WO2022158836A1 - 목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는 재조합 엑소좀 및 이의 용도 - Google Patents

목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는 재조합 엑소좀 및 이의 용도 Download PDF

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조병성
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Definitions

  • the present invention relates to a recombinant exosome comprising an Fc receptor or a portion thereof to which a target protein or peptide is fusible, and uses thereof.
  • the present invention is a recombinant exosome comprising a fusion polypeptide in which a target protein or peptide is fused to an Fc receptor or a part thereof, the efficacy of specifically binding to the Fc domain of an antibody and/or physiology of the target protein or peptide It relates to a recombinant exosome exhibiting activity, for example, anticancer efficacy, immune-related efficacy, or antiviral efficacy, and the like, and uses thereof.
  • the present invention relates to the application of the recombinant exosomes as described above to the prevention, suppression, alleviation, improvement or treatment of immune-related diseases, cancer, inflammatory diseases, viral diseases, and various other diseases.
  • a drug delivery system (DDS) is used to make a therapeutic agent administered to the human body work effectively and reduce side effects.
  • an antibody, Nanobody, protein, or polypeptide when exposed to an in vivo environment, its efficacy may be reduced or it may not be delivered to a target site to be treated.
  • a targeted anticancer agent has been developed to specifically act on cancer cells, but when administered into the human body, if it can act more selectively on a cancer tissue to be treated, the therapeutic effect can be maximized.
  • extracellular vesicles Cells release various membrane types of ERs to the extracellular environment, and these ERs are commonly referred to as extracellular vesicles (EVs).
  • the extracellular vesicles are also called cell membrane-derived ERs, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, exosomes, and the like, and in some cases, they are used separately from exosomes.
  • Exosomes are endoplasmic reticulum with a size of several tens to hundreds of nanometers having the same double phospholipid membrane as the structure of the cell membrane, and contain proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosome cargo inside.
  • Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, and these signaling factors are known to be cell type-specific and differentially regulated according to the environment of secretory cells.
  • Exosomes are intercellular signaling mediators secreted by cells, and various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells.
  • Exosomes contain specific genetic material and bioactive factors according to the nature and state of the cell from which they are derived. In the case of proliferating stem cell-derived exosomes, it regulates cell behaviors such as cell migration, proliferation and differentiation, and reflects the characteristics of stem cells related to tissue regeneration (Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
  • exosomes called avatars of cells contain bioactive factors such as growth factors similar to cells, and serve as a carrier for transporting bioactive factors between cells, that is, communication between cells.
  • Exosomes are known not only to be released from animal cells such as stem cells, immune cells, fibroblasts and cancer cells, but also from cells of various organisms such as plants, bacteria, fungi, and algae. .
  • an exosome When such an exosome is used as a drug carrier, it is biocompatible and has the advantage of being well absorbed while increasing the stability of the drug in vivo.
  • the method of passively absorbing and loading drug cargo into exosomes naturally generated by using hydrophobic properties, etc. has a limitation in that manufacturing efficiency is low and sufficient drug cargo cannot be loaded in the exosomes.
  • the target protein or peptide is fused to the transmembrane protein of the exosome in the gene construct production step, expressed in the cell, and the exosome secreted or released into the cell culture medium is separated, and the target protein or peptide is loaded with the exosome (Exo).
  • a method for obtaining an exosome in which a target protein or peptide is fused to a transmembrane protein of a small cell has been proposed (see WO 2013/084000 A2; WO 2014/168548 A2).
  • the technical field to which the present invention belongs also requires continuous development of new technologies for effectively loading a target protein or peptide into an exosome and effectively delivering it to a target site to be treated.
  • Another object of the present invention is as a recombinant exosome comprising a fusion polypeptide in which a target protein or peptide is fused to an Fc receptor or a part thereof, and the efficacy of specifically binding to the Fc domain of an antibody and/or of the target protein or peptide
  • a recombinant exosome and its use that exhibit physiological activity for example, anticancer efficacy, immune-related efficacy or antiviral efficacy, etc. together.
  • Another object of the present invention is to provide an application of the recombinant exosomes as described above to the prevention, suppression, alleviation, improvement or treatment of immune-related diseases, cancer, inflammatory diseases, viral diseases, and various other diseases.
  • the present inventors have conducted extensive research, and as a result, the target protein or peptide is fused to an Fc receptor or a part thereof without fusion with a nucleic acid sequence encoding an exogenous transmembrane protein or a transmembrane domain thereof.
  • the exosomes secreted or released into the cell culture medium were separated and analyzed.
  • the present invention was completed by confirming unexpected results that specifically bind to the Fc domain and/or also exhibit the physiological activity of the target protein or peptide.
  • extracellular vesicles generally encompasses membrane vesicles, ectosomes, shedding vesicles, microparticles, or equivalents thereof. used in the sense that Depending on the isolation environment, conditions and methods, etc., the extracellular vesicle may have the same meaning as an exosome, and may have the same or similar size as the exosome, but may also have a meaning including nanovesicles that do not have the composition of the exosome.
  • exosome used in relation to the loading of an Fc receptor or a portion thereof is used to encompass the extracellular vesicles.
  • exosomes refers to endoplasmic reticulum having a size of several tens to hundreds of nanometers (preferably about 30 to 200 nm) having the same double phospholipid membrane as the structure of the cell membrane (provided that the separation target is Particle size of exosomes may vary depending on cell type, separation method and measurement method) (Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI) 10.1007/s00216-015-8535-3). Exosomes contain proteins, nucleic acids (mRNA, miRNA, etc.) called exosome cargo.
  • Exosome cargo includes a wide range of signaling factors, and these signaling factors are known to be cell type-specific and differentially regulated according to the environment of secretory cells.
  • Exosomes are intercellular signaling mediators secreted by cells, and various cellular signals transmitted through them regulate cell behavior, including activation, growth, migration, differentiation, dedifferentiation, apoptosis, and necrosis of target cells. is known
  • exosome is a vesicle having a nano-sized vesicle structure secreted from a cell and released into the extracellular space and having a composition similar to that of an exosome (eg, exosome-like). vesicle) is included.
  • the type of the cell is not limited, but as an example that does not limit the present invention, it may be a HEK293 cell, a HEK293T cell, an Expi293F cell, a CHO cell, an SF9 insect cell, a plant cell, a stem cell, an immune cell, or a cancer cell, etc. , preferably HEK293 cells, HEK293T cells or Expi293F cells.
  • the cells may be stem cells, immune cells, immortalized cells, insect cells, plant cells, or cancer cells.
  • the stem cells may be embryonic stem cells, induced pluripotent stem cells (iPSCs), adult stem cells, embryonic stem cell-derived mesenchymal stem cells, or induced pluripotent stem cell-derived mesenchymal stem cells.
  • the immune cells may be T cells, B cells, NK cells, cytotoxic T cells, dendritic cells or macrophages.
  • the adult stem cells may be one or more adult stem cells selected from the group consisting of mesenchymal stem cells, human tissue-derived mesenchymal stromal cells, human tissue-derived mesenchymal stem cells, and pluripotent stem cells.
  • the mesenchymal stem cells may be mesenchymal stem cells derived from one or more tissues selected from the group consisting of umbilical cord, umbilical cord blood, bone marrow, fat, muscle, nerve, skin, amniotic membrane, Wharton's jelly and placenta.
  • the HEK293T cell used in the examples to be described below should be understood as an example of a cell that can be used in the present invention, and the present invention is not limited thereto.
  • Fc receptor refers to Fc alpha receptor (Fc ⁇ R), Fc gamma receptor (Fc ⁇ R), Fc epsilon receptor (Fc ⁇ R), Fc mu receptor (Fc ⁇ R), Fc alpha/mu receptor (Fc ⁇ / ⁇ R). , a broad concept including FcRn (neonatal Fc receptor).
  • Fc alpha receptors include Fc ⁇ RI (CD89), Fc gamma receptors include Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RIIA (CD32), Fc ⁇ RIIB1 (CD32), Fc ⁇ RIIB2 (CD32), Fc ⁇ RIIIA ( CD16A) and Fc ⁇ RIIIB (CD16B), and Fc epsilon receptors include Fc ⁇ RI and Fc ⁇ RII (CD23).
  • the Fc alpha receptor is a receptor that binds to the Fc domain of IgA, the most abundant immunoglobulin in the human body.
  • CD89 is expressed on cytotoxic immune effector cells including polymorphonuclear leukocytes (PMN), monocytes, macrophages, neutrophils and eosinophils. Ligand binding to CD89 triggers phagocytosis and antibody-mediated cytotoxicity of leukocytes and CD89-bearing cell lines. In addition, CD89 can enhance phagocytosis on target cells by cooperating with receptors for IgG on effector cells.
  • Fc gamma receptors are proteins that bind to an antibody portion called the Fc region or Fc domain of an IgG antibody and stimulate phagocytosis or cytotoxic activity through antibody-mediated phagocytosis or antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity.
  • CD64 is a high affinity Fc gamma receptor, also called Fc gamma receptor I (FcyRI).
  • FcyRI Fc gamma receptor I
  • the extracellular domain (ectodomain) of CD64 contains three immunoglobulin domains responsible for antibody binding.
  • CD64 is expressed in monocytes, macrophages, dendritic cells and neutrophils, etc., and is involved in antibody-mediated phagocytosis and cytotoxic activation.
  • CD16 is a low-affinity Fc gamma receptor, also called Fc gamma receptor III (Fc ⁇ RIII).
  • Fc ⁇ RIII Fc gamma receptor III
  • the extracellular domain (ectodomain) of CD16 contains two immunoglobulin domains responsible for antibody binding.
  • CD16A and CD16B are two types of CD16: CD16A and CD16B.
  • CD16A is expressed in monocytes, macrophages and NK cells, etc., and induces cytotoxic activity of NK cells.
  • CD32 is a low-affinity Fc gamma receptor, also called Fc gamma receptor II (Fc ⁇ RII).
  • CD32 is present in monocytes, phagocytes, granulocytes, B cells, T cells, etc., and binds to complex or aggregated IgG.
  • Fc epsilon receptors are present on the surface of mast cells, basophils, eosinophils, monocytes, macrophages and platelets.
  • Fc ⁇ RI is a high-affinity Fc epsilon receptor
  • Fc ⁇ RII CD23
  • IgE primes an IgE-mediated allergic response by binding to the Fc epsilon receptor present on the surface of mast cells and basophils.
  • the recirculating Fc neonatal receptor (FcRn) binds to antibodies of the IgG isotype and extends the in vivo half-life of IgG antibodies. However, FcRn does not bind IgA and IgM isotype antibodies. FcRn is known to prolong the half-life of IgG by effectively blocking the degradation of IgG in lysosomes.
  • Fc ⁇ receptors Fc ⁇ R
  • Fc ⁇ / ⁇ receptors Fc ⁇ / ⁇ receptors
  • Fc ⁇ / ⁇ R promotes uptake of antibodies and immune complexes bound to foreign substances by B cells and phagocytes.
  • Fc ⁇ R is important for B cell development and is known to affect IgM homeostasis, B cell survival, humoral immune response and autoantibody formation.
  • target protein or peptide refers to a protein, polypeptide, oligopeptide, or fragment thereof to be loaded onto and/or into the exosome.
  • the target protein or peptide may be exogenous not present on the exosome and/or in the exosome, and may be endogenous present on the exosome and/or in the exosome.
  • the target peptide may be a protein, polypeptide, oligopeptide, or fragment thereof having immunomodulatory, anticancer, anti-inflammatory, antiviral, and/or other physiologically useful functions.
  • the target peptide may be an antibody, a variable region fragment of an antibody, an Fc domain of an antibody, an Fc domain binding protein of an antibody, a single chain antibody, a single chain variable region fragment (scFv), a minibody, a diabody (diabody).
  • triabody triabody, peptide aptamer, nanobody, CRISPR-binding protein, apoptosis inducing protein, apoptosis inhibitory protein, enzyme, ligand, ligand receptor, growth factor, growth factor receptor, cytokine (for example, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, etc.), cytokine receptors, growth factor binding receptors, cytokine binding receptors, cytokine inhibitory proteins, toxins It may be a protein, a gene damage inducing protein, a gene damage inhibitory protein, a virus suppressor protein (eg, IFITM1 protein, IFITM2 protein, IFITM3 protein, etc.), a viral spike protein, a viral spike protein antibody, or an antibacterial protein or a fragment thereof. .
  • cytokine for example, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, etc.
  • the term “overexpression” refers to a protein or peptide that is not genetically engineered in wild-type cells and/or exosomes derived therefrom, or is expressed at low or normal levels, is genetically engineered. It means that it is expressed at a high level in cells and/or exosomes derived therefrom.
  • genetically engineered refers to an act of introducing one or more genetic modifications into a cell or a cell made by such an act and/or exosomes derived therefrom .
  • transmembrane protein refers to an extracellular domain existing outside the cell (ectodomain), a transmembrane domain existing in the cell membrane across the cell membrane, and an intracellular domain present inside the cell (endodomain). ) is composed of "Exogenous transmembrane protein or transmembrane domain thereof” means any transmembrane protein or a transmembrane domain thereof except for the transmembrane protein or its transmembrane domain possessed by the Fc receptor to be loaded into the exosome.
  • the genetically engineered or modified cell may be a cell that does not naturally express an Fc receptor or a part thereof, for example, a HEK293 cell, a HEK293T cell, or an Expi293F cell.
  • HEK293 cells, HEK293T cells or Expi293F cells do not express Fc receptors such as CD64, CD32 or CD16, and exosomes derived from HEK293 cells, HEK293T cells or Expi293F cells also do not have Fc receptors such as CD64, CD32 or CD16.
  • the present invention is a technology capable of loading Fc receptors such as CD64, CD32 or CD16 into exosomes derived from HEK293 cells, HEK293T cells or Expi293F cells.
  • Recombinant exosomes of one embodiment of the present invention include an Fc receptor or a portion thereof to which a target protein or peptide can be fused.
  • Recombinant exosomes of one embodiment of the present invention include a fusion polypeptide in which a target protein or peptide is fused to an Fc receptor or a portion thereof.
  • the recombinant exosome may specifically bind to the Fc domain of an antibody.
  • the recombinant exosome may exhibit the physiological activity of the target protein or peptide.
  • the recombinant exosome may specifically bind to the Fc domain of an antibody, and may exhibit the physiological activity of the target protein or peptide.
  • the target protein or peptide may be fused to the N-terminus or C-terminus of the Fc receptor or a portion thereof, preferably, the target protein or peptide is the Fc receptor Or it may be fused to the N-terminus of a part thereof.
  • a signal peptide may be fused to the N-terminus of the target protein or peptide.
  • the signal peptide may be derived from the target protein or peptide, or may be derived from the Fc receptor or a portion thereof.
  • the fusion polypeptide may be located through the membrane of the exosome, and the target protein or peptide may be located on the surface of the exosome.
  • the Fc receptor or a portion thereof may include the polypeptide of SEQ ID NO: 1.
  • the Fc receptor or a portion thereof may have at least one Fc binding domain removed.
  • the Fc receptor or a portion thereof may have two or three Fc binding domains removed.
  • Recombinant exosomes of one embodiment of the present invention may include the transmembrane domain of the Fc receptor or a portion thereof.
  • the transmembrane domain may include the polypeptide of SEQ ID NO: 2.
  • Recombinant exosomes of one embodiment of the present invention can be produced from genetically engineered or modified cells to include the sequence encoding the target protein or peptide.
  • the genetically engineered or modified cell is transfected with a genetic construct encoding the fusion polypeptide without fusion with a nucleic acid sequence encoding an exogenous transmembrane protein or a transmembrane domain thereof. It can be obtained by introducing
  • the genetically engineered or modified cell may be a cell that cannot naturally express the Fc receptor or a part thereof.
  • the Fc receptors are Fc ⁇ RI (CD89), Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RIIA (CD32), Fc ⁇ RIIB1 (CD32), Fc ⁇ RIIB2 (CD32), Fc ⁇ RIIIA (CD16A), Fc ⁇ RIIIB (CD16B), Fc ⁇ RI, Fc ⁇ RII (CD23), Fc ⁇ R, Fc ⁇ / ⁇ R, or FcRn.
  • the genetically engineered or modified cells may be HEK293 cells, HEK293T cells, Expi293F cells, CHO cells, SF9 insect cells or plant cells.
  • the Fc receptor or a portion thereof is located on the surface of the exosome.
  • the Fc receptor or a portion thereof may be presented on the surface of the exosome by a transmembrane protein or a transmembrane domain thereof having the Fc receptor or a portion thereof itself.
  • Recombinant exosomes of one embodiment of the present invention may include an overexpressed Fc receptor or a portion thereof.
  • the target protein or peptide is IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFITM1 protein, IFITM2 protein, IFITM3 protein , ACE2 (angiotensin-converting enzyme 2), sACE2 (soluble angiotensin-converting enzyme 2), virus spike protein, virus spike protein antibody, may be at least one selected from the group consisting of enzymes.
  • the present invention provides a composition comprising the recombinant exosome as an active ingredient.
  • the composition may be a pharmaceutical composition or a cosmetic composition.
  • the pharmaceutical composition may be prepared as an injection.
  • the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention comprises the recombinant exosome and a pharmacologically acceptable carrier.
  • the pharmaceutical composition may be used for enhancing anti-tumor effect, enhancing anti-cancer effect, or anti-viral.
  • the pharmaceutical composition of one embodiment of the present invention may include a cancer cell killing substance or an antiviral substance.
  • the cancer cell killing material or antiviral material may be located on the surface or inside of the recombinant exosome, and may be located fused to the target protein or peptide and/or the Fc receptor or a portion thereof.
  • the cancer cell killing material is IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, such as cytokines, toxin proteins, gene damage inducing proteins, CRISPR-binding proteins,
  • immune checkpoint proteins such as apoptosis inducing protein, granzyme A, granzyme B, perforin, FAS protein, TRAIL (TNF-related apoptosis-inducing ligand) protein, PD-1, PD-L1, CTLA-4
  • Cancer-specific antibodies such as antibody, anti-CD47 antibody, anti-EGFR antibody, T cell receptor, immune cell surface protein such as NKG2D, Stimulator of Interferon Genes (STING), STING agonist ( STING agonist), albumin binding paclitaxel, actinomycin, alitretinoin, azacitidine, azathioprine, bevacizumab, bexatotene, bleomycin, proteomib, carb
  • the antiviral substance is at least one selected from the group consisting of IFITM1 protein, IFITM2 protein, IFITM3 protein, angiotensin-converting enzyme 2 (ACE2), soluble angiotensin-converting enzyme 2 (sACE2), virus spike protein antibody, and the like.
  • IFITM1 protein IFITM1 protein
  • IFITM2 protein IFITM2 protein
  • IFITM3 protein angiotensin-converting enzyme 2
  • ACE2 angiotensin-converting enzyme 2
  • sACE2 soluble angiotensin-converting enzyme 2
  • virus spike protein antibody and the like.
  • the present invention is not limited thereto, and of course, various antiviral substances known in the art may be used.
  • the present invention provides a drug delivery system comprising a pharmaceutical composition as described above.
  • the drug delivery system of one embodiment of the present invention may further include an antibody.
  • the antibody may be administered in combination with the recombinant exosome.
  • the antibody is, for example, 3F8, 8H9, abagobumab, avelumab, abciximab, actozumab, adalimumab, adecatumumab, aducanu Mab, apelimomab, afutuzumab, alacizumab pegol, ALD518, alemtuzumab, alirocumab, altumomab pentetate, amatuximab, anatumomab mafenatox, aniprolumab, anlukinzumab, Apolizumab, arsitumomab, acelizumab, atinumab, atlizumab, atrolimumab, bafinuzumab, basiliximab, babituximab, bectumomab, belimumab, benralizumab
  • the pharmaceutical composition or drug delivery system of one embodiment of the present invention may be in various oral or parenteral dosage forms.
  • the pharmaceutical composition or drug delivery system according to one embodiment of the present invention can be used to prevent, suppress, alleviate, ameliorate or treat immune-related diseases, cancer, inflammatory diseases, viral diseases, and/or various other diseases.
  • the pharmaceutical composition or drug delivery system of one embodiment of the present invention may include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • the carrier, excipient and diluent include lactose, dextrose, trehalose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium carbonate, calcium silicate, cellulose , methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil, but are not limited thereto. .
  • the pharmaceutical composition or drug delivery system of one embodiment of the present invention is a formulation for oral administration such as powders, pills, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, granules, elixirs, aerosols, etc. according to a conventional method; It can be formulated and used in the form of external preparations, suppositories, or sterile injection solutions.
  • Administration of the pharmaceutical composition or drug delivery system of one embodiment of the present invention means introducing a predetermined substance to the patient by any suitable method, and the route of administration of the pharmaceutical composition or drug delivery system allows the drug to reach the target tissue. As long as there is, it can be administered through any general route.
  • the pharmaceutical composition or drug delivery system of one embodiment of the present invention may be administered orally or parenterally, and parenteral administration includes intratumoral administration, intra-articular administration, intra-articular administration, intrasynovial administration, intrasternal administration, intrathecal administration, intralesional and intracranial administration, transdermal administration, intraperitoneal administration, intravenous administration, intraarterial administration, intralymphatic administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, Topical administration, rectal administration, etc. may be mentioned. However, it is not limited thereto and does not exclude various administration methods known in the art.
  • the pharmaceutical composition or drug delivery system of one embodiment of the present invention may be administered by any device capable of transporting an active substance to a target tissue or cell.
  • the therapeutically effective amount of the pharmaceutical composition or drug delivery system of one embodiment of the present invention means an amount required for administration in order to expect a disease therapeutic effect.
  • the pharmaceutical composition or solid preparation for oral administration of the drug delivery system of one embodiment of the present invention may be prepared by mixing at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin, and the like.
  • the solid preparation for oral administration may include a lubricant (glidant) such as silica, stearic acid, magnesium stearate, calcium stearate, talc, and polyethylene glycol in addition to the excipients.
  • a lubricant such as silica, stearic acid, magnesium stearate, calcium stearate, talc, and polyethylene glycol in addition to the excipients.
  • the pharmaceutical composition or liquid formulation for oral administration of the drug delivery system of one embodiment of the present invention may contain various excipients, for example, a wetting agent, a sweetener, a fragrance, a preservative, etc. in addition to the simple diluent water and liquid paraffin.
  • the pharmaceutical composition or formulation for parenteral administration of the drug delivery system of one embodiment of the present invention may be a sterile aqueous solution, a non-aqueous solution, a suspension, an emulsion, a freeze-dried formulation, or a suppository.
  • the pharmaceutical composition or formulation for parenteral administration of the drug delivery system of one embodiment of the present invention may also be prepared as an injection.
  • the injection of one embodiment of the present invention may be an aqueous injection, a non-aqueous injection, an aqueous suspension injection, a non-aqueous suspension injection, or a solid injection used by dissolving or suspending, but is not limited thereto.
  • the injection of one embodiment of the present invention is distilled water for injection, vegetable oil (for example, peanut oil, sesame oil, camellia oil, etc.), monoglyceride, diglyceride, propylene glycol, camphor, benzoate estradiol, bismuth salicylate, depending on the type , Arsenobenzol sodium, or at least one of streptomycin sulfate, and may optionally include a stabilizer or a preservative.
  • the compounding ratio of the pharmaceutical composition or drug delivery system of one embodiment of the present invention can be appropriately selected according to the type, amount, form, etc. of the additional components as described above.
  • the pharmaceutical composition or drug delivery system for drug delivery of the present invention may be included in about 0.1 to 99% by weight, preferably about 10 to 90% by weight.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition or drug delivery system for drug delivery of one embodiment of the present invention is the patient's disease type, disease severity, formulation type, formulation method, patient's age, sex, weight, health condition, diet , excretion rate, administration time and administration method.
  • it may be administered at a dose of 0.001 mg/kg to 100 mg/kg in one to several divided doses per day.
  • composition of one embodiment of the present invention is prepared as a cosmetic composition
  • components commonly used in cosmetic compositions for example, moisturizing agents, antioxidants, oily components, ultraviolet absorbers, Emulsifiers, surfactants, thickeners, alcohols, powder components, color materials, aqueous components, water, various skin nutrients, etc. can be appropriately blended as needed.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention is, for example, a patch, mask pack, mask sheet, cream, tonic, ointment, suspension, emulsion, paste, lotion, gel, oil, pack, spray, aerosol, mist, foundation, It can be applied to various forms such as powder and oil paper.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention may be prepared in any cosmetic formulation conventionally prepared in the art.
  • the cosmetic composition of one embodiment of the present invention includes components commonly used in the cosmetic composition, for example, it may include conventional adjuvants and carriers such as antioxidants, stabilizers, solubilizers, vitamins, pigments and fragrances.
  • other components can be appropriately selected and formulated by those skilled in the art without difficulty depending on the type or purpose of use of the cosmetic composition.
  • the present invention may provide a recombinant exosome comprising a fusion polypeptide in which a target protein or peptide is fused to an Fc receptor or a portion thereof, and the recombinant exosome has the effect of specifically binding to the Fc domain of an antibody.
  • a recombinant exosome comprising a fusion polypeptide in which a target protein or peptide is fused to an Fc receptor or a portion thereof, and the recombinant exosome has the effect of specifically binding to the Fc domain of an antibody.
  • the physiological activity of the target protein or peptide for example, there is an advantage of exhibiting together with anticancer efficacy, immune-related efficacy or antiviral efficacy.
  • pEF6_CD64TM_mGFP a vector map in which the gene construct encoding the fusion polypeptide of SEQ ID NO: 3 is fused to the N-terminus and C-terminus of the CD64 transmembrane domain (SEQ ID NO: 2), respectively, a CD64 signal peptide and mGFP; vector map).
  • Figure 2 is a vector map into which the gene construct encoding the fusion polypeptide of SEQ ID NO: 4 in which single-chain IL-12 and mGFP are fused to the N-terminus and C-terminus of the CD64 transmembrane domain (SEQ ID NO: 2), respectively, is inserted; (pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP vector map) is shown.
  • FIG. 3 shows a gene construct encoding a fusion polypeptide of SEQ ID NO: 5 in which single-chain IL-12 and mGFP are fused to the N-terminus and C-terminus of CD64 (SEQ ID NO: 1) from which the signal peptide has been removed, respectively;
  • a vector map (pEF6_scIL12_fCD64_mGFP vector map) is shown.
  • FIG. 4 is a fluorescence micrograph showing fluorescence observed in HEK293T cells transfected with pEF6_CD64TM_mGFP vector, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP vector, and pEF6_scIL12_fCD64_mGFP vector, respectively.
  • Fig. 5a is a flow cytometry graph showing the CD64TM content in HEK293 cells transfected with the pEF6_CD64TM_mGFP vector
  • Fig. 5b is a flow cytometry graph showing the CD64TM content in HEK293 cells transfected with the pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP vector
  • Fig. 5c is a flow cytometry graph showing the CD64TM content in the pEF6_scIL12_fCD64_mGFP vector.
  • FIG. 6A is a flow cytometry graph showing the content of scIL-12 in HEK293 cells transfected with the pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP vector
  • FIG. 6B is a flow cytometry graph showing the content of scIL-12 in HEK293 cells transfected with the pEF6_scIL12_fCD64_mGFP vector.
  • FIG. 7a is a flow cytometry graph showing the scIL-12 content of the scIL12_CD64TM exosome
  • FIG. 7b is a flow cytometry graph showing the scIL-12 content of the scIL12_fCD64 exosome.
  • FIG. 9 is a graph of interferon-gamma ELISA results showing that interferon-gamma (IFN- ⁇ ) secretion is induced in a concentration-dependent manner in NK-92 cells treated with scIL12_fCD64 exosomes or scIL12_CD64TM exosomes.
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • Figure 10 shows the reaction of APC anti-human Fc fragment antibody with scIL12_fCD64 exosome while fixing the concentration of the APC anti-human Fc fragment antibody and increasing the concentration of scIL12_fCD64 exosome (number of particles/mL). It is a graph showing that the mean fluorescence intensity (MFI) increases accordingly.
  • MFI mean fluorescence intensity
  • FIG. 14 is a graph showing that the interferon-gamma secretion in NK-92 cells was significantly increased in the group treated with scIL-12_fCD64 exosomes and anti-CD16 antibody in combination compared to the group treated with scIL12_fCD64 exosomes alone.
  • FIG. 15 is a Western blot showing the detection of V5 protein in all exosomes isolated from the HEK293T-stabilized cell line culture medium expressing the target fusion polypeptides of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, and SEQ ID NO: 5, respectively.
  • Example 1 Preparation of a vector expressing the target fusion polypeptide
  • DNA was linearized by cutting the KpnI and XbaI portions of the multicloning site of the pEF6/V5-His A vector (#V96120, purchased from Invitrogen, USA) using KpnI and XbaI restriction enzymes, respectively. After amplifying the gene fragment encoding each of the fusion polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3, the fusion polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the fusion polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 through PCR Each of the amplified gene fragments was subcloned into the pEF6/V5-His A vector (see FIGS. 1 to 3 ).
  • a linker (GGGGS) was inserted four times between the CD64 transmembrane domain (SEQ ID NO: 2) of the fusion polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3 and mGFP.
  • a linker (GGGGS) was inserted three times between the single chain IL-12 and the CD64 transmembrane domain (SEQ ID NO: 2) of the fusion polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4, and the CD64 transmembrane domain (SEQ ID NO: 2)
  • a linker (GGGGS) was inserted 4 times repeatedly.
  • a linker (GGGGS) was repeatedly inserted three times between the single chain IL-12 of the fusion polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5 and CD64 (SEQ ID NO: 1) from which the signal peptide was removed, and the signal peptide was removed.
  • a linker (GGGGS) was repeatedly inserted between the CD64 (SEQ ID NO: 1) and mGFP.
  • IL-12B constituting single-chain IL-12 located at the N-terminus of the fusion polypeptide of SEQ ID NO: 4 or SEQ ID NO: 5 and IL-12A from which the signal peptide is removed (SEQ ID NO: 7)
  • a linker (GGGGS) was inserted three times in between.
  • CD64TM fusion polypeptide in which the CD64 signal peptide and mGFP are fused to the N-terminus and the C-terminus of the CD64 transmembrane domain
  • CD64TM fusion polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3
  • pEF6_CD64TM_mGFP A vector into which a gene construct encoding is inserted is shown.
  • FIG. 1 shows a fusion polypeptide in which the CD64 signal peptide and mGFP are fused to the N-terminus and the C-terminus of the CD64 transmembrane domain (hereinafter referred to as "CD64TM”) (fusion polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 3)
  • pEF6_CD64TM_mGFP A vector into which a gene construct encoding is inserted is shown.
  • FIG. 2 shows a fusion polypeptide (a fusion polypeptide having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 4) in which single-chain IL-12 (hereinafter referred to as "scIL12”) and mGFP are fused to the N-terminus and C-terminus of CD64TM, respectively. ) into which the gene construct encoding the gene was inserted (hereinafter referred to as "pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP”) is shown.
  • scIL12 single-chain IL-12
  • pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP single-chain IL-12
  • fusion polypeptide (a fusion having the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5) in which scIL12 and mGFP are fused to the N-terminus and C-terminus of CD64 from which the signal peptide has been removed (hereinafter referred to as "fCD64”), respectively.
  • fCD64 CD64 from which the signal peptide has been removed
  • a vector (hereinafter referred to as “pEF6_scIL12_fCD64_mGFP”) into which a gene construct encoding a polypeptide) is inserted is shown.
  • Example 2 Cell culture and stabilization cell line preparation
  • HEK293T cells purchased from Horizon Discovery
  • FBS fetal bovine serum
  • antibiotics-antimycotics ThermoFisher Scientific as recommended by the supplier. . _
  • each of the pEF6_CD64TM_mGFP vector, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP vector, and pEF6_scIL12_fCD64_mGFP vector constructed in Example 1 was treated with Effectene Transfection Reagent (Qiagen, Germany). purchased) was used to transduce HEK293T cells, and cultured for 72 hours after transduction. 10 ⁇ g/mL Blasticidin (purchased from Invivogen, USA) was added to the DMEM medium as described above and cultured for 3 weeks, and only cells stably expressing each target fusion polypeptide were selected.
  • HEK293T cells transfected with each of the three vectors were treated with "APC mouse IgG1, ⁇ isotype control antibody” or "APC anti-human CD64 Antibody (purchased from BioLegend, USA)” was used and stained at 4° C. for 30 minutes. Thereafter, flow cytometry was performed using a NovoCyte 2000R (Novocyte 2000R) flow cytometer (purchased from Agilent, USA) ( FIGS. 5A to 5C ).
  • FIG. 5a is a flow cytometry graph showing the CD64TM content in HEK293 cells transfected with the pEF6_CD64TM_mGFP vector
  • Fig. 5b is a flow cytometry graph showing the CD64TM content in HEK293 cells transfected with the pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP vector
  • Fig. 5c is a flow cytometry graph showing the CD64TM content in the pEF6_scIL12_fCD64_mGFP vector.
  • HEK293T cells transfected with the pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP vector and the pEF6_scIL12_fCD64_mGFP vector, respectively were "APC mouse IgG1, ⁇ isotype control antibody”. " or "APC anti-human IL-12 antibody (purchased from Abcam, UK)” was used for staining at 4° C. for 30 minutes. Thereafter, flow cytometry was performed using a NovoCyte 2000R (Novocyte 2000R) flow cytometer (purchased from Agilent, USA) ( FIGS.
  • 6A and 6B are flow cytometry graph showing the content of scIL-12 in HEK293 cells transfected with the pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP vector
  • FIG. 6B is a flow cytometry graph showing the content of scIL-12 in HEK293 cells transfected with the pEF6_scIL12_fCD64_mGFP vector.
  • Example 3 Isolation of exosomes expressing the target fusion polypeptide
  • Each of the HEK293T stabilized cell lines expressing the target fusion polypeptides of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5 prepared in Example 2 were each dispensed into a 175T cell culture flask by 8.75 ⁇ 10 6 and 5% CO 2 , 37 o C was cultured under conditions. The next day, 1% exosome-depleted fetal bovine serum (exosome-depleted FBS; purchased from System Biosciences, USA), 1% antibiotic-antifungal, and 10 ⁇ g/mL Blasticidin (purchased from Invivogen, USA) were administered. The culture medium was replaced with the contained Opti-MEM (purchased from ThermoFisher Scientific, USA) and incubated at 5% CO 2 , 37 ° C for 48 hours.
  • Opti-MEM purchased from ThermoFisher Scientific, USA
  • Example 4 Check whether the target fusion polypeptide is loaded in the exosome
  • the loading of IL-12 was confirmed in the exosomes isolated from the stabilized cell line culture medium expressing the pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP vector (hereinafter referred to as “scIL12_CD64TM_mGFP exosomes” or “scIL12_CD64TM exosomes”) ( FIG. 7a ), and the pEF6_scIL12_fCD64_mGFP vector
  • the loading of IL-12 was confirmed in the exosomes isolated from the expressing stabilized cell line culture medium (hereinafter, referred to as “scIL12_fCD64_mGFP exosomes” or “scIL12_fCD64 exosomes”) ( FIG. 7b ).
  • each exosome pellet was dissolved using 1X RIPA buffer (purchased from Cell Signaling, USA) to confirm that the target fusion polypeptide was loaded into each of the scIL12_CD64TM exosome and scIL12_fCD64 exosome, and then SDS using the isolated protein. -PAGE was performed. After the SDS-PAGE was performed, the results were transferred to a PVDF membrane (purchased from Merck, Germany) and then either an anti-IL12 p40 antibody (1:1000, purchased from Abcam, UK) or an anti-V5 antibody (1:1,000, purchased from Abcam, UK).
  • exosomes isolated from the HEK293T stabilized cell line culture medium expressing the target fusion polypeptide of SEQ ID NO: 4 (represented as “pEF6_scIL12_CD64tm_mG” in FIG. 8) and the HEK293T stabilized cell line culture medium expressing the target fusion polypeptide of SEQ ID NO: 5 IL-12 protein was detected in both exosomes isolated from (indicated as "pEF6_scIL12_fCD64_mG” in FIG. 8) (FIG. 8).
  • V5 protein was detected in all exosomes isolated from the HEK293T-stabilized cell line culture medium expressing the target fusion polypeptides of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4 and SEQ ID NO: 5, respectively (FIG. 15). From this, it was confirmed that the target fusion polypeptide was normally loaded into each exosome.
  • Interleukin 12 is secreted from antigen presenting cells such as macrophages and dendritic cells to activate natural killer cells (NK cells) and cytotoxic T lymphocytes (CTL). It is a cytokine Immune cells activated by IL-12 stimulation not only increase their own cell killing ability, but also secrete interferon-gamma (IFN- ⁇ ) to promote the differentiation of type 1 helper T cells (Th1) around the immune cells, resulting in the anticancer effect of immune cells. promote Although the development of therapeutic agents using IL-12, which exhibits such a strong anticancer effect, is being actively developed, the IL-12 recombinant protein has a short half-life in the body and has limitations in causing systemic toxicity. Exosomes are recently in the spotlight as a next-generation drug delivery system because they can increase the half-life of the target protein by loading the target protein on the surface and can be efficiently delivered to the tumor microenvironment.
  • IFN- ⁇ interferon-gamma
  • Example 4 the loading of IL-12 was confirmed in both the scIL12_CD64TM exosome and the scIL12_fCD64 exosome. This example was performed to determine whether IL-12 loaded in these exosomes can induce interferon-gamma secretion by stimulating NK cells.
  • NK-92 cells in culture were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells/250 ⁇ L into each well of a 48-well plate.
  • NK-92 cells were treated with 250 ⁇ L of cell culture medium as a negative control (NC), and 20 ng of recombinant IL-12 as a positive control (indicated as “rIL-12” in FIG. 9) (R&D Systems, USA) was diluted in 250 ⁇ L of cell culture solution and treated with NK-92 cells.
  • the protein content of scIL12_fCD64 exosome (indicated as “scIL12_fCD64 exo” in FIG.
  • scIL12_CD64TM exosome (indicated as “scIL12_CD64tm exo” in FIG. 9) was measured, and the protein content of each exosome was 5 ⁇ g and 10 ⁇ g. And after adjusting to be 20 ⁇ g, each concentration of exosomes were diluted in 250 ⁇ L of cell culture solution and treated with NK-92 cells. After treatment, NK-92 cells were cultured for 48 hours at 5% CO 2 , 37 o C conditions.
  • CD64 which is expressed on the surface of immune cells such as macrophages and dendritic cells, binds to the Fc domain consisting of an antibody constant region. This allows immune cells to recognize the antigen-bound antibody and trigger an antigen-specific immune response.
  • Example 5 the IFN- ⁇ secretion-inducing efficacy of IL-12 loaded in the scIL12_fCD64 exosome was confirmed.
  • CD64 loaded onto the scIL12_fCD64 exosome having the effect of inducing IFN- ⁇ secretion has an antibody-binding function.
  • the antibody binds to the surface of the scIL12_fCD64 exosome.
  • scIL12_fCD64 exosome in order for the scIL12_fCD64 exosome to be targeted to cancer cells and/or immune cells, it should be able to bind various antibodies specific to cancer cells and/or immune cells. Therefore, it was confirmed whether scIL12_fCD64 exosomes could bind other antibodies in addition to the APC anti-human FC fragment antibody.
  • the concentration of scIL12_fCD64 exosomes captured with Dynabead was fixed at 1 ⁇ 10 9 particle count/mL (final concentration), and scIL12_fCD64 exosomes were treated with APC anti-human FC fragment antibody, APC anti-human EGFR antibody (R&D bioscience, USA). (purchased from ) or APC anti-human CD16 antibody (purchased from Abcam, UK) for 1 hour at room temperature for staining. Thereafter, flow cytometry was performed using a NovoCyte 2000R (Novocyte 2000R) flow cytometer (purchased from Agilent, USA), and it was confirmed whether the MFI (mean fluorescence intensity) increased in a concentration-dependent manner of the antibody.
  • APC anti-human FC fragment antibody APC anti-human EGFR antibody
  • APC anti-human CD16 antibody purchased from Abcam, UK
  • the mean fluorescence intensity (MFI) from APC increased with increasing concentrations of APC anti-human FC fragment antibody, APC anti-human EGFR antibody, and APC anti-human CD16 antibody ( FIGS. 11 to FIG. 11 ). 13).
  • the above results mean that CD64 present on the surface of scIL12_fCD64 exosome normally binds to Fc domains of various antibodies, and since CD64 is present at a high density on the surface of scIL12_fCD64 exosome, the binding ability of an antibody having an Fc domain is concentration-dependent. means to increase to Thus, the CD64-loaded scIL12_fCD64 exosome can bind to the Fc domain of a cancer cell and/or immune cell-specific antibody to be targeted towards cancer cells and/or immune cells.
  • Example 7 Confirmation of increase in immune cell activation due to binding of scIL12_fCD64 exosome and immune cell-specific antibody
  • Targeted anticancer agents using antibodies bind to antigens specific to cancer cells and exhibit anticancer effects.
  • An exosome comprising a fusion polypeptide in which a target protein or peptide (eg, IL-12, IL-7, etc.) is fused to an Fc receptor (eg, CD64, CD32 or CD16) or a portion thereof of the present invention
  • a target protein or peptide eg, IL-12, IL-7, etc.
  • an Fc receptor eg, CD64, CD32 or CD16
  • An Fc receptor eg, CD64, CD32, or CD16
  • a target protein or peptide such as IL-12 or IL-7 are present on the surface thereof.
  • an exosome comprising a fusion polypeptide on the surface of an Fc receptor (eg, CD64, CD32 or CD16) or a part thereof, a target protein or peptide such as IL-12 or IL-7 is fused,
  • An Fc receptor eg, CD64, CD32 or CD16
  • a portion thereof specifically binds to the Fc domain of an antibody, and IL-12, IL-7, etc. may exhibit anticancer efficacy.
  • an exosome containing both an Fc receptor (eg, CD64, CD32 or CD16) or a part thereof and a target protein or peptide such as IL-12, IL-7 is administered together with an antibody anticancer agent to a cancer patient, the Fc domain It is possible to increase the anticancer effect by enabling an additional and target-specific attack on cancer cells on which the antibody anticancer agent acts.
  • an Fc receptor eg, CD64, CD32 or CD16
  • a target protein or peptide such as IL-12
  • NK cells strongly express CD16 on their surface. If the anti-CD16 antibody and scIL12_fCD64 exosome co-administration showed better interferon-gamma inducing ability than scIL12_fCD64 exosome single administration, it means that scIL-12_fCD64 exosome was efficiently targeted towards NK cells.
  • CD64 of scIL-12_fCD64 exosome binds to the Fc domain of anti-CD16 antibody to form a complex of scIL-12_fCD64 exosome and anti-CD16 antibody, and the anti-CD16 antibody of the complex binds to NK cells.
  • IL-12 of scIL-12_fCD64 exosomes which are efficiently targeted towards, enhance interferon-gamma induction in NK cells.
  • scIL-12_fCD64 exosome-anti-CD16 After mixing 10 ⁇ g of anti-CD16 antibody with scIL-12_fCD64 exosomes (final concentration: 1 ⁇ 10 9 particles/mL), using a hulamixer sample mixer (purchased from Thermofisher, USA) at 4°C The reaction was carried out for 1 hour. Thereafter, the non-specific binding antibody was removed using ultracentrifugation, and the scIL-12_fCD64 exosome to which the anti-CD16 antibody was bound (hereinafter referred to as "scIL-12_fCD64 exosome-anti-CD16") was filtered with a 0.1 ⁇ m syringe. (Product name: SLVVR33RS; purchased from Merck, Germany) was used by mixing with DPBS buffer filtered through.
  • NK-92 cells in culture were seeded at 1 ⁇ 10 5 cells/250 ⁇ L into each well of a 48-well plate.
  • NK-92 cells were treated with 250 ⁇ L of cell culture medium as a negative control (NC), and 20 ng of recombinant IL-12 as a positive control (indicated as “rIL-12” in FIG. 14) (R&D Systems, USA) was diluted in 250 ⁇ L of cell culture solution and treated with NK-92 cells.
  • NC negative control
  • rIL-12 recombinant IL-12
  • scIL12_fCD64 exosome (final concentration: 1 ⁇ 10 9 particles/mL) was diluted in 250 ⁇ L of cell culture solution and treated with NK-92 cells, and scIL-12_fCD64 exosome-anti-CD16 prepared as described above was NK-92 cells were treated by dilution in 250 ⁇ L of cell culture medium. After treatment, NK-92 cells were cultured at 5% CO 2 , 37° C. for 48 hours.
  • scIL-12_fCD64 exosomes were efficiently targeted towards NK cells by the complex anti-CD16 antibody.
  • IL-12 in scIL-12_fCD64 exosomes which are efficiently targeted towards NK-92 cells by the complex anti-CD16 antibody, activates NK cells more efficiently as a result of targeting, resulting in interferon- in NK-92 cells. It is possible to enhance the gamma-inducing effect.

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Abstract

본 발명은 Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀을 제공할 수 있고, 이러한 엑소좀은 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하는 효능 및/또는 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성, 예를 들어 항암 효능, 면역 관련 효능 또는 항바이러스 효능 등을 함께 나타내는 장점이 있다.

Description

목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는 재조합 엑소좀 및 이의 용도
본 발명은 목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는 재조합 엑소좀 및 이의 용도에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 엑소좀으로서, 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하는 효능 및/또는 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성, 예를 들어 항암 효능, 면역 관련 효능 또는 항바이러스 효능 등을 함께 나타내는 재조합 엑소좀 및 이의 용도에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 전술한 바와 같은 재조합 엑소좀을 면역 관련 질환, 암, 염증 질환, 바이러스 질환, 기타 다양한 질환의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 응용하는 것에 관한 것이다.
인체에 투여되는 치료제가 효과적으로 작용하게 하고 부작용을 줄이기 위해 약물 전달 시스템(Drug Delivery System; DDS)이 사용된다.
예를 들어, 항체, 나노바디, 단백질, 또는 폴리펩타이드는 생체 내 환경에 노출되었을 때 그 효능이 저하되거나 치료 대상이 되는 표적 부위로 전달되지 못할 수 있다. 예를 들어, 표적 항암제는 암세포에 특이적으로 작용하도록 개발되었지만, 인체 내에 투여 시 치료 대상이 되는 암조직에 대해 보다 선택적으로 작용할 수 있다면 치료 효과를 극대화할 수 있다.
현재까지 약물 전달 시스템으로 개발된 리포좀 또는 마이셀 등은 생체 내에서 약물의 유지시간을 증가시키고 약물동력학 관점에서 개선이 있었으나, 특정 세포, 예를 들어, 면역 세포나 암세포에 대한 선택적 타겟팅 능력은 결여되어 있다. 뿐만 아니라 합성물질을 사용한 리포좀은 생체 적합성 문제가 발생할 수 있다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외 소포체(extracellular vesicle)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막을 갖는 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다.
이와 같은 엑소좀을 약물 전달체로 사용할 경우 생체적합적이고 생체 내에서 약물의 안정성을 높여주면서도 잘 흡수된다는 장점이 있다. 그러나 자연적으로 생성되는 엑소좀에 약물 카고를 소수성 특성 등을 이용하여 수동적으로 흡수시켜 로딩하는 방식은 제조 효율이 떨어지고 엑소좀에 충분한 약물 카고가 로딩되지 못하는 한계가 있다.
최근에는 유전자 구조체 제작 단계에서 엑소좀의 막관통 단백질에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 후 세포 내에서 발현시키고 세포 배양액에 분비 내지는 방출된 엑소좀을 분리하여 목적 단백질 또는 펩타이드가 로딩된 엑소좀(엑소좀의 막관통 단백질에 목적 단백질 또는 펩타이드가 융합된 엑소좀)을 수득하는 방법이 제안되고 있다(WO 2013/084000 A2; WO 2014/168548 A2 참조).
그러나 다른 기술 분야와 마찬가지로 본 발명이 속하는 기술분야 역시 목적 단백질 또는 펩타이드를 엑소좀에 효과적으로 로딩하고 치료 대상이 되는 표적 부위에 효과적으로 전달하기 위한 새로운 기술에 대한 끊임없는 개발을 요구하고 있다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
본 발명의 목적은 목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는 재조합 엑소좀 및 이의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 엑소좀으로서, 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하는 효능 및/또는 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성, 예를 들어 항암 효능, 면역 관련 효능 또는 항바이러스 효능 등을 함께 나타내는 재조합 엑소좀 및 이의 용도를 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 재조합 엑소좀을 면역 관련 질환, 암, 염증 질환, 바이러스 질환, 기타 다양한 질환의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 응용하는 것을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자는 예의연구를 거듭한 결과, 외인성 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인을 코딩하는 핵산 서열과의 융합없이 Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물을 세포에 형질도입하고 상기 유전자 작제물을 상기 세포 내에서 발현시킨 후 세포 배양액에 분비 내지는 방출된 엑소좀을 분리하여 분석한 결과, 분리된 엑소좀이 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하거나/하고 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성도 함께 나타내는 예상 밖의 결과를 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)"는 통상 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다. 분리 환경, 조건 및 방법 등에 따라 세포외 소포체는 엑소좀과 동일한 의미를 가질 수도 있고 엑소좀과 크기는 동일 내지는 유사하지만 엑소좀의 조성을 갖지 않는 나노베지클까지 포함하는 의미를 가질 수도 있다. 한편, 본 명세서에서 Fc 수용체 또는 이의 일부의 로딩과 관련하여 사용되는 엑소좀이라는 용어는 상기 세포외 소포체를 포괄하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막을 갖는 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, HEK293 세포, HEK293T 세포, Expi293F 세포, CHO 세포, SF9 곤충세포, 식물세포, 줄기세포, 면역세포, 또는 암세포 등일 수 있고, 바람직하게는 HEK293 세포, HEK293T 세포 또는 Expi293F 세포일 수 있다.
또한, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 상기 세포는 줄기세포, 면역세포, 불멸화된 세포, 곤충세포, 식물세포 또는 암세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 성체줄기세포, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 면역세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 수지상 세포 또는 대식 세포일 수 있다. 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 와튼젤리 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다.
그러나 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 세포를 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들에서 사용된 HEK293T 세포는 본 발명에서 사용될 수 있는 세포의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 사용된 용어, "Fc 수용체"는 Fc 알파 수용체(FcαR), Fc 감마 수용체(FcγR), Fc 엡실론 수용체(FcεR), Fc 뮤 수용체(FcμR), Fc 알파/뮤 수용체(Fcα/μR), FcRn(neonatal Fc receptor) 등을 포함하는 광의의 개념이다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, Fc 알파 수용체로는 FcαRI(CD89)을 들 수 있고, Fc 감마 수용체로는 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB1(CD32), FcγRIIB2(CD32), FcγRIIIA(CD16A) 및 FcγRIIIB(CD16B)를 들 수 있으며, Fc 엡실론 수용체로는 FcεRI 및 FcεRII(CD23)를 들 수 있다.
Fc 알파 수용체는 인체 중 가장 풍부한 이뮤노글로불린인 IgA의 Fc 도메인과 결합하는 수용체이다. CD89는 다형핵 백혈구(PMN), 단핵구, 대식세포, 호중구 및 호산구를 비롯한 세포독성 면역 이펙터 세포 상에서 발현된다. 리간드가 CD89에 결합하면 백혈구 및 CD89-보유 세포주의 식세포작용과 항체-매개성 세포독성이 촉발된다. 또한, CD89는 이펙터 세포 상의 IgG에 대한 수용체와 협력하여 표적 세포에 대한 식세포작용을 강화시킬 수 있다.
Fc 감마 수용체는 IgG 항체의 Fc 영역 또는 Fc 도메인이라고 불리는 항체 부분에 결합하여 항체-매개 식세포작용 또는 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 통해 식세포작용 또는 세포독성 활성을 자극하는 단백질이다. 예를 들어, CD64는 고친화성 Fc 감마 수용체이고, Fc 감마 수용체 I(FcγRI)이라고도 불린다. CD64의 세포외 도메인(ectodomain)은 항체 결합을 담당하는 3개의 면역글로불린 도메인을 포함한다. CD64는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 및 호중구 등에서 발현되고, 항체-매개 식세포 작용 및 세포독성 활성화에 관여한다. CD16은 저친화도 Fc 감마 수용체이고, Fc 감마 수용체 III(FcγRIII)라고도 불린다. CD16의 세포외 도메인(ectodomain)은 항체 결합을 담당하는 2개의 면역글로불린 도메인을 포함한다. CD16은 CD16A와 CD16B의 2가지 형태가 있다. CD16A는 단핵구, 대식세포 및 NK 세포 등에서 발현되고, NK 세포의 세포독성 활성을 유발한다. CD32는 저친화도 Fc 감마 수용체이고, Fc 감마 수용체 II(FcγRII)라고도 불린다. CD32는 단핵구, 식세포(phagocyte), 과립구, B 세포, T 세포 등에 존재하며, 복합 또는 응집 IgG와 결합한다.
Fc 엡실론 수용체는 비만세포, 호염기구, 호산구, 단핵세포, 대식세포 및 혈소판의 표면 상에 존재한다. FcεRI은 고친화도 Fc 엡실론 수용체이고, FcεRII(CD23)는 저친화도 Fc 엡실론 수용체이다. IgE는 비만세포 및 호염기구의 표면상에 존재하는 Fc 엡실론 수용체에 결합함으로써 IgE-매개된 알러지성 반응을 프라이밍하게 된다.
재순환하는 Fc 신생아 수용체(Fc neonatal 수용체; FcRn)는 IgG 아이소타입의 항체에 결합하여 IgG 항체의 생체 내 반감기를 연장한다. 그러나 FcRn는 IgA 및 IgM 아이소타입 항체와는 결합하지 않는다. FcRn은 리소좀에서 IgG의 분해를 효과적으로 차단하여 IgG의 반감기를 연장하는 것으로 알려져 있다.
Fc μ 수용체(FcμR) 및 Fc α/μ 수용체(Fcα/μR)는 IgM 아이소타입의 항체에 결합한다. Fcα/μR은 외부 물질에 결합한 항체 및 면역 복합체를 B 세포 및 식세포(phagocyte)가 업테이크하는 것을 촉진한다. 또한, FcμR은 B 세포 발달에 중요하며, IgM 항상성(homeostasis), B 세포 생존, 체액 면역 반응(humoral immune response) 및 자가항체(autoantibody) 형성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "목적 단백질 또는 펩타이드"는 엑소좀 상 및/또는 엑소좀 내에 로딩하고자 하는 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 또는 이들의 단편을 의미한다. 목적 단백질 또는 펩타이드는 엑소좀 상 및/또는 엑소좀 내에 존재하지 않는 외인성(exogenous)일 수 있고, 엑소좀 상 및/또는 엑소좀 내에 존재하는 내인성(endogenous)일 수 있다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 목적 펩타이드는 면역 조절, 항암 작용, 항염 작용, 항바이러스 작용, 및/또는 기타 생리적으로 유용한 기능을 갖는 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 또는 이들의 단편일 수 있다.
예를 들어, 목적 펩타이드는 항체, 항체의 가변영역 단편, 항체의 Fc 도메인, 항체의 Fc 도메인 결합 단백질, 단일 체인 항체, 단일 체인 가변영역 단편(scFv), 미니바디(minibody), 다이아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 펩타이드 앱타머, 나노바디(nanobody), CRISPR-결합 단백질, 세포사멸 유도 단백질, 세포사멸 억제 단백질, 효소, 리간드, 리간드 수용체, 성장인자, 성장인자 수용체, 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 등), 사이토카인 수용체, 성장인자 결합 수용체, 사이토카인 결합 수용체, 사이토카인 저해 단백질, 독소 단백질, 유전자 손상 유도 단백질, 유전자 손상 저해 단백질, 바이러스 억제 단백질(예를 들어, IFITM1 단백질, IFITM2 단백질, IFITM3 단백질 등), 바이러스 스파이크 단백질, 바이러스 스파이크 단백질 항체, 또는 항균 단백질이거나 이들의 단편일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "과발현"은 유전적으로 조작되지 않은 야생형 세포 및/또는 이로부터 유래된 엑소좀이 갖지 않거나 낮은 수준 또는 정상 수준으로 발현하는 단백질 또는 펩타이드가 유전적으로 조작된(genetic engineered) 세포 및/또는 이로부터 유래된 엑소좀에서 높은 수준으로 발현되는 것을 의미한다. 또한, "유전적으로 조작된(genetically engineered)"이란 용어는 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 행위 또는 이러한 행위에 의해 만들어진 세포 및/또는 이로부터 유래한 엑소좀을 의미한다.
본 명세서에서 사용된 용어, "막관통 단백질"은 세포 외에 존재하는 세포외 도메인(ectodomain), 세포막을 가로질러 세포막에 존재하는 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 세포 안쪽에 존재하는 세포내 도메인(endodomain)으로 구성된다. "외인성 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인"은 엑소좀으로의 로딩 대상이 되는 Fc 수용체가 자체적으로 갖는 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인을 제외한 모든 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인을 의미한다.
본 발명에서 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 Fc 수용체 또는 이의 일부를 자연적으로 발현하지 못하는 세포일 수 있고, 예를 들어, HEK293 세포, HEK293T 세포 또는 Expi293F 세포일 수 있다. HEK293 세포, HEK293T 세포 또는 Expi293F 세포는 CD64, CD32 또는 CD16과 같은 Fc 수용체를 발현하지 않고, HEK293 세포, HEK293T 세포 또는 Expi293F 세포로부터 유래된 엑소좀 역시 CD64, CD32 또는 CD16과 같은 Fc 수용체를 갖지 않는다. 본 발명은 HEK293 세포, HEK293T 세포 또는 Expi293F 세포로부터 유래된 엑소좀에 CD64, CD32 또는 CD16과 같은 Fc 수용체를 로딩할 수 있는 기술이다.
본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀은, 목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀은, Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 재조합 엑소좀은 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 상기 재조합 엑소좀은 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성을 나타낼 수 있다. 추가로, 상기 재조합 엑소좀은 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있으며, 바람직하게는 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부의 N-말단에 융합될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 신호 펩타이드가 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에 융합될 수 있다. 상기 신호 펩타이드는 상기 목적 단백질 또는 펩타이드로부터 유래된 것일 수 있거나 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부로부터 유래된 것일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 상기 엑소좀의 막을 통과하여 위치할 수 있고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 엑소좀의 표면 상에 위치할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 서열번호 1의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 적어도 하나의 Fc 결합 도메인이 제거될 수 있다. 바람직하게는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 2개 또는 3개의 Fc 결합 도메인이 제거될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀은, 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부의 막관통 도메인을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 막관통 도메인은 서열번호 2의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀은, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하도록 유전적으로 조작 또는 변형된 세포로부터 생산될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀에 있어서, 상기 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 외인성 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인을 코딩하는 핵산 서열과의 융합없이 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물을 형질도입하여 수득될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀에 있어서, 상기 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부를 자연적으로 발현하지 못하는 세포일 수 있다.
본 발명을 제한하지 않는 예시로서, 상기 Fc 수용체는 FcαRI(CD89), FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB1(CD32), FcγRIIB2(CD32), FcγRIIIA(CD16A), FcγRIIIB(CD16B), FcεRI, FcεRII(CD23), FcμR, Fcα/μR, 또는 FcRn일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 HEK293 세포, HEK293T 세포, Expi293F 세포, CHO 세포, SF9 곤충세포 또는 식물세포일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀에 있어서, 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 엑소좀의 표면 상에 위치한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀에 있어서, 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부가 자체적으로 갖는 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인에 의해 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부가 엑소좀 표면 상에 제시될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀은, 과발현된 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFITM1 단백질, IFITM2 단백질, IFITM3 단백질, ACE2(angiotensin-converting enzyme 2), sACE2(soluble angiotensin-converting enzyme 2), 바이러스 스파이크 단백질, 바이러스 스파이크 단백질 항체, 효소 등으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.
또한, 본 발명은 상기 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학 조성물 또는 화장료 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 주사제로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 상기 재조합 엑소좀과, 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 항종양 효과 증진용, 항암효과 증진용 또는 항바이러스용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 암세포 사멸물질 또는 항바이러스 물질을 포함할 수 있다. 상기 암세포 사멸물질 또는 항바이러스 물질은 상기 재조합 엑소좀 표면 또는 내부에 위치할 수 있고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드 및/또는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부에 융합되어 위치할 수도 있다.
예를 들어, 상기 암세포 사멸물질은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 등의 사이토카인, 독소 단백질, 유전자 손상 유도 단백질, CRISPR-결합 단백질, 세포사멸 유도 단백질, 그랜자임 A, 그랜자임 B, 퍼포린, FAS 단백질, TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand) 단백질, PD-1, PD-L1, CTLA-4 등의 면역 체크포인트 단백질에 대한 항체, 항-CD47 항체, 항-EGFR 항체 등 암 특이적 항체들, T 세포 수용체(T Cell Receptor), NKG2D 등 면역세포 표면 단백질, 인터페론 유전자 자극인자(Stimulator of Interferon Genes; STING), STING 작용제(STING agonist), 알부민 결합 파클리탁셀, 악티노마이신, 알리트레티노인, 아자시티딘, 아자티오프린, 베바시주맙, 벡사토텐, 블레오마이신, 보테조밉, 카보플라틴, 카페시타빈, 세툭시맙, 시스플라틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에를로티닙, 에토포시드, 플루오로우라실, 게피티닙, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이마티닙, 이필리무맙, 이리노테칸, 라파티닙, 메클로레타민, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파니투무맙, 페메트렉세드, 리툭시맙, 타후르포시드, 테니포사이드, 티오구아닌, 토포테칸, 트레티노인, 발루비신, 베무라페닙, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 보리노스타트, 로미뎁신, 5-플루오로우라실(5-FU), 6-메르캅토퓨린(6-MP), 클라드리빈, 클로파라빈, 플록스유리딘, 플루다라빈, 펜토스타틴, 미토마이신, 익사베필론, 에스트라무스틴 등으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다. 그러나 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 항종양 또는 항암 물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
예를 들어, 상기 항바이러스 물질은 IFITM1 단백질, IFITM2 단백질, IFITM3 단백질, ACE2(angiotensin-converting enzyme 2), sACE2(soluble angiotensin-converting enzyme 2), 바이러스 스파이크 단백질 항체 등으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다. 그러나 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 항바이러스 물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
추가로, 본 발명은 전술한 바와 같은 약학 조성물을 포함하는 약물 전달 시스템을 제공한다.
본 발명의 일 구체예의 약물 전달 시스템은 항체를 더 포함할 수 있다. 상기 항체는 상기 재조합 엑소좀과 함께 병용 투여될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템에 있어서, 상기 항체는, 예를 들어, 3F8, 8H9, 아바고보맙, 아벨루맙, 압식시맙, 악토주맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 아두카누맙, 아펠리모맙, 아푸투주맙, 알라시주맙 페골, ALD518, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 알투모맙 펜테테이트, 아마툭시맙, 아나투모맙 마페나톡스, 아니프롤루맙, 안루킨주맙, 아폴리주맙, 아르시투모맙, 아셀리주맙, 아티누맙, 아틀리주맙, 아토롤리무맙, 바피뉴주맙, 바실릭시맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 비시로맙, 비마그루맙, 비바투주맙 메르탄신, 블리나투모맙, 블로소주맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브리아키누맙, 브로달루맙, 카나키누맙, 칸투주맙 메르탄신, 칸투주맙 라브탄신, 카플라시주맙, 카프로맙 펜데티드, 카를루맙, 카투막소맙, CC49, cBR96-독소루비신 면역 복합체, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, Ch.14.18, 시타투주맙 보가톡스, 식수투무맙, 클라자키주맙, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙 테트락세탄, 코나투무맙, 콘시주맙, 크레네주맙, CR6261, 다세투주맙, 다클리주맙, 달로투주맙, 다라투무맙, 뎀시주맙, 데노수맙, 데투모맙, 도를리모맙 아리톡스, 드로지투맙, 둘리고투맙, 듀필루맙, 듀시기투맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙, 에도바코맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에펀구맙, 엘델루맙, 엘로투주맙, 엘실리모맙, 에나바투주맙, 엔리모맙 페골, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙 시툭세탄, 에프라투주맙, 에를리주맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 에트롤리주맙, 에볼로쿠맙, 엑스비비루맙, 파놀레소맙, 파랄리모맙, 파를레투주맙, 파시누맙, FBTA05, 펠비주맙, 페자키누맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 플란보투맙, 폰톨리주맙, 포랄루맙, 포라비루맙, 프레소리무맙, 풀라누맙, 푸툭시맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 간테네루맙, 간비리모맙, 겜투주맙 오조가마이신, 게보키주맙, 기렌툭시맙, 그렘바투무맙 베도틴, 골리무맙, 고밀릭시맙, 구셀쿠맙, 이발리주맙, 이브리투모맙 튜세탄, 이크루쿠맙, 이고보맙, 이필리무맙, IMAB362, 임시로맙, 임가투주맙, 인클라쿠맙, 인다툭시맙 라브탄신, 인플릭시맙, 인테투무맙, 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가마이신, 이필리무맙, 이라투무맙, 이톨리주맙, 이제키주맙, 켈릭시맙, 라베투주맙, 람브롤리주맙, 람팔리주맙, 레브리키주맙, 레말레소맙, 레르델리무맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리겔리주맙, 린투주맙, 리릴루맙, 로델시주맙, 로르보투주맙 메르탄신, 루카투무맙, 루밀릭시맙, 마파투무맙, 마르게툭시맙, 마슬리모맙, 마브릴리무맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미투모맙, 모가물리주맙, 모롤리무맙, 모타비주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 무로모납-CD3, 나콜로맙 타페나톡스, 나밀루맙, 나프투모맙 에스타페나톡스, 나르나투맙, 나탈리주맙, 네바쿠맙, 네시투무맙, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 니모투주맙, 니볼루맙, 노페투모맙 메르펜탄, 오카라투주맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 올로키주맙, 오말리주맙, 오나르투주맙, 온툭시주맙, 오포르투주맙 모나톡스, 오레고보맙, 오르티쿠맙, 오텔릭시주맙, 오틀레르투주맙, 옥셀루맙, 오자네주맙, 오조랄리주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 판코맙, 파노바쿠맙, 파르사투주맙, 파스콜리주맙, 파테클리주맙, 파트리투맙, 펨투모맙, 페라키주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, 피딜리주맙, 피나투주맙 베도틴, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 폴라투주맙 베도틴, 포네주맙, 프릴릭시맙, 프리톡삭시맙, 프리투무맙, PRO 140, 퀼리주맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라피비루맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레가비루맙, 레슬리주맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 로레두맙, 로모소주맙, 론탈리주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사말리주맙, 사릴루맙, 사투모맙 펜데티드, 세쿠키누맙, 세리반투맙, 세톡삭시맙, 사비루맙, 시브로투주맙, SGN-CD19A, SGN-CD33A, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙, 시루쿠맙, 솔라네주맙, 솔리토맙, 소넵시주맙, 손투주맙, 스타물루맙, 술레소맙, 수비주맙, 타발루맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 타네주맙, 타플리투모맙 파프톡스, 테피바주맙, 텔리모맙 아리톡스, 테나투모맙, 테넬릭시맙, 테플리주맙, 테프로투무맙, TGN1412, 티실리무맙, 틸드라키주맙, 티가투주맙, TNX-650, 토실리주맙, 토랄리주맙, 토시투모맙, 벡사, 토베투맙, 트랄로키누맙, 트라스투주맙, TRBS07, 트레갈리주맙, 트레멜리무맙, 투코투주맙 셀모류킨, 투비루맙, 유블리툭시맙, 유레루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙, 반티크투맙, 바팔릭시맙, 바텔리주맙, 베돌리주맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙, 볼로식시맙, 보르세투주맙 마포도틴, 보투무맙, 잘루투무맙, 자놀리무맙, 자툭시맙, 지랄리무맙 및 졸리모맙 아리톡스로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다. 그러나 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 항체가 사용될 수 있음은 물론이다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 면역 관련 질환, 암, 염증 질환, 바이러스 질환, 및/또는 기타 다양한 질환의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 과립제, 엘릭시르제(elixirs), 에어로졸 등의 경구투여용 제제, 외용제, 좌제, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 종양 내 투여, 관절 내 투여, 관절강 내 투여, 활액낭 내(intrasynovial) 투여, 흉골 내 투여, 수강 내(intrathecal) 투여, 병변 내 및 두개 내(intracranial) 투여, 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 림프 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 치료상 유효량은 질환 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 경구투여용 고형제제는 적어도 1종의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 상기 경구투여용 고형제제는 상기 부형제 이외에 실리카, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제(활택제)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 경구투여용 액상제제는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약물 전달용 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약물 전달용 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약물 전달용 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장료 조성물에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 화장품 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명에 따르면, Fc 수용체 또는 이의 일부를 엑소좀에 효율적으로 로딩시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 엑소좀을 제공할 수 있고, 이러한 재조합 엑소좀은 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하는 효능 및/또는 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성, 예를 들어 항암 효능, 면역 관련 효능 또는 항바이러스 효능 등을 함께 나타내는 장점이 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 CD64 막관통 도메인(서열번호 2)의 N-말단 및 C-말단에 각각 CD64 신호 펩타이드 및 mGFP를 융합시킨 서열번호 3의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터 지도(pEF6_CD64TM_mGFP 벡터 지도)를 나타낸다.
도 2는 CD64 막관통 도메인(서열번호 2)의 N-말단 및 C-말단에 각각 단일사슬 IL-12 및 mGFP를 융합시킨 서열번호 4의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터 지도(pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터 지도)를 나타낸다.
도 3은 신호 펩타이드가 제거된 CD64(서열번호 1)의 N-말단 및 C-말단에 각각 단일사슬 IL-12 및 mGFP를 융합시킨 서열번호 5의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터 지도(pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터 지도)를 나타낸다.
도 4는 pEF6_CD64TM_mGFP 벡터, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터 및 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터 각각에 의해 트랙스펙션된 HEK293T 세포에서 형광이 관찰되는 것을 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 5a는 pEF6_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 CD64TM 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이고, 도 5b는 pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 CD64TM 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이며, 도 5c는 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 CD64 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이다.
도 6a는 pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 scIL-12의 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이고, 도 6b는 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 scIL-12의 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이다.
도 7a는 scIL12_CD64TM 엑소좀의 scIL-12 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이고, 도 7b는 scIL12_fCD64 엑소좀의 scIL-12 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이다.
도 8은 scIL12_fCD64 엑소좀 및 scIL12_CD64TM 엑소좀 모두에서 IL-12 단백질이 검출된 것을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.
도 9는 scIL12_fCD64 엑소좀 또는 scIL12_CD64TM 엑소좀이 처리된 NK-92 세포에서 엑소좀의 농도의존적으로 인터페론-감마(IFN-γ) 분비가 유도되는 것을 나타내는 인터페론-감마 ELISA 결과 그래프이다.
도 10은 APC 항-인간 Fc 단편 항체의 농도를 고정시키고 scIL12_fCD64 엑소좀의 농도(입자수/mL)를 증가시키면서 APC 항-인간 Fc 단편 항체와 scIL12_fCD64 엑소좀을 반응시킨 경우, 엑소좀 농도 증가에 따라 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 11은 scIL12_fCD64 엑소좀의 농도(입자수/mL)를 고정시키고 APC 항-인간 Fc 단편 항체의 농도를 증가시키면서 APC 항-인간 Fc 단편 항체와 scIL12_fCD64 엑소좀을 반응시킨 경우, 항체 농도 증가에 따라 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 12는 scIL12_fCD64 엑소좀의 농도(입자수/mL)를 고정시키고 APC 항-인간 EGFR 항체의 농도를 증가시키면서 APC 항-인간 EGFR 항체와 scIL12_fCD64 엑소좀을 반응시킨 경우, 항체 농도 증가에 따라 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 13은 scIL12_fCD64 엑소좀의 농도(입자수/mL)를 고정시키고 APC 항-인간 CD16 항체의 농도를 증가시키면서 APC 항-인간 CD16 항체와 scIL12_fCD64 엑소좀을 반응시킨 경우, 항체 농도 증가에 따라 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 14는 scIL12_fCD64 엑소좀을 단독으로 처리한 그룹에 비해 scIL-12_fCD64 엑소좀과 항-CD16 항체를 병용 처리한 그룹이 NK-92 세포에서 인터페론-감마의 분비량을 크게 증가시킨 것을 나타내는 그래프이다.
도 15는 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 목적 융합 폴리펩타이드를 각각 발현하는 HEK293T 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 엑소좀 모두에서 V5 단백질이 검출된 것을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 목적 융합 폴리펩타이드를 발현하는 벡터의 제조
pEF6/V5-His A 벡터(#V96120, Invitrogen, USA에서 구입)의 멀티클로닝 부위 중 KpnI과 XbaI 부분을 각각 KpnI 제한효소 및 XbaI 제한효소를 이용하여 절단해 DNA를 선형화하였다. 이후, PCR을 통해 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드 각각을 코딩하는 유전자 단편을 증폭한 뒤 증폭된 유전자 단편 각각을 pEF6/V5-His A 벡터에 서브클로닝하였다(도 1 내지 도 3 참조).
서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드의 CD64 막관통 도메인(서열번호 2)과 mGFP 사이에는 링커(GGGGS)를 4번 반복하여 삽입하였다. 또한, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드의 단일사슬 IL-12와 CD64 막관통 도메인(서열번호 2) 사이에는 링커(GGGGS)를 3번 반복하여 삽입하였고, CD64 막관통 도메인(서열번호 2)과 mGFP의 사이에는 링커(GGGGS)를 4번 반복하여 삽입하였다. 추가로, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드의 단일사슬 IL-12와 신호 펩타이드가 제거된 CD64(서열번호 1) 사이에는 링커(GGGGS)를 3번 반복하여 삽입하였고, 신호 펩타이드가 제거된 CD64(서열번호 1)와 mGFP의 사이에는 링커(GGGGS)를 4번 반복하여 삽입하였다. 한편, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 융합 폴리펩타이드의 N-말단에 위치하는 단일사슬 IL-12를 구성하는 IL-12B (서열번호 6)와 신호 펩타이드가 제거된 IL-12A(서열번호 7) 사이에는 링커(GGGGS)를 3번 반복하여 삽입하였다.
도 1에는 CD64 막관통 도메인(이하, "CD64TM"이라 함)의 N-말단 및 C-말단에 각각 CD64 신호 펩타이드 및 mGFP를 융합시킨 융합 폴리펩타이드(서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드)를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(이하, "pEF6_CD64TM_mGFP"라 함)가 도시되어 있다. 또한, 도 2에는 CD64TM의 N-말단 및 C-말단에 각각 단일사슬 IL-12(이하, "scIL12"라 함) 및 mGFP를 융합시킨 융합 폴리펩타이드(서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드)를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(이하, "pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP"라 함)가 도시되어 있다. 추가로, 도 3에는 신호 펩타이드가 제거된 CD64(이하, "fCD64"라 함)의 N-말단 및 C-말단에 각각 scIL12 및 mGFP를 융합시킨 융합 폴리펩타이드(서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드)를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(이하, "pEF6_scIL12_fCD64_mGFP"라 함)가 도시되어 있다.
실시예 2: 세포의 배양 및 안정화 세포주 제작
형질도입에 사용할 HEK293T 세포(Horizon Discovery에서 구입)는 공급사의 권고에 따라 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS; ThermoFisher Scientific, USA에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics; ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)가 함유된 DMEM 배지(ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)에서 5% CO2, 37oC 조건 하에 계대 배양하였다.
실시예 1의 목적 융합 폴리펩타이드 각각을 안정적으로 발현하는 세포주 제작을 위해, 실시예 1에서 제작된 pEF6_CD64TM_mGFP 벡터, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터 및 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터 각각을 이펙텐 트랜스펙션 시약(Effectene Transfection Reagent; Qiagen, Germany에서 구입)을 이용하여 HEK293T 세포에 형질도입하였고, 형질도입 후 72시간 동안 배양하였다. 전술한 바와 같은 DMEM 배지에 10 μg/mL 블라스티시딘(Blasticidin)(Invivogen, USA에서 구입)을 첨가하여 3주 동안 배양하여 각 목적 융합 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 세포들만 선별하였다.
그리고 나서, 인큐사이트 S3(Incucyte S3; Sartorius, Germany에서 구입)를 이용하여, 상기와 같이 선별된 HEK293T 세포 내 목적 융합 폴리펩타이드 발현 여부를 확인하였다. 실시예 1에서 제작된 3가지 벡터 모두 mGFP 유전자를 포함하고 있으므로 이들 벡터 각각이 HEK293T 세포에 정상적으로 형질도입되어 세포 내에서 안정적으로 발현된 경우 HEK293T 세포 내에서 형광이 관찰되어야 한다. 형광현미경으로 이미지를 촬영한 결과, pEF6_CD64TM_mGFP 벡터, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터 및 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터 각각이 형질도입된 HEK293T 세포에서 형광이 관찰되었다(도 4). 따라서, 실시예 1에서 제작된 3가지 벡터 각각은 HEK293T 세포에 정상적으로 형질도입되었고, 이들 벡터 각각에 의해 코딩되는 각 목적 융합 폴리펩타이드는 HEK293T 세포에서 정상적으로 발현된 것을 알 수 있다.
각 세포 표면에서의 CD64 또는 CD64TM의 함량(또는 발현량)을 확인하기 위해, 상기 3가지 벡터 각각에 의해 형질감염된 HEK293T 세포를 "APC 마우스 IgG1, κ 이소타입 대조군 항체" 또는 "APC 항-인간 CD64 항체(BioLegend, USA에서 구입)"를 이용하여 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 이후 노보사이트 2000R(Novocyte 2000R) 유세포분석기(Agilent, USA에서 구입)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다(도 5a 내지 도 5c). 도 5a는 pEF6_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 CD64TM 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이고, 도 5b는 pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 CD64TM 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이며, 도 5c는 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 CD64 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이다.
또한, CD64TM 또는 CD64의 N 말단 부분에 융합된 scIL-12의 함량(또는 발현량)을 확인하기 위해, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터 및 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터 각각에 의해 형질감염된 HEK293T 세포를 "APC 마우스 IgG1, κ 이소타입 대조군 항체" 또는 "APC 항-인간 IL-12 항체(Abcam, UK에서 구입)"를 이용하여 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 이후 노보사이트 2000R(Novocyte 2000R) 유세포분석기(Agilent, USA에서 구입)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다(도 6a 및 도 6b). 도 6a는 pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 scIL-12의 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이고, 도 6b는 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 scIL-12의 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이다.
상기 결과들로부터, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 후 마커 선택과정을 거쳐 안정화된 HEK293 세포는 CD64TM과 scIL12를 안정적으로 발현시키고 이들의 함량이 역시 높은 것을 확인할 수 있었고, pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 후 마커 선택과정을 거쳐 안정화된 HEK293 세포 역시 CD64와 scIL12를 안정적으로 발현시키고 이들의 함량이 역시 높은 것을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 목적 융합 폴리펩타이드를 발현하는 엑소좀 분리
실시예 2에서 제작한 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 목적 융합 폴리펩타이드를 각각 발현하는 HEK293T 안정화 세포주를 각각 175T 세포배양 플라스크에 8.75×106 개 분주하고 5% CO2, 37oC 조건에서 배양하였다. 다음 날 1% 엑소좀-제거 우태아혈청(exosome-depleted FBS; System Biosciences, USA에서 구입), 1% 항생제-항진균제 및 10 μg/mL 블라스티시딘(Blasticidin)(Invivogen, USA에서 구입)이 함유된 Opti-MEM (ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)으로 배양액을 교체하고 48시간 동안 5% CO2, 37°C 조건에서 배양하였다.
이후 세포배양 상층액을 모두 취하고, 이를 0.22 μm PES 바틀탑 (PES Bottle top) 필터(제품명: S2GPT05RE; Merck, Germany에서 구입)로 여과하였다. 그리고 나서, 아미콘　울트라-15 원심분리용 100kDa 필터유닛(Amicon　Ultra-15 Centrifugal 100 kDa Filter Unit; Merck, Germany에서 구입)을 이용해 상층액 2 L를 4℃에서 1시간 동안 농축하였다. 농축액을 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline; Gibco, USA에서 구입)에 현탁한 후, 초고속원심분리기(Beckman Coulter, Optima XE-100)에 넣고 100,000×g 에서 3시간 동안 원심분리를 하였다. 그 후 상층액을 모두 제거하고 엑소좀 펠렛을 500 μL의 DPBS에 현탁한 후 마이크로 BCA 어세이(microBCA assay)(ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)를 이용하여 단백질 농도를 정량하였고, 나노입자분석기(Zetaview; Particle Matrix, Germany에서 구입)를 이용하여 엑소좀 입자수를 측정하였다. 이후 각 엑소좀은 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예 4: 엑소좀에서 목적 융합 폴리펩타이드의 로딩 여부 확인
실시예 3에서 분리한 각 엑소좀에서 IL-12의 로딩을 확인하기 위해, CD81 다이나비드(Dynabead)(ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)를 이용하여 엑소좀을 포획하였다. 이는 엑소좀의 크기가 작아 일반적인 유세포 분석기로 분석이 불가능하기 때문에 2.7 μm 비드를 이용하여 엑소좀만 포획하는 방법이다. pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터 및 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터 각각을 발현하는 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 각각의 엑소좀을 "APC 마우스 IgG1, κ 이소타입 대조군 항체" 또는 "APC 항-인간 IL-12 p40 항체"(BioLegend, USA에서 구입)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 염색하였다. 이후 노보사이트 2000R(Novocyte 2000R) 유세포분석기(Agilent, USA에서 구입)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. 그 결과, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터를 발현하는 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 엑소좀(이하, "scIL12_CD64TM_mGFP 엑소좀" 또는 "scIL12_CD64TM 엑소좀"이라 함)에서 IL-12의 로딩이 확인되었고(도 7a), pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터를 발현하는 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 엑소좀(이하, "scIL12_fCD64_mGFP 엑소좀" 또는 "scIL12_fCD64 엑소좀"이라 함)에서 IL-12의 로딩이 확인되었다(도 7b).
또한, scIL12_CD64TM 엑소좀 및 scIL12_fCD64 엑소좀 각각에 목적 융합 폴리펩타이드가 로딩되었는지 확인하기 위해 각각의 엑소좀 펠렛을 1X RIPA 버퍼 (Cell Signaling, USA에서 구입)를 이용하여 용해한 후 분리한 단백질을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 이후 SDS-PAGE 수행 결과물을 PVDF 멤브레인(Merck, Germany에서 구입)에 트랜스퍼한 후 항-IL12 p40 항체(1:1000, Abcam, UK에서 구입) 또는 항-V5 항체(1:1,000, Abcam, UK에서 구입)를 이용하여 1차 항체반응을 한 뒤 페록시다아제 아피니퓨어 염소 항-마우스 IgG(Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG)(1:100,000, Jackson ImmunoResearch, USA에서 구입)를 이용하여 2차 항체반응을 수행하였다. 이후 애머샴 이미저 680(Amersham Imager 680)(Cytiva, USA에서 구입)을 이용하여 엑소좀에 존재하는 IL-12 단백질 또는 V5 단백질을 검출하였다.
그 결과, 서열번호 4의 목적 융합 폴리펩타이드를 발현하는 HEK293T 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 엑소좀(도 8에서 "pEF6_scIL12_CD64tm_mG"로 표시)과, 서열번호 5의 목적 융합 폴리펩타이드를 발현하는 HEK293T 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 엑소좀(도 8에서 "pEF6_scIL12_fCD64_mG"로 표시) 모두에서 IL-12 단백질이 검출되었다(도 8).
또한, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 목적 융합 폴리펩타이드를 각각 발현하는 HEK293T 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 엑소좀 모두에서 V5 단백질이 검출되었다(도 15). 이로부터 각 엑소좀에 목적 융합 폴리펩타이드가 정상적으로 로딩된 것을 확인하였다.
실시예 5: IL-12가 로딩된 엑소좀의 NK 세포 자극효과 확인
인터루킨 12(Interleukin 12, IL-12)는 대식세포, 수지상 세포 등의 항원전달세포(antigen presenting cells)로부터 분비되어 자연살해 세포(NK 세포)와 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)를 활성화시키는 사이토카인이다. IL-12 자극에 의해 활성화된 면역세포들은 자체 세포살해능력이 증가할 뿐만 아니라 인터페론-감마(IFN-γ)를 분비하여 주변의 타입1 조력 T 세포(Th1) 분화를 촉진시켜 면역 세포들의 항암효과를 증진시킨다. 이러한 강력한 항암효과를 나타내는 IL-12를 이용한 치료제 개발이 활발하게 이루어지고 있지만, IL-12 재조합단백질은 체내 반감기가 짧고 전신독성을 일으키는 한계점을 지니고 있다. 엑소좀은 목적 단백질을 표면에 로딩하여 목적 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있고 종양미세환경에 효율적으로 전달될 수 있어 차세대 약물전달시스템(drug delivery system)으로서 최근 각광을 받고 있다.
실시예 4에서는 scIL12_CD64TM 엑소좀 및 scIL12_fCD64 엑소좀 모두에서 IL-12의 로딩을 확인하였다. 본 실시예는 이들 엑소좀에 로딩된 IL-12가 NK 세포를 자극하여 인터페론-감마의 분비를 유도할 수 있는지 여부를 확인하고자 수행되었다.
배양 중인 NK-92 세포를 48-웰 플레이트의 각 웰에 1×105 세포/250 μL로 접종하였다. 음성대조군(NC)인 250 μL의 세포 배양액을 NK-92 세포에 처리하였고, 양성대조군(Positive Control)인 20 ng의 재조합 IL-12(도 9에서 "rIL-12"로 표시)(R&D Systems, USA에서 구입)를 250 μL의 세포 배양액에 희석하여 NK-92 세포에 처리하였다. 또한, scIL12_fCD64 엑소좀(도 9에서 "scIL12_fCD64 exo"로 표시) 및 scIL12_CD64TM 엑소좀(도 9에서 "scIL12_CD64tm exo"로 표시)의 단백질 함량을 측정하였고, 각 엑소좀의 단백질 함량이 5 μg, 10 μg 및 20 μg이 되도록 조정한 후, 각 농도별 엑소좀을 250 μL의 세포 배양액에 희석하여 NK-92 세포에 처리하였다. 처리 후 NK-92 세포를 5% CO2, 37oC 조건에서 48시간 배양하였다.
48시간 후, scIL12_fCD64 엑소좀(5 μg, 10 μg 및 20 μg)과 scIL12_CD64TM 엑소좀(5 μg, 10 μg 및 20 μg)이 각각 처리된 NK-92 세포의 배양 상층액 100 μL를 수득하고, IFN-γ ELISA 키트(R&D Systems, USA에서 구입)를 이용하여 수득된 상층액 내의 IFN-γ 양, 즉 scIL12_fCD64 엑소좀(5 μg, 10 μg 및 20 μg)과 scIL12_CD64TM 엑소좀(5 μg, 10 μg 및 20 μg) 처리에 의해 NK-92 세포에서 분비된 IFN-γ 양을 측정하였다. 그 결과, scIL12_fCD64 엑소좀 또는 scIL12_CD64TM 엑소좀에 의해 처리된 NK-92 세포에서 엑소좀의 농도의존적으로 IFN-γ 분비가 유도되는 것이 확인되었다(도 9). 따라서, 본 발명에 따라 엑소좀에 로딩된 IL-12는 NK 세포를 자극하여 IFN-γ 분비를 유도할 수 있는 것을 알 수 있다.
실시예 6: 엑소좀의 Fc 도메인 결합 능력 확인
대식세포, 수지상세포 등의 면역세포 표면에 발현되고 있는 CD64는 항체의 불변 영역으로 이루어진 Fc 도메인에 결합한다. 이는 면역세포가 항원과 결합된 항체를 인지하여 항원 특이적인 면역반응을 일으킬 수 있도록 한다.
실시예 5에서는 scIL12_fCD64 엑소좀에 로딩된 IL-12의 IFN-γ 분비 유도 효능을 확인하였다. 본 실시예에서는 IFN-γ 분비 유도의 효능을 갖는 scIL12_fCD64 엑소좀에 로딩된 CD64가 항체 결합 기능을 갖는지 여부를 확인하였다. 이를 위해 본 실시예에서는 항체가 scIL12_fCD64 엑소좀의 표면에 결합하는 것을 확인하였다.
우선, scIL12_fCD64 엑소좀의 입자수에 따른 항체 결합능을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 실시예 3에서 분리한 scIL12_fCD64 엑소좀을 다량으로 모아 풀링하여 고농도의 scIL12_fCD64 엑소좀을 준비한 후 CD63 다이나비드(Dynabead)(ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)를 이용하여 scIL12_fCD64 엑소좀을 포획하였다. APC 항-인간 FC 단편 항체(Jackson immunoresearch, USA에서 구입)의 양을 2 μg으로 고정하였고, scIL12_fCD64 엑소좀을 APC 항-인간 FC 단편 항체와 상온에서 1시간 동안 반응시켜 염색하였다. 이후 노보사이트 2000R(Novocyte 2000R) 유세포분석기(Agilent, USA에서 구입)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. 그 결과, scIL12_fCD64 엑소좀 농도의 증가에 따라 APC로부터의 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하였고, 1×109 입자수/mL의 농도부터는 MFI가 현저히 높았다(도 10). 상기 결과는 scIL12_fCD64 엑소좀 표면에 존재하는 CD64가 항체의 Fc 도메인과 정상적으로 결합하는 것을 의미한다. 따라서, CD64가 로딩된 scIL12_fCD64 엑소좀은 암세포 및/또는 면역세포 특이적인 항체의 Fc 도메인과 결합하여 암세포 및/또는 면역세포를 향해 표적화될 수 있다.
또한, scIL12_fCD64 엑소좀이 암세포 및/또는 면역세포로 표적화되기 위해서는 암세포 및/또는 면역세포 특이적인 다양한 항체와 결합할 수 있어야 한다. 따라서, scIL12_fCD64 엑소좀이 APC 항-인간 FC 단편 항체 외에 또 다른 항체들과 결합할 수 있는지 여부를 확인하였다.
다이나비드로 포획한 scIL12_fCD64 엑소좀의 농도를 1×109 입자수/mL (최종 농도)로 고정하였고, scIL12_fCD64 엑소좀을 APC 항-인간 FC 단편 항체, APC 항-인간 EGFR 항체(R&D bioscience, USA에서 구입) 또는 APC 항-인간 CD16 항체(Abcam, UK에서 구입)와 상온에서 1시간 동안 반응시켜 염색하였다. 이후 노보사이트 2000R(Novocyte 2000R) 유세포분석기(Agilent, USA에서 구입)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였고, 항체의 농도의존적으로 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하는지 여부를 확인하였다.
그 결과, APC 항-인간 FC 단편 항체, APC 항-인간 EGFR 항체 및 APC 항-인간 CD16 항체의 농도 증가에 따라 APC로부터의 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 11 내지 도 13). 상기 결과들은 scIL12_fCD64 엑소좀의 표면에 존재하는 CD64가 다양한 항체의 Fc 도메인과 정상적으로 결합하는 것을 의미하고, scIL12_fCD64 엑소좀의 표면에 CD64가 높은 밀도로 존재하기 때문에 Fc 도메인을 갖는 항체의 결합능이 농도의존적으로 증가하는 것을 의미한다. 따라서, CD64가 로딩된 scIL12_fCD64 엑소좀은 암세포 및/또는 면역세포 특이적인 항체의 Fc 도메인과 결합하여 암세포 및/또는 면역세포를 향해 표적화될 수 있다.
실시예 7: scIL12_fCD64 엑소좀과 면역세포 특이적인 항체와의 결합으로 인한 면역세포 활성화 증가 확인
항체를 이용한 표적 항암제는 암세포에 특이적인 항원에 결합하여 항암 효과를 나타낸다. 본 발명의 Fc 수용체(예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16) 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드(예를 들어, IL-12, IL-7 등)를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀은 그 표면에 Fc 수용체(예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16) 또는 이의 일부와, IL-12, IL-7 등의 목적 단백질 또는 펩타이드가 존재하게 된다.
예를 들어, Fc 수용체(예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16) 또는 이의 일부에 IL-12, IL-7 등의 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 표면에 포함하는 엑소좀의 경우, Fc 수용체(예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16) 또는 이의 일부가 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하고 IL-12, IL-7 등은 항암 효능을 나타낼 수 있다. 따라서 Fc 수용체(예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16) 또는 이의 일부와 IL-12, IL-7 등의 목적 단백질 또는 펩타이드를 모두 포함하는 엑소좀을 항체 항암제와 함께 암환자에게 병용 투여하면 Fc 도메인을 갖는 항체 항암제가 작용하는 암세포에 대한 추가적이고 표적 특이적인 공격이 가능하여 항암 효과를 증가시킬 수 있다.
본 실시예에서는 scIL12_fCD64 엑소좀과, NK 세포 표면에 제시된 CD16을 표적화할 수 있는 항-CD16 항체를 병용투여한 경우, NK 세포에서의 인터페론-감마 유도능력의 변화를 확인하였다. NK 세포는 표면에 CD16을 강하게 발현하고 있다. 항-CD16 항체와 scIL12_fCD64 엑소좀의 병용투여가 scIL12_fCD64 엑소좀의 단독투여 보다 우수한 인터페론-감마 유도능력을 나타낸다면, 이는 scIL-12_fCD64 엑소좀이 NK 세포를 향해 효율적으로 표적화되는 것을 의미한다. 즉, 상기 결과는 scIL-12_fCD64 엑소좀의 CD64가 항-CD16 항체의 Fc 도메인에 결합하여 scIL-12_fCD64 엑소좀과 항-CD16 항체의 복합체를 형성하고, 복합체의 항-CD16 항체에 의해 NK 세포를 향해 효율적으로 표적화되는 scIL-12_fCD64 엑소좀의 IL-12는 NK 세포에서 인터페론-감마 유도를 향상시키는 것을 의미한다.
10 μg의 항-CD16 항체를 scIL-12_fCD64 엑소좀(최종 농도: 1×109 입자수/mL)과 섞은 후 훌라믹서 샘플 혼합기(hulamixer sample mixer, Thermofisher, USA에서 구입)를 이용하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 비특이적 결합 항체는 초고속원심분리를 이용하여 제거하였고, 항-CD16 항체가 결합된 scIL-12_fCD64 엑소좀(이하, "scIL-12_fCD64 엑소좀-항-CD16"라 함)은 0.1 ㎛ 시린지 필터(제품명: SLVVR33RS; Merck, Germany에서 구입)를 통해 여과한 DPBS 완충액과 혼합하여 사용하였다.
배양 중인 NK-92 세포를 48-웰 플레이트의 각 웰에 1×105 세포/250 μL로 접종하였다. 음성대조군(NC)인 250 μL의 세포 배양액을 NK-92 세포에 처리하였고, 양성대조군(Positive Control)인 20 ng의 재조합 IL-12(도 14에서 "rIL-12"로 표시)(R&D Systems, USA에서 구입)를 250 μL의 세포 배양액에 희석하여 NK-92 세포에 처리하였다.
또한, scIL12_fCD64 엑소좀(최종 농도: 1×109 입자수/mL)을 250 μL의 세포 배양액에 희석하여 NK-92 세포에 처리하였고, 전술한 바와 같이 준비된 scIL-12_fCD64 엑소좀-항-CD16을 250 μL의 세포 배양액에 희석하여 NK-92 세포에 처리하였다. 처리 후 NK-92 세포를 5% CO2, 37℃ 조건에서 48시간 배양하였다.
48시간 후, scIL12_fCD64 엑소좀 단독과 scIL-12_fCD64 엑소좀-항-CD16이 처리된 NK-92 세포의 배양 상층액 100 μL를 수득하고, IFN-γ ELISA 키트(R&D Systems, USA에서 구입)를 이용하여 수득된 상층액 내의 IFN-γ 양, 즉 scIL12_fCD64 엑소좀 단독과 scIL-12_fCD64 엑소좀-항-CD16 처리에 의해 NK-92 세포에서 분비된 IFN-γ 양을 측정하였다.
그 결과, scIL12_fCD64 엑소좀 단독을 처리한 그룹에 비해 scIL-12_fCD64 엑소좀-항-CD16을 처리한 그룹이 NK-92 세포에서 인터페론-감마의 분비량을 크게 증가시킨 것을 확인할 수 있었다(도 14). 상기 결과로부터, 항-CD16 항체와 scIL12_fCD64 엑소좀을 병용투여하면, scIL-12_fCD64 엑소좀의 CD64는 항-CD16 항체의 Fc 도메인과 결합하여 scIL-12_fCD64 엑소좀과 항-CD16 항체의 복합체를 형성하고, 복합체의 항-CD16 항체에 의해 scIL-12_fCD64 엑소좀은 NK 세포를 향해 효율적으로 표적화되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 복합체의 항-CD16 항체에 의해 NK-92 세포를 향해 효율적으로 표적화되는 scIL-12_fCD64 엑소좀의 IL-12는 표적화의 결과로 NK 세포를 보다 효율적으로 활성화시켜 NK-92 세포에서의 인터페론-감마 유도 효과를 향상시킬 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

Claims (33)

  1. 목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는, 재조합 엑소좀.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함하는, 재조합 엑소좀.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하는, 재조합 엑소좀.
  4. 제2항에 있어서,
    상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성을 나타내는, 재조합 엑소좀.
  5. 제2항에 있어서,
    항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성을 나타내는, 재조합 엑소좀.
  6. 제2항에 있어서,
    상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부의 N-말단 또는 C-말단에 융합되는, 재조합 엑소좀.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부의 N-말단에 융합되는, 재조합 엑소좀.
  8. 제2항에 있어서,
    신호 펩타이드가 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에 융합되는, 재조합 엑소좀.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 신호 펩타이드는 상기 목적 단백질 또는 펩타이드로부터 유래되거나 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부로부터 유래된 것인, 재조합 엑소좀.
  10. 제2항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 상기 엑소좀의 막을 통과하여 위치하고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 엑소좀의 표면 상에 위치하는, 재조합 엑소좀.
  11. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 서열번호 1의 폴리펩타이드를 포함하는, 재조합 엑소좀.
  12. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 적어도 하나의 Fc 결합 도메인이 제거된, 재조합 엑소좀.
  13. 제12항에 있어서,
    상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 2개 또는 3개의 Fc 결합 도메인이 제거된, 재조합 엑소좀.
  14. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 Fc 수용체 또는 이의 일부의 막관통 도메인을 포함하는, 재조합 엑소좀.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 막관통 도메인은 서열번호 2의 폴리펩타이드를 포함하는, 재조합 엑소좀.
  16. 제2항에 있어서,
    상기 목적 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 포함하도록 유전적으로 조작 또는 변형된 세포로부터 생산되는, 재조합 엑소좀.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 외인성 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인을 코딩하는 핵산 서열과의 융합없이 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물을 형질도입하여 수득되는, 재조합 엑소좀.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부를 자연적으로 발현하지 못하는 세포인, 재조합 엑소좀.
  19. 제18항에 있어서,
    상기 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 HEK293 세포, HEK293T 세포 또는 Expi293F 세포인 것을 특징으로 하는, 재조합 엑소좀.
  20. 제16항 또는 제17항에 있어서,
    상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 엑소좀의 표면 상에 위치하는, 재조합 엑소좀.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 Fc 수용체 또는 이의 일부가 자체적으로 갖는 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인에 의해 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부가 엑소좀 표면 상에 제시되는, 재조합 엑소좀.
  22. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFITM1 단백질, IFITM2 단백질, IFITM3 단백질, ACE2(angiotensin-converting enzyme 2), sACE2(soluble angiotensin-converting enzyme 2), 바이러스 스파이크 단백질, 바이러스 스파이크 단백질 항체, 또는 효소 중 적어도 1종인, 재조합 엑소좀.
  23. 제2항의 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 약학 조성물.
  24. 제23항에 있어서,
    약리학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는, 약학 조성물.
  25. 제24항에 있어서,
    항종양 효과 증진용, 항암효과 증진용 또는 항바이러스용인, 약학 조성물.
  26. 제25항에 있어서,
    암세포 사멸물질 또는 항바이러스 물질을 포함하는, 약학 조성물.
  27. 제26항에 있어서,
    상기 암세포 사멸물질 또는 항바이러스 물질은 상기 재조합 엑소좀 표면 또는 내부에 위치하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  28. 제27항에 있어서,
    상기 암세포 사멸물질 또는 항바이러스 물질은 상기 목적 단백질 또는 펩타이드 및/또는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부에 융합되어 위치하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
  29. 제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 기재된 약학 조성물을 포함하는 약물 전달 시스템.
  30. 제29항에 있어서,
    항체를 더 포함하는, 약물 전달 시스템.
  31. 제30항에 있어서,
    상기 항체는 상기 재조합 엑소좀과 함께 병용 투여되는 것을 특징으로 하는, 약물 전달 시스템.
  32. 제2항의 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물.
  33. 제32항에 있어서,
    샴푸, 비누, 린스, 계면활성제-함유 클렌징, 크림, 로션, 연고, 토닉, 트리트먼트, 컨디셔너, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 오일, 왁스, 스프레이, 에어졸, 미스트, 또는 파우더인, 화장료 조성물.
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