JP2022113690A - Rna治療薬を含むエクソソーム - Google Patents
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Abstract
【課題】1つには、標的細胞内への核酸(NA)ベース治療薬の装填とその後のEV媒介送達とに関連する本願明細書において特定された問題を克服すること、及び当技術分野における既存のニーズを満たすこと(例えば、問題とされるNA治療剤と共に適切な細胞内区画に到達するのを可能にすること)。【解決手段】本発明は、細胞外小胞(EV)治療薬であって、EVが、例えばmRNA、環状RNA、miRNA、shRNA、環状RNA、及び/またはDNA分子などの核酸(NA)ベース治療薬を含む、細胞外小胞(EV)治療薬に関係する。NA治療薬は、EV内への装填を強化し標的細胞内部でNAカーゴ分子の放出を容易にするための発明的なタンパク質及びNA操作戦略を用いて、EV内に装填される。【選択図】なし
Description
本発明は、細胞外小胞(EV)治療薬であって、EVが、内在的に装填されたRNA治療薬(例えば、mRNA、環状RNA、miRNA、shRNA、及び様々な他のRNA治療剤)を含む、細胞外小胞(EV)治療薬に関係する。
核酸ベース治療薬は、急速なペースで臨床的有用性に近づいている。遺伝子療法、mRNAベース療法、短いオリゴヌクレオチド及びsiRNAベース治療薬は、RNA治療薬ランドスケープ内における有り余るモダリティーのうちのいくつかの例に過ぎない。裸の核酸(典型的にはRNA)は、急速なクリアランス、ヌクレアーゼ活性、臓器特異的分布の欠如、及び細胞取込みの低い有効性によりin vivo送達が困難であり、特化された送達ビヒクルは、通常、生体活性送達を達成する手段として必須である。これは特に、非肝臓標的や高分子量RNA治療薬(例えば、mRNA及び遺伝子療法)の場合に該当する。
細胞外小胞(例えば、エクソソーム)は、典型的には、ほとんどの細胞タイプによって生成されるナノメートルサイズの小胞であり、細胞間のタンパク質、核酸、ペプチド、脂質、及びその他の様々な分子のための身体の天然輸送システムとして機能している。RNA含有EVは複数の治療的用法を可能性として有し、既に、遺伝子療法、mRNA送達、及び様々な状況下での短い核酸の送達のための送達ビヒクルとして研究が行われている。WO2010/119256は、エクソソームを用いた核酸送達の分野における基礎的な発明に相当し、当該出願は、いくつかのタイプの核酸カーゴの送達におけるエクソソームの有用性を教示している。公開されていない出願PCT/GB2017/051479は、親細胞内で形成されるEV内に目的RNAを引っ張り込むRNA結合タンパク質の助けによって様々なタイプのRNA治療薬を内在的に装填するための改良された方法を教示している。US14/502,494は、いわゆる標的化及びモジュールエクソソーム装填(TAMEL:Targeted And Modular Exosome Loading)システムを利用して、あるいくつかのRNA種の装填にRNA結合タンパク質を利用するための別の方法を説明している。
しかし、このような進歩にもかかわらず、特異的かつ効率的な方式での大小RNAカーゴのEV内装填は、依然として重大な改善の余地が存在する。さらに、標的細胞内への実際の生体活性送達はいかなる送達システムにおいてもキーとなる局面であり、従来技術はこの点においても改善の余地を有する。
US14/502,494に記載のTAMEL装填システム及び対応する参考文献(Hung and Leonard,Journal of Extracellular Vesicles 2016,5:31027)は複数の難点を有しており、本発明はこれを克服しようと試みている。TAMELシステムの主な難点は、mRNAの機能的送達を達成できないことである。すなわち、TAMELシステムによってエクソソーム内に装填されたmRNAは、細胞がこのエクソソームに曝露されたとき、細胞によって翻訳されない。本出願は、カーゴmRNAの生体活性送達を達成する。
Tutucci et al(An improved MS2 system for accurate reporting of the mRNA life cycle.Nat Methods.2018 Jan;15(1):81-89)は、RNA局在化及びライフサイクルを研究するためのMS2タンパク質の使用について論じており、TAMELシステムが使用するMS2タンパク質がRNAに対し非常に高い親和性で結合することを示している。当該論文は、この緊密な結合がmRNA制御の研究にとって問題になると報告している。MS2の緊密な結合は、装填されたいかなるRNA/核酸も放出されないことを意味するため、発明者らは、EV装填の文脈ではこの高親和性結合もまた問題になると推測している。mRNA放出が妨げられると正常な翻訳が妨げられるであろうことは、US14/502,494でmRNAの翻訳が観察されていない理由を説明すると考えられる。
Tutucci et al(An improved MS2 system for accurate reporting of the mRNA life cycle.Nat Methods.2018 Jan;15(1):81-89)は、RNA局在化及びライフサイクルを研究するためのMS2タンパク質の使用について論じており、TAMELシステムが使用するMS2タンパク質がRNAに対し非常に高い親和性で結合することを示している。当該論文は、この緊密な結合がmRNA制御の研究にとって問題になると報告している。MS2の緊密な結合は、装填されたいかなるRNA/核酸も放出されないことを意味するため、発明者らは、EV装填の文脈ではこの高親和性結合もまた問題になると推測している。mRNA放出が妨げられると正常な翻訳が妨げられるであろうことは、US14/502,494でmRNAの翻訳が観察されていない理由を説明すると考えられる。
TAMELシステムは全てのエクソソームに核酸を装填するわけではないように思われる。また、装填されるエクソソームにも非常に少数の核酸が装填されるに過ぎない(この可変かつ低いレベルの装填の難点については以下で詳細に論じられる)。この可変かつ低いレベルの装填は、装填される非常に少ない核酸が今度は放出される可能性が低く、そのため生体活性ではないという事実と合わせると、TAMELシステムが多くの難点を有することを意味する。TAMELシステムは、臨床的に意義のある量の生体活性の核酸を装填し送達するのに好適ではない。本発明はこれらの重大な難点を克服する。
TAMELシステムのもう1つの難点は、生成されたEVが患者に送達されるときに望ましくない免疫学的応答を誘発する恐れのあるバクテリオファージタンパク質を用いていることである。本発明はこの難点も克服する。
TAMELシステムのもう1つの難点は、生成されたEVが患者に送達されるときに望ましくない免疫学的応答を誘発する恐れのあるバクテリオファージタンパク質を用いていることである。本発明はこの難点も克服する。
Hung and Leonard,Journal of Extracellular Vesicles 2016,5:31027
Tutucci et al(An improved MS2 system for accurate reporting of the mRNA life cycle.Nat Methods.2018 Jan;15(1):81-89)
したがって、本発明の目的は、標的細胞内への核酸(NA)ベース治療薬の装填とその後のEV媒介送達とに関連する上記で特定された問題を克服すること、及び当技術分野における既存のニーズを満たすこと(例えば、問題とされるNA治療剤と共に適切な細胞内区画に到達するのを可能にすること)である。
本発明は、NAカーゴを装填及び放出するための新規のEV操作技術を利用することにより、これを達成する。これは、EN内への効率性の高い装填だけでなく問題とされるNAの有効な放出も確実にするポリペプチド及びポリヌクレオチドコンストラクトの高度な操作によって達成される。第1の態様において、これは、少なくとも1つの核酸(NA)結合ドメインと少なくとも1つのエクソソームポリペプチドとを含む少なくとも1つの融合ポリペプチドを含む細胞外小胞(EV)であって、少なくとも1つのNA結合ドメインが、Pumilio及びFBF相同タンパク質(PUF)、Cas6、ならびに/もしくはNAアプタマー結合ドメイン、またはこれらの任意の派生物及び/もしくはドメイン及び/もしくは類似体のうちの1つ以上である、細胞外小胞(EV)を提供することにより達成される。NA結合ドメインはいくつかのコピー内に有利に存在し得、各NAカーゴ分子も複数のコピー内に存在し得、このときあらゆるコピーはNA結合ドメインに対する複数の結合部位を有する。重要なことには、融合ポリペプチドの一部を形成しNAカーゴ分子との相互作用を担うNA結合ドメインは放出可能なNA結合ドメインであり、このことはNA結合ドメインとNAカーゴ分子との結合が可逆的で放出可能な相互作用であることを意味する。発明者らは、EV生成細胞内でのNAカーゴ分子の過剰発現が、NA結合ドメインとNAカーゴ分子との相互作用を可能にするための十分に高い局所濃度をもたらし、一方で標的位置内(例えば、標的細胞内部)のNA結合分子の濃度が低いとNA分子の効率的な放出が可能になり、これがNA分子の生体活性送達を可能にすることを理解した。そのため、NA結合ドメインとNAカーゴ分子との間の結合が放出可能な性質であることは特に有利である。
本発明は、発明性を有する融合ポリペプチドコンストラクト自体にも関連し、さらにこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドコンストラクトにも関連する。さらに、本発明は、問題とされるポリペプチドコンストラクトをコードするポリヌクレオチドコンストラクトに関連し、加えて安定性及び効力強化のために操作されたNAカーゴポリヌクレオチドにも関連する。
追加の態様において、本発明は、融合ポリペプチドコンストラクト及びNAカーゴ分子を含むEV集団、さらにEV、EV集団、ポリヌクレオチド及び/もしくはポリペプチドのコンストラクトの医薬組成物、ならびに/または上記の生体マクロ分子のいずれかを含有する細胞及び/もしくはその他のベクター(例えば、アデノウイルス、AAV、レンチウイルス、HSV、RSVなどのようなウイルス)に関連する。
また別の態様において、本発明は、本発明に従うEVを生成するための方法に関連する。このような方法は、少なくとも、(i)EV生成細胞内に、少なくとも1つの好適なポリヌクレオチドコンストラクトを導入するステップと、(ii)EV生成細胞内で、少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクトによってコードされた少なくとも1つのポリペプチドコンストラクトを発現させるステップと、(iii)EV生成細胞から、ステップ(ii)経由で取得可能なポリペプチドを含むEVを収集するステップとを含み得る。さらに、本発明は、少なくとも1つのRNAカーゴ分子の細胞内送達のためのin vitroの方法であって、標的細胞(典型的には標的細胞集団)を少なくとも1つのEV及び/または少なくとも1つのEV集団に接触させることを含む、方法にも関連する。
要約すると、本発明は、多数のNA治療薬カーゴのEV媒介送達のための新規の装填及び放出の戦略を提供する。有利なことには、本発明は、真核生物間でいずれも高度に保持されるタンパク質を使用するため、患者に送達されたときに有害な免疫応答を引き起こす可能性が低い。
本発明は、NAカーゴを生体活性様式で標的細胞内にin vitro及び/またはin vivoで導入及び送達するための新規の操作アプローチを用いた、EV送達NA治療薬の装填の改善、放出の調節、及び有効性の強化に関連する。
便宜及び明快性のため、本明細書で用いられるあるいくつかの用語を集め、以下に記載する。別途定義されない限り、本明細書で使用する全ての技術的用語及び科学的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されている意味と同じ意味を有する。
本発明の特色、態様、実施形態、または代替形態がマルクーシュグループの観点で記載されている場合、当業者は、本発明がその記載により、マルクーシュグループの任意の個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの観点でも記載されているものと認識するであろう。当業者はさらに、本発明がその記載により、マルクーシュグループの個々のメンバーまたはメンバーのサブグループの任意の組合せの観点でも記載されているものと認識するであろう。加えて、本発明の態様及び/または実施形態のうちの1つに関して記載されている実施形態及び特色は、本発明の他の全ての態様及び/または実施形態にも必要な変更を加えて適用されることに留意されたい。例えば、EVに関して本明細書に記載されている融合ポリペプチドは、本明細書における他の全ての態様、教示、及び実施形態、例えば、EVを生成するための方法もしくはEVに関する態様及び/もしくは実施形態、または本明細書に記載の対応するポリヌクレオチドコンストラクトに関連する態様及び/もしくは実施形態に関して開示され、関連し、かつ適合すると理解されるべきである。さらに、あるいくつかの態様に関して記載されているあるいくつかの実施形態、例えば、融合ポリペプチド及び任意選択でNA薬物カーゴ分子を含むEVの投与経路は、あるいくつかの医学的症状の治療に関係する態様に対し記載されるように、当然ながら、医薬組成物に関係する態様及び/または実施形態のような他の態様及び/または実施形態に関しても該当し得る。さらに、本明細書で同定されている全てのポリペプチド及びタンパク質は、ポリペプチドを融合させる従来的戦略を用いて、融合タンパク質内で自由に組み合わせることができる。非限定的な例として、本明細書に記載の(ポリペプチド由来の)NA結合ドメインは、1つ以上のエクソソームポリペプチドとの任意の組合せで自由に組み合わせることができ、任意選択で、本明細書における他の全てのポリペプチドドメイン、領域、配列、ペプチド、基、例えば、任意の多量体化ドメイン、放出ドメイン、及び/または標的化ペプチドと組み合わせることができる。また、エクソソームポリペプチド及び/またはNA結合ドメインも互いに組み合わせて、2つ以上のエクソソームポリペプチド及び/または2つ以上のNA結合ドメインを含むコンストラクトを産生することができる。さらに、あらゆる特色(例えば、マルクーシュグループのあらゆるメンバー)はあらゆる他の特色(例えば、他の任意のマルクーシュグループのあらゆるメンバー)と自由に組み合わせることができ、例えば、任意のNA結合ドメインは任意のエクソソームポリペプチドと組み合わせることができる。さらに、本明細書の教示がEVに対し単数形で、及び/または個別的な天然のナノ粒子様小胞として言及する場合、全てのこのような教示は複数のEV及びEV集団にも同様に該当し適用可能であると理解されるべきである。一般論として、本発明に従うNA結合ドメイン、エクソソームポリペプチド、EV生成細胞供給源、追加のドメイン及びペプチド、NAカーゴ分子、ならびに他の全ての態様、実施形態、及び代替形態は、本発明の範囲及び骨子の逸脱を伴わないあらゆる可能な組合せで自由に組み合わせることができる。さらに、本発明の任意のポリペプチドもしくはポリヌクレオチド、または任意のポリペプチドもしくはポリヌクレオチドの配列(それぞれアミノ酸配列もしくはヌクレオチド配列)は、任意の所与の分子が本発明に関連する所望の技術的効果を実行する能力を保持する限り、元のポリペプチド、ポリヌクレオチド、及び配列からある程度逸脱してもよい。本出願に従うポリペプチド及び/またはポリヌクレオチド配列は、その生物学的特性が維持される限り、ネイティブ配列と比較して(例えば、BLASTまたはClustalWを用いた計算で)50%逸脱してもよいが、可能な限り高い配列同一性が好ましい(例えば、60%、70%、80%、または例えば90%以上)。(例えば、いくつかのポリペプチドの)組合せ(融合)は、それぞれのポリペプチドのあるいくつかのセグメントが置換及び/もしくは修飾され得ること、ならびに/または配列が他のアミノ酸の連なりの挿入によって中断され得ることを含意し、これは、キーとなる特性(例えば、NA結合、EV内へのトラフィッキング、標的化能力など)が保存されている限り、ネイティブ配列からの逸脱は考慮に入れるべきであり得ることを意味する。したがって、同様の推論はこのようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド配列にも当然ながら適用される。ペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質に関して本明細書で述べられる任意のアクセッション番号または配列番号は単に例及び参考としてみなされるものとし、全てのペプチド、ポリペプチド、及びタンパク質には、当業者が理解するような通常の意味が与えられるものとする。したがって、上述のように、当業者は、本発明が本明細書で言及される特定の配列番号及び/またはアクセッション番号のみを包含するだけではなく、それらのバリアント及び派生物も包含することも理解するであろう。本明細書で言及される全てのアクセッション番号はUniProtKBアクセッション番号であり、本明細書で述べられる全てのタンパク質、ポリペプチド、ペプチド、ヌクレオチド、及びポリヌクレオチドは、当業者が理解する従来的な意味に従って解釈されるものとする。
「細胞外小胞」もしくは「EV」または「エクソソーム」という用語は、本明細書では互換的に使用され、任意の形態の細胞から取得可能な任意のタイプの小胞、例えば、微小胞(例えば、細胞の形質膜からもたらされる小胞)、エクソソーム(例えば、エンドリソソーム経路から誘導される小胞)、(例えば、アポトーシス細胞から取得可能な)アポトーシス体、(例えば、血小板から誘導される)微粒子、(例えば、血清中の好中球及び単球から誘導可能な)エクソソーム、(例えば、前立腺癌細胞から取得可能な)プロスタトソーム、または(例えば、心臓細胞から誘導可能な)カルジオソームなどに関連するものと理解されたい。EVのサイズは相当程度に変動し得るが、典型的にはEVはナノサイズの流体力学的直径、すなわち1000nm未満の直径を有する。明らかに、EVはin vivo、ex vivo、及びin vitroの任意の細胞タイプから誘導することができる。好ましいEVとしては、エクソソーム及び微小胞が挙げられるが、他のEVも様々な状況下で有利であり得る。さらに、当該用語は、細胞外小胞模倣物や細胞膜ベース小胞(例えば、膜の押出、超音波処理、またはその他の技法を介し取得可能)などにも関連するように理解するものとする。EVの医学的及び科学的な使用及び応用先について記載する場合、本発明が通常、複数のEV、すなわち千、万、億単位のEV、または兆単位ものEVを含み得るEV集団に関連することは当業者には明らかであろう。後述の実験セクションから分かるように、EVは、例えば、体積単位当たり(例えば、ml当たり)105、108、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1018、1025、1030個(しばしば「粒子」と称される)、またはこれより大きい、小さい、もしくはこれらの間にある他の任意の数字の濃度で存在し得る。同じように、「集団」という用語は、例えば、エクソソームポリペプチドとNA結合ドメイン(ひいては目的NAカーゴ分子に結合し得る)との間のある融合ポリペプチドを含むEVに関連する場合があるが、当該用語は、このような集団を構成する複数の実体を包含するように理解するものとする。言い換えれば、個々のEVは、複数で存在する場合、EV集団を構成する。したがって、当然ながら本発明は、当業者には明らかであろうように、個々のEV及びEVを含む集団の両方に関係する。in vivoで適用する場合のEVの薬用量は、当然ながら、治療対象となる疾患、投与経路、治療活性、効果、NAカーゴ分子の効力、EV上に存在する任意の標的化部分、医薬製剤などに応じて相当程度に変動し得る。さらに、本発明のEVは、NAカーゴ分子に加えて追加の治療剤も含むことができる。いくつかの実施形態において、追加の治療剤は少なくとも1つの治療小分子薬物であり得る。いくつかの実施形態において、治療小分子薬物は、DNA損傷剤、DNA合成を阻害する薬剤、微小管及びチューブリン結合剤、代謝拮抗物質、酸化損傷誘導物質、抗血管新生物質、内分泌療法、抗エストロゲン、免疫調節物質(例えば、トール様受容体アゴニストまたはアンタゴニスト)、ヒストンデアセチラーゼ阻害物質、シグナル伝達阻害物質(例えば、キナーゼ阻害物質)、ヒートショックタンパク質阻害物質、レチノイド、成長因子受容体阻害物質、抗有糸分裂化合物、抗炎症物質、細胞周期制御物質、転写因子阻害物質、及びアポトーシス誘導物質、ならびにこれらの任意の組合せからなる群より選択することができる。さらなる実施形態において、追加の治療剤は追加の治療核酸ベース薬剤であり得る。このような追加の核酸ベース治療剤は、1本鎖RNAもしくはDNA、2本鎖RNAもしくはDNA、siRNAのようなオリゴヌクレオチド、スプライススイッチングRNA、CRISPRガイド鎖、ショートヘアピンRNA(shRNA)、miRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、mRNAのようなポリヌクレオチド、プラスミド、または他の任意のRNAもしくはDNAベクターを含む群から選択することができる。特に関心対象となるのは、化学的に合成された核酸ベース薬剤、及び/または化学的に修飾されたヌクレオチド(例えば、2’-O-Me、2’-O-アリル、2’-O-MOE、2’-F、2’-CE、2’-EA 2’-FANA、LNA、CLNA、ENA、PNA、phosphorothioates、tricyclo-DNAなど)を含む核酸ベース薬剤である。またさらなる実施形態において、本発明に従うEVは、タンパク質及び/またはペプチドであり得る追加の治療剤を含むことができる。このようなタンパク質及び/またはペプチドは、EVの内部に存在する場合もあれば、EV膜内に挿入されるかもしくはEV膜に付随する場合もあり、またはEVから小胞外環境に突出している場合もある。このような治療タンパク質及び/またはペプチド薬剤は、以下を含めた非限定的な例の群から選択され得る:抗体、細胞内抗体、1本鎖可変断片(scFv)、アフィボディ、二重及び多重特異性抗体または結合物質、アフィボディ、darpin、受容体、リガンド、酵素(例えば、酵素置換え療法または遺伝子編集のための酵素)、腫瘍抑制物質(非限定的な例としてはp53、p21、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、及び/またはST15が挙げられる)、ウイルスまたは細菌阻害物質、細胞構成要素タンパク質、DNA及び/またはRNA結合タンパク質、DNA修復阻害物質、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグラーゼ、転写因子、成長因子、アポトーシス阻害物質及び誘導物質、毒素(例えば、シュードモナス外毒素)、構造タンパク質、神経栄養因子(例えば、NT3/4)、脳由来神経栄養因子(BDNF)ならびに神経成長因子(NGF)及びその個々のサブユニット(例えば、2.5Sベータサブユニット)、イオンチャネル、膜トランスポーター、プロテオスタシス因子、細胞シグナリングに関与するタンパク質、翻訳及び転写関連タンパク質、ヌクレオチド結合タンパク質、タンパク質結合タンパク質、脂質結合タンパク質、グリコサミノグリカン(GAG)及びGAG結合タンパク質、代謝タンパク質、細胞ストレス制御タンパク質、炎症及び免疫システム制御タンパク質、ミトコンドリアタンパク質、ならびにヒートショックタンパク質など。
「エクソソームポリペプチド」、「エクソソームタンパク質」、「エクソソーム担体タンパク質」、「EVタンパク質」、及び「EVポリペプチド」という用語は本明細書では互換的に使用され、これらの用語は、ポリペプチドコンストラクト(典型的には、エクソソームポリペプチドに加えて、NA結合ドメイン、例えば、NA結合ドメインを含むポリペプチドを含む)を好適な小胞構造まで、すなわち好適なEVまで輸送するのに利用することができる任意のポリペプチドに関連するものと理解されたい。より具体的には、これらの用語は、融合タンパク質コンストラクトの小胞構造(例えば、EV)までの輸送、トラフィッキング、また移送を可能にする任意のポリペプチドを含むものとして理解されたい。このようなエクソソームポリペプチドの例としては、例えば、CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71(トランスフェリン受容体としても知られる)及びそのエンドソーム選別ドメイン、すなわちトランスフェリン受容体エンドソーム選別ドメイン、CD133、CD138(シンデカン-1)、CD235a、ALIX、AARDC1、シンテニン-1、シンテニン-2、Lamp2b、シンデカン-2、シンデカン-3、シンデカン-4、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受容体、インターロイキン受容体(例えば、TNFR及びgp130)、免疫グロブリン、MHC-IまたはMHC-II構成要素、CD2、CD3イプシロン、CD3ゼータ、CD13、CD18、CD19、CD30、TSG101、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1アルファ、Mac-1ベータ、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、その他のエクソソームポリペプチド、ならびにこれらの任意の組合せまたは誘導体があるが、ポリペプチドコンストラクトをEVに輸送可能な多くの他のポリペプチドも本発明の範囲内に含まれる。本発明のいくつかの実施形態において、少なくとも1つのエクソソームポリペプチドは、NAカーゴ分子の装填を助けるためのEV内に存在する融合タンパク質を形成するために、NA結合ドメインと融合している。このような融合タンパク質は、自らの機能(1つまたは複数)を最適化するための他の様々な構成要素も含むことができ、これにはリンカー、膜貫通ドメイン、細胞基質ドメイン、多量体化ドメインなどが含まれる。
「NA結合ドメイン」または「NA結合ポリペプチド」または「NA結合タンパク質」という用語は、本明細書では互換的に使用され、ヌクレオチドの連なりと結合可能な任意のドメインに関連する。NA結合ドメインは、RNA、DNA、RNA及びDNAのミックスマー、特定のタイプのNA、例えば、shRNA、miRNA、mRNA、gRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、環状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、IncRNA、リボザイム、ミニサークルDNA、プラスミドDNAなどと結合することができる。さらに、NA結合ドメイン(1つまたは複数)は、化学的に修飾されたヌクレオチド、例えば、2’-O-Me、2’-O-アリル、2’-O-MOE、2’-F、2’-CE、2’-EA 2’-FANA、LNA、CLNA、ENA、PNA、ホスホロチオエート、トリシクロDNAなどにも結合することができる。さらに、NA結合ドメインは、NAの特定の配列、リピートなどのドメイン、またはNAモチーフ(例えば、ステムループもしくはヘアピン)にも結合することができる。NA結合ドメインのためのこのような結合部位は、NAカーゴ分子内に天然に存在してもよく、かつ/またはNAカーゴ分子内で操作されてEV装填及び生体活性送達をさらに強化してもよい。NA結合ドメインの核酸に対する結合親和性は、核酸が十分に高い親和性でエクソソームに移送され、ただし次に続く、核酸が標的細胞に送達されたときに生体活性であるようにするための核酸の標的細胞内への放出を妨げるほどには高くないようにする。したがって、重要かつ従来技術と完全に対照的であることには、本発明は、放出可能なNA結合ドメインの助けによりNAカーゴ分子が装填されたEVであって、当該NA結合ドメインがエクソソームポリペプチドと共に融合ポリペプチドの一部を形成する、EVに関連する。本発明のNA結合ドメインは、NA結合ドメインとNAカーゴ分子との間のプログラム可能で修飾可能な親和性を可能にし、NA結合ドメインと少なくとも1つのNAカーゴ分子とを含む融合ポリペプチドを含むEVの生成を可能にするように選択されており、このとき、融合ポリペプチドコンストラクトのNA結合ドメインは、プログラム可能で可逆的で修飾可能な様式でNAカーゴ分子と相互作用し、EV内への装填と、EV内で及び/または標的細胞に関してのNAカーゴ分子の放出との両方を可能にする。これは、MS2タンパク質を用いて単にmRNA分子のエクソソーム内への装填を可能にし、ただしMS2タンパク質はmRNAに結合したままであり、その放出及び次に続く翻訳を阻害している先行技術とは完全に対照的である。
本発明は主に、3つの群のNA結合ドメイン、すなわち、PUFタンパク質、CRISPR関連ポリペプチド(Cas)(具体的にはCas6及びCas13)、ならびに様々なタイプのNA結合アプタマーに関連する。本発明では、PUFタンパク質という用語は、全ての関連タンパク質及びこのようなタンパク質のドメイン(PUMタンパク質とも称され得る)、例えば、ヒトPumilioホモログ1(PUM1)、PUM1の重複物であるPUMx2もしくはPUFx2など、または任意のPUF(PUM)タンパク質から取得可能な任意のNA結合ドメインを包含するように使用される。PUFタンパク質は、典型的には、8つの連続したPUFリピートの存在によって特徴づけられ、およそ40アミノ酸の各々には、しばしば2つの関連配列Csp1及びCsp2が隣接する。各リピートは、芳香族残基及び塩基性残基を含有する「コアコンセンサス」を有する。PUFリピートの全体的クラスターはRNA結合に必要とされる。注目すべきことには、この同じ領域はタンパク質共制御物質とも相互作用し、PUFタンパク質変異体の欠点をかなりの程度まで救済するのに十分であり、これによりPUFタンパク質は本発明で使用される変異に対し非常に好適なものとなる。さらに、PUFタンパク質は、好適な親和性でNAカーゴ分子に結合することでPUFタンパク質のNAカーゴに対する放出可能で可逆的な接続を可能にする、放出可能なNA結合ドメインの非常に好ましい例である。PUFタンパク質はほとんどの真核生物に見いだされ、胚形成及び発生に関与する。PUFは、概して36アミノ酸を含有する8つのリピートから構成されるRNAに結合する1つのドメインを有し、これが本特許出願でRNA結合のために典型的に利用されるドメインである。各リピートは特定のヌクレオチドに結合し、アミノ酸13からのスタッキング相互作用を伴って特異性を付与するのは一般的に12位及び16位のアミノ酸である。天然に存在するPUFは、アデノシン、ウラシル、及びグアノシンヌクレオチドに結合することができ、操作されたPUFはシトシンヌクレオチドにも結合することができる。したがって、システムはモジュラー式であり、PUFドメインが結合する8ヌクレオチド配列はリピートドメインの結合特異性を切り替えることにより変化させることができる。したがって、本発明に従うPUFタンパク質は天然であっても、RNA分子内の任意の場所に結合するように操作されてもよく、または代替的に、異なる配列に対する異なる結合親和性を有するPUFタンパク質を選び、RNA分子が当該配列を含有するように操作してもよい。さらに、配列特異的方式で16ヌクレオチドに結合する操作及び/または重複されたPUFドメインが存在し、これはNAカーゴ分子に対する特異性をさらに増加させるために利用することもできる。したがって、PUFドメインは異なる親和性及び配列長で任意の配列に結合するように修飾することができ、これによりシステムのモジュール性は非常に高いものとなり、本発明に従う任意のRNAカーゴ分子に対し適合可能になる。本発明に従うNA結合ドメインとして使用することができるPUFタンパク質及び領域ならびにその派生物としては、以下の非限定的なPUFタンパク質のリストが挙げられる:FBF、FBF/PUF-8/PUF-6、-7、-10(全てC.elegans由来);D.melanogaster由来のPumilio;Puf5p/Mpt5p/Uth4p、Puf4p/Ygl014wp/Ygl023p、Puf5p/Mpt5p/Uth4p、Puf5p/Mpt5p/Uth4p、Puf3p(全てS.cerevisiae由来);Dictyostelium由来のPufA;ヒトPUM1(Pumilio1、場合によりPUF-8Rとしても知られる)及びその任意のドメイン、少なくとも2つのPUM1由来のNA結合ドメインを含むポリペプチド、任意の切断または修飾または操作されたPUFタンパク質、例えば、PUF-6R、PUF-9R、PUF-10R、PUF-12R、及びPUF-16R、またはその派生物;ならびにXenopus由来のX-Puf1。本発明に従う特に好適なNA結合PUFとしては以下のものが挙げられる:PUF531(非限定的な例として配列番号1が例示される)、PUF mRNA loc(場合によりPUFengineeredもしくはPUFengと称される)(非限定的な例として配列番号2が例示される)、及び/またはPUFx2(非限定的な例として配列番号3が例示される)、ならびにこれらの任意の派生物、ドメイン、及び/または領域。PUF/PUMタンパク質は、ヒト由来であるように選択することができるため非常に有利である。配列番号1~3の配列は図5に示されている。
ヒト由来のタンパク質は、有害な免疫応答を誘発する(illicit)可能性がより低いため、US14/502,494で使用されているMS2タンパク質のようなバクテリオファージ由来のタンパク質よりも有益である。さらに、MS2はバクテリオファージ由来のステムループと相互作用するが、これはPUFタンパク質とは異なり、原核生物のNA配列及びモチーフが選択されたNA分子内に導入される必要があることを含意する。明らかに、このバクテリオファージ由来及び構造のステムループ構造の挿入は、mRNA翻訳を妨害して非機能的なmRNAカーゴ分子を生じるか、または免疫毒性を引き起こす恐れがある。
したがって、有利な実施形態において、本発明はエクソソームタンパク質と融合した真核生物NA結合タンパク質に関連する。好ましい実施形態において、NA結合ドメイン(1つまたは複数)はPUFファミリー由来のもの、例えば、PUF531、PUFengineered、及び/またはPUFx2である。重要なことには、PUFタンパク質は、好ましくはmRNAまたはshRNAのEV媒介送達に使用され、これはPUFタンパク質の配列特異性により、NA薬物カーゴの非常に調節され特異的な装填を可能にする。好ましい実施形態において、PUFタンパク質(1つまたは複数)は、膜貫通または可溶性エクソソームタンパク質と有利に組み合わされる。有利な融合タンパク質コンストラクトとしては、以下の非限定的な例が挙げられる:CD63-PUF531、CD63-PUFx2、CD63-PUFengineered、CD81-PUF531、CD81-PUFx2、CD81-PUFengineered、CD9-PUF531、CD9-PUx2、CD9-PUFengineered、及びその他の膜貫通ベース融合タンパク質(好ましくは、1つ、2つ、またはそれ以上のPUFタンパク質と融合したテトラスパニンエクソソームタンパク質に基づくもの)。PUFタンパク質と少なくとも1つの可溶性エクソソームタンパク質とを含む有利な融合タンパク質としては、以下の非限定的な例が挙げられる:シンテニン-PUF531、シンテニン-PUx2、シンテニン-PUFengineered、シンデカン-PUF531、シンデカン-PUx2、シンデカン-PUFengineered、Alix-PUF531、Alix-PUx2、Alix-PUFengineered、さらにPUFタンパク質と融合した他の任意の可溶性エクソソームタンパク質。
PUFタンパク質が標的NAカーゴ分子に対する修飾可能な配列特異性を有するという事実により、PUFタンパク質はエクソソームポリペプチドパートナー(1つまたは複数)と融合するための理想的なNA結合ドメインとなる。したがって、本発明の好ましい実施形態において、EVには、(エクソソームタンパク質を有する融合タンパク質の一部としての)放出可能なNA結合ドメインを用いてNAカーゴ分子が装填され、このとき、NA結合ドメインとNAカーゴ分子との相互作用は標的ヌクレオチド配列に対する特異性に有利に基づき、(2次構造は配列特異性を可能にしないため)標的ヌクレオチドの2次構造には基づかない。好ましい実施形態において、NAカーゴ分子は、NA結合ドメインとして選ばれたPUFタンパク質のための標的ヌクレオチド配列を含むように操作され、かつ/またはこれを天然に含む。このような標的ヌクレオチド配列は、上述のように、例えばmRNAの3’UTRの一部である場合もあれば、任意のNAカーゴ分子(例えば、mRNA、shRNA、miRNA、IncRNA、DNAなど)内に導入されて、PUFタンパク質がNAカーゴ分子に結合するのを可能にする場合もある。NAカーゴ分子上のPUF結合部位は、典型的には、他の多くのRNA結合タンパク質(例えば、4ヌクレオチドとステムループとの組合せを認識するに過ぎないMS2)が結合する配列よりも長いため、標的結合部位上のヌクレオチドの好ましい長さは、例えば、NA結合ドメインにおける修飾可能な配列特異性の必要性に応じて、5ヌクレオチド(nt)、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、またはさらに20nt以上とすることができる。好ましい実施形態において、PUFタンパク質は、長さが6nt、8nt、9nt、10nt、12nt、または16ntの天然及び/または人工的に存在するNAカーゴ分子結合部位に対し特異的である。
CRISPR関連ポリペプチド(Cas)はもう1つのNA結合ドメイン群に相当し、特にCas6(非限定的な例として配列番号4が例示され、これは図5に示されている)及びCas13、ならびに任意の他のRNA結合Cas分子が挙げられ得る。Cas6は前駆体CRISPR RNA(crRNA)に高い親和性で結合し、これを、後の取り込み(例えば、Cas9内への取り込み)のために処理する。RNA分子の切断速度は調節及び高度な定義をすることができ、したがって、RNA分子とCas6との間の会合時間も非常に正確な様式で定義することができる。このことは、本発明の目的において重要である。変異させたCas6またはCas13の変異バージョンを使用してRNA切断の効率を増加または減少させることができる。変異させたCas6またはCas13の変異バージョンを使用してRNA結合の親和性を増加または減少させることができる。これは、例えば、RNAカーゴ分子が受容細胞内で放出されるときに利点となるであろう。次に、規定された会合時間は、生成細胞内ではなく小胞内部にRNA分子を放出するように調節することができる。Cas6が認識できるRNA配列は、目的NA分子内に挿入されるように操作することができる。Cas13は、規定されたRNA標的のみに結合しそれを分解しないように操作することができる。Cas13-sgRNA複合体は、sgRNA分子の配列を変更することにより、20~30ヌクレオチドの任意のRNA配列に結合するように調節することができる。例えば、Casタンパク質由来のNA結合ドメインの使用は、短いRNA(例えば、shRNAまたはmiRNA)の送達に特に有利である。このような場合、選択されたCasポリペプチドの切断活性は、例えばshRNAカーゴ分子を、例えばCas6が結合している結合部位から放出するのに使用することができる。さらに、PUFタンパク質の場合のように、Casタンパク質は、好適な親和性でNAカーゴ分子に結合することでCasタンパク質のNAカーゴに対する放出可能で可逆的な接続を可能にする、放出可能なNA結合ドメインの非常に好ましい例である。PUFベースNA結合ドメインと同様、Casタンパク質は、標的NAカーゴ分子に対するプログラム可能で修飾可能な配列特異性を伴った放出可能で可逆的なNA結合ドメインに相当し、より低い全体親和性でより高い特異性を可能にし、それによりNAカーゴのEV内への装填と、NAカーゴの標的位置内での放出との両方を可能にする。
NAアプタマー結合ドメインは、本発明に従うもう1つのNA結合ドメイン群である。このようなNAアプタマー結合ドメインは、NAベースアプタマーにより特異的に結合され得るドメイン、領域、アミノ酸の連なり、または全体のポリペプチドもしくはタンパク質である。アプタマーは、2次及び/または3次構造を形成して、標的抗原に対する抗体の親和性と同様に分子を認識するRNA配列である。したがって、このようなRNA分子は高い親和性を有する特定のアミノ酸配列を認識することができる。RNAアプタマーは、本発明ではNA分子内に特定のヌクレオチド配列を挿入することにより適用され、特定のアミノ酸配列を認識する。このようなアミノ酸配列は、エクソソーム担体ポリペプチド内及び/またはその隣で操作されて、アプタマー(NAカーゴ分子内及び/またはその隣で操作される)がそれに結合するのを可能にし、よってNAカーゴ分子をエクソソームポリペプチドの助けによりEV内に移送することができる。好適な特徴を有する2つのアプタマーは、ヒスチジン(His)アミノ酸の連なりに対し高い親和性を有するHisアプタマー(非限定的な例として配列番号5により例示される)、及びHIV Tatドメインに対するアプタマー(非限定的な例として配列番号6により例示される)である。アプタマー配列(1つまたは複数)は、好ましくはmRNAの3’及び/もしくは5’非翻訳領域またはノンコーディングRNAの非特異的領域に挿入される。また、2つ以上のアプタマーを1つのNAカーゴ分子内で組み合わせてエクソソーム担体タンパク質に対する特異性及び結合活性を増加させることもできる。配列番号5及び6の配列は図5に示されている。重要なことには、本発明の全てのNA結合ドメインは、NAカーゴ分子(例えば、mRNA、shRNA、またはmiRNA)に対するプログラム可能で配列特異的で可逆的で放出可能な結合をもたらし、先行技術に見いだされるRNAに対する高親和性の非可逆的な結合とは完全に対照的である。本発明の好ましい実施形態において、NA結合ドメインはPUFタンパク質またはCasタンパク質である。これは、これらのタンパク質の容易にプログラム可能な性質及び配列特異性と、これらのタンパク質のNAカーゴ分子に対する可逆的で放出可能な結合とが組み合わされることによるものである。重要なことには、NA結合ドメインとしてのCasタンパク質及びPUFタンパク質の配列特異性は、好ましくは標的NA分子上の少なくとも6nt、好ましくは少なくとも8ntとの相互作用に基づいており、これは、低親和性相互作用と組み合わせたときに、NAカーゴ分子の高生産性のEV媒介送達を可能にする。NAカーゴ分子上の少なくとも6ntの結合部位は、好ましくはヌクレオチドの連続する配列内に存在する。したがって、NAカーゴ分子の結合部位は好ましくは長さが2つのコドンに対応する。
第1の態様において、本発明は、少なくとも1つの核酸(NA)結合ドメインと少なくとも1つのエクソソームポリペプチドとを含む少なくとも1つの融合ポリペプチドを含む細胞外小胞(EV)であって、少なくとも1つのNA結合ドメインが、PUF、CRISPR関連(Cas)ポリペプチド、及び/またはNAアプタマー結合ドメインのうちの1つ以上であってもよい、細胞外小胞(EV)に関連する。EVは、NA結合ドメインが存在する結果として、典型的にはさらに、少なくとも1つのNAカーゴ分子を含む。通常は、あらゆるEVに含まれるNAカーゴ分子の数は相当なものであり、これは、通常達成する装填有効性が非常に低い先行技術にまさる明らかな改善である。本発明の場合、融合ポリペプチドコンストラクトの発明的設計は、少なくとも1つのNAカーゴ分子が(融合ポリペプチドの助けにより)非常に効率的にEV内に輸送され、その後に顕著に改善した放出プロセスが行われることを意味する。NA結合ドメイン(融合ポリペプチドに含まれる)とNAカーゴ分子との間の結合の放出可能な性質は、(NAカーゴ分子が通常は過剰発現する)EV生成細胞内でのNAカーゴ分子の結合を可能にすると同時に、標的細胞内及び/またはその付近の生体活性NA分子の送達を可能にするため、この性質は本発明のキーとなる点である。
したがって、先行技術とは異なり、NA結合ドメインとNAカーゴ分子との間の相互作用がプログラム可能で親和性がより低いことにより、本発明は効率的にEVをEV生成細胞に装填することが可能になると同時に、NAカーゴ分子とNA結合ドメインとの間の相互作用のより低い親和性及び放出可能な性質が非常に有利であるような好適な位置(典型的には標的細胞内部)でNAカーゴを放出することも可能になる。さらに、4nt及びステムループに結合する高親和性RNA結合タンパク質としてMS2を開示するに過ぎない先行技術とは異なり、本発明は、より長いためにより特異的である(例えば6nt長または8nt長の)ヌクレオチドの連なりに対する配列特異的な低親和性または中親和性の結合を可能にする。
結合部位の長さがより長ければ、一連の修飾された結合親和性を有する結合部位を産生する一連の異なる変異が導入され、よって上述されているプログラム可能なより低い親和性相互作用をもたらすことが可能になる。例えば、1つの点変異を6または8ヌクレオチド領域に導入すると結合親和性はわずかに修飾されるが、MS2のより短い4ヌクレオチド結合領域内では、1つの変異ですらMS2のRNAに対する結合親和性に著しく影響を及ぼすことが知られている。核酸の長さが長いほど、その核酸に対するタンパク質の結合親和性に影響を及ぼす1つ以上の変異を導入するための範囲が大きくなる。同様に、より長いヌクレオチドの連なりが結合するように求めれば、より長いヌクレオチド配列と相互作用可能な多数のアミノ酸がもたらされ、よってこれらの相互作用するアミノ酸を変異するためのより多くの可能性がもたらされ、さらに、様々な結合親和性を伴ったより広い範囲の考えられ得るタンパク質変異体がもたらされる。PUF、Cas6、及びCas13のより長いヌクレオチド結合部位及びより大きなタンパク質結合部位は、MS2タンパク質またはMS2 RNA配列の変異によって達成されるであろう親和性よりも広い範囲の親和性が変異によって達成できるようにする点において利点をもたらす。したがって、このより長い配列は、カーゴ核酸の放出を改善するために必要な場合に個々の目的カーゴに対する結合親和性を特異的に調整するように核酸及び/または結合タンパク質を操作する可能性をより大きくする。上記で論じられたように、ヌクレオチドカーゴに対する結合の親和性を調節しヌクレオチドカーゴの放出能力を修飾及び調節する能力は、先行技術にまさる本発明の重大な利点であり、生体活性核酸の送達及び放出をもたらす。
1つの実施形態において、NAカーゴ分子は、shRNA、miRNA、mRNA、gRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、環状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、IncRNA、リボザイム、ミニサークルDNA、プラスミドDNAを含む群から選択することができるが、本質的には、任意のタイプのNA分子が本発明に従ってEVに含まれてもよい。1本鎖及び2本鎖両方のNA分子が本発明の範囲内であり、NA分子は天然に存在するもの(例えば、RNAまたはDNA)であってもよく、または化学的に修飾されたヌクレオチド、例えば、2’-O-Me、2’-O-アリル、2’-O-MOE、2’-F、2’-CE、2’-EA、2’-FANA、LNA、CLNA、ENA、PNA、ホスホロチオエート、トリシクロ-DNAなどを含み得る化学的に合成されたRNA及び/またはDNAであってもよい。重要なことには、本発明はNAカーゴ分子(例えば、mRNA、環状RNA、shRNAなど)の内在的装填に非常に好適であるものの、外因的NA分子による装填にも適用可能であり、外因的NA分子は、EV生成細胞を問題とされるNA分子に曝露することにより、かつ/またはEV自体との共インキュベートもしくは製剤化により、装填することができる。
特定の実施形態において、NA結合ドメインはCas6またはCas13であり、NAカーゴ分子はshRNAである。Cas6/Cas13の生得的活性は、Cas6またはCas13が結合するNA結合ドメイン(1つまたは複数)からのshRNAの切断をもたらし、融合タンパク質とNA結合ドメインとの間の複合体からshRNAを放出することから、Cas6/Cas13とshRNAカーゴとの組合せは有利である。加えて、shRNAは、ひとたび細胞質内に放出されるといかなるcapにもポリAにも機能することを要求しないため、切断されたshRNAは、高い活性を有する遺伝子を直ちにサイレンシングできる状態である。
本発明の実施形態において、本発明に従うNAカーゴ分子は、(i)融合ポリペプチドのNA結合ドメインに対する少なくとも1つの結合部位と、(ii)治療ポリヌクレオチドドメインとを含む。好ましい実施形態において、NAカーゴ分子は少なくとも2つの結合部位を含み、さらにより好ましくは、より多数の結合部位、例えば、3、4、5、6、7、8、9、10、15、またはさらにより多数の結合部位を含む。発明者らは、4~8つの結合部位を含めれば、カーゴの放出及び生体活性送達に負の影響が及ぶことなくNAカーゴ分子がEV内に最適に装填されることを理解した。NA結合ドメインに対する結合部位は、3’及び/もしくは5’UTR内に及び/もしくはそれに近接して遺伝的に操作することができ、かつ/または配列最適化によりNAカーゴ分子のコード領域内に配置することができる。
本発明に従うNAカーゴ分子は、有利には、NAカーゴ分子の治療部分の放出を可能にするために、少なくとも1つの結合部位と治療ポリヌクレオチドドメインとの間に少なくとも1つの切断部位を含むことができる。
概して、NAカーゴ分子は一連の機能を実行するように意図することができ、例えば、目的タンパク質(例えば、治療活性を有するタンパク質)のコード、標的とのアンチセンス相互作用を介した標的ヌクレオチド配列のサイレンシング、スプライシングの切り替え及び/またはブロック、(例えば、RNアーゼH媒介の切断またはRISC複合体媒介のRNA干渉(RNAi)を介した)標的ヌクレオチド配列の切断の媒介を実行するように意図することができる。特に関心対象となる実施形態において、NAカーゴ分子は2つ以上の機能を実行することができ、例えば、目的タンパク質をコードし、(例えば、ガイド機能を有し得る)NA配列を含むことができる。これについての特に有利な例は、NA分子がCRISPR関連タンパク質をコードし、さらに、遺伝子編集のためにCRISPR関連タンパク質(例えば、Cas、Cas9(非限定的な例では、配列番号7に示されるようなアクセッション番号Q99ZW2のCas9)、及び/もしくはCas6)を標的配列に誘導するためのガイド鎖ならびに/または(例えば、相同組換え修復のための)補正DNA鎖を含む例である。このような実施形態において、NAカーゴ分子によりコードされたタンパク質とNAカーゴ分子に含まれるガイド鎖との一方または両方の放出を可能にするためにNA分子内に切断部位を含むことは、特に有利である。
NAカーゴ分子によりコードされ得るタンパク質の非限定的な例としては、以下のものが挙げられる:抗体、細胞内抗体、1本鎖可変断片、アフィボディ、酵素、トランスポーター、腫瘍抑制物質(非限定的な例としてはp53、p21、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、及び/またはST15が挙げられる)、ウイルスまたは細菌阻害物質、細胞抗生物質タンパク質、DNA及び/またはRNA結合タンパク質、DNA修復阻害物質、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグラーゼ、転写因子、成長因子、アポトーシス阻害物質及び誘導物質、毒素、構造タンパク質、神経栄養因子、膜トランスポーター、ヌクレオチド結合タンパク質、ヒートショックタンパク質、CRISPR関連タンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、カスパーゼ、ならびにこれらの任意の組合せ及び/または派生物。
NAカーゴ分子及び融合ポリペプチドコンストラクトの設計は、例えば、標的細胞内ならびに/または特定の臓器、組織、及び身体区画内への装填、放出、及び生体活性送達に対するキーとなる。発明者らが発見した特に有利な実施形態は、少なくとも1つのエクソソームポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含むEVであって、エクソソームポリペプチドが片側または両側で少なくとも1つのNA結合ドメインに隣接される(すなわち、片側または両側に少なくとも1つのNA結合ドメインがある)、EVである。代替的に、NA結合ドメインは、様々な場合において、例えば、外因的装填を強化するためにEVの外側でNA結合ドメインを示すことが望ましい場合に、エクソソームポリペプチド内の少なくとも1つの位置(例えば、小胞外ループ(例えば、CD63)上)に挿入することができる。エクソソームポリペプチドは、C及び/またはN末端のすぐ近くに隣接してもよいが、最も有利な設計は、エクソソームポリペプチドとNA結合ドメインとの間にリンカーペプチドを含めて、エクソソームポリペプチド(1つまたは複数)及びNA結合ドメイン(1つまたは複数)の両方の活性維持のためにスペーシング及びフレキシビリティをもたらすことである。このようなリンカーは、有利には、特定の数のリピートを含有するグリシン-セリン(GS)リンカーとすることができる。発明者らは、1~4リピートのいずれかが、融合ポリペプチドを過度に非構造化することなく十分なフレキシビリティをもたらし、最も有利であることを理解したが、これより長いリンカーもGSベースでないリンカーも本出願の範囲内である。上述のように、NAカーゴ分子の外因性装填を伴う適用については、好ましくは、EVは、NA結合ドメインをエクソソームの表面上で曝露するため、そのN末端及び/もしくはC末端上、ならびに/またはエクソソームポリペプチドの任意の小胞外(すなわちEVの外側に存在する)領域内の少なくとも1つのNA結合ドメインと融合した、少なくとも1つのエクソソームポリペプチドを含む融合ポリペプチドを含む。
融合ポリペプチドコンストラクトのエクソソームポリペプチド構成要素の設計及び選択は、効率的なEV形成、EV内へのNA装填、さらにNAカーゴ分子の放出を可能にするためのキーとなる。エクソソームタンパク質は、以下の非限定的な例から選択することができる:CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、AARDC1、シンテニン-1、シンテニン-2、Lamp2b、TSPAN8、シンデカン-1、シンデカン-2、シンデカン-3、シンデカン-4、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、TNFR、gp130、Fc受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、MHC-IまたはMHC-II構成要素、CD2、CD3イプシロン、CD3ゼータ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1アルファ、Mac-1ベータ、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、その他のエクソソームポリペプチド、及びこれらの任意の組合せ。
上述のように、本発明に従うEVには、融合ポリペプチドの助けによりNAカーゴ分子が装填される。いかなる理論にも拘泥することを望まないが、装填は、EV生成細胞内部でEVの形成と共に生じるか、または操作されたEVによりNAカーゴ分子(1つまたは複数)をインキュベートすることにより外因的に生じると推測される。融合ポリペプチドは通常はNAカーゴ分子(例えば、EV生成細胞内で共発現したmRNA分子)に結合しこれを小胞内に輸送することができ、次にこの小胞がEVとして放出される。前述のように、NAカーゴ分子は、融合ポリペプチドと同じEV生成細胞内で発現する場合があり、かつ/またはひとたびEVが形成され任意選択で精製されたときにEV内に外因的に装填される場合がある。NAカーゴのEV生成細胞内での共発現は、EV生成が単一の細胞内で単一ステップで生じて、プロセスの調整が可能になり上流及び下流の処理が単純化されることから、非常に有利な実施形態である。NAカーゴ分子(例えば、mRNA、shRNA、miRNA、環状RNA、DNA、アンチセンスオリゴヌクレオチドなど)は、融合ポリペプチドと同じポリヌクレオチドコンストラクトから発現してもよく、または別のコンストラクトから発現してもよい。いずれの方法にも利点があり、1つのコンストラクトの使用は、融合ポリペプチド及びNAカーゴ分子が一緒に翻訳/転写されることを確実にし、2つ以上のコンストラクトの使用は、2つの構成要素の差別的発現(例えば、融合ポリペプチドまたはNAカーゴ分子いずれかの発現レベルをより高くすること)を可能にする。好ましい実施形態において、融合ポリペプチド及び/またはNAカーゴ分子が発現するポリヌクレオチドコンストラクトは、一貫的で再生可能で高収量のNA装填EV生成を可能にするために、有利に安定的にEV生成細胞内に導入される。好ましい実施形態において、EV生成細胞は、融合ポリペプチドとNAカーゴ分子とを含むバイシストロン性またはマルチシストロン性のベクター(コンストラクトまたはポリヌクレオチドなどとしても知られる)を用いて安定的に形質移入及び/または形質導入される。このようなバイシストロン性またはマルチシストロン性のコンストラクトは、例えば、IRESエレメント(1つまたは複数)または2Aペプチド結合を含むことができ、これにより(i)NA結合ドメインとエクソソームタンパク質とを含む融合ポリペプチド、及び(ii)目的NAカーゴ分子、例えば、mRNA、shRNA、miRNA、または他の任意のタイプのNAカーゴ分子の両方の発現が可能になる。バイシストロン性またはマルチシストロン性ベクターを使用することに加えて、複数のまたは2方向性のプロモーターは、本発明に従うEV内に装填される2つの目的構成要素をコードする単一のコンストラクトを安定的に挿入するためのもう1つの扱いやすい方法に相当する。明らかに、代替的な実施形態において、2つ以上のコンストラクト(例えば、プラスミド)がEV生成細胞内に形質移入及び/または形質導入することもできるが、等モル濃度の融合ポリペプチド(及びNA結合ドメイン)とNAカーゴ分子自体を可能にし得ることから単一コンストラクトの使用が有利であると考えられる。重要なことには、本発明のEV生成細胞は、通常、少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクトを過剰発現するように設計され、これによりEV生成細胞内で好適な濃度にてNAカーゴ分子を適切に生成することが可能になり、よってNA結合ドメインのNA分子に対する可逆的で放出可能な接続が可能になる。ポリヌクレオチド(1つまたは複数)の過剰発現は、EV生成細胞内で比較的高いNAカーゴ分子濃度の創出を可能にし、それと同時にNAカーゴ分子の濃度がより低い標的細胞内でのNAカーゴ分子の放出を可能にする重要なツールである。これは特にPUF及びCasタンパク質に該当する。
さらなる実施形態において、本発明に従うEVは、目的とする細胞、組織、臓器、及び/または区画への標的化された送達を可能にするために、少なくとも1つの標的化部分を含むことができる。標的化部分は融合ポリペプチドそれ自体に含まれてもよく、これは、EVの表面上での標的化部分の表示を可能にするために膜貫通ドメインを伴うエクソソームポリペプチドを使用する場合に特に有利である。標的化部分は、タンパク質、ペプチド、1本鎖断片、または他の任意の抗体の派生物などであり得る。標的化部分は、EVに含まれる別個のポリペプチドコンストラクトの一部も形成することができる。さらに、本発明のEVに含まれる融合ポリペプチドは、生体活性送達を強化するために様々な追加の部分も含むことができる。このような部分及び/またはドメインとしては、以下の機能的ドメインの非限定的な例が挙げられ得る:(i)EV形成及び/もしくは装填を改善するために融合ポリペプチドを2量体化、3量体化、もしくは多量体化する多量体化ドメイン、(ii)立体障害を回避しフレキシビリティをもたらすための上述のようなリンカー、(iii)放出ドメイン、例えば、インテインのようなcis切断エレメント(融合ポリペプチド及び/もしくはNAカーゴの特定の部分の放出に有用な自己切断活性を有する)、(iv)受容細胞内のRNA放出を改善するためのRNA切断ドメイン、例えば、Cas6、Cas13のようなヌクレアーゼをコードするドメイン、(v)エンドソームエスケープドメイン、例えば、HA2、VSVG、GALA、B18など、ならびに/または(vi)核局在化シグナル(NLS)。
本発明は、装填、放出、及び生体活性送達の高効率性を確実にするためのキーとなる、NAカーゴ分子の発明的な様々な修飾にも関連する。例えば、NAカーゴ分子を直線状または環状になるように設計することにより、装填の効率性及び安定性のような態様を増加または減少させることができる。さらに、配列の設計を最適化することにより、NAカーゴの2次及び3次構造に影響を及ぼすことも可能であり、これはさらに、NA結合ドメインの標的NAに対する容易なアクセス性を促進することにより、装填を促進することができる。
また別の有利な実施形態において、NAカーゴ分子は、NAカーゴ分子の装填の強化、放出の改善、組織特異的活性の増加、及び/または安定性の増加によって効力を増加させるための追加の部分を含むことができる。例えば、NAカーゴ分子は以下のうちの1つ以上を含むことができる:(i)優先的な細胞及び/もしくは組織特異的活性を駆動するためのmiRNA結合のための部位(このような部位は、任意選択で組織及び/もしくは細胞タイプ特異的である)、(ii)少なくとも1つの安定化ドメイン、例えば長いポリAテールもしくは2つ以上のポリAテール(例えば、2、3、もしくはさらに4つのポリAテール)、(iii)ヌクレアーゼ分解を阻害するための5’及び/もしくは3’UTRにおける少なくとも1つのステムループ構造、(iv)NAカーゴ分子の転写を駆動するためのRNAポリメラーゼ、(v)mRNA安定性を増加させるためのコドン最適化された配列、(vi)mRNA翻訳効率を増加させるための5’及び/もしくは3’末端における少なくとも1つのハイブリッドUTR、ならびに/または(vii)リボザイム(1つまたは複数)。
上述のように、EVは典型的には単一の小胞として存在するのではなく実質的な複数の小胞で存在し、したがって本発明はEV集団にも関連する。有利な実施形態において、このような集団全体におけるEV当たりのNAカーゴ分子の平均数は、EV当たり平均でNAカーゴ分子1個超、好ましくはEV当たりNAカーゴ分子10個超、さらにより好ましくはEV当たりNAカーゴ分子100個超である。ただし、集団全体においていかなるNAカーゴ分子も含まないEVが存在する場合もあるため、本発明はEV当たり平均でNAカーゴ分子1個未満を含むEV集団にも関連し得る。
重要なことには、先行技術は典型的に、ごく一部のEV内へのRNAカーゴ装填をもたらしているに過ぎない。例えば、US14/502,494に記載のTAMELシステムは、EV内への、具体的にはエクソソーム内への定量可能な装填を可能にしていないように思われる。このことは、TAMELシステムがゼロ~一桁以下のパーセンテージの単一EV装填をもたらすことを示すものである。TAMELシステムの発明者らは、TAMELシステムを使用する場合、エクソソーム内へのRNA分子の装填は最大で7倍強化されることを報告しているが、一方本発明は、例えばmRNA及びその他のNAカーゴ分子の生産的装填を、以下のものに比べて典型的には少なくとも10倍、好ましくは少なくとも25倍、ただし多くの場合少なくとも50倍、好ましくは少なくとも70倍改善する:(i)融合タンパク質中に存在するNA結合ドメインを有しないEV及び/もしくはNAカーゴ分子内のNA結合ドメインに対する結合部位を有しないEV、(ii)(例えば、図2に示されるような)融合タンパク質自体を有しないEV、(iii)NAカーゴ分子が単に受動的に装填されている操作されていないEV、ならびに/または(iv)所与の内部NA調節分子。したがって、本発明は、相当程度により多くのNAカーゴ分子を所与のEV集団に装填する方法を提供し、重要なことには、本発明は、先行技術と比較して顕著に高い割合のEVの装填も可能にする。1つの実施形態において、本発明はEV集団であって、全てのEVのうちの少なくとも5%、少なくとも10%、少なくとも20%、少なくとも50%、少なくとも70%、少なくとも75%、少なくとも80%、少なくとも85%、少なくとも90%、及び/または少なくとも95%が問題とされるNAカーゴ分子を含む、EV集団に関連する。
上述のように、本発明とUS14/502,494及びその他の先行技術文献との間の決定的な違いは、EV集団全体にわたる融合ポリペプチドの有効でない、かつ重要なことには不均一な分布に関連する。例えば、US14/502,494で使用されたMS2タンパク質は、ごく一部のEV内に存在するに過ぎず、これがEV集団にわたるmRNAカーゴの装填が不均一に分布する結果をもたらす。逆に、本発明の融合タンパク質はEV集団全体にわたり均一に分布しており、このことは、本質的に、あらゆるEVが本発明に従う少なくとも1つの融合ポリペプチド及び通常は少なくとも1つのNAカーゴ分子を含むことを意味する。したがって、1つの実施形態において、本発明は、本質的に2つのEVサブ集団を含むEV組成物であって、(i)第1のEVサブ集団が、EV当たり平均で(NA結合ドメインとエクソソームポリペプチドとを含む)融合ポリペプチド1個超を含み、(ii)第2のEVサブ集団が、問題とされる前記NAカーゴ分子をEV当たり平均で融合ポリペプチド1個超と組み合わせて含む、EV組成物に関連する。これに対し、先行技術、例えばUS14/502,494は、EV当たりの数が非常に少ない融合ポリペプチド、典型的には10EV当たり融合ポリペプチド1個未満を含むEVを教示しており、これは明らかに、当該融合タンパク質に依存するNAカーゴ分子の生産的装填及び送達が、本出願の場合よりも著しく低いことを含意する。いかなる理論にも拘泥することを望まないが、先行技術が融合タンパク質のEV内へのより高い装填を達成できない理由は、MS2及び類似の非真核生物タンパク質がエクソソームに効率的に移送されないという事実、及び/またはこれらのタンパク質が毒性を誘発するという事実に起因すると推測され、この2つの問題は本発明によって対処されている。
別の態様において、本発明は、少なくとも1つのNA結合ドメインと少なくとも1つのエクソソームポリペプチドとを含む、発明的な融合ポリペプチドであって、少なくとも1つのNA結合ドメインが、PUF、Cas、及び/またはNAアプタマー結合ドメインのうちの1つ以上である、融合ポリペプチドに関連する。有利な実施形態において、融合ポリペプチドは任意選択でさらに、ポリペプチドに特定の機能を与える追加の領域、ドメイン、配列、及び/または部分を含むことができる。融合ポリペプチドに含まれる追加のドメインの非限定的な例としては、(i)多量体化ドメイン、(ii)リンカー、(iii)放出ドメイン、(iv)RNA切断ドメイン、(v)エンドソームエスケープ部分、(vi)プロテアーゼ特異的切断部位、(vii)インテイン、及び/または(viii)標的化部分が挙げられる。
多量体化ドメインは、融合ポリペプチドの2量体化、3量体化、または任意のより高次の多量体化を可能にし、これにより融合ポリペプチドの選別及びEV内へのトラフィッキングが増加し、またEV生成細胞により生成される小胞の収量増加にも寄与し得る。リンカーは、融合ポリペプチドコンストラクトに対するフレキシビリティ、さらに対応するポリヌクレオチドコンストラクトに対するフレキシビリティの増加をもたらすのに有用であり、また融合ポリペプチドの立体障害回避及び機能性維持を確実にするために使用することもできる。放出ドメインは、元の融合ポリペプチドからの特定の部分またはドメインの放出を可能にするために融合ポリペプチドコンストラクトに含めることができる。これは、融合ポリペプチドの部分の放出がNAカーゴの生体活性送達を増加すると考えられる場合、及び/またはより小さいコンストラクトの部分であるときに融合ポリペプチドの特定の機能がより良好に働く場合に特に有利である。好適な放出ドメインは、cis切断配列、例えばインテイン、光誘導性単量体または2量体放出ドメイン、例えばKaede、KikGR、EosFP、tdEosFP、mEos2、PSmOrange、GFP様Dendraタンパク質Dendra及びDendra2、CRY2-CIBNなどであり得る。NA切断ドメインは、有利には、NAカーゴの切断を引き起こすために融合ポリペプチドに含めることができる。NA切断ドメインの非限定的な例としては、エンドヌクレアーゼ、例えば、Cas6、Cas13、操作されたPUFヌクレアーゼ、部位特異的RNAヌクレアーゼなどが挙げられる。さらに、本発明の融合ポリペプチドはエンドソームエスケープドメインを含んでエンドソームエスケープを駆動し、それによりEV自体及びEV NAカーゴ分子の生体活性送達を強化することもできる。送達を強化するためのもう1つの戦略は、EVの標的を細胞、組織、及び/もしくは臓器、またはその他の身体区画にすることである。標的化は様々な手段により、例えば標的化ペプチドの使用により達成することができる。このような標的化ペプチドは、数アミノ酸長~数百アミノ酸長のいずれか、例えば、3~100アミノ酸、3~30アミノ酸、5~25アミノ酸の間隔内のいずれか、例えば、7アミノ酸、12アミノ酸、20アミノ酸などであり得る。本発明の標的化ペプチドは、受容体、受容体リガンドなどのような全長タンパク質も含むことができる。さらに、本発明に従う標的化ペプチドは、抗体及び抗体派生物、例えば、モノクローナル抗体、1本鎖可変断片(scFv)、その他の抗体ドメインなども含むことができる。
さらなる態様において、本発明は、本発明に従う融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドコンストラクトに関連する。ポリヌクレオチドコンストラクトは、様々な異なる形態で、及び/または異なるベクターにおいて存在することができる。例えば、ポリヌクレオチドは、本質的に直線状、環状であってもよく、かつ/または任意の2次構造及び/もしくは3次構造及び/もしくはより高次の構造を有する。さらに、本発明は、このポリヌクレオチドを含むベクター(例えば、プラスミド、任意の環状DNAポリヌクレオチド、ミニサークル、ウイルス(例えば、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レンチウイルス)、mRNA、及び/または修飾mRNAなどのベクター)にも関連する。
本発明に従うポリヌクレオチドコンストラクトはさらに、特定の機能性をポリヌクレオチド内に付与するための1つ以上の部位またはドメインを含むことができる。例えば、ポリヌクレオチドコンストラクトの安定性は、安定化ドメイン、例えば、ポリAテールまたはステムループの使用により強化することができ、ポリヌクレオチドコンストラクトは、任意選択で細胞タイプ特異的な誘導的プロモーター、リンカーなどであってもよい特定のプロモーターによって調節することもできる。ポリAテールは、任意選択で、安定化ポリAテールを保持するmRNAの切断をもたらすようにCas6またはCas13切断部位の上流に挿入することができる。
本発明はさらに、EVを生成するための様々な方法に関連する。このような方法は、(i)EV生成細胞内に少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクトを導入するステップと、(ii)EV生成細胞内で少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクトによってコードされた少なくとも1つのポリペプチドコンストラクトを発現させるステップと、任意選択で(iii)EV生成細胞から、ステップ(ii)からの目的ポリペプチドを含む生成されているEVを収集するステップとを含み得る。あるいくつかの実施形態では単一のポリヌクレオチドコンストラクトが使用され、一方他の実施形態では2つ以上のポリヌクレオチドコンストラクトが用いられる。いかなる理論にも拘泥することを望まないが、ポリヌクレオチドコンストラクトが(EVの目的及び使用に応じて一過的にまたは安定的に)挿入されたEV生成細胞は、そのポリヌクレオチドによってコードされたポリペプチドコンストラクトを含むEV(例えば、エクソソーム)を生成すると推測される。次に、EVは任意選択で、典型的には細胞培地から収集されてもよく、特定の使用に供される前に任意選択でさらに精製されてもよい。有利な実施形態において、当該方法により生成されるEVはさらに、融合ポリペプチドコンストラクトの助けによりEV内に装填されるNAカーゴ分子を含む。典型的には、単一のEVはNAカーゴ分子のいくつかのコピーを含むが、単一のEVは2つ以上のタイプのNA薬物カーゴ分子を含むこともできる。2つ以上のタイプのNA薬物カーゴを含むEVの非限定的な例として、単一のEV(すなわち、単一のタイプのEV集団)は例えば、gRNA NA薬物カーゴ分子及びmRNA薬物カーゴ分子を含むことができる。
さらなる態様において、本発明は、(i)少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクト及び/または(ii)少なくとも1つのポリペプチドコンストラクトを含む細胞に関連する。さらに、本発明は、本発明に従うEVを含む細胞にも関係する。EV生成細胞は、例えば、初代細胞、細胞株、多細胞生物内に存在する細胞、または他の任意のタイプの細胞供給源及びEV生成細胞材料の形態で存在し得る。「供給源細胞」もしくは「EV供給源細胞」もしくは「親細胞」もしくは「細胞供給源」もしくは「EV生成細胞」という用語、または他の任意の同様の用語は、好適な条件下で、例えば、懸濁培養もしくは接着培養、または他の任意のタイプの培養系においてEVを生成可能な任意のタイプの細胞に関係するものと理解されたい。本発明に従う供給源細胞は、in vivoでエクソソームを生成する細胞も含むことができる。本発明に従う供給源細胞は、広範囲の細胞及び細胞株から選択することができ、例えば、間葉系幹細胞または間葉系間質細胞(例えば、骨髄、脂肪組織、ワルトン膠質、周産期組織、胎盤、歯蕾、臍帯血、皮膚組織などから取得可能)、線維芽細胞、羊膜細胞、より具体的には任意選択で様々な早期マーカーを発現する羊膜上皮細胞、骨髄抑制細胞、M2極性化マクロファージ、脂肪細胞、内皮細胞、線維芽細胞などから選択することができる。特に関心対象となる細胞株としては、ヒト臍帯内皮細胞(HUVEC)、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞、内皮細胞株(例えば、微小血管またはリンパ内皮細胞)、赤血球、赤血球前駆細胞、軟骨細胞、由来の異なるMSC、羊膜細胞、羊膜上皮(AE)細胞、羊水穿刺または胎盤から取得される任意の細胞、気道または肺胞上皮細胞、線維芽細胞、内皮細胞などが挙げられる。また、免疫細胞(例えば、B細胞、T細胞、NK細胞、マクロファージ、単球、樹状細胞(DC))も本発明の範囲内であり、EVを産生可能な本質的に任意のタイプの細胞も本明細書に包含される。概して、EVは、初代細胞供給源または不死化細胞株であっても本質的に任意の細胞供給源から誘導することができる。EV供給源細胞は、人工多能性幹細胞(iPSC)及び任意の方法により誘導される他の幹細胞を含めた任意の胚性、胎児性、及び成体の体性幹細胞タイプとすることができる。神経疾患を治療する場合、例えば、一次ニューロン、アストロサイト、オリゴデンドロサイト、ミクログリア、及び神経前駆細胞を供給源細胞として利用することが考えられ得る。供給源細胞は、治療対象の患者に対し本来的に同種、自己由来、またはさらに異種であり得、すなわち細胞は、患者自身から、または非血縁、適合、もしくは非適合ドナーからであり得る。あるいくつかの文脈では、同種細胞は、ある徴候を患う患者の自己由来細胞から取得可能でない場合がある免疫修飾効果をもたらし得ることから、医学的観点からは同種細胞が好ましいと考えられる。例えば、全身性、末梢性及び/または神経系の炎症を治療する文脈では、同種MSCまたはAEのような細胞から得られるEVは、例えば、マクロファージ及び/または好中球表現型スイッチング(それぞれ、炎症促進性のM1またはN1表現型から抗炎症性のM2またはN2表現型へのスイッチング)を介して免疫修飾を可能にし得るため、同種MSCまたはAEが好ましいと考えられる。
上述のように、好ましい実施形態において、本発明のEV生成細胞は、(i)NA結合ドメインを含む融合ポリペプチド及び(ii)NAカーゴ分子をコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクト(1つまたは複数)を用いて、安定的に形質移入及び/または形質導入される。非常に好ましい実施形態において、EV生成細胞は、単一細胞クローンのクローナル選択を可能にするクローナル選択プロトコルに曝露される。したがって、非常に好ましい実施形態において、本発明は、融合ポリペプチドとNAカーゴ分子と両方を含むEVを生成するために形質移入及び/または形質導入されるEV生成細胞の単一細胞クローナル集団に関連する。単一クローンは、限界希釈法、単一細胞選別、及び/またはクローニングシリンダーを用いた個々の細胞の単離を用いて取得することができる。
さらなる態様において、本発明は、少なくとも1つのRNAカーゴ分子の細胞内送達のためのin vitro方法に関する。このような方法は、in vitro及び/またはex vivoで有利に行うことができる。本方法は、標的細胞を、本発明に従う少なくとも1つのEV、またはより一般的には本発明に従うEV集団に接触させるステップを含むことができる。さらに、本発明に従うRNAカーゴ分子の送達のための方法は、任意の生体系(例えば、ヒト)に存在する細胞内に、本明細書の融合ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを導入することも含むことができる。
追加の態様において、本発明は、以下の構成要素:(i)本明細書に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクト、(ii)本明細書に記載の少なくとも1つのポリペプチドコンストラクト、(iii)本明細書に記載の少なくとも1つのEV、(iv)本明細書に記載の少なくとも1つの細胞、及び/または(v)本明細書に記載の少なくとも1つのEV集団、のうちのいずれか1つまたはそれ以上を含み、典型的には医薬的に許容される賦形剤、担体、及び/または希釈剤等で製剤化される、医薬組成物に関連する。さらに本発明は、医学分野における使用のための(i)本明細書に記載の少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクト、(ii)本明細書に記載の少なくとも1つのポリペプチドコンストラクト、(iii)本明細書に記載の少なくとも1つのEV、(iv)本明細書に記載の少なくとも1つの細胞、及び/または(v)本明細書に記載の少なくとも1つのEV集団、ならびに(vi)上述の医薬組成物にも関係する。より具体的には、本発明は、様々な疾患の予防及び/または治療及び/または緩和における使用に関連する。疾患及び状態の非限定的な例としては、以下の非限定的な例が挙げられる:クローン病、潰瘍性大腸炎、強直性脊椎炎、関節リウマチ、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、サルコイドーシス、特発性肺線維症、乾癬、腫瘍壊死因子(TNF)受容体関連周期性症候群(TRAPS)、インターロイキン-1受容体アンタゴニスト(DIRA)の欠損、子宮内膜症、自己免疫性肝炎、強皮症、筋炎、脳卒中、急性脊髄損傷、血管炎、ギラン・バレー症候群、急性心筋梗塞、ARDS、敗血症、髄膜炎、脳炎、肝不全、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、非アルコール性脂肪肝疾患(NAFLD)、腎不全、心不全または任意の急性もしくは慢性の臓器不全及び関連する基礎病因、移植片対宿主病、デュシェンヌ型筋ジストロフィー及び他の筋ジストロフィー、リソソーム蓄積症、例えば、ゴーシェ病、ファブリー病、MPSI、II(ハンター症候群)、及びIII、ニーマン・ピック病A、B、及びC型、ポンペ病など、神経変性疾患(アルツハイマー病、パーキンソン病、ハンチントン病及びその他のトリヌクレオチドリピート関連疾患を含む)、認知症、ALS、癌誘導性悪液質、食欲不振、2型糖尿病、ならびに様々な癌。ほぼ全てのタイプの癌が本発明の関連疾患標的であり、例えば、急性リンパ芽球性白血病(ALL)、急性骨髄球性白血病、副腎皮質癌、AIDS関連癌、AIDS関連リンパ腫、肛門癌、虫垂癌、星細胞腫(小脳もしくは大脳)、基底細胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨腫瘍、脳幹グリオーマ、脳癌、脳腫瘍(小脳星細胞腫、大脳星細胞腫/悪性グリオーマ、上衣細胞腫、髄芽腫、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、視覚路及び視床下部グリオーマ)、乳癌、気管支腺腫/カルチノイド、バーキットリンパ腫、カルチノイド腫瘍(小児、胃腸管)、原発不明の癌腫、中枢神経系リンパ腫、小脳星細胞腫/悪性グリオーマ、子宮頸癌、白血病、慢性リンパ性白血病、慢性骨髄性白血病、慢性骨髄増殖性障害、結腸癌、皮膚T細胞リンパ腫、線維形成性小円形細胞腫瘍、子宮内膜癌、上衣細胞腫、食道癌、頭蓋外胚細胞腫瘍、性腺外胚細胞腫瘍、肝外胆管癌、眼癌(眼球内黒色腫、網膜芽細胞腫)、胆嚢癌、胃の(gastric)(胃(stomach))癌、胃腸管カルチノイド腫瘍、胃腸管間質腫瘍(GIST)、胚細胞腫瘍(頭蓋外、性腺外、もしくは卵巣)、妊娠性絨毛性腫瘍、グリオーマ(脳幹グリオーマ、大脳星細胞腫、視覚路及び視床下部グリオーマ)、胃カルチノイド、有毛細胞白血病、頭頸部癌、心臓癌、肝細胞(肝臓)癌、ホジキンリンパ腫、下咽頭癌、眼球内黒色腫、島細胞癌(内分泌膵臓)、カポジ肉腫、腎臓癌(腎細胞癌)、喉頭癌、白血病((急性リンパ芽球性(急性リンパ性白血病とも呼ばれる)、急性骨髄球性(急性骨髄性白血病とも呼ばれる)、慢性リンパ性(慢性リンパ性白血病とも呼ばれる)、慢性骨髄性(慢性骨髄球性白血病とも呼ばれる)、有毛細胞白血病)、口唇及び口腔癌、脂肪肉腫、肝臓癌(原発性)、肺癌(非小細胞、小細胞)、リンパ腫、AIDS関連リンパ腫、バーキットリンパ腫、皮膚T細胞リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、髄芽腫、メルケル細胞癌、中皮腫、原発不明転移性扁平上皮性頸部癌、口部癌、多発性内分泌腫瘍症候群、多発性骨髄腫/形質細胞腫瘍、菌状息肉症、骨髄形成異常/骨髄増殖性疾患、骨髄性白血病、慢性骨髄球性白血病(急性、慢性)、骨髄腫、鼻腔及び副鼻腔癌、鼻咽頭癌、神経芽腫、口腔癌、中咽頭癌、骨肉腫/骨の悪性線維性組織球腫、卵巣癌、卵巣上皮癌(表面上皮間質腫瘍)、卵巣胚細胞腫瘍、卵巣低悪性度潜在性腫瘍、膵臓癌、膵島細胞癌、副甲状腺癌、陰茎癌、咽頭癌、褐色細胞腫、松果体星細胞腫、松果体胚細胞腫、松果体芽腫及びテント上原始神経外胚葉性腫瘍、下垂体腺腫、胸膜肺芽腫、前立腺癌、直腸癌、腎細胞癌(腎臓癌)、網膜芽腫、横紋筋肉腫、唾液腺癌、肉腫(ユーイングファミリーの腫瘍肉腫、カポジ肉腫、軟組織肉腫、子宮肉腫)、セザリー症候群、皮膚癌(非黒色腫、黒色腫)、小腸癌、扁平上皮癌、頸部扁平上皮癌、胃癌、テント上原始神経外胚葉性腫瘍、精巣癌、咽喉癌、胸腺腫及び胸腺癌、甲状腺癌、腎盂及び尿管の移行上皮癌、尿道癌、子宮癌、子宮肉腫、膣癌、外陰癌、ワルデンシュトレームマクログロブリン血症、ならびに/またはウィルムス腫瘍が標的となる。
本発明に従うEVは、様々な異なる投与経路、例えば、耳介(耳)、頬側、結膜、皮膚、歯、電気浸透、子宮頸管内、洞内、気管内、腸、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸潤、間質、腹腔内、羊水内、動脈内、関節内、胆道内、気管支内、滑液内、心臓内、軟骨内、尾骨内、海綿体内、腔内、脳内、胸骨内、角膜内、(歯)冠内、冠動脈内、海綿体内、皮内、円板内、管内、十二指腸内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、歯肉内、回腸内、病巣内、管腔内、リンパ内、髄内、髄膜内、筋肉内、眼内、卵巣内、心膜内、腹腔内、胸膜内、前立腺内、肺内、洞内、脊髄内、滑液嚢内、腱内、精巣内、髄腔内、胸腔内、小管内、腫瘍内、鼓室内、子宮内、血管内、静脈内、静脈内急速、静脈内点滴、心室内、膀胱内、硝子体内、イオントフォレーシス、灌注、喉頭、鼻、経鼻胃、密封包帯法、眼部、経口、中咽頭、その他、非経口、経皮、関節周囲、硬膜上、神経周囲、歯周、直腸、呼吸器(吸入)、球後、軟組織、くも膜下、結膜下、皮下、舌下、粘膜下、局所、経皮、経粘膜、経胎盤、経気管、経鼓室、尿管、尿道、及び/もしくは経膣の投与、ならびに/または上記投与経路の任意の組合せを介して、ヒトまたは動物対象に投与することができ、これは典型的には、治療対象となる疾患、及び/またはEV、問題となるNAカーゴ分子、もしくはEV集団のようなものの特色に依存する。
実施例及び実験セクション
材料及び方法
・コンストラクト設計及びクローニング
様々なNA結合ドメイン及びそのバリアント(例えば、PUF、変異PUF、PUFx2、Cas6、変異Cas6、Cas13、変異Cas13など)をいくつかのエクソソームポリペプチド(例えば、CD81、CD63、CD9、シンテニン、シンデカン、Alix、CD133など)と組み合わせて評価した。ORFは合成により典型的に産生し、哺乳類発現ベクターpSF-CAG-Amp内にクローニングした。簡潔に述べると、合成したDNA及びベクタープラスミドを、製造業者の指示(NEB)に従って酵素NotI及びSalIで消化した。制限された精製DNA断片を、製造業者の指示(NEB)に従ってT4リガーゼを用いて共にライゲーションした。好結果のライゲーションイベントは、アンピシリンを追加したプレート上での細菌形質転換のために選択した。形質移入用のプラスミドは、製造業者の指示に従って「マキシプレップ」により産生した。
材料及び方法
・コンストラクト設計及びクローニング
様々なNA結合ドメイン及びそのバリアント(例えば、PUF、変異PUF、PUFx2、Cas6、変異Cas6、Cas13、変異Cas13など)をいくつかのエクソソームポリペプチド(例えば、CD81、CD63、CD9、シンテニン、シンデカン、Alix、CD133など)と組み合わせて評価した。ORFは合成により典型的に産生し、哺乳類発現ベクターpSF-CAG-Amp内にクローニングした。簡潔に述べると、合成したDNA及びベクタープラスミドを、製造業者の指示(NEB)に従って酵素NotI及びSalIで消化した。制限された精製DNA断片を、製造業者の指示(NEB)に従ってT4リガーゼを用いて共にライゲーションした。好結果のライゲーションイベントは、アンピシリンを追加したプレート上での細菌形質転換のために選択した。形質移入用のプラスミドは、製造業者の指示に従って「マキシプレップ」により産生した。
・細胞培養及び形質移入
実験設計及びアッセイに応じて、あるいくつかのケースでは、従来的な2D細胞培養において非ウイルス一過性形質移入及びEV生成を行い、一方他のケースでは、ウイルス媒介形質導入を用いて安定した細胞株を創出し、これを異なるタイプのバイオリアクター及び/または振とうインキュベーターで典型的に培養した。簡潔性のため、本明細書では数例のみについて述べる。
実験設計及びアッセイに応じて、あるいくつかのケースでは、従来的な2D細胞培養において非ウイルス一過性形質移入及びEV生成を行い、一方他のケースでは、ウイルス媒介形質導入を用いて安定した細胞株を創出し、これを異なるタイプのバイオリアクター及び/または振とうインキュベーターで典型的に培養した。簡潔性のため、本明細書では数例のみについて述べる。
HEK293T細胞を15cmディッシュに典型的に播種し(ディッシュ当たり9×106細胞)、ATCCの推奨通りに血清含有DMEM中で一晩放置した。次の日、細胞に直接添加したリポプレックスDNAにより細胞を一過的に形質移入した。簡潔に述べると、DNA及びポリエチレンイミン(PEI)をOptiMEM中で5分間別々にインキュベートしてから、室温で20分間一緒に合わせた。リポプレックスDNA及び細胞を6時間共インキュベートし、その後に48時間条件培地をOptiMEMに変更した。ディッシュ、フラスコ、及びその他の細胞培養容器内で評価した他の細胞及び細胞株には、骨髄由来間葉系間質細胞(BM-MSC)及びワルトン膠質由来MSC(WJ-MSC)、羊膜細胞、羊膜上皮細胞、線維芽細胞、様々な内皮細胞及び上皮細胞、ならびに様々な免疫細胞及び細胞株が含まれた。
融合ポリペプチドコンストラクト及びNAカーゴ分子の様々な組合せのためのウイルス形質導入及び安定した細胞株の創出については、BM-MSC、WJ-MSC、線維芽細胞、羊膜上皮細胞、線維芽細胞、様々な内皮細胞及び上皮細胞のような細胞供給源にレンチウイルス(LV)形質導入を典型的に使用し、ウイルス形質導入を行った。典型的には、感染の24時間前に、100.000細胞(例えば、線維芽細胞、MSCなど)または200.000細胞(例えば、HEK293T)を6ウェルプレートで平板培養する。2uLのLV及び任意選択でポリブレン(すなわち臭化ヘキサジメトリン、ウェル上の最終濃度8ug/mL)を添加し、形質導入から24時間後に形質導入細胞の細胞培地を新鮮な完全培地に変更する。形質導入後72時間時にピューロマイシンセレクション(4~6μg/ml)を通常は7日間実施し、その後に融合ポリペプチドの安定発現の分析を行う。
安定細胞を2D培養またはバイオリアクターで培養し、次にエクソソーム調製のために条件培地を採取した。様々な調製及び精製ステップを実行した。標準的なワークフローは、上清の予備洗浄、濾過ベース濃縮、タンパク質不純物のクロマトグラフィーベース除去、及び任意選択でin vitro及び/またはin vivoアッセイ用の好適なバッファー中での得られたエクソソーム組成物の製剤化のステップを含む。
・アッセイ及び分析
ウェスタンブロットは、EV内のPolの濃縮を評価するための利便性の高い分析方法である。簡潔に述べると、SDS-PAGEを製造業者の指示(Invitrogen,Novex PAGE 4-12%ゲル)に従って実施し、1×1010のエクソソーム及び20ugの細胞ライセートをウェルごとに装填した。SDS-PAGEゲルからのタンパク質を製造業者の指示(Immobilon(RTM),Invitrogen)に従ってPVDF膜に移した。膜をOdysseyブロッキングバッファー(Licor)でブロックし、NA結合ドメインポリペプチド及び/またはエクソソームタンパク質に対する抗体でプローブした(1次抗体:Abcam、2次抗体:Licor)。分子プローブを680及び800nm波長で視覚化した。
ウェスタンブロットは、EV内のPolの濃縮を評価するための利便性の高い分析方法である。簡潔に述べると、SDS-PAGEを製造業者の指示(Invitrogen,Novex PAGE 4-12%ゲル)に従って実施し、1×1010のエクソソーム及び20ugの細胞ライセートをウェルごとに装填した。SDS-PAGEゲルからのタンパク質を製造業者の指示(Immobilon(RTM),Invitrogen)に従ってPVDF膜に移した。膜をOdysseyブロッキングバッファー(Licor)でブロックし、NA結合ドメインポリペプチド及び/またはエクソソームタンパク質に対する抗体でプローブした(1次抗体:Abcam、2次抗体:Licor)。分子プローブを680及び800nm波長で視覚化した。
EVサイズ定量については、分析ソフトウェアを装備したNanoSight(RTM)装置、または場合によりParticle Matricsマシンを用いて、ナノ粒子トラッキング分析(NTA)を実施した。NanoSight(RTM)での記録については、全ての取得後設定において13または15のカメラレベル及び自動機能を使用した。電子顕微鏡及び蛍光顕微鏡を頻繁に使用して、EVの形態及びサイズを検証及び評価した。
様々な方法を用いて、典型的にはTFFならびにサイズ除外液体クロマトグラフィー及び/またはビーズ溶離液体クロマトグラフィーのような濾過の組合せを用いて、EVを単離及び精製した。典型的には、EV含有培地を収集し、300gで5分間の低速スピンに供し、次いで2000gで10分間のスピンに供して、比較的大きい粒子及び細胞デブリを除去した。次に上清を0.22μシリンジフィルターで濾過し、異なる精製ステップに供した。100kDaカットオフフィルター付きのVivaflow 50Rタンジェンシャルフロー(TFF)デバイス(Sartorius)または100もしくは300kDaカットオフ中空糸フィルター付きのKR2i TFFシステム(SpectrumLabs)を用いて、沢山の量を透析濾過しおよそ20mlに濃縮した。次に、予備濃縮した培地をビーズ溶離カラム(HiScreen(RTM)またはHiTrap(RTM)Capto Core 700カラム、GE Healthcare Life Sciences)に装填し、AKTAprime(RTM)plusまたはAKTA Pure 25(RTM)クロマトグラフィーシステム(GE Healthcare Life Sciences)に接続した。カラム平衡化のための流速設定、サンプル充填、及び定位置のカラム洗浄手順は、製造業者の指示に従って選択した。試料をUV吸収クロマトグラムに従って収集し、Amicon Ultra-15 10kDa分子量カットオフスピンフィルター(Millipore)を用いて最終体積100μlに濃縮し、さらなる下流分析のために-80℃で保管した。タンパク質及びRNAの溶離プロファイルを評価するために、100kDa及び300kDa中空繊維フィルターを用いたKR2i TFFシステムで培地を濃縮及び透析濾過し、試料をTricorn 10/300 Sepharose 4 Fast Flow(S4FF)カラム(GE Healthcare Life Sciences)上で分析した。
実施例1.骨髄由来MSCを従来的な組織培養フラスコ内で培養し、PEI形質移入を用いて一過的に形質移入して、mRNAカーゴ分子及び融合ポリペプチドコンストラクトの装填及び発現を可能にした。図2は、NanoLuc(RTM)及びp21をコードするmRNAカーゴ分子のBM-MSCから取得されたEVにおける装填を示している。装填は、エクソソームポリペプチドとしてのCD63と、NA結合ドメインとしてのPUFまたはCas6とを含む融合ポリペプチドコンストラクトを用いて達成した。当該実験は、NA結合ドメインに対する様々な数の結合部位、すなわち0、3、及び6つの結合部位も含み、これらはコード領域の3’及び/または5’隣接部に対し異なる場所で挿入した。
TFF及びSECの経時的組合せを用いてMSC-EVを精製した。エクソソームポリペプチドCD63のみの発現は、いかなるmRNAのEV内への装填ももたらさなかった(図2のグラフ内の右のカラムセット)。PUFを含む融合ポリペプチド(左のカラムセット:CD63のN末端側及びC末端側の両方に隣接する2つのPUFドメイン、すなわち合計4つのPUFコンストラクト)(左から2番目のカラムセット:CD63のN末端側及びC末端側の両方に隣接する1つのPUFドメイン)ならびに変異Cas6(右から2番目)は、EV供給源細胞内での発現の際に、NanoLuc(RTM)及びp21 mRNAの両方の著しいmRNA装填をもたらした。NanoLuc(RTM)の装填は総じてp21の装填よりも効率的であり、EV当たり最大およそ45コピーが装填された。
実施例2.shRNA標的化ハンチンチンのEV媒介送達の際の標的細胞(HEK293細胞)におけるin vitroの遺伝子発現のサイレンシング。浸透インキュベーター内で培養した羊膜細胞に対し、レンチウイルス形質導入を用いて形質導入して、shRNAを含むEVと、PUFまたはCas6のいずれかのNA結合ドメインをEVポリペプチドとしてのそれぞれCD63またはCD81との組合せで含む融合ポリペプチドコンストラクトとを分泌させた。超遠心分離法を用いてEVを上清から精製した。図3のY軸は、どのようにハンチンチン発現レベルがNAカーゴ分子内の結合部位数の増加に伴って減少しているかを示しており、抗ハンチンチンshRNAに装填するためのPUF-CD63-PUFを含む融合ポリペプチドを用いておよそ80%ノックダウンがもたらされた。
実施例3.NanoLuc(RTM)mRNAをHEK EV媒介送達した後の標的Huh7細胞におけるレポーターシステムとしてのNanoLuc(RTM)の発現。HEK293Tに対し安定的に形質導入して、レポーターNanoLuc(RTM)mRNAカーゴをEV内に装填するための様々な融合ポリペプチドコンストラクトを発現させた。NanoLuc(RTM)mRNAカーゴ分子を操作して、融合ポリペプチドコンストラクトを構成するNA結合ドメイン(本件ではPUFx2-CD63-PUFx2(エクソソームポリペプチドCD63のN末端側及びC末端側の両方に挿入された2つのPUF NA-結合ポリペプチド)、PUF-CD63-PUF、及びCas6-CD9-Cas6(図4))に対する0、3、または6つの結合部位を含むようにした(図4)。
ビーズ溶離LCと組み合わせたTFFに基づいたHEK由来EVの精製後、EVを最適濃度でHEK細胞に添加した。このアッセイにおける最適濃度は、Huh7標的細胞の6ウェルプレート内のウェル当たり10^7 EVであった。図4のY軸は、タンパク質μgに対し正規化した相対光(発光)単位(RLU)を示しており、これにより、異なる融合ポリペプチドコンストラクトを用いての、結合部位の数の増加に伴う送達及び/または翻訳の強化が示される。そのため図4は、本発明が生体活性mRNAを細胞に送達することができるEVを提供し、送達後にそのmRNAが細胞によって首尾よく翻訳されることを実証するものである。これは本発明の重大な利点であり、単にRNAと共にEVを装填することはできるがこのRNAを能動的に翻訳されるように標的細胞のサイトゾルに送達することができない先行技術にまさるものである。
Claims (15)
- 融合ポリペプチドを含むポリペプチドコンストラクトをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクトを含む細胞であって、前記融合ポリペプチドが、少なくとも1つの核酸(NA)結合ドメイン及び少なくとも1つのエクソソームポリペプチドを含み、前記少なくとも1つのNA結合ドメインが、Pumilio及びFBF相同タンパク質(PUF)、CRISPR関連ポリペプチド(Cas)、並びに/又はNAアプタマー結合ドメインの1つ以上である、細胞。
- 前記細胞が、間葉系間質細胞、間葉系幹細胞、ワルトン膠質由来の間葉系幹細胞、羊膜細胞、羊膜上皮細胞、線維芽細胞、ヒト臍帯内皮細胞(HUVEC)、ヒト胎児由来腎臓(HEK)細胞、又は内皮細胞であり、任意選択で、前記細胞が、モノクローナル細胞及び/又はモノクローナル細胞株である、請求項1に記載の細胞。
- 前記細胞が、前記少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクトを含むように安定的に修飾され、前記少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクトが、前記ポリペプチドコンストラクト及び少なくとも1つのNAカーゴ分子をコードする、モノシストロン性、バイシストロン性、又はマルチシストロン性のポリヌクレオチドコンストラクトである、請求項1又は2に記載の細胞。
- 前記少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクトが、本質的に直線状である、環状化されている、並びに/又は任意の2次及び/若しくは3次及び/若しくはより高次の構造を有する、並びに/又はベクター、任意選択でプラスミド、環状DNAポリヌクレオチド、ウイルス、アデノ随伴ウイルス、mRNA、修飾mRNA、及び/若しくはミニサークルに含まれる、請求項1~3のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記少なくとも1つのNA結合ドメインが、Cas6、Cas9及びCas13から選択されるCas、並びに/又は配列番号1、配列番号2若しくは配列番号3に示される配列を有するPUFタンパク質を含む、請求項1~4のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記融合ポリペプチドが、2つ以上のNA結合ドメインを含む、請求項1~5のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記少なくとも1つのエクソソームポリペプチドが、CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138(シンデカン-1)、CD235a、ALIX、AARDC1、シンテニン-1、シンテニン-2、Lamp2b、TSPAN8、シンデカン-2、シンデカン-3、シンデカン-4、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受容体、インターロイキン受容体、免疫グロブリン、MHC-I又はMHC-II構成要素、CD2、CD3イプシロン、CD3ゼータ、CD13、CD18、CD19、CD30、TSG101、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1アルファ、Mac-1ベータ、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、及びそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項1~6のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記融合ポリペプチドが、以下:
(i)少なくとも1つの多量体化ドメイン;
(ii)少なくとも1つのリンカー;
(iii)少なくとも1つの放出ドメイン;
(iv)少なくとも1つのRNA切断ドメイン;
(v)少なくとも1つのエンドソームエスケープ部分;
(vi)少なくとも1つのプロテアーゼ特異的切断部位;
(vii)少なくとも1つのインテイン;及び/又は
(viii)少なくとも1つの標的化部分
をさらに含む、請求項1~7のいずれか1項に記載の細胞。 - 前記少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクトが、少なくとも1つのNAカーゴ分子をさらにコードする、又は、前記細胞が、少なくとも1つのNAカーゴ分子をコードするポリヌクレオチドコンストラクトをさらに含む、請求項1~8のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記少なくとも1つのNAカーゴ分子が、shRNA、miRNA、mRNA、gRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、環状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、lncRNA、リボザイム、ミニサークルDNA、及び/又はプラスミドDNAからなる群から選択される、請求項9に記載の細胞。
- 前記少なくとも1つのNAカーゴ分子が、(i)前記融合ポリペプチドの前記NA結合ドメインのための少なくとも1つの結合部位、及び(ii)治療ポリヌクレオチドドメインを含み、並びに、任意選択で、前記少なくとも1つの結合部位と前記治療ポリヌクレオチドドメインとの間に切断部位をさらに含む、請求項9又は10に記載の細胞。
- 前記少なくとも1つのNAカーゴ分子が、前記NA結合ドメインのための複数の結合部位を含む、請求項9~11のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記少なくとも1つのNAカーゴ分子が、治療ポリペプチドをコードし、任意選択で、前記治療ポリペプチドが、抗体、細胞内抗体、1本鎖可変断片、アフィボディ、酵素、トランスポーター、腫瘍抑制物質、ウイルス又は細菌阻害物質、細胞構成要素タンパク質、DNA及び/又はRNA結合タンパク質、DNA修復阻害物質、ヌクレアーゼ、プロテイナーゼ、インテグラーゼ、転写因子、成長因子、アポトーシス阻害物質及び誘導物質、毒素、構造タンパク質、神経栄養因子、膜トランスポーター、ヌクレオチド結合タンパク質、ヒートショックタンパク質、CRISPR関連タンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、カスパーゼ、並びにそれらの任意の組合せからなる群から選択される、請求項9~12のいずれか1項に記載の細胞。
- 前記NAカーゴ分子が、
(a)直線状若しくは環状である;
(b)2次及び/若しくは3次構造を有する;並びに/又は
(c)以下の1つ以上を含む、請求項9~13のいずれか1項に記載の細胞:
(i)miRNA結合のための部位(かかる部位は、任意選択で、組織及び/若しくは細胞タイプ特異的である);
(ii)任意選択で長いポリAテール若しくは2つ以上のポリAテールから選択される、少なくとも1つの安定化ドメイン;
(iii)5’及び/若しくは3’UTRにおける少なくとも1つのステムループ構造;
(iv)RNAポリメラーゼ;
(v)コドン最適化された配列;
(vi)5’及び/若しくは3’末端における少なくとも1つのハイブリッドUTR;並びに
(vii)少なくとも1つのリボザイム。 - EVを生成するためのin vitro方法であって、
i)EV生成細胞に、融合ポリペプチドを含むポリペプチドコンストラクトをコードする少なくとも1つのポリヌクレオチドコンストラクトを導入することであって、前記融合ポリペプチドが、少なくとも1つのNA結合ドメイン及び少なくとも1つのエクソソームポリペプチドを含み、前記少なくとも1つのNA結合ドメインが、PUF、Cas及び/又はNAアプタマー結合ドメインの1つ以上である、導入すること;
ii)前記EV生成細胞において、前記ポリペプチドコンストラクトを発現させること;並びに、任意選択で
iii)そのようにして生成された前記EVを前記EV生成細胞から収集することであって、前記EVが、前記少なくとも1つのポリペプチドコンストラクトを含む、収集すること
を含む、方法。
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