ES2899857T3 - Exosomas que comprenden terapias de ARN - Google Patents

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Dhanu Gupta
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Abstract

Una vesícula extracelular (VE) que comprende al menos un polipéptido de fusión que comprende al menos un dominio de unión a ácido nucleico (AN) y al menos un polipéptido exosómico, en donde el al menos un dominio de unión a AN es uno o más de PUF, Cas6, Cas13 y/o un dominio de unión a aptámero de AN.

Description

DESCRIPCIÓN
Exosomas que comprenden terapias de ARN
Campo Técnico
La presente invención se refiere a terapias de vesículas extracelulares (VE), en donde las VE comprenden terapias de ácidos nucleicos cargados de manera endógena, tal como ARNm, ARN circulares, miARN, ARNhp y varios otros agentes de terapias de ARN.
Antecedentes de la invención
Las terapias basadas en ácidos nucleicos se aproximan a la utilidad clínica a un ritmo rápido. Las terapias génicas, las terapias basadas en ARNm, las terapias basadas en oligonucleótidos cortos y ARNip son solo algunos ejemplos dentro de la plétora de modalidades dentro del panorama de las terapias de ARN. Ya que los ácidos nucleicos desnudos, típicamente ARN, son difíciles de suministrar in vivo debido a la rápida eliminación, la actividad nucleasa, la falta de distribución específica de órganos y la baja eficacia de la captación celular; a menudo, es obligatorio usar vehículos de suministro especializados como medio para lograr el suministro bioactivo. Este es el caso especialmente para objetivos no hepáticos y para las terapias de ARN de alto peso molecular, tal como el ARNm y la terapia génica.
Las vesículas extracelulares (tal como los exosomas) típicamente son vesículas de tamaño nanométrico producidas por la mayoría de los tipos de células y que funcionan como el sistema de transporte natural del cuerpo para las proteínas, ácidos nucleicos, péptidos, lípidos y varias otras moléculas entre las células. Las VE que contienen ARN tienen varios usos terapéuticos potenciales y ya se encuentran en investigación como vehículos de suministro para terapia génica, suministro de ARNm y suministro de ácidos nucleicos cortos en varios contextos. El documento WO2010/119256 representa la invención fundamental en el campo del suministro de ácido nucleico mediante el uso de exosomas y tal solicitud enseña la utilidad de los exosomas para el suministro de varios tipos de carga de ácido nucleico. El documento WO2017/203260 enseña métodos mejorados para el cargado endógeno de varios tipos de terapias de ARN con la ayuda de proteínas de unión a ARN, que llevan el ARN de interés hacia las VE que se forman dentro de las células parentales. El documento US14/502,494 representa otro método para el uso de proteínas de unión a ARN para cargar determinadas especies de ARN, mediante el uso del sistema denominado cargado de exosomas modular y dirigido (TAMEL, por sus siglas en inglés).
Sin embargo, a pesar de estos avances, todavía hay un espacio significativo en la técnica para mejorar el cargado de cargas de ARN grandes y pequeñas en las VE de una manera específica y eficiente. Además, el suministro bioactivo real a las células objetivo es un aspecto clave de cualquier sistema de suministro y la técnica anterior también puede mejorarse con respecto a esto.
El sistema de cargado TAMEL que se describe en el documento US14/502,494 y la referencia bibliográfica correspondiente (Hung y Leonard, Journal of Extracellular Vesicles 2016, 5: 31027) tiene una serie de desventajas que la presente invención intenta superar. La principal desventaja del sistema TAMEL es que no puede lograr el suministro funcional del ARNm, es decir, cuando las células se exponen a estos exosomas, no traducen el ARNm cargado en los exosomas mediante el sistema TAMEL. La presente solicitud logra el suministro bioactivo de la carga de ARNm.
Tutucci y otros (An improved MS2 system for accurate reporting of the mRNA life cycle. Nat Methods. enero de 2018; 15(1): 81-89) analiza el uso de la proteína MS2 para estudiar la localización y el ciclo de vida del ARN e indica que la proteína MS2, tal como se usa en el sistema TAMEL, se une al ARN con una afinidad muy alta. Este artículo informa que dicha unión estrecha es problemática para el estudio de la regulación del ARNm. Suponemos que, en el contexto del cargado de VE, esta unión de alta afinidad es también problemática porque la unión estrecha de MS2 significa que no se liberará ningún ARN/ácido nucleico cargado. Impedir que se libere el ARNm impedirá la traducción normal y esto explicaría por qué no se observa ninguna traducción del ARNm en el documento US14/502,494.
El sistema TAMEL no parece cargar todos los exosomas con ácidos nucleicos y, aquellos que se cargan, lo hacen con cantidades muy pequeñas de ácidos nucleicos (las desventajas de esta variable y el bajo nivel de carga se discuten en detalle más abajo). Estos niveles de carga variables y bajos, combinado con el hecho de que es poco probable que se libere el poco ácido nucleico cargado y, por lo tanto, no sea bioactivo, significa que el sistema TAMEL tiene muchas desventajas. El sistema TAMEL no es adecuado para cargar y suministrar cantidades de ácidos nucleicos bioactivos relevantes desde el punto de vista clínico. La presente invención supera estas importantes desventajas.
Otra desventaja del sistema TAMEL es que emplea proteínas bacteriófagas que pueden provocar respuestas inmunológicas no deseadas cuando las VE producidas se suministran a los pacientes. La presente invención también supera esta desventaja.
Resumen de la invención
Por lo tanto, un objeto de la presente invención es superar los problemas identificados anteriormente en relación con el cargado y posterior suministro a través de VE de terapias basadas en ácidos nucleicos (AN) en las células objetivo; y satisfacer las necesidades existentes dentro de la técnica, por ejemplo, para permitir alcanzar el compartimento intracelular correcto con un agente terapéutico de AN en cuestión.
La presente invención logra esto mediante el uso de una nueva tecnología de manipulación por ingeniería genética de las VE para cargar y liberar la carga de AN. Esto se logra mediante la manipulación por ingeniería genética avanzada de la construcción de polipéptido y polinucleótido para garantizar no solo un cargado altamente eficiente en las VE, sino también una liberación efectiva del AN en cuestión. En un primer aspecto, esto se logra al proporcionar una vesícula extracelular (VE) que comprende al menos un polipéptido de fusión que comprende al menos un dominio de unión a ácido nucleico (AN) y al menos un polipéptido exosómico, en donde el al menos un dominio de unión a AN es una o más de proteína de homología con Pumilio y FBF (PUF), Cas6, Cas13 y/o un dominio de unión a aptámero de AN. El dominio de unión a AN puede estar presente ventajosamente en varias copias, y cada molécula de carga de AN también puede estar presente en varias copias, todas y cada una de las copias tiene una pluralidad de sitios de unión para el dominio de unión a AN. Es importante destacar que los dominios de unión a AN que forman parte del polipéptido de fusión y que son responsables de la interacción con la molécula de carga de AN son dominios de unión a AN liberables, lo que significa que su unión a la molécula de carga de AN es una interacción reversible y liberable. La naturaleza liberable de la unión entre el dominio de unión a AN y la molécula de carga de AN es particularmente ventajosa, ya que los presentes inventores se dieron cuenta de que la sobreexpresión de la molécula de carga de AN en las células productoras de VE permite concentraciones locales suficientemente altas para permitir la interacción entre los dominio de unión a AN y la molécula de carga de AN, a la vez que la menor concentración de la molécula de unión a AN en el sitio objetivo (tal como dentro de una célula objetivo) permite la liberación eficiente de la molécula de AN, lo que permite su suministro bioactivo.
La presente invención hace uso de construcciones de polipéptido de fusión per se, y además construcciones de polinucleótido que codifican tales polipéptidos. Además, la presente invención hace uso de construcciones de polinucleótido que codifican las construcciones de polipéptido en cuestión, así como también polinucleótidos de carga de AN que se manipularon por ingeniería genética para tener una estabilidad y potencia mejoradas.
En aspectos adicionales, la presente invención se refiere a poblaciones de VE que comprenden las construcciones de polipéptido de fusión y moléculas de carga de AN, así como también a composiciones farmacéuticas de VE o poblaciones de VE.
En otro aspecto más, la presente invención se refiere a métodos in vitro para producir VE según la invención. Tales métodos pueden comprender al menos las etapas de (i) introducir en una célula productora de VE al menos una construcción de polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión que comprende al menos un dominio de unión a AN y al menos un polipéptido exosómico, en donde el al menos un dominio de unión a AN es uno o más de PUF, Cas6, Cas13 y/o un dominio de unión a aptámero de AN, (ii) expresar en la célula productora de VE al menos una construcción de polipéptido codificada por la al menos una construcción de polinucleótido, de esta manera se generan tales VE. Aunque no forma parte de la presente invención, pero es útil para comprender la invención, un método in vitro para el suministro intracelular de al menos una molécula de carga de ARN, en donde dicho método comprende poner en contacto una célula objetivo (típicamente una población de células objetivo) con al menos una VE y/o al menos una población de VE.
En resumen, la presente invención proporciona nuevas estrategias de cargado y liberación para el suministro a través de VE de una multitud de cargas de terapias de AN. Ventajosamente, la presente invención usa proteínas, todas altamente conservadas entre eucariotas y, por lo tanto, es poco probable que provoquen respuestas inmunes adversas cuando se suministran a pacientes.
Breve descripción de las figuras
Figura 1: Ilustración esquemática de una VE cargada con una molécula de carga de AN mediante el uso de las construcciones de polipéptido de fusión según la presente invención.
Figura 2: Gráfico que muestra el cargado, en VE derivadas de MSC, de moléculas de carga de ARNm que codifican NanoLuc (RTM) y p21, mediante el uso de construcciones de polipéptido de fusión que comprenden CD63 como polipéptido exosómico y PUF (en este caso, el dominio PUF de unión a AN se obtiene de la proteína PUM1 humana) o Cas6 como dominios de unión a AN. El experimento también incluyó un número variable de sitios de unión para los dominios de unión a AN, específicamente, 0, 3 y 6 sitios de unión. La expresión de solo el polipéptido exosómico CD63 no produjo el cargado de ningún ARNm en las VE (derecha). La expresión de polipéptidos de fusión que comprenden PUF (conjunto de columnas de la izquierda: dos dominios PUF que flanquean a CD63 tanto en el extremo N como en el extremo C, es decir, 4 construcciones de PUF en total) (segundo conjunto de columnas desde la izquierda: un dominio PUF que flanquea a CD63 tanto en el extremo N como en el extremo C) y Cas6 mutado (segundo desde la derecha) dieron como resultado un cargado significativo de ARNm de los ARNm de NanoLuc (RTM) y p21 tras la expresión en las células fuente de VE. El cargado de NanoLuc (RTM) fue en general más eficiente que el cargado de p21, con hasta alrededor de 45 copias de ARNm por VE.
Figura 3: Silenciamiento de la expresión genética in vitro en células objetivo tras el suministro a través de VE de un ARNhp dirigido a la huntingtina. Las células de amnios se manipularon por ingeniería genética para expresar ARNhp y las construcciones de polipéptido de fusión que comprenden como dominio de unión a AN, PUF (obtenido a partir de la proteína PUM humana) o Cas6, combinados con CD63 o CD81 como polipéptidos de VE, respectivamente. Las VE de AE se recogieron del cultivo celular y se agregaron a las células objetivo in vitro. El eje Y muestra cómo disminuye el nivel de expresión de huntingtina a medida que aumenta el número de sitios de unión en la molécula de carga de AN, lo que da como resultado un silenciamiento de aproximadamente el 80 % mediante el uso de un polipéptido de fusión que comprende PUF-CD63-PUF para cargar el ARNhp antihuntingtina.
Figura 4: Expresión de NanoLuc (RTM) como un sistema reportero en células objetivo Huh7, después de suministrar a través de VE un ARNm de NanoLuc (RTM) a HEK. La molécula de carga de ARNm de NanoLuc (RTM) se manipuló por ingeniería genética para comprender 0, 3 o 6 sitios de unión para los dominios de unión a AN que comprenden las construcciones de polipéptido de fusión, en este caso PUFx2-CD63-PUFx2 (dos polipéptidos PUF de unión a AN insertados tanto en el extremo N y como en el extremo C del polipéptido exosómico CD63), PUF-CD63-PUF y Cas6-CD9-Cas6. El eje Y muestra unidades relativas de luz (luminiscencia) (RLU) normalizadas con respecto a los pg de proteína, lo que indica mejores suministros y/o traducción a medida que aumenta el número de sitios de unión. En este ensayo se evaluó PUM1 humano y también un dominio PUF de unión a AN que se obtuvo de la proteína Pumilio de D. melanogaster.
Figura 5: Secuencias de SEQ ID NO 1 a 6.
Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere al cargado mejorado, la liberación controlada y la eficacia mejorada de las terapias de AN suministradas a través de VE, mediante el uso enfoques de ingeniería genética novedosos para introducir y suministrar carga de AN de una manera bioactiva en células objetivo in vitro y/o in vivo.
Por conveniencia y claridad, a continuación, se recopilan y describen algunos términos empleados en la presente descripción. A menos que se especifique de cualquier otra manera, todos los términos técnicos y científicos usados en la presente descripción tienen el mismo significado que el conocido comúnmente por el experto en la técnica a la que pertenece esta invención.
Cuando se describen las características, aspectos, modalidades o alternativas de la presente invención en términos de grupos de Markush, los expertos en la técnica reconocerán que la invención se describe también de esta manera en términos de cualquier miembro individual o subgrupo de miembros del grupo de Markush. El experto en la técnica reconocerá además que la invención también se describe de esta manera en términos de cualquier combinación de miembros individuales o subgrupos de miembros de grupos de Markush. Adicionalmente, se debe señalar que las modalidades y características descritas en relación con uno de los aspectos y/o las modalidades de la presente invención también se aplican mutatis mutandis a todos los demás aspectos y/o modalidades de la invención. Por ejemplo, los polipéptidos de fusión descritos en la presente descripción en relación con las VE deben entenderse que se describen, son relevantes y compatibles con todos los demás aspectos, enseñanzas y modalidades en la presente descripción, por ejemplo, aspectos y/o modalidades relacionados con los métodos para producir o la VE, o en relación con las correspondientes construcciones de polinucleótido descritas en la presente descripción. Además, determinadas modalidades descritas en relación con determinados aspectos, por ejemplo, las vías de administración de las VE que comprenden los polipéptidos de fusión y opcionalmente la molécula de carga del fármaco de AN, como se describe en relación con los aspectos relacionados con el tratamiento de determinadas indicaciones médicas, naturalmente también pueden ser relevantes en relación con otros aspectos y/o modalidades tales como los que pertenecen a las composiciones farmacéuticas. Además, todos los polipéptidos y proteínas identificados en la presente descripción pueden combinarse libremente en proteínas de fusión mediante el uso de estrategias convencionales para fusionar polipéptidos. Como ejemplo no limitante, los dominios de unión a AN (que son de origen polipeptídico) descritos en la presente descripción pueden combinarse libremente en cualquier combinación con uno o más polipéptidos exosómicos, opcionalmente, se combinan con todos los demás dominios, regiones, secuencias, péptidos y grupos polipeptídicos de la presente descripción, por ejemplo, cualquier dominio de multimerización, dominios de liberación y/o péptidos de direccionamiento. Además, los polipéptidos exosómicos y/o dominios de unión a AN pueden combinarse entre sí para generar construcciones que comprenden más de un polipéptido exosómico y/o más de un dominio de unión a AN. Además, todas y cada una de las características (por ejemplo, todos y cada uno de los miembros de un grupo de Markush) pueden combinarse libremente con todas las demás características (por ejemplo, todos y cada uno de los miembros de cualquier otro grupo de Markush), por ejemplo, cualquier dominio de unión a AN puede combinarse con cualquier polipéptido exosómico. Además, cuando las enseñanzas de la presente descripción se refieren a las VE en singular y/o a las VE como vesículas discretas similares a nanopartículas naturales, debe entenderse que todas estas enseñanzas son igualmente relevantes y aplicables a una pluralidad de VE y poblaciones de VE. Como observación general, los dominios de unión a AN, los
polipéptidos exosómicos, las fuentes de células productoras de VE, los dominios y péptidos adicionales, la molécula
de carga de AN y todos los demás aspectos, modalidades y alternativas de acuerdo con la presente invención
pueden combinarse libremente en todas y cada una de las combinaciones posibles. Además, cualquier polipéptido o
polinucleótido o cualquier secuencia de polipéptido o secuencia de polinucleótido (secuencias de aminoácidos o
secuencias de nucleótidos, respectivamente) que se usa en la presente invención puede desviarse
considerablemente de los polipéptidos, polinucleótidos y secuencias originales siempre que cualquier molécula
determinada conserve la capacidad de llevar a cabo el efecto técnico deseado asociado con la misma. Siempre que
se mantengan sus propiedades biológicas, las secuencias de polipéptido y/o polinucleótido de acuerdo con la
presente solicitud pueden desviarse hasta en un 50 % (calculado mediante el uso de, por ejemplo, BLAST o
ClustalW) en comparación con la secuencia nativa, aunque se prefiere una identidad de secuencia que sea lo más
alta posible (por ejemplo, 60 %, 70 %, 80 % o, por ejemplo, 90 % o más). La combinación (fusión) de, por ejemplo,
varios polipéptidos, implica que determinados segmentos de los respectivos polipéptidos pueden reemplazarse y/o
modificarse y/o que las secuencias pueden interrumpirse mediante la inserción de otros tramos de aminoácidos, lo
que significa que la desviación de la secuencia nativa puede ser considerable siempre que se conserven las
propiedades clave (por ejemplo, unión a AN, tráfico hacia VE, capacidades de actuar sobre la molécula objetivo,
etc.). Por tanto, un razonamiento similar se aplica naturalmente a las secuencias de polinucleótidos que codifican
dichos polipéptidos. Cualquier número de acceso o SEQ ID NO mencionado en la presente descripción en relación
con péptidos, polipéptidos y proteínas solo se considerará como ejemplo y solo de modo informativo, y todos los
péptidos, polipéptidos y proteínas recibirán su significado ordinario tal como se entenderían por el experto en la
técnica. Por tanto, como se mencionó anteriormente, el experto también entenderá que la presente invención abarca
no solo las SEQ ID NO específicas y/o los números de acceso a los que se hace referencia en la presente
descripción, sino también variantes y derivados de estas. Todos los números de acceso a los que se hace referencia
en la presente descripción son números de acceso de UniProtKB, y todas las proteínas, polipéptidos, péptidos,
nucleótidos y polinucleótidos mencionados en la presente descripción deben interpretarse de acuerdo con su
significado convencional según lo entienda un experto.
Los términos "vesícula extracelular" o "VE" o "exosoma" se usan indistintamente en la presente descripción y se
entenderá que se refieren a cualquier tipo de vesícula que pueda obtenerse de una célula en cualquier forma, por
ejemplo, una microvesícula (por ejemplo, cualquier vesícula desprendida de la membrana plasmática de una célula),
un exosoma (por ejemplo, cualquier vesícula derivada de la vía endolisosómica), un cuerpo apoptótico (por ejemplo,
que se obtiene de células apoptóticas), una micropartícula (que puede derivarse de, por ejemplo, plaquetas), un
ectosoma (derivado de, por ejemplo, neutrófilos y monocitos en suero), prostatosoma (por ejemplo, que se obtiene a
partir de células de cáncer de próstata) o un cardiosoma (por ejemplo, derivado de células cardíacas), etc. Los
tamaños de las VE pueden variar considerablemente, pero una VE típicamente tiene un diámetro hidrodinámico de
tamaño nanométrico, es decir, un diámetro inferior a 1000 nm. Claramente, las VE pueden derivarse de cualquier
tipo de célula, in vivo, ex vivo e in vitro. Las VE preferidas incluyen exosomas y microvesículas, pero otras VE
también pueden ser ventajosas en diversas circunstancias. Además, dichos términos también se entenderán en
relación con imitaciones de vesículas extracelulares, vesículas basadas en membranas celulares obtenidas
mediante, por ejemplo, extrusión de membranas, ultrasonidos u otras técnicas, etc. Para el experto en la técnica
será claro que, al describir los usos y aplicaciones médicos y científicos de las VE, la presente invención
normalmente se refiere a una pluralidad de VE, es decir, una población de VE que puede comprender miles,
millones, miles de millones o incluso billones de VE. Como puede verse en la sección experimental a continuación,
las VE pueden estar presentes en concentraciones tales como 105 108, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1030 VE (a menudo denominadas "partículas") por unidad de volumen (por ejemplo, por ml), o cualquier otro número
mayor, menor o en cualquier punto intermedio. En la misma línea, el término "población", que puede, por ejemplo,
relacionarse con una VE que comprende un determinado polipéptido de fusión entre un polipéptido exosómico y un
dominio de unión a AN que a su vez puede unirse a una molécula de carga de AN de interés, se entenderá que
abarca una pluralidad de entidades que constituyen tal población. En otras palabras, las VE individuales cuando
están presentes en una pluralidad constituyen una población de VE. Por tanto, naturalmente, la presente invención
se refiere tanto a VE individuales como a poblaciones que comprenden VE, como quedará claro para el experto en
la técnica. Las dosis de VE cuando se aplican in vivo pueden naturalmente variar de manera considerable en
dependencia de la enfermedad a tratar, la vía de administración, la actividad terapéutica, los efectos y la potencia de
la molécula de carga de AN, cualquier porción de direccionamiento presente en las VE, la formulación farmacéutica,
etc. Además, las VE de la presente invención también pueden comprender agentes terapéuticos adicionales,
además de la molécula de carga de AN. En algunas modalidades, el agente terapéutico adicional puede ser al
menos un fármaco terapéutico de molécula pequeña. En algunas modalidades, el fármaco terapéutico de molécula
pequeña puede seleccionarse del grupo que consiste en agentes que dañan el ADN, agentes que inhiben la síntesis
de ADN, agentes de unión a microtúbulos y tubulina, antimetabolitos, inductores de daño oxidativo,
antiangiogénicos, terapias endocrinas, antiestrógenos, inmunomoduladores como agonistas o antagonistas de
receptores tipo Toll, inhibidores de histona desacetilasa, inhibidores de la transducción de señales tal como
inhibidores de quinasas, inhibidores de proteínas de choque térmico, retinoides, inhibidores de receptores de
factores de crecimiento, compuestos antimitóticos, antiinflamatorios, reguladores del ciclo celular, inhibidores de
factores de transcripción e inductores de apoptosis, y cualquiera de sus combinaciones. En modalidades
adicionales, el agente terapéutico adicional puede ser un agente terapéutico basado en ácido nucleico adicional.
Tales agentes terapéuticos adicionales basados en ácidos nucleicos pueden seleccionarse del grupo que comprende ARN o ADN de cadena sencilla, ARN o ADN de doble cadena, oligonucleótidos tales como ARNip, ARN de cambio de empalme, hebras guía de CRISPR, ARN en horquilla pequeño (ARNhp), miARN, oligonucleótidos antisentido, polinucleótidos como ARNm, plásmidos o cualquier otro vector de ARN o ADN. De particular interés son los agentes basados en ácidos nucleicos que se sintetizan químicamente y/o que comprenden nucleótidos químicamente modificados como 2'-O-Me, 2'-O-alilo, 2'-O-MOE, 2'-F, 2'-CE, 2'-EA 2'-fAnA, LnA, CLNA, ENA, PNA, fosforotioatos, ADN triciclo, etc. En otras modalidades más, las VE según la presente invención pueden comprender agentes terapéuticos adicionales que pueden ser proteínas y/o péptidos. Tales proteínas y/o péptidos pueden estar presentes dentro de las VE, insertados en la membrana de la VE o asociados con la membrana de la VE, o pueden sobresalir de la VE hacia el entorno extravesicular. Tales proteínas terapéuticas y/o agentes peptídicos pueden seleccionarse de un grupo de ejemplos no limitantes que incluyen: anticuerpos, intracuerpos, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), aficuerpos, bianticuerpos y anticuerpos multiespecíficos o aglutinantes, aficuerpos, darpinas, receptores, ligandos, enzimas para, por ejemplo, terapia de reemplazo de enzimas o edición de genes, supresores de tumores (los ejemplos no limitantes incluyen p53, p21, pVHL, APC, CD95, ST5, YPEL3, ST7 y/o ST15) inhibidores virales o bacterianos, proteínas de componentes celulares, ADN y/o proteínas de unión a ARN, inhibidores de la reparación del ADN, nucleasas, proteinasas, integrasas, factores de transcripción, factores de crecimiento, inhibidores e inductores de apoptosis, toxinas (por ejemplo, exotoxinas de pseudomonas), proteínas estructurales, factores neurotróficos como NT3/4, derivados del factor neurotrófico de cerebro (BDNF) y el factor de crecimiento nervioso (NGF) y sus subunidades individuales como la subunidad beta 2.5S, canales iónicos, transportadores de membrana, factores de proteostasis, proteínas involucradas en la señalización celular, proteínas relacionadas con la traducción y la transcripción, proteínas de unión a nucleótidos, proteínas de unión a otras proteínas, proteínas de unión a lípidos, glicosaminoglicanos (GAG) y proteínas de unión a GAG, proteínas metabólicas, proteínas que regulan el estrés celular, proteínas que regulan la inflamación y el sistema inmunológico, proteínas mitocondriales y proteínas de choque térmico, etc.
Los términos "polipéptido exosómico", "proteína exosómica", "proteína portadora exosómica", "proteína de VE" y "polipéptido de VE" se usan indistintamente en la presente descripción y se entenderá que se refieren a cualquier polipéptido que pueda usarse para transportar una construcción de polipéptido (que típicamente comprende, además del polipéptido exosómico, un dominio de unión a AN, por ejemplo, un polipéptido que comprende un dominio de unión a AN) a una estructura vesicular adecuada, es decir, a una VE adecuada. Más específicamente, estos términos deben entenderse como que comprenden cualquier polipéptido que permita el transporte, tráfico o traslado de una construcción de proteína de fusión a una estructura vesicular, tal como una VE. Ejemplos de tales polipéptidos exosómicos son, por ejemplo, CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71 (también conocido como receptor de transferrina) y su dominio de distribución endosomal, es decir, el dominio de distribución endosomal del receptor de transferrina, CD133, CD138 (sindecano-1), CD235a, ALIX, AARDC1, Sintenina-1, Sintenina-2, Lamp2b, sindecano-2, sindecano-3, sindecano-4, TSPAN8, TSPAN14, c D37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, receptores de Fc, receptores de interleucina como TNFR y gp130, inmunoglobulinas, componentes de MHC-I o MHC-II, CD2, CD3 épsilon, CD3 zeta, CD13, CD18, CD19, CD30, TSG101, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 alfa, Mac- 1 beta, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A, VTI1B, otros polipéptidos exosómicos y cualquier combinación o derivados de estos, pero muchos otros polipéptidos capaces de transportar una construcción de polipéptido a una VE están comprendidos dentro del alcance de la presente invención. En varias modalidades de la presente invención, al menos un polipéptido exosómico se fusiona con el dominio de unión a AN, para formar una proteína de fusión presente en una VE para ayudar en el cargado de la molécula de carga de AN. Tales proteínas de fusión también pueden comprender varios otros componentes para optimizar su(s) función(es), incluidos enlazadores, dominios transmembrana, dominios citosólicos, dominios de multimerización, etc.
Los términos "dominio de unión a AN" o "polipéptido de unión a NA" o "proteína de unión a NA" se usan indistintamente en la presente descripción y se refieren a cualquier dominio que sea capaz de unirse a un tramo de nucleótidos. Los dominios de unión a AN pueden unirse a ARN, ADN, mezclas de ARN y ADN, tipos particulares de AN tal como ARNhp, miARN, ARNm, ARNg, pri-miARN, pre-miARN, ARN circular, ARNpi, ARNt, ARNr, ARNnp, ARNlnc, ribozimas, ADN de minicírculo, ADN plasmídico, etc. Además, los dominios de unión a AN también pueden unirse a nucleótidos modificados químicamente tal como 2'-O-Me, 2'-O-alilo, 2'-O-MOE, 2'-F, 2'-CE, 2'-EA 2'-FANA, LNA, CLNA, ENA, PNA, fosforotioatos, ADN triciclo, etc. Además, los dominios de unión a AN también pueden unirse a secuencias particulares de AN, a dominios tal como repeticiones, o a motivos de AN, tal como tallo lazos u horquillas. Dichos sitios de unión para los dominios de unión a AN pueden presentarse de manera natural en la molécula de carga de AN de interés y/o pueden diseñarse en la molécula de carga de AN para mejorar aún más el cargado de VE y el suministro bioactivo. La afinidad de unión del dominio de unión a AN por el ácido nucleico es tal que el ácido nucleico se une con una afinidad lo suficientemente alta como para ser trasladado a los exosomas, pero la afinidad de unión no es tan alta como para evitar la posterior liberación del ácido nucleico en la célula objetivo de manera que el ácido nucleico sea bioactivo una vez que se suministre a la célula objetivo. Por tanto, de manera importante y a diferencia de la técnica anterior, la presente invención se refiere a VE cargadas con moléculas de carga de AN con la ayuda de dominios de unión a AN liberables, en donde tales dominios de unión a AN forman parte de polipéptidos de fusión con polipéptidos exosómicos. Los dominios de unión a AN de la presente invención se seleccionaron para permitir una afinidad programable y modificable entre el dominio de unión a AN y la molécula de carga de AN, lo que permite la producción de VE que comprenden polipéptidos de fusión que comprenden el dominio de unión a AN y al menos una molécula de carga de AN, en donde el dominio de unión a AN de la construcción del polipéptido de fusión interactúa de una manera programable, reversible y modificable con la molécula de carga de AN, lo que permite tanto el cargado en las VE como la liberación de la molécula de carga de AN en las VE y/o en o en relación con las células objetivo. Esto es totalmente diferente a la técnica anterior, que simplemente permite el cargado de moléculas de ARNm en exosomas mediante el uso la proteína MS2, pero en donde la proteína MS2 permanece unida al ARNm, lo cual inhibe su liberación y posterior traducción.
La presente invención se refiere principalmente a tres grupos de dominios de unión a AN, específicamente, proteínas PUF, polipéptidos asociados a CRISPR (Cas) y específicamente Cas6 y Cas13, y varios tipos de aptámeros de unión a AN. La presente invención usa el término proteínas PUF para abarcar todas las proteínas relacionadas y dominios de tales proteínas (que también pueden denominarse proteínas PUM), por ejemplo, homólogo 1 de Pumilio humano (PUM1), PUMx2 o PUFx2 que son duplicados de PUM1, etc., o cualquier dominio de unión a AN que pueda obtenerse a partir de cualquier proteína PUF (PUM). Las proteínas PUF se caracterizan típicamente por la presencia de ocho repeticiones PUF consecutivas, cada una de aproximadamente 40 aminoácidos, a menudo flanqueadas por dos secuencias relacionadas, Csp1 y Csp2. Cada repetición tiene un "consenso central" que contiene residuos aromáticos y básicos. Se requiere todo el grupo de repeticiones de PUF para la unión del ARN. Sorprendentemente, esta misma región también interactúa con correguladores de proteínas, y es suficiente para rescatar, en gran medida, los defectos de una proteína PUF mutante, lo que hace que las proteínas PUF sean muy adecuadas para las mutaciones que se usan en la presente invención. Además, las proteínas PUF son ejemplos muy preferidos de dominios de unión a AN liberables que se unen con una afinidad adecuada a las moléculas de carga de AN, de esta manera se permite una unión reversible y liberable de la proteína PUF a la carga de AN. Las proteínas PUF se encuentran en la mayoría de los eucariotas y participan en la embriogénesis y el desarrollo. Las PUF tienen un dominio que se une al ARN que se compone de 8 repeticiones que generalmente contienen 36 aminoácidos, que es el dominio que se usa típicamente para la unión del ARN en esta solicitud de patente. Cada repetición se une a un nucleótido específico y es comúnmente el aminoácido en la posición 12 y 16 el que confiere la especificidad con una interacción de apilamiento del aminoácido 13. Las PUF de origen natural pueden unirse a los nucleótidos adenosina, uracilo y guanosina, y las PUF modificadas genéticamente también pueden unirse al nucleótido citosina. Por tanto, el sistema es modular y la secuencia de 8 nucleótidos a la que se une el dominio PUF puede cambiarse al cambiar la especificidad de unión de los dominios repetidos. Por tanto, las proteínas PUF según la presente invención pueden ser naturales o manipuladas por ingeniería genética para unirse en cualquier parte de una molécula de ARN, o alternativamente pueden elegirse proteínas PUF con diferentes afinidades de unión para diferentes secuencias y manipular la molécula de ARN para que contenga dicha secuencia. Además, existen dominios PUF manipulados por ingeniería genética y/o duplicados que se unen a 16 nucleótidos de una manera específica de secuencia, que también pueden usarse para aumentar aún más la especificidad por la molécula de carga de AN. Por tanto, el dominio PUF puede modificarse para unirse a cualquier secuencia, con diferente afinidad y longitud de secuencia, lo que hace que el sistema sea altamente modular y adaptable para cualquier molécula de carga de ARN según la presente invención. Las proteínas PUF y las regiones y derivados de estas que pueden usarse como dominios de unión a AN según la presente invención incluyen la siguiente lista no limitante de proteínas PUF: FBF, FBF/PUF-8/PUF-6,-7,-10, todas de C. elegans; Pumilio de D. melanogaster; Puf5p/Mpt5p/Uth4p, Puf4p/Ygl014wp/Ygl023p, Puf5p/Mpt5p/Uth4p, Puf5p/Mpt5p/Uth4p, Puf3p, todas de S. cerevisiae; PufA de Dictyostelium; PUM1 humano (Pumilio 1, a veces también conocido como PUF-8R) y cualquier dominio de esta, polipéptidos que comprenden dominios de unión a AN de al menos dos PUM1, cualquier proteína PUF truncada o modificada o manipulada por ingeniería genética, como por ejemplo PUF-6R, PUF-9R, PUF-10R, PUF-12R y PUF-16R o derivados de estas; y X-Puf1 de Xenopus. Los PUF de unión a AN particularmente adecuadas según la presente invención incluyen lo siguiente: PUF 531 (como ejemplo no limitante ilustrado por la SEQ ID NO 1), PUF ARNm loc (a veces denominado PUF manipulada por ingeniería genética PUFman) (como ejemplo no limitante ilustrado por la SEQ ID NO 2) y/o PUFx2 (como un ejemplo no limitante ilustrado por la SEQ ID NO 3), y cualquier derivado, dominio y/o región de estos. Las proteínas PUF/PUM son muy ventajosas ya que pueden seleccionarse para que sean de origen humano. Las secuencias de SEQ ID NO 1 a 3 se representan en la Figura 5. Las proteínas de origen humano, en lugar de las de origen bacteriófago como la proteína MS2 que se usa en el documento US14/502,494, son beneficiosos porque es menos probable que provoquen una respuesta inmune adversa. Además, MS2 interactúa con un tallo lazo de origen bacteriófago, lo que, a diferencia de las proteínas PUF, implica que es necesario introducir una secuencia y un motivo de AN procariota en la molécula de AN de elección. Claramente, esta inserción de una estructura de tallo lazo de origen y estructura de bacteriófagos puede interferir con la traducción del ARNm y dar como resultado moléculas de carga de ARNm no funcionales, o incluso desencadenar inmunotoxicidad.
Por tanto, en modalidades ventajosas, la presente invención se refiere a proteínas de unión a AN eucariotas fusionadas con proteínas exosómicas. En una modalidad preferida, el dominio o dominios de unión a AN es(son) de la familia de proteínas PUF, por ejemplo, PUF531, PUF modificada y/o PUFx2. Es importante destacar que las proteínas PUF se usan preferentemente en el suministro de ARNm o ARNhp a través de VE que, debido a la especificidad de secuencia de las proteínas PUF, permite un cargado específico y altamente controlado de la carga del fármaco de AN. En modalidades preferidas, la(s) proteína(s) PUF se combinan ventajosamente con proteínas transmembrana o exosómicas solubles. Las construcciones de proteínas de fusión ventajosas incluyen los siguientes ejemplos no limitantes: CD63-PUF531, CD63-PUFx2, CD63-PUFengineered, CD81-PUF531, CD81-PUFx2, CD81-PUFengineered, CD9-PUF531, CD9-PUx2, CD9-PUF manipuladas por ingeniería genética y otras proteínas de fusión transmembrana, que se basan preferentemente en proteínas exosómicas de tetraspanina fusionados con una, dos o más proteínas PUF. Las proteínas de fusión ventajosas que comprenden proteínas PUF y al menos una proteína exosómica soluble incluyen los siguientes ejemplos no limitantes: sintenina-PUF531, sintenina-PUx2, sintenina-PUF manipulada por ingeniería genética, sindecano-PUF531, sindecano-PUx2, sindecano-PUF manipulada por ingeniería genética, Alix-PUF531, Alix-PUx2, Alix-PUF manipulada por ingeniería genética, así como también cualquier otra proteína exosómica soluble fusionada a una proteína PUF.
El hecho de que las proteínas PUF tengan una especificidad de secuencia modificable para la molécula de carga de AN objetivo las convierte en dominios de unión a AN ideales para fusionarse con pareja(s) de unión de polipéptido exosómico. Por lo tanto, en las modalidades preferidas de la presente invención, las VE se cargan con moléculas de carga de AN mediante el uso de dominios de unión a AN liberables (como parte de proteínas de fusión con proteínas exosómicas), en donde la interacción entre el dominio de unión a AN y la molécula de carga de AN ventajosamente se basa en la especificidad para una secuencia de nucleótidos objetivo y no se basa en una estructura secundaria de nucleótido objetivo (ya que las estructuras secundarias no permiten la especificidad de secuencia). En modalidades preferidas, la molécula de carga de AN se manipula por ingeniería genética para comprender y/o comprende de manera natural la secuencia de nucleótidos objetivo para la proteína PUF elegida como dominio de unión a AN. Tales secuencias de nucleótidos objetivo pueden, como se mencionó anteriormente, por ejemplo, ser parte de la 3'UTR de un ARNm o pueden introducirse en cualquier molécula de carga de AN tal como un ARNm, ARNhp, miARN, ARNc, ADN, etc., lo que permite a la proteína PUF unirse a la molécula de carga de AN. El sitio de unión de PUF en la molécula de carga de AN es típicamente más largo que la secuencia a la que se unen muchas otras proteínas de unión a ARN, tal como MS2, que simplemente reconoce 4 nucleótidos y un tallo lazo en combinación, por lo que el tramo preferido de nucleótidos en el sitio de unión al objetivo puede ser, por ejemplo, 5 nucleótidos (nt), 6 nt, 7 nt, 8 nt, 9 nt, 10 nt, 11 nt, 12 nt, 13 nt, 14 nt, 15 nt, 16 nt, 17 nt, 18 nt, 19 nt, o incluso 20 nt y más, en dependencia de la necesidad de especificidad de secuencia modificable del dominio de unión a AN. En una modalidad preferida, la proteína PUF es específica para un sitio de unión de la molécula de carga de AN de origen natural y/o artificial que tiene una longitud de 6 nt, 8 nt, 9 nt, 10 nt, 12 nt o 16 nt.
Los polipéptidos asociados a CRISPR (Cas) representan otro grupo de dominios de unión a AN e incluyen en particular Cas6 (como un ejemplo no limitante ilustrado por la SEQ ID NO 4, tal secuencia se representa en la Figura 5) y Cas13. Cas6 se une al ARN CRISPR precursor (ARNcr) con alta afinidad y lo procesa para su posterior incorporación en, por ejemplo, Cas9. La velocidad de escisión de la molécula de ARN puede modularse y definirse en gran medida, por lo que el tiempo de asociación entre la molécula de ARN y Cas6 también puede definirse de una manera muy precisa, lo cual es importante para los fines de la presente invención. Pueden usarse versiones mutantes de Cas6 o Cas13 mutadas para aumentar o disminuir la eficiencia de la escisión del ARN. Pueden usarse versiones mutantes de Cas6 o Cas13 mutadas para aumentar o disminuir la afinidad de unión del ARN. Esto será una ventaja, por ejemplo, cuando la molécula de carga de ARN deba liberarse en la célula receptora. El tiempo de asociación definido puede entonces modularse para liberar la molécula de ARN dentro de las vesículas, pero no en la célula productora. La secuencia de ARN que puede reconocer Cas6 puede que puede manipularse por ingeniería genética para insertarse en una molécula de AN de interés. Cas13 puede manipularse por ingeniería genética para únicamente unirse a su objetivo de ARN definido y no degradarlo. Al cambiar la secuencia de la molécula de ARNsg, el complejo Cas13-ARNsg puede modularse para unirse a cualquier secuencia de ARN entre 20-30 nucleótidos. Por ejemplo, el uso de dominios de unión a AN de proteínas Cas es especialmente ventajoso para el suministro de ARN cortos, por ejemplo, ARNhp o miARN. En tales casos, la actividad de escisión de los polipéptidos Cas seleccionados puede usarse para liberar, por ejemplo, una molécula de carga de ARNhp de un sitio de unión al que, por ejemplo, se unió Cas6. Además, como es el caso de las proteínas PUF, las proteínas Cas son ejemplos muy preferidos de dominios de unión a AN liberables que se unen con una afinidad adecuada a las moléculas de carga de AN, lo que de esta manera permite una unión reversible y liberable de la proteína Cas a la carga de AN. Al igual que con los dominios de unión a AN basados en PUF, las proteínas Cas representan un dominio de unión a AN liberable e irreversible con especificidad de secuencia modificable y programable para la molécula de carga de AN objetivo, lo que permite una mayor especificidad con una afinidad total más baja, lo que de esta manera permite tanto el cargado de la carga de AN en las VE como la liberación de la carga de An en el sitio objetivo.
Los dominios de unión a aptámeros de AN son otro grupo de dominios de unión a AN según la presente invención. Tales dominios de unión a aptámeros de AN son dominios, regiones, tramos de aminoácidos o polipéptidos o proteínas completas que pueden unirse con especificidad a los aptámeros basados en AN. Los aptámeros son secuencias de ARN que forman estructuras secundarias y/o terciarias para reconocer moléculas, similar a la afinidad de un anticuerpo por su antígeno objetivo. Por tanto, estas moléculas de ARN pueden reconocer secuencias de aminoácidos específicas con alta afinidad. Los aptámeros de ARN se aplican en la presente invención mediante la inserción de secuencias de nucleótidos particulares en la molécula de AN para reconocer secuencias de aminoácidos específicas. Tales secuencias de aminoácidos pueden manipularse por ingeniería genética en y/o junto al polipéptido exosómico portador para permitir que el aptámero (que se manipula por ingeniería genética dentro de y/o junto a la molécula de carga de AN) se les una, de esta manera trasladan la molécula de carga de AN a las VE con la ayuda del polipéptido exosómico. Dos aptámeros con características adecuadas son un aptámero de His (como ejemplo no limitante ilustrado por la SEQ ID NO 5) con alta afinidad por un tramo de aminoácidos de histidina (His) y un aptámero el dominio Tat del VIH (como un ejemplo no limitante ilustrado por la SEQ ID NO 6). La secuencia o secuencias de aptámeros se insertan preferentemente en la región no traducida 3' y/o 5' de un ARNm o región no específica de ARN no codificantes. También pueden combinarse dos o más aptámeros en una molécula de carga de AN para aumentar la especificidad y la avidez por la proteína portadora exosómica. Las secuencias de las SEQ ID NO 5 y 6 se representan en la Figura 5. Es importante destacar que todos los dominios de unión a AN de la presente invención proporcionan una unión programable, específica de secuencia, reversible y liberable a la molécula de carga de AN, por ejemplo, ARNm, ARNhp o miARN, lo que es totalmente diferente a la alta afinidad, unión irreversible al ARN encontrado en la técnica anterior. En modalidades preferidas de la presente invención, los dominios de unión a AN son proteínas PUF o proteínas Cas, debido a su naturaleza fácilmente programable y especificidad de secuencia combinada con su unión reversible y liberable a moléculas de carga de AN. Es importante destacar que la especificidad de secuencia de las proteínas Cas y las proteínas PUF como dominios de unión a AN se basa preferentemente en la interacción con al menos 6 nt, preferentemente al menos 8 nt en la molécula de AN objetivo, que cuando se combina con una interacción de baja afinidad permite un suministro muy productivo de la molécula de carga de AN a través de VE. El sitio de unión de al menos 6 nt en la molécula de carga de AN está presente preferentemente en una secuencia contigua de nucleótidos. Por tanto, el sitio de unión de la molécula de carga de AN corresponde preferentemente a una longitud de dos codones.
En un primer aspecto, la presente invención se refiere a vesículas extracelulares (VE) que comprenden al menos un polipéptido de fusión que comprende al menos un dominio de unión a ácido nucleico (AN) y al menos un polipéptido exosómico, en donde el al menos un dominio de unión a AN es uno o más de PUF, Cas6, Cas13 y/o un dominio de unión a aptámero de AN. Como resultado de la presencia del dominio de unión a AN, las VE típicamente comprenden además al menos una molécula de carga de AN. Normalmente, el número de moléculas de carga de AN comprendidas en todas y cada una de las VE es considerable, lo que es una clara mejora con respecto a la técnica anterior que normalmente consigue una muy baja eficacia de cargado. En el caso de la presente invención, el diseño inventivo de las construcciones de polipéptido de fusión significa que la al menos una molécula de carga de AN se transporta de manera muy eficiente en la VE (con la ayuda del polipéptido de fusión) seguido de un proceso de liberación mejorado de manera significativa. La naturaleza liberable de la unión entre el dominio de unión a AN (que está comprendido en el polipéptido de fusión) y la molécula de carga de AN es un aspecto clave de la presente invención, ya que permite la unión de moléculas de carga de AN en las células productoras de VE (donde normalmente se sobreexpresan las moléculas de carga de AN) a la vez que permite el suministro de moléculas de AN bioactivas en y/o cerca de la célula objetivo.
Por lo tanto, a diferencia de la técnica anterior, una interacción programable de menor afinidad entre el dominio de unión a AN y las moléculas de carga de AN permite que la presente invención cargue de manera eficiente las VE en las células productoras de VE, a la vez que permite la liberación de la carga de AN en sitios adecuados (típicamente dentro de una célula objetivo) donde la menor afinidad y la naturaleza liberable de la interacción entre la molécula de carga de AN y el dominio de unión a AN es muy ventajosa. Además, a diferencia de la técnica anterior que simplemente describe la MS2 como una proteína de unión de ARN de alta afinidad que se une a 4 nts y un tallo lazo, la presente invención permite la unión de baja o media afinidad específica de secuencia a tramos de nucleótidos que son más largos y, de esta manera, más específicos, por ejemplo, 6 nt de longitud u 8 nt de longitud.
La mayor longitud del sitio de unión permite introducir una variedad de mutaciones diferentes que generan sitios de unión con una variedad de afinidades de unión modificadas, de este modo se producen las interacciones programables de menor afinidad mencionadas anteriormente. Por ejemplo, la introducción de una mutación puntual en una región de 6 u 8 nucleótidos modificará sutilmente la afinidad de unión, mientras que se sabe que incluso una única mutación en la región de unión de 4 nucleótidos más corta de MS2 afecta significativamente la afinidad de unión de MS2 por el ARN. La longitud más larga del ácido nucleico proporciona más margen para introducir una o más mutaciones que afectan la afinidad de unión de la proteína por el ácido nucleico. De manera similar, requerir un tramo más largo de nucleótidos para unirse da como resultado un mayor número de aminoácidos que son capaces de interactuar con la secuencia de nucleótidos más larga y, por lo tanto, brindan más posibilidades de mutar esos aminoácidos que interactúan y de nuevo producir una mayor variedad de posibles mutantes de proteínas con una variedad de afinidades de unión. Tanto el sitio de unión de nucleótidos más largo como los sitios de unión de proteínas más grandes de PUF, Cas6 y Cas13 proporcionan ventajas al permitir que se logre un mayor intervalo de afinidades por mutación que lo que podría lograrse mediante la mutación de la proteína MS2 o la secuencia de ARN de MS2. Por tanto, esta secuencia más larga ofrece mayores posibilidades de manipular el ácido nucleico y/o la proteína de unión para adaptar la afinidad de unión específicamente a una carga individual de interés si es necesario para mejorar la liberación de esa carga de ácido nucleico. Como se discutió anteriormente, la capacidad de controlar la afinidad de unión a la carga de nucleótidos y de este modo modificar y controlar la capacidad de liberación de la carga de nucleótidos es una ventaja significativa de la presente invención sobre la técnica anterior, lo que da como resultado el suministro y liberación de ácidos nucleicos bioactivos.
En una modalidad, la molécula de carga de AN puede seleccionarse del grupo que comprende ARNhp, miARN, ARNm, ARNg, pri-miARN, pre-miARN, ARN circular, ARNpi, ARNt, ARNr, ARNnp, ARNlnc, ribozimas, ADN de minicírculo, ADN plasmídico, pero esencialmente cualquier tipo de molécula de AN puede estar comprendida en las VE según la presente invención. Tanto las moléculas de AN de cadena sencilla como de doble cadena están dentro del alcance de la presente invención, y la molécula de AN puede ser de origen natural (como ARN o ADN) o puede ser una molécula de ARN y/o ADN sintetizada químicamente que puede comprender químicamente nucleótidos modificados como 2'-O-Me, 2'-O-alilo, 2'-O-MOE, 2'-F, 2'-CE, 2'-eA, 2'-FANA, LnA, CLNA, ENA, PNA, fosforotioatos, ADN triciclo, etc. Es importante destacar que, aunque la presente invención es muy adecuada para el cargado endógeno de moléculas de carga de AN (por ejemplo, ARNm, ARN circular, ARNhp, etc.), también es aplicable al cargado de moléculas de AN exógenas que pueden cargarse al exponer a las células productoras de VE a la molécula de AN en cuestión y/o por coincubación o formulación con las VE per se.
En una modalidad específica, el dominio de unión a AN es Cas6 o Cas13 y la molécula de carga de AN es un ARNhp. La combinación de Cas6/Cas13 con carga de ARNhp es ventajosa porque la actividad innata de Cas6/Cas13 dará como resultado la escisión del ARNhp del dominio o dominios de unión a AN a los que se unieron Cas6 o Cas13, de esta manera se libera el ARNhp del complejo entre la proteína de fusión y el dominio de unión a AN. Adicionalmente, debido a que el ARNhp no requiere ninguna caperuza o cola de poliA para funcionar una vez que se libera en el citoplasma, el ARNhp escindido está inmediatamente listo para silenciar genes con alta actividad.
En las modalidades de la presente invención, las moléculas de carga de AN según la presente invención comprenden (i) al menos un sitio de unión para el dominio de unión a AN del polipéptido de fusión y (ii) un dominio de polinucleótido terapéutico. En modalidades preferidas, las moléculas de carga de AN comprenden al menos dos sitios de unión y aún con mayor preferencia un número mayor de sitios de unión, por ejemplo, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15 o un número incluso mayor. Los inventores se dieron cuenta de que la inclusión de 4-8 sitios de unión produce un cargado óptimo de la molécula de carga de AN en las VE sin afectar negativamente la liberación y el suministro bioactivo de la carga. Los sitios de unión para el dominio de unión a AN pueden manipularse por ingeniería genética en y/o flanquear la UTR 3' y/o 5' y/o colocarse en la región codificante de la molécula de carga de AN mediante optimización de secuencia.
Las moléculas de carga de AN según la presente invención pueden comprender ventajosamente al menos un sitio de escisión entre el al menos un sitio de unión y el dominio de polinucleótido terapéutico, para permitir la liberación de la parte terapéutica de la molécula de carga de AN.
Generalmente, la molécula de carga de AN puede destinarse para llevar a cabo una variedad de funciones, por ejemplo, codificar una proteína de interés (como una proteína con actividad terapéutica), silenciar una secuencia de nucleótidos objetivo mediante la interacción antisentido con el objetivo, cambio y/o empalme de bloques, participar en la escisión de una secuencia de nucleótidos objetivo, por ejemplo, mediante escisión a través de RNasa H o interferencia de RNA a través del complejo RISC (iARN). En modalidades de particular interés, la molécula de carga de AN puede llevar a cabo más de una función, por ejemplo, puede codificar una proteína de interés y comprender una secuencia de AN que puede tener, por ejemplo, una función de guía. Un ejemplo particularmente ventajoso de esto es una molécula de AN que codifica una proteína asociada a CRISPR (como Cas (fuera de la invención), Cas9 (fuera de la invención; en un ejemplo Cas9 con número de acceso Q99ZW2 como se muestra en la SEQ ID NO: 7), y/o Cas6) y que también comprende una hebra guía para dirigir la proteína asociada a CRISPR a una secuencia objetivo para la edición de genes y/o una hebra de ADN correctora para, por ejemplo, reparación dirigida por homología. En tales modalidades, es particularmente ventajoso incluir sitios de escisión en la molécula de AN, para permitir la liberación de una o ambas proteínas codificadas por la molécula de carga de AN y la hebra guía comprendida en la molécula de carga de AN.
Los ejemplos no limitantes de proteínas que pueden codificarse por la molécula de carga de AN incluyen los siguientes: anticuerpos, intracuerpos, fragmentos variables de cadena simple, aficuerpos, enzimas, transportadores, supresores de tumores (los ejemplos no limitantes incluyen p53, p21, APC, CD95, ST5, YPEL3, ST7 y/o ST15), inhibidores virales o bacterianos, proteínas de componentes celulares, proteínas de unión a ADN y/o ARN, inhibidores de la reparación de ADN, nucleasas, proteinasas, integrasas, factores de transcripción, factores de crecimiento, inhibidores e inductores de apoptosis, toxinas, proteínas estructurales, factores neurotróficos, transportadores de membrana, proteínas de unión a nucleótidos, proteínas de choque térmico, proteínas asociadas a CRISPR, citocinas, receptores de citocinas, caspasas y cualquier combinación y/o derivados de estos.
Los diseños tanto de la molécula de carga de AN como de las construcciones de polipéptido de fusión son clave para el cargado, liberación y suministro bioactivo, por ejemplo, en células objetivo y/o en órganos, tejidos y compartimentos corporales particulares. Los inventores descubrieron que modalidades particularmente ventajosas son las VE que comprenden polipéptidos de fusión que comprenden al menos un polipéptido exosómico flanqueado en uno o ambos lados por al menos un dominio de unión a AN (es decir, al menos un dominio de unión a AN en un lado o en cada lado). Alternativamente, el dominio de unión a AN puede insertarse en varios casos en el polipéptido exosómico en al menos una ubicación (por ejemplo, en un lazo extravesicular de, por ejemplo, CD63), por ejemplo, cuando es conveniente exponer el dominio de unión a AN en el exterior de la VE para mejorar el cargado exógeno. El polipéptido exosómico puede estar flanqueado inmediatamente en el extremo C y/o N, pero el diseño más ventajoso es incluir un péptido enlazador entre el polipéptido exosómico y los dominios de unión a AN, para proporcionar separación y flexibilidad para mantener la actividad tanto del polipéptido exosómico(s) como el(los) dominio(s) de unión a AN. Estos enlazadores pueden ser ventajosamente enlazadores de glicina-serina (GS) que contienen un número particular de repeticiones. Los inventores se dieron cuenta de que 1 a 4 repeticiones son las más ventajosas, ya que proporcionan suficiente flexibilidad sin dejar el polipéptido de fusión demasiado desestructurado; sin embargo, los enlazadores más largos y los enlazadores que no se basan en GS también están dentro del alcance de la presente solicitud. Como se mencionó anteriormente, para aplicaciones que involucran el cargado exógeno de moléculas de carga de AN, las VE comprenden preferentemente polipéptidos de fusión que comprenden al menos un polipéptido exosómico fusionado a al menos un dominio de unión de AN en su extremo N, y/o su extremo C y/o en cualquier región extravesicular (es decir, presente fuera de la VE) del polipéptido exosómico, con el fin de exponer el dominio de unión a AN en la superficie del exosoma.
El diseño y la selección del componente de polipéptido exosómico de la construcción del polipéptido de fusión es clave para permitir la formación eficiente de la VE, el cargado de AN en las VE y también la liberación de la molécula de carga de AN. Las proteínas exosómicas pueden seleccionarse de los siguientes ejemplos no limitantes: CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, AARDC1, Sintenina-1, Sintenina-2, Lamp2b, TSPAN8, sindecano-1, sindecano-2, sindecano-3, sindecano-4, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, TNFR, gp130, receptores de Fc, receptores de interleucina, inmunoglobulinas, componentes de MHC-I o MHC-II, CD2, CD3 épsilon, CD3 zeta, CD13, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 alfa, Mac-1 beta, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A, VTI1B, otros polipéptidos exosómicos y cualquiera de sus combinaciones.
Como se mencionó anteriormente, las VE según el presente se cargan con la molécula de carga de AN con la ayuda del polipéptido de fusión. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se supone que el cargado tiene lugar en relación con la formación de la VE dentro de la célula productora de VE o de forma exógena al incubar la(s) molécula(s) de carga de AN con VE manipuladas por ingeniería genética. El polipéptido de fusión normalmente puede unirse a la molécula de carga de AN (tal como una molécula de ARNm coexpresada en la célula productora de VE) y transportarla a la vesícula que luego se libera como una VE. Como se mencionó, la molécula de carga de AN puede expresarse en la misma célula productora de VE que el polipéptido de fusión y/o puede cargarse de forma exógena en una VE una vez que se forma la VE y opcionalmente se purifica. La coexpresión en la célula de producción de VE de la carga de AN es una modalidad muy ventajosa, ya que la producción de VE se realiza en una sola etapa en una sola célula, lo que permite escalar el proceso y simplifica el procesamiento aguas arriba y aguas abajo. La molécula de carga de An (por ejemplo, un ARNm, un ARNhp, un miARN, un ARN circular, un ADN, un oligonucleótido antisentido, etc.) puede expresarse a partir de las mismas construcciones de polinucleótido que el polipéptido de fusión, o también puede expresarse a partir de otra construcción. Ambos métodos tienen ventajas: el uso de una construcción asegura que tanto el polipéptido de fusión como la molécula carga de AN se traduzcan/transcriban juntos, mientras que el uso de más de una construcción permite la expresión diferencial de los dos componentes, por ejemplo, un mayor nivel de expresión de ya sea el polipéptido de fusión o la molécula de carga de AN. En modalidades preferidas, la construcción de polinucleótido a partir de la cual se expresan el polipéptido de fusión y/o la molécula de carga de AN se introduce ventajosamente de manera estable en las células productoras de VE, para permitir una producción consistente, reproducible y de alto rendimiento de las VE cargadas con AN. En una modalidad preferida, las células productoras de VE se transfectan y/o transducen de manera estable con vectores bicistrónicos o multicistrónicos (también conocidos como construcciones o polinucleótidos, etc.) que comprenden el polipéptido de fusión y la molécula de carga de AN. Tal construcción bicistrónica o multicistrónica puede comprender, por ejemplo, elemento(s) IRES o enlaces peptídicos 2A, lo que permite la expresión de (i) el polipéptido de fusión que comprende el dominio de unión a AN y la proteína exosómica, y (ii) la molécula de carga de AN de interés, por ejemplo, un ARNm, un ARNhp, un miARN o cualquier otro tipo de molécula de carga de AN. Además de usar vectores bicistrónicos o multicistrónicos, los promotores múltiples o bidireccionales representan otro método manejable para insertar de manera estable una única construcción que codifica los dos componentes de interés que van a cargarse en las VE de acuerdo con la presente invención. Claramente, en modalidades alternativas, dos o más construcciones (por ejemplo, plásmidos) también pueden transfectarse y/o transducirse en células productoras de VE, aunque el uso de construcciones individuales puede ser ventajoso ya que puede permitir concentraciones equimolares del polipéptido de fusión (y, por lo tanto, el dominio de unión a AN) y la molécula de carga de AN per se. Es importante destacar que las células productoras de VE de la presente invención normalmente se diseñan para sobreexpresar la al menos una construcción de polinucleótido, lo que permite la producción adecuada de la molécula de carga de AN a una concentración adecuada en la célula productora de VE, de esta manera se permite la reversibilidad, unión liberable del dominio de unión a AN a la molécula de AN. La sobreexpresión del polinucleótido(s) es una herramienta importante que permite crear una concentración de molécula de carga de AN relativamente alta en la célula productora de VE, al mismo tiempo que permite la liberación de la molécula de carga de AN en la célula objetivo donde la concentración de la molécula de carga de AN es más baja. Esto es especialmente relevante para las proteínas PUF y Cas.
En una modalidad adicional, las VE según la presente invención pueden comprender al menos una porción de direccionamiento, para permitir la administración dirigida a una célula, tejido, órgano y/o compartimento de interés. La porción de direccionamiento puede estar comprendidas en el propio polipéptido de fusión, lo que es especialmente ventajoso cuando se usa un polipéptido exosómico con un dominio transmembrana para permitir exponer la porción de direccionamiento en la superficie de las VE. Las porciones de direccionamiento pueden ser proteínas, péptidos, fragmentos de cadena sencilla o cualquier otro derivado de anticuerpos, etc. La porción de direccionamiento también puede formar parte de una construcción de polipéptido separada que está comprendida en la VE. Además, los polipéptidos de fusión comprendidos en las VE de la presente invención también pueden comprender varias porciones adicionales para mejorar el suministro bioactivo. Tales porciones y/o dominios pueden incluir los siguientes ejemplos no limitantes de dominios funcionales: (i) dominios de multimerización que dimerizan, trimerizan o multimerizan los polipéptidos de fusión para mejorar la formación y/o cargado de VE, (ii) enlazadores, como se mencionó anteriormente, para evitar impedimentos estéricos y proporcionar flexibilidad, (iii) dominios de liberación, tales como elementos de escisión en cis como inteínas, que tienen actividad de autoescisión que es útil para la liberación de partes particulares del polipéptido de fusión y/o la carga de AN, (iv) dominios de escisión de ARN para una mejor liberación del ARN en las células receptoras, por ejemplo dominios que codifican nucleasas como Cas6, Cas13, (v) dominios de escape endosomal, como HA2, VSVG, GALA, B18, etc., y/o (vi) señales de localización nuclear (NLS).
La presente invención también se refiere a varias modificaciones inventivas de la molécula de carga de AN, que son clave para asegurar una alta eficiencia de cargado, liberación y suministro bioactivo. Por ejemplo, al diseñar la molécula de carga de AN para que sea lineal o circular, se pueden aumentar o disminuir aspectos como la eficiencia y la estabilidad del cargado. Además, al optimizar el diseño de la secuencia, también es posible influir en las estructuras secundarias y terciarias de la carga de AN, lo que puede facilitar aún más el cargado, lo que facilita la fácil accesibilidad del dominio de unión a AN al AN objetivo.
En otra modalidad ventajosa más, la molécula de carga de AN puede comprender porciones adicionales para aumentar la potencia, ya sea al mejorar el cargado, al mejorar la liberación, al aumentar la actividad específica de tejido y/o al aumentar la estabilidad de la molécula de carga de AN. Por ejemplo, la molécula de carga de AN puede comprender uno o más de los siguientes: (i) un sitio para la unión de miARN, en donde tal sitio es opcionalmente específico de tejido y/o tipo celular, para promover la actividad preferencial de células y/o tejidos específicos, (ii) al menos un dominio estabilizador, tal como una cola larga de poliA o más de una cola de poliA (por ejemplo, 2 o 3 o incluso 4 colas de poliA), (iii) al menos una estructura de tallo lazo en la UTR 5' y/o 3', para inhibir la degradación de la nucleasa, (iv) una ARN polimerasa para promover la transcripción de la molécula de carga AN, (v) secuencias de codones optimizados para aumentar la estabilidad del ARNm, (vi) al menos una UTR híbrida en el extremo 5' y/o 3' para aumentar la eficiencia de traducción del ARNm, y/o (vii) ribozima(s).
Como se mencionó anteriormente, las VE típicamente están presentes no como vesículas individuales sino en una pluralidad sustancial de vesículas y, por lo tanto, la presente invención también se refiere a poblaciones de VE. En modalidades ventajosas, el número promedio de moléculas de carga de AN por VE a lo largo de tal población es superior a una (1) molécula de carga de AN por VE, preferentemente superior a 10 moléculas de carga de AN por VE, e aún con mayor preferencia superior a 100 moléculas de carga de AN por VE. Sin embargo, en toda la población también puede haber VE que no comprenden ninguna molécula de carga de AN y, por lo tanto, la presente invención también puede referirse a poblaciones de VE que comprenden en promedio menos de una (1) molécula de carga de AN por VE.
Es importante destacar que la técnica anterior típicamente solo produce el cargado de la carga de ARN en una pequeña fracción de las VE. Por ejemplo, el sistema TAMEL descrito en el documento US14/502,494 no parece permitir un cargado cuantificable en VE y, específicamente, no en exosomas. Esto probablemente indica que el sistema TAMEL da como resultado un cargado porcentual de cero a por debajo de VE individuales. Los inventores del sistema TAMEL informan que el cargado de una molécula de ARN en exosomas se mejora cuando se usa el sistema TAMEL como máximo 7 veces, mientras que la presente invención mejora el cargado productivo, por ejemplo, de ARNm y otras moléculas de carga de AN típicamente al menos 10 veces, preferentemente al menos 25 veces, pero frecuentemente al menos 50 veces, y preferentemente al menos 70 veces, en comparación con (i) VE sin dominio de unión a AN presente en la proteína de fusión y/o sin sitio de unión para el dominio de unión a AN en la molécula de carga de AN, (ii) VE sin la proteína de fusión per se (por ejemplo, como se muestra en la Figura 2), (iii) VE no manipuladas por ingeniería genética que solo se cargan pasivamente con la molécula de carga de AN, y/o (iv) una molécula de AN de control interno dada. Por tanto, la presente invención proporciona una forma de cargado para considerablemente más moléculas de carga de AN en una población determinada de VE y, lo que es más importante, la presente invención también permite el cargado de una proporción significativamente mayor de VE en comparación con la técnica anterior. En una modalidad, la presente invención se refiere a poblaciones de VE en donde al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 50 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos 85 %, al menos el 90 % y/o al menos el 95 % de todos las VE comprenden una molécula de carga de AN en cuestión.
Como se mencionó anteriormente, una diferencia crucial entre la presente invención y el documento US14/502,494 y otros documentos de la técnica anterior se refieren a la distribución inefectiva e importantemente desigual de los polipéptidos de fusión en poblaciones enteras de VE. La proteína MS2 que se usó en el documento US14/502,494, por ejemplo, solo está presente en una pequeña fracción de las VE, lo que da como resultado un cargado de la carga de ARNm que se distribuye de manera desigual en las poblaciones de VE. En cambio, las proteínas de fusión que se usaron en la presente invención se distribuyen uniformemente en poblaciones de VE completas, lo que significa que esencialmente todas y cada una de las VE comprenden al menos un polipéptido de fusión según la presente invención y normalmente al menos una molécula de carga de AN. Por tanto, en una modalidad, la presente invención se refiere a una composición de VE que comprende esencialmente dos subpoblaciones de VE, en donde (i) la primera subpoblación de VE comprende en promedio más de un polipéptido de fusión (que comprende el dominio de unión a AN y el polipéptido exosómico) por VE y (ii) en donde la segunda subpoblación de VE comprende la molécula de carga de AN en cuestión combinada con un promedio de más de un polipéptido de fusión por VE. Por el contrario, el estado de la técnica, por ejemplo, el documento US14/502,494, enseña VE que comprenden muy pocos polipéptidos de fusión por VE, típicamente menos de 1 polipéptido de fusión por 10 VE, lo que claramente implica que el cargado productivo y el suministro de una molécula de carga de AN que depende de dicha proteína de fusión será significativamente menor que en el caso de la presente solicitud. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se supone que la razón por la que la técnica anterior no logró alcanzar un cargado más alto de la proteína de fusión en las VE se debe al hecho de que la MS2 y proteínas no eucariotas similares no se trasladan de manera eficiente a los exosomas y/o que desencadenan toxicidad, dos cuestiones que se tratan en la presente invención.
La presente invención hace uso de polipéptidos de fusión inventivos que comprenden al menos un dominio de unión a AN y al menos un polipéptido exosómico, en donde el al menos un dominio de unión a AN es uno o más de PUF, Cas y/o un dominio de unión a aptámero de AN. En modalidades ventajosas, los polipéptidos de fusión pueden comprender opcionalmente además regiones, dominios, secuencias y/o porciones adicionales que dotan al polipéptido de funciones particulares. Los ejemplos no limitantes de dominios adicionales comprendidos en el polipéptido de fusión incluyen (i) dominios de multimerización, (ii) enlazadores, (iii) dominios de liberación, (iv) dominios de escisión de ARN, (v) porciones de escape endosomal, (vi) sitios de escisión específicos de proteasa, (vii) inteínas y/o (viii) porciones de direccionamiento.
Los dominios de multimerización permiten la dimerización, trimerización o cualquier orden superior de multimerización de los polipéptidos de fusión, lo que aumenta la clasificación y el tráfico de los polipéptidos de fusión en VE y también puede contribuir a aumentar el rendimiento de vesículas producidas por células productoras de VE. Los enlazadores son útiles para proporcionar una mayor flexibilidad a las construcciones de polipéptido de fusión, y también a las correspondientes construcciones de polinucleótido, y también pueden usarse para asegurar que se eviten los impedimentos estéricos y se mantenga la funcionalidad de los polipéptidos de fusión. Los dominios de liberación pueden incluirse en las construcciones de polipéptido de fusión para permitir la liberación de partes o dominios particulares del polipéptido de fusión original. Esto es particularmente ventajoso cuando la liberación de partes del polipéptido de fusión aumentaría el suministro bioactivo de la carga de AN y/o cuando una función particular del polipéptido de fusión funciona mejor cuando forma parte de una construcción más pequeña. Los dominios de liberación adecuados pueden ser secuencias de escisión en cis tales como inteínas, dominios de liberación monoméricos o diméricos inducidos por luz tales como Kaede, KikGR, EosFP, tdEosFP, mEos2, PSmOrange, las proteínas Dendra similares a GFP Dendra y Dendra2, CRY2-CIBN, etc. Los dominios de escisión de AN también pueden incluirse ventajosamente en los polipéptidos de fusión para desencadenar la escisión de la carga de AN. Los ejemplos no limitantes de dominios de escisión de AN incluyen endonucleasas como Cas6, Cas13, nucleasas PUF manipuladas por ingeniería genética, nucleasas de ARN específicas de sitio, etc. Además, los polipéptidos de fusión que se usan en la presente invención también pueden incluir dominios de escape endosomal para promover el escape endosomal y, de esta manera, mejorar el suministro bioactivo de la VE per se y la molécula de carga de AN de VE. Otra estrategia para mejorar el suministro es dirigir las VE a células, tejidos y/u órganos u otros compartimentos corporales. El direccionamiento puede lograrse mediante una variedad de medios, por ejemplo, el uso de péptidos de direccionamiento. Dichos péptidos de direccionamiento pueden tener desde unos pocos aminoácidos de longitud hasta cientos de aminoácidos de longitud, por ejemplo, en cualquier lugar en el intervalo de 3-100 aminoácidos, 3-30 aminoácidos, 5-25 aminoácidos, por ejemplo, 7 aminoácidos, 12 aminoácidos, 20 aminoácidos, etc. Los péptidos de direccionamiento de la presente invención también pueden incluir proteínas de longitud completa tales como receptores, ligandos de receptor, etc. Además, los péptidos de direccionamiento según la presente invención también pueden incluir anticuerpos y derivados de anticuerpos, por ejemplo, anticuerpos monoclonales, fragmentos variables de cadena sencilla (scFv), otros dominios de anticuerpos, etc.
La presente invención también hace uso de construcciones de polinucleótido que codifican los polipéptidos de fusión según la presente invención. Las construcciones de polinucleótido pueden estar presentes en varias formas diferentes y/o en diferentes vectores. Por ejemplo, los polinucleótidos pueden ser esencialmente lineales, circulares y/o tener cualquier estructura secundaria y/o terciaria y/o de orden superior. Los vectores que comprenden los polinucleótidos también son útiles para poner en práctica la invención, por ejemplo, vectores como plásmidos, cualquier polinucleótido de ADN circular, minicírculos, virus como adenovirus, virus adenoasociados, lentivirus, ARNm y/o ARNm modificados.
Las construcciones de polinucleótido que se usan en la presente invención pueden comprender además uno o más sitios o dominios para impartir una funcionalidad particular al polinucleótido. Por ejemplo, la estabilidad de las construcciones de polinucleótido puede mejorarse mediante el uso de dominios estabilizadores, tales como colas de poliA o tallos lazos, y la construcción de polinucleótido también puede controlarse mediante promotores particulares que pueden ser opcionalmente promotores inducibles específicos del tipo celular, enlazadores, etc. La cola de poliA puede insertarse opcionalmente aguas arriba del sitio de corte de Cas6 o Cas13 para dar como resultado la escisión de ARNm que retienen la cola de poliA estabilizadora.
La presente invención se refiere además a métodos in vitro para producir VE. Tales métodos comprenden las etapas de (i) introducir en una célula productora de VE al menos una construcción de polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión que comprende al menos un dominio de unión a AN y al menos un polipéptido exosómico, en donde el al menos un dominio de unión a AN es uno o más de PUF, Cas6, Cas13 y/o un dominio de unión a aptámero de AN, (ii) expresar en la célula productora de VE al menos una construcción de polipéptido codificada por la al menos una construcción de polinucleótido, de esta manera se generan tales VE, y opcionalmente (iii) recoger de la célula productora de VE las VE que se producen, que comprende el polipéptido de interés de la etapa (ii). En determinadas modalidades, se usa una única construcción de polinucleótido mientras que en otras modalidades se emplea más de una construcción de polinucleótido. Sin desear ceñirse a ninguna teoría, se supone que la célula productora de VE en la que se introdujo una construcción de polinucleótido (ya sea de forma transitoria o estable, en dependencia del propósito y el uso de las VE) produce VE (como exosomas) que comprenden la construcción de polipéptido codificada por el polinucleótido. Las VE pueden entonces recogerse opcionalmente, típicamente del medio de cultivo celular, y opcionalmente purificarse adicionalmente antes de darles un uso particular. En modalidades ventajosas, las VE producidas mediante tales métodos comprenden además una molécula de carga de AN, que se carga en las VE con la ayuda de la construcción de polipéptido de fusión. Típicamente, un solo VE comprende varias copias de la molécula de carga de AN, pero un solo VE también puede comprender más de un tipo de molécula de carga del fármaco de AN. Como ejemplo no limitante de VE que comprenden más de un tipo de carga del fármaco de AN, una sola VE (es decir, una población de un solo tipo de VE) puede comprender, por ejemplo, una molécula de carga del fármaco de AN de ARNg y una molécula de carga del fármaco de ARNm.
Las células productoras de VE pueden estar presentes en forma de, por ejemplo, células primarias, líneas celulares o esencialmente cualquier otro tipo de fuente de células in vitro y material celular productor de VE. Se entenderá que los términos "célula fuente de VE" o "célula fuente de VE" o "célula parental" o "fuente de células" o "célula productora de VE" o cualquier otra terminología similar se refieren a cualquier tipo de célula que sea capaz de producir VE en condiciones adecuadas in vitro, por ejemplo, en cultivo en suspensión o en cultivo adherente o en cualquier otro tipo de sistema de cultivo. Las fuentes de células según la presente invención pueden seleccionarse de una amplia gama de células y líneas celulares, por ejemplo, células madre mesenquimales o estromales (obtenibles, por ejemplo, de médula ósea, tejido adiposo, gelatina de Wharton, tejido perinatal, placenta, yemas dentales, cordón umbilical sangre, tejido cutáneo, etc.), fibroblastos, células de amnios y más específicamente células epiteliales de amnios que expresan opcionalmente varios marcadores tempranos, células mieloides supresoras, macrófagos M2 polarizados, adipocitos, células endoteliales, fibroblastos, etc. Las líneas celulares de particular interés incluyen células endoteliales de cordón umbilical humano (HUVEC), células de riñón embrionario humano (HEK), líneas de células endoteliales tal como células endoteliales microvasculares o linfáticas, eritrocitos, progenitores eritroides, condrocitos, MSC de diferente origen, células de amnios, células epiteliales de amnios (AE), cualquier célula obtenida mediante amniocentesis o de la placenta, las vías respiratorias o las células epiteliales alveolares, fibroblastos, células endoteliales, etc. Además, las células inmunes tal como las células B, las células T, las células NK, los macrófagos, los monocitos, las células dendríticas (DC) también están dentro del alcance de la presente invención, y esencialmente cualquier tipo de célula que sea capaz de producir VE también se incluye en la presente descripción. Generalmente, las Ve pueden derivarse esencialmente de cualquier fuente de células, ya sea una fuente celular primaria o una línea celular inmortalizada. Las células fuente de VE pueden ser cualquier tipo de células madre somáticas embrionarias, fetales y adultas, incluidas las células madre pluripotentes inducidas (iPSC) y otras células madre derivadas por cualquier método. Cuando se tratan enfermedades neurológicas, puede contemplarse usar como células fuente, por ejemplo, neuronas primarias, astrocitos, oligodendrocitos, microglía y células progenitoras neurales. La célula fuente puede ser de naturaleza alogénica, autóloga o incluso xenogénica para el paciente a tratar, es decir, las células pueden ser del propio paciente o de un donante no emparentado, compatible o no emparejado. En determinados contextos, las células alogénicas pueden preferirse desde un punto de vista médico, ya que podrían proporcionar efectos inmunomoduladores que pueden no obtenerse a partir de células autólogas de un paciente que padece una determinada indicación. Por ejemplo, en el contexto del tratamiento de la inflamación sistémica, periférica y/o neurológica, las MSC o EA alogénicas pueden preferirse, ya que las VE que se obtienen de dichas células pueden permitir la inmunomodulación mediante, por ejemplo, el cambio fenotípico de macrófagos y/o neutrófilos (de M1 proinflamatorio o fenotipos N1 a fenotipos antiinflamatorios M2 o N2, respectivamente).
Como se mencionó anteriormente, en modalidades preferidas, las células productoras de VE de la presente invención se transfectan y/o transducen de manera estable con al menos una construcción de polinucleótido que codifica (i) el polipéptido de fusión que comprende el dominio de unión a AN y (ii) la molécula de carga de AN. En una modalidad muy preferida, las células productoras de VE se exponen a un protocolo de selección clonal que permite la selección clonal de un clon de una sola célula. Por tanto, en modalidades muy preferidas, la presente invención se refiere a poblaciones clonales unicelulares de células productoras de VE que se transfectan y/o transducen para producir VE que comprenden tanto el polipéptido de fusión como la molécula de carga de AN. Los clones individuales pueden obtenerse mediante el uso de métodos de dilución limitante, clasificación de células individuales y/o aislamiento de células individuales mediante el uso cilindros de clonación.
No forman parte de la presente invención, pero son útiles para comprender la invención, los métodos in vitro para el suministro intracelular de al menos una molécula de carga de ARN. Tales métodos pueden realizarse ventajosamente in vitro y/o ex vivo. Los métodos pueden comprender las etapas de poner en contacto una célula objetivo con al menos una VE según la presente invención, o más comúnmente una población de VE según la presente invención. Además, los métodos para el suministro de moléculas de carga de ARN también pueden comprender introducir en una célula presente en cualquier sistema biológico (tal como un ser humano) un polinucleótido que codifica los polipéptidos de fusión de la presente descripción.
En aspectos adicionales, la presente invención se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden (i) al menos una VE cómo se describe en la presente descripción, y/o (ii) al menos una población de VE cómo se describe en la presente descripción, y un excipiente o portador aceptable farmacéuticamente. Además, la presente invención también se refiere a (i) al menos una VE cómo se describe en la presente descripción, (ii) al menos una población de VE cómo se describe en la presente descripción, y/o la (vi) composición farmacéutica mencionada anteriormente, para su uso en medicina. Más específicamente, la presente invención se refiere al uso en la profilaxis y/o tratamiento y/o la mitigación de una variedad de enfermedades. Los ejemplos no limitantes de enfermedades y afecciones incluyen los siguientes ejemplos no limitantes: Enfermedad de Crohn, colitis ulcerativa, espondilitis anquilosante, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, sarcoidosis, fibrosis pulmonar idiopática, psoriasis, síndrome periódico asociado al receptor del factor de necrosis tumoral (TNF) (TRAPS), deficiencia del antagonista del receptor de interleucina-1 (DIRA), endometriosis, hepatitis autoinmune, esclerodermia, miositis, enfermedad cerebrovascular, lesión aguda de la médula espinal, vasculitis, síndrome de Guillain-Barré, infarto agudo de miocardio, ARDS, sepsis, meningitis, encefalitis, insuficiencia hepática, esteatohepatitis no alcohólica (NASH), enfermedad del hígado graso no alcohólico (NAFLD), insuficiencia renal, insuficiencia cardíaca o cualquier insuficiencia orgánica aguda o crónica y la etiología subyacente asociada, enfermedad de injerto contra huésped, distrofia muscular de Duchenne y otras distrofias musculares, enfermedades de almacenamiento lisosómico como la enfermedad de Gaucher, enfermedad de Fabry, MPS I, II (síndrome de Hunter) y III, enfermedad de Niemann-Pick tipo A, B y C, enfermedad de Pompe, etc., enfermedades neurodegenerativas que incluyen enfermedad de Alzheimer, enfermedad de Parkinson, enfermedad de Huntington y otras enfermedades relacionadas con la repetición de trinucleótidos, demencia, ALS, caquexia inducida por cáncer, anorexia, diabetes mellitus tipo 2 y varios cánceres. Prácticamente todos los tipos de cáncer son objetivos de enfermedad relevantes para la presente invención, por ejemplo, leucemia linfoblástica aguda (ALL), leucemia mieloide aguda, carcinoma adrenocortical, cánceres relacionados con el SIDA, linfoma relacionado con el SIDA, cáncer anal, cáncer de apéndice, astrocitoma, cerebeloso o cerebral, carcinoma de células basales, cáncer de vías biliares, cáncer de vejiga, tumor óseo, glioma del tronco encefálico, cáncer de cerebro, tumor cerebral (astrocitoma cerebeloso, astrocitoma cerebral/glioma maligno, ependimoma, meduloblastoma, tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, glioma de la vía visual e hipotálamo), cáncer de mama, adenomas/carcinoides bronquiales, linfoma de Burkitt, tumor carcinoide (infantil, gastrointestinal), carcinoma de origen primario desconocido, linfoma del sistema nervioso central, astrocitoma cerebeloso/glioma maligno, cáncer de cuello uterino, leucemia linfocítica crónica, leucemia mielógena crónica, mielopriferencia crónica, cáncer de colon, linfoma cutáneo de células T, tumor desmoplásico de células redondas pequeñas, cáncer de endometrio, ependimoma, cáncer de esófago, tumor extracraneal de células germinales, tumor extragonadal de células germinales, cáncer de vías biliares extrahepáticas, cáncer de ojo (melanoma intraocular, retinoblastoma), cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico (estómago), tumor carcinoide gastrointestinal, tumor del estroma gastrointestinal (GIST), tumor de células germinales (extracraneal, extragonadal u ovárico), tumor trofoblástico gestacional, glioma (glioma del tronco encefálico, astrocitoma cerebral, glioma de vía visual e hipotalámico), carcinoide gástrico, leucemia de células pilosas, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de corazón, cáncer hepatocelular (hígado), linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, melanoma intraocular, carcinoma de células de los islotes (páncreas endocrino), sarcoma de Kaposi, cáncer de riñón (cáncer de células renales), cáncer de laringe, leucemias ((leucemia linfoblástica aguda (también llamada linfocítica aguda)), mieloide aguda (también llamada leucemia mielógena aguda), linfocítica crónica (también llamada leucemia linfocítica crónica), mielógena crónica ( también llamada leucemia mieloide crónica), leucemia de células pilosas), cáncer de cavidad, labio y oral, liposarcoma, cáncer de hígado (primario), cáncer de pulmón (células no pequeñas, células pequeñas), linfomas, linfoma relacionado con el SIDA, linfoma de Burkitt, linfoma cutáneo de células T, linfoma de Hodgkin, no Hodgkin, meduloblastoma, carcinoma de células de Merkel, mesotelioma, cáncer de cuello escamoso metastásico con primario oculto, cáncer de boca, síndrome de neoplasia endocrina múltiple, mieloma múltiple/neoplasia de células plasmáticas, enfermedades de micosis fungoide/mieloproliferativa, leucemia mielógena, leucemia mieloide crónica (aguda, crónica), mieloma, cáncer de cavidad nasal y seno paranasal, carcinoma nasofaríngeo, neuroblastoma, cáncer oral, cáncer de orofaringe, osteosarcoma/histiocitoma fibroso maligno de hueso, cáncer de ovario de superficie, tumor epitelial-estromal), tumor de células germinales de ovario, tumor de ovario de bajo potencial maligno, cáncer de páncreas, cáncer de células de los islotes pancreáticos, cáncer de paratiroides, cáncer de pene, cáncer de faringe, feocromocitoma, astrocitoma pineal, germinoma pineal, pineoblastoma y tumores neuroectodérmicos primitivos supratentoriales, adenoma hipofisario, blastoma pleuropulmonar, cáncer de próstata, cáncer de recto, carcinoma de células renales (cáncer de riñón), retinoblastoma, sarcoma (familia de tumores de sarcoma de Ewing, sarcoma de Kaposi, sarcoma de tejidos blandos, sarcoma uterino), síndrome de Sézary, cáncer de piel (no melanoma, melanoma), cáncer de intestino delgado, células escamosas, cáncer de cuello escamoso, cáncer de estómago, tumor neuroectodérmico primitivo supratentorial, cáncer testicular, cáncer de garganta, timoma y carcinoma tímico, cáncer de tiroides, cáncer de células de transición de pelvis renal y uréter, cáncer de uretra, cáncer de útero, sarcoma de útero, cáncer de vagina, cáncer de vulva, macroglobulinemia de Waldenstrom y/o tumor de Wilm.
Las VE según la presente invención pueden suministrarse a un sujeto humano o animal a través de varias vías de administración diferentes, por ejemplo, auricular (ótico), bucal, conjuntival, cutáneo, dental, electroósmosis, endocervical, endosinusial, endotraqueal, enteral, epidural, extraamniótico, extracorpóreo, hemodiálisis, infiltración, intersticial, intraabdominal, intraamniótico, intraarterial, intraarticular, intrabiliar, intrabronquial, intrabursal, intracardíaco, intracartilaginoso, intracaudal, intracavernoso, intracavitario, intracerebral, intraalcisternal, intracorneal, intracoronario (dental), intracoronario, intracorporus cavernosum, intradérmico, intradiscal, intraductal, intraduodenal, intradural, intraepidérmico, intraesofágico, intragástrico, intragingival, intraileal, intralesional, intraluminal, intralinfático, intramedular, intrameníngeo, intraperitérmico, intraperitérmico, intrapleural, intraprostático, intrapulmonar, intrasinal, intraespinal, intrasinovial, intratendinoso, intratesticular, intratecal, intratorácico, intratubular, intratumor, intratimpánico, intrauterino, intravascular, intravenoso, bolo intravenoso, goteo intravenoso, intraventricular, intravesical, intravítreo, iontoforesis, irrigación nasal, nasogástrica, técnica de vendaje oclusivo, oftálmico, oral, orofaríngeo, otro, parenteral, percutáneo, periarticular, peridural, perineural, periodontal, rectal, respiratorio (inhalación), retrobulbar, tejido blando, subaracnoideo, subconjuntival, subcutáneo, sublingual, submucoso, tópico, transdérmico, transmucoso, administración transplacentaria, transtraqueal, transtimpánica, ureteral, uretral y/o vaginal, y/o cualquier combinación de las vías de administración anteriores, que típicamente depende de la enfermedad a tratar y/o de las características de las VE, la molécula de carga de AN en cuestión, o la población de VE como tal.
Ejemplos y sección experimental
Materiales y procedimientos
• Diseño de construcciones y clonación
Se evaluaron varios dominios de unión a AN y variantes de estos (por ejemplo, PUF, PUF mutado, PUFx2, Cas6, Cas6 mutado, Cas13, Cas13 mutado, etc.), en combinación con varios polipéptidos exosómicos (tal como CD81, CD63, CD9, sintenina, sindecano, Alix, CD133, etc.). Los ORF se generaron típicamente mediante síntesis y se clonaron en el vector de expresión de mamífero pSF-CAG-Amp. Brevemente, el ADN sintetizado y el plásmido vector se digirieron con las enzimas Notl y Sall de acuerdo con las instrucciones del fabricante (NEB). Los fragmentos de ADN purificados digeridos con enzimas de restricción se ligaron juntos mediante el uso de ligasa T4 de acuerdo con las instrucciones del fabricante (NEB). Los eventos de ligación exitosos se seleccionaron mediante transformación bacteriana en placas suplementadas con ampicilina. El plásmido para la transfección se generó mediante 'maxi-prep', de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
• Cultivo celular y transfección
En dependencia del diseño experimental y los ensayos, en determinados casos, la transfección transitoria no viral y la producción de VE se llevó a cabo en un cultivo celular 2D convencional, mientras que en otros casos se empleó la transducción a través de virus para crear líneas celulares estables, que típicamente se cultivaron en biorreactores y/o incubadoras con agitación de diferentes tipos. Para mayor brevedad, en la presente descripción solo se mencionan algunos ejemplos.
Las células HEK293T se sembraron típicamente en placas de 15 cm (9x106 células por placa) y se dejó durante la noche en DMEM que contiene suero de acuerdo con las recomendaciones de la ATCC. Al día siguiente, las células se transfectaron de manera transitoria con ADN en complejo lipídico que se añadió directamente a las células. Brevemente, el ADN y la polietilenimina (PEI) se incubaron por separado en OptiMEM durante 5 minutos antes de combinarlos durante 20 minutos a temperatura ambiente. El ADN en complejo lipídico y las células se incubaron conjuntamente durante 6 horas, después de lo cual el medio de cultivo acondicionado se cambió a OptiMEM durante 48 horas. Otras células y líneas celulares que se evaluaron en placas, matraces y otros recipientes de cultivo celular incluyeron células estromales mesenquimales derivadas de la médula ósea (BM-MSC) y MSC derivadas de gelatina de Wharton (WJ-MSC), células de amnios, células epiteliales de amnios, fibroblastos, varias células endoteliales y epiteliales, así como también varias células inmunes y líneas celulares.
En el caso de la transducción viral y la creación de líneas celulares estables para varias combinaciones de construcciones de polipéptido de fusión y moléculas de carga de AN, se usaron fuentes de células como BM-MSC, WJ-MSC, fibroblastos, células epiteliales de amnios, fibroblastos, diversas células endoteliales y epiteliales transducidas mediante virus, típicamente mediante el uso de la transducción con lentivirus (LV). Típicamente, 24 horas antes de la infección, se siembran 100 000 células (por ejemplo, fibroblastos, MSC, etc.) o 200 000 células (por ejemplo, HEK293T) en una placa de 6 pocillos. Se añaden 2 gl de LV y opcionalmente Polybrene (o bromuro de hexadimetrina, concentración final en el pocillo de 8 gg/ml) y 24 horas después de la transducción, el medio celular de las células transducidas se cambia a medio completo fresco. A las 72 horas después de la transducción, se realiza la selección con puromicina (4-6 gg/ml), normalmente durante 7 días, seguido del análisis de la expresión estable de los polipéptidos de fusión.
Las células estables se cultivaron en cultivo 2D o en biorreactores y subsecuentemente se recogió el medio acondicionado para la preparación del exosoma. Se llevaron a cabo varias etapas de preparación y purificación. El flujo de trabajo estándar comprende las etapas de aclarado previo del sobrenadante, concentración basada en filtración, eliminación basada en cromatografía de contaminantes proteicos y formulación opcional de la composición de exosoma resultante en un tampón adecuado para ensayos in vitro y/o in vivo.
• Ensayos y análisis
La transferencia Western es un método analítico muy conveniente para evaluar el enriquecimiento de Pols en VE. Brevemente, se realizó SDS-PAGE de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Invitrogen, geles Novex PAGE de 4-12 %), de manera que se cargaron 1 x 1010 exosomas y 20 |ug de lisado celular por pocillo. Las proteínas del gel de SDS-PAGE se transfirieron a una membrana de PVDF de acuerdo con las instrucciones del fabricante (Immobilon (RTM), Invitrogen). Las membranas se bloquearon en tampón de bloqueo Odyssey (Licor) y se probaron con anticuerpos contra el polipéptido del dominio de unión a AN y/o la proteína exosómica de acuerdo con las instrucciones del proveedor (anticuerpos primarios de Abcam, anticuerpos secundarios de Licor). Sondas moleculares visualizadas a longitudes de onda de 680 y 800 nm.
Para la determinación del tamaño de VE, el análisis de seguimiento de nanopartículas (NTA) se realizó con un instrumento NanoSight (RTM) equipado con software analítico, u ocasionalmente con una máquina Particle Matrics. Para las grabaciones en el NanoSight (RTM), se usó un nivel de cámara de 13 o 15 y una función automática para todos los ajustes posteriores a la adquisición. Con frecuencia se usó microscopía electrónica y microscopía de fluorescencia para validar y evaluar la morfología y el tamaño de las VE.
Las VE se aislaron y purificaron mediante el uso una variedad de métodos, típicamente una combinación de filtración tal como TFF y cromatografía líquida de exclusión por tamaño y/o cromatografía líquida de elución de perlas. Típicamente, el medio que contenía VE se recogió y se sometió a una centrifugación a baja velocidad a 300 g durante 5 minutos, seguido de una centrifugación de 2000 g durante 10 minutos para eliminar las partículas más grandes y los restos celulares. A continuación, el sobrenadante se filtró con un filtro de jeringa de 0,22 |um y se sometió a diferentes etapas de purificación. Se diafiltraron grandes volúmenes y se concentraron hasta aproximadamente 20 ml mediante el uso el dispositivo de flujo tangencial (TFF) Vivaflow 50R (Sartorius) con filtros de corte de 100 kDa o el sistema TFF KR2i (SpectrumLabs) con filtros de fibra hueca de corte de 100 o 300 kDa. El medio preconcentrado se cargó subsecuentemente en las columnas de eluato de perlas (columna HiScreen (RTM) o HiTrap (RTM) Capto Core 700, GE Healthcare Life Sciences), conectadas a un sistema de cromatografía ÁKTAprime (RTM) plus o ÁKTA Pure 25 (RTM) (de GE Healthcare Life Sciences). Los ajustes del régimen de flujo para el equilibrio de la columna, el cargado de la muestra y el procedimiento de limpieza de la columna en el lugar se eligieron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La muestra se recogió de acuerdo con el cromatograma de absorbancia UV y se concentró mediante el uso de un filtro giratorio de corte de peso molecular de 10 kDa Amicon Ultra-15 (Millipore) hasta un volumen final de 100 |ul y se almacenó a -80 °C para más análisis posterior. Para evaluar los perfiles de elución de proteínas y ARN, el medio se concentró y se diafiltró con el sistema KR2i TFF mediante el uso filtros de fibra hueca de 100 kDa y 300 kDa y se analizó una muestra en una columna Tricorn 10/300 Sepharose 4 Fast Flow (S4FF) (GE Healthcare Life Sciences).
• Ejemplos
Ejemplo 1. Las MSC derivadas de la médula ósea se cultivaron en matraces de cultivo de tejidos convencionales y se transfectaron de manera transitoria mediante el uso de transfección con PEI para permitir el cargado y la expresión de las moléculas de carga de ARNm y las construcciones de polipéptido de fusión. La Figura 2 muestra el cargado en VE que se obtuvo a partir de las BM-MSC de moléculas de carga de ARNm que codifican NanoLuc (RTM) y p21. El cargado se logró mediante el uso de construcciones de polipéptido de fusión que comprenden CD63 como polipéptido exosómico y PUF o Cas6 como dominios de unión a AN. El experimento también incluyó un número variable de sitios de unión para los dominios de unión a AN, específicamente, 0, 3 y 6 sitios de unión, que se insertaron en diferentes lugares que flanquean el 3' y/o 5' de la región codificante.
Las MSC-VE se purificaron mediante el uso de una combinación secuencial de TFF y SEC. La expresión de solo el polipéptido exosómico CD63 no dio como resultado el cargado de ningún ARNm en las VE (conjunto de columnas de la derecha en el gráfico en la Figura 2). La expresión de polipéptidos de fusión que comprenden PUF (conjunto de columnas de la izquierda: dos dominios PUF que flanquean a CD63 tanto en el extremo N como en el extremo C, es decir, 4 construcciones de PUF en total) (segundo conjunto de columnas desde la izquierda: un dominio PUF que flanquea a CD63 tanto en el extremo N como en el extremo C) y Cas6 mutado (segundo desde la derecha) dieron como resultado un cargado significativo de ARNm de los ARNm de NanoLuc (RTM) y p21 tras la expresión en las células fuente de VE. El cargado de NanoLuc (RTM) fue en general más eficiente que el cargado de p21, con hasta alrededor de 45 copias de ARNm por VE.
Ejemplo 2. Silenciamiento de la expresión genética in vitro en células objetivo (células HEK293) tras el suministro a través de VE de un ARNhp dirigido a la huntingtina. Las células de amnios cultivadas en una incubadora con agitación se transdujeron mediante el uso de transducción con lentivirus para secretar VE que comprenden los ARNhp y las construcciones de polipéptido de fusión que comprenden PUF o Cas6 como dominio de unión a AN,

Claims (16)

REIVINDICACIONES
1. Una vesícula extracelular (VE) que comprende al menos un polipéptido de fusión que comprende al menos un dominio de unión a ácido nucleico (AN) y al menos un polipéptido exosómico, en donde el al menos un dominio de unión a AN es uno o más de PUF, Cas6, Cas13 y/o un dominio de unión a aptámero de AN.
2. Una VE de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además al menos una molécula de carga de AN.
3. Una VE de acuerdo con la reivindicación 2, en donde la al menos una molécula de carga de AN se:
(a) transporta a la VE con la ayuda del polipéptido de fusión; y/o
(b) se selecciona del grupo que consiste en ARNhp, miARN, ARNm, ARNg, pri-miARN, pre-miARN, ARN circular, ARNpi, ARNt, ARNr, ARNnp, ARNlnc, ribozimas, ADN de minicírculo y/o ADN plasmídico.
4. Una VE de acuerdo con la reivindicación 2 o la reivindicación 3, en donde cada molécula de carga de AN comprende (i) al menos un sitio de unión para el dominio de unión a AN y (ii) un dominio de polinucleótido terapéutico.
5. Una VE de acuerdo con la reivindicación 4, en donde la molécula de carga de AN comprende un sitio de escisión entre el al menos un sitio de unión y el dominio de polinucleótido terapéutico.
6. Una VE de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-5, en donde cada molécula de carga de AN codifica un polipéptido terapéutico.
7. Una VE de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el polipéptido terapéutico se selecciona del grupo que consiste en anticuerpos, intracuerpos, fragmentos variables de cadena sencilla, aficuerpos, enzimas, transportadores, supresores de tumores, inhibidores virales o bacterianos, proteínas de componentes celulares, proteínas de unión a ADN y/o ARN, inhibidores de la reparación del ADN, nucleasas, proteinasas, integrasas, factores de transcripción, factores de crecimiento, inhibidores e inductores de apoptosis, toxinas, proteínas estructurales, factores neurotróficos, transportadores de membrana, proteínas de unión a nucleótidos, proteínas de choque térmico, proteínas asociadas a CRISPR y cualquier de sus combinaciones.
8. Una VE de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido de fusión comprende al menos un polipéptido exosómico flanqueado en el extremo N y/o C por dominios de unión a AN y/o en donde el al menos un dominio de unión a AN se inserta en la secuencia del polipéptido exosómico.
9. Una VE de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el polipéptido exosómico se selecciona del grupo que consiste en CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, AARDC1, sintenina-1, sintenina-2, Lamp2b, TSPAN8, sindecano-1, sindecano-2, sindecano-3, sindecano-4, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, receptores de Fc, receptores de interleucina, inmunoglobulinas, componentes de MHC-I o MHC-II, CD2, CD3 épsilon, CD3 zeta, CD13, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 alfa, Mac-1 beta, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A, VTI1B y cualquiera de sus combinaciones.
10. Una VE de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-9, en donde la molécula de carga de AN:
(a) es lineal, circularizada y/o tiene cualquier estructura secundaria y/o terciaria y/o de otro tipo; y/o (b) comprende uno o más de los siguientes:
(i) un sitio para la unión de miARN;
(ii) al menos un dominio estabilizador seleccionado de una cola poliA o un tallo lazo; o, (iii) al menos una UTR híbrida en el extremo 5' y/o 3'.
11. Una VE de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el sitio para la unión de miARN es específico de tejido y/o tipo celular.
12. Una población de VE de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores.
13. Una población de acuerdo con la reivindicación 12, en donde:
(a) el número promedio de moléculas de carga de AN por VE en toda la población de VE es superior a una por VE;
(b) la población comprende al menos dos subpoblaciones,
en donde la primera subpoblación de VE comprende en promedio más de un polipéptido de fusión por VE, y
en donde la segunda subpoblación de VE comprende la molécula de carga de AN en cuestión combinada con, en promedio, más de un polipéptido de fusión por VE; y/o
(c) al menos el 5 %, al menos el 10 %, al menos el 20 %, al menos el 50 %, al menos el 70 %, al menos el 75 %, al menos el 80 %, al menos el 85 %, al menos el 90 %, y/o al menos el 95 % de todas las VE comprenden al menos una molécula de carga de AN.
14. Un método in vitro para producir VE de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende:
(i) introducir en una célula productora de VE al menos una construcción de polinucleótido que codifica un polipéptido de fusión que comprende al menos un dominio de unión a AN y al menos un polipéptido exosómico, en donde el al menos un dominio de unión a AN es uno o más de PUF, Cas6, Cas13 y/o un dominio de unión a aptámero de AN;
(ii) expresar en la célula productora de VE al menos una construcción de polipéptido codificada por la al menos una construcción de polinucleótido, de esta manera se generan dichas VE.
15. Una composición farmacéutica que comprende (i) al menos una VE de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, y/o (ii) al menos una población de VE de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, y un excipiente o portador aceptable farmacéuticamente.
16. La (i) al menos una VE de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-11, (ii) al menos una población de VE de acuerdo con la reivindicación 12 o la reivindicación 13, y/o (iii) una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 15, para su uso en medicina.
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