assim, em modalidades preferidas da presente invenção, as EVs são carregadas com moléculas cargas de NA usando domínios de ligação de NA liberáveis (como parte de proteínas de fusão com proteínas exossomais), em que a interação entre o domínio de ligação de NA e a molécula carga de NA é vantajosamente baseada em especificidade para uma sequência de nucleotídeo alvo e não baseada em um estrutura secundário de nucleotídeo alvo (já que estruturas secundárias não possibilitam especificidade de sequência). Em modalidades preferidas, a molécula carga de NA é modificada geneticamente para compreender e/ou naturalmente compreende a sequência de nucleotídeo alvo para a proteína PUF escolhida como o domínio de ligação de NA. Tais sequências de nucleotídeos alvos podem como mencionado anteriormente, por exemplo, ser parte do 3'UTR de um mRNA ou podem ser introduzidas em qualquer molécula carga de NA tal como um mRNA, ShRNA, miRNA, IncRNA, DNA, etc., permitindo que a proteína PUF se ligue à molécula carga de NA. O sítio de ligação de PUF na molécula carga de NA é tipicamente maior que a sequência ligada por muitas outras proteínas de ligação de RNA, tal como MS2 que reconhece meramente 4 nucleotídeos e uma haste alça em combinação, assim o trecho de nucleotídeos preferido no sítio de ligação alvo pode ter, por exemplo, 5 nucleotídeos (nt), 6 nt, 7 nt, 8 nt, 9 nt, 10 nt, 11 nt, 12 nt, 13 nt, 14 nt, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, ou ainda 20 nt e mais, dependendo da necessidade de especificidade de sequência modificável do domínio de ligação de NA. Em uma modalidade preferida, a proteína PUF é específica para um sítio de ligação de molécula carga de NA de ocorrência natural e/ou artificial que tem 6 nt, 8 nt, 9 nt, 10 nt, 12 nt, ou 16 nt de comprimento.
[0029] Polipeptídeos associados a CRISPR (Cas) representam um outro grupo de domínios de ligação de NA, e podem incluir em particular Cas6 (como exemplo não limitante ilustrado por SEQ ID NO 4, cuja sequência é representada na Figura 5) e Casl3 bem como qualquer outra molécula Cas de ligação de RNA. Cas6 se liga CRISPR RNA precursor (crRNA) com alta afinidade e processa-o para incorporação posterior em, por exemplo, Cas9. A taxa de clivagem da molécula de RNA pode ser modulada e altamente definida, consequentemente, o tempo de associação entre a molécula de RNA e Cas6 pode também ser definido de uma maneira muito precisa, que é importante para os propósitos da presente invenção.
Versões mutantes de Cas6 ou Casl3 podem ser usadas que foram mutadas para aumentar Ou diminuir a eficiência de clivagem de RNA.
Versões mutantes de Cas6 ou Casl3 podem ser usadas que foram mutadas para aumentar ou diminuir a afinidade de ligação de RNA.
Isso será uma vantagem, por exemplo, quando a molécula carga de RNA tem de ser liberada na célula recipiente.
O tempo de associação definido pode então ser modulado para liberar a molécula de RNA dentro das vesículas, mas não na célula produtora.
A sequência de RNA que Cas6 pode reconhecer pode ser modificada geneticamente para ser inserida em uma molécula de NA de interesse.
Casl3 pode ser modificada geneticamente apenas para se ligar a seu RNA alvo definido, e não degradá-lo.
Mudando a sequência da molécula de sgRNA, o complexo de Casl3-sgRNA pode ser modulado para ligar qualquer sequência de RNA entre 20-30 nucleotídeos.
Por exemplo, o uso de domínios de ligação de NA das proteínas Cas é especialmente vantajoso para a administração de RNAs curto, por exemplo, SshRNAs ou miRNAs.
Em tais casos, a atividade de clivagem do polipeptídeos de Cas selecionado pode ser usada para liberar, por exemplo, uma molécula carga de sShRNA de um sítio de ligação ao qual, por exemplo, Cas6 foi ligado. Além disso, como é o caso com as proteínas PUF, proteínas Cas são exemplos altamente preferidos de domínios de ligação de NA liberáveis que se ligam com afinidade adequada às moléculas cargas de NA, por meio disso possibilitando uma fixação liberável, reversível da proteína Cas na carga de NA. Como com os domínios de ligação de NA a base de PUF, as proteínas Cas representam um domínio de ligação de NA liberável, irreversível com especificidade de sequência programável, modificável para a molécula carga de NA alvo, possibilitando maior especificidade a uma menor afinidade total, por meio disso permitindo tanto carregamento da carga de NA em EVs quanto liberação da carga de NA em uma localização alvo.
[0030] Os domínios de ligação de aptâmero de NA são um outro grupo de domínios de ligação de NA como pela presente invenção. Tais domínios de ligação de aptâmero de NA são domínios, regiões, trechos de aminoácidos, Ou polipeptídeos ou proteínas totais que podem ser ligados com especificidade por aptâmeros a base de NA. Aptâmeros são sequências de RNA que formam estruturas secundárias e/ou terciárias para reconhecer moléculas, similares à afinidade de um anticorpo para seu antígeno alvo. Consequentemente, essas moléculas de RNA podem reconhecer sequências de aminoácidos específicas com alta afinidade.
Aptâmero de RNA são aplicados na presente invenção inserindo sequências de nucleotídeos particulares na molécula de NA para reconhecer sequências de aminoácidos específicas.
Tais sequências de aminoácidos podem ser modificadas geneticamente em e/ou próximas ao polipeptídeo carreador exossômico para possibilitar que o aptâmero (que é modificado geneticamente em e/ou próximo à molécula carga de NA) se ligue a ele, por meio disso levando e trazendo a molécula carga de NA para as EVs com o auxílio do polipeptídeo exossômico.
Dois aptâmeros com características adequada são um aptâmero His (como exemplo não limitante ilustrado por SEQ ID NO 5) com alta afinidade para um trecho de aminoácidos de histidina (His) e um aptâmero em direção ao domínio HIV Tat (como exemplo não limitante ilustrado por SEQ ID NO 6). A(s) sequência(s) de aptâmero é(são) preferivelmente inserida(s) na região não traduzida 3' e/ou 5' de um mRNA ou região não específica de RNAs não codificantes.
Dois ou mais aptâmeros podem também ser combinados em uma molécula carga de NA para aumentar a especificidade e avidez na proteína carreadora exossômico.
As sequências de SEQ ID NO's 5 e 6 são representadas na Figura 5. Importantemente, todos os domínios de ligação de NA da presente invenção fornecem ligação reversível, liberável específica de sequência programável na molécula carga de NA, por exemplo, mRNA,
ShRNA, ou miRNA, que é completamente contrário à ligação irreversível, de alta afinidade em RNA observada na técnica anterior. Em modalidades preferidas da presente invenção, os domínios de ligação de NA são tanto proteínas PUF quanto proteínas Cas, devido a sua natureza e especificidade facilmente programável de sequência combinada com sua ligação reversível, liberável em moléculas cargas de NA. Importantemente, a especificidade de sequência de proteínas Cas e proteínas PUF como domínios de ligação de NA é preferivelmente baseada em interação com pelo menos 6 nt, preferivelmente pelo menos 8 nt na molécula de NA alvo, que, quando combinada com uma interação de baixa afinidade, permite alta administração produtiva mediada por EV da molécula carga de NA. Pelo menos sítio de ligação de 6 nt na molécula carga de NA está preferivelmente presente em uma sequência de nucleotídeos contígua. O sítio de ligação da molécula carga de NA assim preferivelmente corresponde em comprimento a dois códons
[0031] Em um primeiro aspecto, a presente invenção se refere a vesículas extracelulares (EVs) compreendendo pelo menos um polipeptídeo de fusão compreendendo pelo menos um domínio de ligação de ácido nucleico (NA) e pelo menos um polipeptídeo exossômico, em que pelo menos um domínio de ligação de NA pode ser um ou mais de PUF, um polipeptídeo (Cas) associada a CRISPR, e/ou um domínio de ligação de aptâmero de NA. Em decorrência de presença do domínio de ligação de NA, as EVs tipicamente compreendem adicionalmente pelo menos uma molécula carga de NA. Normalmente, o número de moléculas cargas de NA que são compreendidas em toda e qualquer EV é considerável, que é uma melhoria clara com relação a técnica anterior que normalmente alcança uma eficácia de carregamento muito baixa. No caso da presente invenção, o projeto inventivo dos construtos de polipeptídeo de fusão significa que pelo menos uma molécula carga de NA é transportada muito eficientemente para a EV (com a ajuda do polipeptídeo de fusão) seguido por um processo de liberação significativamente melhorado. A natureza liberável da ligação entre o domínio de ligação de NA (que é compreendido no polipeptídeo de fusão) e a molécula carga de NA é um aspecto chave da presente invenção, uma vez que ela permite ligação de moléculas cargas de NA nas células produtoras de EV (em que moléculas cargas de NA são normalmente sobre-expressas) ao mesmo tempo possibilitando administração de moléculas de NA bioativo em e/ou próximas à célula alvo.
[0032] Assim, diferente da técnica anterior, uma interação de menor afinidade programável entre o domínio de ligação de NA e as moléculas cargas de NA possibilita à presente invenção carregar eficientemente EVs em células produtoras de EV, ao mesmo tempo também possibilitando a liberação de carga de NA em localizações adequadas (tipicamente dentro de uma célula alvo) em que a afinidade inferior e a natureza liberável da interação entre a molécula carga de NA e o domínio de ligação de NA é altamente vantajosa. Além disso, diferente da técnica anterior que revela meramente MS2 como uma proteína de ligação de RNA de alta afinidade ligando a 4 nts e uma haste alça, a presente invenção permite ligação de baixa afinidade ou de média afinidade específica da sequência em trechos de nucleotídeos que são maiores e por meio disso mais específicos, por exemplo, 6 nt de comprimento, ou 8 nt de comprimento
[0033] O maior comprimento do sítio de ligação possibilita que uma faixa de diferentes mutações seja introduzida que gera sítios de ligação com uma faixa de afinidades de ligação modificadas, produzindo assim as interações inferiores de afinidade programável mencionadas anteriormente. Por exemplo, introdução de uma mutação de único ponto em uma região de 6 ou 8 nucleotídeos sutilmente modificará a afinidade de ligação, ao passo que, mesmo uma única mutação na região de ligação de 4 nucleotídeos menores de MS2, é sabido que afeta significativamente a afinidade de ligação de MS2 ao RNA. O maior comprimento de ácido nucleico provê mais escopo para introduzir uma Ou mais mutações que afetam a afinidade de ligação da proteína para o ácido nucleico.
Similarmente, exigir que um trecho de nucleotídeos maiores seja ligado resulta em um maior número de aminoácidos que são capazes de interagir com a maior sequência de nucleotídeos e assim prover mais possibilidades de mutar os aminoácidos de interação e novamente produzir uma grande faixa de possíveis mutantes de proteína com uma variedade de afinidades de ligação.
Tanto o maior sítio de ligação de nucleotídeo quanto os maiores sítios de ligação de proteína de PUF, Cas6 e Casl3 fornecem vantagens em possibilitar uma maior faixa de afinidades a ser alcançada por mutação que seria alcançada por mutação da proteína MS2 ou a sequência de RNA de MS2. Assim, essa maior sequência proporciona maiores possibilidades de modificar o ácido nucleico e/ou a ligação proteína para adaptar a afinidade de ligação especificamente a uma carga individual de interesse se necessário para melhorar a liberação desse ácido nucleico carga.
Como foi discutido anteriormente, a capacidade de controlar a afinidade de ligação ao nucleotídeo carga e assim modificar e controlar a capacidade de liberação do nucleotídeo carga é um avanço significante da presente invenção com relação à técnica anterior, resultando em administração e liberação de ácidos nucleicos bioativos.
[0034] Em uma modalidade, a molécula carga de NA pode ser selecionada do grupo compreendendo sShRNA, miRNA, MRNA, gRNA, pri-miRNA, pre-miRNA, RNA circular, PpiRNA, tRNA, rRNA, SsnRNA, IncRNA, ribozimas, DNA minicírculo, DNA de plasmídeo, mas essencialmente qualquer tipo de molécula de NA pode ser compreendido nas EVs como pela presente invenção. Moléculas tanto de fita única quanto de fita dupla de NA estão no escopo da presente invenção, e a molécula de NA pode ser de ocorrência natural (tal como RNA ou DNA) ou pode ser uma molécula de RNA e/ou DNA quimicamente sintetizada que pode compreender nucleotídeos quimicamente modificados tais como 2'-O-Me, 2'-O-Alila, 2 - O-MOE, 2'-F, 2 -CE, 2'-EA 2'-FANA, LNA, CLNA, ENA, PNA, fosforotioatos, triciclo-DNA, etc. Importantemente, embora a presente invenção seja altamente adequada para carregamento endógeno de moléculas cargas de NA (por exemplo, mRNA, RNA circular, shRNA, etc.) ela é também aplicável a carregamento com moléculas de NA exógenas que podem ser carregadas expondo células produtoras de EV às molécula de NA em questão e/ou por coincubação Ou formulação com as EVs per se.
[0035] Em uma modalidade específica, o domínio de ligação de NA é Cas6 ou Casl13 e a molécula carga de NA é um ShRNA. A combinação de Cas6/Casl3 com sShRNA carga é vantajosa em virtude de que a atividade inata de Cas6/Cas13 resultará na clivagem do ShRNA do(s) domínio(s) de ligação de NA ao qual Cas6 ou Casl3 foram ligados, por meio disso liberando o ShRNA do complexo entre a proteína de fusão e o domínio de ligação de NA. Adicionalmente, em virtude de o ShRNA não exigir nenhuma tampa ou cauda poliA para funcionar uma vez liberado dentro do citoplasma, o SshRNA clivado fica imediatamente pronto para silenciar genes com alta atividade.
[0036] Em modalidades da presente invenção, as moléculas cargas de NA como pela presente invenção compreendem (1i) pelo menos um sítio de ligação para o domínio de ligação de NA do polipeptídeo de fusão e (ii) um domínio de polinucleotídeo terapêutico. Em modalidades preferidas, as moléculas cargas de NA compreende pelo menos dois sítios de ligação e ainda mais preferivelmente um maior número de sítios de ligação, por exemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, ou um número ainda maior. Os inventores perceberam que incluindo 4-8 sítios de ligação produz carregamento ideal da molécula carga de NA em EVs impactando “negativamente a liberação e administração bioativa da carga. Os sítios de ligação para o domínio de ligação de NA podem ser geneticamente modificados na e/ou flanqueando a UTR 3' e/ou 5' e/ou por optimização de sequência ser colocados na região codificante da molécula carga de NA.
[0037] As moléculas cargas de NA como pela presente invenção podem vantajosamente compreender pelo menos um sítio de clivagem entre pelo menos um sítio de ligação e o domínio de polinucleotídeo terapêutico, a fim de possibilitar liberação da parte terapêutica da molécula carga de NA.
[0038] Geralmente, a molécula carga de NA pode ser destinada a realizar uma gama de funções, por exemplo, codificar para uma proteína de interesse (tal como uma proteína com uma atividade terapêutica), silenciar uma sequência de nucleotídeo alvo por meio de interação antissentido com o alvo, mudar e/ou bloquear a montagem, mediar a clivagem de uma sequência de nucleotídeo alvo, por exemplo, por meio de clivagem mediada por RNase H ou complexo de interferência de RNA mediada por RISC (RNAi). Em modalidades de interesse particular, a molécula carga de NA pode realizar mais que uma função, por exemplo, ela pode codificar para uma proteína de interesse e compreender uma sequência de NA que pode ter, por exemplo, uma função de guia. Um exemplo particularmente vantajoso disso é uma molécula de NA que codifica para uma proteína associada a CRISPR (tais como Cas, Cas9 (em um exemplo não limitante Cas9º com número de acesso Q99ZW2 como mostrado em SEQ ID NO: 7), e/ou Cas6) e também compreendendo uma fita guia para direcionar a proteína associada a CRISPR para uma sequência alvo para edição de genoma e/ou uma correção de fita de DNA para, por exemplo, homologia direcionada a reparo. Em tais modalidades, é particularmente vantajoso incluir sítios de clivagen na molécula de NA, para possibilitar liberação tanto de uma quanto de ambas as proteínas codificadas pela molécula carga de NA e a fita guia compreendidas na molécula carga de NA
[0039] Exemplos não limitantes de proteínas que podem ser codificadas pela molécula carga de NA incluem o seguinte: anticorpos, intracorpos, fragmentos variáveis de cadeia única, aficorpos, enzimas, transportadores, supressores de tumor (exemplos não limitantes incluem p53, p21, APC, CD95, ST5, YPEL3, ST7, e/ou ST15), inibidores virais ou bacterianos, proteínas de componente celular, proteínas de ligação de DNA e/ou RNA, inibidores de reparo de DNA, nucleases, proteinases, integrases, fatores de transcrição, fatores de crescimento, inibidores e indutores de apoptose, toxinas, proteínas estruturais, fatores neurotróficos, transportadores de membrana, proteínas de ligação de nucleotídeo, proteínas de choque térmico, proteínas associadas a CRISPR, citocinas, receptores de citocina, caspases e qualquer combinação e/ou derivados dos mesmos
[0040] Os projetos tanto da molécula carga de NA quanto dos construtos de polipeptídeo de fusão são chaves para carregamento, liberação, e administração bioativa, por exemplo, nas células alvos e/ou em órgãos, tecidos, e compartimentos corpóreos particulares. os inventores descobriram que modalidades particularmente vantajosas são EVs compreendendo polipeptídeos de fusão que compreendem pelo menos um polipeptídeo exossômico flanqueado em um ou ambos os lados por pelo menos um domínio de ligação de NA (isto é, pelo menos um domínio de ligação de NA tanto em um lado quanto em cada lado). Alternativamente, o domínio de ligação de NA pode em vários casos ser inseridos no polipeptídeo exossômico em pelo menos uma localização (por exemplo, em uma alça extravesicular, por exemplo, de CD63), por exemplo, quando é desejável exibir o domínio de ligação de NA no lado de fora da EV para intensificar carregamento exógeno.
O polipeptídeo exossômico pode ser flanqueado imediatamente C e/ou N terminalmente, mas o projeto mais vantajoso é incluir um peptídeo ligante entre o polipeptídeo exossômico e os domínios de ligação de NA, para prover espaçamento e flexibilidade para manter a atividade tanto do(s) polipeptídeo(s) exossômico(is) quanto do(s) domínio(s) de ligação de NA.
Tais ligantes podem vantajosamente ser ligantes de glicina-serina (GS) contendo um número particular de repetições. os inventores perceberam que tanto 1 quanto 4 repetições são as mais vantajosas, provendo bastante flexibilidade com tornando o polipeptídeo de fusão bastante não estruturado, entretanto, ligantes maiores e ligantes não a base de GS estão também no escopo do presente pedido. Como mencionado anteriormente, para aplicações envolvendo carregamento exógeno de moléculas cargas de NA, EVs preferivelmente compreendem polipeptídeos de fusão que compreendem pelo menos um polipeptídeo exossômico fundido a pelo menos um domínio de ligação de NA em seu N terminal, e/ou seu C terminal e/ou em quaisquer regiões extravesiculares (isto é, presente fora da EV) do polipeptídeo exossômico, a fim de expor o domínio de ligação de NA na superfície do exossoma.
[0041] O projeto e seleção do componente de polipeptídeo exossômico do construto de polipeptídeo de fusão são chaves para possibilitar a formação de EV, carregamento de NA nas EVs, e também liberação da molécula carga de NA eficientes. As proteínas exossomais podem ser selecionadas dos seguintes exemplos não limitantes: CD9, CD53, CD63, CD8l, CD54, CD50, FLOT1l, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, AARDC1, Sintenina-l, Sintenina- 2, Lamp2b, TSPAN8, sindecan-l, sindecan-2, sindecan-3, sindecan-4, TSPANI4, CD37, CD82, CD1I51, CD231, CDI02, NOTCH 1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCHA4, DLL1, DLLA4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB/7, CDlla, CDllb, CDllc, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104,
TNFR, gpl30, receptores de Fc, receptores de interleucina, imunoglobulinas, componentes de MHC-I ou MHC-II, CD2, CD3 epsilon, CD3 zeta, CDl3, CD1I8, CDl9, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CDl11, CDl15, CDll17, CD1I25, CD135, CDI84, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6Al, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA- DM, HSPG2, LICAM, LAMBl, LAMCl, LFA-l, LGALS3BP, Mac-l alfa, Mac-l beta, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTIl A, VTIl B, outros polipeptídeos exossomais, e quaisquer combinações dos mesmos
[0042] Como mencionado anteriormente, as EVs como pela presente são carregadas com a molécula carga de NA com o auxílio do polipeptídeo de fusão. Sem querer se ligar a nenhuma teoria, supõe-se que oO carregamento ocorre com relação à formação de a EV dentro da célula produtora de EV ou exogenosamente incubando molécula(s) da carga de NA com EVs modificadas geneticamente. O polipeptídeo de fusão pode normalmente se ligar a molécula carga de NA (tal como uma molécula de RNA coexpressa na célula produtora de EV) e transportá-la para a vesícula que é então liberada como uma EV. Como mencionado, a molécula carga de NA pode ser expressa na mesma célula produtora de EV como oO polipeptídeo de fusão e/ou ela pode ser carregada exogenamente para uma EV uma vez que a EV é formada e opcionalmente purificada. Coexpressão na célula produtora de EV da carga de NA é uma modalidade altamente vantajosa, uma vez que a produção de EV ocorre em uma única etapa em uma única célula, que possibilita a escala do processo e simplifica processamento tanto à montante quanto à jusante.
A molécula carga de NA (por exemplo, um mRNA, um SshRNA, um MiRNA, um RNA circular, um DNA, um oligonucleotídeo antisssentido, etc.) podem ser expressados mesmos construtos de polinucleotídeo como o polipeptídeo de fusão, ou ela pode também ser expressa de um outro construto.
Ambos os métodos têm vantagens: o uso de um construto possibilita que tanto o polipeptídeo de fusão quanto a molécula carga de NA sejam traduzidos/transcritos juntos enquanto que o uso de mais que um construto possibilita expressão diferencial dos dois componentes, por exemplo, um maior nível de expressão tanto do polipeptídeo de fusão quanto da molécula carga de NA.
Em modalidades preferidas, o construto de polinucleotídeo dos quais o polipeptídeo de fusão e/ou a molécula carga de NA são expressos é vantajosamente estavelmente introduzida nas células produtoras de EV, para possibilitar produção de alto rendimento consistente, reprodutível e das EVs carregadas com NA.
Em uma modalidade preferida, as células produtoras de EV são estavelmente transfectadas e/ou transduzidas com vetores bicistrônico ou multicistrônico (também conhecidos como construtos ou polinucleotídeos, etc.) compreendendo o polipeptídeo de fusão e a molécula carga de NA.
Tais construto bicistrônico ou multicistrônico podem compreender, por exemplo, elemento(s) de IRES ou ligações de peptídeo 2A, permitindo a expressão tanto de (i) o polipeptídeo de fusão compreendendo o domínio de ligação de NA e a proteína exossômica, quanto de (ii) a molécula carga de NA de interesse, por exemplo, um mRNA, um shRNA, um MiRNA, ou qualquer outro tipo de molécula carga de NA.
Além de usar vetores bicistrônicos ou multicistrônicos, promotores múltiplos ou bidirecionais representam um outro método tratável "para inserir estavelmente um único construto que codifica para os dois componentes de interesse que devem ser carregados nas EVs de acordo com a presente invenção.
Claramente, em modalidades alternativas, dois ou mais construtos (por exemplo, plasmídeos) podem também ser transfectados e/ou transduzidos nas células produtoras de EV, embora o uso de construtos únicos possa ser vantajoso uma vez que ele pode possibilitar concentrações equimolares do polipeptídeo de fusão (e assim o domínio de ligação de NA) e a molécula carga de NA per se.
Importantemente, as células produtoras de EV da presente invenção são normalmente projetadas para sobre- expressar pelo menos um construto de polinucleotídeo, que permite produção apropriada da molécula carga de NA a uma concentração adequada na célula produtora de EV, por meio disso permitindo a fixação reversível, liberável do domínio de ligação de NA na molécula de NA. Sobre-expressão do(s) polinucleotídeo(s) é um importante ferramenta que permite criar uma concentração relativamente alta de molécula carga de NA na célula produtora de EV, permitindo ao mesmo tempo no mesmo momento a liberação da molécula carga de NA na célula alvo em que a concentração da molécula carga de NA é menor. Isso é especialmente relevante para as proteínas PUF e Cas.
[0043] Em uma modalidade adicional, as EVS como pela presente invenção podem compreender pelo menos uma fração de alvejamento, para possibilitar administração de alvejamento a uma célula, tecido, órgão, e/ou compartimento de interesse. A fração de alvejamento pode ser compreendida no próprio polipeptídeo de fusão, que é especialmente vantajoso quando se usa um polipeptídeo exossômico com um domínio transmembrana para possibilitar exibição da fração de alvejamento sobre a superfície das EVs. As frações de alvejamento podem ser proteínas, peptídeos, fragmentos de cadeia única ou quaisquer outros derivados de anticorpos, etc. A fração de alvejamento pode também formar parte de um construto de polipeptídeo separado que é compreendido na EV. Adicionalmente, os polipeptídeos de fusão compreendidos nas EVs da presente invenção podem também compreender várias frações adicionais para intensificar a administração bioativa. Tais frações e/ou domínios podem incluir os seguintes exemplos não limitantes de domínios funcionais: (i) domínios de multimerização que dimerizam, trimerizam, ou multimerizam os polipeptídeos de fusão para melhorar formação e/ou carregamento de EV, (ii) ligantes, como mencionado anteriormente, para evitar impedimento estérico e prover flexibilidade, (iii) domínios de liberação, tais como elementos de cis-clivagem como inteínas, que têm atividade de autoclivagem que é útil para liberação de partes particulares do polipeptídeo de fusão e/ou da carga de NA, (iv) domínios de clivagem de RNA para liberação melhorada do RNA em célula recipientes, por exemplo, domínios que codificam para nucleases tais como Cas6, Casl3, (v) domínios de escape endossomal, tais como HA2, VSVG, GALA, B18, etc., e/ou (vi) sinais de localização nuclear (NLSs).
[0044] A presente invenção também se refere a várias modificações inventivas da molécula carga de NA, que são chaves para possibilitar alta eficiência de carregamento, liberação e administração bioativa. Por exemplo, projetando a molécula carga de NA para ser tanto linear que circular pode-se aumentar ou diminuir aspectos tais como eficiência e estabilidade de carregamento. Além disso, otimizando o projeto da sequência é também possível influenciar estruturas secundárias e terciárias da carga de
NA, que pode facilitar adicionalmente o carregamento, facilitando a fácil acessibilidade de domínio de ligação de NA ao alvo NA.
[0045] Ainda em uma outra modalidade vantajosa, a molécula carga de NA pode compreender frações adicionais para aumentar potência, tanto intensificar o carregamento, melhorar a liberação, aumentar a atividade específica do tecido, e/quanto aumentar a estabilidade da molécula carga de NA. Por exemplo, a molécula carga de NA pode compreender um ou mais do seguinte: (i) um sítio para ligação de miRNA, em que tal sítio opcionalmente é tipo de tecido e/ou célula específico, para acionar atividade específica de célula e/ou tecido preferencial, (ii) pelo menos um domínio estabilizante, tal como uma cauda PoliA longa ou mais que uma cauda PoliA (por exemplo, 2 ou 3 ou ainda 4 caudas PoliA), (iii) pelo menos uma estrutura haste alça na UTR 5' e/ou 3", a fim de inibir degradação de nuclease, (iv) um RNA polimerase para acionar transcrição da molécula carga de NA, (v) sequências códon-optimizado para aumentar a estabilidade de mRNA, (vi) pelo menos uma UTR híbrida na extremidade 5' e/ou 3' para aumentar eficiência de tradução de mRNA, e/ou (vii) ribozima(s).
[0046] Como mencionado anteriormente, EVs estão tipicamente presentes não como vesículas únicas, mas em uma pluralidade substancial de vesículas, e a presente invenção consequentemente também se refere a populações de EVs. Em modalidades vantajosas, o número médio de moléculas cargas de NA por EV em toda uma população como essa é em média acima de uma (1) molécula carga de NA por EV, preferivelmente acima de 10 moléculas da carga de NA por EV, e ainda mais preferivelmente acima de 100 moléculas da carga de NA por EV. Entretanto, em toda a população pode também haver EVs que não compreendem nenhuma molécula carga de NA, e a presente invenção pode assim também se referir a populações de EVs que compreendem em média menos que uma (1) molécula carga de NA por EV.
[0047] Importantemente, a técnica anterior tipicamente meramente produz carregamento da carga de RNA em uma pequena fração das EVs. Por exemplo, o sistema TAMEL descrito em US14/502.494 não parece garantir carregamento quantificável em EVs e não especificamente em exossomas. Isso provavelmente indica que o sistema TAMEL resulta em carregamento percentual de zero a subúnico de EVs únicas. Os inventores do sistema TAMEL reportam que carregamento de uma molécula de RNA em exossomas é intensificado quando se usa o sistema TAMEL no máximo 7 vezes, enquanto que a presente invenção melhora o carregamento produtivo de, por exemplo, mMRNA e outras moléculas cargas de NA tipicamente em pelo menos 10 vezes, preferivelmente pelo menos 25 vezes, mas frequentemente em pelo menos 50 vezes, e preferivelmente em pelo menos 70 vezes, comparado com (i) EVs com domínio de ligação de NA presente na proteína de fusão e/ou com sítio de ligação para o domínio de ligação de NA na molécula carga de NA, (ii) EVs com a proteína de fusão per se (por exemplo, como mostrado na Figura 2), (iii) EVsS não modificadas geneticamente que são apenas passivamente carregadas com a molécula carga de NA, e/ou (iv) uma dada molécula de controle de NA interno. Assim, a presente invenção se refere a um meio de carregar consideravelmente mais moléculas cargas de NA em uma dada população de EVs, e importantemente a presente invenção também permite carregamento de uma proporção significativamente maior de EVs comparada como técnica anterior. Em uma modalidade, a presente invenção se refere a populações de EV em que pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, e/ou pelo menos 95% de todas as EVs compreendem uma molécula carga de NA em questão.
[0048] Como mencionado anteriormente, uma diferença crucial entre a presente invenção e US14/502.494 e outros documentos da técnica anterior se refere a distribuição ineficiente e importantemente desigual de polipeptídeos de fusão através de todas as populações de EVs. A proteína MS2 usada em US14/502.494, por exemplo, está apenas presente em uma pequena fração de EVs, que resulta em carregamento de carga de mRNA desigualmente distribuído através das populações de EV.
Ao contrário, as proteínas de fusão da presente invenção são uniformemente distribuídas através de toda as populações de EV, que significa que essencialmente toda e qualquer EV compreende pelo menos um polipeptídeo de fusão como pela presente invenção e normalmente pelo menos uma molécula carga de NA.
Assim, em uma modalidade, a presente invenção se refere a uma composição de EV compreendendo essencialmente duas subpopulações de EV, em que (1) a primeira subpopulação de EV compreende em média mais que um polipeptídeo de fusão (compreendendo o domínio de ligação de NA e o polipeptídeo exossômico) por EV, e (il) em que a segunda subpopulação de EV compreende a molécula carga de NA em questão combinada com em média mais que um polipeptídeo de fusão por EV.
Ao contrário, a técnica anterior, por exemplo, US14/502.494, preceitua EVs que compreendem muito poucos polipeptídeos de fusão por EV, tipicamente menos que 1 polipeptídeo de fusão por 10 EVs, que claramente implica em que o carregamento produtivo e administração de uma molécula carga de NA que depende da dita proteína de fusão será significativamente menor que é o caso no presente pedido.
Sem querer se ligar a nenhuma teoria, supõe-se que o motivo para a falha da técnica anterior para alcançar maior carregamento da proteína de fusão em EVs resulta do fato de que MS2 e proteínas não eucarióticas similares não se movem eficientemente nos exossomas e/ou que elas desencadeiam toxicidade, dois problemas que são abordados pela presente invenção.
[0049] Em um outro aspecto, a presente invenção se refere a polipeptídeos de fusão inventivos compreendendo pelo menos um domínio de ligação de NA e pelo menos um polipeptídeo exossômico, em que pelo menos um domínio de ligação de NA é um ou mais de PUF, Cas, e/ou um domínio de ligação de aptâmero de NA. Em modalidades vantajosas, os polipeptídeos de fusão podem opcionalmente compreender adicionalmente regiões, domínios, sequências, e/ou frações adicionais dotando o polipeptídeo com funções particulares. Exemplos não limitantes de domínios adicionais compreendidos no polipeptídeo de fusão incluem (i) domínios de multimerização, (ii) ligantes, (iii) domínios de liberação, (iv) domínios de clivagem de RNA, (v) frações de escape endossomal, (vi) sítios de clivagem específicos de protease, (vii) inteínas e/ou (viii) frações de alvejamento
[0050] Domínios de multimerização permite dimerização, trimerização, ou qualquer maior ordem de multimerização dos polipeptídeos de fusão, que aumenta a classificação e tráfico do polipeptídeos de fusão em EVs e pode também contribuir para aumentar a produção de vesículas produzidas por células produtoras de EV. Ligantes são úteis em prover maior flexibilidade aos construtos de polipeptídeo de fusão, e também aos construtos de polinucleotídeo correspondentes, e podem também ser usados para permitir evitar impedimento estérico e funcionalidade mantida dos polipeptídeos de fusão.
Domínios de liberação podem ser incluídos nos construtos de polipeptídeo de fusão a fim de permitir liberação de partes particulares ou domínios do original polipeptídeo de fusão.
Isso é particularmente vantajoso quando a liberação de partes do polipeptídeo de fusão aumentaria administração bioativa da carga de NA e/ou quando uma função particular do polipeptídeo de fusão funciona melhor quando parte de um menor construto.
Os domínios de liberação adequados podem ser sequências de clivagem em cis, tais como inteínas, domínios de liberação monoméricos ou diméricos induzidos por luz tais como Kaede, KikGR, EosFP, tdEosFP, mEos2, PSmOrange, as proteínas Dendra tipo GFP Dendra e Dendra2, CRY2-CIBN, etc.
Os domínios de clivagem de NA podem vantajosamente também ser incluídos nos polipeptídeos de fusão, para desencadear clivagem da carga de NA.
Exemplos não limitantes de domínios de clivagem de NA incluem endonucleases tais como Cas6, Casl3, PUF nucleases modificadas geneticamente, nucleases de RNA específicas do sítio etc.
Além disso, os polipeptídeos de fusão da presente invenção podem também incluir domínios de escape endossomal para acionar escape endossomal e por meio disso intensificar a administração bioativa da EV per se e a molécula carga de NA de EV. Um outra estratégia para intensificar administração é alvejar as EVs nas células, tecidos, e/ou órgãos ou outros compartimentos corpóreos. Alvejamento pode ser alcançado por uma variedade de meios, por exemplo, o uso de peptídeos de alvejamento. Tais peptídeos de alvejamento pode ser qualquer lugar de alguns aminoácidos de comprimento a 100s de aminoácidos de comprimento, por exemplo, qualquer lugar no intervalo de 3 a 100 aminoácidos, 3 a 30 aminoácidos, 5 a 25 aminoácidos, por exemplo, 7 aminoácidos, 12 aminoácidos, 20 aminoácidos, etc. Os peptídeos de alvejamento da presente invenção podem também incluir proteínas de comprimento total tais como receptores, ligantes de receptor, etc. Além disso, os peptídeos de alvejamento como pela presente invenção podem também incluir anticorpos e derivados de anticorpo, por exemplo, anticorpos monoclonais, fragmentos variáveis de cadeia única (scFvs), outros domínios de anticorpo, etc.
[0051] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a construtos de polinucleotídeo que codificam para os polipeptídeos de fusão como pela presente invenção. Os construtos de polinucleotídeo podem estar presentes em várias diferentes formas e/ou em diferentes vetores. Por exemplo, os polinucleotídeos podem ser essencialmente lineares, circulares, e/ou ter qualquer estrutura secundária e/ou terciária e/ou maior ordem. Além disso, a presente invenção também se refere a vetores compreendendo os polinucleotídeos, por exemplo, vetores tais como plasmídeos, qualquer polinucleotídeo de DNA circular, minicírculos, vírus tais como adenovírus, vírus adeno- associados, lentivirus, mRNAs, e/ou mRNASs modificados.
[0052] Os construtos de polinucleotídeo como pela presente invenção podem compreender adicionalmente um ou mais sítios ou domínios para conferir funcionalidade particular ao polinucleotídeo. Por exemplo, a estabilidade dos construtos de polinucleotídeo pode ser intensificada através do uso de domínios estabilizantes, tais como caudas poliA ou haste alça, e o construto de polinucleotídeo pode também ser controlado por promotores particulares que podem opcionalmente ser promotores, ligantes indutíveis, específicos do tipo célula etc. A cauda PoliA pode opcionalmente ser inserida à montante do sítio de corte de Cas6 ou Casl3 de maneira a resultar em clivagem de mRNAs que retém a cauda PoliA estabilizante.
[0053] A presente invenção se refere adicionalmente a vários métodos para produzir EVs. Tais métodos podem compreender as etapas de (i) introduzir em uma célula produtora de EV pelo menos um construto de polinucleotídeo, (ii) expressar na célula produtora de EV pelo menos um construto de polipeptídeo codificado para pelo menos um construto de polinucleotídeo, e opcionalmente (iii) coletar da célula produtora de EV as EVs que estão sendo produzida, que compreende o polipeptídeo de interesse da etapa (ii). Em certas modalidades, um único construto de polinucleotídeo é usado enquanto em outras modalidades mais que um construto de polinucleotídeo é empregado.
Sem querer se ligar a nenhuma teoria, supõe-se que a célula produtora de EV na qual um construto de polinucleotídeo foi introduzido (tanto transientemente quanto estavelmente, dependendo do propósito e uso das EVs) produz EVs (tais como exossomas) que compreendem o construto de polipeptídeo codificado para pelo polinucleotídeo.
As EVs podem então opcionalmente ser coletadas, tipicamente dos meios celulares da cultura, e opcionalmente purificadas adicionalmente antes de ser colocadas em um uso particular.
Em modalidades vantajosas, as EVs produzidas pelos ditos métodos compreendem adicionalmente uma molécula carga de NA, que é carregada nas EVs com o auxílio do construto de polipeptídeo de fusão.
Tipicamente, uma única EV compreende diversas cópias da molécula carga de NA, mas uma única EV pode também compreender mais que um tipo de molécula carga de fármaco de NA.
Como exemplo não limitante de EVs compreendendo mais que um tipo de carga de fármaco de NA, uma única EV (isto é, uma população de um único tipo de
EVs) pode compreender, por exemplo, uma molécula de mRNA de carga de fármaco de NA e um molécula carga de fármaco de mMRNA
[0054] Em aspectos adicionais, a presente invenção se refere a células compreendendo (i) pelo menos um construto de polinucleotídeo de acordo com e/ou (ii) pelo menos um construto de polipeptídeo. Além disso, a presente invenção também se refere a células compreendendo as EVs como pela presente invenção. As células produtoras de EV podem estar presentes na forma de, por exemplo, células primárias, linhagens celulares, células presentes em um organismo multicelular, ou essencialmente qualquer outro tipo de fonte de célula e célula produtora de material de EV. Deve-se entender que as expressões "célula da fonte" ou "célula da fonte de EV" ou "célula parental" ou "fonte de célula" ou "célula produtora de EV" ou qualquer outra terminologia similar se referem a qualquer tipo de célula que é capaz de produzir EVs em condições adequadas, por exemplo, em cultura de suspensão ou em cultura aderente ou qualquer em outro tipo de sistema de cultura. As células da fonte como pela presente invenção podem também incluir células que produzem exossomas in vivo. As células da fonte pela presente invenção podem ser selecionadas de uma ampla faixa de células e linhagens celulares, por exemplo, células tronco mesenquêmicas ou estromais (obteníveis de,
por exemplo, medula óssea, tecido adiposo, geleia de Wharton, tecido perinatal, placenta, polpas dos dentes, sangue do cordão umbilical, tecido de pele, etc.), fibroblastos, células amnióticas e mais especificamente células epiteliais amnióticas opcionalmente expressando vários marcadores iniciais, células Supressoras de mieloide, macrófagos polarizados M2, adipócitos, células endoteliais, fibroblastos, etc.
As linhagens celulares de interesse particular incluem células endoteliais do cordão umbilical humano (HUVECsS), células embrionárias de rim (HEK) humano, linhagens celulares endoteliais tais como células endoteliais microvasculares ou linfáticas, eritrócitos, progenitores de eritroide, condrócitos, MSCs de diferente origem, células amnióticas, células epiteliais amnióticas (AE), quaisquer células obtidas através de amniocentese ou da placenta, células epiteliais da via aérea ou alveolares, fibroblastos, células endoteliais, etc.
Também, células imunes tais como células B, células T, células NK, macrófagos, monócitos, células dendríticas (DCs) estão também no escopo da presente invenção, e essencialmente qualquer tipo de célula que é capaz de produzir EVs é também englobada aqui.
Geralmente, EVs podem ser derivadas de essencialmente qualquer fonte de célula, ser uma fonte de célula primária ou uma linhagem celular imortalizada.
As células da fonte de EV podem ser quaisquer tipos de células tranco somática, embrionárias, fetais, e adultas, incluindo células tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) e outras células tronco derivadas por qualquer método. Quando se trata doenças neurológicas, pode-se contemplar utilizar as células da fonte, por exemplo, neurônios primários, astrócitos, oligodendrócitos, microglia, e células progenitoras neurais. A célula da fonte pode ser tanto alogênica, autóloga, ou ainda genogênica em natureza para o paciente a ser tratado, isto é, as células podem ser do próprio paciente ou de um doador não relacionado, compatível ou não compatível. Em certos contextos, células alogênicas podem ser preferíveis de um ponto de vista médico, uma vez que elas podem prover efeitos imunomodulatórios que podem não ser obteníveis de células autólogas de um paciente que sofre de uma certa indicação. Por exemplo, no contexto de tratamento de inflamação sistêmica, periférica e/ou neurológica, MSCs ou AEs alogênicas podem ser preferíveis uma vez que EVs obteníveis de tais células podem permitir imunomodulação por meio de, por exemplo, comutação fenotípica de macrófago e/ou neutrófilo (de fenótipos de Ml ou Nl proinflamatórios para fenótipos de M2 ou N2 anti-inflamatório, respectivamente).
[0055] Como mencionado anteriormente, em modalidades preferidas, as células produtoras de EV da presente invenção são estavelmente transfectadas e/ou transduzidas com pelo menos um construto(s) de polinucleotídeo que codifica(m) para (i) o polipeptídeo de fusão compreendendo o domínio de ligação de NA e (ii) a molécula carga de NA. Em uma modalidade altamente preferida, as células produtoras de EV são expostas a um protocolo de seleção clonal permitindo seleção clonal de um único clone celular. Assim, em modalidades altamente preferidas, a presente invenção se refere a populações de célula clonal única de células produtoras de EV que são transfectadas e/ou transduzidas para produzir EVsS compreendendo tanto o polipeptídeo de fusão quanto a molécula carga de NA. Os clones únicos podem ser obtidos usando métodos de diluição limitante, classificação de célula única, e/ou isolamento de células individuais usando cilindros de clonagem.
[0056] Em um aspecto adicional, a presente invenção se refere a métodos in vitro para administração intracelular de pelo menos uma molécula carga de RNA. Tais métodos podem vantajosamente ser realizados in vitro e/ou ex vivo. Os métodos podem compreender as etapas de colocar uma célula alvo em contato com pelo menos uma EV como pela presente invenção, ou mais comumente uma população de EVs como pela presente invenção. Além disso, os métodos para administração de moléculas cargas de RNA como pela presente invenção podem também compreender introduzir em uma célula presente em qualquer sistema biológico (tal como um ser humano) um polinucleotídeo que codifica para os polipeptídeos de fusão aqui.
[0057] Em aspectos adicionais, a presente invenção se refere a composições farmacêuticas compreendendo tanto um quanto mais dos seguintes componentes: (i) pelo menos um construto de polinucleotídeo como descrito aqui, (ii) pelo menos um construto de polipeptídeo como descrito aqui, (iii) pelo menos uma EV como descrito aqui, (iv) pelo menos uma célula como descrito aqui, e/ou (v) pelo menos uma população de EVs como descrito aqui, tipicamente formuladas com um excipiente, carreador e/ou diluente ou similares farmaceuticamente aceitáveis. Além disso, a presente invenção também se refere a (1) pelo menos um construto de polinucleotídeo como descrito aqui, (ii) pelo menos um construto de polipeptídeo como descrito aqui, (iii) pelo menos uma EV como descrito aqui, (iv) pelo menos uma célula como descrito aqui, e/ou (v) pelo menos uma população de EVs como descrito aqui, e a (vi) composição farmacêutica mencionada anteriormente, para uso em medicina. Mais especificamente, a presente invenção se refere a uso na profilaxia e/ou tratamento e/ou alívio de uma variedade de doenças. Exemplos não limitantes de doenças e condições incluem os seguintes exemplos não limitantes: doença de
Crohn, colite ulcerativa, espondilite anquilosante, artrite reumatoide, esclerose múltipla, lúpus eritematoso sistêmico, sarcoidose, fibrose pulmonar idiopática, psoríase, fator de necrose tumoral (TNF) síndrome periódica associada ao receptor (TRAPS), deficiência do antagonista do receptor de interleucina-l (DIRA), endometriose, hepatite autoimune, escleroderma, miosite, acidente vascular cerebral, lesão da medula espinhal aguda, vasculite, síndrome de Guillain-Barré, infarto do miocárdio agudo, ARDS, sepsia, meningite, encefalite, insuficiência hepática, esteato-hepatite não alcoólica (NASH), doença hepática gordurosa não alcoólica (NAFLD), insuficiência renal, insuficiência cardíaca ou qualquer insuficiência de órgão aguda ou crônica e a etiologia subjacente associada, doença do enxerto vs hospedeiro, distrofia muscular de Duchenne e outras distrofias musculares, doenças do armazenamento lisossomal tal como doença de Gaucher, doença de Fabry, MPS I, II (síndrome de Hunter), e III, doença de Niemann-Pick tipo A, B, e C, doença de Pompe, etc., doenças neurodegenerativas incluindo doença de Alzheimer, doença de Parkinson, doença de Huntington e outras doenças relacionadas a repetição de trinucleotídeo, demência, ALS, caquexia induzida por câncer, anorexia, diabetes melito tipo 2, e vários cânceres.
Virtualmente todos os tipos de câncer são alvos de doenças relevantes para a presente invenção, por exemplo, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cânceres relacionados a AIDS, linfoma relacionado a AIDS, câncer anal, câncer de apêndice, astrocitoma, cerebelar ou cerebral, carcinoma de célula basal, câncer de duto biliar, câncer de bexiga, tumor ósseo, glioma do tronco encefálico, câncer cerebral, tumor cerebral (astrocitoma cerebelar, astrocitoma cerebral /glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriais, glioma do trajeto visual e hipotalâmico), câncer de mama, adenomas Bronquiais/carcinóides, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide (infância, gastrintestinal), carcinoma de linfoma do sistema nervoso central primário desconhecido, astrocitoma cerebelar/glioma maligno, câncer cervical, leucemia linfocítica crônica, leucemia mielogenosa crônica, distúrbios mieloproliferativos crônicos, câncer de cólon, linfoma da célula T cutânea, tumor desmoplástico de célula pequena redonda, câncer endometrial, ependimoma, câncer esofageal, tumor da célula germinal extracraniana, tumor da célula germinal extragonadal, câncer de duto biliar extra-hepático, câncer de olho (melanoma intraocular, etinoblastoma), câncer de vesícula biliar, câncer gástrico (estômago), tumor carcinoide gastrintestinal, tumor estromal gastrintestinal (GIST), tumor de célula germinal (extracraniana,
extragonadal, ou de ovário), tumor trofoblástico gestational, glioma (glioma do tronco cerebral, astrocitoma cerebral, glioma trajeto visual e hipotalâmico), carcinoide gástrico, leucemia de célula capilar, câncer de cabeça e pescoço, câncer de coração, câncer hepatocelular (fígado), linfoma de Hodgkin, câncer hipofaringeal, melanoma intraocular, carcinoma de célula ilhota (Pâncreas Endócrinos), sarcoma de Kaposi, câncer renal (câncer de célula renal), câncer laringeal, leucemias ((linfoblástica aguda (também chamada leucemia linfocítica aguda), mieloide agudo (também chamada leucemia mielogenosa aguda), linfocítica crônica (também chamada leucemia linfocítica crônica), mielogenosa crônica (também chamada leucemia mieloide crônica), leucemia da célula capilar)), câncer de lábio e cavidade oral, lipossarcoma, câncer de fígado (Primário), câncer de pulmão (célula não pequena, célula pequena), linfomas, linfoma relacionado a AIDS, linfoma de Burkitt, linfoma cutâneo de célula T, linfoma de Hodgkin, não Hodgkin, meduloblastoma, carcinoma de célula Merkel, mesotelioma, câncer de pescoço escamoso metástico com primário oculto, câncer de boca, síndrome de neoplasia endócrina múltipla, mieloma múltiplo/neoplasma de célula plasmática, micose fungoide, doenças mielodisplásticas/mieloproliferativas, leucemia mielogenosa, leucemia mieloide crônica (aguda, crônica),
mieloma, câncer de sino da cavidade nasal e paranasal, carcinoma nasofaringeal, neuroblastoma, câncer oral, câncer orofaringeal, osteossarcoma/histiocitoma fibroso maligno do osso, câncer de ovário, câncer epitelial de ovário (tumor de superfície epitelial-estromal), tumor germinal de célula de ovário, tumor de baixo potencial de malignidade do ovário, câncer pancreático, câncer de célula de ilhotas pancreáticas, câncer da paratireoide, câncer do pênis, câncer faringeal, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma e tumores supratentorial neuroectodérmicos primitivos, adenoma pituitário, blastoma pleuropulmonar, câncer de próstata, câncer retal, carcinoma de célula renal (câncer renal), eetinoblastoma, rabdomiossarcoma, câncer de glândula salivar, sarcoma (família Ewing de sarcoma de tumores, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tecido macio, sarcoma uterino), síndrome de Sezary, câncer de pele (não melanoma, melanoma), câncer de intestino delgado, célula escamosa, câncer de pescoço escamoso, câncer de estômago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, câncer testicular, câncer de garganta, timoma e carcinoma tímico, câncer de tireoide, câncer de célula transicional da pélvis renal e uretra, câncer de uretra, câncer de útero, sarcoma de útero, câncer vaginal, câncer vulvar, macroglobulinemia de Waldenstrom, e/ou tumor de Wilm.
[0058] As EVs como pela presente invenção podem ser administradas a um sujeito humano ou animal por meio de várias diferente vias de administração, por exemplo, administração auricular (otic), bucal, conjuntival, cutânea, dental, eletro-osmose, endocervical, endosinusial, endotraqueal, enteral, epidural, extra-amniótica, extracorpórea, hemodiálise, infiltração, intersticial, intra-abdominal, intra-amniótica, intra-arterial, intra- articular, intrabiliar, intrabronquial, intrabursal, intracardíaca, intracartilagenosa, intracaudal, intracavernosa, intracavitar, intracerebral, intracisternal, intracorneal, intracoronal (dental), intracoronar, intracorporus cavernoso, intradérmica, intradiscal, intradutal, intraduodenal, intradural, intraepidérmica, intraesofageal, intragástrica, intragengival, intraileal, intralesional, intraluminal, intralinfáticas, intramedular, intrameningeal, intramuscular, intraocular, intraovariana, intrapericardial, intraperitoneal, intrapleural, intraprostática, intrapulmonar, intrasinal, intraespinhal, intrasinovial, intratendinosa, intratesticular, intratecal, intratoráxica, intratubular, intratumoral, intratimpânica, intrauterina, intravascular, intravenosa, bolo intravenoso, gota intravenosa, intraventricular, intravesical, intravítrea, iontoforese, irrigação, laringeal, nasal,
nasogástrica, técnica de curativo oclusivo, oftálmica, oral, orofaringeal, outra, parenteral, percutâneo, periarticular, peridural, perineural, periodontal, retal, respiratória (inalação), retrobulbar, tecido macio, subaracnóide, subconjuntival, subcutâneo, sublingual, submucosal, tópica, transdérmica, transmucosal, transplacental, transtraqueal, transtimpânica, ureteral, uretral, e/ou vaginal, e/ou qualquer combinação das vias de administração anteriores, que tipicamente dependem da doença a ser tratada e/ou das características das EVs, da molécula carga de NA em questão, ou da população de EV como tal.
E 1 z : 1 Materiais e métodos . Projeto e clonagem de construto
[0059] Vários domínios de ligação de NA e variantes dos mesmos (por exemplo, PUF, PUF mutada, PUFx2, Cas6, Cas6 mutadas, Casl3, Casl3 mutada, etc.) foram avaliados, em combinação com diversos polipeptídeos exossomais (tal como CD81, CD63, CD9, sintenina, sindecan, Alix, CD133, etc.). ORFs foram tipicamente gerados por síntese e clonados no vetor de expressão de mamífero pSF-CAG-Amp. Resumidamente, DNA e plasmídeo vetor sintetizados foram digeridos com enzimas NotI e Sail como pela instrução dos fabricantes (NEB). Fragmentos de DNA restritos, purificados foram ligados entre si usando T4 ligase como pela instrução dos fabricantes (NEB). Eventos de ligação com êxito foram selecionados por transformação bacteriana em placas suplementadas ampicilina. Plasmídeo para transfecção foi gerado por 'maxi-prep', como pela instrução dos fabricantes .º Cultura celular e transfecção
[0060] Dependendo do projeto experimental e ensaios, em certos casos, transfecção transiente não viral e produção de EV foram realizados em cultura celular 2D convencional, ao passo que, em outros casos, transdução mediada por vírus foi empregada para criar linhagens celulares estáveis, que foram tipicamente cultivadas em biorreatores e/ou incubadores de agitação de diferentes tipos. Para concisão, apenas alguns exemplos são mencionados aqui.
[0061] Células HEK293T foram tipicamente semeadas em pratos 15 cm (9x106s células por prato) e deixadas por toda a noite em DMEM contendo soro como recomendado por ATCC. No dia seguinte as células foram transientemente transfectadas com DNA lipoplexado adicionado diretamente nas células. Resumidamente, DNA e polietilenoimina (PEL) foram separadamente incubados em OptiMEM por 5 minutos antes de combinar entre si por 20 minutos à temperatura ambiente. O DNA lipoplexado e células foram coincubados por 6 horas após o que meios de cultura condicionados foram trocados para OptiMEM por 48 horas. Outras células e linhagens celulares que foram avaliadas em pratos, frascos e outros vasos de cultura celular incluíram células estromais mesenquimais derivadas da medula óssea (BM-MSCs) e MSCs derivadas de geleia de Wharton (WJI-MSCs), células amnióticas, células epiteliais amnióticas, fibroblastos, várias células endoteliais e epiteliais, bem como várias células imunes e linhagens celulares.
[0062] No caso de transdução viral e criação de linhagens celulares estáveis para várias combinações de construtos de polipeptídeo de fusão e moléculas cargas de NA, fontes de célula tais como BM-MSCs, WJI-MSC, fibroblastos, células epiteliais amnióticas, fibroblastos, várias células endoteliais e epiteliais, foram transduzidas por vírus, tipicamente usando transdução de lentivírus (LV). Tipicamente, 24 horas antes de infeção, 100.000 células (por exemplo, fibroblastos, MSCs, etc.) ou 200.000 células (por exemplo, HEK293T) são plaqueadas em uma placa de 6 poços. 2 ul de LV e opcionalmente Polibreno (ou brometo de hexadimetrina, concentração final no poço de 8 ug/mL) são adicionados, e 24 horas após transdução o meio celular de células transduzidas é trocado para meios completos frescos. A 72 horas após transdução, seleção de puromicina (4-6ug/ml) é realizada, normalmente por 7 dias seguido por análise de expressão estável dos polipeptídeos de fusão.
[0063] As células estáveis foram cultivadas tanto em cultura 2D quanto em biorreatores, e os meios condicionados foram subsequentemente colhidos para preparação de exossoma. Várias etapas de preparação e purificação foram realizadas. O fluxo de trabalho padrão compreende as etapas de pré-limpeza do sobrenadante, concentração a base de filtração, remoção a base de cromatografia de contaminantes de proteína, e formulação opcional da composição de exossoma resultante em um tampão adequado para ensaios in vitro e/ou in vivo . Ensaios e analítico
[0064] Western blot é um método analítico altamente conveniente para avaliar o enriquecimento de Pols em EVs. Resumidamente, SDS-PAGE foi realizada de acordo com instrução do fabricante (Invitrogen, géis Novex PAGE 4- 12%), por meio do que 1 x 1010 exossomas e 20 ug de lisato celular foram carregados por poço. Proteínas do gel SDS- PAGE foram transferidas para membrana PVDF de acordo com instrução do fabricante (Immobilon (RTM), Invitrogen). As membranas foram bloqueadas em tampão de bloqueio Odyssey (Licor) e sondadas com anticorpos contra polipeptídeo de domínio de ligação de NA e/ou a proteína exossômica de acordo com instrução do fornecedor (Anticorpos primários -
Abeam, Anticorpos secundários- Licor). Sondas moleculares visualizaram a ondas de comprimento 680 e 800 nm.
[0065] Para determinação de tamanho de EV, análise de rastreamento de nanopartícula (NTA) foi realizada com um instrumento NanoSight (RTM) equipado com software analítico, ou ocasionalmente com uma máquina Particle Matrics. Para registro no NanoSight (RTM), um nível de câmara de 13 ou 15 e função automática para todos as definições pós-aquisição foram usados. Microscopia eletrônica e microscopia de fluorescência foram frequentemente usadas para validar e avaliar morfologia e tamanho de EV.
[0066] As EVs foram isoladas e purificadas usando uma variedade de métodos, tipicamente uma combinação de filtração tais como TFF e cromatografia líquida de exclusão de tamanho e/ou cromatografia líquida de eluição de glóbulos. Tipicamente, os meios contendo EV foram coletados e submetidos a uma centrifugação a baixa velocidade a 300g por 5 minutos, seguido por centrifugação a 2.000g por 10 minutos para remover partículas grandes e resíduos celulares. O sobrenadante foi então filtrado com um filtro de seringa de 0,22 m e submetido a diferentes etapas de purificação. Grandes volumes foram diafiltrados e concentrados a aproximadamente 20 mL usando o dispositivo de fluxo tangencial Vivaflow 50R (TFF) (Sartorius) com filtros de corte 100 kDa ou o sistema KR2i TFF (SpectrumLabs) com filtros de fibra oca de corte 100 ou 300 kDa. O meio preconcentrado foi subsequentemente carregado nas colunas de eluição de glóbulos (HiScreen (RTM) ou coluna HiTrap (RTM) Capto Core 700, GE Healthcare Life Sciences), conectado a um sistema de cromatografia AKTAprime (RTM) plus ou AKTA Pure 25 (RTM) (GE Healthcare Life Sciences). As definições de vazão para equilíbrio da coluna, procedimento de carregamento de amostra e limpeza de coluna no local foram escolhidos de acordo com as instruções do fabricante. A amostra foi coletada de acordo com a cromatograma de absorbância de UV e concentrados usando um filtro de giro de corte de peso molecular de 10 kDa Amicon Ultra-15 (Millipore) a um volume final de 100 uL e armazenados a -80ºC para análise à jusante adicional. Para avaliar os perfis de eluição de proteína e RNA, os meios foram concentrados e diafiltrados com sistema KR2i TFF usando filtros de fibra oca de 100 kDa e kDa 300 e uma amostra analisada em uma coluna Tricorn 10/300 Sepharose 4 Fast Flow (S4FF) (GE Healthcare Life Sciences) . Exemplos
[0067] Exemplo 1. As MSCs derivadas de medula óssea foram cultivadas em frascos de cultura de tecido convencional e transientemente transfectadas usando transfecção PEI para permitir carregamento e expressão de moléculas cargas de mRNA e construtos de polipeptídeo de fusão. A Figura 2 mostra carregamento em EVs obtidad de BM- MSCs de moléculas cargas de mRNA que codificam NanoLuc (RTM) e p21. O carregamento foi alcançado usando construtos de polipeptídeo de fusão compreendendo CD63 como o polipeptídeo exossômico e PUF ou Cas6 como os domínios de ligação de NA. O experimento também incluiu números variados de sítios de ligação para os domínios de ligação de NA, a saber, 0, 3 e 6 sítios de ligação, que foram inseridos em diferentes lugares nos flancos 3' e/ou 5' da região codificante
[0068] As MSC-EVs foram purificadas usando uma combinação sequencial de TFF e SEC. A expressão apenas de polipeptídeo exossômico CD63 não resultou em carregamento de qualquer mRNA nas EVs (conjunto de colunas da direita no gráfico na Figura 2). A expressão de polipeptídeos de fusão compreendendo PUF (conjunto da esquerda das colunas: dois domínios de PUFs flanqueando CD63 tanto N terminalmente quanto C terminalmente, isto é, 4 construtos de PUF no total) (segundo conjunto de colunas da esquerda: um domínio PUF flanqueando CD63 tanto N terminalmente quanto C terminalmente) e Cas6 mutada (segundo da direita) não resultaram em carregamento significante de mRNA tanto de NanoLuc (RTM) quanto de mRNASs p21 mediante expressão nas células da fonte de EV. O carregamento de NanoLuc (RTM) foi em geral mais eficaz que o carregamento de p21, com até cerca de 45 cópias de mRNA por EV.
[0069] Exemplo 2. Silenciamento de expressão genética in vitro em células alvo (células HEK293) mediante administração mediada por EV de um shRNA alvejando huntingtina. Células amnióticas cultivadas em um incubador de agitação foram transduzidas usando transdução lentiviral para secretar EVs compreendendo o shRNA e construtos de polipeptídeo de fusão compreendendo como domínio de ligação de NA tanto PUF quanto Cas6, combinadas com CD63 ou CD81 como os polipeptídeos de EV, respectivamente. As EVs foram purificadas do sobrenadante usando ultracentrifugação. O eixo geométrico Y da Figura 3 mostra como o nível de expressão de huntingtina é diminuído com números crescentes de sítios de ligação na molécula carga de NA, resultando em aproximadamente 80% de eliminação usando um polipeptídeo de fusão compreendendo PUF-CD63-PUF para carregar o shRNA anti-huntingtina.
[0070] Exemplo 3. Expressão de NanoLuc (RTM) como um sistema repórter em células Huh7 alvos após administração de HEK mediada por EV de uma célula HEK293T de mRNA NanoLuc (RTM) foram estavelmente transduzidas para expressar vários construtos de polipeptídeo de fusão para carregamento de carga de mRNA NanoLuc (RTM) repórter em EVs. A molécula carga de RNA NanoLuc (RTM) foi modificada geneticamente para compreender 0, 3, ou 6 sítios de ligação para os domínios de ligação de NA compreendendo os construtos de polipeptídeo de fusão, nesse caso PUFx2-CD63- PUFxX2 (dois NA de PUF-polipeptídeos de ligação inseridos tanto N terminalmente quanto Cc terminalmente do polipeptídeo exossômico CD63), PUF-CD63-PUF, e Cas6-CD9- Cas6 (Figura 4).
[0071] Após a purificação das EVs derivadas de HEK com base em TFF combinadas com eluição de glóbulos LC, as EVs foram adicionadas às células HEK na concentração ideal, que para esse ensaio foi 10º7 EVs por poço em placa de 6 poços de células Huh7 alvos. O eixo geométrico Y da Figura 4 mostra unidades de brilho relativo (luminescência) (RLU) normalizadas em ug de proteína, indicando administração e/ou tradução intensificada com números crescentes de sítios de ligação usando os diferentes construtos de polipeptídeo de fusão. A Figura 4, portanto, demonstra que a presente invenção provês EVs que são capazes de administrar mRNA bioativa a células que é então traduzido com êxito por essas células. Isso é uma vantagem significante da presente invenção com relação à técnica anterior que é capaz de carregar apenas EVs com RNA, mas não é capaz de administrar essas RNAs ao citosol de células alvos a ser ativamente traduzidas.

Claims (28)

REIVINDICAÇÕES
1. Vesícula extracelular (EV), caracterizada pelo fato de compreender pelo menos um polipeptídeo de fusão compreendendo pelo menos um domínio de ligação de ácido nucleico (NA) e pelo menos um polipeptídeo exossômico, em que pelo menos um domínio de ligação de NA é um ou mais de PUF, Cas6, Casl3, e/ou um domínio de ligação de aptâmero de
NA
2. EV , de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de compreender adicionalmente pelo menos uma molécula de carga NA
3. EV, de acordo com a reivindicação 2, caracterizada pelo fato de que pelo menos uma molécula de carga NA é transportada para a EV com a ajuda do polipeptídeo de fusão.
4, EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 3, caracterizada pelo fato de que a molécula de carga NA é selecionada a partir do grupo compreendendo shRNA, miRNA, mRNA, gRNA, pri-miRNA, pre- MiRNA, RNA circular, piRNA, tRNA, rRNA, snRNA, INcRNA, ribozimas, DNA minicírculo, e/ou DNA de plasmídeo.
5. EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 4, caracterizada pelo fato de que cada molécula de carga NA compreende (i) pelo menos um sítio de ligação para o domínio de ligação de NA e (ii) um domínio de polinucleotídeo terapêutico.
6. EV, de acordo com a reivindicação 5, caracterizada pelo fato de que a molécula de carga NA compreende um sítio de clivagem entre pelo menos um sítio de ligação e o domínio de polinucleotídeo terapêutico.
7. EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 6, caracterizada pelo fato de que a molécula de carga NA codifica para um polipeptídeo terapêutico.
8. EV, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo terapêutico é selecionado a partir do grupo compreendendo anticorpos, intracorpos, fragmentos variáveis de cadeia única, aficorpos, enzimas, transportadores, supressores de tumor, inibidores virais ou bacterianos, proteínas de componente celular, proteínas de ligação de DNA e/ou RNA, inibidores de reparo de DNA, nucleases, proteinases, integrases, fatores de transcrição, fatores de crescimento, inibidores e indutores de apoptose, toxinas, proteínas estruturais, fatores neurotróficos, transportadores de membrana, proteínas de ligação de nucleotídeo, proteínas de choque térmico, proteínas associadas a CRISPR, e qualquer combinação dos mesmos.
9. EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo de fusão compreende pelo menos um polipeptídeo exossômico flanqueado N- e/ou C- terminalmente por domínios de ligação de NA e/ou em que pelo menos um domínio de ligação de NA é inserido na sequência de polipeptídeo exossômico.
10. EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo exossômico é selecionado a partir do grupo compreendendo CD9, CD53, CD63, CD8l, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, AARDCI1, Sintenina-l, Sintenina-2, Lamp2b, TSPAN8, sindecan-1l, sindecan-2, sindecan-3, sindecan-4, TSPANI4, CD37, CD82, CD151, CD231, CD1I02, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CDlla, CDll1b, CDllc, CDI8/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49%e, CD51, CD61, CD1I04, receptores de Fc, receptores de interleucina, imunoglobulinas, componentes de MHC-I ou MHC-II, CD2, CD3 epsilon, CD3 zeta, CDl3, CDI8, CDl9, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CDl11, CD1I15, CDl17, CDl25, CD135, CDI84, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6Al, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA- DM, HSPG2, LICAM, LAMBl, LAMC1, LFA-l, LGALS3BP, Mac-l alfa, Mac-l beta, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD,
TCRG, VTIl A, VTIl B, outros polipeptídeos exossomais, e quaisquer combinações dos mesmos.
11. EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que a EV compreende adicionalmente pelo menos uma fração de alvejamento.
12. EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 11, caracterizada pelo fato de que a molécula de carga NA é linear, circularizada, e/ou tem qualquer estrutura secundária e/ou terciária e/ou outras.
13. EV, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2 a 12, caracterizada pelo fato de que a molécula de carga NA compreende um ou mais do seguinte: (1) um sítio para ligação de miRNA, em que tal sítio opcionalmente é tipo específico de tecido e/ou célula; (ii) pelo menos um domínio estabilizante, tal como uma cauda poliA ou uma haste alça; Ou, (iii) pelo menos uma UTR híbrida na extremidade 5' e/ou 3'.
14. População de EVs caracterizada pelo fato de ser conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
15. População, de acordo com a reivindicação 14, caracterizada pelo fato de que o número médio de moléculas de cargas NA por EV em toda a população de EVs é acima de um por EV.
16. População, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 15, caracterizada pelo fato de compreender pelo menos duas subpopulações, em que a primeira subpopulação de EV compreende em média mais que um polipeptídeo de fusão por EV, e em que a segunda subpopulação de EV compreende a molécula de carga NA em questão combinada em média com mais que um polipeptídeo de fusão por EV.
17. População, de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 16, caracterizada pelo fato de que pelo menos 5%, pelo menos 10%, pelo menos 20%, pelo menos 50%, pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, e/ou pelo menos 95% de todas as EVs compreendem pelo menos uma molécula de carga NA.
18. Construto de polipeptídeo caracterizado pelo fato de compreender um polipeptídeo de fusão compreendendo pelo menos um domínio de ligação de NA e pelo menos um polipeptídeo exossômico, em que pelo menos um domínio de ligação de NA é um ou mais de PUF, Cas6, Casl3, e/ou um domínio de ligação de aptâmero de NA.
19. Construto de polipeptídeo, de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que opcionalmente compreende adicionalmente um ou mais de:
(1) pelo menos um domínio de multimerização; (ii) pelo menos um ligante; (iii) pelo menos um domínio de liberação tal como uma inteína; (iv) pelo menos um domínio de clivagem de RNA; (v) pelo menos uma fração de escape endossomal, e/ou, (vi) pelo menos uma fração de alvejamento
20. Construto de polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que codifica para o construto de polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a
19.
21. Construto de polinucleotídeo, de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo é essencialmente linear, circularizado e/ou tem qualquer estrutura secundária e/ou terciária e/ou de ordem superior e/ou é compreendido em um vetor tal como um plasmídeo, um polinucleotídeo de DNA circular, um vírus, um vírus adeno-associado, um mMRNA, um mRNA modificado, e/ou um minicírculo.
22. Método para produzir EVs, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de compreender:
(i) introduzir em uma célula produtora de EV pelo menos um construto de polinucleotídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 21; (ii) expressar na célula produtora de EV pelo menos um construto de polipeptídeo codificado por pelo menos um construto de polinucleotídeo, por meio disso gerando as ditas EVs.
23. Célula caracterizada pelo fato de compreender (1) pelo menos um construto de polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 21 e/ou (ii) pelo menos um construto de polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18-19 e/ou (iii) pelo menos uma EV, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
24. Célula, de acordo com a reivindicação 23, caracterizada pelo fato de que a célula é uma célula monoclonal e/ou uma linhagem celular monoclonal.
25. Célula, de acordo com qualquer uma das reivindicações 23 a 24, caracterizada pelo fato de que a célula é estavelmente modificada para compreender pelo menos um construto de polinucleotídeo monocistrônico, bicistrônico ou multicistrônico que codifica para o construto de polipeptídeo conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 19 e pelo menos uma molécula de carga NA.
26. Método in vitro para administração intracelular de pelo menos uma molécula de carga RNA caracterizado pelo fato de compreender colocar uma célula alvo em contato com pelo menos uma EV, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e/ou pelo menos uma população de EVs, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 17 e/ou pelo menos um construto de polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 21.
27. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de compreender (1) pelo menos um construto de polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20 a 21, (ii) pelo menos um construto de polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18 a 19, (iii) pelo menos uma EV, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, (iv) pelo menos uma célula, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 23 a 25, e/ou (v) pelo menos uma população de EVs, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 14 a 17, e um excipiente ou carreador farmaceuticamente aceitável.
28. o (i) pelo menos um construto de polinucleotídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 20-21, (11) pelo menos um construto de polipeptídeo, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 18-19, (iii) pelo menos uma EV, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 -13, (iv) pelo menos uma célula, conforme definida em qualquer uma das reivindicações 23-25, (v) pelo menos uma população de EVs, conforme definida qualquer uma das reivindicações 14- 17, e/ou (vi) a composição farmacêutica, conforme definida na reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que é para uso em medicina.
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