KR20190032480A - 결합능을 갖는 융합 단백질을 포함하는 세포외 소포 - Google Patents

결합능을 갖는 융합 단백질을 포함하는 세포외 소포 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포외 소포 (EV) 치료법에 관한 것으로, 상기 EV는 i.a. 표적화 및 치료적 응용을 위하여 Fc 도메인을 함유하는 단백질 (예컨대 항체)로 코팅된다. EV의 코팅은 EV 폴리펩타이드의 본 발명의 단백질 공학기술을 통해 달성된다. 본 발명은 따라서 EV의 코팅 방법, EV 자체, 뿐만 아니라 Fc 함유 단백질로 코팅된 그와 같은 EV의 약제학적 조성물 및 의료 응용에 관한 것이다.

Description

결합능을 갖는 융합 단백질을 포함하는 세포외 소포
본 발명은 세포외 소포 (EV) 치료법에 관한 것으로, 상기 EV는 i.a. 표적화 및 치료적 응용을 위하여 Fc 도메인을 포함하는 단백질 (예컨대 항체)로 코팅된다.
단백질 생물학은, 암, 유전적 장애 및 자가면역 질환을 포함하는, 광범위한 질환의 치료 및/또는 예방에서 일상적으로 사용된다. 많은 오늘날의 블록버스터 약물이 발견될 수 있는 것들 중에서, 항체 및 키메라성 수용체는 네이키드 형태로, 즉 임의의 전달 비히클 없이, 전형적으로 투여된다. 세포외 소포 (EV)는 세포외 환경에 EV-생산 세포에 의해 방출되는 나노-크기의 소포이다. EV 및 특히 엑소좀은 단백질 생물학, 예컨대 항체 및 유인 수용체를, 표적 세포에 수송시킬 수 있는 것으로 밝혀져서, 재조합 단백질의 특이성과 조합으로 EV의 특성을 활용하는 진전된 생물학적 치료법의 전적으로 신규한 형태를 가능하게 한다.
단백질 치료법을 전달하기 위한 EV의 용도는 생물학의 종래의 직접 투여에 대해 수많은 이점을 제공한다. 예를 들어, 생물치료법이 EV를 사용하여 전달되는 경우 이들은 분해로부터 보호되고 더욱 안정하고; EV는 향상된 효능으로 이어질 수 있는 다가 약물 전달 양식을 구성하고; EV는 단백질 생물학의 약동학 및 약력학을 개선시킬 수 있고; EV는 관심의 조직 및 세포에 표적화될 수 있고; EV는 그것의 세포 기원을 반영하는 고유한 치료적 효과를 가질 수 있고; EV는 또한 혈액-뇌-장벽의 침투 및 개선된 CNS 전달을 가능하게 한다.
모든 그것의 이점에도 불구하고, 표적 세포에 후속적인 전달을 위하여 EV에 큰 및 복합체 단백질 생물학의 장입은 전적으로 간단한 것으로 입증되지 않았다. WO2013/084000 및 WO2014/168548 양쪽은 EV 속에 그리고 그 위에 단백질-기반 생물학 (예컨대 항체 및 유인 수용체)의 성공적인 장입을 기재한다. WO2013/084000은 EV 예컨대 엑소좀에 예를 들어 항체의 양쪽 소위 내인성 및 외인성 장입을 기재한다. 외인성 장입은 배양물에서 EV-생산 세포로부터 그것의 단리 후 EV에 직접적으로 단백질 전달대상물 분자의 도입을 통한 EV의 장입을 지칭한다. 단백질의 외인성 도입은, WO2013/084000에서 처럼, 친계 세포로부터 단리 이후 관심의 폴리펩타이드의 전기천공 또는 형질감염을 예를 들어 사용하여 수행될 수 있다. 내인성 장입은 다른 한편으로, 예를 들어 WO2014/168548에 의해 교시된 바와 같이, 관심의 치료적 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 작제물로 EV-생산 세포의 형질감염을 포함한다. WO2015/058148은 관심의 단백질의 내인성 장입의 예, 즉 Fc 수용체 예컨대 CD64, CD32 및 CD16에 대하여 인코딩하는 작제물과 NK 세포의 유전 공학을 교시한다. 그러나, Fc 수용체를 발현시키기 위해 예를 들면 NK 세포의 유전적 변형은, EV당 Fc 수용체의 적은 수를 단지 초래할 것임에 따라, 관심의 장입 단백질의 특히 효과적인 방식은 아니다. 따라서, WO2015/058148에 의해 교시된 접근법은, 특히 통제가능한, 예측가능한, 확장가능한, 및 비용-효율적인 방식에서, 다중 큰 및 복합체 단백질 생물학으로 EV의 효율적인 장입과 관련된 과제를 전혀 다루지 않는다.
후속적인 치료적 응용을 위하여, 단백질 생물학으로 EV의 장입, 및 특히 Fc 도메인을 포함하는 다른 단백질 및 항체의 장입과 관련된 상기-확인된 문제를 극복하는 것이 따라서 본 발명의 목적이다. 게다가, 본 발명은 기술 분야 내에서 다른 현존하는 필요성을 만족시키는 것, 예를 들어, 치료적 단백질 전달을 위하여 EV의 치료적 잠재력을 상당히 향상시키기 위해, (어느 한쪽 자연적으로 또는 단백질 공학기술의 결과로서) Fc 도메인을 포함하는 다른 단백질 및 실질적인 복수의 치료적, 표적화, 또는 항-청소능 항체로 EV의 고-친화도 및 고밀도 코팅을 가능하는 것이다.
본 발명은 인간 및/또는 비-인간 기원의 (본 명세서에서 종종 Fc 결합제로서 지칭된) Fc 결합 폴리펩타이드에 융합된 엑소좀 단백질을 포함하는 융합 작제물 이용에 의해 이들 및 다른 목적을 달성한다. EV의 장입용 양식으로서 엑소좀 단백질의 용도는, Fc 결합제와 Fc 도메인을 포함하는 단백질 (그와 같은 Fc 함유 단백질은 유리한 구현예에서 항체일 수 있다) 사이의 상호작용을 통해 EV에 결합되는, (본 명세서에서 종종 Fc 함유 단백질로서 지칭된) Fc 도메인을 포함하는 단백질로 EV를 치밀하게 코팅시킬 수 있기 위해 중요한, EV의 표면에서 다수의 Fc 결합제를 표시하는 것을 가능하게 한다. Fc 도메인이 천연적으로 부족한 단백질상에 융합될 수 있는 인간 및/또는 포유동물 기원의 Fc 도메인은 대안의 하기 비-제한 목록으로부터 선택될 수 있다: 인간 IGHM (비-제한 예로서 등록 번호 P01871), 인간 IGHA1 (비-제한 예로서 등록 번호 P01876), 인간 IGHA2 (비-제한 예로서 등록 번호 P01877), 인간 IGKC (비-제한 예로서 등록 번호 P01834), 인간 IGHG1 (비-제한 예로서 등록 번호 P01857), 인간 IGHG2 (비-제한 예로서 등록 번호 P01859), 인간 IGHG3 (비-제한 예로서 등록 번호 P01860), 인간 IGHG4 (비-제한 예로서 등록 번호 P01861), 인간 IGHD (비-제한 예로서 등록 번호 P01880), 인간 IGHE (비-제한 예로서 등록 번호 P01854), 및 이의 임의의 도메인, 유도체, 또는 조합. 비-인간 Fc 결합 폴리펩타이드 예컨대 단백질 A/G 그리고 소위 Z 도메인 및 이량체성 ZZ 도메인의 용도는 Fc 결합제와 그것의 상호작용 파트너(들), 즉 Fc 함유 단백질의 Fc 도메인 사이 더 높은 결합 친화도를 초래할 수 있다. 게다가, 비-인간 Fc 결합제는 인간 Fc 결합 단백질보다 크기가 종종 더 작다. 다른 한편으로, 인간 및/또는 포유동물 기원의 Fc 결합 단백질 및 폴리펩타이드 도메인, 예컨대 인간 FCGRI (CD64) (비-제한 예로서 서열번호 31), FCGR2A (CD32A) (비-제한 예로서 등록 번호 P12318), FCGR2B (CD32B) (비-제한 예로서 등록 번호 P31994), FCGR2C (CD32C) (비-제한 예로서 등록 번호 P31995), FCGR3A (CD16A) (비-제한 예로서 등록 번호 P0837), FCGR3B (CD16B) (비-제한 예로서 등록 번호 O75015), FCAMR (비-제한 예로서 서열번호 28), FCERA (비-제한 예로서 서열번호 30), FCAR (비-제한 예로서 서열번호 29), 또는 마우스 FCGRI (비-제한 예로서 서열번호 79), FCGRIIB (비-제한 예로서 서열번호 80), FCGRIII (비-제한 예로서 서열번호 81), FCGRIV (비-제한 예로서 서열번호 82), FCGRn (비-제한 예로서 서열번호 83)은, 이들이 포유동물 단백질인 경우 그리고 그 자체로 덜 면역자극성인 경우 이점을 제공할 수 있다. 무관하게, EV에서 표시되는 Fc 결합 폴리펩타이드의 적절한 수를 확보하기 위해 그리고 통제가능 생산을 가능하게 하기 위해, Fc 도메인에 결합하는 단지 과발현된 단백질과는 대조적으로 Fc 결합 폴리펩타이드의 융합 작제물을 이들이 포함한다는 것을 확보하도록 EV를 조작하는 것이 핵심이다.
게다가, 본 발명의 Fc 결합제 폴리펩타이드는, EV 단백질을 가진 융합 작제물의 도움으로 EV 표면에 이들을 유도하는 것을 더욱 쉽게 하는, 천연적으로 발현된 Fc 결합 단백질보다 더 작도록 조작될 수 있다. 또한, (예를 들면 기원이 박테리아성일 수 있는) 비-인간 Fc 결합제와 인간 Fc 결합제 사이 하나의 유의차는 그와 같은 비-인간 Fc 결합제가, Fc 도메인을 포함하는 관심의 단백질로 EV의 증가된 표면 코팅을 초래할 수 있는, 특정 사례에서 동시에 1 초과 Fc 도메인을 결합시킬 수 있다는 사실이다. 예를 들어, 스타필로코쿠스 아우레스로부터 그리고 연쇄상구균 디스갈락티애로부터 유래된 단백질 A 사이 융합 단백질인, 단백질 A/G는 IgG 항체의 Fc 도메인에 대하여 7개의 결합 영역을 갖는다. 이러한 다원자가는, 각각의 Fc 결합제 (이 경우에 단백질 A/G)에 결합되는, Fc 도메인-함유 단백질, 예컨대 항체로 EV의 더욱 치밀한 코팅을 가능하게 하는, Fc 도메인을 포함하는 다중 단백질, 예컨대 항체를 초래할 수 있다. Fc 결합제로 EV의 더욱 치밀한 코팅은 중요하게는 또한 예를 들면, 향상될 관심의 상기 표적에 그 결합을 의미하는, 예를 들면 항체와 그것의 상응하는 항원 사이 더 높은 결합능을 가능하게 할 수 있고, 이는 표적화 및/또는 치료적 관점으로부터 유익할 수 있다.
일 양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 포함하는 EV에 관한 것이고, 상기 융합 단백질은 엑소좀 폴리펩타이드에 융합된 적어도 하나의 폴리펩타이드-기반 Fc 결합제를 포함한다. EV 단백질과 융합의 결과로서, Fc 결합제는, Fc 도메인-함유 단백질 예컨대 항체를 가진 EV의 치밀한 코팅을 가능하게 하는, EV의 표면에서 높은 수로 효율적으로 표시된다. (천연적으로 또는 분자 생물학 공학기술의 결과로서) Fc 도메인을 포함하는 항체 및 다른 단백질로 EV의 코팅은 몇 개의 이유로 유리하다: (1) 특정 세포 유형, 조직, 및/또는 기관을 표적하는 항체 또는 다른 단백질이 분포의 재유도 및 EV-기반된 치료법의 전달 최적화에 고도로 유용한 접근법을 나타냄, (2) 관심의 표적 항원과 상호작용하는 치료적 항체 또는 다른 Fc 도메인-함유 단백질이 EV를 사용하여 관심의 조직에 (예를 들어 CNS에 또는 뇌에) 효율적으로 전달될 수 있음, (3) EV의 표면에서 다중화된 항체 또는 다른 Fc 도메인-함유 단백질이 결합 표적, 예컨대 표적 항원에서 상당히 더 양호할 수 있음, (4) ADCs의 다중화가 그것의 치료적 효능을 상당히 향상시킬 수 있고 EV에서 그것의 존재가 이들이 또한 표적 세포에 진입할 수 있다는 것을 의미함에 따라, EV가 항체-약물 콘주게이트 (ADCs) 또는 수용체-약물 콘주게이트의 전달에 유리한 양식임, (5) Fc 결합제를 포함하는 EV가, 어느 한쪽 천연적으로 또는 공학기술의 결과로서, Fc 도메인-함유 단백질, 예컨대 항체, ADCs 또는 Fc 도메인을 포함하는 본질적으로 임의의 단백질의 세포 내재화를 용이하게 함, 및 (6) 항체 또는 Fc 도메인-함유 단백질로 EV의 코팅이, 그것의 치료적 활성에 차례로 중요할 수 있는, EV의 옵소닌화 및/또는 면역-매개된 청소능을 감소시킬 수 있음.
또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따라 융합 단백질과 Fc 도메인-함유 단백질 (예컨대 항체 그리고 Fc 도메인이 사실상 융합될 수 있는 임의의 생물약제, 예를 들면 세포내^ 활성 효소 예컨대 NPC1 또는 뉴클레아제 Cas9) 사이 복합체에 관한 것이다. 상기-언급된 바와 같이 융합 단백질은 엑소좀 폴리펩타이드에 융합된 Fc-결합 폴리펩타이드를 포함하고, Fc 결합제는 복합체에서 Fc 도메인-함유 단백질의 Fc 도메인에 결합하고, Fc 도메인-함유 단백질은, 어느 한쪽 천연적으로 또는 문제의 단백질의 공학기술의 결과로서, 관심의 임의의 단백질, 예를 들어 Fc 도메인을 포함하는 임의의 다른 단백질 또는 항체일 수 있다. EV 단백질의 EV 이동조절 능력의 결과로서, 융합 단백질과 Fc 도메인-함유 단백질 사이 그와 같은 비-공유 복합체는, 예를 들면 EV의 막에서 전형적으로 고정되어, 그것의 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 복수의 Fc 도메인-함유 단백질로 코팅된 EV를 초래한다. 복합체는 추가로 또는 대안적으로 EV 내부에 위치할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따라 EV 및/또는 비-공유 복합체, 예컨대 나노입자 복합체 (즉 복수의 적어도 하나의 유형의 Fc 함유 단백질을 가진 EV 막 내부, 외부, 및/또는 막에서 장식된 EV), 및 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 추가 양태에서, 본 발명은 따라서 또한 의약에서, 바람직하게는 항체- 또는 Fc 도메인-함유 단백질-기반 치료, ADC-기반 치료, 및/또는 항체-매개 표적화로부터 유익할 질환의 치료에서 사용하기 위한 EV, EV-단백질 복합체, 및/또는 그와 같은 EV 및 EV-단백질 복합체를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
추가 양태에서, 본 발명은 Fc 도메인을 포함하는 단백질에 결합될 수 있는 EV의 제조 방법에 관한 것이다. 상기 방법은 다음의 단계들을 포함할 수 있다: (i) 적어도 하나의 Fc 결합제 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 EV 공급원 세포로 도입시키는 단계, 및 (ii) 관심있는 융합 단백질을 포함하는 상기 EV인, EV 공급원 세포로부터 분비된 EV를 하베스트하는 단계.
추가로, 본 발명은 (i) 적어도 하나의 Fc 결합제 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 EV를 제공하는 단계 및 (ii) 융합 단백질의 Fc 결합제가 Fc 도메인을 포함하는 적어도 하나의 단백질중 Fc 도메인에 결합될 수 있도록 하는 단계를 포함하는, Fc 도메인을 포함하는 적어도 하나의 단백질로 EV를 코팅시키는 방법에 관한 것이다.
마지막으로, 본 발명은 또한 적어도 하나의 Fc 결합제 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 및 상기 융합 단백질을 인코팅하는 폴리뉴클레오타이드 작제물과, 상기 작제물을 포함하는 벡터, EV 및 세포에 관한 것이다.
도 1. 엑소좀 단백질이 Fc 결합 폴리펩타이드 (즉 Fc 결합제 도메인)에 융합된 융합 단백질을 포함하는 EV의 도식적 실례. Fc 결합제는 예를 들어 항체 및/또는 Fc 도메인을 포함하는 임의의 다른 단백질에 결합됨으로써, EV를 단백질 치료제용 다가 전달 비히클로 바꿀 수 있다.
도 2. Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 EV의 전자 현미경검사 사진 (A)는 나노금 표지된 항체로 장식되어 있고 (즉 Fc 함유 단백질), 반면에 Fc 결합 폴리펩타이드가 결여된 대조군 EV (B)는 그것의 표면에 결합된 임의의 항체를 갖지 않는다.
도 3. Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 EV가 관심있는 Fc 함유 단백질 (인간 IgG)에 결합됨을 보여주는 유세포측정 데이터. 결합은 비특이적/아이소타입/음성 대조군 비드 모집단을 포함한, 키트에 포함된 모든 비드 모집단에 대해 매우 효율적이다.
도 4. 항-HER2 항체는 HER2 저-발현 세포주 MDA-MB-231에서는 아니고, 단지 HER2 고-발현 세포주 MDA-MB-361에서만 아이소타입 대조군-장식되고 야생형인 EV에 비하여 항체-장식된 EV의 흡수를 증가시킨다.
도 5. 에타너셉트-코팅된 EV는, WT 또는 대조군 장식된-EV와는 대조적으로, 체중의 손실로부터 마우스를 보호하고, 에타너셉트가 다중화된 경우 및/또는 Fc 결합 폴리펩타이드가 그것의 Fc 도메인에 결합하는 경우 에타너셉트와 TNF알파 사이 더 높은 친화도로 인해 가능한, 네이키드 에타너셉트보다 더 높은 활성을 표시하였다.
도 6. 형광 표지된 항체의 신호는 분명히 Fc 도메인을 포함하는 그것의 표면 항체에 부착된 Fc-결합 EV로 처리된 세포에 존재하며, 한편 형광 현미경검사 (A) 및 유세포측정 (B)으로 측정된, 형광 신호는 비처리된 (1) 또는 대조군 EV 처리된 (2) 세포에는 존재하지 않는다. 이는 Fc 함유 단백질, 예컨대 항체가 Fc 결합 EV에 의해 세포내에서 전달될 수 있고, EV에 대한 결합은 극적으로 세포로 항체의 흡수를 증가시킴을 입증하는 것이다.
도 7. 항-NFkB 항체가 Fc-결합 EV (즉, 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드가 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드에 융합된 EV)에 의해 세포로 전달된 경우 NFkB-매개된 세포내 신호의 성공적인 억제.
도 8. 대조군 EV, 뿐만 아니라 항-인테그린-4a 항체로 단일 치료는 마우스에서 EAE 발생으로부터 중간 정도 보호성 효과를 표시하고, 반면에 동일한 항-인테그린-4a 항체로 코팅된 zz 도메인 EV는 생체내 EAE 발생을 거의 완전히 폐지시킨다.
도 9. 표적화된 게놈 편집용 CRISPR-Cas9 가이드 RNA 복합체의 세포내 전달, Fc 결합 도메인-Lamp2b 조작된 EV를 통해 Fc Cas9 가이드 RNA 복합체의 전달 후 표적화된 게놈 절단을 도시하는 그래프.
도 10. Fc 도메인에 융합된, 및 Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 HEK-유래 EV에 결합된 리소좀 축적 장애 효소 GBA의 세포내 전달.
도 11. 상당한 표적 침묵화를 초래하는, Lamp2b-ZZ 도메인 EV의 표면에 부착된 siRNA-장입 Ago2로 U20S 세포 치료 이후 사이클린 D 수준.
본 발명은, Fc 결합제에 의해 격리될 수 있고 다양한 질환 및 장애의 치료에서 치료적 응용에 사용될 수 있는 항체 및 다른 Fc 도메인-함유 단백질로 EV의 치밀한 코팅을 가능하게 하기 위해, 엑소좀 폴리펩타이드에 융합된 적어도 하나의 Fc 결합제를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 EV에 관한 다양한 양태 및 구현예에 관한 것이다.
편의상 및 명료성을 위해, 본원에 이용된 특정 용어들이 수집되었고, 하기에 기재된다. 달리 정의되지 않는 한, 본원에 사용된 모든 기술 및 과학 용어들은 본 발명이 속하는 당해 분야의 숙련가가 통상적으로 이해하는 것과 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 특색, 양태, 구현예, 또는 대안은 마쿠쉬(Markush) 그룹에 관하여 기재되는 경우에, 당해 분야의 숙련가는 본 발명이 또한 이에 의해 마쿠쉬 그룹의 임의의 개별 구성원 또는 구성원의 하위그룹에 관하여 기재됨을 인지할 것이다. 당해 분야의 숙련가는 본 발명이 또한 이에 의해 마쿠쉬 그룹의 개별 구성원 또는 구성원의 하위그룹의 임의 조합으로 기재됨을 추가로 인지할 것이다. 추가로, 본 발명의 양태 및/또는 구현예중 하나와 연결되어 기재된 구현예 및 특색도 또한 본 발명의 다른 양태 및/또는 구현예 모두에 필요한 부분만 약간 수정하여 적용함을 유의해야 한다. 예를 들어, Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 EV와 연계되어 본원에 기재된 상기 Fc 결합 폴리펩타이드는 본원의 다른 모든 양태, 교시 및 구현예, 예를 들어, EV의 제조 또는 코팅 방법에 관한, 또는 본원에 기재된 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 작제물에 관한 양태 및/또는 구현예를 개시하고, 이에 관련되며, 이것과 양립가능한 것으로 이해되어야 한다. 게다가, 특정 양태와 관련하여 기재된 특정 구현예, 예를 들어, 특정 의료 징후 치료에 관한 양태에 관하여 기재된 바와 같이, Fc 결합 폴리펩타이드 및 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 EV의 투여 경로는 천연적으로 또한 다른 양태 및/또는 구현예 예컨대 본 발명의 약제학적 조성물 및/또는 Fc 결합 폴리펩타이드 -Fc 함유 단백질 복합체에 관한 것에 관하여 관련될 수 있다. 게다가, 본원에서 확인된 모든 폴리펩타이드 및 단백질은 융합 폴리펩타이드를 위한 종래의 전략을 사용하는 융합 단백질에 자유롭게 조합될 수 있다. 비제한적인 예로서, 본원에 기재된 모든 Fc 결합 폴리펩타이드는 하나 이상의 엑소좀 폴리펩타이드와의 임의 조합으로 자유롭게 조합 수 있다. 또한, Fc 결합 폴리펩타이드는 1개 초과의 Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 작제물을 생성하기 위하여 서로 조합시킬 수 있다. 또한, 임의 및 모든 특색 (예를 들어 마쿠쉬 그룹의 임의 및 모든 구성원)는 임의 및 모든 다른 특색 (예를 들어 임의의 다른 마쿠쉬 그룹의 임의 및 모든 구성원)와 자유롭게 조합시킬 수 있다, 예를 들어, 임의의 Fc 결합 단백질은 임의의 Fc 함유 단백질, 예컨대 임의의 항체와 조합시킬 수 있거나, 또는 임의의 엑소좀 폴리펩타이드는 임의의 Fc 결합 폴리펩타이드와 조합시킬 수 있다. 게다가, 본원에 교시가 EV (및/또는 EV-고정된 융합 단백질 - Fc 함유 단백질 복합체)를 단수로 및/또는 EV를 별개의 천연 나노입자-유사 소포로서 지칭하는 경우에, 상기의 모든 교시는 복수의 EV 및 EV 모집단 및 Fc 함유 단백질로 코팅된 EV에 동등하게 관련되고 이에 적용가능함을 이해해야 한다. 일반적인 언급으로서, Fc 결합 폴리펩타이드, Fc 함유 단백질, 예컨대 항체, EV-생산 세포 공급원, 엑소좀 단백질, 및 본 발명에 따른 모든 다른 양태, 구현예, 및 대안은 본 발명의 범위 및 요지로부터 벗어나지 않고 임의 및 모든 가능한 조합으로 자유롭게 조합될 수 있다. 게다가, 본 발명의 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 또는 임의의 폴리펩타이드 또는 폴리뉴클레오타이드 서열 (각각, 아미노산 서열 또는 뉴클레오타이드 서열)은 임의의 제시된 분자가 이와 관련된 원하는 기술 효과를 수행하는 능력을 유지하는 한 최초 폴리펩타이드, 폴리뉴클레오타이드 및 서열로부터 상당히 벗어날 수 있다. 그것의 생물학적 특성이 유지되는 한, 본 발명에 따른 폴리펩타이드 및/또는 폴리뉴클레오타이드 서열은 가능한 높은 서열 동일성이 바람직함에도 불구하고 (예를 들어 60%, 70%, 80%, 또는 예를 들어 90% 또는 그 초과), 천연 서열에 비하여 50% 만큼 (예를 들어, BLAST 또는 ClustalW를 사용하여 계산된) 벗어날 수 있다. 예를 들어 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 엑소좀 단백질의 조합(융합)은 각각의 폴리펩타이드의 특정 분절이 대체 및/또는 변형될 수 있고/있거나, 서열이 다른 아미노산 스트레치의 삽입에 의해 차단될 수 있음을 암시하며, 천연 서열로부터의 편차는 주요 특성 (예를 들어 Fc 결합 특성, 엑소좀 표면에 대한 이동조절, 치료 활성 등)이 보존되는 한 상당할 수 있다. 따라서, 유사한 추리가 자연스럽게 상기 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열에 적용된다. 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질과 연결되어 본원에 언급된 모든 수탁 번호 및 서열번호는 단지 예로서 및 단지 정보를 위해 제시될 것이고, 모든 펩타이드, 폴리펩타이드 및 단백질은 숙련가가 그것들을 이해하는 그것의 통상적인 의미로 제시될 것이다. 따라서, 상기-언급된 바와 같이, 숙련가는 또한 본 발명이 단지 본원에 언급된 특정 서열번호 및/또는 수탁 번호뿐만 아니라, 이의 변이체 및 유도체를 포함함을 이해할 것이다. 본원에 언급된 모든 수탁 번호는 2017년 6월 22일자 데이터베이스 버전에 따르는 UniProtKB 수탁 번호이고, 본원에 언급된 모든 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 뉴클레오타이드 및 폴리뉴클레오타이드는 숙련가가 이해하는 바와 같이 그것의 종래의 의미에 따라 해석되어진다.
용어들 "세포외 소포" 또는 "EV" 또는 "엑소좀"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 임의의 형태로 세포로부터 수득될 수 있는 임의 유형의 소포, 예를 들어, 미세소포 (예를 들어 세포의 원형질막으로부터 벗어난 임의의 소포), 엑소좀 (예를 들어 엔도-리소좀 경로로부터 유래된 임의의 소포), 세포자멸체 (예를 들어 세포자멸적 세포로부터 수득될 수 있음), 극미립자 (예를 들어 혈소판으로부터 유래될 수 있는), 엑토좀 (예를 들어 혈청의 호중구 및 단핵구로부터 유래될 수 있음), 프로스타토좀 (예를 들어 전립선암 세포로부터 수득될 수 있음), 또는 카디오좀 (예를 들어 심장 세포로부터 유래될 수 있음), 등에 관한 것으로 이해해야 할 것이다. EV의 크기는 상당히 변할 수 있지만, EV는 전형적으로 나노-크기의 유체역학적 반경, 즉 1000 nm 미만의 반경을 갖는다. 분명히, EV는 생체내, 생체외, 및 시험관내 모두에서 임의의 세포 유형으로부터 유래될 수 있다. 게다가, 상기 용어들 또한 세포외 소포 모방체, 예를 들어 막 압출, 초음파처리, 또는 다른 기술, 등을 통해 수득된 세포막-기반 소포에 관한 것으로 이해될 것이다. EV, 의료, 및 과학적 용도와 적용을 기술하는 경우, 본 발명은 정상적으로 다수의 EV, 즉 수 천, 수 백만, 수 십억 또는 심지어 1조의 EV를 포함할 수 있는 EV 모집단에 관한 것임이 숙련가에게는 명확할 것이다. 하기의 실험적 부분에서 알 수 있는 바와 같이, EV는 예컨대 용적 단위당(예를 들어 /mL) 105, 108, 1010, 1011, 1012, 1013, 1014, 1015, 1018, 1025, 1030　EV (종종 일명 "입자")의 농도, 또는 임의의 다른 더 큰수, 더 작은수 또는 그 사이의 임의의 수로 존재할 수 있다. 동일한 정맥에서, 예를 들어, 차례로 관심있는 Fc 함유 단백질에 결합될 수 있는 엑소좀 폴리펩타이드와 Fc 결합 폴리펩타이드 사이에 특정 융합 단백질을 포함하는 EV에 관련될 수 있는 용어 "모집단"은 상기 모집단을 구성하는 복수의 독립체를 포함하는 것으로 이해해야 할 것이다. 환언하면, 복수로 존재하는 경우 개별 EV는 EV 모집단을 구성한다. 따라서, 자연적으로, 본 발명은 숙련가에게 명확해지는 바와 같이, 개별 EV 및 EV를 포함하는 모집단 모두에 속한다.
생체내 적용된 경우 EV의 투약량은 치료되기 위한 질환, 투여 경로, 관심의 Fc 함유 단백질, EV에서 존재하는 임의의 표적화 모이어티, 약제학적 제형, 등에 상당히 의존하여 천연적으로 다양할 수 있다. 게다가, 본 발명의 EV는 또한, EV 표면에 결합될 수 있는 Fc 함유 단백질에 더하여, 추가의 치료적 제제를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가의 치료제는 적어도 하나의 치료적 소분자 약물일 수 있다. 일부 구현예에서, 치료적 소분자 약물은 DNA 손상 제제, DNA 합성을 억제하는 제제, 미세소관 및 튜불린 결합제, 항-대사물, 산화적 손상 유발제, 항-혈관신생제, 내분비 요법, 항-에스트로겐, 면역-모듈레이터 예컨대 톨(Toll)-유사 수용체 효능제 또는 길항제, 히스톤 탈아세틸화효소 억제제, 신호 형질도입 억제제 예컨대 키나제 억제제, 열충격 단백질 억제제, 레티노이드, 성장 인자 수용체 억제제, 항-유사분열 화합물, 항-염증제, 세포 주기 조절자, 전사 인자 억제제, 및 세포자멸사 유발제, 및 이들의 임의의 조합으로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다. 추가 구현예에서, 추가 치료제는 치료적 핵산-기반 제제일 수 있다. 상기 핵산-기반 치료제는 단일-가닥 RNA 또는 DNA, 이중-가닥 RNA 또는 DNA, 올리고뉴클레오타이드 예컨대 siRNA, 스플라이드-스위칭(splice switching) RNA, CRISPR 유도 가닥, 짧은 헤어핀 RNA (shRNA), miRNA, 안티센스 올리고뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 예컨대 mRNA, 플라스미드, 또는 임의의 다른 RNA 또는 DNA 벡터를 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 특정 관심은 화학적으로 합성된 및/또는 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드, 예컨대 2'-O-Me, 2'-O-알릴, 2'-O-MOE, 2'-F, 2'-CE, 2'-EA 2'-FANA, LNA, CLNA, ENA, PNA, 포스포로티오에이트, 트리사이클로-DNA, 등을 포함하는 핵산-기반 제제이다. 또 추가의 구현예에서, 본 발명에 따르는 EV는 단백질 및/또는 펩타이드일 수 있는 추가의 치료제를 포함할 수 있다. 그와 같은 치료 단백질 및/또는 펩타이드는 EV의 내부에 존재하거나, EV 막으로 삽입되거나 또는 EV 막과 연계되어 존재할 수 있고, 또는 EV로부터 소포외 환경으로 돌출될 수 있다. 상기 단백질 및/또는 펩타이드 제제는 다음을 포함하는 비-제한적인 예의 군으로부터 선택될 수 있다: 항체, 인트라바디, 단일 사슬 가변성 단편 (scFv), 아피바디, 이중- 및 다중특이적 항체 또는 결합제, 아피바디, 달핀, 수용체, 리간드, 예를 들어 효소 대체 요법 또는 유전자 교정을 위한 효소, 종양 억제인자, 바이러스성 또는 박테리아 억제제, 세포 성분 단백질, DNA 및/또는 RNA 결합 단백질, DNA 회복 억제제, 뉴클레아제, 프로테이나제, 인테그라제, 전사 인자, 성장 인자, 세포자멸사 억제제 및 유발제, 독소 (예를 들어 슈도모나스 외독소), 구조 단백질, 신경친화성 인자 예컨대 NT3/4, 뇌-유래된 신경친화성 인자 (BDNF) 및 신경 성장 인자 (NGF) 및 그것의 개별 하위단위 예컨대 2.5S 베타 하위단위, 이온 통로, 막 수송체, 프로테오스타시스 인자, 세포 신호전달에 관여된 단백질, 번역- 및 전사 관련된 단백질, 뉴클레오타이드 결합 단백질, 단백질 결합 단백질, 지질 결합 단백질, 글리코사미노글리칸 (GAGs) 및 GAG-결합 단백질, 대사성 단백질, 세포 스트레스 조절 단백질, 염증 및 면역계 조절 단백질, 미토콘드리아 단백질, 및 열충격 단백질, 등. 바람직한 구현예에서, 치료제는 EV에 의해 전달되는 경우 표적 세포에서 Cas 폴리펩타이드가 그것의 뉴클레아제 활성을 수행할 수 있도록 하는 RNA 가닥과 관련된 (즉, 그것에 의해 수행하는) 온전한 뉴클레아제 활성이 있는 CRISPR-관련 (Cas) 폴리펩타이드 (예를 들어, Cas 9 (비제한적 예로서, 수탁번호 Q99ZW2))일 수 있다. 대안적으로, 또 다른 바람직한 구현예에서, Cas 폴리펩타이드는 표적화된 유전공학이 가능하도록, 촉매적으로 불활성일 수 있다. 또 다른 대안은 임의의 다른 유형의 CRISPR 효과기, 예컨대 단일 RNA-유도된 엔도뉴클레아제 Cpfl (종, 예컨대 악시다미노코쿠스 또는 라크노스피라세아에로부터) (비제한적인 예로서, 수탁 번호 U2UMQ6 및 A0Q7Q2)일 수 있다. 추가의 바람직한 구현예는 리소좀 축적 장애를 위한 효소, 예를 들어 글루코세레브로시다제 예컨대 이미글루세라제, 알파-갈락토시다아제, 알파-L-이두로니다제, 이듀로네이트-2-설파타제 및 이두르설파제, 아릴설파타제, 갈설파제, 산-알파 글루코시다제, 스핑고미엘리나제, 갈락토세레브로시다제, 갈락토실세라미다제, 글루코실세라미다제 (비-제한적인 예로서, 수탁 번호 P04062) 세라미다제, 알파-N-아세틸갈락토사미니다제, 베타-갈락토시다제, 리소좀 산 리파제, 산 스핑고미엘리나제, NPC1 (비제한적인 예로서, 수탁 번호 O15118), NPC2 (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P61916), 헤파란 설파미다아제, N-아세틸글루코사미니다제, 헤파란-a-글루코사미나이드-N-아세틸전달효소, N-아세틸글루코사민 6-설파타제, 갈락토스-6-설페이트 설파타제, 갈락토스-6-설페이트 설파타제, 하이알루로니다제, 알파-N-아세틸 뉴라미니다제, GlcNAc 인산전달효소, 무콜리핀 1, 팔미토일-단백질 티오에스테라제, 트리펩티딜 펩티다제 I, 팔미토일-단백질 티오에스테라제 1 , 트리펩티딜 펩티다제 1 , 바테닌, 린클린, 알파-D-만노시다제, 베타-만노시다제, 아스파르틸글루코사미니다제, 알파-L-푸코시다제, 시스티노신, 카텝신 K, 시알린, LAMP2, 및 헥소아미니다제를 포함하는 군으로부터 선택된 치료적 단백질을 포함한다. 다른 바람직한 구현예에서, 치료적 단백질은, 예를 들어 염증 반응을 변형시키는 세포내 단백질, 예를 들어 후성유전적 단백질(예: 메틸화효소 및 브로모도메인), 또는 근육 기능을 변형시키는 세포내 단백질, 예를 들어 전사 인자 예컨대 MyoD (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P15172) 또는 Myf5, 근육 수축성을 조절하는 단백질 예를 들어 미오신, 액틴, 칼슘/결합 단백질 예컨대 트로포닌, 또는 구조 단백질 예컨대 디스트로핀 (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P11532), 미니 디스트로핀 (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P15172), 우트로핀, 티틴, 네불린, 디스트로핀-관련된 단백질 예컨대 디스트로브레빈, 신트로핀, 신코일린, 데스민, 사르코글리칸, 디스트로글리칸, 사르코스판, 아그린, 및/또는 푸쿠틴일 수 있다. 중요하게는, 상기-언급된 모든 치료적 단백질은 Fc 도메인을 함유하도록 조작되어, EV에 존재하는 Fc 결합 폴리펩타이드에 결합될 수 있도록 할 수 있다. 또 다른 비-제한적인 예는 표적 세포로 후속적인 전달을 위해 효소 NPC1 위로 Fc 도메인의 융합이다. EV-전달된 Fc 함유 단백질 (예를 들어 Fc-Cas9 또는 항체)의 세포내 생물활성을 개선하기 위해 이용될 수 있는 또 다른 비-제한적인 예는 엔도좀 탈출 펩타이드 또는 단백질, 예컨대 HA2, 세포-침투 펩타이드 (CPPs) 예컨대 TAT 펩타이드, 트랜스포르탄, 페네라틴, 폴리-라이신, 또는 gp41, 콜레라 독소, 시가 독소, 사포린, 디프테리아 독소 펩타이드, 등에 Fc 도메인을 융합시키는 것이다. EV 표면에 상기 엔도좀 탈출 도메인의 표시는 표적 세포로의 내재화 및 후속되는 엔도좀 탈출을 향상시킬 수 있다.
Fc 도메인을 관심있는 단백질로 융합시킬 수 있는 방법의 유리한 비-제한적인 예는 Cas9, Cpf1, 비-절단 Cas 변이체, 또는 표적 세포로 EV-매개된 전달을 위한 임의의 다른 유형의 유전자 교정 단백질 또는 리보핵단백질 (RNP)로의 Fc 도메인의 융합이다. 바람직한 구현예에서, Fc 도메인은 시험관내에서 단일 유도 RNA (sgRNA) 가닥으로 미리 로딩된, Cas9에 N-말단 또는 C-말단으로 융합시킨다 (RNA로 미리 로딩된 Cas는 소위 리보핵단백질 (RNP) 복합체를 형성한다). 이에 따라 형성된 수득한 Fc 도메인-함유 RNP 복합체는 이어서 그것들이 EV 표면에 부착되도록 적합한 EV의 Fc 결합 폴리펩타이드에 의해 결합시킨 다음, 표적 세포로 전달시킨다. RNP 복합체의 생성은 상이한 방법 및 상이한 RNA 성분, 예컨대 종래의 단일 유도 RNA, 헤어핀 루프, crRNA, tracrRNA와 선택적으로 조합시킨 crRNA 및 tracrRNA를 모두 포함하는 합성 유도 RNA, 및 다양한 이들의 조합을 사용하여 성취할 수 있다. 상동성-지향된 재조합 또는 비-상동성 말단-결합을 위한 회복 주형 또는 임의의 다른 회복 또는 대체 기전 또한 이어서 Fc 도메인 - Fc 결합 폴리펩타이드 연결을 이용하여 EV에 부착시킬 수 있는 사전-형성된 RNP에 포함될 수 있다.
본 명세서에서 기재된 바와 같이 용어들 "항체" 및 "mAb" 및 "Ab"는 항원-결합 특성을 갖는 항체 그 전체 (즉 전체 항체) 및 이의 임의의 유도체를 포함하는 것으로 이해해야 한다. 종래에, 항체는 디설파이드 결합에 의해 상호-연결된 적어도 2종의 무거운 (H) 사슬 및 2종의 가벼운 (L) 사슬, 또는 이의 항원 결합-부분을 포함하는 당단백질을 지칭한다. 각각의 중쇄는 중쇄 가변 영역 (본원에서 VH로 약칭됨) 및 중쇄 불변 영역으로 구성된다. 각각의 경쇄는 경쇄 가변 영역 (본원에서 VL 로 약칭됨) 및 경쇄 불변 영역으로 구성된다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 항원과 상호작용하는 결합 도메인을 함유한다. VH　및 VL　영역은 추가로 일명 상보성 결정 영역 (CDR)이고, 보다 보존성인 영역, 일명 프레임워크 영역 (FR)으로 산재되어 있는 초가변성 영역으로 세분될 수 있다. 중요하게는, 본 발명을 위해 관심있는 항체는 바람직하게는 본 발명의 Fc 결합 폴리펩타이드가 결합되어, EV 표면의 코팅을 가능하게 할 수 있는 Fc 도메인 또는 이의 유도체를 갖는다. 본 발명에서 사용되는 항체는 단클론성 항체 (mAbs) 또는 다클론성 항체, 바람직하게는 mAbs일 수 있다. 본 발명에서 특정 유용성의 항체는 키메라성 항체, CDR-그라프팅된 항체, 나노바디, 인간 또는 인간화 항체 또는 그것이 본 발명에 따라 융합 단백질에 전형적으로 포함된 Fc 결합 폴리펩타이드에 의해 결합될 수 있는 한 이의 임의의 유도체일 수 있다. 항체의 생산은 본 발명의 범위 밖이지만, 전형적으로 단클론성 및 다클론성 항체는 모두 상승된 실험적 비-인간 포유동물 예컨대 염소, 토끼, 라마, 낙타과, 랫트 또는 마우스이되, 적합한 항체는 또한 다른 생산 방법론, 예를 들어 Kohler 및 Milstein의 표준 체세포 하이브리드화 기술의 결과물일 수 있다. 예를 들어 마우스에서 하이브리도마 생산은 매우 잘-확립된 절차이고, 당해 기술 분야에서 잘 알려진 기술을 사용하여 성취할 수 있다. 본 발명에 사용되는 항체는 인간 항체, 인간화된 항체, 및/또는 임의의 유형의 키메라성 항체일 수 있다. 용어 "인간 항체"는 본 명세서에서 사용된 바와 같이, 프레임워크 및 CDR 영역이 모두 인간 생식계열 면역글로불린 서열로부터 유래된 가변 영역을 갖는 항체를 포함하고자 한다. 본 발명에 사용되는 인간 항체는 인간 생식계열 면역글로불린 서열에 의해 인코딩되지 않은 아미노산 잔기를 포함할 수 있다 (예를 들어, 시험관내에서 무작위 또는 부위-특이적인 돌연변이유발에 의해 또는 생체내 체세포 돌연변이에 의해 도입된 돌연변이). 용어 "항체 유도체(antibody derivatives)"는 임의의 변형 형태의 항체, 예를 들어 어떤 식으로든 변형된 아미노산 서열을 갖는 항체, 또는 항체 및 또 다른 제제 또는 항체와의 콘주게이트, 이중특이적 항체, 다중특이적 항체, 항체 도메인, 등을 지칭한다. 용어 "인간화된 항체"는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스, 낙타과, 라마 등으로부터 유래된 CDR 서열이 인간 프레임워크 서열로 그라프팅된 항체를 지칭한다. 추가의 프레임워크 영역 변경은 인간 프레임워크 서열내에서 이루어 수 있다. 본 발명에 따르는 항체는 모든 아이소타입 및 하위유형 예컨대 IgG (예를 들어 lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgG2a, lgG2d, 및 lgG2c), IgA, IgM, IgM, IgD, 등, 및 단량체, 이량체, 및 이의 올리고머를 포함할 수 있다. 또한, 본 발명에 따라 항체는 EV에서 표시된 경우 몇 개의 기능을 가질 수 있다: (1) 항체가 EV-기반된 치료법의 전달을 최적화 그리고 분포를 재-유도하기 위해 특이적 세포 유형, 조직, 및/또는 기관을 표적시킬 수 있음, (2) 관심의 표적 항원과 상호작용하는 치료적 항체가 EV를 사용하여 관심의 조직에 (예를 들어 CNS에 또는 뇌에) 효율적으로 전달될 수 있음, (3) EV의 표면에서 다중화된 항체가 결합 표적 항원에서 상당히 더 양호할 수 있음, (4) 항체-약물 콘주게이트 (ADCs)가 그것의 치료적 효능을 상당히 향상시키기 위해 EV에서 다중화될 수 있음, (5) Fc 결합 폴리펩타이드에 의해 결합된 항체가 표적에 대하여 더 높은 친화도를 가질 수 있음, (6) 본 발명에 따라 EV상에 코팅된 항체가 세포내에서 전달될 수 있음, 및 (7) 항체로 EV의 코팅은 EV의 옵소닌화 및/또는 면역-매개된 청소능을 감소시킬 수 있고, 이는 치료적 활성에 차례로 중요할 수 있다.
용어 "Fc 함유 단백질" 및 "Fc 도메인을 포함하는 단백질" 및 "Fc 도메인-함유 단백질" 및 "Fc 도메인 함유 단백질" 및 "Fc 도메인 단백질" 및 유사한 용어들은 본원에서 상호교환적으로 사용되며, 자연적으로 또는 Fc 도메인을 도입시키기 위한 문제의 단백질의 공학의 결과로서 적어도 하나의 Fc 도메인을 포함하는 임의의 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드 (즉 아미노산 서열을 포함하는 임의의 분자)에 관한 것으로 이해해야 할 것이다. Fc는 항체의 꼬리 영역의 명칭인, "결정화가능한 단편(fragment crystallizable)"을 나타낸다. 그러나, Fc 도메인은 또한 단지 항체가 아닌, 다른 단백질에 생성되어 사용될 수 있다. 상기 Fc 도메인-함유 단백질의 비-제한적 예는 항체 및 항체 유도체, Fc-변형된 유인 수용체 및/또는 신호 변환체 예컨대 IL1, IL2, IL3, IL4, IL5, IL6 (예컨대 신호 변환체 gp130 (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P40189)), IL7, IL8, IL9, IL10, IL11, IL12, IL13, IL14, IL15, IL17 (예컨대 IL17R, 비제한적인 예로서, 수탁 번호 Q96F46), IL23 (예컨대 IL23R, 비제한적인 예로서, 수탁 번호 Q5VWK5), 등에 대한 인터류킨 유인 수용체, Fc 도메인-함유 이중- 및 다중특이적 결합제, 임의 유형의 Fc 도메인-함유 수용체 또는 리간드, 예를 들어 효소 대체 요법 또는 유전자 교정을 위한 Fc 도메인-변형된 효소, 뉴클레아제 예컨대 Fc 도메인이 그라프팅된 Cas 및 Cas9, Fc 도메인에 융합된 종양 억제인자 등을 포함한다. 천연적으로 Fc 도메인이 결여된 관심있는 단백질과 융합될 수 있는 적합한 Fc 도메인은 하기 비-제한적인 예를 포함한다: 인간 IGHM (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P01871), 인간 IGHA1 (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P01876), 인간 IGHA2 (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P01877), 인간 IGKC (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P01834), 인간 IGHG1 (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P01857), 인간 IGHG2 (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P01859), 인간 IGHG3 (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P01860), 인간 IGHG4 (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P01861), 인간 IGHD (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P01880), 인간 IGHE (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P01854), 및 임의의 도메인, 유도체, 또는 이들의 조합. 필수적으로, 관심있는 임의의 단백질은 Fc 도메인을 편입시키기 위해 변형시킬 수 있다. Fc 도메인이 도입될 수 있는 단백질의 비-제한적인 예는, 예를 들어 종양 억제인자, 바이러스성 또는 박테리아 억제제, 세포 성분 단백질, DNA 및/또는 RNA 결합 단백질, DNA 회복 억제제, 뉴클레아제, 프로테이나제, 인테그라제, 전사 인자, 성장 인자, 세포자멸사 억제제 및 유발제, 독소 (예를 들어 슈도모나스 외독소), 구조 단백질, 신경친화성 인자 예컨대 NT3/4, 뇌-유래된 신경친화성 인자 (BDNF) 및 신경 성장 인자 (NGF) 및 그것의 개별 하위단위 예컨대 2.5S 베타 하위단위, 이온 통로, 막 수송체, 프로테오스타시스 인자, 세포 신호전달에 관여된 단백질, 번역- 및 전사 관련된 단백질, 뉴클레오타이드 결합 단백질, 단백질 결합 단백질, 지질 결합 단백질, 글리코사미노글리칸 (GAGs) 및 GAG-결합 단백질, 대사성 단백질, 세포 스트레스 조절 단백질, 염증 및 면역계 조절 단백질, 미토콘드리아 단백질, 및 열충격 단백질, 등을 포함한다. 관심있는 단백질의 상기 목록은 소모적이 아니고, 단백질이 Fc 도메인을 포함하는 한 또는 Fc 도메인을 포함하도록 문제의 단백질을 조작할 수 있는 한 다른 단백질이 또한 관련될 수 있다. Fc 도메인을 도입시키기 위한 상기 단백질 공학기술의 한 비제한적 예는 Fc 도메인을 유인 수용체로 부가함, 예를 들어 Fc 도메인을 유전자 교정이 가능한 표적 세포로 생물활성 전달을 위한 Cas 또는 Cas9 효소로 부가함을 포함한다. Fc 도메인을 도입시키기 위한 상기 단백질 공학기술의 또 다른 비제한적 예는 효소 대체 요법을 위한 효소로 Fc 도메인을 부가함을 포함한다 (예를 들어 Fc 도메인-글루코세레브로시다제 또는 Fc 도메인-a-갈락토시다제 또는 Fc 도메인-NPC1). 상업적으로 입수가능한 Fc 도메인-변형된 단백질의 잘-공지된 예는 TNF 수용체 2로 융합된 IgG의 Fc 도메인을 포함하는 에타네르셉트로, 이는 다양한 자가면역 질환의 치료를 위한 생물약제이다. 따라서, 상기로부터 명확한 바와 같이, 본 발명에 따르는 Fc 도메인-함유 단백질은 본질적으로 자연스럽게 또는 이의 도입의 결과로서 Fc 도메인을 함유하는 관심있는 임의의 단백질이다.
Fc 함유 단백질은 EV"에 부착된" 및/또는 Fc 결합 폴리펩타이드에 부착된 것으로서 본 명세서에서 종종 기재된다. 대안적으로, EV는 Fc 함유 단백질"에 의해 코팅된", 또는 Fc 함유 단백질 "그것의 표면에 결합된" 또는 "그것의 표면에 부착된" 것으로서 때때로 지칭된다. 이들 용어들은 Fc 결합 폴리펩타이드와 Fc 도메인 사이 종래의 상호작용의 문맥에서 이해될 수 있다, 즉 2개의 폴리펩타이드는 Fc 결합제와 Fc 도메인 사이 형성하는 화학 결합 (전형적으로 비-공유 결합)을 초래하는 방식으로 서로 상호작용하고 있다. 따라서, 이것은 정상적으로 Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 EV가 따라서, 화학 결합의 덕택으로, Fc 함유 단백질의 Fc 도메인에 부착하는 것을 의미한다. 숙련가에 의해 이해될 바와 같이, EV는 그것에 결합된 (부착된) 복수의 그와 같은 Fc 함유 단백질을 결과적으로 가질 수 있어서, 결합이 EV 표면에서 발생하는 경우 코팅의 형태를 초래한다.
용어들 "Fc 결합 폴리펩타이드" 및 "Fc 결합 단백질" 및 "Fc 결합제" 및 "Fc-결합 단백질" 및 "결합제"는 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 관심있는 임의 단백질의 Fc 도메인을 결합할 수 있는 임의의 단백질, 폴리펩타이드, 또는 펩타이드 (즉 아미노산 서열을 포함하는 임의의 분자)로 이해해야 할 것이다. 전형적으로, 본 발명의 Fc 결합 폴리펩타이드는 인간 또는 비-인간 (예를 들어 포유동물 공급원, 박테리아, 등)인 다양한 공급원으로부터 유래되고, 그들은 다양한 항체 아이소타입, 하위유형, 및 종 (예를 들어 IgG (lgG, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgG2a, lgG2d, 및/또는 lgG2c의 경우에 비제한적인 예로서), IgA, IgM, IgM, IgD, 등)의 Fc 도메인에 대해 고친화도를 가지며, 그들은 EV 단백질에 융합될 수 있다. 본 발명에 따르는 Fc 결합 폴리펩타이드의 비-제한적인 예는 본원을 통해 언급된 다른 Fc 결합 폴리펩타이드 이외에, 단백질 A (비제한적인 예로서, 서열목록번호 77), 단백질 G (비제한적인 예로서, 서열목록번호 78), 단백질 A/G (비제한적인 예로서, 서열목록번호 72), Z 도메인 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 73), ZZ 도메인 (비제한적인 예로서 서열목록번호 73의 2개의 작동가능하게 연결된 복사체, 즉 비제한적인 예로서, 서열목록번호 74), 인간 FCGRI (비제한적인 예로서, 서열목록번호 31), 인간 FCGRIIA (비제한적인 예로서, 서열목록번호 33), 인간 FCGRIIB (비제한적인 예로서, 수탁 번호 31994), 인간 FCGRIIC (비제한적인 예로서, 수탁 번호 31995), 인간 FCGRIIIA (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P08637), 인간 FCGR3B (비제한적인 예로서, 수탁 번호 075015), 인간 FCAMR (비제한적인 예로서, 서열목록번호 28), 인간 FCERA, 인간 FCAR, 마우스 FCGRI (비제한적인 예로서, 서열목록번호 79), 마우스 FCGRIIB (비제한적인 예로서, 서열목록번호 80), 마우스 FCGRIII (비제한적인 예로서, 서열목록번호 81), 마우스 FCGRIV (비제한적인 예로서, 서열목록번호 82), 마우스 FCGRn (비제한적인 예로서, 서열목록번호 83), 및 이의 다양한 조합, 유도체, 또는 대안을 포함한다.
용어들 "EV 단백질" 및 "EV 폴리펩타이드" 및 "엑소좀 폴리펩타이드" 및 "엑소좀 단백질"은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 폴리펩타이드 작제물 (이는 전형적으로 EV 단백질 이외에, Fc 결합 폴리펩타이드를 포함한다)을 적합한 소포성 구조, 즉 적합한 EV로 운송하기 위해 사용될 수 있는 임의의 폴리펩타이드에 관한 것으로 이해해야 할 것이다. 더 구체적으로, 이들 용어는 융합 단백질 작제물을 소포성 구조 (예: EV)로 운송, 이동조절 또는 셔틀링(shuttling)할 수 있도록 하는 임의의 폴리펩타이드를 포함하는 것으로 이해해야 할 것이다. 상기 엑소좀 폴리펩타이드의 예는 예를 들어 CD9 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 1), CD53 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 2), CD63 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 3), CD81 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 4), CD54 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 5), CD50 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 6), FLOT1 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 7), FLOT2 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 8), CD49d (비제한적인 예로서, 서열목록번호 9), CD71 (트랜스페린 수용체로도 공지된다) (비제한적인 예로서, 서열목록번호 10) 및 그것의 엔도좀 분류 도메인, 즉 트랜스페린 수용체 엔도좀 분류 도메인 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 23), CD133 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 11), CD138 (신데칸-1) (비제한적인 예로서, 서열목록번호 12), CD235a (비제한적인 예로서, 서열목록번호 13), ALIX (비제한적인 예로서, 서열목록번호 14), 신테닌-1 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 15), 신테닌-2 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 16), Lamp2b (비제한적인 예로서, 서열목록번호 17), 신데칸-2 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 20), 신데칸-3 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 21), 신데칸-4 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 22), TSPAN8, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH 1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, Fc 수용체, 인터류킨 수용체, 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-II 성분, CD2, CD3 엡실론, CD3 제타, CD13, CD18, CD19 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 26), CD30 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 27), TSG101, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 알파, Mac-1 베타, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A, VTI1B, 다른 엑소좀 폴리펩타이드, 및 이들의 임의의 조합이지만, 폴리펩타이드를 EV로 운송할 수 있는 수많은 다른 폴리펩타이드가 본 발명의 범위내에 포함된다. 전형적으로, 본 발명의 많은 구현예에서, 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드가 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드에 융합되어, EV에 존재하는 융합 단백질을 형성한다. 상기 융합 단백질은 또한 링커, 막관통 도메인, 세포질 도메인, 다량체화 도메인 등을 포함하는, 그것의 기능(들)을 최적화하기 위한 다양한 다른 성분을 포함할 수 있다.
용어들 "공급원 세포(source cell)" 또는 "EV 공급원 세포" 또는 "친계 세포(parental cell)" 또는 "세포 공급원" 또는 "EV-생산 세포" 또는 임의의 다른 유사한 용어는 적당한 조건하에, 예를 들어 현탁 배양으로 또는 부착 배양으로 또는 임의의 다른 유형의 배양 시스템에서 EV를 생산할 수 있는 임의의 유형의 세포에 관한 것으로 이해해야 할 것이다. 본 발명에 따르는 공급원 세포는 또한 생체내 엑소좀을 생산하는 세포를 포함할 수 있다. 본 발명에 따르는 공급원 세포는 광범위한 세포 및 세포주, 예를 들어 간엽 줄기 또는 기질 세포 또는 섬유모세포 (예를 들어 골수, 지방 조직, Wharton's 젤리, 출산전후 조직, 치아싹, 탯줄 혈액, 피부 조직, 등으로부터 수득가능함), 양막 세포 및 더 구체적으로 다양한 초기 마커를 선택적으로 발현하는 양막 상피 세포, 골수 억제 세포, M2 극성화된 대식세포, 지방세포, 내피 세포, 섬유모세포 등으로부터 선택될 수 있다. 특히 관심있는 세포주는 인간 탯줄 내피 세포 (HUVECs), 인간 배아 신장 (HEK) 세포, 내피 세포주 예컨대 미세혈관 또는 림프 내피 세포, 연골 세포, 상이한 기원의 MSCs, 기도 또는 폐포 상피 세포, 섬유모세포, 내피 세포, 등을 포함한다. 또한, 면역 세포 예컨대 B 세포, T 세포, NK 세포, 대식세포, 단핵구, 수지상 세포 (DCs)가 또한 본 발명의 범위 내에 속하고, 본질적으로 EV를 생산할 수 있는 임의 유형의 세포도 또한 본원에 포괄된다. 일반적으로, EV는 본질적으로 임의의 세포 공급원으로부터 유래될 수 있거나, 그것이 일차 세포 공급원 또는 불멸화된 세포주일 수 있다. EV 공급원 세포는 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs) 및 임의의 방법으로 유래된 다른 줄기 세포를 포함한, 임의의 배아, 태아, 및 성인 체세포 줄기 세포 유형일 수 있다. 신경적 질환을 치료하는 경우에, 공급원 세포로서, 예를 들어 1차 뉴런, 별아교세포, 희소돌기교세포, 미세아교, 및 신경 선조 세포를 이용하기 위해 시도할 수 있다. 공급원 세포는 치료할 환자에 대해 본질적으로 동종이계, 자가조직, 또는 심지어 이종발생성일 수 있다, 즉 세포는 환자 자체로부터 또는 관련없는, 일치된 또는 일치되지 않은 공여체로부터의 것일 수 있다. 특정 상황에서, 동종이계 세포는 의료 관점에서 바람직할 수 있는데, 이는 그들이 특정 징후로 고통받고 있는 환자의 자가조직 세포로부터 수득될 수 없는 면역-조절 효과를 제공할 수 있기 때문이다. 예를 들어, 전신, 주변 및/또는 신경적 염증을 치료하는 상황에서, 동종이계 MSCs는 상기 세포로부터 수득될 수 있는 EV가 예를 들어 대식세포 및/또는 호중구 표현형 스위칭 (각각 전-염증성 M1 또는 N1 표현형으로부터 항-염증성 M2 또는 N2 표현형까지)을 통해 면역-조절될 수 있기 때문에 바람직할 수 있다.
제1 양태에서, 본 발명은 융합 단백질을 포함하는 EV에 관한 것이고, 상기 융합 단백질은 엑소좀 폴리펩타이드에 융합된 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드를 포함한다. EV 단백질과 융합의 결과로서, Fc 결합 폴리펩타이드는 EV의 표면에서 높은 수로 표시되고 거기에 효율적으로 수송되어, 이는 다양한 유형의 Fc 함유 단백질, 전형적으로 Fc 도메인, 표적화 항체, 치료적 항체, 항체-약물 콘주게이트, 및/또는 (EV의 순환 시간을 연장시키기 위해) 면역 세포에 의한 인식 및 옵소닌화를 감소시키도록 고의로 선택되거나 생체내 수동적으로 결합되는 항체가 부여된 치료적 단백질로 EV의 후속적인 코팅을 가능하게 한다.
따라서, 한 구현예에서, 제1 양태에 따른 EV는 Fc 결합 폴리펩타이드와 복수의 Fc 함유 단백질의 Fc 도메인 사이의 상호작용을 통해 복수의 Fc 함유 단백질에 결합하였고, 상기 복수의 Fc 함유 단백질은 동일한 것 또는 상이한 것일 수 있다. EV는 Fc 결합제와 Fc 도메인을 포함하는 적어도 하나의 단백질 사이 비-공유 상호작용을 통해 Fc 도메인을 포함하는 복수의 단백질로 코팅될 수 있다. 상기 복수는 Fc 도메인을 포함하는 적어도 10, 적어도 20 또는 적어도 30 단백질일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, Fc 결합제는 비-인간 기원이고, 이들은 예를 들면 박테리아, 바이러스, 또는 비-인간 포유동물로부터 수득될 수 있다. 또 다른 구현예에서, Fc 결합제는 인간 또는 포유동물 기원이다. 바람직한 구현예에서, 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드는 단백질 A (비제한적인 예로서, 서열목록번호 77), 단백질 G (비제한적인 예로서, 서열목록번호 78), 단백질 A/G (비제한적인 예로서, 서열목록번호 72), Z 도메인 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 73), ZZ 도메인 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 74), 단백질 L (비제한적인 예로서, pdb id no 1HEZ), 단백질 LG, 인간 FCGRI (비제한적인 예로서, 서열목록번호 31), 인간 FCGR2A (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P12318), 인간FCGR2B (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P31994), 인간 FCGR2C (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P31994), 인간 FCGR3A (비제한적인 예로서, 수탁 번호 P08637), 인간 FCGR3B (비제한적인 예로서, 수탁 번호 O75015), 인간 FCGRB (비제한적인 예로서, 수탁 번호 Q92637) (비제한적인 예로서, 서열목록번호 32), 인간 FCAMR (비제한적인 예로서, 서열목록번호 28), 인간 FCERA (비제한적인 예로서, 서열목록번호 30), 인간 FCAR (비제한적인 예로서, 서열목록번호 29), 마우스 FCGRI (비제한적인 예로서, 서열목록번호 79), 마우스 FCGRIIB (비제한적인 예로서, 서열목록번호 80), 마우스 FCGRIII (비제한적인 예로서, 서열목록번호 81), 마우스 FCGRIV (비제한적인 예로서, 서열목록번호 82), 마우스 FCGRn (비제한적인 예로서, 서열목록번호 83), 및 상기 Fc 결합 폴리펩타이드의 임의의 것의 임의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다. 예를 들어, 파아지 표시 스크리닝으로부터 및 생물정보학을 통해 수득된 다른 적합한 Fc 결합 폴리펩타이드는 Fc 결합 펩타이드 SPH (비제한적인 예로서, 서열목록번호 57), SPA (비제한적인 예로서, 서열목록번호 58), SPG2 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 59), SpA 모방체 1 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 60), SpA 모방체 2 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 61), SpA 모방체 3 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 62), SpA 모방체 4 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 63), SpA 모방체 5 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 64), SpA 모방체 6 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 65), SpA 모방체 7 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 66), SpA 모방체 8 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 69), SpA 모방체 9 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 70), SpA 모방체 10 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 71), Feγ 모방체 1 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 67), 및 Feγ 모방체 2 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 68), 및 임의의 조합 또는 이의 유도체를 포함한다. 특별한 작제물을 위해 가장 적합한 Fc 결합 폴리펩타이드의 선택은 원하는 결합 특징, 친화성, 엑소좀 폴리펩타이드에 융합된 경우 Fc 결합 폴리펩타이드의 배향, 및 다양한 다른 인자에 따라 상당히 좌우된다.
단백질 A/G는 7개의 Fc-결합 도메인 EDABC-C1C3으로 구성된 재조합 유전자 조작된 단백질이며, 단백질 A 일부는 스타필로코쿠스 아우레스 분절 E, D, A, B 및 C로부터, 및 단백질 G 일부는 연쇄상구균 분절 C1 및 C3으로부터 수득된다. 유익하게는, 단백질 A/G (비제한적인 예로서, 서열목록번호 72)는 단백질 A (비제한적인 예로서, 서열목록번호 77) 또는 단백질 G (비제한적인 예로서, 서열목록번호 78) 단독보다 더 넓은 결합능을 가지며, 다양한 종으로부터의 항체에 대해 넓은 결합 친화도를 갖는다. 단백질 A/G는 다양한 인간, 마우스 및 랫트 IgG 서브클래스, 예컨대 인간 IgG1, IgG2, IgG3, IgG4; 마우스 IgG2a, IgG2b, IgG3 및 랫트 IgG2a, IgG2c에 결합된다. 또한, 단백질 A/G는 소, 염소, 양, 말, 토끼, 기니아 피그, 돼지, 개 및 고양이로부터의 총 IgG에 결합된다. 단백질 A/G는 관심있는 단백질의 Fc 도메인에 강하게 결합될 수 있도록 세포벽-결합 영역, 세포막-결합 영역 및 알부민-결합 영역을 제거하도록 조작되었다. 따라서, 본 발명에 따르는 유리한 구현예에서, Fc 결합제는 단백질 A, 단백질 G, 및 단백질 A/G와의 경우와 같이, 1개 초과의 Fc 결합 영역을 포함한다. 대안적인 구현예에서, Fc 결합제는 여러배로 하여 관심있는 항체의 1개 초과 복사체에 결합될 수 있도록 한다. 예를 들어, 짧은 Z 도메인 Fc 결합제는 1개 초과의 Fc 도메인에 대한 결합을 허용하도록 작동 연결을 통해, 1개 초과의 복사체중 융합 단백질에 포함될 수 있다. 이 방법은 별개의 융합 단백질 뿐만 아니라 1개의 단일 융합 단백질 내에서 항체 및 다른 Fc 도메인-함유 단백질을 다중화할 수 있고, 이에 따라 1개 초과의 항체를 결합할 수 있다. 예를 들어, Fc 결합 폴리펩타이드가 테트라스파닌 계열 (예컨대 CD63)에 속하는 EV 단백질로 도입되는 경우, 1개의 루프 위 1개의 Fc 결합제 및 단백질의 또 다른 루프의 또 다른 Fc 결합제 (이는 동일하거나 상이할 수 있다)를 삽입하는 것이 유리할 수 있다. Fc 결합제는 Fc 함유 단백질이 EV의 내강으로 또는 EV 표면 위로 장입됨을 의미하는지에 따라, 내측-배향 및/또는 외측-배향 루프로 배치될 수 있다. 본 발명에 따르는 융합 단백질의 일부 비-제한적인 예는 다음과 같이 개략적으로 기재될 수 있다 (하기의 표기법은 임의의 C 및/또는 N 말단 방향을 예시하는 것으로 간주되어서는 안되고, 단지 예시적 목적을 의미한다):
엑소좀 폴리펩타이드 - Fc 결합 폴리펩타이드 - Fc 결합 폴리펩타이드
엑소좀 폴리펩타이드 도메인 - Fc 결합 폴리펩타이드 - 엑소좀 폴리펩타이드 도메인 - Fc 결합 폴리펩타이드
엑소좀 폴리펩타이드 도메인 - Fc 결합 폴리펩타이드 A - 엑소좀 폴리펩타이드 도메인 - Fc 결합 폴리펩타이드 B
일부 구현예에서, 엑소좀 폴리펩타이드 및 Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질은 또한 추가의 폴리펩타이드, 폴리펩타이드 도메인 또는 서열을 함유할 수 있다. 이러한 추가의 폴리펩타이드 도메인은 다양한 기능을 나타낼 수 있다, 예를 들어 상기 도메인은 다양한 다른 기능뿐만 아니라, (i) 융합 단백질의 EV 표면 표시를 향상시키는데 기여하고, (ii) 융합 단백질의 클러스터링(clustering)을 유도함으로써 Fc 결합 폴리펩타이드의 결합능을 증가시키고, (iii) 엑소좀 폴리펩타이드와 Fc 결합 폴리펩타이드 사이의 상호작용을 최적화하기 위한 링커로서 기능하고/하거나, (iv) EV 막에 고착을 개선시킬 수 있다. 사전설정 발명의 융합 단백질에서 부분적으로 또는 전체적으로 유용하게 포함될 수 있는 2개의 이러한 추가의 폴리펩타이드는 gp130 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 18) 및 종양 괴사 인자 수용체 1 (TNFR1) (비제한적인 예로서, 서열목록번호 19)이다. 특히, 이들 추가의 폴리펩타이드의 막관통 도메인은 EV 막으로의 삽입 및 Fc 결합 폴리펩타이드의 표시를 최적화하는데 상당히 유용할 수 있다. 전반적으로, 다양한 막관통 도메인은 융합 단백질에서 추가의 도메인으로서 상당히 유리할 수 있다. 예를 들어, 엑소좀 단백질 신테닌을 사용하는 경우에, 신테닌과 융합 단백질의 Fc 결합 폴리펩타이드 사이에, TNFR의 막관통 도메인 및 gp130의 막관통 도메인과 같은, 추가의 폴리펩타이드 도메인을 삽입하는 것이 상당히 유리하다. 또한, 추가의 도메인은 다량체화 도메인, 예컨대 폴드-온(fold-on) 도메인, 류신 지퍼 도메인 및/또는 삼량체화 도메인을 포함하여, 표면 표시 및/또는 결합능을 증가시킬 수 있다. 이것의 비제한적인 도시적 예는 하기에 제시되어 있다:
신테닌 - 세포질TNRF - 폴드온 삼량체화 도메인 - 막관통TNFR 도메인 - Z 도메인 - 세포외TNFR 도메인
신데칸 - 류신 지퍼 도메인 - gp130세포질 도메인 - gp130 막관통 도메인 - Fc 결합 폴리펩타이드 - gp130 세포외 도메인
추가 구현예에서, 엑소좀 폴리펩타이드는 CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, 신테닌-1 , 신테닌-2, Lamp2b, TSPAN8, 신데칸-1, 신데칸-2, 신데칸-3, 신데칸-4, TSPAN14, CD37, CD82 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 24), CD151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, Fc 수용체, 인터류킨 수용체, 면역글로불린, MHC-I 또는 MHC-II 성분, CD2, CD3 엡실론, CD3 제타, CD13, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD111, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA-DM, HSPG2, L1CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 알파, Mac-1 베타, MFGE8 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 25), SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A, VTI1B, 다른 엑소좀 폴리펩타이드, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명에 따르는 특히 유리한 융합 단백질은 하기 Fc 결합 폴리펩타이드의 복사체중 적어도 하나에 융합된, 인간 엑소좀 단백질 CD63, CD81, CD9, CD71 (트랜스페린 수용체), Lamp2, 및 신테닌을 포함할 수 있다: Z 도메인, 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, FCGRI, 인간 FCGR2A, 인간 FCGR2B, 인간 FCGR2C, 인간 FCGR3A, 인간 FCGR3B, 인간 FCGR3C, 인간 FCAMR, 인간 FCAR, 및 인간 FCERA. 구체적으로, EV 단백질 CD63 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 3)에 대한 2개의 Z 도메인의 융합은 작은 크기의 Z 도메인 및 CD63의 높은 EV 표면 발현의 결과로서, EV 표면에 높은 양으로 표시되는 상당히 효능있는 Fc 결합제를 생성하게 된다. EV 외부 표면에 Fc 결합제의 표시는 자연적으로 관심있는 Fc 도메인-함유 단백질의 외인성 결합을 가능하게 하는데 바람직하다. CD63-ZZ 도메인 융합 단백질의 경우에, Z 도메인은 CD63의 제1 및 제2 루프로 삽입되어, CD63이 EV 막으로 고정된 후 외부 EV 표면에 표시될 수 있도록 할 수 있다. 게다가, 상기-언급된 바와 같이, 적합한 추가의 폴리펩타이드 및 폴리펩타이드 도메인 및 링커 또한, 융합 단백질에 포함될 수 있는데, 이는 통상 엑소좀 폴리펩타이드 및 Fc 결합 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 추가의 폴리펩타이드는 다양한 사이토카인 수용체, 예컨대 TNFR1 및 TNFR2, IL6 신호 변환체 gp130, 및 다양한 다른 사이토카인과 사이토카인-관련된 폴리펩타이드로부터의 도메인을 포함한다. 특정 사례에서, 사이토카인 및 사이토카인-관련된 폴리펩타이드 (예컨대 다양한 사이토카인 수용체)는 단독으로 Fc 결합 폴리펩타이드를 EV로 운송할 수 있다. 특별한 유용성의 링커는 작고 가요성인 아미노산, 예컨대 전형적으로 GS로 표시되는, 글리신 (G) 및 세린 (S)의 다중 및/또는 조합, 예를 들어 2XGS 또는 4XGS이다. 정제 및 검정을 간소화하기 위한 His 태그가 또한, C 말단 및 N 말단에 모두 부가될 수 있고, 또한 다양한 형광 단백질 예컨대 GFP일 수 있다. 다음은 종종 링커를 통해 연결되고 선택적으로 추가의 폴리펩타이드 또는 폴리펩타이드 도메인을 포함하며, 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드(들)를 포함하는 융합 단백질의 특히 유용한 비-제한적 예이다:
ㆍ CD81 -단백질 A/G CD81 제2 루프 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 75)
ㆍ CD9-ZZ 도메인 CD9 제2 루프 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 76)
ㆍ FCAR 세포외 도메인-2XGGGgS링커-Lamp2b (비제한적인 예로서, 서열목록번호 55)
ㆍ FCAR 세포외 도메인-4XGS링커-Lamp2b (비제한적인 예로서, 서열목록번호 54)
ㆍ FCGR1A 세포외 도메인-2XGGGgS링커-Lamp2b (비제한적인 예로서, 서열목록번호 49)
ㆍ FCGR1A 세포외 도메인-4XGS링커-Lamp2b (비제한적인 예로서, 서열목록번호 48)
ㆍ FcRN 세포외 도메인-4XGS링커-Lamp2b (비제한적인 예로서, 서열목록번호 39)
ㆍ FcRN-2XGGGgS링커-Lamp2b (비제한적인 예로서, 서열목록번호 40).
ㆍ Gp130 세포외 도메인-2XGGGGS 링커-FCAR 세포외 도메인-Gp130 막관통 도메인-류신 지퍼-N 말단 신테닌 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 52)
ㆍ Gp130 세포외 도메인-2XGGGGS 링커-FCGRIA 세포외 도메인-Gp130 막관통 도메인-류신 지퍼-N 말단 신테닌 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 46)
ㆍ Gp130 세포외 도메인-2XGGGGS 링커-FcRN 세포외 도메인-Gp130 막관통 도메인-류신 지퍼-N 말단 신테닌 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 43)
ㆍ Gp130 세포외 도메인-2XGGGGS 링커-Z 도메인-Gp130 막관통 도메인-류신 지퍼-N 말단 신테닌 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 34)
ㆍ 트랜스페린 수용체-2XGGGGS링커-FCAR 세포외 도메인 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 56)
ㆍ 트랜스페린 수용체-2XGGGGS링커-FCGR1A 세포외 도메인 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 50)
ㆍ 트랜스페린 수용체-2XGGGGS링커-FcRN 세포외 도메인 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 41)
ㆍ 트랜스페린 수용체-2XGGGGS링커-Z 도메인 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 38)
ㆍ CD63-FCAR 세포외 도메인 CD63 제1 루프 및 CD63 제2 루프 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 53)
ㆍ CD63-FCGR1A 세포외 도메인 CD63 제1 루프 및 CD63 제2 루프 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 47)
ㆍ CD63-FcRN 세포외 도메인 CD63 제1 루프 및 CD63 제2 루프 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 44)
ㆍ CD63-Z 도메인 CD63 제1 루프 및 CD63 제2 루프 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 35)
ㆍ TNFR 세포외 도메인-2XGGGGS 링커-FCAR 세포외 도메인-TNFR 막관통 도메인-폴드온-N 말단 신테닌 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 51)
ㆍ TNFR 세포외 도메인-2XGGGGS 링커-FCGRIA 세포외 도메인-TNFR 막관통 도메인-폴드온-N 말단 신테닌 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 45)
ㆍ TNFR 세포외 도메인-2XGGGGS 링커-FcRN 세포외 도메인-TNFR 막관통 도메인-폴드온-N 말단 신테닌 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 42)
ㆍ TNFR 세포외 도메인-2XGGGGS 링커-Z 도메인-TNFR 막관통 도메인-폴드온-N 말단 신테닌 (비제한적인 예로서, 서열목록번호 33)
ㆍ Z 도메인-2XGGGgS링커-Lamp2b (비제한적인 예로서, 서열목록번호 37)
ㆍ Z 도메인-4XGS링커-Lamp2b (비제한적인 예로서, 서열목록번호 36)
ㆍ 트랜스페린 수용체 - 단백질 AG (비제한적인 예로서 서열목록번호 72에 작동가능하게 융합된 비제한적인 예로서, 서열목록번호 10)
상기-언급된 융합 단백질은 단지 본 발명이 허용하는 많은 공학기술 가능성의 예이며, 또한 그들은 단지 본 발명의 비제한적인 구현예이다. 본 발명에 따르는 융합 단백질의 모든 성분은 자유롭게 조합될 수 있다, 예를 들어 융합 단백질은 C 말단, N 말단, 또는 둘 모두, 또는 융합 단백질의 어디든지에 배치될 수 있는 1개 또는 몇 개의 엑소좀 폴리펩타이드를 함유할 수 있다. 추가로, 융합 단백질은 또한 1개 또는 몇 개의 Fc 결합 폴리펩타이드를 함유할 수 있고, 이는 C 말단, N 말단, 또는 둘 모두, 또는 예를 들어 막관통 부분의 임의 루프중 하나 이상, 또는 융합 단백질의 어디든지에 배치될 수 있다. 명백하게 하기 위해, 1개 초과 유형의 엑소좀 폴리펩타이드 및 1개 초과 유형의 Fc 결합 폴리펩타이드가 단일 작제물에 포함될 수 있다. 게다가, 아미노산 예컨대 링커 (종종 아미노산 글리신 및 세린을 포함함) 및 His 태그의 추가의 스트레치(stretches)가 정제, 검정 및 가시화를 간소화하기 위해 포함될 수 있다. 또한, 다른 펩타이드 및 폴리펩타이드 도메인 또한, 융합 단백질 서열의 어디든지에 포함될 수 있다. 예를 들어, 다양한 사이토카인 수용체로부터의 다양한 도메인 및 영역, 예를 들어 TNFR1, TNFR2, IL17R, IL23R, gp130, IL6R, 등의 다양한 도메인이 유익하게 포함될 수 있다.
추가 구현예에서, Fc 결합 폴리펩타이드는 상기-언급된 바와 같이 Fc 도메 인을 포함한 임의의 단백질, 항체 뿐만 아니라 Fc 도메인을 포함하는 다른 단백질, 자연 발생 및 조작된 Fc 도메인-함유 단백질, 예컨대 상기 몇 개의 사례로 언급된 것들에 결합된다. 유익하게는, 본 발명은 Fc 결합 폴리펩타이드와 적어도 하나의 Fc 함유 단백질 사이에 상호작용을 통한, Fc 도메인을 포함하는 복수의 단백질로 코팅된 EV를 생성한다. Fc 결합제 및 Fc 함유 단백질 간의 상호작용은 통상 Fc 결합 폴리펩타이드 및 Fc 함유 단백질의 Fc 도메인 간에 비-공유결합을 기반으로 한다. 자연적으로, 1개의 단일 EV는 1개 초과 유형의 Fc 도메인-함유 단백질로 코팅시킬 수 있다. 하나의 비-제한적인 예로, Fc 결합 EV는 PD1 축을 따라 적합한 표적을 표적화하는 하나의 항체로 코팅시키는 반면에, 다른 항체는 CTLA4 축을 따라 적합한 표적을 표적화한다. 또 다른 비-제한 예에서, Fc 결합 EV는 Fc 도메인에 융합된 Cas9 및 종양 세포 표면 수용체를 표적하는 항체로 코팅된다. 하나의 단일 EV는 또한, 전형적으로 흔히 그렇듯이, Fc 도메인-함유 단백질의 하나의 단일 유형, 예컨대 단클론성 항체의 하나의 유형의 실질적인 복수를 포함할 수 있다. 표적화 항체, 치료적 항체, 관심의 Fc 함유 비-항체 치료적 단백질, 항체-약물 콘주게이트 (ADCs), 및 옵소닌화 및/또는 면역 세포-매개 청소능 감소용 항체의 다양한 조합은 본 발명의 바람직한 구현예를 구성한다. 유리한 구현예에서, 본 발명에 다른 EV는 Fc 도메인을 포함하는 복수의 단백질로 코팅된다. 예를 들어, 고도로 발현된 EV 단백질 예컨대 CD63 또는 CD81 또는 syntenin을 사용하는 경우 EV의 표면의 매우 치밀한 코팅을 달성할 수 있다. 따라서, 본 발명은 Fc 도메인을 포함하는 적어도 10 단백질, 바람직하게는 Fc 도메인을 포함하는 적어도 20 단백질, 더욱 더 바람직하게는 Fc 도메인을 포함하는 적어도 30 단백질로 코팅될 수 있다. 그와 같은 단백질은 동일한 단백질 (예를 들면 하나의 EV를 코팅하는 50 에타너셉트 분자, 예로써) 또는 1 초과 단백질 (예를 들면 하나의 EV를 코팅하는 30 에타너셉트 분자 및 30 gp130-Fc 도메인 융합 단백질, 예로써)의 카피일 수 있다. EV 단백질 및 Fc 결합제의 최적의 조합 선택에 의해 표시를 증가시키는 것이 가능할 수 있고 추가로, 특정 경우에 Fc 도메인을 포함하는 50 초과 단백질, 또는 심지어 Fc 도메인을 포함하는 대략 75 초과 단백질로 EV를 코팅하는 것이 가능할 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 또한 표시 폴리펩타이드와 Fc 결합 폴리펩타이드 사이 융합 단백질을 포함하는 세포에 관한 것이다. 표시 폴리펩타이드는 전형적으로 막관통 단백질일 수 있다. 다양한 엑소좀 폴리펩타이드는 이러한 목적을 위해 사용될 수 있고, 관심의 Fc 함유 단백질이 세포 내부에서 존재 또는 세포의 표면에서 표시되는 중인지 여부에 의존하여, 세포 막의 외부 또는 내부에서 표시용 세포 막에 Fc 결합 폴리펩타이드를 수송할 수 있는, 규칙적 세포 막관통 단백질 예컨대 T 세포 수용체 막관통 도메인, 인터류킨 수용체, 트랜스페린 수용체, 스탄닌, 사르콜리핀, 포스폴람반, 및 다양한 다른 막 단백질 예컨대 채널 및 동반수송체/수입체도 그럴 수 있다. 바람직한 구현예에서, Fc 함유 단백질은 항체이고 세포는 세포 요법을 위하여 의도된 세포, 예컨대 키메라성 항원 수용체 (CAR) T 세포이다. 이러한 접근법을 사용하여, 세포는 관심의 특정 조직에 표적화될 수 있고, CAR-T 세포의 경우에 관심의 조직은 종양 조직이 될 것 같다. 면역-조절 세포 예컨대 MSC의 경우에, 관심의 조직은 염증 및/또는 손상의 부위가 될 것 같다. 본 명세서에서 모든 항체 및 다른 Fc 함유 단백질은 EV에 대하여와 동일한 이유로 세포상에 표시됨에 동등하게 적합하다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 엑소좀 폴리펩타이드 및 (ii) Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질과, Fc 도메인을 포함하는 단백질 사이 형성된 복합체에 관한 것이다. 본 발명에 따라 EV는 따라서 전형적으로 복수의 그와 같은 복합체를 포함하고, 예를 들어 입체 장애에 관한 사안 없이 EV에서 표시된 그와 같은 복합체의 수가 전형적으로 더 높을수록 EV가 치료적 및/또는 표적화 관점으로부터 더 강해진다. 그와 같은 융합 단백질-Fc 함유 단백질 복합체는 전형적으로, 엑소좀 막에 수송 및 고착을 매개하는 엑소좀 단백질의 존재의 덕택에, EV의 지질 막에서 존재한다. 그러나, 복합체는 또한 다른 지질 막, 예를 들어 세포 막 또는 세포 소기관의 막에서 존재할 수 있다. 본 발명에 따라 EV는 또한 Fc 함유 단백질을 가진 나노입자 복합체의 한 유형을 형성한다. 전형적으로, 상기-언급된 바와 같이, Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 각각의 EV는 복수의 Fc 함유 단백질에 결합하고, 이는 코팅되는 (장식되는) EV를 초래하고/하거나 관심의 복수의 Fc 함유 단백질을 함유한다. 이것의 예는 그와 같은 항체로 인큐베이션을 통해 항체에 결합하도록 허용되는 Fc-결합 EV가 그것의 표면에서 EV당 복수의 항체, 예를 들면 적어도 10 항체로, 또는 더 자주 EV당 적어도 20 또는 30 항체로 장식된다. 따라서, 이러한 EV-항체 복합체는 표적화, 요법, 및 세포내 전달에 대하여 상당한 유용성을 가진 나노입자 복합체의 한 유형을 구성한다.
중요하게는, 본 발명은 또한 내인성 방식으로 EV에 Fc 함유 단백질의 장입 방법을 제공한다. 그와 같은 내인성 장입 방법은 (i) 엑소좀 폴리펩타이드 및 Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질, 및 (ii) Fc 도메인을 포함하는 관심의 단백질의 EV-생산 세포에서 공-발현을 포함한다. Fc 결합 도메인에 융합된 엑소좀 폴리펩타이드는 EV-생산 세포에서 EV에 융합 단백질의 활성 분류를 가능하게하고, Fc 결합 단백질의 존재는 융합 단백질이 EV에 Fc 함유 단백질을 따라 끌어내 (수송하)도록 한다. 상기-언급된 바와 같이, 다양한 엑소좀 단백질은 EV에 융합 단백질을 분류하는데 사용될 수 있고 특히 내인성 장입의 경우에 단백질의 선택은 고도로 중요하다. 가용성 EV 단백질 예컨대 Alix 및 syntenin은 상기 표적 환경에서 가용성이도록 의미되는 Fc 함유 단백질, 예컨대 바람직하게는 표적 세포 내부에서 가용성인 Cas9의 장입에 적합할 수 있다. 그러나, Fc 함유 단백질의 내인성 장입은 또한 막관통 및/또는 막-관련 EV 단백질 예컨대 CD9, CD81, CD63, 등으로 달성될 수 있다. 내인성 장입을 위하여 막-결합 엑소좀 단백질을 이용하는 경우 Fc 결합 폴리펩타이드는 소포외 측에서와는 대조적으로 EV 막의 내강에서 루프상에 대신 배치되어, 소포외 장입과는 대조적으로 내강을 가능하게 한다. 본 발명에 따라 EV는 따라서 정상적으로, 어느 한쪽 내부에서 또는 외부에서 EV 막에서 고정된 또는 막과 관련된, 또는 EV에서 내강으로 본질적으로 가용성 형태로, 복수의 그와 같은 융합 단백질-Fc 도메인-함유 단백질 복합체를 포함한다 ("복수"는 동일한 Fc 도메인-함유 단백질 또는 몇 개의 상이한 Fc 도메인 함유 단백질의 다중 카피에 관한 것으로 이해될 수 있다).
추가 양태에서, 본 발명은 Fc 도메인을 포함하는 단백질, 예컨대 Fc 도메인을 포함하도록 조작된 항체 및 단백질에 결합할 수 있는 EV의 생산 방법에 관한 것이다. 그와 같은 방법은 전형적으로 (i) 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드 작제물을 EV 공급원 세포에 도입하는 단계, 및 (ii) EV-생산 공급원 세포에 의해 분비된 EV를 수집하는 단계를 포함하고, 상기 EV는 폴리뉴클레오타이드 작제물로부터 발현된 융합 단백질을 포함한다. 후속적인 단계에서, 융합 단백질을 포함하는 EV는 적합한 정제 기술을 사용하여 정제될 수 있고, 이어서 Fc 도메인-함유 단백질, 예컨대 항체에 노출될 수 있어서, 관심의 단백질의 Fc 도메인과 Fc 결합 폴리펩타이드 사이의 상호작용을 통해 Fc 함유 단백질의 결합을 가능하게 한다. 상기-언급된 바와 같이, 대안적 구현예에서, 단계 (i)은 또한 동일한 EV 공급원 세포내 폴리뉴클레오타이드 작제물로부터 관심의 Fc 함유 단백질을 발현시켜, 그렇게 함으로써 EV의 내인성 장입을 달성시키는 것을 포함할 수 있다. (엑소좀 폴리펩타이드와 Fc 결합 폴리펩타이드 사이) 융합 단백질 그리고 Fc 함유 단백질은, 작제물 디자인에 의존하여, 동일한 또는 상이한 폴리뉴클레오타이드 작제물로부터 발현될 수 있다.
더욱 또 다른 양태에서, 본 발명은 EV에 Fc 도메인, 예컨대 항체를 포함하는 적어도 하나의 단백질의 부착 방법에 관한 것이다. 한 구현예에서, 상기 방법은 Fc 도메인을 포함하는 상기 적어도 하나의 단백질로 EV를 코팅하기 위한 것이다. 그와 같은 방법은 (i) 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드에 융합된 적어도 하나의 Fc 결합 단백질을 포함하는 융합 단백질을 포함하는 EV를 제공하는 단계, 및 (ii) 융합 단백질의 Fc 결합 단백질이 Fc 도메인을 포함하는 적어도 하나의 단백질의 Fc 도메인을 결합시키게 하는 단계를 포함한다. 본 발명에 따라 융합 단백질을 포함하는 EV의 생산을 위하여 사용된 EV 공급원 세포는 융합 단백질-Fc 함유 단백질 복합체를 담지하는 EV를 생성하기 위해 필요한 폴리뉴클레오타이드 작제물로 어느 한쪽 안정적으로 또는 일시적으로 형질감염될 수 있다. 안정한 형질감염은 마스터 세포 은행 (MCBs) 및 작업 세포 은행 (WCBs)의 창출을 가능하게 함에 따라 유리하다.
그러나, 일과성 형질감염은 특정 사례에서, 예를 들어 상이한 작제물을 사정하는 경우 또는 예를 들면 환자의 자체 EV-생산 세포로부터 수득된 EV를 포함하는 자가조직 요법을 빠르게 창출하는 경우 또한 유리하다.
추가 양태에서, 본 발명은, 어느 한쪽 생체외, 시험관내 또는 생체내, 표적 세포의 세포내 환경에 관심의 단백질의 전달 방법에 관한 것이다. 그와 같은 방법은 (i) 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 EV를 제공하는 단계, (ii) EV에서 포함된 Fc 결합 폴리펩타이드와 Fc 함유 단백질의 Fc 도메인 사이 결합을 가능하게 하기 위해, Fc 함유 단백질과 접촉하여 Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 EV를 배치하는 단계, 및 (iii) 표적 세포(들)과 접촉하여 EV와 Fc 함유 단백질(들) 사이 형성된 복합체 (즉 Fc 결합 폴리펩타이드와 Fc 도메인 사이의 상호작용을 통해 그것에 부착된 적어도 하나의 Fc 함유 단백질을 갖는 EV)를 배치하는 단계를 포함한다. 바람직한 구현예에서, Fc 결합 폴리펩타이드는 적어도 한 엑소좀 폴리펩타이드와 함께, 그러나 임의로 다른 폴리펩타이드 및 도메인도 또한 융합 단백질에서 포함된다. 표적 세포에 내재화하는 EV의 특유의 능력으로 인해, Fc 함유 단백질은 또한 내재화될 것이다. 이것은 매우 유리하고 사실상 임의의 단백질-기반 치료법의 전달을 위하여 세포내 공간을 개방시킨다. 상기-언급된 바와 같이, Fc 함유 단백질의 EV-매개된 내재화는 양쪽 생체내 및 생체외 발생하고, 이들 방법은 따라서 요법 개발을 위하여 그러나 또한 연구 및 진단 목적을 위하여 상당한 충격을 가질 수 있다.
추가 양태에서, 본 발명은 항체 및 관심있는 다른 Fc 도메인 함유 단백질을 위한 전달 비히클로서의 EV의 용도에 관한 것이다. 게다가, 본 발명은 또한 다른 관심있는 치료제를 위한 전달 비히클로서의 Fc 함유 단백질에 부차된 EV의 용도를 위해 제공된다. 비-제한적 예로서, 그들의 표면에 표적화 항체가 부착된 EV는 또한 EV의 내부에 및/또는 EV 막에 존재할 수 있는 추가의 치료제를 함유할 수 있다. 예를 들어, 항체-코팅된 EV는 표적 세포, 조직 및/또는 장기로 RNA 치료제 전달대상물 (예컨대 mRNA, siRNA, 올리고뉴클레오타이드 등)을 전달하는데 사용될 수 있다. 다른 비-제한적인 예로, 그것의 표면에 Fc 함유 표적화 단백질 (예컨대, Fc 도메인을 함유하도록 조작된 scFv)이 부착되어 있고, 선택적으로 CRISPR RNA 유도 가닥과 함께, EV 내부에 또는 EV 막 내부/위에 치료적 단백질, 예컨대 유전자 교정을 위한 Cas9를 포함하는 EV가 있다.
추가 양태에서, 본 발명의 방법은 또한, 생성된 EV의 수율 또는 특성에 영향을 주기 위해, EV 공급원 세포를 혈청 기아, 저산소증, 바필로마이신, 또는 사이토카인 예컨대 TNF-알파 및/또는 IFN-감마에 노출시키는 단계를 포함할 수 있다. EV 생산 규모 및 타임라인은 EV-생산 세포 또는 세포주에 따라 상당히 의존적일 것이고, 이에 따라 당해 분야의 숙련가는 상응하게 적응할 것이다. 본 발명에 따르는 방법은 추가로 EV 정제 단계를 포함할 수 있고, 이는 EV에 부착된 (예를 들면, 코팅된) Fc 도메인-함유 단백질 (예: 항체)과 융합 단백질을 포함하는 EV를 공-인큐베이팅시키기 전에 수행할 수 있다. EV는 액체 크로마토그래피 (LC), 고-성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 비드-용출물 크로마토그래피, 스핀 여과, 접선 유동 여과 (TFF), 중공 섬유 여과, 원심분리, 면역침강, 유동장 분별화, 투석, 미세유체-기반 분리 등, 또는 이들의 임의 조합을 포함하는 기술 군으로부터 선택된 절차를 통해 정제시킬 수 있다. 유리한 구현예에서, EV의 정제는 여과 (바람직하게는 한외여과 (UF), 접선 유동 여과 또는 중공 섬유 여과) 및 크기 배제 액체 크로마토그래피 (LC) 또는 비드-용출물 크로마토그래피의 순차적 조합을 사용하여 수행한다. 이러한 정제 단계 조합은 최적화된 정제를 일으키고, 이는 차례로 우수한 치료 활성을 유도한다. 또한, 엑소좀 정제에 일상적으로 이용되는 초원심분리 (UC)에 비하여, 순차적인 여과-크로마토그래피는 상당히 더 빠르고, 선행기술을 주도하는 현행 UC 방법론의 상당한 단점인, 더 높은 제조 용적에 대한 규모까지 가능하다. 또 다른 유리한 정제 방법론은 접선 유동 여과 (TFF)로, 이는 확장성 및 순도를 제공하고, 임의의 다른 유형의 정제 기술과 조합될 수 있다.
더욱 또 다른 양태에서, 본 발명은, 본 발명에 따라, 정상적으로 EV의 모집단의 형태로, EV를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 전형적으로, 본 발명에 따른 약제학적 조성물은 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제로 제형화된 치료적 EV의 하나의 유형 (즉 융합 단백질의 특정 유형을 포함하는 그리고 Fc 함유 단백질, 예컨대 항체; Cas9-Fc 융합 단백질 및 Fc-RNP 융합 복합체; Fc 도메인에 융합된 리소좀 축적 장애 효소, 등의 하나 이상의 유형에 의해 코팅되는 EV의 모집단)을 포함한다. 그러나, EV 모집단의 1 초과 유형은 단일 약제학적 조성물에서, 예를 들어 조합 항체가 바람직한 사례에서 천연적으로 포함될 수 있다. 천연적으로 그러나, 상기-언급된 바와 같이, 단일 EV 또는 EV의 단일 모집단은 EV 표면에 결합된 1 초과 Fc-함유 단백질 (예를 들면 항체)를 포함할 수 있다. 적어도 하나의 약제학적으로 허용가능한 부형제는, 바디의 하나의 장기, 또는 부분부터 바디의 또 다른 장기, 또는 부분까지 (예를 들면 혈액부터 관심의 임의의 조직 및/또는 장기 및/또는 몸체부까지) EV 모집단의 유예, 상기의 활성 유지 또는 상기의 담지 또는 수송에서 예를 들면 관여될 수 있는, 임의의 약제학적으로 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 고체 또는 액체 충전제, 희석제, 부형제, 담체, 용매 또는 캡슐화 물질을 포함하는 군으로부터 선택될 수 있다.
본 발명은 또한 EV의 미용 응용에 관한 것이다. 따라서, 본 발명은, 증상 및 문제 예컨대 건조 피부, 주름, 오목부, 볼록부, 및/또는 피부 주름을 개선 및/또는 경감시키기 위해, 적합한 EV를 포함하는, 피부 케어 제품 예컨대 크림, 로션, 겔, 에멀젼, 연고, 페이스트, 분말, 도찰제, 햇볕차단제, 샴푸, 등에 관한 것일 수 있다. 하나의 구현예에서, (예를 들면 관심의 항체에 결합된 융합 단백질을 담지하는) EV는 주름, 라인, 오목부, 볼록부 및/또는 피부 주름의 미용적 또는 치료적 경감에서 사용을 위하여 미용 크림, 로션, 또는 겔에서 포함되는 재생 특성을 가진 적합한 EV-생산 세포 공급원 (예를 들어 MSC)로부터 수득된다.
더욱 또 다른 양태에서, 본 발명은 의약에서 사용을 위하여 본 발명에 따른 EV에 관한 것이다. 천연적으로, 관심의 단백질 (예컨대 항체)의 Fc 도메인에 결합된 융합 단백질을 포함하는 EV가 의약에서 사용되는 경우, 사실상 정상적으로 사용되고 있는 EV의 모집단이다. 환자에게 투여된 EV의 용량은 EV 표면에서 코팅된 관심의 예를 들면 항체의 수, 치료되는 또는 경감되는 질환 또는 증상, 투여 경로, 치료적 단백질 자체의 약리 작용, EV의 고유한 특성, 임의의 표적화 항체 또는 다른 표적화 독립체의 존재, 뿐만 아니라 숙련된 사람에 공지된 관련성의 다양한 다른 파라미터에 의존할 것이다.
Fc 함유 단백질을 운반하는 본 발명의 EV는 몇 개의 상이한 치료적 및 약제학적 양태를 위해 사용될 수 있다. 일 구현예에서, EV는 항체 또는 특정 세포 유형, 조직 및/또는 장기를 표적으로 하는 다른 Fc 함유 단백질로 도포된다. 이것은 Fc 함유 단백질 이외에, 약제를 포함할 수 있는, EV를 관심있는 조직으로 표적화하는 고도로 강력한 방법이고, 표적화 약물 전달에서 단계 가능성(step chance)을 나타낼 수 있다. 또 다른 구현예에서, 관심있는 표적 항원과 상호작용하는 치료 항체 또는 다른 Fc 도메인-함유 단백질은 생물학적 장벽을 넘는 능력을 갖는 EV를 사용하여, 전형적으로 연구하기 어려운 관심있는 조직으로 효율적으로 전달할 수 있다. 이러한 접근법은 예를 들어 중추신경계 또는 뇌로 단클론성 항체의 전달을 가능하게 할 수 있다. 또 다른 구현예에서, Fc 함유 단백질에 의한 EV의 코팅은 관심있는 표적에 대한 그것의 표적 결합능 또는 그것의 결합 형태를 향상시키거나 영향을 주기 위하여, 관심있는 Fc 함유 단백질을 다중화하는 방법이다. 또 다른 구현예에서, 본 발명에 따르는 EV는 ADCs의 다중화가 그것의 치료적 효능을 상당히 향상시킬 수 있기 때문에, 항체-약물 콘주게이트 (ADCs) 또는 수용체-약물 콘주게이트의 전달 및 효능을 개선시킬 수 있고, EV 상에 그것의 존재는 그들이 표적 세포로 또한 들어갈 수 있음을 의미한다. 추가 구현예에서, 표적 세포에 들어가는 EV의 능력은 본 발명의 EV가 전체 세포내 공간을 개방하고, 본질적으로 Fc 도메인을 포함하는 임의 단백질 및/또는 Fc 도메인이 융합될 수 있는 임의 단백질 (예컨대 효소 대체 요법을 위한 효소, 뉴클레아제 예컨대 Cas9, 또는 종양 억제인자 예컨대 p53, pVHL, APC, CD95, ST5, YPEL3, ST7, 및 ST14중 임의의 것)에 의해 그것을 의약품이 될만하게 만듬을 의미한다.
따라서, 본 발명에 따르는 EV 및 이의 EV 모집단은, 예를 들어 다양한 질환 및 장애의 예방 및/또는 치료 및/또는 경감에 사용하기 위해, 예방적 및/또는 치료적 목적을 위해 사용될 수 있다. 본 발명에 따르는 EV가 적용될 수 있는 질환의 비제한적인 샘플은 크론병, 궤양성 대장염, 강직 척추염, 류마티스성 관절염, 다발성 경화증, 전신 홍반성 낭창, 유육종증, 특발성 폐 섬유증, 건선, 종양 괴사 인자 (TNF) 수용체-관련된 주기적 증후군 (TRAPS), 인터류킨-1 수용체 길항제 결핍 (DIRA), 자궁내막증, 자가면역 간염, 경피증, 근염, 뇌졸중, 급성 척수 손상, 혈관염, 길랑-바레 증후군, 급성 심근경색증, ARDS, 패혈증, 수막염, 뇌염, 간부전, 비-알코올성 지방간염 (NASH), 비-알코올성 지방 간 질환 (NAFLD), 신부전, 심부전 또는 임의의 급성 또는 만성 장기 부전 및 관련된 기저 병인, 이식편대숙주(raft-vs-host) 질환, 뒤센 근육 이상증 및 다른 근육 이영양증, 리소좀 축적 질환 예컨대 고셔병, 파브리 질환, MPS I, II (헌터 증후군), 및 III, 니만-피크병, 폼페병, 등, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 및 다른 트리뉴클레오타이드 반복체-관련된 질환을 포함하는 신경퇴행성 질환, 치매, ALS, 암-유도된 악액질, 식욕부진, 진성 당뇨병 유형 2, 및 다양한 암을 포함한다. 사실상 모든 유형의 암은 본 발명을 대해 관련된 질환 표적, 예를 들어, 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 급성 골수 백혈병, 부신피질 암종, AIDS-관련된 암, AIDS-관련된 림프종, 항문암, 맹장암, 별아교세포종, 소뇌 또는 뇌, 기저-세포 암종, 담도암, 방광암, 뼈 종양, 뇌간 신경아교종, 뇌암, 뇌종양 (소뇌 별아교세포종, 뇌 별아교세포종/악성 신경아교종, 뇌실막세포종, 수모세포종, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 시각적 경로 및 시상하부 신경아교종), 유방암, 기관지 선종/암양종, 버킷 림프종, 유암종 (소아기, 위장), 미공지된 1차 암종, 중추신경계 림프종, 소뇌 별아교세포종/악성 신경아교종, 자궁경부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 피부 T-세포 림프종, 결합조직형성 작은 원형 세포 종양, 자궁내막암, 뇌실막세포종, 식도암, 두개외 생식세포 종양, 고환외 생식세포 종양, 간외 담도암, 안암 (안구내 흑색종, 망막모세포종), 담낭암, 위 (위) 암, 위장 유암종, 위장 간질성 종양 (GIST), 생식세포 종양 (두개외, 고환외, 또는 난소), 임신성 융모성 종양, 신경아교종 (뇌간의 신경아교종, 뇌 별아교세포종, 시각적 경로 및 시상하부 신경아교종), 위 암양종, 모발 세포 백혈병, 두경부암, 심장암, 간세포 (간) 암, 호지킨 림프종, 하인두암, 안구내 흑색종, 소도세포 암종 (내분비 췌장), 카포시 육종, 신장암 (신장 세포 암), 후두암, 백혈병 ((급성 림프아구성 (또한 소위 급성 림프구성 백혈병), 급성 골수 (또한 소위 급성 골수성 백혈병), 만성 림프구성 (또한 소위 만성 림프구성 백혈병), 만성 골수성 (또한 소위 만성 골수 백혈병), 모발 세포 백혈병)), 입술 및 경구, 공동 암, 지방육종, 간암 (1차), 폐암 (비-소세포, 소세포), 림프종, AIDS-관련된 림프종, 버킷 림프종, 피부 T-세포 림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨, 수모세포종, 머켈 세포 암종, 중피종, 잠복 원발인 전이성 편평상피 목 암, 입 암, 다중 내분비 신조직형성 증후군, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상식육종, 골수이형성/골수증식성 질환, 골수성 백혈병, 만성 골수 백혈병 (급성, 만성), 골수종, 비강 및 부비동 암, 비인두 암종, 신경교세포종, 구강암, 구강인두암, 뼈의 골육종/악성 섬유질 조직구종, 난소암, 난소 상피성 암 (표면 상피성-간질성 종양), 난소 생식세포 종양, 난소 하부 악성 잠재적 종양, 췌장암, 췌장 소도세포 암, 부갑상선암, 음경암, 인두암, 크롬친화세포종, 송과체 별아교세포종, 송과체 종자세포종, 송과체아세포종 및 천막상 원시 신경외배엽 종양, 뇌하수체 샘종, 흉막폐 모세포종, 전립선암, 직장암, 신장 세포 암종 (신장암), 망막모세포종, 횡문근육종, 타액샘 암, 육종 (종양 육종, 카포시 육종, 연조직 육종, 자궁 육종의 유잉 계열), 세자리 증후군, 피부암 (비흑색종, 흑색종), 소장암, 편평상피 세포, 편평상피 목암, 위암, 천막상 원시 신경외배엽 종양, 고환암, 인후두암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신우 및 요관의 이행 세포암, 요도암, 자궁암, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 및/또는 윌름스 종양이다.
본 발명에 따르는 EV는 다양한 상이한 투여 경로를 통해, 예를 들어 귓바퀴 (귀), 볼, 결막, 피부, 치과, 전기-삼투, 자궁경내, 부비동내, 기관내, 장관, 경막외, 추가의-양막, 체외, 혈액투석, 침윤, 사이질, 복부내, 양막내, 동맥내, 관절내, 담도내, 기관지내, 혈액낭내, 심장내, 연골내, 꼬리내, 해면상내, 강내, 뇌내, 낭내, 각막내, 치관내 (치과), 관상동맥내, 코포라스내(intracorporus) 해면체, 진피내, 디스크내, 도관내, 십이지장내, 경막내, 표피내, 식도내, 위내, 잇몸내, 회장내, 병소내, 관강내, 림프내, 수질내, 수막내, 근육내, 안구내, 난소내, 심막내, 복강내, 늑막내, 전립선내, 폐내, 부비강내, 척수내, 활막내, 건질내, 고환내, 척추강내, 흉내, 세뇨관내, 종양내, 고실내, 자궁내, 혈관내, 정맥내, 정맥내 볼러스, 정맥내 드립, 심실내, 방광내, 초자체내, 이온침투요법, 관개, 후두, 비강, 비위, 폐쇄성 드레싱 기술, 안과, 경구, 구강인두, 기타, 비경구, 경피, 관절주위, 경막주위, 신경주위, 치주, 직장, 호흡 (흡입), 안구뒤, 연조직, 지주막하, 결막하, 피하, 설하, 점막하, 국소, 경피, 경점막, 경태반, 경기관, 경고막, 요관, 요도, 및/또는 질 투여, 및/또는 상기 투여 경로의 임의 조합을 통해 인간 또는 동물 대상에 투여될 수 있는데, 이는 전형적으로 치료할 질환 및/또는 항체 또는 EV 모집단 자체의 특징에 따라 좌우된다.
본 발명에 따르는 적합한 표적화 항체는 예를 들어 종양, 고형 기관, 신체 구조, 세포 또는 조직 유형으로부터 유래된 표적 항원일 수 있다. 표적 항체에 의해 표적화될 수 있는 항원의 기원의 비-제한적인 예는 간, 폐, 신장, 심장, 췌장, 부신, 갑상선, 부갑상선, 모든 뇌 영역 (예를 들어 시상, 시상하부, 선조체, 등)을 포함하는 뇌, 혈액-뇌-장벽, CNS, PNS, 골수, 피부, 혈관계, 비장을 포함하는 림프계, 관절, 눈, 근육 조직, 염증 부위, 손상 부위, 및 세포 유형 예컨대 지방세포, 근육 세포 (근아세포 및 근관), 위성 세포, 심장 세포, 내피 세포, 섬유모세포, 간세포, 신장 세포, 혈관주위세포, 뉴런, 아교세포, 별아교세포, 희소돌기교세포, 대식세포, DC-세포, B-세포, T-세포, NK-세포, 연골세포, 골아세포, 골세포, 상피 세포, 적혈구, 초기 선조세포 예컨대 다분화 조혈 줄기 세포/혈구모세포, 골수 선조세포, 림프양 선조세포, 등을 포함한다. 암을 표적화하는데 관련된 항원의 비-제한적인 예는 선암종 항원, 알파-태아단백, BAFF, C242 항원, CA-125, 탄산탈수소효소 9 (CA-IX), 디시알로강글리오사이드 (GD2), 4-IBB, 5T4, CD22, CD221, CD23 (IgE 수용체), CD28, CD30 (TNFRSF8), CD33, CD4, CD40, CD44 v6, CD51, CD52, CD56, CD74, CD80, CEA, CNT0888, CTLA-4, DR5, EGFR, EpCAM, CD3, FAP, 파이브로넥틴 추가의 도메인-B, 엽산 수용체 1, GD2, GD3 강글리오사이드, 당단백질 75, GPNMB, HER2/neu, HGF, 인간 산란검출기 인자 수용체 키나제, IGF-1 수용체, IGF-I, IgGI, LI-CAM, IL-13, IL-6, 인슐린-유사 성장 인자 I 수용체, 인테그린 α5β1, 인테그린 αvβ3, 레구마인, MORAb-009, MS4A1, MUC1, 뮤신 CanAg, C-MET, CCR4, CD 152, CD 10, CD 19, CD20, CD200, N-글라이콜릴뉴라민산, NPC-IC, PDGF-R a, PDL192, 포스파티딜세린, 종양 항원 CTAA16.88, VEGF-A, VEGFR-1, VEGFR2, 비멘틴, RANKL, RON, ROR1, SCH 900105, SDC1, SLAMF7, TAG-72, 테나스신 C, TGF 베타 2, TGF-β, TRAIL-R1, TRAIL-R2, 엽산 수용체, 트랜스페린 수용체 및 이들의 임의의 조합을 포함한다.
본 발명에 따라 옵소닌화 및/또는 면역 세포-매개 EV 청소능을 예방 또는 감소시키기 위해 EV를 코팅하는 항체 또는 다른 Fc 도메인-함유 단백질은, 혈청에서 또는 임의의 다른 체액에서 천연적으로 존재하는, 본질적으로 임의의 Fc-함유 단백질, 예컨대 항체일 수 있다. 그와 같은 항체는 따라서 임의의 유형, 예를 들면 IgG, IgA, IgM, IgE 및/또는 IgD일 수 있지만, Fc 도메인을 포함하는 그리고 생체내 EV의 옵소닌화를 예방하기 위한 수용력을 갖는 임의의 다른 단백질은 EV를 코팅하는데 또한 사용될 수 있다. 따라서, 면역에 의해 청소능을 회피 또는 감소시키기 위한 EV의 코팅은 능동적으로 또는 수동적으로 수행될 수 있고, 여기서 능동적 코팅은 생체내 적용에 앞서 Fc 도메인을 포함하는 적합한 단백질로 문제의 EV를 장식하는 것을 포함할 수 있다. 적합한 Fc 함유 단백질은 이러한 목적을 위해 Fc 도메인에 융합된 인자 H 및/또는 인자 I를 포함한다. 인자 H 및 인자 I는 (C3b로의 C3 전환 억제에 의해) 보체 시스템의 음성 조절자이고, 그렇게 함으로써 Fc 도메인에 융합된 경우 그리고 Fc 결합 폴리펩타이드와 융합 단백질의 Fc 도메인 사이 결합을 통해 EV 표면에 부착된 경우 감소된 EV 청소능을 초래한다. 수동적 코팅은 다른 한편으로 문제의 EV가 그것의 이용가능한 비-결합된 Fc 결합제로 생체내 단백질을 격리시키는 것을 수반할 수 있다.
추가 구현예에서, 본 발명에 따른 치료 및/또는 표적화 항체의 적합한 비-제한적인 예는 하나 이상의 아바고보맙, 압식시맙, 악톡수맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 아도트라스투주맙 엠탄신, 아두카누맙, 아펠리모맙, 아푸투주맙, 알라시주맙 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 알투모맙 펜테테이트, 아마툭시맙, 아나투모맙 마페나톡스, 아니프롤루맙, 안루킨주맙, 아폴리주맙, 아르시투모맙, 아셀리주맙, 아테졸리주맙, 아티누맙, 아틀리주맙, 아토롤리무마, 아벨루맙, 바피뉴주맙, 바실릭시마맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 비시로맙, 비마그루맙, 비바투주맙 메르탄신, 블리나투모맙, 블로소주맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브리아키누맙, 브로달루맙, 카나키누맙, 칸투주맙 메르탄신, 칸투주맙 라브탄신, 카플라시주맙, 카프로맙 펜데타이드, 카를루맙, 카투막소맙, cBR96-독소루비신 면역접합체, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, 시타투주맙 보가톡스, 식수투무맙, 클라자키주맙, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙 테트락세탄, 코나투무맙, 콘시주맙, 크레네주맙, CR6261, 다세투주맙, 다클리주맙, 달로투주맙, 다라투무맙, 뎀시주맙, 데노수맙, 데투모맙, 디누툭시맙, 도를리모맙 아리톡스, 드로지투맙, 둘리고투맙, 두필루맙, 더발루맙, 두시기투맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙, 에도바코맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에펀구맙, 엘델루맙, 엘로투주맙, 엘실리모맙, 에나바투주맙, 엔리모맙 페골, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙 시툭세탄, 에프라투주맙, 에를리주맙, 에르투막소맙, 에타네르셉트, 에타라시주맙, 에트롤리주맙, 에볼로쿠맙, 엑스비비루맙, 파놀레소맙, 파랄리모맙, 파를레투주맙, 파시누맙, FBTA05, 펠비주맙, 페자키누맙, 피클라투주맙, 피지투무맙, 플란보투맙, 폰톨리주맙, 포랄루맙, 포라비루맙, 프레솔리무맙, 풀라누맙, 푸툭시맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 간테네루맙, 가빌리모맙, 젬투주맙 오조가마이신, 게보키주맙, 기렌툭시맙, 글렘바투무맙 베도틴, 골리무맙, 고밀릭시맙, 구셀쿠맙, 이발리주맙, 이브리투모맙 티욱세탄, 이크루쿠맙, 이고보맙, IMAB362, 임시로맙, 임가투주맙, 인클라쿠맙, 인다툭시맙 라브탄신, 인플릭시맙, 인테투무맙, 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가마이신, 이필리무맙, 이라투무맙, 이톨리주맙, 익세키주맙, 켈릭시맙, 라베투주맙, 람브롤리주맙, 람팔리주맙, 레브리키주맙, 레말레소맙, 레르델리무맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리겔리주맙, 린투주맙, 리릴루맙, 로델시주맙, 로르보투주맙 메르탄신, 루카투무맙, 루밀릭시맙, 마파투무맙, 마르게툭시맙, 마슬리모맙, 마브릴리무맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미투모맙, 모가물리주맙, 모롤리무맙 모타비주맙, 목세투모맙 파수독스, 무로모납-CD3, 나콜로맙 타페나톡스, 나밀루맙, 납투모맙 에스타페나톡스, 나르나투맙, 나탈리주맙, 네바쿠맙, 네시투무맙, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 니모투주맙, 니볼루맙, 노페투모맙 메르펜탄, 오카라투주맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 올로키주맙, 오말리주맙, 오나투주맙, 온툭시주맙, 오포르투주맙 모나톡스, 오레고보맙, 오르티쿠맙, 오텔릭시주맙, 오틀레르투주맙, 옥셀루맙, 오자네주맙, 오조랄리주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 판코맙, 파노바쿠맙, 파르사투주맙, 파스콜리주맙, 파테클리주맙, 파트리투맙, 펨브롤리주맙, 펨투모맙, 페라키주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, 피딜리주맙, 피나투주맙 베도틴, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 폴라투주맙 베도틴, 포네주맙, 프릴릭시맙, 프리톡사시맙, 프리투무맙, PRO 140, 퀼리주맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라피비루맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레가비루맙, 레슬리주맙, 릴로투무맙, 리산키주맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 롤레두맙, 로모소주맙, 론탈리주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사말리주맙, 사릴루맙, 사투모맙 펜데타이드, 세쿠키누맙, 세리반투맙, 세톡사시맙, 세비루맙, 시브로투주맙, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙, 시루쿠맙, 솔라네주맙, 솔리토맙, 소네프시주맙, 손투주맙, 스타물루맙, 술레소맙, 수비주맙, 타발루맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙 , 타네주맙, 타플리투모맙 팝톡스, 테피바주맙, 텔리모맙 아리톡스, 테나투모맙, 테넬릭시맙, 테플리주맙, 테프로투무맙, 틱실리무맙, 틸드라키주맙, 티가투주맙, 토실리주맙, 토랄리주맙, 토시투모맙, 벡사르, 토베투맙, 트랄로키누맙, 트라스투주맙, 트레갈리주맙, 트레멜리무맙, 투코투주맙 셀모류킨, 투비루맙, 우블리툭시맙, 우렐루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙, 반티크투맙, 바팔릭시맙, 바텔리주맙, 베돌리주맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙, 볼록식시맙, 보르세투주맙 마포도틴, 보투무맙, 잘루투무맙, 자놀리무맙, 자툭시맙, 지랄리무맙, 졸리모맙 아리톡스, 또는 이들의 임의 조합중 임의의 것일 수 있다. 중요하게는, 본 발명은 그의 표적이 세포내 및/또는 세포외이든지와 무관하게, 임의 항체의 전달을 위해 제공한다. 항체를 효율적으로 내부화하는 본 발명의 EV의 능력은 단클론성 항체 개발에서 단계-변화를 나타내고, 표적 세포의 전체 세포내 구획에 대해 항원 및 표적을 표적화 가능하게 할 수 있다. 중요하게는, 본 발명에 따라 항체 및 Fc 함유 단백질은 유익하게는 검출 및 이미지형성 목적을 위해, 예를 들어 형광단, MRI 제제, PET 제제, 방사선활성제, 효소, 나노입자, 금속, 유기 및 무기 화합물, 등을 사용하여 표지화할 수 있다.
상기 기재된 예시화 양태, 구현예, 대안, 및 변환은 본 발명의 범위를 벗어나지 않고 변형시킬 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명은 이제 포함된 예를 사용하여 추가로 예시할 것이고, 이 또한 자연적으로 본 발명의 범위 및 요지를 벗어나지 않으면서 상당히 변형시킬 수 있다.
실험적 부분
물질 및 방법
작제물 디자인 및 클로닝: 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 다양한 융합 단백질을 작제하여, 벡터로 클로닝시켰고, 몇 개의 상이한 EV-생산 세포 공급원에서 생성시켰다. ORFs는 전형적으로 합성에 의해 생성하였고, 포유동물 발현 벡터 pSF-CAG-Amp로 클로닝시켰다. 간단히, 합성된 DNA 및 벡터 플라스미드는 제조자 지침 (NEB)에 따라 효소 NotI 및 Sail로 분해시켰다. 제한된, 정제된 DNA 단편은 제조자 지침 (NEB)에 따라 T4 리가제를 사용하여 함께 결찰시켰다. 성공적인 결찰 사건은 암피실린-보충된 플레이트 상에서 박테리아 형질전환에 의해 선택되었다. 형질감염을 위한 플라스미드는 제조자 지침에 따라 '맥스-프렙(maxi-prep)'에 의해 생성하였다.
Fc 함유 단백질이 융합 단백질을 발현하는 동일한 EV-생산 세포 공급원에서 내인성으로 생산된 경우에, ORF 서열은 구매하였고 (Origene Technologies, Inc.), pIRES 바이시스트로닉 발현 벡터 (Clonetech, Laboratories Inc.)의 MSC A 부위로 증폭시키고 클로닝하여, 번역시, 엑소좀 폴리펩타이드가 한 작제물의 Fc 결합 폴리펩타이드에 융합되도록 한 반면에, 관심있는 Fc 함유 단백질은 별도로 번역하였고 (별개의 작제물로부터 또는 동일한 작제물로부터), EV-생산 세포 공급원에 형성된 EV로 수송하였다. 클로닝의 대부분은 NEBuilder HiFi DNA 어셈블리 클로닝 키트 (NEB, Inc.)를 사용하여 수행하였고, Sanger 서열분석 (Source Bioscience)을 사용하여 확인하였다. pIRES 벡터는 동시에 두 이식유전자의 바이시스트로닉 발현을 가능하게 함으로써, EV-생산 세포가 융합 단백질 및 관심있는 Fc 함유 단백질을 동시에 발현하도록 보장한다. 플라스미드는 NEB 5-알파 컴피턴트(competent) 이.콜라이 세포 (NEB, Inc.)로 형질전환시켰고, 제조자의 권고에 따라 진탕 배양기에서 밤새 성장시켰다. 플라스미드는 제조자의 지침에 따라 '맥스-프렙 플라스미드 DNA 정제 키트' (Qiagen)를 사용하여 단리 및 정제시켰다.
ㆍ 세포 배양 및 형질감염
실험 디자인 및 검정에 따라, 특정 경우에, 비-바이러스 일과성 형질감염 및 엑소좀 생산은 종래의 2D 세포 배양으로 수행한 반면에, 다른 경우에, 바이러스-매개된 형질도입이 전형적으로 상이한 유형의 생물반응기에서 배양시킨, 안정한 세포주를 생성하기 위해 사용되었다. 간결함을 위해, 단지 몇 개의 예가 본원에 언급된다.
HEK293T 세포는 전형적으로 15 cm 디쉬 (9x106　세포/디쉬)에 씨딩하였고, ATCC가 권고한 바와 같이 혈청-함유 DMEM에서 밤새 방치시켰다. 다음 날, 세포는 세포로 직접 첨가된 리포플렉스 DNA로 일시적으로 형질감염시켰다. 간단히, DNA 및 폴리에틸렌이민 (PEI)은 실온에서 20분 동안 함께 배합시키기 전에 5분 동안 OptiMEM에서 별도로 인큐베이션시켰다. 리포플렉스 DNA 및 세포를 6시간 동안 공-인큐베이션시킨 다음, 컨디셔닝된 배양 배지를 48시간 동안 OptiMEM으로 바꿨다. 디쉬, 플라스크 및 다른 세포 배양 용기에서 평가된 다른 세포 및 세포주는 골수-유래된 간엽 기질 세포 (BM-MSCs) 및 Wharton's 젤리-유래된 MSCs (WJ-MSCs), 양막 세포, 섬유모세포, 다양한 내피와 상피 세포, 및 다양한 면역 세포 및 세포주를 포함했다
융합 단백질 및 관심있는 Fc 함유 단백질의 다양한 조합을 위해 안정한 세포주를 바이러스성 형질도입 및 생성하는 경우에, 세포 공급원 예컨대 BM-MSCs, WJ-MSC, 섬유모세포, 양막 세포, 섬유모세포, 다양한 내피 및 상피 세포는 전형적으로 렌티바이러스 (LV)를 이용하여 바이러스-형질도입시켰다. 전형적으로, 감염시키기 24시간 전에, 100.000 세포 (예를 들어 섬유모세포, MSCs, 등) 또는 200.000 세포 (예를 들어 HEK293T)를 6-웰 플레이트에 플레이팅시킨다. 2 uL의 LV 및 선택적으로 폴리브렌 (또는 헥사디메트린 브로마이드, 8 ug/mL의 웰에 대한 최종 농도)를 첨가하고, 형질도입 24시간 후, 형질도입된 세포의 세포 배지는 신선한 완전 배지로 바꾼다. 형질도입 72시간 후, 퓨로마이신 선택 (4㎍/ml)을 통상 7일 동안 수행한 다음, 엑소좀 폴리펩타이드 및 Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질 작제물의 안정한 발현을 분석한다.
안정한 세포는 2D 배양 또는 생물반응기, 전형적으로 중공-섬유 생물반응기 또는 교반-랭크 생물반응기에서 배양시켰고, 컨디셔닝된 배지는 엑소좀 제조를 위해 후속적으로 하베스트하였다. 다양한 제조 및 정제 단계를 수행하였다. 표준 작업흐름은 상청액의 예비-클리어링(pre-clearing), 여과-기반 농축, 단백질 오염물질의 크로마토그래피-기반 제거, 및 시험관내, 및/또는 생체내 검정을 위한 적합한 완충액중 생성된 엑소좀 조성물의 선택적인 제형화 단계를 포함한다.
ㆍ 검정 및 분석
웨스턴 블랏은 EV중 융합 단백질의 농축을 평가하기 위한 고도로 편리한 분석 방법이다. 간단히, SDS-PAGE는 제조자의 지침 (Invitrogen, Novex PAGE 4-12% 겔)에 따라 수행하였고, 그것에 의하여 1 x 1010　엑소좀 및 20 ug 세포 용해물이 웰당 장입되었다. SDS-PAGE 겔로부터 단백질은 제조자의 지침 (Immobilon, Invitrogen)에 따라 PVDF 막으로 전달하였다. 막은 Odyssey 차단 완충액 (Licor)으로 차단시켰고, 공급자의 지침 (1차 항체 -Abcam, 2차 항체 - Licor)에 따라 Fc 결합 폴리펩타이드 및/또는 엑소좀 단백질에 대해 항체로 탐침시켰다. 분자 탐침은 680 및 800 nm 파장에서 시각화하였다.
EV 크기 결정을 위해, 나노입자 추적 분석 (NTA)은 분석적 소프트웨어가 구비된 NanoSight 기기를 사용하여 수행하였다. 모든 기록을 위해, 본 발명자는 13 또는 15의 카메라 수준 및 모든 후-취득 설정을 위해 자동 기능을 사용했다. 전자 현미경검사 및 형광 현미경검사가 세포내 위치 및 방출을 이해하고, EV를 정량화 및 분석하기 위해 빈번히 사용되었다.
EV는 단리시켰고, 여러 가지 방법, 전형적으로 여과의 조합, 예컨대 TFF 및 LC, 특히 비드-용출 LC를 사용하여 정제하였다. 전형적으로, EV-함유 배지를 수집했고, 5분 동안 300g로 저속 스핀에 이어서, 10분 동안 2000g 스핀에 적용시켜 보다 큰 입자 및 세포 잔해를 제거하였다. 그 다음에, 상청액은 0.22 ㎛ 시린지 필터를 사용하여 여과시켰고, 상이한 정제 단계에 적용시켰다. 큰 용적은 정용여과시켰고, 100 kDa 컷오프 필터가 있는 Vivaflow 50R 접선 유동 (TFF) 디바이스 (Sartorius) 또는 100 또는 300 kDa 컷오프 중공 섬유 필터가 있는 KR2i TFF 시스템 (SpectrumLabs)을 사용하여 대략 20 ml로 농축시켰다. 미리농축시킨 배지는 후속해서 AKTAprime 플러스 또는 AKTA Pure 25 크로마토그래피 시스템 (GE Healthcare Life Sciences)에 연결된, 비드-용출물 칼럼 (HiScreen 또는 HiTrap Capto Core 700 칼럼, GE Healthcare Life Sciences)에 장입시켰다. 칼럼 평형, 샘플 장입 및 제때 칼럼 세척 절차를 위한 유량 설정은 제조자의 지침에 따라 선택되었다. 샘플은 UV 흡광도 크로마토그램에 따라 수집하였고, Amicon Ultra-15 10 kDa 분자량 컷-오프 스핀-필터 (Millipore)를 사용하여 100 μl의 최종 용적으로 농축시켰고, 추가의 하류 분석을 위해 -80°C에서 저장하였다. 단백질 및 RNA 용출 프로파일을 평가하기 위하여, 배지를 농축시켰고, 100 kDa 및 300 kDa 중공 섬유 필터를 사용하여 KR2i TFF 시스템으로 정용여과시켰고, 샘플은 Tricorn 10/300 S4FF (Sepharose 4 Fast Flow) 칼럼 (GE Healthcare Life Sciences) 상에서 분석하였다.
ㆍ 실시예
실시예 1: Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는 EV (Fc-결합 EV)에 IgG의 결합
EV는 300 kd 중공 섬유 칼럼과 함께 접선 유동 여과를 사용한 다음, 농축을 위해 10 kd 스핀 필터를 사용하는 한외여과에 의해 조작된 HEK293T 세포 (안정적으로 Gp130 세포외 도메인-2XGGGGS 링커-Z 도메인-Gp130 막관통 도메인-류신 지퍼-N 말단 신테닌-His 태그를 발현하는 대조군 대 Fc-결합 작제물)로부터의 컨디셔닝된 배지로부터 단리시켰다. 그 다음에, Fc-결합 EV에 의한 IgG에 대한 결합능은 전자 현미경검사 및 유세포측정을 사용하여 평가하였다.
전자 현미경검사를 위해, 1 x 10Λ9 EV는 37 ℃에서 2시간 동안 금 나노입자와 콘쥬게이트된 토끼 항-염소 10nm 항체와 함께 인큐베이션시켰다. 도 2에 나타낸 바와 같이, Fc-결합 EV (A)는 나노금 표지된 항체 (즉 Fc 함유 단백질)로 장식된 반면에, 대조군 EV (B)는 임의의 항체가 결합되지 않는다.
유세포측정을 위해, 1 x 10Λ8 EV는 MACSPlex 엑소좀 키트, 인간 (Miltenyi Biotec, Order no 130-108-813)으로부터의 15 μl 항체-코팅된 포획 비드를 사용하여 120 μl PBS에서 16시간 동안 450 rpm으로 회전식 진탕기에서 밤새 인큐베이션시켰다. 세척후, 3 μg의 AlexaFluor647-접합된 인간 IgG Fc 단편 (Jackson Laboratories, 카탈로그 009-600-008)을 EV가 없는 대조군 (A), 대조군 EV (B), 또는 Fc-결합 EV (신테닌 -gp130-z도메인-gp130) (C)에 첨가했다. 실온에서 1시간 인큐베이션후, 미결합된 Fc 단편을 세정하였고, 샘플은 유세포측정을 통해 분석하였다. 도 3에서, 각각의 좌측 점플롯은 B1-A (여기: 488 nm, 방출 필터: 500-550 nm; Area) 대 B2-A (여기: 488 nm, 방출 필터: 565-605 nm, Area) 파라미터를 사용하여 강하게-염색된 포획 비드 모집단을 나타낸다. 각각의 우측 플롯은 R1-A (여기: 635 nm, 방출 필터: 655-730 nm, Area) 대 B2-A 파라미터를 나타내며, (C)에서 단지 포획 비드에 결합된 EV에 대한 AlexaFluor647 표지된 Fc-단편의 결합을 입증하는 것이다. 도 3은 Fc-결합 EV가 AlexaFluor647-표지된 Fc 단편 (인간 IgG) 및 매우 효율적으로 또한, 2개의 음성 대조군 비드 모집단을 포함하는, 키트에 포함된 제조자에 의해 모든 포획 비드 모집단에서 코팅된 모든 39개의 상이한 항체중 Fc 도메인에 모두 결합됨을 보여준다.
실시예 2: 항-HER2 항체의 전달을 위한 FCGR1A Lamp2B EV
EV는 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 HEK293T 세포 (안정적으로 발현하는 FCGR1A 세포외 도메인-4XGS링커-Lamp2b, 또는 그것의 야생형 대조군)로부터 단리시켰다. EV는 PKH26 적색 형광 염료로 표지시켰고, 37 ℃에서 1시간 동안 EV 및 항체를 공-인큐베이팅시켜 항-HER2 항체 또는 그것의 아이소타입 대조군으로 장식하였다. 미결합된 항체는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거하였다. 항체 장식된 EV의 흡수는 유세포측정을 사용하여 HER2 저-발현 세포주 MDA-MB-231 및 HER2 고-발현 세포주 MDA-MB-361에서 특성규명하였다. 도 4는 항-HER2 항체가 HER2 저-발현 세포주 MDA-MB-231에서는 아닌, HER2 고-발현 세포주 MDA-MB-361에서만 아이소타입 대조군 장식된 및 야생형 EV에 비하여 장식된 EV의 흡수를 증가시킴을 보여준다. 유사한 결과가 EV 발현 CD63-ZZ 융합 단백질에 의해 수득되었다.
실시예 3: CD81 -단백질 A/G 융합 단백질을 포함하는 EV에 의한 에타너셉트 전달
EV는 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 HEK293T 세포 (어느 한쪽 안정적으로 발현하는 CD81 -단백질A/G CD81 초 루프 융합 단백질 또는 그것의 야생형 대조군)으로부터 단리되었다. EV는 1시간 동안 37℃에서 EV 및 에타너셉트 공-인큐베이팅에 의해 에타너셉트 또는 대조군 항체로 장식되었다. 미결합된 에타너셉트는 크기 배제 크로마토그래피에 의해 제거되었다. 에타너셉트-장식 EV의 항-염증성 효과를 연구하기 위해, 잘-연구된 TNBS-유도 결장염 마우스 모델은 사용되었다. 이 모델은 IBD 환자와 관련된 소화관 염증, 사이토카인 폭풍 및 중량 감소를 시뮬레이션한다. 24 마우스는, 그룹 당 6 마우스로, 4 처리 그룹으로 분할되었다. 마우스는, 결장염 유도에 1 주 앞서, 피부에서, 2% TNBS를 가진 150 μl의 올리브 오일-아세테이트 용액을 적용함으로써 사전-감지되었다. 결장염은 그 다음 40 % 에탄올내 1.5 % TNBS를 함유하는 100 μl 용액의 직장 주입을 제공함으로써 유도되었다. 결장염 유도 직후, 200 μl내 10E10 EV/g EV는 꼬리 정맥에서 정맥내로 투여되었다. 도 5는, 에타너셉트가 다중화되는 경우 및/또는 Fc 결합 폴리펩타이드가 그것의 Fc 도메인에 결합하는 경우 에타너셉트와 TNF알파 사이 더 높은 친화도로 인해 가능한, 에타너셉트-코팅된 EV가, WT 또는 대조군 장식된-EV와는 대조적으로, 체중의 손실로부터 마우스를 보호하였고, 네이키드 에타너셉트보다 더 높은 활성을 표시하였다는 것을 보여준다.
실시예 4: Fc-결합 EV을 통한 항체의 세포내 흡수 및 전달
EV는 한외여과 및 크기 배제 크로마토그래피를 사용하여 Wharton's 젤리-유래된 MSCs (안정적으로 발현하는 TNFR 세포외 도메인-2XGGGGS 링커-Z 도메인-TNFR 막관통 도메인-폴드온-N 말단 신테닌 융합 단백질 또는 대조군)의 컨디셔닝된 배지로부터 단리시켰다. Fc-결합 EV가 Abs의 세포내 전달에 사용될 수 있는 지를 조사하기 위하여, 4 x 10Λ11 EV는 16시간 (밤새) 동안 총 3 μg AlexaFluor488-표지된 항-Lamin B2 IgGs [abeam ab200426, 토끼 단클론성 EPR9701 (B)]와 함께 400μl에서 인큐베이션시켰다. 흡수 실험을 위해, Huh7 세포는 48 웰 플레이트에 30,000 세포/웰로 플레이팅시켰고, 0.675x10Λ11 항체-표지된 EV를 첨가하기 전에 16시간 동안 인큐베이션시켰다. 세포는 가습된 대기에서 37 ℃ 및 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 후, 그들을 트립신화했고, 도 6에 제시된 바와 같이 형광 현미경검사 (A) 및 유세포측정 (B)으로 분석하였다: A)는 상 콘트라스트 이미지와 병합된 녹색 형광 신호를 나타낸다. B)에서 히스토그램은 x-축에 대수 규모 및 y-축에 정규화된 빈도에 대해 녹색 형광 강도를 나타낸다. 1: 임의의 항체 또는 EV로 처리되지 않은 HuH7 세포. 2: 항-Lamin B2 항체와 인큐베이션시킨 대조군 EV로 처리한 HuH7 세포는. 3: 항-Lamin B2 항체와 인큐베이션시킨 Fc-결합 EV로 처리한 HuH7 세포. 도 6은 형광 항체의 신호가 Fc-결합 EV 플러스 항체로 처리한 세포에서 분명히 존재하는 반면에, 형광 신호는 미처리 (1) 또는 처리된 대조군 EV (2)에서는 존재하지 않음을 나타낸다. 이는 항체가 Fc-결합 EV를 통해 세포내에서 전달될 수 있고, EV에 대한 결합은 극적으로 세포에서 항체의 흡수를 증가시킴을 입증하는 것이다.
기능적 세포내 전달을 입증하기 위하여, 항-NFkB 항체 (항-NFkB-Ab)는 각각의 EV와 37 ℃에서 1시간 동안 인큐베이션시켰다. 리포터 세포주, NFkB-루시퍼라제를 안정적으로 발현하는 HEK 세포는 5 ng/ml hTNF-알파 및 EV-Ab-mix로 처리하였다. 처리한 지 6시간 후, 루시퍼라제 활성을 측정하였다. 도 7은 항-NFkB-ab가 Fc-결합 EV에 의해 전달된 경우 성공적인 억제를 나타낸다.
실시예 5: 항-인테그린-4-알파-Ab로 장식된 Fc-결합 EV를 사용하는 EAE 처리
C57BL/6 마우스는 같은 날 그리고 면역화 2 일 후에서 100 ul의 MOG35-55-CFA 에멀젼의 s.c. 주사 및 400 ng 백일해 독소의 i.p. 주사에 의해 실험적 자가면역 뇌염 (EAE)로 유도되었다. EV는, 골수-유래 MSCs의 조건화된 배지 (어느 한쪽 안정적으로 발현하는 CD9-ZZ (비-제한 예로서 서열번호 74에 작동가능하게 연결된 비-제한 예로서 서열번호 1을 포함하는 융합 작제물) 도메인 융합 단백질 또는 그것의 야생형 대조군)으로부터, 실시예 1에서 기재된 바와 같이 단리되었다. 항-인테그린-4-알파 항체 (Ab)는 각각의 EV (zzEV 또는 ctrl-EV)로 인큐베이션되었다. EAE 마우스는 일 7에서 EV와 또는 상기 없이 항-인테그린-4a-Ab로 주사되었다. 도 8은 ctrl-EV, 뿐만 아니라 항-인테그린-4a-Ab가 EAE 발생 자체로부터 중간 정도 보호성 효과를 표시하고, 반면에 항-인테그린-4a-Ab로 인큐베이션된 zzEV가 EAE 발생의 거의 완전한 억제를 표시하였다는 것을 보여준다.
실시예 6: Fc-결합 EV를 사용하여 Fc-Cas9 엔도뉴클레아제 전달에 의한 표적화된 게놈 결실.
EV는 지방세포로부터 수득된 세포 배양 배지 (대조군으로서 안정적으로 형질감염된 FCGR1A 세포외 도메인-4XGS링커-Lamp2b 융합 단백질 또는 Lamp2b GFP)로부터 실시예 1에서 언급된 바와 같이 정제되었다. EV의 가변량은 사용되었고 (100 ig, 500 μg, 2.5 mg, 5 mg 및 10 mg), 반면 HPRT를 표적하는 Fc (IGHG1) 태깅된-Cas9 가이드 RNA 복합체 (소위 RNP 복합체)의 양은 100 μg에서 남아있다. Cas9 복합체 대 EV의 최종 중량비는 1:1, 1:5, 1:25, 1:50 및 1:100 각각이었고 22℃에서 60 분 동안 인큐베이션되었다. EV에서 Cas9의 최대 장입은 Cas9 복합체 대 EV의 1:5 중량비로 수득되었고, 자유 Cas9 복합체는 한외여과에 의해 제거되었다. 그 다음 Cas9 장입된 Fc+ 지방세포-EV는 상이한 농도로 Huh7 세포를 처리하는데 사용되었다. 24 시간 후 세포는 수확되었고 GeneArt 게놈 절단 검출 키트 (Thermo scientific)은 샘플 게놈 절단 검정 준비용 제조 프로토콜에 따라 사용되었고 2% 아가로스 겔에서 운영되었다. 인델은 그 다음 이미지 J 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다. 도 9는 표적 세포에서 용량-의존적 유전자 편집을 도시한다. Cas9에 융합된 Fc 도메인 및 Fc 결합 폴리펩타이드의 다양한 다른 쌍은 동일한 셋업에서 또한 평가되었다. CD83에 융합된 그리고 몇 개의 상이한 인간 Fc 도메인 (예를 들면 IGHM, IGHA1, IGHG1, 등)에 융합된 Cas9와 조합된 인간 FCAMR (IgA 및 IgM 결합), 인간 FCGR3A (IgG 결합), 및 인간 FCGRB (IgG 결합)은 동일한 셋업에서 또한 평가되었다. 전반적으로, 모든 작제물은 FCGR1 A 세포외 도메인-4XGS링커-Lamp2b 융합 단백질보다 더 낮은 효력을 가진 유전자 편집 활성을 보여주었다 (데이터 도시되지 않음).
실시예 7: 인간-Fc / pH-감지 단백질 G 복합체를 사용하여 가용성 리소좀 단백질로 EV 장식
다양한 엑소좀 단백질 예컨대 CD63에 융합된 단백질 G의 C2 도메인, Lamp2, 및 트랜스페린 수용체는 그것의 발현 및 EV 표시 수준에 대하여 평가되었다. EV의 표면에 리소좀 단백질의 결박을 용이하게 하기 위해, (IgG로부터 유도하는) 인간 Fc 도메인 (hFc)는 효소 GBA의 어느 한쪽 N 또는 C 말단에 융합되었다. N-융합 작제물의 경우에, hFc 도메인은 GBA에 원상태인 신호 펩타이드 이후 삽입되었다. 양쪽 작제물의 공-발현은, 야생형 GBA의 과잉 발현보다 더욱 그렇게, EV로 GBA의 상당한 농축을 초래하였다. 단백질 G의 wt C2 도메인에 더하여, pH-감지 C2 도메인은 이전에 기재된 방식으로 EV 표면에서 또한 표시되었다. pH 감지 C2 도메인이 인간 Fc 영역을 효과적으로 결합하기 위한 수용력을 갖는 반면, 복합체 형성용 친화도는 pH 4에서 천배 넘게 떨어진다. pH-감지 C2 도메인 EV에 의한 GBA-장식된 세포 흡수 이후, 이들은 리소좀 구획에 이동조정된다. 구획의 저 pH 내에서, 결박된 GBA 및 pH-감지 c2 도메인은 리소좀의 내강 이내 자유 결박되지 않은 GBA의 존재 용이화를 분리시킨다.
야생형 엑소좀을 생산하는 Hek293T 세포로부터 단리된 조건화된 배지, 단백질 G 장식된 엑소좀의 C2 도메인 또는 단백질 G 장식된 엑소좀의 pH-감지 C2 도메인은 1 시간 동안 37℃에서 야생형 GBA 또는 인간 Fc-GBA 융합을 발현시키는 Hek293T 세포로부터 조건화된 배지와 조합되었다. 또한, 조건화된 배지가 pH 4로 산성화된 공-인큐베이션은 수행되었다. EV는 그 다음 한외여과 및 비드 용출 크로마토그래피에 의해 단리되었다. 엑소좀-결박된 GBA의 수준을 평가하기 위해, 정제된 소포는 웨스턴 블랏에 의해 분석되었고 GBA의 존재에 대하여 탐색되었다. GBA-담지 엑소좀의 GBA 활성을 평가하기 위해, 환자-유래된 GBA 결핍된 섬유모세포는 GBA-농축한 엑소좀과 공-인큐베이션되었고 48 시간 후 글루코실세라미드 수준에 대하여 분석되었다. 도 10은 이 실험의 결과를 도시한다: WT - 야생형 Hek293t 엑소좀; GBA - 야생형 GBA; hFc-GBA - 인간 Fc 단편-GBA 융합; 단백질 G의 C2 도메인으로 장식된 PG - 엑소좀; pH 감지 단백질 G의 C2 도메인으로 장식된 PGpH -엑소좀. n=3. 유사한 실험에서, 단백질 L 및 단백질 LG는 동일한 셋업에서 Fc 결합 폴리펩타이드로서 또한 평가되어, 유사한 결과를 초래하였다 (데이터 도시되지 않음).
실시예 8: 인간 Fc 도메인에 융합된 siRNA-장입된 Ago2로 코팅된 EV
Lamp2b와 Fc 결합 폴리펩타이드 ZZ 사이 융합 단백질을 포함하는 EV는 한외여과 및 비드-용출물 크로마토그래피를 사용하여 Hek293T 세포로부터 생성 및 단리되었다. hFc-Ago2 융합 단백질은 Hek293T 세포에서 발현되었고 친화도 크로마토그래피에 의해 단리되었고, 그 이후 융합 단백질은 밤새 사이클린 D에 대한 분자 과잉으로 인큐베이션되었다. 과잉의 siRNAs는 제2 라운드의 친화도 정제에 의해 제거되었다. 5x106 장입된 EV는 밤새 105 U2OS 세포로 공-인큐베이션되었고, 그 이후 48 시간 후 세포는 수확되었고 사이클린 D 수준은 평가되었다. 생체내 연구를 위하여, 1x106의 A549 세포는 매트리겔의 1:1 비로 혼합되었고 NCRNU 마우스에 피하로 주사되었다. 종양-보유 마우스는 꼬리-정맥 투여를 사용하여 107 siRNA-장입된 엑소좀으로 격일로 처리되었다. 연구의 과정에 걸쳐 캘리퍼스 측정은 종양 부피를 계산하는데 사용되었다. Lamp2b-ZZ 도메인 EV의 표면에서 표시된 siRNA-장입된 Ago2로 U2OS 세포 처리 이후 사이클린 D 수준은, 도 11에서 나타낸 바와 같이, 상당한 표적 침묵화를 보여주었다. siCyclin D는 +ve 대조군에 대하여 직접적으로 형질감염되었다. hFc는 엑소좀 표면 표시; siCyclin - 항 CyclinD siRNA; siScr - 스크램블드 서열을 나타낸다. n=3.
SEQUENCE LISTING <110> EVOX THERAPEUTICS LTD <120> EXTRACELLULAR VESICLE COMPRISING A FUSION PROTEIN HAVING FC BINDING CAPACITY <130> Evox8 <150> GB1612643.5 <151> 2016-07-21 <160> 83 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 227 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Pro Val Lys Gly Gly Thr Lys Cys Ile Lys Tyr Leu Leu Phe Gly Phe 1 5 10 15 Asn Phe Ile Phe Trp Leu Ala Gly Ile Ala Val Leu Ala Ile Gly Leu 20 25 30 Trp Leu Arg Phe Asp Ser Gln Thr Lys Ser Ile Phe Glu Gln Glu Thr 35 40 45 Asn Asn Asn Asn Ser Ser Phe Tyr Thr Gly Val Tyr Ile Leu Ile Gly 50 55 60 Ala Gly Ala Leu Met Met Leu Val Gly Phe Leu Gly Cys Cys Gly Ala 65 70 75 80 Val Gln Glu Ser Gln Cys Met Leu Gly Leu Phe Phe Gly Phe Leu Leu 85 90 95 Val Ile Phe Ala Ile Glu Ile Ala Ala Ala Ile Trp Gly Tyr Ser His 100 105 110 Lys Asp Glu Val Ile Lys Glu Val Gln Glu Phe Tyr Lys Asp Thr Tyr 115 120 125 Asn Lys Leu Lys Thr Lys Asp Glu Pro Gln Arg Glu Thr Leu Lys Ala 130 135 140 Ile His Tyr Ala Leu Asn Cys Cys Gly Leu Ala Gly Gly Val Glu Gln 145 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Glu Val Ile Asp Ala Ser Glu 50 55 60 Leu Thr Pro Ala Val Thr Thr Tyr Lys Leu Val Ile Asn Gly Lys Thr 65 70 75 80 Leu Lys Gly Glu Thr Thr Thr Lys Ala Val Asp Ala Glu Thr Ala Glu 85 90 95 Lys Ala Phe Lys Gln Tyr Ala Asn Asp Asn Gly Val Asp Gly Val Trp 100 105 110 Thr Tyr Asp Asp Ala Thr Lys Thr Phe Thr Val Thr Glu 115 120 125 <210> 79 <211> 404 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 79 Met Ile Leu Thr Ser Phe Gly Asp Asp Met Trp Leu Leu Thr Thr Leu 1 5 10 15 Leu Leu Trp Val Pro Val Gly Gly Glu Val Val Asn Ala Thr Lys Ala 20 25 30 Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Ile Phe Gln Lys Glu Asn 35 40 45 Val Thr Leu Trp Cys Glu Gly Pro His Leu Pro Gly Asp Ser Ser Thr 50 55 60 Gln Trp Phe Ile Asn Gly Thr Ala Val Gln Ile Ser Thr Pro Ser Tyr 65 70 75 80 Ser Ile Pro Glu Ala Ser Phe Gln Asp Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln 85 90 95 Ile Gly Ser Ser Met Pro Ser Asp Pro Val Gln Leu Gln Ile His Asn 100 105 110 Asp Trp Leu Leu Leu Gln Ala Ser Arg Arg Val Leu Thr Glu Gly Glu 115 120 125 Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Gly Trp Lys Asn Lys Leu Val Tyr Asn 130 135 140 Val Val Phe Tyr Arg Asn Gly Lys Ser Phe Gln Phe Ser Ser Asp Ser 145 150 155 160 Glu Val Ala Ile Leu Lys Thr Asn Leu Ser His Ser Gly Ile Tyr His 165 170 175 Cys Ser Gly Thr Gly Arg His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly Val Ser Ile 180 185 190 Thr Val Lys Glu Leu Phe Thr Thr Pro Val Leu Arg Ala Ser Val Ser 195 200 205 Ser Pro Phe Pro Glu Gly Ser Leu Val Thr Leu Asn Cys Glu Thr Asn 210 215 220 Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu His Phe Ser Phe Tyr Val 225 230 235 240 Gly Ser Lys Ile Leu Glu Tyr Arg Asn Thr Ser Ser Glu Tyr His Ile 245 250 255 Ala Arg Ala Glu Arg Glu Asp Ala Gly Phe Tyr Trp Cys Glu Val Ala 260 265 270 Thr Glu Asp Ser Ser Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln 275 280 285 Val Leu Gly Pro Gln Ser Ser Ala Pro Val Trp Phe His Ile Leu Phe 290 295 300 Tyr Leu Ser Val Gly Ile Met Phe Ser Leu Asn Thr Val Leu Tyr Val 305 310 315 320 Lys Ile His Arg Leu Gln Arg Glu Lys Lys Tyr Asn Leu Glu Val Pro 325 330 335 Leu Val Ser Glu Gln Gly Lys Lys Ala Asn Ser Phe Gln Gln Val Arg 340 345 350 Ser Asp Gly Val Tyr Glu Glu Val Thr Ala Thr Ala Ser Gln Thr Thr 355 360 365 Pro Lys Glu Ala Pro Asp Gly Pro Arg Ser Ser Val Gly Asp Cys Gly 370 375 380 Pro Glu Gln Pro Glu Pro Leu Pro Pro Ser Asp Ser Thr Gly Ala Gln 385 390 395 400 Thr Ser Gln Ser <210> 80 <211> 330 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 80 Met Glu Ser Asn Trp Thr Val His Val Phe Ser Arg Thr Leu Cys His 1 5 10 15 Met Leu Leu Trp Thr Ala Val Leu Asn Leu Ala Ala Gly Thr His Asp 20 25 30 Leu Pro Lys Ala Val Val Lys Leu Glu Pro Pro Trp Ile Gln Val Leu 35 40 45 Lys Glu Asp Thr Val Thr Leu Thr Cys Glu Gly Thr His Asn Pro Gly 50 55 60 Asn Ser Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Gly Arg Ser Ile Arg Ser Gln 65 70 75 80 Val Gln Ala Ser Tyr Thr Phe Lys Ala Thr Val Asn Asp Ser Gly Glu 85 90 95 Tyr Arg Cys Gln Met Glu Gln Thr Arg Leu Ser Asp Pro Val Asp Leu 100 105 110 Gly Val Ile Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Thr Pro Gln Leu Val Phe 115 120 125 Leu Glu Gly Glu Thr Ile Thr Leu Arg Cys His Ser Trp Arg Asn Lys 130 135 140 Leu Leu Asn Arg Ile Ser Phe Phe His Asn Glu Lys Ser Val Arg Tyr 145 150 155 160 His His Tyr Ser Ser Asn Phe Ser Ile Pro Lys Ala Asn His Ser His 165 170 175 Ser Gly Asp Tyr Tyr Cys Lys Gly Ser Leu Gly Arg Thr Leu His Gln 180 185 190 Ser Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Gly Pro Lys Ser Ser Arg Ser 195 200 205 Leu Pro Val Leu Thr Ile Val Ala Ala Val Thr Gly Ile Ala Val Ala 210 215 220 Ala Ile Val Ile Ile Leu Val Ser Leu Val Tyr Leu Lys Lys Lys Gln 225 230 235 240 Val Pro Ala Leu Pro Gly Asn Pro Asp His Arg Glu Met Gly Glu Thr 245 250 255 Leu Pro Glu Glu Val Gly Glu Tyr Arg Gln Pro Ser Gly Gly Ser Val 260 265 270 Pro Val Ser Pro Gly Pro Pro Ser Gly Leu Glu Pro Thr Ser Ser Ser 275 280 285 Pro Tyr Asn Pro Pro Asp Leu Glu Glu Ala Ala Lys Thr Glu Ala Glu 290 295 300 Asn Thr Ile Thr Tyr Ser Leu Leu Lys His Pro Glu Ala Leu Asp Glu 305 310 315 320 Glu Thr Glu His Asp Tyr Gln Asn His Ile 325 330 <210> 81 <211> 261 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 81 Met Phe Gln Asn Ala His Ser Gly Ser Gln Trp Leu Leu Pro Pro Leu 1 5 10 15 Thr Ile Leu Leu Leu Phe Ala Phe Ala Asp Arg Gln Ser Ala Ala Leu 20 25 30 Pro Lys Ala Val Val Lys Leu Asp Pro Pro Trp Ile Gln Val Leu Lys 35 40 45 Glu Asp Met Val Thr Leu Met Cys Glu Gly Thr His Asn Pro Gly Asn 50 55 60 Ser Ser Thr Gln Trp Phe His Asn Gly Arg Ser Ile Arg Ser Gln Val 65 70 75 80 Gln Ala Ser Tyr Thr Phe Lys Ala Thr Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr 85 90 95 Arg Cys Gln Met Glu Gln Thr Arg Leu Ser Asp Pro Val Asp Leu Gly 100 105 110 Val Ile Ser Asp Trp Leu Leu Leu Gln Thr Pro Gln Arg Val Phe Leu 115 120 125 Glu Gly Glu Thr Ile Thr Leu Arg Cys His Ser Trp Arg Asn Lys Leu 130 135 140 Leu Asn Arg Ile Ser Phe Phe His Asn Glu Lys Ser Val Arg Tyr His 145 150 155 160 His Tyr Lys Ser Asn Phe Ser Ile Pro Lys Ala Asn His Ser His Ser 165 170 175 Gly Asp Tyr Tyr Cys Lys Gly Ser Leu Gly Ser Thr Gln His Gln Ser 180 185 190 Lys Pro Val Thr Ile Thr Val Gln Asp Pro Ala Thr Thr Ser Ser Ile 195 200 205 Ser Leu Val Trp Tyr His Thr Ala Phe Ser Leu Val Met Cys Leu Leu 210 215 220 Phe Ala Val Asp Thr Gly Leu Tyr Phe Tyr Val Arg Arg Asn Leu Gln 225 230 235 240 Thr Pro Arg Glu Tyr Trp Arg Lys Ser Leu Ser Ile Arg Lys His Gln 245 250 255 Ala Pro Gln Asp Lys 260 <210> 82 <211> 249 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 82 Met Trp Gln Leu Leu Leu Pro Thr Ala Leu Val Leu Thr Ala Phe Ser 1 5 10 15 Gly Ile Gln Ala Gly Leu Gln Lys Ala Val Val Asn Leu Asp Pro Lys 20 25 30 Trp Val Arg Val Leu Glu Glu Asp Ser Val Thr Leu Arg Cys Gln Gly 35 40 45 Thr Phe Ser Pro Glu Asp Asn Ser Ile Lys Trp Phe His Asn Glu Ser 50 55 60 Leu Ile Pro His Gln Asp Ala Asn Tyr Val Ile Gln Ser Ala Arg Val 65 70 75 80 Lys Asp Ser Gly Met Tyr Arg Cys Gln Thr Ala Leu Ser Thr Ile Ser 85 90 95 Asp Pro Val Gln Leu Glu Val His Met Gly Trp Leu Leu Leu Gln Thr 100 105 110 Thr Lys Trp Leu Phe Gln Glu Gly Asp Pro Ile His Leu Arg Cys His 115 120 125 Ser Trp Gln Asn Arg Pro Val Arg Lys Val Thr Tyr Leu Gln Asn Gly 130 135 140 Lys Gly Lys Lys Tyr Phe His Glu Asn Ser Glu Leu Leu Ile Pro Lys 145 150 155 160 Ala Thr His Asn Asp Ser Gly Ser Tyr Phe Cys Arg Gly Leu Ile Gly 165 170 175 His Asn Asn Lys Ser Ser Ala Ser Phe Arg Ile Ser Leu Gly Asp Pro 180 185 190 Gly Ser Pro Ser Met Phe Pro Pro Trp His Gln Ile Thr Phe Cys Leu 195 200 205 Leu Ile Gly Leu Leu Phe Ala Ile Asp Thr Val Leu Tyr Phe Ser Val 210 215 220 Arg Arg Gly Leu Gln Ser Pro Val Ala Asp Tyr Glu Glu Pro Lys Ile 225 230 235 240 Gln Trp Ser Lys Glu Pro Gln Asp Lys 245 <210> 83 <211> 365 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 83 Met Gly Met Pro Leu Pro Trp Ala Leu Ser Leu Leu Leu Val Leu Leu 1 5 10 15 Pro Gln Thr Trp Gly Ser Glu Thr Arg Pro Pro Leu Met Tyr His Leu 20 25 30 Thr Ala Val Ser Asn Pro Ser Thr Gly Leu Pro Ser Phe Trp Ala Thr 35 40 45 Gly Trp Leu Gly Pro Gln Gln Tyr Leu Thr Tyr Asn Ser Leu Arg Gln 50 55 60 Glu Ala Asp Pro Cys Gly Ala Trp Met Trp Glu Asn Gln Val Ser Trp 65 70 75 80 Tyr Trp Glu Lys Glu Thr Thr Asp Leu Lys Ser Lys Glu Gln Leu Phe 85 90 95 Leu Glu Ala Leu Lys Thr Leu Glu Lys Ile Leu Asn Gly Thr Tyr Thr 100 105 110 Leu Gln Gly Leu Leu Gly Cys Glu Leu Ala Ser Asp Asn Ser Ser Val 115 120 125 Pro Thr Ala Val Phe Ala Leu Asn Gly Glu Glu Phe Met Lys Phe Asn 130 135 140 Pro Arg Ile Gly Asn Trp Thr Gly Glu Trp Pro Glu Thr Glu Ile Val 145 150 155 160 Ala Asn Leu Trp Met Lys Gln Pro Asp Ala Ala Arg Lys Glu Ser Glu 165 170 175 Phe Leu Leu Asn Ser Cys Pro Glu Arg Leu Leu Gly His Leu Glu Arg 180 185 190 Gly Arg Arg Asn Leu Glu Trp Lys Glu Pro Pro Ser Met Arg Leu Lys 195 200 205 Ala Arg Pro Gly Asn Ser Gly Ser Ser Val Leu Thr Cys Ala Ala Phe 210 215 220 Ser Phe Tyr Pro Pro Glu Leu Lys Phe Arg Phe Leu Arg Asn Gly Leu 225 230 235 240 Ala Ser Gly Ser Gly Asn Cys Ser Thr Gly Pro Asn Gly Asp Gly Ser 245 250 255 Phe His Ala Trp Ser Leu Leu Glu Val Lys Arg Gly Asp Glu His His 260 265 270 Tyr Gln Cys Gln Val Glu His Glu Gly Leu Ala Gln Pro Leu Thr Val 275 280 285 Asp Leu Asp Ser Ser Ala Arg Ser Ser Val Pro Val Val Gly Ile Val 290 295 300 Leu Gly Leu Leu Leu Val Val Val Ala Ile Ala Gly Gly Val Leu Leu 305 310 315 320 Trp Gly Arg Met Arg Ser Gly Leu Pro Ala Pro Trp Leu Ser Leu Ser 325 330 335 Gly Asp Asp Ser Gly Asp Leu Leu Pro Gly Gly Asn Leu Pro Pro Glu 340 345 350 Ala Glu Pro Gln Gly Ala Asn Ala Phe Pro Ala Thr Ser 355 360 365

Claims (23)

  1. 적어도 하나의 융합 단백질을 포함하는 EV로서, 상기 적어도 하나의 융합 단백질이 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드에 융합된 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하는, EV.
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드가 단백질 A, 단백질 G, 단백질 A/G, 단백질 L, 단백질 LG, Z 도메인, ZZ 도메인, 인간 FCGRI, 인간 FCGR2A, 인간 FCGR2B, 인간 FCGR2C, 인간 FCGR3A, 인간 FCGR3B, 인간 FCGRB, 인간 FCAMR, 인간 FCERA, 인간 FCAR, 마우스 FCGRI, 마우스 FCGRIIB, 마우스 FCGRIII, 마우스 FCGRIV, 마우스 FCGRn, SPH 펩타이드, SPA 펩타이드, SPG2, SpA 모방체 1, SpA 모방체 2, SpA 모방체 3, SpA 모방체 4, SpA 모방체 5, SpA 모방체 6, SpA 모방체 7, SpA 모방체 8, SpA 모방체 9, SpA 모방체 10, Fey 모방체 1, Fey 모방체 2, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, EV.
  3. 청구항 1 내지 2 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드가 1 초과 Fc 결합 영역을 포함하는, EV.
  4. 청구항 1 내지 3 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드가 CD9, CD53, CD63, CD81, CD54, CD50, FLOT1, FLOT2, CD49d, CD71, CD133, CD138, CD235a, ALIX, 신테닌-1, 신테닌-2, Lamp2b, TSPAN8, TSPAN14, CD37, CD82, CD151, CD231, CD102, NOTCH1, NOTCH2, NOTCH3, NOTCH4, DLL1, DLL4, JAG1, JAG2, CD49d/ITGA4, ITGB5, ITGB6, ITGB7, CD11a, CD11b, CD11c, CD18/ITGB2, CD41, CD49b, CD49c, CD49e, CD51, CD61, CD104, Fc 수용체, 인터류킨 수용체, 면역글로불린, CD2, CD3 엡실론, CD3 제타, CD13, CD18, CD19, CD30, CD34, CD36, CD40, CD40L, CD44, CD45, CD45RA, CD47, CD86, CD110, CD11 1, CD115, CD117, CD125, CD135, CD184, CD200, CD279, CD273, CD274, CD362, COL6A1, AGRN, EGFR, GAPDH, GLUR2, GLUR3, HLA- DM, HSPG2, L1 CAM, LAMB1, LAMC1, LFA-1, LGALS3BP, Mac-1 알파, Mac-1 베타, MFGE8, SLIT2, STX3, TCRA, TCRB, TCRD, TCRG, VTI1A, VTI1B, 다른 엑소좀 폴리펩타이드, 및 이들의 임의의 조합을 포함하는 군으로부터 선택되는, EV.
  5. 청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드가 상기 EV의 외부 표면에서 표시되는, EV.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드가 적어도 하나의 Fc 함유 단백질에 결합되는, EV.
  7. 청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EV가 상기 복수의 Fc 함유 단백질의 Fc 도메인과 상기 Fc 결합 폴리펩타이드 사이의 상호작용을 통해 복수의 Fc 함유 단백질에 결합되고, 상기 복수의 Fc 함유 단백질이 동일한 것 또는 상이한 것일 수 있는, EV.
  8. 청구항 1 내지 7 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 Fc 함유 단백질이 Fc 도메인을 포함하도록 조작된 항체 및/또는 단백질인, EV.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 항체가 표적 항체, 치료적 항체, 항체-약물 콘주게이트 (ADC), 또는 옵소닌화 및/또는 면역 세포-매개된 청소능 감소용 항체인, EV.
  10. 청구항 6 내지 9 중 어느 한 항에 있어서, 적어도 하나의 Fc 함유 단백질에 결합된 상기 EV가 적어도 10, 바람직하게는 적어도 20, 더욱 더 바람직하게는 적어도 30 Fc 함유 단백질에 결합되는, EV.
  11. 청구항 6 내지 10 중 어느 한 항에 있어서, 상기 적어도 하나의 Fc 함유 단백질이 상기 EV 내부에서, 상기 EV의 지질 막에서 및/또는 상기 EV의 외부 표면에 부착되어 존재하는, EV.
  12. (i) 융합 단백질과, (ii) Fc 함유 단백질 사이의 비-공유 복합체로서,
    상기 융합 단백질이 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드에 융합된 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드를 포함하며, 상기 Fc 결합 폴리펩타이드가 상기 Fc 함유 단백질에 결합하는 것을 특징으로 하는, 비-공유 복합체.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 비-공유 복합체가 EV의 지질 막에서 및/또는 EV 내부에서 존재하는, 비-공유 복합체.
  14. 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 EV, 및/또는 청구항 12 내지 13 중 어느 한 항에 따른 상기 비-공유 복합체, 및 선택적으로 약제학적으로 허용가능한 담체를 포함하는, 약제학적 조성물.
  15. 의약에서 사용하기 위한, 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 EV, 및/또는 청구항 12 내지 13 중 어느 한 항에 따른 비-공유 복합체, 및/또는 청구항 14에 따른 약제학적 조성물.
  16. 세포외 소포 (EV)에 적어도 하나의 Fc 함유 단백질을 부착시키는 방법으로서, 하기 단계를 포함하는, 방법:
    (i) 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는 EV를 제공하는 단계; 및
    (ii) 상기 융합 단백질의 상기 Fc 결합 폴리펩타이드를 적어도 하나의 Fc 함유 단백질의 상기 Fc 도메인에 결합시키는 단계.
  17. 적어도 하나의 Fc 결합 폴리펩타이드 및 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 포함하는 융합 단백질을 포함하는, 폴리펩타이드 작제물.
  18. 청구항 17의 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물에 대하여 인코딩하는, 폴리뉴클레오타이드 작제물.
  19. 청구항 17에 따른 적어도 하나의 폴리펩타이드 작제물, 청구항 18에 따른 적어도 하나의 폴리뉴클레오타이드 작제물, 청구항 1 내지 11 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 EV 및/또는 청구항 12 내지 13 중 어느 한 항에 따른 적어도 하나의 비-공유 복합체를 포함하는, 세포.
  20. (i) EV에서 포함된 Fc 결합 폴리펩타이드에 적어도 하나의 Fc 함유 단백질의 상기 Fc 도메인을 부착시키는 단계, 및 (ii) 상기 적어도 하나의 Fc 함유 단백질에 부착된, 상기 EV를, 표적 세포와 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 세포에 적어도 하나의 Fc 함유 단백질의 전달 방법.
  21. 청구항 20에 있어서, 상기 방법이 생체외, 생체내, 및/또는 시험관내 수행되는, 방법.
  22. 청구항 20 내지 21 중 어느 한 항에 있어서, 상기 EV의 상기 Fc 결합 폴리펩타이드가 적어도 하나의 엑소좀 폴리펩타이드를 가진 융합 단백질의 일부인, 방법.
  23. 청구항 20 내지 22 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 함유 단백질이 표적 세포에 전달되는, 방법.
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