CN111629760B - 包含rna治疗剂的外泌体 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及细胞外囊泡(EV)治疗剂，其中所述EV包含基于核酸(NA)的治疗剂，例如m RNA、环状RNA、mi RNA、sh RNA、环状RNA和/或DNA分子。使用本发明的工程化改造蛋白和NA工程策略将NA治疗剂加载到EV中，以增强到EV中的加载并促进NA货物分子在靶细胞内的释放。

Description

包含RNA治疗剂的外泌体
技术领域
本发明涉及细胞外囊泡(EV)治疗剂，其中EV包含内源性加载的RNA治疗剂，例如mRNA、环状RNA、miRNA、shRNA和各种其它RNA治疗剂。
背景技术
基于核酸的治疗剂正迅速进入临床应用。基因疗法、基于mRNA的疗法、基于短寡核苷酸和siRNA的疗法只是RNA疗法领域内众多模式中的一些实例。裸核酸(通常为RNA)由于清除速度快、具有核酸酶活性、缺乏器官特异性分布以及细胞摄取效率低而难以在体内递送，因此通常必须使用专门的递送载体作为实现生物活性递送的手段。对于非肝靶标和高分子量RNA治疗剂(例如mRNA和基因疗法)尤其如此。
细胞外囊泡(例如外泌体)通常是由大多数细胞类型产生的纳米大小的囊泡，并充当人体用于细胞间蛋白质、核酸、肽、脂质和各种其它分子的天然转运系统。含RNA的EV具有多种潜在的治疗用途，并且已经被研究用作基因疗法、mRNA递送和各种环境中短核酸递送的递送载体。WO2010/119256代表使用外泌体的核酸递送领域中的基础发明，并且所述申请教导了外泌体用于递送几种类型的核酸货物的实用性。未公开的申请PCT/GB2017/051479教导了借助于RNA结合蛋白内源性加载各种类型的RNA治疗剂的改进方法，该方法将目标RNA拖到在亲本细胞内形成的EV中。US14/502,494代表另一种利用RNA结合蛋白加载某些RNA种类的方法，即利用所谓的“靶向和模块化外泌体加载(TAMEL)”系统。
然而，尽管取得了这些进步，但是在本领域中仍然存在以特定且高效的方式改进将大和小的RNA货物加载到EV中的巨大空间。此外，任何递送系统的关键方面都在于将生物活性实际递送到靶细胞中，而现有技术在这方面也有改进的空间。
US14/502,494和相应文献参考(Hung和Leonard，《细胞外囊泡杂志》(Journal ofExtracellular Vesicles)2016,5:31027)中描述的TAMEL加载系统具有本发明试图克服的多种缺点。TAMEL系统的主要缺点在于其不能实现mRNA的功能性递送，即当细胞暴露于这些外泌体时，由TAMEL系统加载到外泌体中的mRNA无法被细胞翻译。本申请实现了货物mRNA的生物活性递送。
Tutucci等人(一种改进的精确报告mRNA生命周期的MS2系统(An improved MS2system for accurate reporting of the mRNA life cycle)，《自然方法(NatMethods)》，2018年1月；15(1):81-89)讨论了MS2蛋白用于研究RNA定位和生命周期的用途，并指出TAMEL系统所使用的MS2蛋白质以很高的亲和力结合RNA。本文报告这种紧密结合对于mRNA调节的研究是有问题的。推测在EV加载的情况下，这种高亲和力结合仍然是有问题的，因为MS2的紧密结合意味着加载的任何RNA/核酸都不会被释放。阻止mRNA的释放将会阻止正常的翻译，这可以解释为什么在US14/502,494中没有观察到mRNA的翻译。
TAMEL系统似乎并未向所有外泌体加载核酸，而已加载核酸的外泌体也只加载了非常少量的核酸(这种可变的和低水平的加载的缺点将在下面详细讨论)。这些可变的和低水平的加载结合以下事实，即所加载的核酸非常少，几乎不可能被释放，因此不具有生物活性，这意味着TAMEL系统具有多种缺点。TAMEL系统不适用于临床相关量的生物活性核酸的加载和递送。本发明克服了这些重大的缺点。
TAMEL系统的另一个缺点是它使用噬菌体蛋白质，当所生产的EV递送给患者时，噬菌体蛋白质可能会引起不良的免疫反应。本发明也克服了这种重大的缺点。
发明内容
因此，本发明的目的是克服上述与将基于核酸(NA)的治疗剂加载以及随后EV介导递送到靶细胞中相关的问题，并满足本领域内的现有需求，例如以使所讨论的NA治疗剂到达正确的细胞内区室。
本发明通过利用新的EV工程技术加载和释放NA货物来实现该目的。这是通过多肽和多核苷酸构建体的高级工程化改造来实现的，以确保不仅高效地加载到EV中，而且有效释放所讨论的NA。在第一方面，这通过提供包含至少一个融合多肽的细胞外囊泡(EV)来实现，是至少一个融合多肽包含至少一个核酸(NA)结合结构域和至少一个外泌体多肽，其中至少一个NA结合结构域是Pumilio和FBF同源蛋白质(PUF)、Cas6和/或NA适体结合结构域中的一个或多个、或其任何衍生物和/或结构域和/或类似物。NA结合结构域可有利地以多个拷贝存在，并且每个NA货物分子也可以以多个拷贝存在，其中每个NA货物分子拷贝都具有多个NA结合结构域的结合位点。重要的是，形成融合多肽的一部分并负责与NA货物分子相互作用的NA结合结构域是可释放的NA结合结构域，这意味着其与NA货物分子的结合是可逆的、可释放的相互作用。NA结合结构域和NA货物分子之间的结合的可释放性质是特别有利的，因为本发明人已经认识到，NA货物分子在产EV细胞中的超表达允许足够高的局部浓度以使得NA结合结构域和NA货物分子之间能够相互作用，而NA结合分子在靶位置(例如在靶细胞内部)中的浓度较低，这允许NA分子高效释放，从而实现其生物活性递送。
本发明还涉及本发明的融合多肽构建体本身，以及编码此类多肽的多核苷酸构建体。此外，本发明涉及编码所讨论的多肽构建体的多核苷酸构建体，以及经工程化改造以具有稳定性和增强的效力的NA货物多核苷酸。
在其它方面，本发明涉及包含融合多肽构建体和NA货物分子的EV群体，以及EV、EV群体、多核苷酸和/或多肽构建体、和/或含有上述任何一种生物大分子的细胞和/或其它载体(例如像腺病毒、AAV、慢病毒、HSV、RSV等之类的病毒)的药物组合物。
在另一方面，本发明涉及用于产生根据本发明的EV的方法。此类方法可以包含至少以下步骤：(i)将至少一个合适的多核苷酸构建体引入到产EV细胞中，(ii)在产EV细胞中表达由至少一个多核苷酸构建体编码的至少一个多肽构建体，以及(iii)从产EV细胞中收集包含可经由步骤(ii)获得的多肽的EV。此外，本发明还涉及一种用于细胞内递送至少一个RNA货物分子的体外方法，其中所述方法包括使靶细胞(通常是靶细胞群体)与至少一个EV和/或至少一个EV群体接触。
总之，本发明提供用于EV介导的大量NA治疗剂货物的递送的新的加载和释放策略。有利地，本发明使用在真核生物中都是高度保守的蛋白质，因此当递送给患者时不太可能引起不良的免疫反应。
附图说明
图1：使用根据本发明的融合多肽构建体加载有NA货物分子的EV的示意图。
图2：示出使用融合多肽构建体将编码NanoLuc(RTM)和p21的mRNA货物分子加载到源自MSC的EV中的图形，其中所述融合多肽构建体包含CD63作为外泌体多肽和PUF(在这种情况下，NA结合PUF结构域可从人PUM1蛋白质获得)或Cas6作为NA结合结构域。该实验还包括NA结合结构域的不同数目的结合位点，即0个、3个和6个结合位点。仅外泌体多肽CD63的表达不会导致将任何mRNA加载到EV中(右)。包含PUF的融合多肽的表达(左列：CD63的N端和C端侧接有两个PUF结构域，即总共4个PUF构建体)(左起第二列：CD63的N端和C端都侧接有一个PUF结构域)和突变的Cas6(右起第二列)在EV源细胞中表达时确实导致了NanoLuc(RTM)和p21 mRNA两者的显著mRNA加载。加载NanoLuc(RTM)总体上比加载p21更为有效，每个EV最多可加载约45个mRNA拷贝。
图3：在靶向亨廷顿蛋白(huntingtin)的shRNA的EV介导递送下，靶细胞中的体外基因表达的沉默。将羊膜细胞工程化改造以表达shRNA和融合多肽构建体，所述融合多肽构建体包含PUF(从人PUM蛋白质获得)或Case6作为NA结合结构域，分别与CD63或CD81结合作为EV多肽。从细胞培养物中收集AE-EV，并在体外将其添加到靶细胞中。Y轴示出了亨廷顿蛋白表达水平是如何随着NA货物分子中结合位点数目的增加而降低的，使用包含PUF-CD63-PUF的融合多肽加载抗亨廷顿蛋白shRNA会导致大约80％的敲除。
图4：NanoLuc(RTM)mRN的HEK EV介导递送后，NanoLuc(RTM)作为报告基因在Huh7靶细胞中的表达。将NanoLuc(RTM)mRNA货物分子经工程化改造以包含NA结合结构域的0个、3个或6个结合位点，NA结合结构域包含融合多肽构建体，在这种情况下融合多肽构建体为PUFx2-CD63-PUFx2(外泌体多肽CD63的N端和C端均插接有两个PUF NA结合多肽)、PUF-CD63-PUF和Cas6-CD9-Cas6。Y轴示出相对于微克蛋白质标准化的相对光(发光)单位(RLU)，指示随着结合位点数量的增加，递送和/或翻译增强。在该测定中评价人PUM1以及从果蝇(D.melanogaster)的Pumilio蛋白质获得的NA结合PUF。
图5：SEQ ID No：1至6的序列。
具体实施方式
本发明涉及使用新的工程化改造方法将NA货物以生物活性形式体外和/或体内地引入到或递送到靶细胞中的EV递送的NA治疗剂的改进的加载、受控释放以及增强效力。
为了方便和清楚起见，下文收集并描述了本文采用的某些术语。除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。
当根据马库什(Markush)组来描述本发明的特征、方面、实施例或替代方案时，本领域技术人员将认识到还由此按照马库什组成员的任何单独成员或亚组来描述本发明。本领域技术人员将进一步认识到还由此按照马库什组成员的单独成员或亚组的任何组合来描述本发明。另外，应当注意，结合本发明的方面和/或实施例之一描述的实施例和特征在细节上作必要修改后也适用于本发明的所有其它方面和/或实施例。例如，本文描述的与EV相关的融合多肽应理解为公开的、相关的并且可与本文的所有其它方面、教导和实施例兼容的，例如与用于产生EV的方法或EV的实施例相关的方面和/或实施例，或与本文描述的相应的多核苷酸构建体相关。此外，结合某些方面描述的某些实施例，例如包含融合多肽和任选的NA药物货物分子的EV的给药途径(如涉及与治疗某些医学适应症有关的方面所描述的)，也可以自然地与其它方面和/或实施例相关，例如与药物组合物有关的那些。此外，可使用用于融合多肽的常规策略将本文确定的所有多肽和蛋白质自由地结合在融合蛋白中。作为非限制性实例，本文描述的NA结合结构域(属于多肽来源)可与一种或多种外泌体多肽以任意结合方式自由结合，任选地与本文的所有其它多肽结构域、区域、序列、肽、基团结合，例如任何多聚化结构域、释放结构域和/或靶向肽。同样，外泌体多肽和/或NA结合结构域可以彼此结合以产生包含多于一个外泌体多肽和/或多于一个NA结合域的构建体。此外，任何和所有特征(例如马库什组的任何和所有成员)可以与任何和所有其它特征(例如任何其它马库什组的任何和所有成员)自由结合，例如任何NA结合结构域可与任何外泌体多肽结合。此外，当本文的教导将EV视为单个和/或将EV称为离散的天然纳米颗粒样囊泡时，应当理解的是，所有此类教导均同等地与多个EV和EV群体相关并且适用于它们。作为一般性评论，根据本发明的NA结合结构域、外泌体多肽、产EV细胞来源、另外的结构域和肽、NA货物分子、以及所有其它方面、实施例和替代方案可以在不脱离本发明的范围和主旨的前提下以任何和所有可能的结合方式自由地结合。此外，只要任何给定的分子保留有能够实现与之相关的所希望的技术效果的能力，本发明的任何多肽或多核苷酸或任何多肽或多核苷酸序列(分别为氨基酸序列或核苷酸序列)都可与原始的多肽、多核苷酸和序列有相当大的偏差。只要保持其生物学特性，根据本发明的多肽和/或多核苷酸序列与天然序列的偏差可高达50％(使用例如BLAST或ClustalW计算)，尽管优选尽可能高的序列一致性(例如60％、70％、80％，或例如90％或更高)。例如一些多肽的结合(融合)意味着相应多肽的某些片段可以被替换和/或修饰和/或该序列可以通过插入其它氨基酸序列来中断，这意味着只要保留关键属性(例如，NA结合、转运到EV中、靶向功能等)，与天然序列的偏差可以是相当大的。因此，类似的推论自然适用于编码此类多肽的多核苷酸序列。本文提及的与肽、多肽和蛋白质有关的任何登录号或SEQ ID NO仅应被视为实例并且仅用于提供信息，并且所有肽、多肽和蛋白质应被给予技术人员将会理解它们的普通含义。因此，如上所述，本领域技术人员还将理解，本发明不仅涵盖本文所指的特定SEQ ID NO和/或登录号，而且还涵盖其变体和衍生物。本文所指的所有登录号均为UniProtKB登录号，并且本文所提及的所有蛋白质、多肽、肽、核苷酸和多核苷酸均应根据技术人员所理解的其常规含义来解释。
术语“细胞外囊泡”或“EV”或“外泌体”在本文可互换使用，并且应理解为涉及可从细胞以任何形式获得的任何类型的囊泡，例如微囊泡(例如从细胞的质膜脱落的任何囊泡)、外泌体(例如源自内溶酶体途径的任何囊泡)、凋亡小体(例如可从凋亡细胞获得)、微粒(可源自例如血小板)、核外颗粒体(可源自例如血清中的中性粒细胞和单核细胞)、前列腺小体(例如可从前列腺癌细胞获得)或心脏小体(例如可从心脏细胞获得)等。EV的大小可以相差很大，但是EV通常具有纳米级的流体动力学直径，即直径小于1000nm。显然，EV可以源自体内、离体和体外的任何细胞类型。优选的EV包括外泌体和微囊泡，但是其它EV在各种情况下也可以是有利的。此外，所述术语还应理解为涉及细胞外囊泡模拟物、通过例如膜挤出、超声处理或其它技术等获得的基于细胞膜的囊泡。对于本领域技术人员显而易见的是，当描述EV的医学和科学用途和应用时，本发明通常涉及多个EV，即，可以包含数千个、数百万个、数十亿个或甚至数万亿个EV的EV群体。从下面的实验部分中可以看出，EV可以每单位体积(例如，每毫升)105、108、1010、1011、1012、1013、1014、1015、1018、1025、1030个EV(通常称为“颗粒”)、或更大、或更小或介于两者之间的任何其它数值的浓度存在。同样，术语“群体”可以例如涉及包含外泌体多肽和NA结合结构域之间的某种融合多肽的EV，所述融合多肽进而可结合目标NA货物分子，术语“群体”应理解为涵盖构成该群体的多个实体。换句话说，当多个单个EV存在时，构成EV群体。因此，自然地，本领域技术人员将清楚，本发明既涉及单个的EV，也涉及包含EV的群体。在体内应用时，EV的剂量可以根据待治疗的疾病、给药途径、NA货物分子的治疗活性、效果和效力、EV上存在的任何靶向部分、制剂配方等自然显著地改变。此外，本发明的EV还可以包含除NA货物分子之外的其它治疗剂。在一些实施例中，所述其它治疗剂可以是至少一种治疗性小分子药物。在一些实施例中，所述治疗性小分子药物可以选自由DNA损伤剂、抑制DNA合成的制剂、微管和微管蛋白结合剂、抗代谢物、氧化损伤诱导剂、抗血管产生剂、内分泌治疗剂、抗雌激素、免疫调节剂(例如Toll样受体激动剂或拮抗剂)、组蛋白去乙酰化酶抑制剂、信号转导抑制剂(例如激酶抑制剂)、热休克蛋白抑制剂、类维生素A、生长因子受体抑制剂、抗有丝分裂化合物、抗炎剂、细胞周期调节剂、转录因子抑制剂和凋亡诱导剂及其任意组合组成的组。在其它实施例中，所述其它治疗剂可以是其它基于核酸的治疗剂。此类其它基于核酸的治疗剂可以选自由单链RNA或DNA、双链RNA或DNA、寡核苷酸(例如siRNA)、剪接转换RNA(splice-switching RNA)、CRISPR引导链、短发夹RNA(shRNA)、miRNA、反义寡核苷酸、多核苷酸(例如mRNA)、质粒或任何其它RNA或DNA载体组成的组。特别受关注的是化学合成和/或包含化学修饰的核苷酸(例如2'-O-Me、2'-O-烯丙基、2'-O-MOE、2'-F、2'-CE、2'-EA 2'-FANA、LNA、CLNA、ENA、PNA、硫代磷酸酯、三环DNA(tricyclo-DNA)等)的基于核酸的制剂。在另一些实施例中，根据本发明的EV可以包含可以是蛋白质和/或肽的其它治疗剂。此类蛋白质和/或肽可以存在于EV内部、插入到EV膜中或与EV膜结合，或者可以从EV突出到囊泡外环境中。此类治疗性蛋白质和/或肽制剂可以选自一组非限制性实例，包括：抗体、胞内抗体、单链可变片段(scFv)、亲和体、双特异性和多特异性抗体或结合剂、亲和体、重复蛋白(darpins)、受体、配体、用于例如酶替代疗法或基因编辑的酶、肿瘤抑制因子(非限制性实例包括p53、p21、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7和/或ST15)病毒或细菌抑制剂、细胞成分蛋白、DNA和/或RNA结合蛋白、DNA修复抑制剂、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、凋亡抑制剂和诱导剂、毒素(例如假单胞菌外毒素)、结构蛋白、神经营养因子(例如NT3/4)、脑源性神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)及其各个亚基(例如2.5Sβ亚基)、离子通道、膜转运蛋白、蛋白稳态因子、与细胞信号传导有关的蛋白、翻译和转录相关蛋白、核苷酸结合蛋白、蛋白结合蛋白、脂质结合蛋白、糖胺聚糖(GAG)和GAG结合蛋白、代谢蛋白、细胞应激调节蛋白、炎症和免疫系统调节蛋白、线粒体蛋白和热休克蛋白等。
术语“外泌体多肽”、“外泌体蛋白”、“外泌体载体蛋白”、“EV蛋白”和“EV多肽”在在本文中可互换使用，并且应理解为涉及能用于将多肽构建体(除外泌体多肽之外，其通常还包含NA结合结构域，例如包含NA结合域的多肽)转运到合适的囊泡结构(即到合适的EV)的任何多肽。更具体地说，这些术语应理解为包含能够将融合蛋白构建体转运、运输或穿梭到囊泡结构(例如EV)的任何多肽。此类外泌体多肽的实例为例如CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71(也称为运铁蛋白受体)及其内体分选结构域(即运铁蛋白受体内体分选结构域)CD133、CD138(syndecan-1)、CD235a、ALIX、AARDC1、Syntenin-1、Syntenin-2、Lamp2b、syndecan-2、syndecan-3、syndecan-4、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61，CD104、Fc受体、白介素受体(例如TNFR和gp130)、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II成分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、TSG101、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其它外泌体多肽及其任何组合或衍生物，但是还有多种能够将多肽构建体转运到EV的其它多肽包含在本发明的范围内。在本发明的一些实施例中，至少一个外泌体多肽融合到NA结合域，以形成存在于EV中的融合蛋白以协助NA货物分子的加载。此类融合蛋白还可以包含各种其它成分以优化其功能，包括连接肽、跨膜结构域、胞质结构域、多聚化结构域等。
术语“NA结合结构域”或“NA结合多肽”或“NA结合蛋白”在本文中可互换使用，并且涉及能够结合一段核苷酸的任何结构域。NA结合结构域可以结合RNA、DNA、RNA和DNA的混合体、特定类型的NA(例如shRNA、miRNA、mRNA、gRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、环状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、lncRNA、核酶、微环DNA(mini-circle DNA)、质粒DNA等。此外，NA结合结构域还可以结合化学修饰的核苷酸，例如2'-O-Me、2'-O-烯丙基、2'-O-MOE、2'-F、2'-CE、2'-EA2'-FANA、LNA、CLNA、ENA、PNA、硫代磷酸酯、三环DNA等。此外，NA结合结构域还可以结合NA的特定序列、结构域(例如重复序列)或NA基序(例如茎环或发夹)。NA结合结构域的此类结合位点可以天然存在于目标NA货物分子中和/或可以经工程化改造到NA货物分子中以进一步增强EV加载和生物活性递送。NA结合结构域对核酸的结合亲和力使得核酸以足够高的亲和力结合以穿梭到外泌体中，但是结合的亲和力没有高到阻止核酸随后释放到靶细胞中，使得核酸一旦被递送到靶细胞就具有生物活性。因此，与现有技术相比，重要且完全相反的是，本发明的EV借助于可释放的NA结合结构域加载NA货物分子，其中所述NA结合结构域与外泌体多肽共同形成融合多肽的一部分。选择本发明的NA结合结构域以实现NA结合结构域和NA货物分子之间的可编程、可修饰亲和力，从而能够产生包含融合多肽的EV，融合多肽包含NA结合结构域和至少一个NA货物分子，其中融合多肽构建体的NA结合结构域以可编程、可逆、可修饰的方式与NA货物分子相互作用，从而既可将NA货物分子加载到EV中，又可在EV中释放NA货物分子和/或在靶细胞中或与靶细胞结合。这与现有技术完全相反，现有技术仅允许使用MS2蛋白将mRNA分子加载到外泌体中，但是其中MS2蛋白仍然与mRNA结合，从而抑制其释放和随后的翻译。
本发明主要涉及三组NA结合结构域，即PUF蛋白、CRISPR相关多肽(Cas)(特别是Cas6和Cas13)、以及各种类型的NA结合适体。本发明使用术语PUF蛋白以涵盖所有相关蛋白和此类蛋白的结构域(也可以称为PUM蛋白)，例如人Pumilio同系物1(PUM1)、PUMx2或PUFx2(它们是PUM1的拷贝)等、或可从任何PUF(PUM)蛋白获得的任何NA结合结构域。PUF蛋白的典型特征在于存在8个连续的PUF重复序列，每个重复序列约40个氨基酸，通常侧接有两个相关序列Csp1和Csp2。每个重复序列都有包含芳香族残基和碱性残基的“核心共有序列”。RNA结合需要整个PUF重复序列簇。显著地，该同一区域还与蛋白质共调节剂相互作用，并且在很大程度上充分弥补了PUF蛋白突变体的缺陷，这使得PUF蛋白高度适合于本发明中使用的突变。此外，PUF蛋白是高度优选的可释放NA结合结构域的实例，其以合适的亲和力结合NA货物分子，从而使得PUF蛋白可释放地、可逆地附着到NA货物。PUF蛋白存在于大多数真核生物中，参与胚胎发生和发育。PUF具有一个结合RNA的结构域，该结构域由8个通常包含36个氨基酸的重复序列组成，这是本专利申请中通常用于RNA结合的结构域。每个重复序列都结合一个特定的核苷酸，通常是位置12和16处的氨基酸通过与氨基酸13的堆积相互作用赋予特异性。天然存在的PUF可以结合核苷酸腺苷、尿嘧啶和鸟苷，工程化改造的PUF还可以结合核苷酸胞嘧啶。因此，该系统是模块化的，并且可以通过转换重复结构域的结合特异性来改变PUF结构域所结合的8个核苷酸序列。因此，根据本发明的PUF蛋白可以是天然的或经工程化改造以结合RNA分子中的任何位置，或另一种处理方式是可以选择对不同序列具有不同结合亲和力的PUF蛋白并工程化改造RNA分子以包含所述序列。此外，存在以序列特异性方式结合16-核苷酸的工程化改造的和/或复制的PUF结构域，该序列特异性方式还可以用于进一步增加NA货物分子的特异性。因此，可以修饰PUF结构域以结合具有不同亲和力和序列长度的任何序列，这使得该系统高度模块化并且适用于根据本发明的任何RNA货物分子。可以用作根据本发明的NA结合结构域的PUF蛋白及其区域和衍生物包括以下PUF蛋白的非限制性列表：FBF、FBF/PUF-8/PUF-6,-7,-10，均来自蠕虫线虫(C.elegans)；来自果蝇的Pumilio；Puf5p/Mpt5p/Uth4p、Puf4p/Ygl014wp/Ygl023p、Puf5p/Mpt5p/Uth4p、Puf5p/Mpt5p/Uth4p、Puf3p，均来自酿酒酵母(S.cerevisiae)；来自盘基网柄菌(Dictyostelium)的PufA；人PUM1(Pumilio 1，有时也称为PUF-8R)及其任何结构域、包含来自至少两个PUM1的NA结合结构域的多肽、任何截短的或修饰的或工程化改造的PUF蛋白，例如PUF-6R、PUF-9R、PUF-10R、PUF-12R和PUF-16R或其衍生物；以及来自爪蟾(Xenopus)的X-Puf1。特别合适的根据本发明的NA结合PUF包括以下：PUF 531(作为SEQ ID NO 1所示的非限制性实例)、PUF mRNA loc(有时称为工程化改造PUF(PUFengineered)或PUFeng)(作为SEQ ID NO 2所示的非限制性实例)和/或PUFx2(作为SEQ ID NO 3所示的非限制性实例)及其任何衍生物、结构域和/或区域。PUF/PUM蛋白是高度有利的，因为它们可以选自人类来源。SEQ ID No:1至3的序列在图5中描述。
人类来源的蛋白质而不是噬菌体来源的蛋白质(例如US14/502,494中使用的MS2蛋白)是有益的，因为它们不太可能引起不良的免疫反应。此外，MS2与噬菌体来源的茎环相互作用，与PUF蛋白不同，这意味着需要将原核NA序列和基序引入到所选的NA分子中。显然，这种插入噬菌体来源和结构的茎环结构可能会干扰mRNA的翻译，从而导致无功能的mRNA货物分子，甚至触发免疫毒性。
因此，在有利的实施例中，本发明涉及融合到外泌体蛋白的真核NA结合蛋白。在优选的实施例中，NA结合结构域来自PUF蛋白家族，例如PUF531、工程化改造PUF和/或PUFx2。重要的是，PUF蛋白优选地用于mRNA或shRNA的EV介导递送，由于PUF蛋白的序列特异性，可以高度控制和特异化NA药物货物的加载。在优选的实施例中，PUF蛋白有利地与跨膜蛋白或可溶性外泌体蛋白结合。有利的融合蛋白构建体包括以下非限制性实例：CD63-PUF531、CD63-PUFx2、工程化改造CD63-PUF、CD81-PUF531、CD81-PUFx2、工程化改造CD81-PUF、CD9-PUF531、CD9-PUx2、工程化改造CD9-PUF以及其它基于跨膜蛋白的融合蛋白，优选基于融合到一个、两个或更多个PUF蛋白的四次跨膜外泌体蛋白。包含PUF蛋白和至少一种可溶性外泌体蛋白的有利融合蛋白包括以下非限制性实例：syntenin-PUF531、syntenin-PUx2、工程化改造syntenin-PUF、syndecan-PUF531、syndecan-PUx2、工程化改造syndecan-PUF、Alix-PUF531、Alix-PUx2、工程化改造Alix-PUF、以及融合到PUF蛋白的任何其它可溶性外泌体蛋白。
PUF蛋白对目标NA货物分子具有可修饰的序列特异性这一事实使它们成为融合到外泌体多肽配偶体的理想NA结合结构域。因此，在本发明的优选实施例中，使用可释放的NA结合结构域(作为具有外泌体蛋白的融合蛋白的一部分)将NA货物分子加载到EV中，其中NA结合结构域与NA货物分子之间的相互作用是有利地基于对靶核苷酸序列的特异性而不是基于靶核苷酸二级结构(因为二级结构不能实现序列特异性)。在优选的实施例中，NA货物分子经工程化改造包含和/或天然包含选择为NA结合结构域的PUF蛋白的目标核苷酸序列。此类靶核苷酸序列可以如上所述，例如是mRNA的3'UTR的一部分，或者可以被引入到任何NA货物分子中，例如mRNA、shRNA、miRNA、lncRNA、DNA等，从而允许PUF蛋白结合NA货物分子。NA货物分子上的PUF结合位点通常比由大多其它RNA结合蛋白结合的序列长，例如MS2仅结合识别4个核苷酸和茎环，因此在目标结合位点上优选的核苷酸片段可以是例如5个核苷酸(nt)、6nt、7nt、8nt、9nt、10nt、11nt、12nt、13nt、14nt、15nt、16nt、17nt、18nt、19nt、甚至20nt或更长，取决于NA结合结构域的可修饰序列特异性的需要。在优选的实施例中，PUF蛋白对长度为6nt、8nt、9nt、10nt、12nt或16nt的天然存在和/或人工形成的NA货物分子结合位点具有特异性。
CRISPR相关多肽(Cas)代表另一组NA结合结构域，尤其可以包括Cas6(作为SEQ IDNO 4所示的非限制性实例，其序列如图5所示)和Cas13以及任何其它RNA结合Cas分子。Cas6以高亲和力结合前体CRISPR RNA(crRNA)，并对其进行处理，以供以后整合到例如Cas9中。RNA分子的切割速率可以被调节和高度定义，因此RNA分子与Cas6之间的结合时间也可以以非常准确的方式定义，这对于本发明的目的是重要的。可以使用已经突变以提高或降低RNA切割效率的Cas6或Cas13的突变版本。可以使用已经突变以提高或降低RNA结合亲和力的Cas6或Cas13的突变版本。例如，当RNA货物分子要在受体细胞中释放时，这将是一个优势。然后可以调节所定义的结合时间，以在囊泡内释放RNA分子，而不在生产细胞内释放。Cas6能够识别的RNA序列可以经工程化改造以将其插入到目标NA分子中。Cas13可以经工程化改造以仅结合其定义的RNA靶，而不会降解它。通过改变sgRNA分子的序列，可以调节Cas13-sgRNA复合体以结合20-30个核苷酸之间的任何RNA序列。例如，使用来自Cas蛋白的NA结合结构域对于短RNA(例如shRNA或miRNA)的递送特别有利，在这种情况下，所选Cas多肽的切割活性可以用于释放来自例如与Cas6结合的结合位点的例如shRNA货物分子。此外，如PUF蛋白的情况一样，Cas蛋白是高度优选的可释放NA结合结构域的实例，其以合适的亲和力结合NA货物分子，从而使得Cas蛋白可释放地、可逆地附着到NA货物。与基于PUF的NA结合结构域一样，Cas蛋白代表可释放的、不可逆的NA结合结构域，对目标NA货物分子具有可编程的、可修饰的序列特异性，能够以较低的总亲和力实现更高的特异性，从而允许将NA货物加载到EV中并且在目标位置释放NA货物。
NA适体结合结构域是另一组根据本发明的NA结合结构域。此类NA适体结合结构域是可以被基于NA的适体特异性结合的结构域、区域、氨基酸片段或整个多肽或蛋白质。适体是形成二级和/或三级结构以识别分子的RNA序列，类似于抗体对其靶抗原的亲和力。因此，这些RNA分子可以以高亲和力识别特定的氨基酸序列。在本发明中，通过将特定的核苷酸序列插入到NA分子中以识别特定的氨基酸序列来应用RNA适体。此类氨基酸序列可以经工程化改造到外泌体载体多肽中和/或附近，以使适体(其经工程化改造到NA货物分子中和/或附近)能够与其结合，从而借助于外泌体多肽将NA货物分子穿梭到EV中。具有合适特征的两个适体是：对一段组氨酸(His)氨基酸具有高度亲和力的His适体(作为SEQ ID NO 5所示的非限制性实例)和针对HIV Tat结构域的适体(作为SEQ ID NO 6所示的非限制性实例)。适体序列优选插入到mRNA的3'和/或5'非翻译区域或非编码RNA的非特异性区域。还可以将两个或更多个适体结合到一个NA货物分子中，以增强对外泌体载体蛋白的特异性和亲和力。SEQ ID No 5和6的序列在图5中描述。重要的是，本发明的所有NA结合结构域都提供可编程的、序列特异的、可逆的、可释放的与NA货物分子(例如mRNA、shRNA或miRNA)的结合，这与现有技术中发现的与RNA的高亲和力的、不可逆的结合完全相反。在本发明的优选实施例中，NA结合结构域是PUF蛋白或Cas蛋白，因为它们具有可易于编程的性质和序列特异性并且它们与NA货物分子的结合是可逆的、可释放的。重要的是，作为NA结合结构域的Cas蛋白和PUF蛋白的序列特异性优选基于与目标NA分子上的至少6nt(优选至少8nt)的相互作用，当与低亲和力相互作用结合时，可以实现NA货物分子的高效的EV介导递送。NA货物分子上的至少6nt结合位点优选以连续的核苷酸序列存在。因此，NA货物分子的结合位点的长度优选对应于两个密码子。
在第一方面，本发明涉及包含至少一个融合多肽的细胞外囊泡(EV)，所述至少一个融合多肽包含至少一个核酸(NA)结合结构域和至少一个外泌体多肽，其中所述至少一个NA结合结构域可以是PUF、CRISPR相关(Cas)多肽和/或NA适体结合结构域中的一个或多个。由于NA结合结构域的存在，EV通常进一步包含至少一个NA货物分子。通常，每个EV中包含的NA货物分子的数量相当可观，这是对通常实现非常低的加载效率的现有技术的明显改进。在本发明的情况下，融合多肽构建体的发明性设计是指将至少一个NA货物分子非常有效地转运到EV中(借助于融合多肽)，随后是显著改进的释放过程。NA结合结构域(其包含在融合多肽中)和NA货物分子之间的结合的可释放性质是本发明的关键方面，因为它允许在产EV细胞中结合NA货物分子(其中NA货物分子通常过表达)，同时能够在靶细胞内和/或附近递送生物活性NA分子。
因此，与现有技术不同，NA结合结构域和NA货物分子之间的可编程的、较低亲和力的相互作用使得本发明能够有效地将EV加载在产EV细胞中，同时还能够在合适的位置释放NA货物(通常在靶细胞内部)，其中NA货物分子和NA结合结构域之间的相互作用的较低亲和力和可释放性是高度有利的。此外，与现有技术仅公开MS2作为与4nt和茎环结合的高亲和力RNA结合蛋白不同，本发明允许序列特异性低亲和力或中等亲和力与更长的核苷酸片段结合，从而更具体的，例如长度为6nt或8nt。
更长的结合位点长度使得能够引入一系列不同的突变，这些突变产生具有一系列修饰的结合亲和力的结合位点，从而产生上述可编程的较低亲和力相互作用。例如，将单点突变引入到6或8个核苷酸区域中会微妙地修饰结合亲和力，然而，已知即使是MS2的较短的4个核苷酸结合区域中的单个突变也会显著影响MS2对RNA的结合亲和力。更长的核酸长度提供更大的范围以引入一种或多种影响蛋白质对核酸的结合亲和力的突变。类似地，需要更长的核苷酸片段以待结合，导致更多的氨基酸，这些氨基酸能够与更长的核苷酸序列相互作用，从而提供更多的可能性，使这些相互作用的氨基酸发生突变，并再次产生更大范围的可能蛋白突变体，它们具有各种结合亲和力。PUF、Cas6和Cas13都具有更长的核苷酸结合位点和更大的蛋白质结合位点，其优势在于：相比通过突变MS2蛋白或MS2 RNA序列，通过突变PUF、Cas6和Cas13可以实现更大范围的亲和力。因此，如果需要改善核酸货物的释放，则这种更长的序列提供更大的可能性以工程化改造核酸和/或结合蛋白来特异地调节对单个目标货物的结合亲和力。如上所述，控制与核苷酸货物结合的亲和力从而修饰和控制核苷酸货物的可释放性的能力是本发明相对于现有技术的显著优点，其导致生物活性核酸的递送和释放。
在一个实施例中，NA货物分子可以选自由shRNA、miRNA、mRNA、gRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、环状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、lncRNA、核酶、小环DNA、质粒DNA组成的组，但是基本上任何类型的NA分子均可包含在根据本发明的EV中。单链和双链NA分子均在本发明的范围内，并且NA分子可以是天然存在的(例如RNA或DNA)，或者可以是化学合成的RNA和/或DNA分子，其可包含化学修饰的核苷酸，例如2'-O-Me、2'-O-烯丙基、2-O-MOE、2'-F、2'-CE、2'-EA 2'-FANA、LNA、CLNA、ENA、PNA、硫代磷酸酯、三环DNA等。重要的是，尽管本发明高度适合于内源性加载NA货物分子(例如，mRNA、环状RNA、shRNA等)，它也适用于加载外源性NA分子，这些外源性NA分子可通过将产EV细胞暴露于所讨论的NA分子中和/或通过与EV自身共同孵育或配制来加载。
在具体的实施例中，NA结合结构域是Cas6或Cas13，并且NA货物分子是shRNA。Cas6/Cas13与shRNA货物的结合是有利的，因为Cas6/Cas13的先天活性将导致shRNA从与Cas6或Cas13结合的NA结合域切割，从而从融合蛋白和NA结合结构域之间的复合体释放shRNA。此外，由于shRNA一旦释放到细胞质中，不需要任何帽或聚A尾就能发挥作用，因此被切割的shRNA可以立即沉默高活性的基因。
在本发明的实施例中，根据本发明的NA货物分子包含(i)融合多肽的NA结合结构域的至少一个结合位点和(ii)治疗性多核苷酸结构域。在优选实施例中，NA货物分子包含至少两个结合位点，甚至更优选更高数目的结合位点，例如3、4、5、6、7、8、9、10、15或甚至更大的数目。发明人已经认识到，包括4-8个结合位点可将NA货物分子最优地加载到EV中且不会对货物的释放和生物活性递送产生不利影响。可以将NA结合结构域的结合位点遗传工程化改造到3'和/或5'UTR中和/或旁侧和/或通过序列优化将其放置在NA货物分子的编码区域中。
根据本发明的NA货物分子可以有利地包含位于至少一个结合位点和治疗性多核苷酸结构域之间的至少一个切割位点，以便能够释放NA货物分子的治疗性部分。
通常，NA货物分子旨在执行一系列功能，例如编码目标蛋白质(例如具有治疗活性的蛋白质)、经由与靶的反义相互作用使目标核苷酸序列沉默、转换和/或阻断剪接、介导靶核苷酸序列的切割，例如经由RNase H介导的切割或RISC复合体介导的RNA干扰(RNAi)。在特定目标的实施例中，NA货物分子可以执行多于一种功能，例如它可以编码目标蛋白质并包含可以具有例如引导功能的NA序列。这方面特别有利的实例是编码CRISPR相关蛋白(例如Cas，Cas9(在如SEQ ID NO:7所示的具有登录号Q99ZW2的非限制性实例Cas9中)和/或Cas6)并包含用于将CRISPR相关蛋白引导到靶序列以进行基因编辑的引导链和/或用于例如同源性定向修复的校正DNA链的NA分子。在此类实施例中，特别有利的是：在NA分子中包括切割位点，使得能够释放由NA货物分子编码的蛋白质和NA货物分子中包含的引导链中的一者或两者。
可以由NA货物分子编码的蛋白质的非限制性实例包括如下：抗体、胞内抗体、单链可变片段、亲和体、酶、转运蛋白、肿瘤抑制因子(非限制性示例包括p53、p21、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7和/或ST15)、病毒或细菌抑制剂、细胞成分蛋白、DNA和/或RNA结合蛋白、DNA修复抑制剂、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、凋亡抑制剂和诱导剂、毒素、结构蛋白、神经营养因子、膜转运蛋白、核苷酸结合蛋白、热休克蛋白、CRISPR相关蛋白、细胞因子、细胞因子受体、胱天蛋白酶及其任何组合和/或衍生物。
NA货物分子和融合多肽构建体两者的设计是加载、释放和生物活性递送的关键，例如进入靶细胞和/或进入特定器官、组织和身体区室。发明人已经发现特别有利的实施例是包含融合多肽的EV，所述融合多肽包含在一侧或两侧上侧接有至少一个NA结合结构域(即，在一侧或每侧上的至少一个NA结合结构域)的至少一个外泌体多肽。可选地，NA结合结构域可以在各种情况下通过在至少一个位置(例如在例如CD63的外囊泡环(extravesicular loop)上)插入到外泌体多肽中，例如当期望在EV外部显示NA结合结构域来增强外源性加载时。可以立刻在C端和/或N端侧接外泌体多肽，但最有利的设计是在外泌体多肽和NA结合结构域之间包含连接肽，以提供间隔和灵活性来维持外泌体多肽和NA结合结构域两者的活性。此类连接肽可以有利地是含有特定数目重复序列的甘氨酸-丝氨酸(GS)连接肽。发明人已经认识到1-4个重复序列是最有利的，其提供足够的灵活性且不会使融合多肽结构过于非结构化，但是更长的连接肽和非基于GS的连接肽也在本发明的范围内。如上所述，对于涉及NA货物分子的外源性加载的应用，EV优选包含融合多肽，所述融合多肽包含与在其N端和/或C端和/或在外泌体多肽的任何外囊泡区域(即存在于EV外部)的至少一个NA结合结构域融合的至少一个外泌体多肽，以便将NA结合结构域暴露在外泌体表面上。
融合多肽构建体的外泌体多肽成分的设计和选择对于确保高效EV形成、将NA加载到EV中以及释放NA货物分子至关重要。外泌体蛋白可以选自以下非限制性实例：CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、AARDC1、Syntenin-1、Syntenin-2、Lamp2b、TSPAN8、syndecan-1、syndecan-2、syndecan-3、syndecan-4、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、TNFR、gp130、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II成分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其它外泌体多肽及其任何组合。
如上所述，根据本发明的EV借助于融合多肽加载有NA货物分子。在不希望受到任何理论约束的情况下，可以推测，加载与产EV细胞内EV的形成有关，或是外源性地通过将NA货物分子与工程化改造的EV一起孵育而发生的。融合多肽通常可以结合NA货物分子(例如在产EV细胞中共表达的mRNA分子)，并将其转运到囊泡中，然后作为EV释放。如前所述，NA货物分子可以在与融合多肽相同的产EV细胞中表达，和/或一旦形成EV并任选地纯化后就可以将其外源性地加载到EV中。NA货物在产EV细胞中的共表达是高度有利的实施例，因为EV的产生是在单个细胞中以单个步骤完成的，这可以缩放过程并简化上游和下游处理。NA货物分子(例如mRNA、shRNA、miRNA、环状RNA、DNA、反义寡核苷酸等)可以从与融合多肽相同的多核苷酸构建体来表达，也可以从另一个构建体来表达。两种方法均具有优势：使用一种构建体确保融合多肽和NA货物分子两者一起被翻译/转录，而使用多于一个构建体则使得两种成分的差异表达成为可能，例如融合多肽或NA货物分子的较高表达水平。在优选的实施例中，从其表达融合多肽和/或NA货物分子的多核苷酸构建体被有利地稳定地引入到产EV细胞中，以使得能够一致地、可再生地和高产量地产生加载有NA的EV。在优选的实施例中，使用包含融合多肽和NA货物分子的双顺反子或多顺反子载体(也称为构建体或多核苷酸等)稳定地转染和/或转导产EV细胞。此类双顺反子或多顺反子构建体可以包含例如IRES元件或2A肽键，允许表达：(i)包含NA结合结构域和外泌体蛋白的融合多肽，以及(ii)目标NA货物分子，例如mRNA、shRNA、miRNA或任何其它类型的NA货物分子。除了使用双顺反子或多顺反子载体之外，多个或双向启动子代表另一种易处理的方法，其用于稳定地插入单个构建体，所述构建体编码将要加载到根据本发明的EV中的两个目标组分。显然，在替代的实施例中，也可以将两种或更多种构建体(例如质粒)转染和/或转导到产EV细胞中，尽管使用单一构建体可能是有利的，因为它可以使融合多肽(从而使NA结合结构域)和NA货物分子保持等摩尔浓度。重要的是，通常将本发明的产EV细胞设计为过表达至少一种多核苷酸构建体，这允许在产EV细胞中以合适的浓度适当地产生NA货物分子，从而允许NA结合结构域可逆地、可释放地附着到NA分子。多核苷酸的过表达是重要的工具，其允许在产EV细胞中产生相对较高的NA货物分子浓度，同时允许在NA货物分子浓度较低的靶细胞中释放NA货物分子。这与PUF和Gas蛋白尤其相关。
在进一步的实施例中，根据本发明的EV可以包含至少一个靶向部分，以能够靶向递送到目标细胞、目标组织、目标器官和/或目标区室。靶向部分可以包含在融合多肽本身中，当使用具有跨膜结构域的外泌体多肽使靶向部分能够在EV的表面上显示时，这是特别有利的。靶向部分可以是蛋白质、肽、单链片段或抗体的任何其它衍生物等。靶向部分还可以形成包含在EV中的单独多肽构建体的一部分。此外，本发明的EV中包含的融合多肽还可以包含各种另外的部分以增强生物活性递送。此类部分和/或结构域可以包括功能结构域的以下非限制性实例：(i)多聚化结构域，其使融合多肽二聚、三聚或多聚化以改善EV形成和/或加载，(ii)连接肽，如上所述的，其用以避免空间位阻并提供灵活性，(iii)释放结构域，例如具有自我切割活性的顺式切割元件(如内含肽)，其可用于释放融合多肽和/或NA货物的特定部分，(iv)RNA切割结构域，其用于改善RNA在受体细胞中的释放，例如编码核酸酶的结构域，例如Cas6、Cas13，(v)内体逃逸结构域，例如HA2、VSVG、GALA、B18等，和/或(vi)核定位信号(NLS)。
本发明还涉及NA货物分子的各种发明性修饰，这些修饰是确保高效率的加载、释放和生物活性递送的关键。例如，通过将NA货物分子设计为线性或环状，可以增加或减少诸如加载效率和稳定性的方面。此外，通过优化序列的设计，还可能影响NA货物的二级和三级结构，这可以通过促进NA结合结构域对靶NA的易接近性来进一步促进加载。
在又一个有利的实施例中，NA货物分子可包含另外的部分以通过增强加载、改善释放、增加组织比活性和/或增加NA货物分子的稳定性来增加效力。例如，NA货物分子可包含以下的一个或多个：(i)miRNA结合位点，其中此类位点任选地是组织和/或细胞类型特异性的，用以驱动优先的细胞和/或组织比活性，(ii)至少一个稳定结构域，例如长的聚A尾或多于一个聚A尾(例如2个或3个或甚至4个聚A尾)，(iii)位于5'和/或3'UTR中的至少一个茎环结构，用以抑制核酸酶降解，(iv)RNA聚合酶，其用以驱动NA货物分子的转录，(v)密码子优化的序列，其用以增加mRNA的稳定性，(vi)位于5'和/或3'端中的至少一个杂合UTR，用以提高mRNA的翻译效率，和/或(vii)核酶。
如上所述，EV通常不以单个囊泡的形式存在，而是以大量的多个囊泡的形式存在，因此，本发明还涉及EV群体。在有利的实施例中，在整个此类群体中，每个EV的NA货物分子的平均数量为每个EV平均一(1)个以上NA货物分子，优选地每个EV 10个以上NA货物分子，甚至更优选地每个EV 100个以上NA货物分子。然而，在整个群体中，也可能存在不包含任何NA货物分子的EV，因此本发明还可以涉及包含每个EV平均少于一(1)个NA货物分子的EV群体。
重要的是，现有技术通常仅将RNA货物加载到一小部分EV中。例如，US14/502,494中描述的TALEL系统似乎不能确保到EV中，特别是外泌体中的定量加载。这很可能表明TAMEL系统导致单个EV的加载百分比为零到小于一(sub-single)。TAMEL系统的发明人报道，当使用TAMEL系统时，RNA分子到外泌体中的加载至多提高7倍，而与(i)融合蛋白中不含NA结合结构域和/或NA货物分子中不含NA结合结构域的结合位点的EV，(ii)本身不含融合蛋白的EV(如图2所示)，(iii)仅加载有NA货物的未经工程化工作的EV，和/或(iv)给定的内部NA对照分子相比，本发明改善了例如mRNA和其它NA货物分子的生产性加载，典型地提高至少10倍，优选至少25倍，但通常提高至少50倍和优选至少提高70倍。因此，本发明提供一种将大量更多的NA货物分子加载到给定的EV群体中的方法，重要的是，与现有技术相比，本发明还能够加载显著更高比例的EV。在一个实施例中，本发明涉及EV群体，其中至少5％、至少10％、至少20％、至少50％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％和/或至少95％的EV包含所讨论的NA货物分子。
如上所述，本发明与US14/502,494和其它现有技术文献之间的关键差异涉及融合多肽在整个EV群体中的无效，且重要的是，不均匀分布。例如，US14/502,494中使用的MS2蛋白仅存在于一小部分EV中，这导致整个EV群体中mRNA货物的加载分布不均匀。相反，本发明的融合蛋白均匀地分布在整个EV群体中，这意味着基本上每个EV都包含至少一个根据本发明的融合多肽和通常至少一个NA货物分子。因此，在一个实施例中，本发明涉及基本上包含两个EV亚群的EV组合物，其中(i)第一EV亚群中每个EV包含平均多于一个融合多肽(包含NA结合结构域和外泌体多肽)，以及(ii)其中第二EV亚群中每个EV包含与平均多于一个融合多肽结合的所讨论的NA货物分子。相反，现有技术(例如US14/502,494)教导了每个EV包含非常少的融合多肽的EV，通常每10个EV包含少于1个融合多肽，这显然意味着依赖于所述融合蛋白的NA货物分子的生产性加载和递送将显著低于本发明中的情况。在不希望受到任何理论约束的情况下，可以推测，现有技术未能实现将融合蛋白较高地加载到EV中的原因在于：MS2和类似非真核生物蛋白不能有效地穿梭到外泌体中和/或它们触发毒性，本发明解决了这两个问题。
在另一个方面，本发明涉及包含至少一个NA结合结构域和至少一个外泌体多肽的发明性融合多肽，其中所述至少一个NA结合结构域是PUF、Cas和/或NA适体结合结构域中的一个或多个。在有利的实施例中，融合多肽可任选地进一步包含赋予多肽具有特定功能的其它区域、结构域、序列和/或部分。融合多肽中包含的其它结构域的非限制性实例包括：(i)多聚化结构域，(ii)连接肽，(iii)释放结构域，(iv)RNA切割结构域，(v)内体逃逸部分，(vi)蛋白酶特异性切割位点，(vii)内含肽和/或(viii)靶向部分。
多聚化结构域使融合多肽能够二聚化、三聚化或任何高阶的多聚化，这增加了融合多肽到EV中的分选和运输，还可以有助于增加由产EV细胞产生的囊泡的产量。连接肽可用于提供增加的融合多肽结构和相应的多核苷酸结构的灵活性，并且还可用于确保避免空间位阻和保持融合多肽的功能性。释放结构域可以包含在融合多肽构建体中，以便能够从原始融合多肽释放特定部分或结构域。当融合多肽的部分的释放将增加NA货物的生物活性递送时，和/或当融合多肽的特定功能在较小构建体的部分中更好地起作用时，这是特别有利的。合适的释放结构域可以是顺式切割序列例如内含肽、光诱导的单体或二聚体释放结构域例如Kaede、KikGR、EosFP、tdEosFP、mEos2、PSmOrange、GFP样的Dendra蛋白Dendra和Dendra2、CRY2-CIBN等。NA切割结构域还可以有利地包括在融合多肽中，以引发NA货物的切割。NA切割结构域的非限制性实例包括核酸内切酶例如Cas6、Cas13、工程化改造的PUF核酸酶、位点特异性RNA核酸酶等。此外，本发明的融合多肽还可以包括内体逃逸结构域以驱动内体逃逸并由此增强EV本身和NA货物分子的生物活性递送。增强递送的另一策略是将EV靶向细胞、组织和/或器官或其它身体区室。可以通过多种手段来实现靶向，例如使用靶向肽。此类靶向肽可以是长度从几个氨基酸到长度为100个氨基酸的任何地方，例如在3-100个氨基酸、3-30个氨基酸、5-25个氨基酸之间的任何地方，例如7个氨基酸、12个氨基酸、20个氨基酸等。本发明的靶向肽还可以包括全长蛋白，例如受体、受体配体等。此外，根据本发明的靶向肽还可以包括抗体和抗体衍生物，例如单克隆抗体、单链可变片段(scFvs)、其它抗体结构域等。
在进一步的方面，本发明涉及编码根据本发明的融合多肽的多核苷酸构建体。多核苷酸构建体可以以各种不同的形式和/或在不同的载体中存在。例如，多核苷酸可以是基本上线性的、环状的和/或具有任何二级和/或三级和/或高级结构。此外，本发明还涉及包含多核苷酸的载体，例如，载体例如质粒、任何环状DNA多核苷酸、微环、病毒，例如腺病毒、腺相关病毒、慢病毒、mRNA和/或修饰的mRNA。
根据本发明的多核苷酸构建体可以进一步包含一个或多个位点或结构域以用于将特定的功能赋予多核苷酸。例如，可通过使用稳定结构域(例如聚A尾或茎环)来增强多核苷酸构建体的稳定性，并且多核苷酸构建体还可以由特定的启动子控制，所述启动子可任选地是细胞类型特异性的可诱导启动子、连接肽等。聚A尾可任选地插入Cas6或Cas13切割位点的上游，以导致保留稳定聚A尾的mRNA的切割。
本发明进一步涉及生成EV的各种方法。此类方法可以包括以下步骤：(i)将至少一种多核苷酸构建体引入到产EV细胞中，(ii)在产EV细胞中表达由至少一种多核苷酸构建体编码的至少一个多肽构建体，以及(iii)从产EV细胞中收集正在产生的EV，其包含来自步骤(ii)的目标多肽。在某些实施例中，使用单一多核苷酸构建体，而在其它实施例中，使用多于一种多核苷酸构建体。在不希望受到任何理论约束的情况下，可以推测，已将多核苷酸构建体(根据EV的目的和用途而瞬时或稳定地)引入其中的产EV细胞产生EV(例如外泌体)，其包含由多核苷酸编码的多肽构建体。然后可任选地通常从细胞培养基中收集EV，并任选地在用于特定用途之前将其进一步纯化。在有利的实施例中，通过所述方法产生的EV进一步包含NA货物分子，其借助于融合多肽构建体被加载到EV中。通常，单个EV包含NA货物分子的若干拷贝，但是单个EV还可以包含多于一种类型的NA药物货物分子。作为包含多于一种类型的NA药物货物的EV的非限制性示例，单个EV(即，单一类型的EV的群体)可以包含例如gRNANA药物货物分子和mRNA药物货物分子。
在进一步的方面，本发明涉及包含(i)至少一个多核苷酸构建体和/或(ii)至少一个多肽构建体的细胞。此外，本发明还涉及包含根据本发明的EV的细胞。产EV细胞可以以例如以下的形式存在：原代细胞、细胞系、存在于多细胞生物的细胞、或基本上任何其它类型的细胞来源和产EV细胞材料。术语“源细胞”或“EV源细胞”或“亲本细胞”或“细胞来源”或“产EV细胞”或任何其它类似术语应理解为涉及在合适的条件下能够产生EV的任何类型的细胞，例如在悬浮培养或贴壁培养或任何其它类型的培养系统中。根据本发明的源细胞还可以包括体内产生外泌体的细胞。根据本发明的源细胞可以选自广泛范围的细胞和细胞系，例如间充质干细胞或基质细胞(可从例如骨髓、脂肪组织、脐带胶质(Wharton'sjelly)、围产期组织、胎盘、牙芽、脐带血、皮肤组织等获得)、成纤维细胞、羊膜细胞且更具体地说是任选地表达各种早期标记物的羊膜上皮细胞、骨髓抑制细胞、M2极化巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。特别关注的细胞系包括人脐带内皮细胞(HUVEC)、人胚肾(HEK)细胞、内皮细胞系例如微血管内皮细胞或淋巴内皮细胞、红细胞、红系祖细胞、软骨细胞、不同来源的MSC、羊膜细胞、羊膜上皮(AE)细胞、通过羊膜穿刺术或从胎盘获得的任何细胞、气道上皮细胞或肺泡上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等。此外，免疫细胞例如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞(DC)也在本发明的范围内，并且基本上能够产生EV的任何类型的细胞也包括在本文中。通常，EV基本上可以源自任何细胞来源，无论是原始细胞来源还是永生化细胞系。EV源细胞可以是任何胚胎的、胎儿的和成年的体干细胞类型，包括诱导多能干细胞(iPSC)和通过任何方法衍生的其它干细胞。当治疗神经系统疾病时，可以考虑利用例如原代神经细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞和神经祖细胞作为源细胞。对于待治疗的患者而言，源细胞本质上可以是同种异体的、自体的、甚至异种的，即源细胞可以来自患者本人或者来自无关的、匹配的或不匹配的供体。在某些情况下，从医学角度看，同种异体细胞可以是优选的，因为它们可以提供免疫调节作用，而这种作用可能无法从患有某种适应症的患者的自体细胞中获得。例如，在治疗全身性、周围性和/或神经性炎症的情况下，同种异体MSC或AE可以是优选的，因为可获自此类细胞的EV可以经由例如巨噬细胞和/或嗜中性粒细胞的表型转换(分别从促炎性M1或N1表型到抗炎性M2或N2表型)来实现免疫调节。
如上所述，在优选的实施例中，使用至少一种多核苷酸构建体来稳定地转染和/或转导本发明的产EV细胞，所述多核苷酸构建体编码(i)包含NA结合结构域的融合多肽和(ii)NA货物分子。在高度优选的实施例中，将产EV细胞暴露于克隆选择方案下，以允许单细胞克隆的克隆选择。因此，在高度优选的实施例中，本发明涉及产EV细胞的单细胞克隆种群，其被转染和/或转导以产生既包含融合多肽又包含NA货物分子的EV。可以使用有限稀释方法、单细胞分选和/或使用克隆离心机分离单个细胞来获得单个克隆。
在进一步的方面，本发明涉及用于细胞内递送至少一个RNA货物分子的体外方法。此类方法可以有利地在体外和/或离体进行。所述方法可以包含以下步骤：使靶细胞与至少一种根据本发明的EV、或更通常地根据本发明的EV群体接触。此外，根据本发明的用于递送RNA货物分子的方法还可以包含将编码本文的融合多肽的多核苷酸引入到存在于任何生物系统(例如人类)中的细胞中。
在其它方面，本发明涉及药物组合物，其包含以下组分中的一个或多个：(i)至少一个如本文所述的多核苷酸构建体，(ii)至少一个如本文所述的多肽构建体，(iii)至少一个如本文所述的EV，(iv)至少一个如本文所述的细胞，和/或(v)至少一个如本文所述的EV，其通常与药学上可接受的赋形剂、载体和/或稀释剂或类似物一起配制。此外，本发明还涉及：(i)至少一个如本文所述的多核苷酸构建体，(ii)至少一个如本文所述的多肽构建体，(iii)至少一个如本文所述的EV，(iv)至少一个如本文所述的细胞，和/或(v)至少一个如本文所述的EV群体，和(vi)上述药物组合物，其用于药物中。更具体地说，本发明涉及在预防和/或治疗和/或减轻各种疾病中的用途。疾病和症状的非限制性实例包括以下非限制性实例：克罗恩病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、多发性硬化、系统性红斑狼疮、结节病、特发性肺纤维化、牛皮癣、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关周期性综合征(TRAPS)、白介素1受体拮抗剂缺乏症(DIRA)、子宫内膜异位症、自身免疫肝炎、硬皮病、肌炎、中风、急性脊髓损伤、血管炎、格林-巴利综合征、急性心肌梗塞、急性呼吸窘迫综合征(ARDS)、败血症、脑膜炎、脑炎、肝衰竭、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝(NAFLD)、肾衰竭、心力衰竭或任何急性或慢性器官衰竭以及相关的潜在病因、移植物抗宿主病、Duchenne型肌营养不良症和其它肌肉萎缩症、溶酶体贮积症(例如戈谢病(Gaucher disease)、法布瑞氏症(Fabry's disease)、MPSI、II(亨特综合征(Hunter syndrome))和III、尼曼-匹克病(Niemann-Pick disease)A、B和C型、庞贝病(Pompe disease)等)、神经退行性疾病(包括阿尔茨海默病、帕金森病、亨廷顿病和其它三核苷酸重复相关疾病、痴呆、肌萎缩侧索硬化(ALS))、癌症引起的恶病质、厌食症、2型糖尿病和各种癌症。几乎所有类型的癌症都是本发明的相关疾病靶标，例如，急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓细胞白血病、肾上腺皮质癌、艾滋病相关癌症、艾滋病相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、小脑或脑癌、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、脑干胶质瘤、脑癌、脑瘤(小脑星形细胞瘤、脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层瘤、视觉通路下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(儿童、胃肠道)、原发灶不明肿瘤、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性粒细胞白血病、慢性骨髓增殖性疾病、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、颅外生殖细胞瘤、性腺外生殖细胞瘤、肝外胆管癌、眼癌(眼内黑色素瘤、视网膜母细胞瘤)、胆囊癌、胃癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤、生殖细胞瘤(颅外、性腺外或卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤(脑干胶质瘤、脑星形细胞瘤、视觉通路下丘脑胶质瘤)、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病(急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞白血病、毛细胞白血病)、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、肺癌(非小细胞、小细胞)、淋巴瘤、艾滋病相关淋巴瘤、布基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成神经管细胞瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、原发灶隐匿转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞肿瘤、蕈样肉芽肿、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、骨髓性白血病、慢性粒细胞白血病(急性、慢性)、骨髓瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、神经母细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮间质瘤)、卵巢生殖细胞瘤、卵巢低恶性潜能瘤、胰腺癌、胰岛细胞癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、涎腺癌、肉瘤(尤因(Ewing)家族肿瘤肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤)、西泽里(Sezary)综合征、皮肤癌(非恶性肿瘤、黑色素瘤)、小肠癌、鳞状细胞癌、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、巨球蛋白血症和/或肾母细胞瘤。
可以经由各种不同的给药途径将根据本发明的EV给药到人或受试动物，例如耳、颊、结膜、皮肤、牙齿、电渗、子宫颈内、鼻窦内、气管内、肠内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸润、间质、腹腔内、羊膜内、动脉内、关节内、胆道内、支气管内、囊内、心内、软骨内、尾内、海绵窦内、腔内、脑内、脑池内、角膜内、冠内(牙齿)、冠状动脉内、海绵体内、皮内、椎间盘内、导管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、牙龈内、回肠内、病灶内、管腔内、淋巴管内、髓内、脑膜内、肌内、眼内、卵巢内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、窦内、椎管内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸腔内、小管内、肿瘤内、鼓室内、子宫内、血管内、静脉内、静脉推注、静脉滴注、心室内、膀胱内、玻璃体内、离子电渗、冲洗、喉、鼻腔、鼻饲、封闭敷裹法、眼、口服、口咽、其它、肠胃外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周、牙周、直肠、呼吸(吸入)、眼球后、软组织、蛛网膜下腔、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、经皮、经粘膜、经胎盘、经气管、经鼓膜、输尿管、尿道和/或阴道给药、和/或上述给药途径的任意组合，给药途径通常取决于要治疗的疾病和/或EV、所讨论的NA货物分子或EV群体本身的特征。
实例和实验部分
材料和方法
构建体设计和克隆
已经结合几种外泌体多肽(例如CD81、CD63、CD9、syntenin、syndecan、Alix、CD133等)评估了各种NA结合结构域及其变体(例如PUF、突变的PUF、PUFx2、Cas6、突变的Cas6、Cas13、突变的Cas13等)。ORF通常通过合成产生，并被克隆到哺乳动物表达载体pSF-CAG-Amp中。简而言之，根据制造商的说明书(NEB)，使用酶Notl和Sall消化合成的DNA和载体质粒。根据制造商的说明书(NEB)，使用T4连接酶将限制性纯化DNA片段连接在一起。通过补充氨苄青霉素的平板上的细菌转化选择成功的连接事件。根据制造商的说明书，通过“maxi-prep”产生用于转染的质粒。
细胞培养和转染
根据实验设计和测定，在某些情况下，非病毒瞬时转染和EV产生是在常规2D细胞培养中进行的，而在其它情况下，采用病毒介导的转导构建稳定的细胞系，其通常在生物反应器和/或不同类型的振荡培养箱中培养。为简洁起见，本文仅提及几个实例。
通常将HEK293T细胞接种到15cm培养皿中(每培养皿9x106个细胞)，并按照ATCC的建议在含血清的DMEM中放置过夜。第二天，使用直接添加到细胞上的脂质复合DNA(lipoplexed DNA)瞬时转染细胞。简而言之，将DNA和聚乙烯亚胺(PEI)在OptiMEM中分别孵育5分钟，然后在室温下合并在一起20分钟。将脂质复合DNA和细胞共孵育6小时，然后将条件培养基更换为OptiMEM培养基，再共孵育48小时。在培养皿、烧瓶和其它细胞培养皿中评估的其它细胞和细胞系包括：源自骨髓的间充质基质细胞(BM-MSC)和源自脐带胶质的MSC(WJ-MSC)、羊膜细胞、羊膜上皮细胞、成纤维细胞、各种内皮细胞和上皮细胞、以及各种免疫细胞和细胞系。
在病毒转导和构建用于融合多肽构建体和NA货物分子的各种组合的稳定细胞系的情况下，细胞来源例如BM-MSC、WJ-MSC、成纤维细胞、羊膜上皮细胞、成纤维细胞、各种内皮细胞和上皮细胞使用病毒转导，通常使用慢病毒(LV)转导。通常，在感染前24小时，将100.000个细胞(例如成纤维细胞、MSC等)或200.000个细胞(例如HEK293T)铺板在6孔板中。加入2uL的LV和任选的聚凝胺(或海美溴铵，孔上的最终浓度为8ug/mL)，并且在转导24小时后，将转导细胞的细胞培养基更换为新鲜的完全培养基。在转导72小时后，进行嘌呤霉素选择(4-6μg/ml)，通常进行7天，然后分析融合多肽的稳定表达。
在2D培养基中或在生物反应器中培养稳定的细胞，随后收获条件培养基用于外泌体制备。进行各种制备和纯化步骤。标准的工作流程包含以下步骤：预先清除上清液，基于过滤法浓缩，基于色谱法去除蛋白质污染物，以及在合适的缓冲液中任选地配制最终的外泌体组合物以用于体外和/或体内测定。
测定和分析
蛋白质印迹(Western blot)是一种非常方便的评估EV中Pols富集的分析方法。简而言之，根据制造商的说明书(英杰公司(Invitrogen)，Novex PAGE 4-12％凝胶)进行SDS-PAGE，其中每孔加载1×1010个外泌体和20ug细胞裂解物。根据制造商的说明书(Immobilon(RTM)，英杰公司)，将SDS-PAGE凝胶中的蛋白质转移到PVDF膜上。将膜在Odyssey封闭缓冲液(Licor)中封端，并根据供应商的说明书使用抗NA结合结构域多肽和/或外泌体蛋白的抗体(一级抗体-Abeam、二级抗体-Licor)进行探测。分子探针在680nm和800nm波长下可视化。
为了确定EV大小，使用配备有分析软件的NanoSight(RTM)仪器或有时使用颗粒矩阵(Particle Matrics)仪器进行纳米粒子跟踪分析(NTA)。对于在NanoSight(RTM)上的记录，使用13或15的摄像机级别以及所有采集后设置的自动功能。经常使用电子显微镜法和荧光显微镜法验证和评估EV的形态和大小。
使用各种方法分离和纯化EV，这些方法通常是过滤法(例如TFF)和尺寸排阻液相色谱法和/或珠洗脱液相色谱法的组合。通常，收集含EV的培养基，并以300g离心力低速旋转5分钟，然后以2000g离心力旋转10分钟，以去除较大的颗粒和细胞碎片。然后使用0.22μm注射器过滤器过滤上清液，并进行不同的纯化步骤。使用带有100kDa截止过滤器的Vivaflow50R切向流(TFF)设备(Sartorius)或带有100或300kDa截止中空纤维过滤器的KR2i TFF系统(SpectrumLabs)将大量样品进行渗滤并浓缩至大约20ml。随后将预浓缩的介质加载到珠洗脱液色谱柱(HiScreen(RTM)或HiTrap(RTM)Capto Core 700色谱柱，GE医疗生命科学(GE Healthcare Life Sciences))上，并连接到(RTM)plus或纯25(RTM)色谱系统(GE医疗生命科学)。根据制造商的说明书，选择用于柱平衡、样品加载和原位柱清洗的流速设置。根据UV吸收色谱图收集样品，并使用Amicon超-1510kDa分子量截止旋转过滤器(密理博(Millipore))将样品浓缩至最终体积为100μl，并保存在-80℃以便进一步进行下游分析。为了评估蛋白质和RNA的洗脱曲线，使用100kDa和300kDa中空纤维过滤器，使用KR2i TFF系统对培养基进行浓缩和渗滤，并在Tricorn 10/300琼脂糖4急流(Sepharose 4Fast Flow)(S4FF)色谱柱(GE医疗生命科学)上分析样品。
实例
实例1.在常规组织培养瓶中培养源自骨髓的MSC，并使用PEI转染进行瞬时转染，以实现mRNA货物分子和融合多肽构建体的加载和表达。图2示出了从BM-MSC获得的编码NanoLuc(RTM)和p21的mRNA货物分子的EV中的加载。使用包含CD63作为外泌体多肽和PUF或Cas6作为NA结合结构域的融合多肽构建体实现加载。该实验还包括NA结合结构域的不同数目的结合位点，即0个、3个和6个结合位点，其插入到编码区域的3'和/或5’旁侧的不同位置中。
使用TFF和SEC的顺序组合纯化MSC-EV。仅外泌体多肽CD63的表达不会导致将任何mRNA加载到EV中(图2中图形的右列)。包含PUF的融合多肽的表达(左列：CD63的N端和C端都侧接有两个PUF结构域，即总共4个PUF构建体)(左起第二列：CD63的N端和C端都侧接有一个PUF结构域)和突变的Cas6(右起第二列)在EV源细胞中表达时确实导致了NanoLuc(RTM)和p21 mRNA两者的显著mRNA加载。加载NanoLuc(RTM)总体上比加载p21更为有效，每个EV最多可加载约45个mRNA拷贝。
实例2.在靶向亨廷顿蛋白(huntingtin)的shRNA的EV介导递送下，靶细胞(HEK293细胞)中的体外基因表达的沉默。使用慢病毒转导来转导在振荡培养箱中培养的羊膜细胞，以分泌包含shRNA和融合多肽构建体的EV，所述融合多肽构建体包含PUF或Cas6作为NA结合结构域，分别与CD63或CD81结合作为EV多肽。使用超速离心从上清液纯化EV。图3的Y轴示出了亨廷顿蛋白表达水平是如何随着NA货物分子中结合位点数目的增加而降低的，使用包含PUF-CD63-PUF的融合多肽加载抗亨廷顿蛋白shRNA会导致大约80％的敲除。
实例3.NanoLuc(RTM)mRN的HEK EV介导递送后，NanoLuc(RTM)作为报告基因在靶Huh7细胞中的表达。稳定地转导HEK293T细胞以表达各种融合多肽构建体，以将报告基因NanoLuc(RTM)mRNA货物加载到EV中。NanoLuc(RTM)mRNA货物分子经工程化改造以包含NA结合结构域的0个、3个或6个结合位点，NA结合结构域包含融合多肽构建体，在这种情况下融合多肽构建体为PUFx2-CD63-PUFx2(外泌体多肽CD63的N端和C端均插接有两个PUF NA结合多肽)、PUF-CD63-PUF和Cas6-CD9-Cas6(图4)。
基于结合珠洗脱LC的TFF纯化源自HEK的EV后，将EV以最佳浓度添加到HEK细胞中，对于该测定而言，最佳浓度是在Huh7靶细胞的6孔板中每孔有107个EV。图4的Y轴示出了相对于微克蛋白质标准化的相对光(发光)单位(RLU)，指示了随着使用的不同融合多肽构建体的结合位点数量的增加，递送和/或翻译增强。因此，图4表明本发明提供能够将生物活性mRNA递送到细胞，然后由这些细胞成功翻译的EV。与现有技术相比，这是本发明的显著优势，现有技术仅能够将RNA加载到EV中，而不能将那些RNA递送到靶细胞的胞质溶胶中以进行主动翻译。

Claims (21)

1.一种包含至少一个融合多肽的细胞外囊泡，所述至少一个融合多肽包含至少一个核酸结合结构域和至少一个外泌体多肽，其中所述至少一个核酸结合结构域是PUF、Cas6和/或Cas13中的一个或多个。
2.根据权利要求1所述的细胞外囊泡，进一步包含至少一个核酸货物分子。
3.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述至少一个核酸货物分子借助于所述融合多肽运输到所述细胞外囊泡中。
4.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中所述核酸货物分子选自由shRNA、miRNA、mRNA、gRNA、pri-miRNA、pre-miRNA、环状RNA、piRNA、tRNA、rRNA、snRNA、和/或lncRNA组成的组。
5.根据权利要求2所述的细胞外囊泡，其中每个核酸货物分子包含(i)所述核酸结合结构域的至少一个结合位点和(ii)治疗性多核苷酸结构域。
6.根据权利要求5所述的细胞外囊泡，其中所述核酸货物分子在所述至少一个结合位点与所述治疗性多核苷酸结构域之间包含切割位点。
7.根据权利要求2至6中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述核酸货物分子编码治疗性多肽。
8.根据权利要求7所述的细胞外囊泡，其中所述治疗性多肽选自由抗体、单链可变片段、亲和体、转运蛋白、肿瘤抑制因子、病毒或细菌抑制剂、细胞成分蛋白、DNA和/或RNA结合蛋白、DNA修复抑制剂、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、凋亡抑制剂和诱导剂、毒素、结构蛋白、神经营养因子、膜转运蛋白、热休克蛋白、CRISPR相关蛋白及其任何组合组成的组。
9.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述融合多肽包含至少一个外泌体多肽，所述至少一个外泌体多肽在N端和/或C端侧接核酸结合结构域和/或其中所述至少一个核酸结合结构域插入到所述外泌体多肽序列中。
10.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述外泌体多肽选自由CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、AARDC1、Syntenin-1、Syntenin-2、Lamp2b、TSPAN8、syndecan-1、syndecan-2、syndecan-3、syndecan-4、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II成分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B及其任何组合组成的组。
11.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述细胞外囊泡进一步包含至少一个靶向部分。
12.根据权利要求2至6中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述核酸货物分子是线性的、环化的和/或具有任何二级和/或三级结构。
13.根据权利要求2至6中任一项所述的细胞外囊泡，其中所述核酸货物分子包含以下的一个或多个：
(i)miRNA结合位点，其中此类位点任选地是组织和/或细胞类型特异性的；
(ii)至少一个稳定结构域；或者
(iii)位于5'和/或3'端处的至少一个杂合UTR。
14.一种细胞外囊泡的群体，其包含根据权利要求1至13中任一项所述的细胞外囊泡。
15.根据权利要求14所述的细胞外囊泡的群体，其中在整个所述细胞外囊泡群体中，每个细胞外囊泡的核酸货物分子的平均数量高于一个。
16.根据权利要求14至15中任一项所述的细胞外囊泡的群体，其中所述细胞外囊泡的群体包含至少两个亚群，
其中第一细胞外囊泡亚群中每个细胞外囊泡包含平均多于一个融合多肽，以及
其中第二细胞外囊泡亚群中每个细胞外囊泡包含与平均多于一个融合多肽结合的所述核酸货物分子。
17.根据权利要求16所述的细胞外囊泡的群体，其中至少5％的细胞外囊泡包含至少一个核酸货物分子。
18.一种用于产生根据权利要求1至13中任一项所述的细胞外囊泡的方法，包含：
(i)将至少一个多核苷酸构建体引入到产细胞外囊泡细胞中，所述多核苷酸构建体编码融合多肽；所述融合多肽包含至少一个核酸结合结构域和至少一个外泌体多肽，其中所述至少一个核酸结合结构域是PUF、Cas6和/或Cas13中的一个或多个；
(ii)在所述产细胞外囊泡细胞中表达由所述至少一个多核苷酸构建体编码的至少一个多肽构建体，从而产生所述细胞外囊泡。
19.一种用于细胞内递送至少一个RNA货物分子的体外方法，包含使靶细胞与至少一个根据权利要求1至13中任一项所述的细胞外囊泡和/或至少一个根据权利要求14至17中任一项所述的细胞外囊泡的群体接触。
20.一种药物组合物，包含：(i)至少一个根据权利要求1至13中任一项所述的细胞外囊泡，和/或(ii)至少一个根据权利要求14至17中任一项所述的细胞外囊泡的群体，以及药学上可接受的赋形剂或载体。
21.(i)至少一个根据权利要求1至13中任一项所述的细胞外囊泡，(ii)至少一个根据权利要求14至17中任一项所述的细胞外囊泡的群体，和/或(iii)根据权利要求20所述的药物组合物在制备药物中的用途。
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