CN109689098A

CN109689098A - 包括具有fc结合能力的融合蛋白的胞外囊泡的用途

Info

Publication number: CN109689098A
Application number: CN201780045183.0A
Authority: CN
Inventors: A.格根斯; D.古普塔; O.维克兰德
Original assignee: Medical Fox Therapy Co Ltd
Current assignee: Medical Fox Therapy Co Ltd; Evox Therapeutics Ltd
Priority date: 2016-07-21
Filing date: 2017-07-21
Publication date: 2019-04-26
Also published as: EP4299137A3; JP2023026440A; JP7254016B2; EP3487529A1; BR112019001099A2; CN109689097A; SG11201811151PA; CA3031183A1; US11236143B2; US20220098267A1; KR20190032480A; WO2018015535A1; SG10202100598RA; SG11201811152YA; EP3487528A1; GB2552473A; WO2018015539A1; SG10202100597TA; GB201612643D0; EP3487528B1

Abstract

本发明涉及用于各种各样的研究、诊断、成像和治疗应用中的工程化胞外囊泡(EV)。所述EV被工程化以使能够并入和表面展示各种关注的蛋白，所关注的蛋白本质上可以是外源性的和/或内源性的。通过EV多肽的发明性蛋白质工程化来实现EV的涂覆，并且本发明因此涉及用于涂覆EV的方法、EV本身、以及试剂盒、检测方法、诊断应用、基于所述工程化EV的成像和递送方法。

Description

包括具有FC结合能力的融合蛋白的胞外囊泡的用途

技术领域

本发明涉及胞外囊泡，所述胞外囊泡被工程化以作为用于例如标准化和评估针对EV表征的测定、诊断各种疾病的研究和诊断工具和作为用于例如流式细胞术的生物参比材料(RM)起作用。

背景技术

胞外囊泡(EV)是通过EV产生的细胞释放到胞外环境中的纳米尺寸的囊泡。已经示出EV以及具体地外排体能够转运蛋白质生物如抗体和诱饵受体，从而实现利用EV特性结合重组蛋白的特异性的先进的生物治疗剂的完全新颖的形式。此外，已证明取决于其起源和生物体的疾病状态的不同质量的EV的存在以及对特定类型或质量的EV在诊断方面的检测的后续值。受此大量不同的电位应用的触发，已建立或正在建立旨在设定大小、枚举和表型EV的许多分析方法。这种方法包含流式细胞术、光散射、纳米颗粒跟踪分析(NTA)和/或在结合不同探针之后对荧光进行的检测。

人体液中的EV的分子含量和浓度已经升高，从而提高对其用作生物标志物的用途的关注(Fais等人，2016)。仍未完全实现基于EV的生物标志物，部分是因为缺乏标准化。标准化很难，因为仪器校准、结果解释和验证以及测量的比较需要具有与EV的特性等同或非常类似的参比材料(RM)。最多分析的EV样本的特性之一是浓度。然而，所测得的EV浓度取决于EV的物理特性，如下文进一步说明的大小分布和屈光指数(RI)，这使分析复杂化。

小于300nm的EV构成EV群体的大多数(Aatonen等人，2014)。EV的典型大小分布以约30nm开始，这展现出直径＜100nm的峰值，并且随后是直径＞100nm的减小的幂律函数或指数函数(van der Pol等人，2016)。除了透射电子显微术(TEM)之外，当前的分析方法均不能检测EV的整个群体(van der Pol等人，2016)。无法检测最小的EV导致所确定的浓度的差异和低估。因此，所报道的正常人血浆中的EV的数量在10⁴mL-1到10¹²mL-1的范围内(vander Pol等人，2014a)。EV浓度中的这8个数量级差异强调了对标准化的需求。

流式细胞术是EV研究中最常用的方法之一(Lacroix等人，2010)，在流式细胞术中，颗粒检测通常基于光散射。因为二氧化硅(1.45)和聚苯乙烯珠(1.61)的RI比天然存在的EV的平均RI(约1.39)高，对二氧化硅或聚苯乙烯珠的散射信号施加栅极将导致对EV大小和浓度的错误估计(van der Pol，2012，2014b)。例如，对散射与约500nm的EV相同量的光的200nm的聚苯乙烯珠设置较低大小的栅极(Chandler等人，2011)导致排除在200nm与500nm之间的EV(van der Pol等人，2014b)。由于EV的浓度随直径增大而降低，因此聚苯乙烯大小栅极通常导致对实际EV浓度的低估。

在纳米颗粒跟踪分析(NTA)的情况下，斯托克斯-爱因斯坦方程用于从其布朗运动推导出流体动力学直径(Dragovic等人，2011)。尽管在NTA中EV的RI不影响所测得的直径，但是EV大小分布和RI影响所测得的浓度(Filipe等人，2010)，因为所测得的浓度取决于散射颗粒的亮度。

总而言之，这些实例强调对开发具有类似的RI和大小分布、而优选地还具有类似于所研究的EV的形态学(对于TEM)和ζ电位(对于可调电阻脉冲感测，TRPS)的RM的迫切需求。最后，其它RM特性还将与EM的那些特性相匹配，包含表面分子或内部运载。这是极具挑战性的，因为针对EV研究的最佳RM的开发和用于其检测的分析方法彼此依赖。进一步地，不同的分析技术取决于EV的不同特性。

虽然已表征和描述了针对单分散的(Lacroix等人，2010；Chandler等人，2011；Maas等人，2015)和双模的(Nicolet等人，2016)合成RM的用途的若干研究，但是所报道的生物RM的用途是受限的。具有类似于EV的物理和生物化学特性的亚微米颗粒可以从天然存在源中分离并且可以包含1)从例如细胞培养物中分离的EV群体；2)血浆脂蛋白、植物和海洋病毒；以及3)小型球形形状的(球菌状)细菌或超微型浮游生物。潜在的EV源是体外细胞培养物、治疗临床级的红细胞和血小板浓缩物、尿液、以及由细菌产生的外膜囊泡。在此，特定优点在于所获得的RM具有带有真实EV的增强的物理和生物化学相似性，包含分子含量。

来自植物和海洋源的脂蛋白和病毒颗粒适合作为EV-RM，因为它们具有与大部分EV重叠的大小分布并且它们具有相对较小的大小变化。然而，脂蛋白和病毒颗粒的主要缺点在于由于其高蛋白含量、尤其蛋白包膜病毒的突出问题，这些颗粒的RI比EV的RI高。使用病毒颗粒的另一个问题是其生物安全性，这可能通过产生病毒样颗粒来规避，即颗粒缺少病毒基因组。

生物RM可以进一步通过干扰细胞来产生以由产生具有不同直径的颗粒的片段产生小囊泡。使用这种材料的主要优点在于与合成的RM相比，所获得的RM的物理和生物化学特性将更类似于EV。红细胞是理论上使用的理想材料，因为其细胞膜组合物被很好表征并且它们缺乏胞内膜。此外，红细胞在延长的储存期间是结构上稳定的并且是容易得到的材料。出于这些原因，已经使用来自临床剩余浓缩物的红细胞来产生用于测试和评估的RM，并且还已经比较了用于红细胞干扰的不同方法。生物RM还可以从广泛用作递送媒剂的脂质构建体如脂质体获得，并且其产生方法是众所周知的。期望大小的脂质体可以通过使起始材料通过例如设定孔隙大小的聚碳酸酯过滤器的超声处理或挤出来制备。脂质体的优点在于其RI可以在产生过程中进行操纵。

目前，冻干的外排体用作标准化的阳性对照以进行免疫捕获性能评估。冻干是通常应用于维持各种类型的生物样本的长期稳定性的技术，并且冻干的外排体可以作为用于多个应用的对照物标准和作为用于定量来自生物样本的外排体衍生的标记物的校准标准购买，所述多个应用包含流式细胞术(FACS)、蛋白质印迹法(WB)、ELISA。然而，冻干相当大地影响EV的生物物理和生物特性，并且因此，用于生成生物RM的这种方法不适于强大的分析方法，其中需要与呈其天然形式的EV的相似性。

因此，虽然作出大量尝试来设计用于EV的相关RM，但是所述领域远非达到适合的解决方案。此外，尽管对EV作出大量研究，但是已出现其作为研究工具和/或诊断工具用于转运EV的非常少的有用应用的药物运载能力。

发明内容

因此，本发明的目的是克服上文标识的与使用非生物RM像基本上由具有与EV的特性不类似的特性的颗粒和外排体组成的珠或生物RM相关联的问题。本发明还旨在满足本领域内另一个现有需求，例如实现将EV用作可预测的和特定的阳性对照物、用作补偿对照物或用作用于任何种类的使用例如抗体、荧光探针和/或各种生物分子的测定的生物RM来检测、枚举、设定大小或表型EV以进行研究和诊断。此外，本发明还旨在提供在临床前、临床和诊断环境中作为例如与免疫组织化学、显微术、放射性标记等组合的研究工具的EV的新颖的重要用途。具体地讲，工程化EV的独特递送特性在于本申请利用的用于解决生物医学研究的广泛领域内的若干障碍。

本发明通过利用人和/或非人起源的Fc结合多肽(在本文中通常被称为Fc结合物)工程化EV的内容和特征来实现这些和其它目标。这种Fc结合多肽经常与外排体多肽融合以增强具有Fc结合多肽的EV的负载量。包括Fc结合多肽的EV然后可以允许与抗体上存在的Fc结构域、天然地包括Fc结构域的其它蛋白和/或已修饰以包括出于本发明的目的的Fc结构域的蛋白结合。

因此，本发明提供了一种生物RM，其包括包含至少一个Fc结合多肽的EV，所述至少一个Fc结合多肽与外排体多肽一起形成融合蛋白的部分。在有利的实施例中，含Fc的蛋白(如可以用检测部分标记的抗体)的Fc结构域通过所述EV的所述Fc结合多肽结合，由此生成具有作为RM、诊断工具、成像工具的广泛应用和基本上用于任何研究目的的涂覆的EV。因此，在第一方面，本发明提供了一种作为研究工具、诊断工具、成像工具、检测试剂盒、作为生物RM、作为实验对照和/或实验标准的EV的用途，所述EV包括至少一个Fc结合多肽。

在另一方面，本发明涉及一种用于将含Fc的蛋白递送到靶细胞的体外、体内和/或离体方法。所述方法包括以下步骤：(i)提供包括至少一个Fc结合多肽的EV；(ii)允许所述Fc结合多肽与所述含Fc的蛋白结合；以及(iii)使所述EV与靶细胞接触，所述EV已将所述含Fc的蛋白连接到其Fc结合多肽上，以实现所讨论的含Fc的蛋白的胞内、胞外和/或膜内递送。

在又另一方面，本发明通过了一种包括EV的检测试剂盒，其中所述EV包括融合蛋白，所述融合蛋白包括至少一个Fc结合多肽和至少一个外排体多肽。所述Fc结合多肽可以与至少一个含Fc的蛋白如抗体结合(连接)。所述检测试剂盒可以用于各种目的，例如检测可以通过递送例如针对所讨论的抗原的标记的抗体来实现的胞内、膜内或胞外抗原。

在另一方面，本发明涉及一种部件试剂盒，其包括(i)包括至少一个Fc结合多肽的EV，和(ii)至少一个含Fc的蛋白。如上文所提及的，所述Fc结合多肽可以与至少一个外排体多肽融合以增加EV中或上的Fc结合物的数量。

在又另一方面，本发明涉及一种纳米颗粒复合物，其介于(i)包括至少一个Fc结合多肽的EV与(ii)至少一个含Fc的蛋白之间。所述至少一个含Fc的蛋白可以是一种类型的含Fc的蛋白(例如，靶向胞内致癌蛋白的抗体的多个拷贝)或多于一种类型的含Fc的蛋白的若干拷贝(例如，针对一个胞内靶标的抗体的多个拷贝和针对膜靶标的另一个抗体的多个拷贝)。通常，在根据本发明的EV与含Fc的蛋白之间形成的所述纳米颗粒复合物可以在各种研究、诊断和治疗领域中广泛使用，例如在流式细胞术、电子显微术、共聚焦和/或荧光显微术、体外、体内和/或离体诊断、靶细胞的成像和/或治疗内使用并且用于许多其它目的。

在另外的方面，本发明涉及用于产生能够与包括Fc结构域的蛋白结合的EV的方法。这种方法可以包括以下步骤：(i)将对包括至少一个Fc结合物多肽和至少一个外排体多肽的融合蛋白进行编码的多核苷酸构建体引入到EV源细胞中；以及(ii)收获从所述EV源细胞分泌的EV，所述EV包括所关注的融合蛋白。此外，本发明涉及用于用包括Fc结构域的至少一个蛋白涂覆EV的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供包括融合蛋白的EV，所述融合蛋白包括至少一个Fc结合物和至少一个外排体多肽；以及(ii)允许所述融合蛋白的所述Fc结合物与包括Fc结构域的至少一个蛋白的Fc结构域结合。

最后，本发明还涉及融合蛋白，所述融合蛋白包括至少一个Fc结合多肽和至少一个外排体多肽、以及对这种融合蛋白进行编码的多核苷酸构建体、以及载体、EV和包括这种构建体的细胞。

附图说明

图1.包括融合蛋白的EV的示意性图示，所述融合蛋白包括与Fc结合多肽(即Fc结合物结构域)融合的外排体蛋白。Fc结合物能够结合例如抗体和/或包括Fc结构域的任何其它蛋白质，由此使EV变成用于蛋白质治疗剂的多价递送媒剂。

图2.EV的电子显微术图片，所述EV包括用纳米金标记的抗体(即含Fc的蛋白)装饰的Fc结合多肽(A)，而缺少Fc结合多肽的对照EV(B)不具有与其表面结合的任何抗体。

图3.流式细胞术数据，其示出包括Fc结合多肽的EV结合所关注的含Fc的蛋白(人IgG)。结合对于试剂盒中包含的所有珠群体是非常有效的，包含非特异性/同种型/阴性对照珠群体。

图4.与仅在HER2高表达细胞系MDA-MB-361中而不在HER2低表达细胞系MDA-MB-231中的同种型对照物装饰的和野生型EV相比，抗HER2抗体增加了抗体装饰的EV的摄取。

图5.荧光标记的抗体的信号明显存在于用已连接到其包括Fc结构域的表面抗体上的Fc结合的EV处理的细胞中，而荧光信号不存在于通过荧光显微术(A)和流式细胞术(B)测量的未处理的(1)或对照物EV处理的(2)细胞中。这表明含Fc的蛋白如抗体可以通过Fc结合EV在胞内递送，并且与EV的结合显著地增加了摄取到细胞中的抗体。

图6.当抗NFkB抗体通过Fc结合EV(即包括至少一个Fc结合多肽的EV与至少一个外排体多肽融合)递送到细胞中时对NFkB-介导的胞内信号的成功抑制。

具体实施方式

本发明涉及用于大量的研究、诊断和治疗应用的包括至少一个Fc结合多肽的EV。在有利的实施例中，至少一个Fc结合多肽包括在具有EV多肽的融合蛋白中以增加每个EV中的Fc结合多肽的数量。在有利的实施例中，含Fc的蛋白(如可以用检测部分标记的抗体)的Fc结构域通过EV的Fc结合多肽结合，由此产生已将所述含Fc的蛋白连接到其表面上的EV，从而导致具有广泛应用技术如流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析、显微术和电子显微术的作为诊断工具、作为成像工具并且基本上用于任何研究、成像、诊断和治疗目的的纳米颗粒。

为方便和清楚起见，在下文中收集并描述了本文中采用的某些术语。除非另外限定，否则在此所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

当本发明的特征、方面、实施例或替代方案以马库什组描述时，本领域技术人员将认识到，本发明还由此以马库什组的任何单独成员或成员的子组进行描述。本领域技术人员将进一步认识到，本发明还由此以马库什组的单独成员或成员的子组的任何组合进行描述。此外，应注意，结合本发明的方面和/或实施例之一进行描述的实施例和特征在进行必要的修改后还适用于本发明的所有其它方面和/或实施例。例如，本文中结合包括包含这种Fc结合多肽的融合蛋白的EV进行描述的Fc结合多肽应被理解为公开的、与本文中的所有其它方面、教导和实施例例如与用于产生或涂覆EV的方法相关或与本文中描述的多核苷酸和多肽构建体相关的方面和/或实施例相关和兼容。此外，结合某些方面例如如所描述的与作为生物RM相关的其用途相关的包括已将多个含Fc的蛋白连接到EV上的Fc结合多肽的EV的用途描述的某些实施例还可以天然地与关于其它方面和/或实施例例如与例如病理学和/或免疫组织化学中的作为诊断工具和/或成像工具的EV的用途相关的实施例相关。此外，本文中标识的所有多肽和蛋白质可以使用用于融合多肽的常规策略自由地组合到融合蛋白中。作为非限制性实例，本文中描述的所有Fc结合多肽可以按任意组合方式与一个或多个外排体多肽自由地结合。而且，Fc结合多肽可以彼此组合以生成包括多于一个Fc结合多肽的构建体。此外，任何和所有特征(例如马库什组的任何和所有成员)可以与任何和所有其它特征(例如任何其它马库什组的任何和所有成员)自由地组合，例如任何Fc结合蛋白可以与任何含Fc的蛋白如任何抗体组合，或者任何外排体多肽可以与任何Fc结合多肽组合。此外，当本文中的教导涉及单数形式的EV(和/或EV锚定的融合蛋白-含Fc的蛋白复合物)和/或作为离散的天然纳米颗粒样囊泡的EV时，应理解所有这种教导与多个EV和EV群体和用含Fc的蛋白涂覆的EV同等相关且适用于所述多个EV和EV群体和用含Fc的蛋白涂覆的所述EV。作为一般注释，Fc结合多肽、含Fc的蛋白如抗体、EV产生的细胞源、外排体多肽以及根据本发明的所有其它方面、实施例和替代方案可以以任何和所有可能的组合自由地组合而不脱离本发明的范围和主旨。此外，只要任何给定分子保持进行与其相关联的期望的技术效果的能力，本发明的任何多肽或多核苷酸或任何多肽或多核苷酸序列(对应地氨基酸序列或核苷酸序列)就可以相当大地脱离原始多肽、多核苷酸和序列。只要维持其生物特性，根据本发明的多肽和/或多核苷酸序列就可以脱离与原生序列相比至多50％(使用例如BLAST或ClustalW计算)，尽管尽可能高的序列同一性是优选的(例如60％、70％、80％或例如90％或更高)。例如至少一个Fc结合多肽和至少一个外排体蛋白的组合(融合)暗示相应多肽的某些区段可以被替换和/或修饰和/或序列可以通过插入其它氨基酸拉伸物而中断，这意味着只要保存了关键特性(例如，Fc结合特性、对外排体的表面运输、结合亲和力等)，与原生序列的偏离就可以是相当大的。类似推理因此理所当然地适于对这种多肽进行编码的多核苷酸序列。本文中提及的结合肽、多肽和蛋白质的所有登录号和SEQ ID NO应仅被视为实例并且仅供参考，并且所有肽、多肽和蛋白质应给定如技术人员将理解的其普通含义。因此，如上文所提及的，技术人员还将理解本发明不仅仅涵盖本文中涉及的特定的SEQ ID NO或登录号，而且还有其变体和衍生物。除非另外提及，否则本文中涉及的所有登录号是根据2017年6月22日版本的数据库的UniProtKB登录号，并且本文中提及的所有蛋白质、多肽、肽、核苷酸和多核苷酸将根据如技术人员所理解的其常规含义进行解释。

术语“胞外囊泡”或“EV”或“外排体”在本文中可互换地使用并且应被理解为涉及任何类型的可从呈任何形式的细胞获得的囊泡，例如微囊泡(例如从细胞的血浆膜脱落的任何囊泡)、外排体(例如源自内溶酶体通路的任何囊泡)、(例如可从凋亡细胞获得的)凋亡小体、(可以源自例如血小板的)微颗粒、(可源自例如血清中的中性粒细胞和单核细胞的)核外颗粒体、(例如可从前列腺癌细胞获得的)前列腺颗粒体或(例如可源自心肌细胞的)心肌颗粒体等。EV的大小可以大大变化，而EV通常具有纳米大小的流体动力学半径，即低于1000nm的半径。显然，EV可以源自任何细胞类型，可以是体内、离体和体外细胞。此外，所述术语还应被理解为涉及通过例如膜挤出、超声处理或其它技术等获得的胞外囊泡模拟物、基于细胞膜的囊泡。技术人员将清楚的是，在描述EV的研究、诊断、医疗、技术和科学用途和应用时，本发明一般涉及多个EV，即可以包括数千、数百万、数十亿或甚至数万亿的EV的EV群体。如可以从下文实验部分看到的，EV可以以如每体积单位(例如每ml)10⁵、10⁸、10¹⁰、10¹¹、10¹²、10¹³、10¹⁴、10¹⁵、10¹⁸、10²⁵、10³⁰的EV(通常被称为“颗粒”)或任何其它更大、更小或介于其中的任何地方的数量的浓度存在。同样地，可以例如涉及包括介于外排体多肽与进而可以与所关注的含Fc的蛋白结合的Fc结合多肽之间的某些融合蛋白的EV的术语“群体”应被理解为涵盖构成这种群体的多个实体。换言之，以多个存在的单独EV构成EV群体。因此，自然而然地，本发明涉及如技术人员将清楚的单独EV和包括EV的群体两者。此外，除了可以与EV表面结合的含Fc的蛋白之外，本发明的EV还可以包括额外治疗剂和/或诊断剂。在一些实施例中，EV可以包括诊断剂和追踪剂，如荧光团、放射性化合物、示踪剂、无机和有机化合物、成像剂等。在另外的实施例中，额外治疗剂可以是至少一种治疗小分子药物。在一些实施例中，治疗小分子药物可以选自由以下组成的组：DNA损伤剂、抑制DNA合成的药剂、微管和微管蛋白结合剂、抗代谢物、氧化性损伤的诱导剂、抗血管生成、内分泌疗法、抗雌激素、免疫调制剂如Toll样受体激动剂或拮抗剂、组蛋白脱乙酰酶抑制剂、信号转导抑制剂如激酶抑制剂、热休克蛋白抑制剂、类视黄醇、生长因子受体抑制剂、抗有丝分裂化合物、抗炎剂、细胞周期调控因子、转录因子抑制剂、以及凋亡诱导剂及其任何组合。在另外的实施例中，额外药剂可以是治疗剂和/或诊断剂和/或基于核酸的成像剂。这种基于核酸的治疗剂可以选自由以下组成的组：单链RNA或DNA、双链RNA或DNA、寡核苷酸如siRNA、剪接转换RNA、CRISPR引导链、短发夹RNA(shRNA)、miRNA、反义寡核苷酸、多核苷酸如mRNA、质粒或任何其它RNA或DNA载体。特别关注的是基于核酸的药剂，所述基于核酸的药剂是化学合成的和/或包括化学修饰的核苷酸，如2'-O-Me、2'-O-Allyl、2'-O-MOE、2'-F、2'-CE、2'-EA 2'-FANA、LNA、CLNA、ENA、PNA、硫代磷酸、三环-DNA等。在又另外的实施例中，根据本发明的EV可以包括额外治疗剂和/或诊断剂，所述额外治疗剂和/或诊断剂可以是蛋白质和/或肽。这种蛋白质和/或肽可以存在于EV内部、插入到EV膜中或与EV膜相关联，或者可以从EV突出到外囊泡环境中。这种蛋白质和/或肽剂可以选自非限制性实例的组，所述非限制性实例包含：抗体、胞内抗体、单链可变片段(scFv)、亲合体、用于例如酶替换疗法或基因编辑的双特异性和多特异性抗体或结合物、亲合体、DARPin、受体、配体、酶、肿瘤抑制基因、病毒和细菌抑制剂、细胞组分蛋白、DNA和/或RNA结合蛋白、DNA修复抑制剂、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、凋亡抑制剂和诱导剂、毒素(例如假单胞菌外毒素)、结构蛋白、神经营养因子如NT3/4、脑衍生神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)及其单独亚单元如2.5Sβ亚单元、离子通道、膜转运体、蛋白质稳态因子、细胞信号传导中涉及的蛋白质、转译和转录相关蛋白、核苷酸结合蛋白、蛋白结合蛋白、脂质结合蛋白、粘多糖(GAG)和GAG结合蛋白、代谢蛋白、细胞应激调节蛋白、炎症和免疫系统调节蛋白、线粒体蛋白和热休克蛋白等。在优选的实施例中，治疗剂可以是具有完整核酸酶活性的与RNA链相关联(即携带其)的CRISPR相关(Cas)多肽(如Cas9(作为非限制性实例，登录号为Q99ZW2))，一旦通过EV递送，所述RNA链使Cas多肽能够在靶细胞中执行其核酸酶活性。可替代地，在另一个优选的实施例中，Cas多肽可以催化失活以实现靶向基因工程化。又另一个替代方案可以是任何其它类似的CRISPR效应子如单个RNA引导的核酸内切酶Cpf1(来自物种如氨基酸球菌属或毛螺菌科)(作为非限制性实例，登录号为U2UMQ6和A0Q7Q2)。额外优选的实施例包含选自包括以下的组的治疗蛋白：针对溶酶体贮积障碍的酶，例如葡糖脑苷脂酶如伊米苷酶、α-半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖醛酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶和艾度硫酸酯酶、芳香基硫酸酯酶、加硫酶、酸性α葡糖苷酶、鞘磷酯酶、乳糖脑苷酯酶、半乳糖神经酰、葡溏苷酰鞘氨醇酶(作为非限制性实例，登录号为P04062)、神经酰胺酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、溶酶体酸性脂肪酶、酸性鞘磷脂酶、NPC1(作为非限制性实例，登录号为O15118)、NPC2(作为非限制性实例，登录号为P61916)、乙酰肝素磺酰胺酶、N-乙酰葡糖胺糖苷酶、乙酰肝素-α-氨基葡糖苷-N-乙酰转移酶、N-乙酰氨基葡萄糖6-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、透明质酸酶、α-N-乙酰神经氨酸苷酶、GlcNAc磷酸转移酶、粘脂蛋白1、软脂酰-蛋白硫酯酶、三肽氨基肽酶I、软脂酰-蛋白硫酯酶1、三肽氨基肽酶1、battenin、linclin、α-D-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、天冬氨酰葡、α-L-岩藻糖苷酶、胱肽素、组织蛋白酶K、唾液酸转运蛋白、LAMP2和氨基己糖苷酶。在其它优选的实施例中，治疗蛋白可以是例如修饰炎症应答的胞内蛋白例如表观遗传蛋白如甲基化酶和布罗莫结构域、或修饰肌肉功能的胞内蛋白例如转录因子如MyoD(作为非限制性实例，登录号为P15172)或Myf5、调节肌肉收缩力的蛋白例如肌浆球蛋白、肌动蛋白、钙/结合蛋白如肌钙蛋白、或结构蛋白如抗肌萎缩蛋白(作为非限制性实例，登录号为P11532)、迷你抗肌萎缩蛋白(作为非限制性实例，登录号为P15172)、肌营养相关蛋白、肌联蛋白、伴肌动蛋白、抗肌萎缩蛋白相关蛋白如小肌营养蛋白、互养蛋白、肌肉萎缩相关蛋白、肌间线蛋白、肌糖、肌养蛋白聚糖、肌长、集聚蛋白和/或fukutin蛋白。重要的是，上文提及的所有治疗蛋白可以被工程化以含有Fc蛋白以使能够与EV上存在的Fc结合多肽结合。另一个非限制性实例是将Fc结构域融合到酶NPC1上以便后续递送到靶细胞中。可以用于改善EV递送的含Fc的蛋白(例如，Fc-Cas9或抗体)的胞内生物活性的又另一个非限制性实例是将Fc结构域与内体逃逸肽或蛋白如HA2、细胞穿透肽(CPP)如TAT肽、转运素、穿透素、聚赖氨酸、或gp41、霍乱毒素、志贺毒素、皂草素、白喉毒素肽等融合。展示EV的表面上的这种内体逃逸结构域可以增强到靶细胞中的内化和后续内体逃逸两者。

Fc结构域如何可以融合到所关注的蛋白上的有利的非限制性实例是将Fc结构域融合到Cas9、Cpf1、非切割Cas变体或任何其它类型的基因编辑蛋白或核糖核蛋白(RNP)上以进行到靶细胞中的EV介导的递送。在优选的实施例中，Fc结构域将N端或C端与Cas9融合，所述Cas9体外或离体已预负载有单引导RNA(sgRNA)链(Cas预负载有被称为核糖核蛋白(RNP)复合物的RNA形式)。然后，允许所产生的因此形成的含Fc结构域的RNP复合物通过连接到其的适合的EV的Fc结合多肽与EV表面结合，随后递送到靶细胞中。RNP复合物的产生可以以不同的方式实现并且具有不同的RNA组分，如常规单引导RNA、包括任选地与发夹环组合的crRNA和tracrRNA两者的合成引导RNA、crRNA、tracrRNA及其各种组合。用于同源定向重组或非同源末端连接的修复模板或任何其它修复或替换机制还可以包含在预先形成的RNP中，然后可以使用Fc结构域-Fc结合多肽键联将所述预先形成的RNP连接到EV上。

如本文所描述的，术语“抗体”和“mAb”和“Ab”将被理解为包含以其整体的抗体(即，全部抗体)和其具有抗体结合特性的任何衍生物两者。常规地，抗体是指包括通过二硫键相互连接的至少两个重(H)链和两个轻(L)链的糖蛋白或其抗原结合部分。每条重链由重链可变区(本文中缩写为V_H)和重链恒定区构成。每条轻链由轻链可变区(本文中缩写为V_L)和轻链恒定区构成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。V_H区和V_L区可以进一步细分为被称作互补决定区(CDR)的超变区，所述超变区散布有更保守的被称作构架区(FR)的区域。重要的是，出于本发明的目的，所关注的抗体优选地具有Fc结构域或其衍生物，本发明的Fc结合多肽可以与所述Fc结构域或其衍生物结合，以使能够涂覆EV表面。本发明中使用的抗体可以是单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体，优选地mAb。本发明中特别应用的抗体可以是嵌合抗体、CDR-移植的抗体、纳米抗体、人或人源化抗体、或其任何衍生物，只要其可以通过Fc结合多肽结合，所述Fc结合多肽典型地包括在根据本发明的融合蛋白中。抗体的产生在本发明的范围之外，但通常双克隆抗体和多克隆抗体在实验非人哺乳动物如山羊、野兔、美洲驼、驼科动物、大鼠或小鼠中提出，而适合的抗体还可以是其它产生方法例如Kohler和Milstein的标准体细胞杂交技术的结果。在例如小鼠中产生的杂交瘤是充分确立的程序并且可以使用本领域众所周知的技术实现。本发明中使用的抗体可以是人抗体、人源化抗体和/或任何类型的嵌合抗体。如本文所使用的，术语“人抗体”旨在包含具有可变区的抗体，在所述可变区中，构架区和CDR区两者均衍生自人种系免疫球蛋白序列。本发明中使用的人抗体可以包含不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如通过体外随机或定点诱变或通过体内体细胞突变引入的突变)。术语“抗体衍生物”是指抗体的任何修饰的形式，例如具有以任何方式修饰的氨基酸序列的抗体、或抗体的缀合物、以及另一种药剂或抗体、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体结构域等。术语“人源化抗体”是指衍生自另一个哺乳动物物种如小鼠、驼科动物、美洲驼等的CDR序列已被移植到人构架序列上的抗体。可以在人构架序列内进行额外的构架区修饰。根据本发明的抗体可以包含所有同种型和亚型如IgG(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG2a、IgG2d和IgG2c)、IgA、IgM、IgM、IgD等、及其单体、二聚体和低聚体。进一步地，当在EV上展示时，根据本发明的抗体可以具有若干功能：(1)抗体可以靶向特定细胞类型、组织和/或器官；(2)与所关注的靶抗原相互作用的诊断抗体和/或治疗抗体可以使用EV有效地递送到所关注的组织；(3)EV的表面上的多重抗体可以在结合靶抗原时显著更好；(4)抗体-药物缀合物(ADC)可以在EV上多路复用以增强例如连接到抗体上的放射性核素的效力；(5)由于Fc结合多肽与抗体Fc结构域之间的结合，通过Fc结合多肽结合的抗体可以具有较高靶标亲和力；(6)出于诊断和/或治疗和/或成像和/或研究目的，涂覆到根据本发明的EV上的抗体可以胞内递送。重要的是，根据本发明的抗体和其它含Fc的蛋白有利地用检测部分的一些形式标记。检测部分如荧光团、放射性物质、PET示踪剂、MRI药剂或任何其它类型的检测部分的存在对于体内、体外和/或离体跟踪所标记的含Fc的蛋白以及因此EV是非常有利的。相应地，跟踪、追踪和检测因此可以使用多种多样的不同方法实现，如PET扫描、共聚焦显微术和荧光显微术、电子显微术、磁共振成像(MRI)、X射线扫描、CAT扫描、流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析等。

术语“含Fc的蛋白”和“包括Fc结构域的蛋白”和“含Fc结构域的蛋白(Fc domain-containing和Fc domain containing protein)”和“Fc结构域蛋白”以及类似术语在本文中可互换地使用并且应被理解为涉及包括至少一个Fc结构域的任何蛋白、多肽或肽(即，包括氨基酸序列的任何分子)，所述至少一个Fc结构域是天然地或由于所讨论的蛋白的工程化而引入的Fc结构域。Fc代表“片段可结晶”，其是抗体的尾区的名称。然而，还可以产生Fc结构域并且在其它蛋白而不仅仅是抗体上使用。这种含Fc结构域的蛋白的非限制性实例包含抗体和抗体衍生物、Fc修饰的诱饵受体和/或信号转导子如针对IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6(如信号转导子gp130(作为非限制性实例，登录号为P40189))、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL17(如IL17R，其中作为非限制实例，登录号为Q96F46))、IL23(如IL23R，作为非限制实例，登录号为Q5VWK5)等的白介素诱饵受体、任何类型的含Fc结构域的受体或配体、针对例如酶替换疗法或基因标记的Fc结构域修饰的酶、核酸酶如Fc结构域已移植到其上的Cas和Cas9、与Fc结构域融合的肿瘤抑制基因等。可以与所关注的天然地缺少Fc结构域的蛋白融合的适合的Fc结构域包含以下非限制性实例：人IGHM(作为非限制性实例，登录号为P01871)、人IGHA1(作为非限制性实例，登录号为P01876)、人IGHA2(作为非限制性实例，登录号为P01877)、人IGKC(作为非限制性实例，登录号为P01834)、人IGHG1(作为非限制性实例，登录号为P01857)、人IGHG2(作为非限制性实例，登录号为P01859)、人IGHG3(作为非限制性实例，登录号为P01860)、人IGHG4(作为非限制性实例，登录号为P01861)、人IGHD(作为非限制性实例，登录号为P01880)、人IGHE(作为非限制性实例，登录号为P01854)、及其任何结构域、衍生物或组合。本质上，所关注的任何蛋白可以被修饰以并入Fc结构域。Fc结构域可以引入到的蛋白的非限制性实例包含例如肿瘤抑制基因、病毒和细菌抑制剂、细胞组分蛋白、DNA和/或RNA结合蛋白、DNA修复抑制剂、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、凋亡抑制剂和诱导剂、毒素(例如假单胞菌外毒素)、结构蛋白、神经营养因子如NT3/4、脑来源的神经营养因子(BDNF)和神经生长因子(NGF)及其单独亚单元如2.5Sβ亚单元、离子通道、膜转运体、蛋白稳态因子、细胞信号传导中涉及的蛋白、转译和转录相关蛋白、核苷酸结合蛋白、蛋白结合蛋白、脂质结合蛋白、粘多糖(GAG)和GAG结合蛋白、代谢蛋白、细胞应激调节蛋白、炎症和免疫系统调节蛋白、线粒体蛋白和热休克蛋白等。所关注的蛋白的上述列表不是穷尽的，并且只要蛋白包括Fc结构域或者只要其可能工程化所讨论的蛋白以包括Fc结构域，其它蛋白还可以是相关的。用于引入Fc结构域的蛋白的这种工程化的一个非限制性实例包含将Fc结构域添加到诱饵受体中，例如将Fc结构域添加到Cas9酶上以将生物活性递送到靶细胞中，以便实现基因编辑。用于引入Fc结构域的蛋白的这种工程化的另一个非限制性实例包含将Fc结构域添加到酶上以进行酶替换疗法(例如，Fc结构域葡糖脑苷脂酶或Fc结构域-α-半乳糖苷酶或Fc结构域-NPC1)。可商购的Fc结构域修饰的蛋白的众所周知的实例是依那西普，所述依那西普是用于治疗各种自身免疫性疾病的生物药物、包括融合到TNF受体2上的IgG的Fc结构域。因此，如从上文清楚的，根据本发明的含Fc结构域的蛋白可以基本上是所关注的含有Fc结构域的任何蛋白，所述Fc结构域是天然的或是其引入的结果。如上文结合抗体所提及的，所有含Fc结构域的蛋白可以被修饰以并入检测部分，以使能够检测和追踪所讨论的分子和/或所讨论的EV。

术语“Fc结合多肽”和“Fc结合蛋白”和“Fc结合物”和“Fc结合蛋白”和“结合物”在本文中可互换地使用，并且应被理解为涉及可以结合所关注的任何蛋白的Fc结构域的任何蛋白、多肽或肽(即，包括氨基酸序列的任何分子)。典型地，本发明的Fc结合多肽衍生自各种人或非人源(例如，哺乳动物源、细菌等)，它们对各种抗体同种型、亚型和物种(例如，IgG(以及更具体地IgG 1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG2a、IgG2d和/或IgG2c)、IgA、IgM、IgM、IgD等)具有高亲和力，并且它们可以与EV蛋白融合。除了贯穿本申请提及的其它Fc结合多肽之外，根据本发明的Fc结合多肽的非限制性实例包含：蛋白A(作为非限制性实例，SEQ ID NO 77)、蛋白G(作为非限制性实例，SEQ ID NO 78)、蛋白Protein A/G(作为非限制性实例，SEQ IDNO 72)、Z结构域(作为非限制性实例，SEQ ID NO 73)、ZZ结构域(作为非限制性实例，SEQID NO 73的两个可操作的拷贝，即作为非限制性实例，SEQ ID NO 74)、人FCGRI(作为非限制性实例，SEQ ID NO 31)、人FCGRIIA(作为非限制性实例，SEQ ID NO 33)、人FCGRIIB(作为非限制性实例，登录号为31994)、人FCGRIIC(作为非限制性实例，登录号为31995)、人FCGRIIIA(作为非限制性实例，登录号为P08637)、人FCGR3B(作为非限制性实例，登录号为075015)、人FCAMR(作为非限制性实例，SEQ ID NO 28)、人FCERA、人FCAR、小鼠FCGRI(作为非限制性实例，SEQ ID NO 79)、小鼠FCGRIIB(作为非限制性实例，SEQ ID NO 80)、小鼠FCGRIII(作为非限制性实例，SEQ ID NO 81)、小鼠FCGRIV(作为非限制性实例，SEQ ID NO82)、小鼠FCGRn(作为非限制性实例，SEQ ID NO 83)、及其各种组合、衍生物或替代物。

本文中含Fc的蛋白通常被描述为“连接到”EV上和/或连接到Fc结合多肽上。可替代地，EV有时被称为由含Fc的蛋白“涂覆”、或将含Fc的蛋白“与其表面结合”或“连接到其表面上”。这些术语应在Fc结合多肽与Fc结构域之间的常规相互作用的背景下进行理解，也就是说，两个多肽以导致在Fc结合物与Fc结构域之间形成化学键(典型地，非共价键)的方式彼此相互作用。因此，这通常意味着包括Fc结合多肽的EV因此凭借化学键已将含Fc的蛋白的Fc结构域连接到其上。如技术人员将理解的，EV因此可以将多个这种含Fc的蛋白与其结合(连接)，从而当在EV表面上发生结合时导致包衣形式。

术语“EV蛋白”和“EV多肽”和“外排体多肽”以及“外排体蛋白”在本文中可互换地使用，并且应被理解为涉及可以用于将多肽构建体(除了EV蛋白之外，所述多肽构建体典型地包括至少一个Fc结合多肽以及任选地额外多肽和/或连接子)转运到适合的囊泡结构即合适的EV的任何多肽。更具体地，这些术语应被理解为包括使能够将融合蛋白构建体转运、运输或穿梭到囊泡结构如EV的任何多肽。这种外排体多肽的实例是例如CD9(作为非限制性实例，SEQ ID NO 1)、CD53(作为非限制性实例，SEQ ID NO 2)、CD63(作为非限制性实例，SEQ ID NO 3)、CD81(作为非限制性实例，SEQ ID NO 4)、CD54(作为非限制性实例，SEQ IDNO 5)、CD50(作为非限制性实例，SEQ ID NO 6)、FLOT1(作为非限制性实例，SEQ ID NO 7)、FLOT2(作为非限制性实例，SEQ ID NO 8)、CD49d(作为非限制性实例，SEQ ID NO 9)、CD71(也被称为转铁蛋白受体)(作为非限制性实例，SEQ ID NO 10)及其内体分选结构域即转铁蛋白受体内体分选结构域(作为非限制性实例，SEQ ID NO 23)、CD133(作为非限制性实例，SEQ ID NO 11)、CD138(多配体聚糖-1)(作为非限制性实例，SEQ ID NO 12)、CD235a(作为非限制性实例，SEQ ID NO 13)、ALIX(作为非限制性实例，SEQ ID NO 14)、同线蛋白-1(作为非限制性实例，SEQ ID NO 15)、同线蛋白-2(作为非限制性实例，SEQ ID NO 16)、Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 17)、多配体聚糖-2(作为非限制性实例，SEQ ID NO 20)、多配体聚糖-3(作为非限制性实例，SEQ ID NO 21)、多配体聚糖-4(作为非限制性实例，SEQID NO 22)、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II组分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19(作为非限制性实例，SEQ ID NO26)、CD30(作为非限制性实例，SEQ ID NO 27)、TSG101、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其它外排体多肽、及其任何组合，而能够将多肽构建体转运到EV的许多其它多肽包括在本发明的范围内。典型地，在本发明的许多实施例中，至少一个外排体多肽与至少一个Fc结合多肽融合以形成存在于EV中的融合蛋白。这种融合蛋白可以包括用于优化其一个或多个功能的各种其它组分，包含连接子、跨膜结构域、胞质结构域、多聚化结构域等。

术语“源细胞”或“EV源细胞”或“亲本细胞”或“细胞源”或“EV产生的细胞”或任何其它类似术语应被理解为涉及能够在适合条件下例如在悬浮培养物中或在贴壁培养物中或在任何其它类型的培养系统中产生EV的任何类型的细胞。根据本发明的源细胞还可以包含在体内产生外排体的细胞。根据本发明的源细胞可以选自范围广泛的细胞和细胞系，例如(可从例如骨髓、脂肪组织、华顿氏胶、围产期组织、牙蕾、脐带血、皮肤组织等获得的)间充质干细胞或基质细胞或纤维原细胞、羊膜细胞以及更具体地任选地表达各种早期标志物的羊膜上皮细胞、髓样抑制细胞、M2极化巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞、纤维原细胞等。特别关注的细胞系包含人脐带内皮细胞(HUVEC)、人胚肾(HEK)细胞、内皮细胞系如微脉管或淋巴内皮细胞、软骨细胞、不同起源的MSC、气道或肺泡内皮细胞、纤维原细胞、内皮细胞等。而且，如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核细胞、树突细胞(DC)等免疫细胞还可以在本发明的范围内，并且本文中还涵盖能够产生EV的基本上任何类型的细胞。通常，EV可以衍生自基本上任何细胞源，其可以是原代细胞源或永生化细胞系。EV源细胞可以是任何胚胎细胞、胎儿细胞和成年体干细胞类型，包含诱导性多能干细胞(iPSC)和通过任何方法衍生的其它干细胞。在治疗神经疾病时，可以考虑用作源细胞例如原代神经细胞、星形胶质细胞、少突细胞、小神经胶质细胞和神经前体细胞。源细胞对有待治疗的患者而言可以是本质上同种异体的、自体的或甚至异种的，即细胞可以来自患者本身或来自不相关的、匹配的或不匹配的供体。在某些情况下，同种异体细胞可以优选地来自医疗角度，因为它们可以提供不可能从患有某些适应症的患者的自体细胞获得的免疫调节效应。例如，在治疗全身性、外周和/或神经炎症的背景下，可以优选地作为可从这种细胞获得的EV的同种异体MSC可以通过例如巨噬细胞和/或中性粒细胞表型转换(分别从促炎性M1或N1表型转换到抗炎M2或N2表型)实现免疫调节。

在第一方面，本发明涉及作为研究工具的包括至少一个Fc结合多肽的EV的用途。相关性的非限制性用途包含在检测试剂盒中使用在流式细胞术、成像流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析、纳米成像、共聚焦显微术、荧光显微术、动态光散射、电子显微术、基于发光的检测、荧光相关光谱、基于荧光共振能量转移(FRET)的技术、基于磁性、荧光和/或基于浮力的标记的阳性或阴性选择技术、基于颗粒密度、电荷或大小的阳性或阴性选择技术、或在基本上任何其它技术或方法中作为生物RM、作为对照物和/或标准的Fc结合EV，其中具有与含Fc结构域的蛋白(如抗体)结合的能力的EV可以是有用的。在有利的实施例中，EV中包括的至少一个Fc结合多肽与至少一个外排体多肽以及任选地其它多肽结构域和/或区域一起形成融合蛋白的部分。

具体地，当EV的Fc结合多肽与包括Fc结构域的蛋白结合时，根据本发明的EV对于各种研究、诊断、成像和治疗用途是非常有利的。EV的Fc结合多肽与含Fc的蛋白之间的结合导致纳米大小的EV-Fc蛋白复合物的形成，所述EV-Fc蛋白复合物作为用于含Fc的蛋白如抗体的运送媒剂显著应用于例如流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析、动态光散射、电子显微术和/或各种其它类型的技术中。在优选的实施例中，根据本发明的EV的用途包含将抗体连接到至少一个Fc结合多肽上，并且在甚至更优选的实施例中，用检测部分的一些形式标记抗体。可以连接抗体(或连接到任何其它含Fc的蛋白上)的适合的检测部分和/或药剂是荧光团、放射性标记物、PET配体、MRI药剂、纳米颗粒、无机和/或有机化合物、酶、或适于在其中使用EV的方法的任何其它适合的检测部分。

在一方面，本发明提供了一种基于本文所公开的EV的囊泡参比材料(RM)。术语RM可以意指出于标准化、阳性对照、校准对照和/或补偿对照或任何其它类型的参比对照的目的可以用于任何种类的测定、方法或应用中的任何材料。在用于EV研究和分析的RM的背景下，最优RM将是生物衍生囊泡，这是为什么本发明的Fc结合含多肽的EV最佳适合于此目的。因此，在一个实施例中，本发明涉及包括如本文所描述的EV群体的RM，即包含Fc结合多肽的EV任选地包括在具有至少一个EV蛋白的融合蛋白中。在有利的实施例中，Fc结合多肽与含Fc的蛋白(如抗体)结合，这将额外信息层和功能添加到RM中。RM可以以任何物理形式作为冷冻干燥的材料存在，如以液体、粉末、气溶胶的形式。如上文所提及的，不仅在EV领域内而且还更广泛地跨科学高度地寻求生物相关的RM，并且本发明的工程化EV表示用于从流式细胞术和纳米颗粒跟踪分析到荧光显微术和电子显微术的许多应用的几乎完美的RM。

在一个实施例中，EV中包括的至少一个Fc结合多肽与至少一个外排体多肽一起形成融合蛋白的部分。与至少一个EV蛋白的融合通常增强了对EV的运输以及随后Fc结合多肽的并入和/或展示。EV中和/或上存在的Fc结合多肽明显地旨在将含蛋白的Fc结构域如Fc结构域已融合到的抗体和/或蛋白与EV结合并且由此将其连接到所述EV上。结合通常通过常规非共价相互作用在EV的Fc结合多肽与所关注的蛋白的Fc结构域之间发生。

如上文所提及的，在优选的实施例中，生物RM已将呈抗体的形式的含Fc的蛋白连接到其上。在另外有利的实施例中，含Fc的蛋白已将至少一个荧光团、至少一个放射性标记物、至少一个PET配体、至少一种MRI药剂、或任何其它检测部分连接到其上，以使能够在体外、体内、离体或任何研究环境中对RM进行检测、追踪和成像。生物RM可以用于研究环境中，所述研究环境包含以下非限制性实例：流式细胞术、成像流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析、纳米成像、共聚焦显微术、荧光显微术、动态光散射、电子显微术、基于发光的检测、荧光相关光谱、基于荧光共振能量转移(FRET)的技术、基于磁性、荧光和/或基于浮力的标记的阳性或阴性选择技术、基于颗粒密度、电荷或大小的阳性或阴性选择技术、或其任何组合。

在另外的方法，本发明涉及一种用于将至少一种类型的含Fc的蛋白递送到靶细胞中的体外、体内和/或离体方法，其包括(i)提供包括至少一个Fc结合多肽的EV，(ii)允许所述Fc结合多肽与所述含Fc的蛋白结合，以及(iii)使靶细胞与所述EV接触，所述EV已将所述含Fc的蛋白连接到其Fc结合多肽上。在一个实施例中，至少一个Fc结合多肽可以与至少一个外排体多肽以及任选地各种其它多肽(如连接子、多聚化结构域、细胞因子受体和信号转导子等)一起形成融合蛋白的部分。在一个有利实施例中，含Fc的蛋白是抗体。在另一个有利的实施例中，含Fc的蛋白连接到至少一个荧光团、至少一个放射性标记物、至少一个PET配体、或任何其它检测部分上。

在又另一方面，本发明涉及一种包括EV的检测试剂盒，其中EV包括至少一个(与至少一个外排体多肽融合的)Fc结合多肽，其中Fc结合多肽任选地与至少一个含Fc的蛋白结合。抗体明显地特别适合于检测各种靶抗原，并且借助于本发明的EV，不仅可以探测胞外靶标而且还可以探测胞内靶标。为了实现检测，含Fc的蛋白(例如，至少一种类型的抗体)可以用检测部分标记。检测部分的性质完全依赖于所应用的检测方法，而适合的检测部分可以选自例如以下非限制性实例：荧光团、放射性标记物、PET配体、MRI药剂、用于酶促检测的酶、色度检测部分、生物荧光和/或化学荧光检测部分、无机或有机化合物、金属、量子点、纳米颗粒(例如金纳米颗粒)、或取决于意在应用的检测方法的任何其它检测部分。

如上文所提及的，本发明允许在靶细胞内部和外部以及还有细胞膜中进行检测，这意味着可以使用本发明的基于EV的检测试剂盒来探测胞外、膜相关和/或胞内生物分子。此外，特定生物分子的检测可以在体外、体内和/或离体发生。活的或死的例如冷冻的、保藏的、固定的或保存的样本(如动物、组织、器官、细胞、亚细胞器、体液等)可以可视化和/或成像以用于免疫组织化学或者可以在用于显微术和电子显微术的玻片和载网上。

根据本发明的检测试剂盒可以用于流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析、纳米成像、共聚焦显微术、荧光显微术、动态光散射、电子显微术、基于发光的检测、荧光相关光谱、基于荧光共振能量转移(FRET)的技术、基于磁性、荧光和/或基于浮力的标记的阳性或阴性选择技术、基于密度、电荷或大小的阳性或阴性选择技术、或这种方法的任何组合。典型地，检测试剂盒可以被设计或配制以使能够在Fc结合含多肽的EV与含Fc的蛋白之间结合，以便在各种条件下保持完整并且在其它条件下偶尔释放含Fc的蛋白。EV与含Fc的蛋白之间的复合物可以以各种物理和化学状态存在，例如以溶液、凝胶、乳剂、适合的缓冲剂状态、呈冻干形式、喷雾形式、颗粒形式、水凝胶形式、脂质体配制品、聚合物配制品形式等。

在另外的方面，本发明涉及一种部件试剂盒，其包括(i)包括至少一个Fc结合多肽的EV，和(ii)至少一个含Fc的蛋白。至少一个Fc结合多肽可以与至少一个外排体多肽以及任选地其它多肽及其结构域一起包括在融合蛋白中。组合物(i)和(ii)可以存在于例如不同容器或相同容器中，这取决于例如将如何使用、储存、出售和运输试剂盒。组合物(i)和(ii)可以在使用之前立即混合，或者它们可以作为介于EV与含Fc的蛋白之间的纳米颗粒复合物预先混合和运输。

在又另一方面，本发明涉及一种纳米颗粒复合物，其介于(i)包括至少一个Fc结合多肽的EV与(ii)含Fc的蛋白之间。至少一个Fc结合多肽可以与至少一个外排体多肽一起形成融合蛋白的部分，以增加其到EV中的并入和/或在EV的表面上的Fc结合多肽的展示。在工程化EV与含Fc的蛋白之间形成的纳米颗粒复合物可以示意性地描述为用含Fc的蛋白(作为实例，抗体的多个拷贝)涂覆的纳米颗粒。抗体构成本发明的特别优选的实施例，因为其具有高靶标特异性，易于开发，可以被修饰以并入检测部分并且借助于本发明的EV可以递送到靶细胞中。本发明的纳米颗粒复合物在研究、诊断、成像、分析和疗法方面具有广泛应用，并且可以用作生物RM、研究工具、作为诊断工具、成像工具、检测试剂盒和/或用于体外、体内和/或离体递送不同类型的含Fc的蛋白。

在一个实施例中，EV本身包括检测部分，所述检测部分可以任选地与连接到含Fc的蛋白(如荧光标记的抗体)上的检测部分组合。由于EV是纳米大小的囊泡，因此可以使用各种类型的检测部分，例如荧光团、染料、荧光蛋白如绿色荧光蛋白、红色荧光蛋白、黄色荧光蛋白以及任何荧光蛋白；萤火虫或海肾萤光素酶、纳米荧光素酶以及其它类型的产生生物发光信号的酶；放射性药剂；PET和MRI药剂和示踪剂；溶解的或各种复合物中的纳米颗粒、无机化合物、金属和金属离子等。有利的实施例是包括GFP和/或荧光素酶/纳米荧光素酶、与例如连接到EV的Fc结合多肽上的荧光标记的抗体(或任何其它含Fc的蛋白)组合的EV。本质上，因此将任何其它类型的检测部分添加到EV提供通过多于一种手段进行的检测，所述多于一种手段可能在例如显微术、流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析、动态光散射以及任何其它技术中非常有用。

本发明的Fc结合多肽可以是非人起源或人起源的。Fc结合物可以从例如细菌、病毒或非人哺乳动物获得。在另一个实施例中，Fc结合物是人或哺乳动物起源。在优选的实施例中，至少一个Fc结合多肽可以选自包括以下的组：蛋白A(作为非限制性实例，SEQ ID NO77)、蛋白G(作为非限制性实例，SEQ ID NO 78)、蛋白A/G(作为非限制性实例，SEQ ID NO72)、Z结构域(作为非限制性实例，SEQ ID NO 73)、ZZ结构域(作为非限制性实例，SEQ IDNO 74)、蛋白L(作为非限制性实例，pdb id号为1HEZ)、蛋白LG、人FCGRI(作为非限制性实例，SEQ ID NO 31)、人FCGR2A(作为非限制性实例，登录号为P12318)、人FCGR2B(作为非限制性实例，登录号为P31994)、人FCGR2C(作为非限制性实例，登录号为P31994)、人FCGR3A(作为非限制性实例，登录号为P08637)、人FCGR3B(作为非限制性实例，登录号为075015、人FCGRB(作为非限制性实例，登录号为Q92637)(作为非限制性实例，SEQ ID NO 32、人FCAMR(作为非限制性实例，SEQ ID NO 28、人FCERA(作为非限制性实例，SEQ ID NO 30)、人FCAR(作为非限制性实例，SEQ ID NO 29)、小鼠FCGRI(作为非限制性实例，SEQ ID NO 79)、小鼠FCGRIIB(作为非限制性实例，SEQ ID NO 80)、小鼠FCGRIII(作为非限制性实例，SEQ ID NO81)、小鼠FCGRIV(作为非限制性实例，SEQ ID NO 82)、小鼠FCGRn(作为非限制性实例，SEQID NO 83)、以及上述Fc结合多肽中的任一个的任何组合。已根据例如噬菌体展示筛选并通过生物信息学获得的其它适合的Fc结合多肽包含Fc结合肽SPH(作为非限制性实例，SEQ IDNO 57)、SPA(作为非限制性实例，SEQ ID NO 58)、SPG2(作为非限制性实例，SEQ ID NO59)、SpA模拟物1(作为非限制性实例，SEQ ID NO 60)、SpA模拟物2(作为非限制性实例，SEQID NO 61)、SpA模拟物3(作为非限制性实例，SEQ ID NO 62)、SpA模拟物4(作为非限制性实例，SEQ ID NO 63)、SpA模拟物5(作为非限制性实例，SEQ ID NO 64)、SpA模拟物6(作为非限制性实例，SEQ ID NO 65)、SpA模拟物7(作为非限制性实例，SEQ ID NO 66)、SpA模拟物8(作为非限制性实例，SEQ ID NO 69)、SpA模拟物9(作为非限制性实例，SEQ ID NO 70)、SpA模拟物10(作为非限制性实例，SEQ ID NO 71)、Fey模拟物1(作为非限制性实例，SEQ ID NO67)和Fey模拟物2(作为非限制性实例，SEQ ID NO 68)及其任何组合或衍生物。用于特定构建体的最适合的Fc结合多肽的选择很大程度上取决于所期望的结合特征、亲和力、当与外排体多肽融合时Fc结合多肽的朝向、以及各种其它因素。

蛋白A或G是由7个Fc结合结构域EDABC-C1C3构成的重组基因工程蛋白，其中蛋白A部分从金黄色酿脓葡萄球菌区段E、D、A、B和C获得，并且蛋白G部分从链球菌区段C1和C3获得。有利地，蛋白A/G(作为非限制性实例，SEQ ID NO 72)具有比单独地蛋白A(作为非限制性实例，SEQ ID NO 77)或蛋白G(作为非限制性实例，SEQ ID NO 78)更广泛的结合能力，并且其对于来自各种物种的抗体具有广泛的结合亲和力。蛋白A/G与各种人、小鼠和大鼠IgG亚类如人IgG1、IgG2、IgG3、IgG4；小鼠IgG2a、IgG2b、IgG3以及大鼠IgG2a、IgG2c结合。此外，蛋白A/G与来自奶牛、山羊、绵羊、马、野兔、豚鼠、狗和猫的总IgG结合。蛋白A/G已被工程化以去除细胞壁结合区、细胞膜结合区和白蛋白结合区以使能够与所关注的蛋白如抗体的Fc结构域强结合。因此，在根据本发明的有利的实施例中，与蛋白A、蛋白G和蛋白A/G的情况一样，Fc结合物包括多于一个Fc结合区，以使能够结合范围广泛的抗体。在替代性实施例中，Fc结合物可以繁殖以使能够与所关注的抗体的多于一种拷贝结合。例如，短Z结构域Fc结合物可以通过允许与多于一个Fc结构域结合的操作性键联包含在多于一个拷贝中的融合蛋白中。此方式不仅可以在单独的融合蛋白之间而且在一个单融合蛋白内多路复用抗体和其它含Fc的蛋白，所述一个单融合蛋白因此可以结合多于一个抗体。例如，当Fc结合多肽引入到属于四次穿膜蛋白家族的EV蛋白(如CD63)中时，可能有利的是，将一个Fc结合物插入到一个环上并将另一个Fc结合物(可以相同或不同)插入到蛋白的另一个环上。Fc结合物可以置于向内面向的和/或向外面向的环上，这取决于含Fc的蛋白是否意在装载到EV的内腔中或装载到EV的表面上。根据本发明的融合蛋白的一些非限制性实例可以如下示意性地描述(以下符号不应被解释为示出任何C和/或N端检测，其仅意指说明性目的)：

外排体多肽-Fc结合多肽-Fc结合多肽

外排体多肽结构域-Fc结合多肽-外排体多肽结构域-Fc结合多肽

外排体多肽结构域-Fc结合多肽A-外排体多肽结构域-Fc结合多肽B

在一些实施例中，包括外排体多肽和Fc结合多肽的融合蛋白还可以包含额外多肽、多肽结构域或序列。这种额外多肽结构域可以赋予各种功能，例如，这种结构域可以：(i)有助于增强融合蛋白的EV表面展示；(ii)导致融合蛋白聚类，由此增加Fc结合多肽的亲合力；(iii)作为连接子起作用以优化外排体多肽与Fc结合多肽之间的相互作用；和/或(iv)改善EV膜中锚定以及各种其它功能。可以有利地部分或整体包含在本发明的融合蛋白中的两个这种额外多肽是gp130(作为非限制实例，SEQ ID NO 18)和肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)(作为非限制实例，SEQ ID NO 19)。具体地，这些额外多肽的跨膜结构域可能对于优化到EV膜中的插入以及Fc结合多肽的展示非常有用。总体而言，各种跨膜结构域作为融合蛋白中的额外结构域可能非常有利。例如，在使用外排体蛋白同线蛋白时，非常有利的是，在例如同线蛋白与融合蛋白的Fc结合多肽之间插入额外多肽结构域，如TNFR的跨膜结构域或gp130的跨膜结构域。另外的额外结构域可以包含多聚化结构域如折叠子结构域、亮氨酸拉链结构域和/或三聚结构域以增加表面展示和/或亲合力。下文示出了其非限制性示意实例：

同线蛋白-胞质TNRF-折叠子三聚结构域-跨膜TNFR结构域-Z结构域-胞外TNFR结构域

多配体聚糖-亮氨酸拉链结构域-gp130胞质结构域-gp130跨膜结构域-Fc结合多肽-gp130胞外结构域

在另外的实施例中，外排体多肽可以选自包括以下的组：CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、同线蛋白1、同线蛋白2、Lamp2b、TSPAN8、多配体聚糖1、多配体聚糖2、多配体聚糖3、多配体聚糖4、TSPAN14、CD37、CD82(作为非限制性实例，SEQ ID NO 24)、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白介素受体、免疫球蛋白、MHC-I或MHC-II组分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8(作为非限制性实例，SEQ IDNO 25)、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其它外排体多肽及其任何组合。

根据本发明的特别有利的融合蛋白可以包括与以下Fc结合多肽的至少一个拷贝融合的人外排体蛋白CD63、CD81、CD9、CD71(转铁蛋白受体)、Lamp2和同线蛋白：Z结构域、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、FCGRI、人FCGR2A、人FCGR2B、人FCGR2C、人FCGR3A、人FCGR3B、人FCGR3C、人FCAMR、人FCAR和人FCERA。具体地，将两个Z结构域与EV蛋白CD63(作为非限制性实例，SEQ ID NO 3)融合导致高效的Fc结合物，由于Z结构域的小尺寸和CD63的高EV表面表达，大量的所述高效Fc结合物展示在EV的表面上。将Fc结合物展示在EV的外表面上是天然优选的以使能够外源性地结合所关注的含Fc结构域的蛋白。在CD63-ZZ结构域融合蛋白的情况下，Z结构域可以插入到CD63的第一环和第二环中，以使能够在将CD63锚定到EV膜中之后在外部EV表面上进行展示。此外，如上文所提及的，适合的额外多肽和多肽结构域以及连接子还可以包含在融合蛋白中，所述融合蛋白通常包括外排体多肽和Fc结合多肽。这种额外多肽包含来自各种细胞因子受体如TNFR1和TNFR2、IL6信号转导子gp130以及各种其它细胞因子和细胞因子相关多肽的结构域。在某些情况下，细胞因子和细胞因子相关多肽(如各种细胞因子受体)单独地可能能够将Fc结合多肽转运到EV中。具体应用的连接子是多个小型和柔性氨基酸和/或所述小型和柔性氨基酸如通常由GS指代的甘氨酸(G)和丝氨酸(S)的组合，例如2XGS或4XGS。用于简化纯化和测定的C端和N端的His标签还可以添加，并且因此可以是各种荧光蛋白如GFP。以下是包括通常通过连接子连接的至少一个外排体多肽和至少一个Fc结合多肽以及任选地包含额外多肽或多肽结构域的特别有利的非限制性实例：

·CD81-蛋白A/G CD81第二环(作为非限制性实例，SEQ ID NO 75)

·CD9-ZZ结构域CD9第二环(作为非限制性实例，SEQ ID NO 76)

·FCAR胞外结构域-2XGGGgS连接子-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 55)

·FCAR胞外结构域-4XGS连接子-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 54)

·FCGR1A胞外结构域-2XGGGgS连接子-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO49)

·FCGR1A胞外结构域-4XGS连接子-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 48)

·FcRN胞外结构域-4XGS连接子-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 39)

·FcRN-2XGGGgS连接子-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 40)

·Gp130胞外结构域-2XGGGGS连接子-FCAR胞外结构域-Gp130跨膜结构域-亮氨酸拉链结构域-N端同线蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 52)

·Gp130胞外结构域-2XGGGGS连接子-FCGRIA胞外结构域-Gp130跨膜结构域-亮氨酸拉链结构域-N端同线蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 46)

·Gp130胞外结构域-2XGGGGS连接子-FcRN胞外结构域-Gp130跨膜结构域-亮氨酸拉链结构域-N端同线蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 43)

·Gp130胞外结构域-2XGGGGS连接子-Z结构域-Gp130跨膜结构域-亮氨酸拉链结构域-N端同线蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 34)

·转铁蛋白受体-2XGGGGS连接子-FCAR胞外结构域(作为非限制性实例，SEQ IDNO 56)

·转铁蛋白受体-2XGGGGS连接子-FCGR1A胞外结构域(作为非限制性实例，SEQ IDNO 50)

·转铁蛋白受体-2XGGGGS连接子-FcRN胞外结构域(作为非限制性实例，SEQ IDNO 41)

·转铁蛋白受体-2XGGGGS连接子-Z结构域(作为非限制性实例，SEQ ID NO 38)

·CD63-FCAR胞外结构域CD63第一环和CD63第二环(作为非限制性实例，SEQ IDNO 53)

·CD63-FCGR1A胞外结构域CD63第一环和CD63第二环(作为非限制性实例，SEQ IDNO 47)

·CD63-FcRN胞外结构域CD63第一环和CD63第二环(作为非限制性实例，SEQ IDNO 44)

·CD63-FcRN结构域CD63第一环和CD63第二环(作为非限制性实例，SEQ ID NO35)

·TNFR胞外结构域-2XGGGGS连接子-FCAR胞外结构域-TNFR跨膜结构域-折叠子-N端同线蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 51)

·TNFR胞外结构域-2XGGGGS连接子-FCGRIA胞外结构域-TNFR跨膜结构域-折叠子-N端同线蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 45)

·TNFR胞外结构域-2XGGGGS连接子-FcRN胞外结构域-TNFR跨膜结构域-折叠子-N端同线蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 42)

·TNFR胞外结构域-2XGGGGS连接子-Z结构域-TNFR跨膜结构域-折叠子-N端同线蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 33)

·Z结构域-2XGGGgS连接子-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 37)

·Z结构域-4XGS连接子-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 36)

·转铁蛋白受体-蛋白AG(作为非限制性实例的SEQ ID NO 10可操作地与作为非限制性实例的SEQ ID NO 72融合)

上文提及的融合蛋白仅是本发明允许的许多工程化可能性的实例，并且因此仅是本发明的非限制性实施例。根据本发明的融合蛋白的所有组分可以自由组合，例如，融合蛋白可以含有可以置于融合蛋白中的C端、N端两者或任何地方的一个或若干个外排体多肽。进一步地，融合蛋白还可以含有可以置于例如跨膜部分的C端、N端两者或任何环中的一个或多个上或融合蛋白中的任何地方的一个或若干个Fc结合多肽。为清楚起见，多于一种类型的外排体多肽和多于一种类型的Fc结合多肽可以包括在单个构建体中。此外，可以包含氨基酸的额外拉伸物如连接子(通常包括氨基酸甘氨酸和丝氨酸)和His标签以简化纯化、测定和可视化。而且，其它肽和多肽结构域还可以包含在融合蛋白序列中的任何地方。例如，还可以有利地包含来自各种细胞因子受体的各种结构域和区域，例如TNFR1、TNFR2、IL17R、IL23R、gp130、IL6R等的各种结构域。

在另外的实施例中，如上文所提及的，Fc结合多肽可以与包括Fc结构域的任何蛋白、不仅抗体而且其它包括Fc结构域的蛋白、天然存在的和工程化的含Fc结构域的蛋白如上文若干情况中提及的蛋白结合。有利地，本发明导致通过Fc结合多肽与至少一个含Fc的蛋白之间的相互作用用包括Fc结构域的多个蛋白涂覆的EV。Fc结合物与含Fc的蛋白之间的相互作用通常基于Fc结合多肽与含Fc的蛋白的Fc结构域之间的共价键。自然而然地，一个单EV可以用多于一种类型的含Fc结构域的蛋白涂覆。在一个非限制性实例中，Fc结合EV可以用沿着PD1轴线靶向适合的靶标的一个抗体涂覆，而另一个抗体沿着CTLA4轴线靶向适合的靶标。在另一个非限制性实例中，Fc结合EV用靶向胞内癌蛋白的抗体和与Fc结构域融合的肿瘤抑制因子涂覆。通常情况下，一个单EV还可以包括基本上多个一种单个类型的含Fc结构域的蛋白，如一种类型的单克隆抗体。检测抗体、靶向抗体、治疗抗体、所关注的含Fc的非抗体蛋白以及抗体-药物缀合物(ADC(可以用于诊断、成像和治疗目的)的各种组合构成本发明的优选的实施例。在有利的实施例中，根据本发明的EV用包括Fc结构域的多个蛋白涂覆。例如，在使用高度表达的EV蛋白如CD63或CD81或同线蛋白时，可以通过Fc结合多肽与含Fc的蛋白的Fc结构域之间的相互作用实现EV的表面的非常致密的涂覆。因此，本发明可以用至少10个包括Fc结构域的蛋白、优选地至少20个包括Fc结构域的蛋白、甚至更优选地至少30个包括Fc结构域的蛋白进行涂覆。这种蛋白可以是相同蛋白(例如，通过举例的方式，靶向连接在一个单EV上的胞内蛋白的50个抗体)或多于一个蛋白(例如，靶向胞内蛋白的30个抗体和例如含肿瘤抑制蛋白的40个Fc结构域)的拷贝。通过选择EV蛋白和Fc结合物的最佳组合，可以可能地进一步增加展示，在某些情况下，有可能用包括Fc结构域的50个蛋白或包括Fc结构域的甚至多于近75个蛋白涂覆EV，或者在某些情况下，每个EV涂覆甚至多于100个含Fc的蛋白。

在另一方面，本发明涉及用于产生能够与包括Fc结构域的蛋白如工程化为包括Fc结构域的抗体和蛋白结合的EV的方法。这种方法通常包括以下步骤：(i)将多核苷酸构建体引入到EV源细胞中，所述多核苷酸构建体对至少一个Fc结合多肽以及任选地至少一个外排体多肽进行编码；以及(ii)收集已通过EV产生的源细胞分泌的EV，其中EV包括(任选地包括在融合蛋白中的)已由多核苷酸构建体表达的Fc结合多肽。在后续步骤中，包括Fc结合多肽的EV可以使用适合的纯化技术进行纯化，随后暴露于含Fc结构域的蛋白如抗体以使能够通过Fc结合多肽与所关注的蛋白的Fc结构域之间的相互作用结合含Fc的蛋白。如上文所提及的，在替代性实施例中，步骤(i)还可以包含由相同EV源细胞中的多核苷酸构建体表达所关注的含Fc的蛋白，由此实现EV的内源性负载。(任选地具有至少一个外排体多肽的融合蛋白中包括的)Fc结合多肽和含Fc的蛋白可以由相同或不同的多核苷酸构建体表达，这取决于构建体设计。在又另一方面，本发明涉及用于用至少一个包括Fc结构域的蛋白如抗体涂覆EV的方法。这种方法包括以下步骤：(i)提供包括至少一个Fc结合多肽的EV，至少一个Fc结合多肽包括任选地与至少一个外排体多肽融合的至少一个Fc结合蛋白；以及(ii)允许Fc结合多肽与包括Fc结构域的至少一个蛋白的Fc结构域结合。用于产生包括Fc结合多肽的EV的EV源细胞可以用生成携带Fc结合多肽-含Fc的蛋白复合物的EV所需的多核苷酸构建体稳定地或瞬时地转染。稳定传染是有利的，因为其使能够产生主细胞库(MCB)和工作细胞库(WCB)。然而，在某些情况下例如在评估不同构建体或例如在迅速产生包括从患者自身的EV产生的细胞获得的自体疗法时，瞬时转染还是有利的。这些方法之后可以是附加步骤以优化应用于研究、诊断、成像和疗法的EV和含Fc的蛋白。例如，可以在适合的器皿中将包括Fc结合多肽的EV配制成液体配制品以供储存和使用。这种液体配制品可以被冷冻、冻干、配制成脂质或蛋白配制品和/或以适合的方法进行处理，这取决于所讨论的应用。含Fc的蛋白还可以被配制为液体配制品，但是可替代地，还可以以另一种物理方式进行配制，例如配制为冻干粉末。重要的是，应用考虑到的最终应用设计和产生检测试剂盒和部件试剂盒的不同组分，最终应用为流式细胞术、荧光显微术、电子显微术、体外、体内和/或离体递送方法等。

在另一方面，本发明涉及作为体外、离体和/或体内递送媒剂用于抗体或所关注的其它含Fc结构域的蛋白的EV的用途。此外，本发明还提供了作为递送媒剂用于所关注的其它诊断剂、成像剂和/或治疗剂的连接到含Fc的蛋白上的EV的用途。作为非限制性实例，已将靶向抗体连接到其表面上的EV还可以含有可以存在于EV内部和/或存在于EV膜中的额外诊断剂和/或治疗剂。例如，抗体涂覆的EV可以用于将RNA治疗运载(如mRNA、siRNA、寡核苷酸等)递送到靶细胞/组织和/或器官中。在另一个非限制性实例中，EV已将含Fc的靶向蛋白(如已工程化以含有Fc结构域的scFv)连接到其表面上并且EV内部或EV膜中/上包括治疗蛋白如任选地与CRISPR RNA引导链一起用于基因编辑的Cas9。

在另一方面，本发明的方法还可以包括将EV源细胞暴露于血清饥饿、低氧、巴弗洛霉素或细胞因子如TNF-α和/或IFN-γ以影响所产生的EV的产率或特性。EV生产规模和时间线将在很大程度上取决于EV产生的细胞或细胞系，并且因此由本领域技术人员相应地适应。根据本发明的方法可以进一步包括EV纯化步骤，在将包括Fc结合多肽的EV与连接到EV上的含Fc结构域的蛋白(如抗体)共同孵育之前，可以执行所述纯化步骤。可以通过选自包括以下的技术的组的程序来纯化EV：液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)、珠-洗出液色谱法、旋转过滤法、切向流过滤法(TFF)、中空纤维过滤法、离心法、免疫沉淀法、场流细分法、透析、基于微流体的分离等、或其任何组合。在有利的实施例中，使用过滤法(优选地超滤法(UF)、切向流过滤法或中空纤维过滤法)和大小排阻液相色谱法(LC)或珠-洗出物色谱法的顺序组合进行EV的纯化。纯化步骤的这种组合导致优化的纯化，这进而导致各种应用、测定和分析方法的优良活性和效力。进一步地，如与用于纯化外排体常规采用的超速离心法(UC)相比，顺序过滤法-色谱法相对较快并且可以拓展到较高制造总量，这是主导现有技术的当前UC方法的显著缺陷。另一种有利的纯化方法是切向流过滤法(TFF)，其提供可扩展性和纯度并且可以与任何其它类型的纯化技术组合。

在又另一方面，本发明涉及包括根据本发明的EV、通常采用EV群体的形式的药物、诊断和/或成像组合物。典型地，根据本发明的组合物包括一种类型的用至少一种可接受的赋形剂配制的EV(即，包括某些类型的Fc结合蛋白并已将一种或多种类型的含Fc的蛋白如抗体连接到其上的EV群体)。然而，例如在抗体的组合是期望的情况下，多于一种类型的EV群体可以天然地包括在单一组合物中。自然而然地，然而，如上文所提及的，单一EV或EV的单个群体可以包括多于一个与EV表面结合的含Fc的蛋白(例如，抗体)。适合的赋形剂的选择由实际应用确定，并且赋形剂可以选自包括以下的组：药学上可接受的和/或研究级材料、组合物或媒剂，例如可以参与例如悬浮、维持EV群体的活性或携带或运送EV群体的固态或液态填充剂、稀释剂、赋形剂、载剂、溶剂或包封材料。

在又另一方面，本发明涉及根据本发明的EV在医疗例如成像、诊断和/或疗法或治疗诊断中的用途。自然而然地，当根据本发明的EV用于医疗时，实际上使用了EV群体。施用给患者的EV的剂量将取决于例如所关注的已涂覆在EV表面上的含Fc的蛋白的量、待检测、诊断、治疗或减轻的疾病或症状、施用途径、任何额外诊断剂、成像剂和/或治疗剂本身的作用机制、EV的固有特性、任何靶向抗体或其它靶向实体的存在、以及技术人员已知的相关性的各种其它参数。

本发明的携带含Fc的蛋白的EV可以用于若干不同的诊断、成像和/或治疗方面。在一个实施例中，EV用靶向特定细胞类型、组织和/或器官的抗体或其它含Fc的蛋白覆盖。这是靶向EV的非常强大的方式，除了含Fc的蛋白、所关注的组织之外，所述EV可以包括其它成像剂或药剂并且可以表示治疗诊断、诊断、成像和药物递送方面的步骤机会。在另一个实施例中，与所关注的靶抗原相互作用的抗体或其它含Fc结构域的蛋白可以使用具有能够跨生物屏障的能力的EV有效地递送到所关注的通常难以达到的组织中。这种方法可以例如使单克隆抗体能够递送到中央神经系统中或递送到针对疗法和诊断/成像的大脑中。在又另一个实施例中，用含Fc的蛋白涂覆EV是一种多路复用所关注的含Fc的蛋白以增强或影响其靶标亲合力或其在体外、离体和体内与所关注的靶标结合的构象的方式。在又另一个实施例中，根据本发明的EV使能够改善抗体-药物缀合物(ADC)或受体-药物缀合物的递送和功效，因为ADC的多路复用可以显著增强其治疗活性，并且其存在于EV上意指它们还可以进入靶细胞。在另外的实施例中，EV进入靶细胞的能力意指本发明的EV打开了整个胞内空间并且使其可通过基本上包括Fc结构域的任何蛋白和/或Fc结构域可以融合到其上的任何蛋白(如用于酶替换疗法的酶、核酸酶如Cas9、或肿瘤抑制基因如p53、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7和ST14中的任何一种)施药。

根据本发明的EV和其EV群体可以因此用于诊断、成像、研究、预防和/或治疗目的，例如用于诊断、成像、评估、预防和/或治疗和/或减轻各种疾病和障碍。疾病的非限制性样本包括克罗恩氏病、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、多发性硬化、全身性红斑狼疮、类肉状瘤病、特发性肺间质纤维化、牛皮癣、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关周期性综合症(TRAPS)、白介素-1受体拮抗剂缺乏(DIRA)、子宫内膜异位、自身免疫性肝炎、硬皮病、肌炎、中风、急性脊髓损伤、血管炎、吉兰-巴雷综合征、急性心肌梗塞、ARDS、脓毒病、脑膜炎、脑炎、肝功能衰竭、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肾功能衰竭、心脏衰竭、或任何急性或慢性器官衰竭、以及相关潜在病因、移植物抗宿主疾病、杜氏肌营养不良、以及其它肌肉萎缩症、溶酶体贮积病如戈谢病、法布瑞氏症、MPS I、II(亨特氏综合征)和III、尼曼-皮克病、庞贝氏症等、神经退行性疾病(包含阿尔茨海默病、帕金森氏病、亨廷顿氏舞蹈病以及其它三核苷酸重复相关疾病)、痴呆、ALS、癌症诱导的恶病质、厌食、2型糖尿病、以及各种癌症，根据本发明的EV可以应用于这些疾病中。事实上，各种类型的癌症是用于本发明的相关疾病靶标，例如急性淋巴细胞白血病(ALL)、急性髓性白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、小脑或大脑、基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨癌、脑干胶质瘤、脑癌、脑肿瘤(小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性脑胶质瘤、室管膜细胞瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视通路和下丘脑胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/良性肿瘤、伯基特淋巴瘤、类癌瘤(儿童，胃肠道)、不明原发癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤/恶性胶质瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓细胞性白血病、慢性骨髓增生性障碍、结肠癌、原发性皮肤T细胞淋巴瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、室管膜细胞瘤、食道癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(眼内黑色素瘤、成视网膜细胞瘤)、胆囊癌、胃窦(胃)癌、胃肠类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞瘤(颅外、性腺外或卵巢)、妊娠滋养细胞肿瘤、胶质瘤(脑干胶质瘤、脑星形细胞瘤、视通路和下丘脑胶质瘤)、胃类癌、毛细胞白血病、头颈癌、心癌、肝细胞(肝)癌、霍奇金淋巴瘤、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西肉瘤、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病((急性淋巴细胞白血病(也被称为急性淋巴性白血病)、急性骨髓性白血病(也被称为急性髓系白血病)、慢性淋巴细胞白血病(也被称为慢性淋巴性白血病)、慢性髓系白血病(也被称为慢性骨髓性白血病)、毛细胞白血病)、唇及口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、肺癌(非小细胞、小细胞)、淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金病、成神经管细胞瘤、梅克尔细胞癌、间皮瘤、具有隐匿原发性的转移性鳞状颈癌、口腔癌、多发性内分泌瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞赘生物、蕈状真菌病、脊髓发育不良/骨髓增殖性疾病、骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病(急性，慢性)、骨髓瘤、鼻腔和鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮间质瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低恶性瘤、胰腺癌、胰岛细胞癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽喉癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、松果体母细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(肿瘤肉瘤、卡波西肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤的尤文家族)、塞扎里综合征、皮肤癌(非黑色素瘤、黑色素瘤)、小肠癌、鳞状细胞、鳞状颈癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺癌和胸腺上皮癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症和/或维尔姆斯瘤。

根据本发明的EV可以通过各种不同的施用途径施用给人或动物受试者，例如耳廓(耳)、颊、结膜、皮肤、牙齿、电渗、宫颈内膜、内窦、气管内、肠内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸润、间质、腹腔内、羊膜腔内、动脉内、关节内、颅内、支气管内、囊内、心脏内、软骨内、骶管内、海绵体内、腔内、大脑内、脑池内、角膜内、冠状位内(牙齿)、冠状动脉内、阴茎海绵体内、真皮内、椎间盘内、导管内、十二指肠内、硬脑膜内、表皮内、食管内、胃内、齿龈内、回肠内、病灶内、内腔内、淋巴管内、髓内、内膜内、肌肉内、眼内、动脉内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、窦内、脊柱内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸腔内、管内、肿瘤内、鼓膜内、子宫内、血管内、静脉内、静脉内丸剂、静脉内滴注、脑室内、膀胱内、玻璃体内、离子电渗疗法、灌洗、喉、鼻、鼻胃、闭塞性敷料技术、眼、口腔、口咽、其它、肠外、经皮、关节周围、硬膜外、神经周围、牙周、直肠、呼吸(吸入)、眼球后、软组织、蛛网膜下腔、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、透皮、经粘膜、经胎盘、经气管、经鼓室、输尿管、尿道和/或阴道给药和/或上述施用途径的任何组合，这通常取决于待治疗的疾病和/或抗体的特征或因此EV群体。

根据本发明的适合的靶向抗体可以靶向衍生自例如肿瘤、实体器官、身体结构、细胞或组织类型的抗原。可以用过靶向抗体靶向的抗原来源的非限制性实例包含肝、肺、肾、心脏、胰腺、肾上腺、甲状腺、甲状旁腺、包含所有脑区(例如丘脑、下丘脑、纹状体等)的大脑、血脑屏障、CNS、PNS、骨髓、皮肤、血管系统、包含脾脏、关节、眼睛、肌肉组织的淋巴系统、炎症位点、损伤位点、以及细胞类型如脂肪细胞、肌细胞(成肌细胞和肌管)、卫星细胞、心肌细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肾细胞、周细胞、神经元、神经胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、巨噬细胞、DC细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、上皮细胞、红细胞、早期祖细胞如多能造血干细胞/血细胞成纤维细胞、骨髓祖细胞、淋巴祖细胞等。用于靶向癌症的相关抗原的非限制性实例包含腺癌抗原、甲胎蛋白、BAFF、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、双唾液酸神经节苷脂(GD2)、4-IBB、5T4、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNT0888、CTLA-4、DR5、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纤连蛋白额外结构域-B、叶酸受体1、GD2、GD3神经节苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/神经鞘、HGF、人散射因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGI、LI-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、整合素α5β1、整合素αvβ3、豆荚蛋白、MORAb-009、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、C-MET、CCR4、CD 152、CD 10、CD 19、CD20、CD200、羟乙酰神经氨酸、NPC-IC、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、腱生蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、叶酸受体、转铁蛋白受体及其任何组合。

在另外的实施例中，根据本发明的抗体的适合的非限制性实例可以是以下中的一个或多个：阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、博纳吐单抗(Actoxumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatumumab)、曲妥珠单抗-美坦新偶联物(Adotrastuzumab emtansine)、阿杜卡尼单抗(Aducanumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、阿夫土珠单抗(Afutuzumab)、培化阿珠单抗阿仑单抗(Alacizumab Alemtuzumab)、阿利库单抗(Alirocumab)、阿妥莫单抗三胺五乙酸(Altumomab pentetate)、阿麦妥昔单抗(Amatuximab)、麻安莫单抗(Anatumomab mafenatox)、Anifrolumab(安利夫单抗)、安芦珠单抗(Anrukinzumab)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、安妥明单抗(Atinumab)、托珠单抗(Atlizumab)、阿托木单抗(Atorolimuma)、阿维鲁单抗(Avelumab)、巴匹珠单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴维昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝利木单抗(Belimumab)、贝拉利珠单抗(Benralizumab)、柏替木单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐珠单抗(Bevacizumab)、贝珠妥单抗(Bezlotoxumab)、比西单抗(Biciromab)、比莫哥鲁单抗(Bimagrumab)、莫比伐单抗(Bivatuzumab mertansine)、兰妥莫单抗(Blinatumomab)、布罗锁珠单抗(Blosozumab)、本妥昔单抗(Brentuximab vedotin)、布雷奴单抗(Briakinumab)、布洛多单抗(Brodalumab)、卡那奴单抗(Canakinumab)、美坎珠单抗(Cantuzumab mertansine)、拉-坎妥珠单抗(Cantuzumab ravtansine)、坎普拉珠单抗(Caplacizumab)、喷替酸卡罗单抗(Capromabpendetide)、卡鲁单抗(Carlumab)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、cBR96-阿霉素免疫偶联物、西地珠单抗(Cedelizumab)、赛妥珠单抗(Certolizumab pegol)、西妥昔单抗(Cetuximab)、泊西他珠单抗(Citatuzumabbogatox)、西妥木单抗(Cixutumumab)、克拉唑卡珠单抗(Clazakizumab)、克立昔单抗(Clenoliximab)、克立沃妥单抗(Clivatuzumabtetraxetan)、可那木单抗(Conatumumab)、可丝珠单抗(Concizumab)、克雷内治单抗(Crenezumab)、CR6261、达西珠单抗(Dacetuzumab)、达克珠单抗(Daclizumab)、达洛珠单抗(Dalotuzumab)、达雷妥木单抗(Daratumumab)、登西珠单抗(Demcizumab)、地舒单抗(Denosumab)、地莫单抗(Detumomab)、地努图希单抗(Dinutuximab)、阿托度单抗(Dorlimomab aritox)、卓齐妥单抗(Drozitumab)、杜利他单抗(Duligotumab)、杜普单抗(Dupilumab)、杜伐单抗(Durvalumab)、杜昔单抗(Dusigitumab)、依美昔单抗(Ecromeximab)、依库珠单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依屈洛单抗(Edrecolomab)、依法珠单抗(Efalizumab)、依芬古单抗(Efungumab)、埃尔德单抗(Eldelumab)、伊洛珠单抗(Elotuzumab)、艾西莫单抗(Elsilimomab)、恩伐珠单抗(Enavatuzumab)、PEG化恩莫单抗(Enlimomab pegol)、依诺珠单抗(Enokizumab)、依诺替单抗(Enoticumab)、恩师妥昔单抗(Ensituximab)、西依匹莫单抗(Epitumomab cituxetan)、依帕珠单抗(Epratuzumab)、厄利珠单抗(Erlizumab)、厄马索单抗(Ertumaxomab)、依那西普(Etanercept)、依他珠单抗(Etaracizumab)、依曲利珠单抗(Etrolizumab)、依福单抗(Evolocumab)、艾韦单抗(Exbivirumab)、法索单抗(Fanolesomab)、法拉莫单抗(Faralimomab)、法鲁珠单抗(Farletuzumab)、法辛单抗(Fasinumab)、FBTA05、泛维珠单抗(Felvizumab)、费扎尼单抗(Fezakinumab)、非卡妥珠单抗(Ficlatuzumab)、菲妥木单抗(Figitumumab)、法兰妥单抗(Flanvotumab)、芬特妥珠单抗(Fontolizumab)、福拉木单抗(Foralumab)、福韦单抗(Foravirumab)、去甲美马单抗(Fresolimumab)、富拉单抗(Fulranumab)、伏妥昔单抗(Futuximab)、加利昔单抗(Galiximab)、甘露单抗(Ganitumab)、冈特莫单抗(Gantenerumab)、加维莫单抗(Gavilimomab)、格图单抗-奥佐米星偶联物(Gemtuzumab ozogamicin)、格伐克单抗(Gevokizumab)、吉妥昔单抗(Girentuximab)、维格列巴单抗(Glembatumumab vedotin)、哥利木单抗(Golimumab)、高密昔单抗(Gomiliximab)、古塞尔库姆单抗(Guselkumab)、伊巴珠单抗(Ibalizumab)、伊立莫单抗替西坦偶联物(Ibritumomab tiuxetan)、伊鲁库单抗(Icrucumab)、伊戈伏单抗(Igovomab)、IMAB362、英西单抗(Imciromab)、伊马曲单抗(Imgatuzumab)、依克拉单抗(Inclacumab)、吲妥昔单抗瑞伐坦(Indatuximab ravtansine)、英夫利昔单抗(Infliximab)、英特单抗(Intetumumab)、伊诺莫单抗(Inolimomab)、奥妥珠格图单抗-奥佐米星偶联物(Inotuzumabozogamicin)、伊匹木单抗(Ipilimumab)、伊拉单抗(Iratumumab)、伊托珠单抗(Itolizumab)、衣克珠单抗(Ixekizumab)、克利昔单抗(Keliximab)、拉托唑单抗(Labetuzumab)、兰布利单抗(Lambrolizumab)、拉帕单抗(Lampalizumab)、利勃珠单抗(Lebrikizumab)、利马索单抗(Lemalesomab)、勒德利木单抗(Lerdelimumab)、莱卡单抗(Lexatumumab)、利比维单抗(Libivirumab)、利格珠单抗(Ligelizumab)、林妥珠单抗(Lintuzumab)、利鲁单抗(Lirilumab)、洛德昔单抗(Lodelcizumab)、莫洛伐妥单抗(Lorvotuzumab mertansine)、卢卡珠单抗(Lucatumumab)、鲁米昔单抗(Lumiliximab)、马塔单抗(Mapatumumab)、马妥昔单抗(Margetuximab)、马司莫单抗(Maslimomab)、马维里单抗(Mavrilimumab)、马妥单抗(Matuzumab)、美泊利单抗(Mepolizumab)、迈他珠单抗(Metelimumab)、米拉珠单抗(Milatuzumab)、明妥莫单抗(Minretumomab)、米托单抗(Mitumomab)、莫加利单抗(Mogamulizumab)、莫洛莫单抗(Morolimumab)、莫他珠单抗(Motavizumab)、莫昔单抗-帕多毒素偶联物(Moxetumomab pasudotox)、穆罗莫纳-CD3(Muromonab-CD3)、塔非那托克-塔芬毒素偶联物(Nacolomab tafenatox)、纳霉单抗(Namilumab)、萘妥莫单抗-衣塔芬毒素偶联物(Naptumomab estafenatox)、纳妥单抗(Narnatumab)、那他珠单抗(Natalizumab)、奈巴库单抗(Nebacumab)、奈米单抗(Necitumumab)、奈利莫单抗(Nerelimomab)、奈西伐单抗(Nesvacumab)、尼妥珠单抗(Nimotuzumab)、尼沃单抗(Nivolumab)、巯诺莫单抗-美培坦偶联物(Nofetumomabmerpentan)、奥卡鲁单抗(Ocaratuzumab)、奥克里昔单抗(Ocrelizumab)、奥杜莫单抗(Odulimomab)、阿法单抗(Ofatumumab)、奥拉他单抗(Olaratumab)、奥昔单抗(Olokizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、阿那妥单抗(Onartuzumab)、恩妥昔单抗(Ontuxizumab)、阿曲单抗-莫那毒素偶联物(Oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、奥替单抗(Orticumab)、奥立昔单抗(Otelixizumab)、奥特鲁单抗(Otlertuzumab)、奥索单抗(Oxelumab)、奥扎尼单抗(Ozanezumab)、奥索利单抗(Ozoralizumab)、帕吉巴昔单抗(Pagibaximab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、潘科曼单抗(Pankomab)、泛巴单抗(Panobacumab)、帕撒单抗(Parsatuzumab)、帕昔单抗(Pascolizumab)、帕替利单抗(Pateclizumab)、帕特利单抗(Patritumab)、彭布利单抗(Pembrolizumab)、培马单抗(Pemtumomab)、哌拉单抗(Perakizumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、培昔单抗(Pexelizumab)、匹利珠单抗(Pidilizumab)、维匹那妥单抗(Pinatuzumab vedotin)、品妥莫单抗(Pintumomab)、普鲁单抗(Placulumab)、维波达单抗(Polatuzumab vedotin)、庞尼泽单抗(Ponezumab)、普利昔单抗(Priliximab)、普罗昔单抗(Pritoxaximab)、普鲁米单抗(Pritumumab)、PRO 140、奎珠单抗(Quilizumab)、拉托单抗(Racotumomab)、拉德鲁单抗(Radretumab)、拉维夫单抗(Rafivirumab)、拉莫鲁单抗(Ramucirumab)、雷尼珠单抗(Ranibizumab)、拉克昔单抗(Raxibacumab)、瑞伐单抗(Regavirumab)、利昔单抗(Reslizumab)、利妥珠单抗(Rilotumumab)、利撒克珠单抗(Risankizumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、罗巴单抗(Robatumumab)、罗乐单抗(Roledumab)、罗莫索单抗(Romosozumab)、罗他珠单抗(Rontalizumab)、罗维珠单抗(Rovelizumab)、鲁普单抗(Ruplizumab)、沙马利单抗(Samalizumab)、沙利鲁单抗(Sarilumab)、沙妥单抗-喷地肽偶联物(Satumomabpendetide)、塞库单抗(Secukinumab)、塞巴坦单抗(Seribantumab)、塞妥昔单抗(Setoxaximab)、赛韦单抗(Sevirumab)、西布曲单抗(Sibrotuzumab)、西伐单抗(Sifalimumab)、西妥昔单抗(Siltuximab)、西妥珠单抗(Simtuzumab)、西普利单抗(Siplizumab)、西鲁库单抗(Sirukumab)、索冷珠单抗(Solanezumab)、索利单抗(Solitomab)、索普昔单抗(Sonepcizumab)、索妥单抗(Sontuzumab)、丝塔单抗(Stamulumab)、舒乐单(Sulesomab)、苏维珠单抗(Suvizumab)、他巴单抗(Tabalumab)、塔卡珠单抗-四乙酸偶联物(Tacatuzumab tetraxetan)、塔多珠单抗(Tadocizumab)、塔利单抗(Talizumab)、坦纳单抗(Tanezumab)、普利妥单抗-帕普毒素偶联物(Taplitumomabpaptox)、替非珠单抗(Tefibazumab)、阿替莫单抗-阿利毒素偶联物(Telimomab aritox)、替纳单抗(Tenatumomab)、替尼昔单抗(Teneliximab)、替普珠单抗(Teplizumab)、四丙珠单抗(Teprotumumab)、替昔单抗(Ticilimumab)、替拉珠单抗(Tildrakizumab)、替加妥单抗(Tigatuzumab)、塔西单抗(Tocilizumab)、托拉珠单抗(Toralizumab)、托西单抗(Tositumomab)、托西莫单抗(Bexxar)、托维单抗(Tovetumab)、曲洛单抗(Tralokinumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、曲利单抗(Tregalizumab)、曲美单抗(Tremelimumab)、图卡珠单抗-西莫白介素偶联物(Tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(Tuvirumab)、乌布妥昔单抗(Ublituximab)、乌洛单抗(Urelumab)、乌索单抗(Urtoxazumab)、乌司他单抗(Ustekinumab)、范蒂姆单抗(Vantictumab)、伐昔单抗(Vapaliximab)、伐他珠单抗(Vatelizumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、维帕莫单抗(Vepalimomab)、维森单抗(Vesencumab)、维西珠单抗(Visilizumab)、伏罗昔单抗(Volociximab)、沃塞妥单抗-马伏毒素偶联物(Vorsetuzumab mafodotin)、伏妥单抗(Votumumab)、扎鲁单抗(Zalutumumab)、扎诺米单抗(Zanolimumab)、扎妥昔单抗(Zatuximab)、齐拉明单抗(Ziralimumab)、阿佐莫单抗-阿利毒素偶联物(Zolimomabaritox)或其任何组合。重要的是，本发明提供了任何抗体的递送，无论其靶标是胞内的和/或胞外的。本发明的EV有效地内化抗体的能力表示单克隆开发的步骤变化并且可以使能够跨靶细胞的整个胞内室靶向抗原和靶标。重要的是，出于检测和成像目的，根据本发明的抗体和含Fc的蛋白可以有利地例如使用荧光团、MRI药剂、PET药剂、放射性药剂、酶、纳米颗粒、金属、有机和无机化合物等进行标记。

应理解的是，在不背离本发明的范围的情况下，可以修改上述例示方面、实施例、替代方案和变体。现在将用所附实例进一步例示本发明，自然而然地，在不背离本发明的范围和主旨的情况下，还可以相当大地修改所附实例。

实验部分

材料和方法

构建体设计和克隆：已构建包括至少一个Fc结合多肽以及任选地至少一个外排体多肽的各种蛋白构建体、将其克隆到载体中并且在若干种不同的EV产生的源细胞中产生。ORF通常通过合成产生并且克隆到哺乳动物表达载体pSF-CAG-Amp中。简而言之，用根据制造商指示(NEB)的酶Notl和Sail消化所合成的DNA和载体质粒。用根据制造商指示(NEB)的T4连接酶将所限制的、纯化的DNA片段连接在一起。通过氨苄青霉素-补充板上的细菌转化来选择成功的连接事件。根据制造商指示，用于转染的质粒通过“maxi-prep”产生。

在含Fc的蛋白内源性地在表达融合蛋白的相同的EV产生的源细胞中产生的情况下，ORF被购买(奥杰技术公司(Origene Technologies,Inc.))并扩增并且克隆到pIRES双顺反子表达载体(克隆技术实验室公司(Clontech Laboratories Inc.))的MSC A位点中，使得在转译时，最佳外排体多肽与一个构建体中的Fc结合多肽融合，而所关注的含Fc的蛋白被单独(从单独构建体或从相同构建体)转译并且运送到待在EV产生的源细胞中形成的EV中。大部分克隆使用NEBuilder HiFi DNA组合件克隆试剂盒(NEB公司)进行并且使用Sanger测序(源生物科学公司(Source Bioscience))进行确认。pIRES载体同时实现两个转基因的双顺反子表达，这确保EV产生的细胞将同时表达Fc结合多肽(任选地作为融合蛋白)和所关注的含Fc的蛋白两者。质粒被转化成NEB 5-α感受态大肠杆菌细胞(NEB公司)并且在根据制造商的推荐的振荡培养箱中生长过夜。质粒被分离并使用根据制造商的指示的‘maxi-prep质粒DNA纯化试剂盒’(凯杰公司(Qiagen))进行纯化。

·细胞培养和转染

取决于实验设计和测定，在某些情况下，在常规的2D细胞培养物中进行非病毒性瞬时转染和外排体产生，而在其它情况下，采用病毒介导的转导来产生稳定的细胞系，所述稳定的细胞系通常在不同类型的生物反应器中进行培养。为简洁起见，在本文中仅提及了一些实例。

HEK293T细胞通常接种到15cm的培养皿(每个培养皿9x10⁶个细胞)并且在如由ATCC推荐的含血清的DMEM中放置过夜。第二天，用直接添加到细胞中的脂质体的DNA对细胞进行瞬时转染。简而言之，在室温下在20分钟内组合在一起之前，分别将DNA和聚乙烯亚胺(PEI)在OptiMEM中孵育5分钟。将脂质体的DNA和细胞共孵育6小时，随后将所养护的培养基换成OptiMEM孵育48小时。在培养皿、烧瓶和其它细胞培养物器皿中评估的其它细胞和细胞系包含骨髓来源的间充质基质细胞(BM-MSC)和华顿氏胶衍生的MSC(WJ-MSC)、羊膜细胞、纤维原细胞、各种内皮细胞和上皮细胞、以及各种免疫细胞和细胞系。

在用于Fc结合多肽(任选地包括在具有外排体多肽的融合蛋白中)和所关注的含Fc的蛋白的各种组合的稳定的细胞系的病毒转导和产生的情况下，通常使用慢病毒(LV)对细胞源如BM-MSC、WJ-MSC、纤维原细胞、羊膜细胞、各种内皮细胞和上皮细胞进行病毒转导。通常，在感染后的24小时，将100.000个细胞(例如，纤维原细胞、MSC等)或200.000个细胞(例如，HEK293T)置于6孔板中。添加2μL的LV以及任选地聚凝胺(或海地美溴铵，孔上的最终浓度为8μg/mL)，并且在转导后24小时将所转导的细胞的细胞培养基换为新鲜完整的培养基。转导后72小时，进行嘌呤霉素选择(4-6μg/ml)，通常7天之后分析Fc结合多肽的稳定表达(任选地作为与EV蛋白在一起的融合蛋白)。

在2D培养物或生物反应器中培养稳定的细胞，通常是中空纤维生物反应器或搅拌级生物反应器，并且随后收获所养护的培养基以进行外排体制备。执行各种制备和纯化步骤。标准工作流程包括以下步骤：预清除上清液、基于过滤进行浓缩、基于色谱法地去除蛋白污染物、以及任选地在适合的缓冲剂中配制所产生的外排体组合物以进行体外、离体和/或体内测定。

·测定和分析

蛋白质印迹是用于评估EV中融合蛋白的富集的非常方便的分析方法。简而言之，根据制造商的指示执行SDS-PAGE(英杰公司(Invitrogen)，Novex PAGE 4-12％凝胶)，由此每个孔装载1x10¹⁰个外排体和20μg的细胞裂解物。将来自SDS-PAGE凝胶的蛋白转移到根据制造商的指示的PVDF膜(Immobilon，英杰公司)中。膜被封闭在奥德赛封闭缓冲液(Licor)中并用根据供应商的指示的针对Fc结合多肽和/或外排体蛋白的抗体(一抗-Abeam，二抗-Licor)进行探测。以680nm和800nm的波长可视化分子探针。

对于EV大小确定，用配备有分析软件的NanoSight仪器执行纳米颗粒跟踪分析(NTA)。对于所有记录，使用13或15的相机水平和针对所有后续获取设定的自动功能。电子显微术和荧光显微术频繁地用于理解胞内位置并释放并且定量和分析EV和用标记的含Fc的蛋白如抗体涂覆的EV。

EV被分离并使用各种各样的方法进行纯化，通常是过滤如TFF和LC的组合，具体地珠-洗脱物LC。典型地，收集含EV的培养基并使300g的其经受低速旋转5分钟，随后2000g低速旋转10分钟以去除较大颗粒和细胞碎屑。然后用0.22μm注射器式滤器对上清液进行过滤并使其经受不同的纯化步骤。使用具有100kDa截止过滤器的Vivaflow 50R切向流(TFF)装置(Sartorius)或具有100kDa或300kDa截止中空纤维过滤器的KR2i TFF系统(SpectrumLabs)渗透大体积并粗略地浓缩到20ml。随后将预浓缩的培养基装载到珠-洗出物柱(HiScreen或HiTrap Capto Core 700柱，通用医疗生命科学公司(GE HealthcareLife Sciences))上、连接到AKTAprime+或AKTA Pure 25色谱系统上。根据制造商的指示选择针对柱平衡、样本装载和柱原位清洗步骤的流速设定。根据UV吸收度色谱图收集样本并使用Amicon Ultra-15 10kDa分子量截止旋转过滤器(Millipore)将其浓缩到最终体积100μl，并且将其储存在-80℃下以进行另外的下游分析。为了估计蛋白和RNA洗脱物曲线，使培养基浓缩并使用100kDa和300kDa中空纤维过滤器用KR2i TFF系统进行渗透，并且在Tricorn 10/300 Sepharose 4 Fast Flow(S4FF)柱(通用医疗生命科学公司)上分析样本。

·实例

实例1：将IgG与包括Fc结合多肽的EV(Fc结合EV)结合

使用切向流过滤法用300kd的中空纤维柱从所养护的来自工程化HEK293T细胞(对照物相对于稳定地表达Gp130胞外结构域-2XGGGGS连接子-Z结构域-Gp130跨膜结构域-亮氨酸拉链结构域-N端同线蛋白-His标签的Fc结合构建体)的培养基中分离EV，随后使用10kd旋转过滤器进行超滤以进行浓缩。然后使用电子显微术和流式细胞术估计IgG与Fc结合EV的结合能力。

对于电子显微术，在37℃下用与金纳米颗粒缀合的野兔抗山羊10nm抗体孵育1x10^9个EV 2小时。如图2中所示出的，用纳米金标记的抗体(即含Fc的蛋白)装饰Fc结合多肽(A)，而对照EV(B)不具有结合的任何抗体。

对于流式细胞术，用来自MACSPlex外排体试剂盒、人(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)，订单号130-108-813)的15μl抗体涂覆的捕获珠在120μl的PBS中在450rpm下的定轨振荡器上孵育1x10^8EV 16小时过夜。洗涤后，将3μg的AlexaFluor647-缀合人IgG Fc片段(杰克逊实验室公司(Jackson Laboratories)，目录009-600-008)添加到对照物中，而无EV(A)、对照物EV(B)或Fc结合EV(同线蛋白-gp130-z结构域-gp130)(C)。在室温下孵育1小时后，未结合的Fc片段被清洗掉，并且通过流式细胞术分析样本。在图3中，相应的左边斑点印迹示出使用B1-A(激发：488nm，发射滤光片：500nm到550nm；面积)相对于B2-A(激发：488nm，发射滤光片：565nm到605nm；面积)参数的难染色的捕获珠群体。相应的右边图示出R1-A(激发：635nm，发射滤光片：655nm到730nm；面积)相对于B2-A参数，其表明AlexaFluor647标记的Fc片段与已与仅(C)中的捕获珠结合的EV结合。图3示出Fc结合EV与AlexaFluor647标记的Fc片段(人IgG)结合并且还非常有效地与所有39个不同抗体的Fc结构域结合，这39个不同是抗体通过制造商涂覆在试剂盒中包含的所有捕获珠上，包含两个阴性对照物珠群体。

这些结果表明Fc结合EV可以用于标准化目的、任何种类的测定、方法或包括将抗体或含Fc的蛋白或探针与EV结合的应用中的阳性对照物、校准对照物或补偿对照物。通常，抗体或含Fc的蛋白将用荧光团或其它种类的检测部分标记。由于从抗体或含Fc的蛋白的Fc介导的结合期望的信号通常将至少与将从特异性互补决定区(CDR)介导的抗体与EV的结合期望的信号一样高，因此这些Fc结合EV将表示用于任何种类的测定例如基于EV的表型的流式细胞术的适合的阳性对照物，并且还与可能用于流式细胞术或就此而言用于任何其它类型的技术或测定(如使用连接到例如金纳米颗粒上的抗体的荧光显微术、纳米成像、纳米颗粒跟踪分析、动态光散射、电子显微术)的任何种类的抗体兼容。这尤其对于旨在将不同类型的抗体与不同荧光标记物组合例如用FITC标记的抗体1和用PE标记的抗体2的多颜色测定将有用。在这种多颜色方法中，大部分方法要求用于相应抗体的所发射的荧光信号之间的光谱重叠补偿，并且因此需要阳性对照物以执行这种光谱补偿，所述光谱补偿可以通过用相应抗体标记Fc结合EV来产生。在仪器或试剂的校准或测定的标准化方面，与给定抗体或含Fc的探针结合的EV实体还将适用于监测变化和验证随时间推移的完整设置，例如作为校准诊断试验或实验室设定的稳定源。

实例2：用于递送抗HER2抗体的FCGR1A Lamp2B EV

使用超滤法和尺寸排阻色谱法将EV与HEK293T细胞(其稳定地表达FCGR1A胞外结构域-4XGS连接子-Lamp2b、单独地Fc结合物FCGR1A、或其野生型对照物)分离。用PKH26红荧光染料标记EV并通过在37℃下共孵育EV和抗体1小时来用抗HER2抗体或其同种型对照物进行装饰。通过尺寸排阻色谱法去除未结合而定抗体。装饰EV的抗体的摄取的特征在于使用流式细胞术进行HER2低表达细胞系MDA-MB-231和HER2高表达细胞系MDA-MB-361。图4示出与仅在HER2高表达细胞系MDA-MB-361中而不在HER2低表达细胞系MDA-MB-231中的同种型对照物装饰的和野生型EV相比，抗HER2抗体增加了所装饰的EV的摄取。单独表达FCGR1A的EV(不包括在融合蛋白中)展示了类似活性，并且还用表达CD63-ZZ融合蛋白的EV获得了类似结果。

实例3：通过Fc结合EV进行抗体的胞内摄取和递送

使用超滤法和尺寸排阻色谱法将EV与所养护的华顿氏胶衍生的MSC的培养基(其稳定地表达TNFR胞外结构域-2XGGGGS连接子-Z结构域-TNFR跨膜结构域-折叠子-N端同线蛋白融合蛋白或对照物)分离。为了研究Fc结合EV是否可以用于Abs的胞内递送，在400μl中孵育4x10^11个EV 16小时(过夜)，总共3μg的AlexaFluor488-标记的抗核纤层蛋白B2IgGs[abeam ab200426，野兔单克隆EPR9701(B)]。对于摄取实验，将Huh7细胞铺板于48个孔板中，每个孔30,000个细胞并且在添加0.675x10^11个抗体标记的EV之前孵育16小时。在通过如图5中示出的荧光显微术(A)和流式细胞术(B)胰蛋白酶处理和分析之前，将细胞在37℃下和加湿气氛中5％的CO₂下孵育2小时；A)示出与相衬图像合并的绿色荧光信号。B)中的直方图示出在x轴上的对数刻度与y轴上的归一化频率的绿色荧光强度。1：未用抗体或EV处理HuH7细胞。2：用对照物EV处理的HuH7细胞，所述对照物EV用抗核纤层蛋白B2抗体进行孵育。3：用Fc结合EV处理的HuH7细胞，所述对照物EV用抗核纤层蛋白B2抗体进行孵育。图5示出荧光抗体的信号明显存在于用Fc结合EV加抗体进行处理的细胞中，而荧光信号不存在于未处理的(1)或处理的(2)对照EV中。这表明抗体可以通过Fc结合EV在胞内递送，并且与EV的结合显著地增加了摄取到细胞中的抗体。

为了表明功能性胞内递送，在37℃下用相应EV孵育抗NFkB抗体(抗NFkB-Ab)1小时。用5ng/ml的hTNF-α和EV-Ab-混合物处理报告细胞系、稳定表达NFkB荧光素酶的HEK细胞。处理6小时后，测量荧光素酶活性。图6示出当通过Fc结合EV递送抗NFkB-ab时成功的抑制。

Claims

1.一种作为研究工具、诊断工具、成像工具、作为生物参比材料(RM)、作为实验对照和/或实验标准的胞外囊泡(EV)的用途，所述EV包括至少一个Fc结合多肽。

2.根据权利要求1所述的用途，其中所述用途在于流式细胞术、成像流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析、纳米成像、共聚焦显微术、荧光显微术、动态光散射、电子显微术、基于发光的检测、荧光相关光谱、基于荧光共振能量转移(FRET)的技术、基于磁性、荧光和/或基于浮力的标记的阳性或阴性选择技术、基于颗粒密度、电荷或大小的阳性或阴性选择技术、或其任何组合。

3.根据权利要求1或权利要求2所述的用途，其中所述至少一个Fc结合多肽与至少一个外排体多肽一起形成融合蛋白的部分。

4.根据权利要求1到3中任一项所述的用途，其中所述Fc结合多肽与含Fc的蛋白的Fc结构域结合。

5.根据权利要求2到4中任一项所述的用途，其中所述含Fc的蛋白是抗体。

6.根据权利要求2到5中任一项所述的用途，其中所述含Fc的蛋白连接到至少一个荧光团、至少一个放射性标记物、至少一个PET配体、至少一种MRI药剂、纳米颗粒、无机化合物、或任何其它检测部分上。

7.根据权利要求1到6中任一项所述的用途，其中所述用途作为用于流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析和/或动态光散射的生物RM。

8.根据权利要求7所述的用途，其中所述RM用于补偿、校准、标准化、验证、或任何其它类似目的。

9.根据权利要求1到8中任一项所述的用途，其中所述EV本身包括至少一个检测部分。

10.根据权利要求9所述的用途，其中所述检测部分选自包括以下的组：至少一个荧光团、至少一种染料、至少一个荧光多肽、至少一个放射性标记物、至少一种PET药剂、至少一种MRI药剂、无机化合物、有机化合物、或任何其它检测部分。

11.一种用于将含Fc的蛋白递送到靶细胞的体外、体内和/或离体方法，其包括(i)提供包括至少一个Fc结合多肽的EV；(ii)允许所述Fc结合多肽与所述含Fc的蛋白结合；(iii)使靶细胞与所述EV接触，所述EV已将所述含Fc的蛋白连接到其Fc结合多肽上。

12.根据权利要求11所述的方法，其中所述含Fc的蛋白被递送到靶细胞的胞内环境中。

13.根据权利要求11到12中任一项所述的方法，其中所述至少一个Fc结合多肽与至少一个外排体多肽一起形成融合蛋白的部分。

14.根据权利要求11到13中任一项所述的方法，其中所述含Fc的蛋白是抗体。

15.根据权利要求11到14中任一项所述的方法，其中所述含Fc的蛋白连接到至少一个荧光团、至少一个放射性标记物、至少一个PET配体、至少一种MRI药剂、纳米颗粒、无机化合物、或任何其它检测部分上。

16.根据权利要求11到15中任一项所述的用途，其中所述EV本身包括检测部分，所述检测部分任选地选自包括以下的组：至少一个荧光团、至少一种染料、至少一个荧光多肽、至少一个放射性标记物、至少一种PET药剂、至少一种MRI药剂、纳米颗粒、无机化合物、或任何其它检测部分。

17.一种包括EV的检测试剂盒，其中所述EV包括至少一个融合蛋白，所述至少一个融合蛋白包括至少一个Fc结合多肽和至少一个外排体多肽。

18.根据权利要求17所述的检测试剂盒，其中所述至少一个Fc结合多肽与含Fc的蛋白的Fc结构域结合。

19.根据权利要求17到18中任一项所述的检测试剂盒，其中所述含Fc的蛋白是抗体。

20.根据权利要求17到19中任一项所述的检测试剂盒，其中所述含Fc的蛋白连接到至少一个荧光团、至少一个放射性标记物、至少一个PET配体、至少一种MRI药剂、纳米颗粒、无机化合物、或任何其它检测部分上。

21.根据权利要求17到20中任一项所述的检测试剂盒，其用于检测胞外或胞内生物分子。

22.根据权利要求21所述的检测试剂盒，其中所述生物分子的检测在活的或死的细胞和/或组织和/或器官中发生。

23.根据权利要求21到22中任一项所述的检测试剂盒，其中所述生物分子的检测在体外、离体或体内发生。

24.根据权利要求17到23中任一项所述的检测试剂盒，其中所述EV本身包括至少一个额外检测部分，所述至少一个额外检测部分任选地选自至少一个荧光团，如至少一个荧光多肽、至少一个产生生物发光的多肽、至少一个放射性标记物、至少一种PET药剂、至少一种MRI药剂、纳米颗粒、无机化合物、或任何其它检测部分。

25.根据权利要求17到24中任一项所述的检测试剂盒，其用于流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析、纳米成像、共聚焦显微术、荧光显微术、动态光散射、电子显微术、基于发光的检测、荧光相关光谱、基于荧光共振能量转移(FRET)的技术、基于磁性、荧光和/或基于浮力的标记的阳性或阴性选择技术、基于密度、电荷或大小的阳性或阴性选择技术、或其任何组合。

26.一种部件试剂盒，其包括(i)包括至少一个Fc结合多肽的EV，和(ii)至少一个含Fc的蛋白。

27.根据权利要求26所述的部件试剂盒，其中所述至少一个Fc结合多肽与至少一个外排体多肽一起形成融合蛋白的部分。

28.根据权利要求26到27中任一项所述的部件试剂盒，其中所述含Fc的蛋白是抗体。

29.根据权利要求26到28中任一项所述的部件试剂盒，其中所述含Fc的蛋白连接到至少一个荧光团、至少一个放射性标记物、至少一种PET药剂、至少一种MRI药剂、纳米颗粒、无机化合物、或任何其它检测部分上。

30.根据权利要求26到29中任一项所述的部件试剂盒，其中所述EV包括至少一个额外检测部分，所述至少一个额外检测部分选自至少一个荧光团、至少一个放射性标记物、至少一个PET配体、至少一种MRI药剂、纳米颗粒、无机化合物、或任何其它检测部分。

31.一种纳米颗粒复合物，其介于(i)包括至少一个Fc结合多肽的EV与(ii)含Fc的蛋白之间。

32.根据权利要求31所述的纳米颗粒复合物，其中所述至少一个Fc结合多肽与至少一个外排体多肽一起形成融合蛋白的部分。

33.根据权利要求31到32中任一项所述的纳米颗粒复合物，其中所述含Fc的蛋白是抗体。

34.根据权利要求31到33中任一项所述的纳米颗粒复合物，其中所述含Fc的蛋白连接到至少一个荧光团、至少一个放射性标记物、至少一种PET药剂、至少一种MRI药剂、纳米颗粒、无机化合物、或任何其它检测部分上。

35.根据权利要求31到34中任一项所述的纳米颗粒复合物，其作为研究工具、成像工具、诊断工具、成像工具、参比材料、检测试剂盒用于流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析、纳米成像、共聚焦显微术、荧光显微术、动态光散射、电子显微术、基于发光的检测、荧光相关光谱、基于荧光共振能量转移(FRET)的技术、基于磁性、荧光和/或基于浮力的标记的阳性或阴性选择技术、基于密度、电荷或大小的阳性或阴性选择技术和/或用于含Fc的蛋白的体外、体内和/或离体递送。

36.一种(i)根据权利要求17到25中任一项所述的检测试剂盒、(ii)根据权利要求26到30中任一项所述的部件试剂盒和/或(iii)根据权利要求31到35中任一项所述的纳米颗粒复合物的用途，其作为研究工具、诊断工具、成像工具、生物RM、检测试剂盒用于流式细胞术、纳米颗粒跟踪分析、纳米成像、共聚焦显微术、荧光显微术、动态光散射、电子显微术、基于发光的检测、荧光相关光谱、基于荧光共振能量转移(FRET)的技术、基于磁性、荧光和/或基于浮力的标记的阳性或阴性选择技术、基于密度、电荷或大小的阳性或阴性选择技术和/或用于含Fc的蛋白的体外、体内和/或离体递送或其任何组合。