KR20220106696A

KR20220106696A - 목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는 재조합 엑소좀 및 이의 용도

Info

Publication number: KR20220106696A
Application number: KR1020220007013A
Authority: KR
Inventors: 조병성
Original assignee: 주식회사 엑소코바이오
Priority date: 2021-01-21
Filing date: 2022-01-18
Publication date: 2022-07-29

Abstract

본 발명은 Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀을 제공할 수 있고, 이러한 엑소좀은 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하는 효능 및/또는 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성, 예를 들어 항암 효능, 면역 관련 효능 또는 항바이러스 효능 등을 함께 나타내는 장점이 있다.

Description

목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는 재조합 엑소좀 및 이의 용도 {Recombinant exosome comprising Fc receptor or its part which can be fused to target protein or peptide and its use}

본 발명은 목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는 재조합 엑소좀 및 이의 용도에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 엑소좀으로서, 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하는 효능 및/또는 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성, 예를 들어 항암 효능, 면역 관련 효능 또는 항바이러스 효능 등을 함께 나타내는 재조합 엑소좀 및 이의 용도에 관한 것이다.

추가로, 본 발명은 전술한 바와 같은 재조합 엑소좀을 면역 관련 질환, 암, 염증 질환, 바이러스 질환, 기타 다양한 질환의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 응용하는 것에 관한 것이다.

인체에 투여되는 치료제가 효과적으로 작용하게 하고 부작용을 줄이기 위해 약물 전달 시스템(Drug Delivery System; DDS)이 사용된다.

예를 들어, 항체, 나노바디, 단백질, 또는 폴리펩타이드는 생체 내 환경에 노출되었을 때 그 효능이 저하되거나 치료 대상이 되는 표적 부위로 전달되지 못할 수 있다. 예를 들어, 표적 항암제는 암세포에 특이적으로 작용하도록 개발되었지만, 인체 내에 투여 시 치료 대상이 되는 암조직에 대해 보다 선택적으로 작용할 수 있다면 치료 효과를 극대화할 수 있다.

현재까지 약물 전달 시스템으로 개발된 리포좀 또는 마이셀 등은 생체 내에서 약물의 유지시간을 증가시키고 약물동력학 관점에서 개선이 있었으나, 특정 세포, 예를 들어, 면역 세포나 암세포에 대한 선택적 타겟팅 능력은 결여되어 있다. 뿐만 아니라 합성물질을 사용한 리포좀은 생체 적합성 문제가 발생할 수 있다.

한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외 소포체(extracellular vesicle)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.

세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.

엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막을 갖는 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).

즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다.

이와 같은 엑소좀을 약물 전달체로 사용할 경우 생체적합적이고 생체 내에서 약물의 안정성을 높여주면서도 잘 흡수된다는 장점이 있다. 그러나 자연적으로 생성되는 엑소좀에 약물 카고를 소수성 특성 등을 이용하여 수동적으로 흡수시켜 로딩하는 방식은 제조 효율이 떨어지고 엑소좀에 충분한 약물 카고가 로딩되지 못하는 한계가 있다.

최근에는 유전자 구조체 제작 단계에서 엑소좀의 막관통 단백질에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 후 세포 내에서 발현시키고 세포 배양액에 분비 내지는 방출된 엑소좀을 분리하여 목적 단백질 또는 펩타이드가 로딩된 엑소좀(엑소좀의 막관통 단백질에 목적 단백질 또는 펩타이드가 융합된 엑소좀)을 수득하는 방법이 제안되고 있다(WO 2013/084000 A2; WO 2014/168548 A2 참조).

그러나 다른 기술 분야와 마찬가지로 본 발명이 속하는 기술분야 역시 목적 단백질 또는 펩타이드를 엑소좀에 효과적으로 로딩하고 치료 대상이 되는 표적 부위에 효과적으로 전달하기 위한 새로운 기술에 대한 끊임없는 개발을 요구하고 있다.

한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.

대한민국 공개특허공보 제10-2020-0098512호 (2020.08.20) 국제공개공보 WO 2013/084000 A2 (2013.06.13) 국제공개공보 WO 2014/168548 A2 (2014.10.16)

본 발명의 목적은 목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는 재조합 엑소좀 및 이의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 다른 목적은 Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 엑소좀으로서, 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하는 효능 및/또는 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성, 예를 들어 항암 효능, 면역 관련 효능 또는 항바이러스 효능 등을 함께 나타내는 재조합 엑소좀 및 이의 용도를 제공하는데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 전술한 바와 같은 재조합 엑소좀을 면역 관련 질환, 암, 염증 질환, 바이러스 질환, 기타 다양한 질환의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 응용하는 것을 제공하는데 있다.

그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자는 예의연구를 거듭한 결과, 외인성 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인을 코딩하는 핵산 서열과의 융합없이 Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물을 세포에 형질도입하고 상기 유전자 작제물을 상기 세포 내에서 발현시킨 후 세포 배양액에 분비 내지는 방출된 엑소좀을 분리하여 분석한 결과, 분리된 엑소좀이 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하거나/하고 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성도 함께 나타내는 예상 밖의 결과를 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.

본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)"는 통상 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다. 분리 환경, 조건 및 방법 등에 따라 세포외 소포체는 엑소좀과 동일한 의미를 가질 수도 있고 엑소좀과 크기는 동일 내지는 유사하지만 엑소좀의 조성을 갖지 않는 나노베지클까지 포함하는 의미를 가질 수도 있다. 한편, 본 명세서에서 Fc 수용체 또는 이의 일부의 로딩과 관련하여 사용되는 엑소좀이라는 용어는 상기 세포외 소포체를 포괄하는 의미로 사용된다.

본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막을 갖는 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.

한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, HEK293 세포, HEK293T 세포, Expi293F 세포, CHO 세포, SF9 곤충세포, 식물세포, 줄기세포, 면역세포, 또는 암세포 등일 수 있고, 바람직하게는 HEK293 세포, HEK293T 세포 또는 Expi293F 세포일 수 있다.

또한, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 상기 세포는 줄기세포, 면역세포, 불멸화된 세포, 곤충세포, 식물세포 또는 암세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 성체줄기세포, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 면역세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 수지상 세포 또는 대식 세포일 수 있다. 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 와튼젤리 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다.

그러나 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 세포를 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들에서 사용된 HEK293T 세포는 본 발명에서 사용될 수 있는 세포의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.

본 명세서에서 사용된 용어, "Fc 수용체"는 Fc 알파 수용체(FcαR), Fc 감마 수용체(FcγR), Fc 엡실론 수용체(FcεR), Fc 뮤 수용체(FcμR), Fc 알파/뮤 수용체(Fcα/μR), FcRn(neonatal Fc receptor) 등을 포함하는 광의의 개념이다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, Fc 알파 수용체로는 FcαRI(CD89)을 들 수 있고, Fc 감마 수용체로는 FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB1(CD32), FcγRIIB2(CD32), FcγRIIIA(CD16A) 및 FcγRIIIB(CD16B)를 들 수 있으며, Fc 엡실론 수용체로는 FcεRI 및 FcεRII(CD23)를 들 수 있다.

Fc 알파 수용체는 인체 중 가장 풍부한 이뮤노글로불린인 IgA의 Fc 도메인과 결합하는 수용체이다. CD89는 다형핵 백혈구(PMN), 단핵구, 대식세포, 호중구 및 호산구를 비롯한 세포독성 면역 이펙터 세포 상에서 발현된다. 리간드가 CD89에 결합하면 백혈구 및 CD89-보유 세포주의 식세포작용과 항체-매개성 세포독성이 촉발된다. 또한, CD89는 이펙터 세포 상의 IgG에 대한 수용체와 협력하여 표적 세포에 대한 식세포작용을 강화시킬 수 있다.

Fc 감마 수용체는 IgG 항체의 Fc 영역 또는 Fc 도메인이라고 불리는 항체 부분에 결합하여 항체-매개 식세포작용 또는 항체-의존성 세포-매개 세포독성을 통해 식세포작용 또는 세포독성 활성을 자극하는 단백질이다. 예를 들어, CD64는 고친화성 Fc 감마 수용체이고, Fc 감마 수용체 I(FcγRI)이라고도 불린다. CD64의 세포외 도메인(ectodomain)은 항체 결합을 담당하는 3개의 면역글로불린 도메인을 포함한다. CD64는 단핵구, 대식세포, 수지상 세포 및 호중구 등에서 발현되고, 항체-매개 식세포 작용 및 세포독성 활성화에 관여한다. CD16은 저친화도 Fc 감마 수용체이고, Fc 감마 수용체 III(FcγRIII)라고도 불린다. CD16의 세포외 도메인(ectodomain)은 항체 결합을 담당하는 2개의 면역글로불린 도메인을 포함한다. CD16은 CD16A와 CD16B의 2가지 형태가 있다. CD16A는 단핵구, 대식세포 및 NK 세포 등에서 발현되고, NK 세포의 세포독성 활성을 유발한다. CD32는 저친화도 Fc 감마 수용체이고, Fc 감마 수용체 II(FcγRII)라고도 불린다. CD32는 단핵구, 식세포(phagocyte), 과립구, B 세포, T 세포 등에 존재하며, 복합 또는 응집 IgG와 결합한다.

Fc 엡실론 수용체는 비만세포, 호염기구, 호산구, 단핵세포, 대식세포 및 혈소판의 표면 상에 존재한다. FcεRI은 고친화도 Fc 엡실론 수용체이고, FcεRII(CD23)는 저친화도 Fc 엡실론 수용체이다. IgE는 비만세포 및 호염기구의 표면상에 존재하는 Fc 엡실론 수용체에 결합함으로써 IgE-매개된 알러지성 반응을 프라이밍하게 된다.

재순환하는 Fc 신생아 수용체(Fc neonatal 수용체; FcRn)는 IgG 아이소타입의 항체에 결합하여 IgG 항체의 생체 내 반감기를 연장한다. 그러나 FcRn는 IgA 및 IgM 아이소타입 항체와는 결합하지 않는다. FcRn은 리소좀에서 IgG의 분해를 효과적으로 차단하여 IgG의 반감기를 연장하는 것으로 알려져 있다.

Fc μ 수용체(FcμR) 및 Fc α/μ 수용체(Fcα/μR)는 IgM 아이소타입의 항체에 결합한다. Fcα/μR은 외부 물질에 결합한 항체 및 면역 복합체를 B 세포 및 식세포(phagocyte)가 업테이크하는 것을 촉진한다. 또한, FcμR은 B 세포 발달에 중요하며, IgM 항상성(homeostasis), B 세포 생존, 체액 면역 반응(humoral immune response) 및 자가항체(autoantibody) 형성에 영향을 주는 것으로 알려져 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "목적 단백질 또는 펩타이드"는 엑소좀 상 및/또는 엑소좀 내에 로딩하고자 하는 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 또는 이들의 단편을 의미한다. 목적 단백질 또는 펩타이드는 엑소좀 상 및/또는 엑소좀 내에 존재하지 않는 외인성(exogenous)일 수 있고, 엑소좀 상 및/또는 엑소좀 내에 존재하는 내인성(endogenous)일 수 있다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 목적 펩타이드는 면역 조절, 항암 작용, 항염 작용, 항바이러스 작용, 및/또는 기타 생리적으로 유용한 기능을 갖는 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 또는 이들의 단편일 수 있다.

예를 들어, 목적 펩타이드는 항체, 항체의 가변영역 단편, 항체의 Fc 도메인, 항체의 Fc 도메인 결합 단백질, 단일 체인 항체, 단일 체인 가변영역 단편(scFv), 미니바디(minibody), 다이아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 펩타이드 앱타머, 나노바디(nanobody), CRISPR-결합 단백질, 세포사멸 유도 단백질, 세포사멸 억제 단백질, 효소, 리간드, 리간드 수용체, 성장인자, 성장인자 수용체, 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 등), 사이토카인 수용체, 성장인자 결합 수용체, 사이토카인 결합 수용체, 사이토카인 저해 단백질, 독소 단백질, 유전자 손상 유도 단백질, 유전자 손상 저해 단백질, 바이러스 억제 단백질(예를 들어, IFITM1 단백질, IFITM2 단백질, IFITM3 단백질 등), 바이러스 스파이크 단백질, 바이러스 스파이크 단백질 항체, 또는 항균 단백질이거나 이들의 단편일 수 있다.

본 명세서에서 사용된 용어, "과발현"은 유전적으로 조작되지 않은 야생형 세포 및/또는 이로부터 유래된 엑소좀이 갖지 않거나 낮은 수준 또는 정상 수준으로 발현하는 단백질 또는 펩타이드가 유전적으로 조작된(genetic engineered) 세포 및/또는 이로부터 유래된 엑소좀에서 높은 수준으로 발현되는 것을 의미한다. 또한, "유전적으로 조작된(genetically engineered)"이란 용어는 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 행위 또는 이러한 행위에 의해 만들어진 세포 및/또는 이로부터 유래한 엑소좀을 의미한다.

본 명세서에서 사용된 용어, "막관통 단백질"은 세포 외에 존재하는 세포외 도메인(ectodomain), 세포막을 가로질러 세포막에 존재하는 막관통 도메인(transmembrane domain) 및 세포 안쪽에 존재하는 세포내 도메인(endodomain)으로 구성된다. "외인성 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인"은 엑소좀으로의 로딩 대상이 되는 Fc 수용체가 자체적으로 갖는 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인을 제외한 모든 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인을 의미한다.

본 발명에서 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 Fc 수용체 또는 이의 일부를 자연적으로 발현하지 못하는 세포일 수 있고, 예를 들어, HEK293 세포, HEK293T 세포 또는 Expi293F 세포일 수 있다. HEK293 세포, HEK293T 세포 또는 Expi293F 세포는 CD64, CD32 또는 CD16과 같은 Fc 수용체를 발현하지 않고, HEK293 세포, HEK293T 세포 또는 Expi293F 세포로부터 유래된 엑소좀 역시 CD64, CD32 또는 CD16과 같은 Fc 수용체를 갖지 않는다. 본 발명은 HEK293 세포, HEK293T 세포 또는 Expi293F 세포로부터 유래된 엑소좀에 CD64, CD32 또는 CD16과 같은 Fc 수용체를 로딩할 수 있는 기술이다.

본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀은, 목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함한다.

본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀은, Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함한다. 상기 재조합 엑소좀은 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합할 수 있다. 또한, 상기 재조합 엑소좀은 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성을 나타낼 수 있다. 추가로, 상기 재조합 엑소좀은 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합할 수 있고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성을 나타낼 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있으며, 바람직하게는 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부의 N-말단에 융합될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 신호 펩타이드가 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에 융합될 수 있다. 상기 신호 펩타이드는 상기 목적 단백질 또는 펩타이드로부터 유래된 것일 수 있거나 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부로부터 유래된 것일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 상기 엑소좀의 막을 통과하여 위치할 수 있고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 엑소좀의 표면 상에 위치할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 서열번호 1의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 적어도 하나의 Fc 결합 도메인이 제거될 수 있다. 바람직하게는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 2개 또는 3개의 Fc 결합 도메인이 제거될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀은, 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부의 막관통 도메인을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 막관통 도메인은 서열번호 2의 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀은, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 서열을 포함하도록 유전적으로 조작 또는 변형된 세포로부터 생산될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 엑소좀에 있어서, 상기 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 외인성 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인을 코딩하는 핵산 서열과의 융합없이 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물을 형질도입하여 수득될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 엑소좀에 있어서, 상기 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부를 자연적으로 발현하지 못하는 세포일 수 있다.

본 발명을 제한하지 않는 예시로서, 상기 Fc 수용체는 FcαRI(CD89), FcγRI(CD64), FcγRIIA(CD32), FcγRIIB1(CD32), FcγRIIB2(CD32), FcγRIIIA(CD16A), FcγRIIIB(CD16B), FcεRI, FcεRII(CD23), FcμR, Fcα/μR, 또는 FcRn일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 HEK293 세포, HEK293T 세포, Expi293F 세포, CHO 세포, SF9 곤충세포 또는 식물세포일 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 엑소좀에 있어서, 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 엑소좀의 표면 상에 위치한다.

본 발명의 일 구체예의 엑소좀에 있어서, 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부가 자체적으로 갖는 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인에 의해 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부가 엑소좀 표면 상에 제시될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀은, 과발현된 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 재조합 엑소좀에 있어서, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFITM1 단백질, IFITM2 단백질, IFITM3 단백질, ACE2(angiotensin-converting enzyme 2), sACE2(soluble angiotensin-converting enzyme 2), 바이러스 스파이크 단백질, 바이러스 스파이크 단백질 항체, 효소 등으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학 조성물 또는 화장료 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 주사제로 제조될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 상기 재조합 엑소좀과, 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 항종양 효과 증진용, 항암효과 증진용 또는 항바이러스용으로 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 암세포 사멸물질 또는 항바이러스 물질을 포함할 수 있다. 상기 암세포 사멸물질 또는 항바이러스 물질은 상기 재조합 엑소좀 표면 또는 내부에 위치할 수 있고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드 및/또는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부에 융합되어 위치할 수도 있다.

예를 들어, 상기 암세포 사멸물질은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 등의 사이토카인, 독소 단백질, 유전자 손상 유도 단백질, CRISPR-결합 단백질, 세포사멸 유도 단백질, 그랜자임 A, 그랜자임 B, 퍼포린, FAS 단백질, TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand) 단백질, PD-1, PD-L1, CTLA-4 등의 면역 체크포인트 단백질에 대한 항체, 항-CD47 항체, 항-EGFR 항체 등 암 특이적 항체들, T 세포 수용체(T Cell Receptor), NKG2D 등 면역세포 표면 단백질, 인터페론 유전자 자극인자(Stimulator of Interferon Genes; STING), STING 작용제(STING agonist), 알부민 결합 파클리탁셀, 악티노마이신, 알리트레티노인, 아자시티딘, 아자티오프린, 베바시주맙, 벡사토텐, 블레오마이신, 보테조밉, 카보플라틴, 카페시타빈, 세툭시맙, 시스플라틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에를로티닙, 에토포시드, 플루오로우라실, 게피티닙, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이마티닙, 이필리무맙, 이리노테칸, 라파티닙, 메클로레타민, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파니투무맙, 페메트렉세드, 리툭시맙, 타후르포시드, 테니포사이드, 티오구아닌, 토포테칸, 트레티노인, 발루비신, 베무라페닙, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 보리노스타트, 로미뎁신, 5-플루오로우라실(5-FU), 6-메르캅토퓨린(6-MP), 클라드리빈, 클로파라빈, 플록스유리딘, 플루다라빈, 펜토스타틴, 미토마이신, 익사베필론, 에스트라무스틴 등으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다. 그러나 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 항종양 또는 항암 물질이 사용될 수 있음은 물론이다.

예를 들어, 상기 항바이러스 물질은 IFITM1 단백질, IFITM2 단백질, IFITM3 단백질, ACE2(angiotensin-converting enzyme 2), sACE2(soluble angiotensin-converting enzyme 2), 바이러스 스파이크 단백질 항체 등으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다. 그러나 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 항바이러스 물질이 사용될 수 있음은 물론이다.

추가로, 본 발명은 전술한 바와 같은 약학 조성물을 포함하는 약물 전달 시스템을 제공한다.

본 발명의 일 구체예의 약물 전달 시스템은 항체를 더 포함할 수 있다. 상기 항체는 상기 재조합 엑소좀과 함께 병용 투여될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템에 있어서, 상기 항체는, 예를 들어, 3F8, 8H9, 아바고보맙, 아벨루맙, 압식시맙, 악토주맙, 아달리무맙, 아데카투무맙, 아두카누맙, 아펠리모맙, 아푸투주맙, 알라시주맙 페골, ALD518, 알렘투주맙, 알리로쿠맙, 알투모맙 펜테테이트, 아마툭시맙, 아나투모맙 마페나톡스, 아니프롤루맙, 안루킨주맙, 아폴리주맙, 아르시투모맙, 아셀리주맙, 아티누맙, 아틀리주맙, 아토롤리무맙, 바피뉴주맙, 바실릭시맙, 바비툭시맙, 벡투모맙, 벨리무맙, 벤랄리주맙, 베르틸리무맙, 베실레소맙, 베바시주맙, 베즐로톡수맙, 비시로맙, 비마그루맙, 비바투주맙 메르탄신, 블리나투모맙, 블로소주맙, 브렌툭시맙 베도틴, 브리아키누맙, 브로달루맙, 카나키누맙, 칸투주맙 메르탄신, 칸투주맙 라브탄신, 카플라시주맙, 카프로맙 펜데티드, 카를루맙, 카투막소맙, CC49, cBR96-독소루비신 면역 복합체, 세델리주맙, 세르톨리주맙 페골, 세툭시맙, Ch.14.18, 시타투주맙 보가톡스, 식수투무맙, 클라자키주맙, 클레놀릭시맙, 클리바투주맙 테트락세탄, 코나투무맙, 콘시주맙, 크레네주맙, CR6261, 다세투주맙, 다클리주맙, 달로투주맙, 다라투무맙, 뎀시주맙, 데노수맙, 데투모맙, 도를리모맙 아리톡스, 드로지투맙, 둘리고투맙, 듀필루맙, 듀시기투맙, 에크로멕시맙, 에쿨리주맙, 에도바코맙, 에드레콜로맙, 에팔리주맙, 에펀구맙, 엘델루맙, 엘로투주맙, 엘실리모맙, 에나바투주맙, 엔리모맙 페골, 에노키주맙, 에노티쿠맙, 엔시툭시맙, 에피투모맙 시툭세탄, 에프라투주맙, 에를리주맙, 에르투막소맙, 에타라시주맙, 에트롤리주맙, 에볼로쿠맙, 엑스비비루맙, 파놀레소맙, 파랄리모맙, 파를레투주맙, 파시누맙, FBTA05, 펠비주맙, 페자키누맙, 피클라투주맙, 피기투무맙, 플란보투맙, 폰톨리주맙, 포랄루맙, 포라비루맙, 프레소리무맙, 풀라누맙, 푸툭시맙, 갈릭시맙, 가니투맙, 간테네루맙, 간비리모맙, 겜투주맙 오조가마이신, 게보키주맙, 기렌툭시맙, 그렘바투무맙 베도틴, 골리무맙, 고밀릭시맙, 구셀쿠맙, 이발리주맙, 이브리투모맙 튜세탄, 이크루쿠맙, 이고보맙, 이필리무맙, IMAB362, 임시로맙, 임가투주맙, 인클라쿠맙, 인다툭시맙 라브탄신, 인플릭시맙, 인테투무맙, 이놀리모맙, 이노투주맙 오조가마이신, 이필리무맙, 이라투무맙, 이톨리주맙, 이제키주맙, 켈릭시맙, 라베투주맙, 람브롤리주맙, 람팔리주맙, 레브리키주맙, 레말레소맙, 레르델리무맙, 렉사투무맙, 리비비루맙, 리겔리주맙, 린투주맙, 리릴루맙, 로델시주맙, 로르보투주맙 메르탄신, 루카투무맙, 루밀릭시맙, 마파투무맙, 마르게툭시맙, 마슬리모맙, 마브릴리무맙, 마투주맙, 메폴리주맙, 메텔리무맙, 밀라투주맙, 민레투모맙, 미투모맙, 모가물리주맙, 모롤리무맙, 모타비주맙, 목세투모맙 파수도톡스, 무로모납-CD3, 나콜로맙 타페나톡스, 나밀루맙, 나프투모맙 에스타페나톡스, 나르나투맙, 나탈리주맙, 네바쿠맙, 네시투무맙, 네렐리모맙, 네스바쿠맙, 니모투주맙, 니볼루맙, 노페투모맙 메르펜탄, 오카라투주맙, 오크렐리주맙, 오둘리모맙, 오파투무맙, 올라라투맙, 올로키주맙, 오말리주맙, 오나르투주맙, 온툭시주맙, 오포르투주맙 모나톡스, 오레고보맙, 오르티쿠맙, 오텔릭시주맙, 오틀레르투주맙, 옥셀루맙, 오자네주맙, 오조랄리주맙, 파기박시맙, 팔리비주맙, 파니투무맙, 판코맙, 파노바쿠맙, 파르사투주맙, 파스콜리주맙, 파테클리주맙, 파트리투맙, 펨투모맙, 페라키주맙, 페르투주맙, 펙셀리주맙, 피딜리주맙, 피나투주맙 베도틴, 핀투모맙, 플라쿨루맙, 폴라투주맙 베도틴, 포네주맙, 프릴릭시맙, 프리톡삭시맙, 프리투무맙, PRO 140, 퀼리주맙, 라코투모맙, 라드레투맙, 라피비루맙, 라무시루맙, 라니비주맙, 락시바쿠맙, 레가비루맙, 레슬리주맙, 릴로투무맙, 리툭시맙, 로바투무맙, 로레두맙, 로모소주맙, 론탈리주맙, 로벨리주맙, 루플리주맙, 사말리주맙, 사릴루맙, 사투모맙 펜데티드, 세쿠키누맙, 세리반투맙, 세톡삭시맙, 사비루맙, 시브로투주맙, SGN-CD19A, SGN-CD33A, 시팔리무맙, 실툭시맙, 심투주맙, 시플리주맙, 시루쿠맙, 솔라네주맙, 솔리토맙, 소넵시주맙, 손투주맙, 스타물루맙, 술레소맙, 수비주맙, 타발루맙, 타카투주맙 테트락세탄, 타도시주맙, 탈리주맙, 타네주맙, 타플리투모맙 파프톡스, 테피바주맙, 텔리모맙 아리톡스, 테나투모맙, 테넬릭시맙, 테플리주맙, 테프로투무맙, TGN1412, 티실리무맙, 틸드라키주맙, 티가투주맙, TNX-650, 토실리주맙, 토랄리주맙, 토시투모맙, 벡사, 토베투맙, 트랄로키누맙, 트라스투주맙, TRBS07, 트레갈리주맙, 트레멜리무맙, 투코투주맙 셀모류킨, 투비루맙, 유블리툭시맙, 유레루맙, 우르톡사주맙, 우스테키누맙, 반티크투맙, 바팔릭시맙, 바텔리주맙, 베돌리주맙, 벨투주맙, 베팔리모맙, 베센쿠맙, 비실리주맙, 볼로식시맙, 보르세투주맙 마포도틴, 보투무맙, 잘루투무맙, 자놀리무맙, 자툭시맙, 지랄리무맙 및 졸리모맙 아리톡스로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다. 그러나 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 항체가 사용될 수 있음은 물론이다.

본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 면역 관련 질환, 암, 염증 질환, 바이러스 질환, 및/또는 기타 다양한 질환의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는데 사용될 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 과립제, 엘릭시르제(elixirs), 에어로졸 등의 경구투여용 제제, 외용제, 좌제, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 종양 내 투여, 관절 내 투여, 관절강 내 투여, 활액낭 내(intrasynovial) 투여, 흉골 내 투여, 수강 내(intrathecal) 투여, 병변 내 및 두개 내(intracranial) 투여, 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 림프 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 치료상 유효량은 질환 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 경구투여용 고형제제는 적어도 1종의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 상기 경구투여용 고형제제는 상기 부형제 이외에 실리카, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제(활택제)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 경구투여용 액상제제는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약물 전달용 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약물 전달용 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약물 전달용 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.

한편, 본 발명의 일 구체예의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장료 조성물에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다.

본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 화장품 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.

본 발명에 따르면, Fc 수용체 또는 이의 일부를 엑소좀에 효율적으로 로딩시킬 수 있다. 또한, 본 발명은 Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함하는 재조합 엑소좀을 제공할 수 있고, 이러한 재조합 엑소좀은 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하는 효능 및/또는 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성, 예를 들어 항암 효능, 면역 관련 효능 또는 항바이러스 효능 등을 함께 나타내는 장점이 있다.

한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.

도 1은 CD64 막관통 도메인(서열번호 2)의 N-말단 및 C-말단에 각각 CD64 신호 펩타이드 및 mGFP를 융합시킨 서열번호 3의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터 지도(pEF6_CD64TM_mGFP 벡터 지도)를 나타낸다.
도 2는 CD64 막관통 도메인(서열번호 2)의 N-말단 및 C-말단에 각각 단일사슬 IL-12 및 mGFP를 융합시킨 서열번호 4의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터 지도(pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터 지도)를 나타낸다.
도 3은 신호 펩타이드가 제거된 CD64(서열번호 1)의 N-말단 및 C-말단에 각각 단일사슬 IL-12 및 mGFP를 융합시킨 서열번호 5의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터 지도(pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터 지도)를 나타낸다.
도 4는 pEF6_CD64TM_mGFP 벡터, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터 및 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터 각각에 의해 트랙스펙션된 HEK293T 세포에서 형광이 관찰되는 것을 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 5a는 pEF6_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 CD64TM 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이고, 도 5b는 pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 CD64TM 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이며, 도 5c는 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 CD64 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이다.
도 6a는 pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 scIL-12의 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이고, 도 6b는 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 scIL-12의 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이다.
도 7a는 scIL12_CD64TM 엑소좀의 scIL-12 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이고, 도 7b는 scIL12_fCD64 엑소좀의 scIL-12 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이다.
도 8은 scIL12_fCD64 엑소좀 및 scIL12_CD64TM 엑소좀 모두에서 IL-12 단백질이 검출된 것을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.
도 9는 scIL12_fCD64 엑소좀 또는 scIL12_CD64TM 엑소좀이 처리된 NK-92 세포에서 엑소좀의 농도의존적으로 인터페론-감마(IFN-γ) 분비가 유도되는 것을 나타내는 인터페론-감마 ELISA 결과 그래프이다.
도 10은 APC 항-인간 Fc 단편 항체의 농도를 고정시키고 scIL12_fCD64 엑소좀의 농도(입자수/mL)를 증가시키면서 APC 항-인간 Fc 단편 항체와 scIL12_fCD64 엑소좀을 반응시킨 경우, 엑소좀 농도 증가에 따라 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 11은 scIL12_fCD64 엑소좀의 농도(입자수/mL)를 고정시키고 APC 항-인간 Fc 단편 항체의 농도를 증가시키면서 APC 항-인간 Fc 단편 항체와 scIL12_fCD64 엑소좀을 반응시킨 경우, 항체 농도 증가에 따라 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 12는 scIL12_fCD64 엑소좀의 농도(입자수/mL)를 고정시키고 APC 항-인간 EGFR 항체의 농도를 증가시키면서 APC 항-인간 EGFR 항체와 scIL12_fCD64 엑소좀을 반응시킨 경우, 항체 농도 증가에 따라 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 13은 scIL12_fCD64 엑소좀의 농도(입자수/mL)를 고정시키고 APC 항-인간 CD16 항체의 농도를 증가시키면서 APC 항-인간 CD16 항체와 scIL12_fCD64 엑소좀을 반응시킨 경우, 항체 농도 증가에 따라 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하는 것을 나타내는 그래프이다.
도 14는 scIL12_fCD64 엑소좀을 단독으로 처리한 그룹에 비해 scIL-12_fCD64 엑소좀과 항-CD16 항체를 병용 처리한 그룹이 NK-92 세포에서 인터페론-감마의 분비량을 크게 증가시킨 것을 나타내는 그래프이다.
도 15는 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 목적 융합 폴리펩타이드를 각각 발현하는 HEK293T 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 엑소좀 모두에서 V5 단백질이 검출된 것을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.

이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.

명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.

실시예

실시예 1: 목적 융합 폴리펩타이드를 발현하는 벡터의 제조

pEF6/V5-His A 벡터(#V96120, Invitrogen, USA에서 구입)의 멀티클로닝 부위 중 KpnI과 XbaI 부분을 각각 KpnI 제한효소 및 XbaI 제한효소를 이용하여 절단해 DNA를 선형화하였다. 이후, PCR을 통해 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드 각각을 코딩하는 유전자 단편을 증폭한 뒤 증폭된 유전자 단편 각각을 pEF6/V5-His A 벡터에 서브클로닝하였다(도 1 내지 도 3 참조).

서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드의 CD64 막관통 도메인(서열번호 2)과 mGFP 사이에는 링커(GGGGS)를 4번 반복하여 삽입하였다. 또한, 서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드의 단일사슬 IL-12와 CD64 막관통 도메인(서열번호 2) 사이에는 링커(GGGGS)를 3번 반복하여 삽입하였고, CD64 막관통 도메인(서열번호 2)과 mGFP의 사이에는 링커(GGGGS)를 4번 반복하여 삽입하였다. 추가로, 서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드의 단일사슬 IL-12와 신호 펩타이드가 제거된 CD64(서열번호 1) 사이에는 링커(GGGGS)를 3번 반복하여 삽입하였고, 신호 펩타이드가 제거된 CD64(서열번호 1)와 mGFP의 사이에는 링커(GGGGS)를 4번 반복하여 삽입하였다. 한편, 서열번호 4 또는 서열번호 5의 융합 폴리펩타이드의 N-말단에 위치하는 단일사슬 IL-12를 구성하는 IL-12B (서열번호 6)와 신호 펩타이드가 제거된 IL-12A(서열번호 7) 사이에는 링커(GGGGS)를 3번 반복하여 삽입하였다.

도 1에는 CD64 막관통 도메인(이하, "CD64TM"이라 함)의 N-말단 및 C-말단에 각각 CD64 신호 펩타이드 및 mGFP를 융합시킨 융합 폴리펩타이드(서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드)를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(이하, "pEF6_CD64TM_mGFP"라 함)가 도시되어 있다. 또한, 도 2에는 CD64TM의 N-말단 및 C-말단에 각각 단일사슬 IL-12(이하, "scIL12"라 함) 및 mGFP를 융합시킨 융합 폴리펩타이드(서열번호 4의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드)를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(이하, "pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP"라 함)가 도시되어 있다. 추가로, 도 3에는 신호 펩타이드가 제거된 CD64(이하, "fCD64"라 함)의 N-말단 및 C-말단에 각각 scIL12 및 mGFP를 융합시킨 융합 폴리펩타이드(서열번호 5의 아미노산 서열을 갖는 융합 폴리펩타이드)를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(이하, "pEF6_scIL12_fCD64_mGFP"라 함)가 도시되어 있다.

실시예 2: 세포의 배양 및 안정화 세포주 제작

형질도입에 사용할 HEK293T 세포(Horizon Discovery에서 구입)는 공급사의 권고에 따라 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS; ThermoFisher Scientific, USA에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics; ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)가 함유된 DMEM 배지(ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)에서 5% CO₂, 37^oC 조건 하에 계대 배양하였다.

실시예 1의 목적 융합 폴리펩타이드 각각을 안정적으로 발현하는 세포주 제작을 위해, 실시예 1에서 제작된 pEF6_CD64TM_mGFP 벡터, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터 및 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터 각각을 이펙텐 트랜스펙션 시약(Effectene Transfection Reagent; Qiagen, Germany에서 구입)을 이용하여 HEK293T 세포에 형질도입하였고, 형질도입 후 72시간 동안 배양하였다. 전술한 바와 같은 DMEM 배지에 10 μg/mL 블라스티시딘(Blasticidin)(Invivogen, USA에서 구입)을 첨가하여 3주 동안 배양하여 각 목적 융합 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 세포들만 선별하였다.

그리고 나서, 인큐사이트 S3(Incucyte S3; Sartorius, Germany에서 구입)를 이용하여, 상기와 같이 선별된 HEK293T 세포 내 목적 융합 폴리펩타이드 발현 여부를 확인하였다. 실시예 1에서 제작된 3가지 벡터 모두 mGFP 유전자를 포함하고 있으므로 이들 벡터 각각이 HEK293T 세포에 정상적으로 형질도입되어 세포 내에서 안정적으로 발현된 경우 HEK293T 세포 내에서 형광이 관찰되어야 한다. 형광현미경으로 이미지를 촬영한 결과, pEF6_CD64TM_mGFP 벡터, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터 및 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터 각각이 형질도입된 HEK293T 세포에서 형광이 관찰되었다(도 4). 따라서, 실시예 1에서 제작된 3가지 벡터 각각은 HEK293T 세포에 정상적으로 형질도입되었고, 이들 벡터 각각에 의해 코딩되는 각 목적 융합 폴리펩타이드는 HEK293T 세포에서 정상적으로 발현된 것을 알 수 있다.

각 세포 표면에서의 CD64 또는 CD64TM의 함량(또는 발현량)을 확인하기 위해, 상기 3가지 벡터 각각에 의해 형질감염된 HEK293T 세포를 "APC 마우스 IgG1, κ 이소타입 대조군 항체" 또는 "APC 항-인간 CD64 항체(BioLegend, USA에서 구입)"를 이용하여 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 이후 노보사이트 2000R(Novocyte 2000R) 유세포분석기(Agilent, USA에서 구입)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다(도 5a 내지 도 5c). 도 5a는 pEF6_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 CD64TM 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이고, 도 5b는 pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 CD64TM 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이며, 도 5c는 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 CD64 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이다.

또한, CD64TM 또는 CD64의 N 말단 부분에 융합된 scIL-12의 함량(또는 발현량)을 확인하기 위해, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터 및 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터 각각에 의해 형질감염된 HEK293T 세포를 "APC 마우스 IgG1, κ 이소타입 대조군 항체" 또는 "APC 항-인간 IL-12 항체(Abcam, UK에서 구입)"를 이용하여 4℃에서 30분 동안 염색하였다. 이후 노보사이트 2000R(Novocyte 2000R) 유세포분석기(Agilent, USA에서 구입)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다(도 6a 및 도 6b). 도 6a는 pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 scIL-12의 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이고, 도 6b는 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 HEK293 세포에서의 scIL-12의 함량을 나타내는 유세포분석 그래프이다.

상기 결과들로부터, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 후 마커 선택과정을 거쳐 안정화된 HEK293 세포는 CD64TM과 scIL12를 안정적으로 발현시키고 이들의 함량이 역시 높은 것을 확인할 수 있었고, pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터에 의해 형질감염된 후 마커 선택과정을 거쳐 안정화된 HEK293 세포 역시 CD64와 scIL12를 안정적으로 발현시키고 이들의 함량이 역시 높은 것을 확인할 수 있었다.

실시예 3: 목적 융합 폴리펩타이드를 발현하는 엑소좀 분리

실시예 2에서 제작한 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 목적 융합 폴리펩타이드를 각각 발현하는 HEK293T 안정화 세포주를 각각 175T 세포배양 플라스크에 8.75×10⁶ 개 분주하고 5% CO₂, 37^oC 조건에서 배양하였다. 다음 날 1% 엑소좀-제거 우태아혈청(exosome-depleted FBS; System Biosciences, USA에서 구입), 1% 항생제-항진균제 및 10 μg/mL 블라스티시딘(Blasticidin)(Invivogen, USA에서 구입)이 함유된 Opti-MEM (ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)으로 배양액을 교체하고 48시간 동안 5% CO₂, 37^°C 조건에서 배양하였다.

이후 세포배양 상층액을 모두 취하고, 이를 0.22 μm PES 바틀탑 (PES Bottle top) 필터(제품명: S2GPT05RE; Merck, Germany에서 구입)로 여과하였다. 그리고 나서, 아미콘　울트라-15 원심분리용 100kDa 필터유닛(Amicon　Ultra-15 Centrifugal 100 kDa Filter Unit; Merck, Germany에서 구입)을 이용해 상층액 2 L를 4℃에서 1시간 동안 농축하였다. 농축액을 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline; Gibco, USA에서 구입)에 현탁한 후, 초고속원심분리기(Beckman Coulter, Optima XE-100)에 넣고 100,000×g 에서 3시간 동안 원심분리를 하였다. 그 후 상층액을 모두 제거하고 엑소좀 펠렛을 500 μL의 DPBS에 현탁한 후 마이크로 BCA 어세이(microBCA assay)(ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)를 이용하여 단백질 농도를 정량하였고, 나노입자분석기(Zetaview; Particle Matrix, Germany에서 구입)를 이용하여 엑소좀 입자수를 측정하였다. 이후 각 엑소좀은 사용하기 전까지 -80℃에서 보관하였다.

실시예 4: 엑소좀에서 목적 융합 폴리펩타이드의 로딩 여부 확인

실시예 3에서 분리한 각 엑소좀에서 IL-12의 로딩을 확인하기 위해, CD81 다이나비드(Dynabead)(ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)를 이용하여 엑소좀을 포획하였다. 이는 엑소좀의 크기가 작아 일반적인 유세포 분석기로 분석이 불가능하기 때문에 2.7 μm 비드를 이용하여 엑소좀만 포획하는 방법이다. pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터 및 pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터 각각을 발현하는 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 각각의 엑소좀을 "APC 마우스 IgG1, κ 이소타입 대조군 항체" 또는 "APC 항-인간 IL-12 p40 항체"(BioLegend, USA에서 구입)를 이용하여 상온에서 1시간 동안 염색하였다. 이후 노보사이트 2000R(Novocyte 2000R) 유세포분석기(Agilent, USA에서 구입)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. 그 결과, pEF6_scIL12_CD64TM_mGFP 벡터를 발현하는 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 엑소좀(이하, "scIL12_CD64TM_mGFP 엑소좀" 또는 "scIL12_CD64TM 엑소좀"이라 함)에서 IL-12의 로딩이 확인되었고(도 7a), pEF6_scIL12_fCD64_mGFP 벡터를 발현하는 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 엑소좀(이하, "scIL12_fCD64_mGFP 엑소좀" 또는 "scIL12_fCD64 엑소좀"이라 함)에서 IL-12의 로딩이 확인되었다(도 7b).

또한, scIL12_CD64TM 엑소좀 및 scIL12_fCD64 엑소좀 각각에 목적 융합 폴리펩타이드가 로딩되었는지 확인하기 위해 각각의 엑소좀 펠렛을 1X RIPA 버퍼 (Cell Signaling, USA에서 구입)를 이용하여 용해한 후 분리한 단백질을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 이후 SDS-PAGE 수행 결과물을 PVDF 멤브레인(Merck, Germany에서 구입)에 트랜스퍼한 후 항-IL12 p40 항체(1:1000, Abcam, UK에서 구입) 또는 항-V5 항체(1:1,000, Abcam, UK에서 구입)를 이용하여 1차 항체반응을 한 뒤 페록시다아제 아피니퓨어 염소 항-마우스 IgG(Peroxidase AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG)(1:100,000, Jackson ImmunoResearch, USA에서 구입)를 이용하여 2차 항체반응을 수행하였다. 이후 애머샴 이미저 680(Amersham Imager 680)(Cytiva, USA에서 구입)을 이용하여 엑소좀에 존재하는 IL-12 단백질 또는 V5 단백질을 검출하였다.

그 결과, 서열번호 4의 목적 융합 폴리펩타이드를 발현하는 HEK293T 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 엑소좀(도 8에서 "pEF6_scIL12_CD64tm_mG"로 표시)과, 서열번호 5의 목적 융합 폴리펩타이드를 발현하는 HEK293T 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 엑소좀(도 8에서 "pEF6_scIL12_fCD64_mG"로 표시) 모두에서 IL-12 단백질이 검출되었다(도 8).

또한, 서열번호 3, 서열번호 4 및 서열번호 5의 목적 융합 폴리펩타이드를 각각 발현하는 HEK293T 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 엑소좀 모두에서 V5 단백질이 검출되었다(도 15). 이로부터 각 엑소좀에 목적 융합 폴리펩타이드가 정상적으로 로딩된 것을 확인하였다.

실시예 5: IL-12가 로딩된 엑소좀의 NK 세포 자극효과 확인

인터루킨 12(Interleukin 12, IL-12)는 대식세포, 수지상 세포 등의 항원전달세포(antigen presenting cells)로부터 분비되어 자연살해 세포(NK 세포)와 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL)를 활성화시키는 사이토카인이다. IL-12 자극에 의해 활성화된 면역세포들은 자체 세포살해능력이 증가할 뿐만 아니라 인터페론-감마(IFN-γ)를 분비하여 주변의 타입1 조력 T 세포(Th1) 분화를 촉진시켜 면역 세포들의 항암효과를 증진시킨다. 이러한 강력한 항암효과를 나타내는 IL-12를 이용한 치료제 개발이 활발하게 이루어지고 있지만, IL-12 재조합단백질은 체내 반감기가 짧고 전신독성을 일으키는 한계점을 지니고 있다. 엑소좀은 목적 단백질을 표면에 로딩하여 목적 단백질의 반감기를 증가시킬 수 있고 종양미세환경에 효율적으로 전달될 수 있어 차세대 약물전달시스템(drug delivery system)으로서 최근 각광을 받고 있다.

실시예 4에서는 scIL12_CD64TM 엑소좀 및 scIL12_fCD64 엑소좀 모두에서 IL-12의 로딩을 확인하였다. 본 실시예는 이들 엑소좀에 로딩된 IL-12가 NK 세포를 자극하여 인터페론-감마의 분비를 유도할 수 있는지 여부를 확인하고자 수행되었다.

배양 중인 NK-92 세포를 48-웰 플레이트의 각 웰에 1×10⁵ 세포/250 μL로 접종하였다. 음성대조군(NC)인 250 μL의 세포 배양액을 NK-92 세포에 처리하였고, 양성대조군(Positive Control)인 20 ng의 재조합 IL-12(도 9에서 "rIL-12"로 표시)(R&D Systems, USA에서 구입)를 250 μL의 세포 배양액에 희석하여 NK-92 세포에 처리하였다. 또한, scIL12_fCD64 엑소좀(도 9에서 "scIL12_fCD64 exo"로 표시) 및 scIL12_CD64TM 엑소좀(도 9에서 "scIL12_CD64tm exo"로 표시)의 단백질 함량을 측정하였고, 각 엑소좀의 단백질 함량이 5 μg, 10 μg 및 20 μg이 되도록 조정한 후, 각 농도별 엑소좀을 250 μL의 세포 배양액에 희석하여 NK-92 세포에 처리하였다. 처리 후 NK-92 세포를 5% CO₂, 37^oC 조건에서 48시간 배양하였다.

48시간 후, scIL12_fCD64 엑소좀(5 μg, 10 μg 및 20 μg)과 scIL12_CD64TM 엑소좀(5 μg, 10 μg 및 20 μg)이 각각 처리된 NK-92 세포의 배양 상층액 100 μL를 수득하고, IFN-γ ELISA 키트(R&D Systems, USA에서 구입)를 이용하여 수득된 상층액 내의 IFN-γ 양, 즉 scIL12_fCD64 엑소좀(5 μg, 10 μg 및 20 μg)과 scIL12_CD64TM 엑소좀(5 μg, 10 μg 및 20 μg) 처리에 의해 NK-92 세포에서 분비된 IFN-γ 양을 측정하였다. 그 결과, scIL12_fCD64 엑소좀 또는 scIL12_CD64TM 엑소좀에 의해 처리된 NK-92 세포에서 엑소좀의 농도의존적으로 IFN-γ 분비가 유도되는 것이 확인되었다(도 9). 따라서, 본 발명에 따라 엑소좀에 로딩된 IL-12는 NK 세포를 자극하여 IFN-γ 분비를 유도할 수 있는 것을 알 수 있다.

실시예 6: 엑소좀의 Fc 도메인 결합 능력 확인

대식세포, 수지상세포 등의 면역세포 표면에 발현되고 있는 CD64는 항체의 불변 영역으로 이루어진 Fc 도메인에 결합한다. 이는 면역세포가 항원과 결합된 항체를 인지하여 항원 특이적인 면역반응을 일으킬 수 있도록 한다.

실시예 5에서는 scIL12_fCD64 엑소좀에 로딩된 IL-12의 IFN-γ 분비 유도 효능을 확인하였다. 본 실시예에서는 IFN-γ 분비 유도의 효능을 갖는 scIL12_fCD64 엑소좀에 로딩된 CD64가 항체 결합 기능을 갖는지 여부를 확인하였다. 이를 위해 본 실시예에서는 항체가 scIL12_fCD64 엑소좀의 표면에 결합하는 것을 확인하였다.

우선, scIL12_fCD64 엑소좀의 입자수에 따른 항체 결합능을 확인하기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다. 실시예 3에서 분리한 scIL12_fCD64 엑소좀을 다량으로 모아 풀링하여 고농도의 scIL12_fCD64 엑소좀을 준비한 후 CD63 다이나비드(Dynabead)(ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)를 이용하여 scIL12_fCD64 엑소좀을 포획하였다. APC 항-인간 FC 단편 항체(Jackson immunoresearch, USA에서 구입)의 양을 2 μg으로 고정하였고, scIL12_fCD64 엑소좀을 APC 항-인간 FC 단편 항체와 상온에서 1시간 동안 반응시켜 염색하였다. 이후 노보사이트 2000R(Novocyte 2000R) 유세포분석기(Agilent, USA에서 구입)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였다. 그 결과, scIL12_fCD64 엑소좀 농도의 증가에 따라 APC로부터의 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하였고, 1×10⁹입자수/mL의 농도부터는 MFI가 현저히 높았다(도 10). 상기 결과는 scIL12_fCD64 엑소좀 표면에 존재하는 CD64가 항체의 Fc 도메인과 정상적으로 결합하는 것을 의미한다. 따라서, CD64가 로딩된 scIL12_fCD64 엑소좀은 암세포 및/또는 면역세포 특이적인 항체의 Fc 도메인과 결합하여 암세포 및/또는 면역세포를 향해 표적화될 수 있다.

또한, scIL12_fCD64 엑소좀이 암세포 및/또는 면역세포로 표적화되기 위해서는 암세포 및/또는 면역세포 특이적인 다양한 항체와 결합할 수 있어야 한다. 따라서, scIL12_fCD64 엑소좀이 APC 항-인간 FC 단편 항체 외에 또 다른 항체들과 결합할 수 있는지 여부를 확인하였다.

다이나비드로 포획한 scIL12_fCD64 엑소좀의 농도를 1×10⁹입자수/mL (최종 농도)로 고정하였고, scIL12_fCD64 엑소좀을 APC 항-인간 FC 단편 항체, APC 항-인간 EGFR 항체(R&D bioscience, USA에서 구입) 또는 APC 항-인간 CD16 항체(Abcam, UK에서 구입)와 상온에서 1시간 동안 반응시켜 염색하였다. 이후 노보사이트 2000R(Novocyte 2000R) 유세포분석기(Agilent, USA에서 구입)를 이용하여 유세포 분석을 수행하였고, 항체의 농도의존적으로 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하는지 여부를 확인하였다.

그 결과, APC 항-인간 FC 단편 항체, APC 항-인간 EGFR 항체 및 APC 항-인간 CD16 항체의 농도 증가에 따라 APC로부터의 MFI(mean fluorescence intensity)가 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 11 내지 도 13). 상기 결과들은 scIL12_fCD64 엑소좀의 표면에 존재하는 CD64가 다양한 항체의 Fc 도메인과 정상적으로 결합하는 것을 의미하고, scIL12_fCD64 엑소좀의 표면에 CD64가 높은 밀도로 존재하기 때문에 Fc 도메인을 갖는 항체의 결합능이 농도의존적으로 증가하는 것을 의미한다. 따라서, CD64가 로딩된 scIL12_fCD64 엑소좀은 암세포 및/또는 면역세포 특이적인 항체의 Fc 도메인과 결합하여 암세포 및/또는 면역세포를 향해 표적화될 수 있다.

실시예 7: scIL12_fCD64 엑소좀과 면역세포 특이적인 항체와의 결합으로 인한 면역세포 활성화 증가 확인

항체를 이용한 표적 항암제는 암세포에 특이적인 항원에 결합하여 항암 효과를 나타낸다. 본 발명의 Fc 수용체(예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16) 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드(예를 들어, IL-12, IL-7 등)를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀은 그 표면에 Fc 수용체(예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16) 또는 이의 일부와, IL-12, IL-7 등의 목적 단백질 또는 펩타이드가 존재하게 된다.

예를 들어, Fc 수용체(예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16) 또는 이의 일부에 IL-12, IL-7 등의 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 표면에 포함하는 엑소좀의 경우, Fc 수용체(예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16) 또는 이의 일부가 항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하고 IL-12, IL-7 등은 항암 효능을 나타낼 수 있다. 따라서 Fc 수용체(예를 들어, CD64, CD32 또는 CD16) 또는 이의 일부와 IL-12, IL-7 등의 목적 단백질 또는 펩타이드를 모두 포함하는 엑소좀을 항체 항암제와 함께 암환자에게 병용 투여하면 Fc 도메인을 갖는 항체 항암제가 작용하는 암세포에 대한 추가적이고 표적 특이적인 공격이 가능하여 항암 효과를 증가시킬 수 있다.

본 실시예에서는 scIL12_fCD64 엑소좀과, NK 세포 표면에 제시된 CD16을 표적화할 수 있는 항-CD16 항체를 병용투여한 경우, NK 세포에서의 인터페론-감마 유도능력의 변화를 확인하였다. NK 세포는 표면에 CD16을 강하게 발현하고 있다. 항-CD16 항체와 scIL12_fCD64 엑소좀의 병용투여가 scIL12_fCD64 엑소좀의 단독투여 보다 우수한 인터페론-감마 유도능력을 나타낸다면, 이는 scIL-12_fCD64 엑소좀이 NK 세포를 향해 효율적으로 표적화되는 것을 의미한다. 즉, 상기 결과는 scIL-12_fCD64 엑소좀의 CD64가 항-CD16 항체의 Fc 도메인에 결합하여 scIL-12_fCD64 엑소좀과 항-CD16 항체의 복합체를 형성하고, 복합체의 항-CD16 항체에 의해 NK 세포를 향해 효율적으로 표적화되는 scIL-12_fCD64 엑소좀의 IL-12는 NK 세포에서 인터페론-감마 유도를 향상시키는 것을 의미한다.

10 μg의 항-CD16 항체를 scIL-12_fCD64 엑소좀(최종 농도: 1×10⁹ 입자수/mL)과 섞은 후 훌라믹서 샘플 혼합기(hulamixer sample mixer, Thermofisher, USA에서 구입)를 이용하여 4℃에서 1시간 반응시켰다. 그 후, 비특이적 결합 항체는 초고속원심분리를 이용하여 제거하였고, 항-CD16 항체가 결합된 scIL-12_fCD64 엑소좀(이하, "scIL-12_fCD64 엑소좀-항-CD16"라 함)은 0.1 ㎛ 시린지 필터(제품명: SLVVR33RS; Merck, Germany에서 구입)를 통해 여과한 DPBS 완충액과 혼합하여 사용하였다.

배양 중인 NK-92 세포를 48-웰 플레이트의 각 웰에 1×10⁵ 세포/250 μL로 접종하였다. 음성대조군(NC)인 250 μL의 세포 배양액을 NK-92 세포에 처리하였고, 양성대조군(Positive Control)인 20 ng의 재조합 IL-12(도 14에서 "rIL-12"로 표시)(R&D Systems, USA에서 구입)를 250 μL의 세포 배양액에 희석하여 NK-92 세포에 처리하였다.

또한, scIL12_fCD64 엑소좀(최종 농도: 1×10⁹ 입자수/mL)을 250 μL의 세포 배양액에 희석하여 NK-92 세포에 처리하였고, 전술한 바와 같이 준비된 scIL-12_fCD64 엑소좀-항-CD16을 250 μL의 세포 배양액에 희석하여 NK-92 세포에 처리하였다. 처리 후 NK-92 세포를 5% CO₂, 37℃ 조건에서 48시간 배양하였다.

48시간 후, scIL12_fCD64 엑소좀 단독과 scIL-12_fCD64 엑소좀-항-CD16이 처리된 NK-92 세포의 배양 상층액 100 μL를 수득하고, IFN-γ ELISA 키트(R&D Systems, USA에서 구입)를 이용하여 수득된 상층액 내의 IFN-γ 양, 즉 scIL12_fCD64 엑소좀 단독과 scIL-12_fCD64 엑소좀-항-CD16 처리에 의해 NK-92 세포에서 분비된 IFN-γ 양을 측정하였다.

그 결과, scIL12_fCD64 엑소좀 단독을 처리한 그룹에 비해 scIL-12_fCD64 엑소좀-항-CD16을 처리한 그룹이 NK-92 세포에서 인터페론-감마의 분비량을 크게 증가시킨 것을 확인할 수 있었다(도 14). 상기 결과로부터, 항-CD16 항체와 scIL12_fCD64 엑소좀을 병용투여하면, scIL-12_fCD64 엑소좀의 CD64는 항-CD16 항체의 Fc 도메인과 결합하여 scIL-12_fCD64 엑소좀과 항-CD16 항체의 복합체를 형성하고, 복합체의 항-CD16 항체에 의해 scIL-12_fCD64 엑소좀은 NK 세포를 향해 효율적으로 표적화되는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 복합체의 항-CD16 항체에 의해 NK-92 세포를 향해 효율적으로 표적화되는 scIL-12_fCD64 엑소좀의 IL-12는 표적화의 결과로 NK 세포를 보다 효율적으로 활성화시켜 NK-92 세포에서의 인터페론-감마 유도 효과를 향상시킬 수 있다.

이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.

<110> ExoCoBio Inc. <120> Recombinant exosome comprising Fc receptor or its part which can be fused to target protein or peptide and its use <130> P21-0122KR <150> KR 10-2021-0008729 <151> 2021-01-21 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 359 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> fCD64 without signal peptide <400> 1 Gln Val Asp Thr Thr Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val 1 5 10 15 Ser Val Phe Gln Glu Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His 20 25 30 Leu Pro Gly Ser Ser Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr 35 40 45 Gln Thr Ser Thr Pro Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp 50 55 60 Ser Gly Glu Tyr Arg Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro 65 70 75 80 Ile Gln Leu Glu Ile His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser 85 90 95 Arg Val Phe Thr Glu Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp 100 105 110 Lys Asp Lys Leu Val Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala 115 120 125 Phe Lys Phe Phe His Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn 130 135 140 Ile Ser His Asn Gly Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg 145 150 155 160 Tyr Thr Ser Ala Gly Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala 165 170 175 Pro Val Leu Asn Ala Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu 180 185 190 Val Thr Leu Ser Cys Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu 195 200 205 Gln Leu Tyr Phe Ser Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg 210 215 220 Asn Thr Ser Ser Glu Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser 225 230 235 240 Gly Leu Tyr Trp Cys Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys 245 250 255 Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr 260 265 270 Pro Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe 275 280 285 Leu Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg 290 295 300 Lys Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys 305 310 315 320 Lys Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu 325 330 335 Lys Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg 340 345 350 Lys Glu Pro Gln Gly Ala Thr 355 <210> 2 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD64 transmembrane (CD64 TM) <400> 2 Asn Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu 1 5 10 15 Gln Leu Pro Thr Pro Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val 20 25 30 Gly Ile Met Phe Leu Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys 35 40 45 Glu Leu Lys Arg Lys Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser 50 55 60 Gly His Glu Lys Lys Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu 65 70 75 80 Glu Glu Glu Leu Lys Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu 85 90 95 Gly Val His Arg Lys Glu Pro Gln Gly Ala Thr 100 105 <210> 3 <211> 380 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CD64TM_mGFP vector <400> 3 Met Trp Phe Leu Thr Thr Leu Leu Leu Trp Val Pro Val Asp Gly Asn 1 5 10 15 Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln 20 25 30 Leu Pro Thr Pro Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly 35 40 45 Ile Met Phe Leu Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile 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Phe 260 265 270 Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn 275 280 285 Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys 290 295 300 Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu 305 310 315 320 Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu 325 330 335 Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp 340 345 350 Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala 355 360 365 Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 370 375 380 <210> 4 <211> 920 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scIL12_CD64TM_mGFP vector <400> 4 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 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Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala 290 295 300 Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 305 310 315 320 Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 325 330 335 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp 340 345 350 Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala 355 360 365 Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro 370 375 380 Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr 385 390 395 400 Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser 405 410 415 Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu 420 425 430 Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile 435 440 445 Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala 450 455 460 Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met 465 470 475 480 Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu 485 490 495 Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr 500 505 510 Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val 515 520 525 Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser Gly Gly Gly Gly 530 535 540 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asn Val Leu Lys Arg 545 550 555 560 Ser Pro Glu Leu Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro 565 570 575 Val Trp Phe His Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu 580 585 590 Val Asn Thr Val Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys 595 600 605 Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys 610 615 620 Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys 625 630 635 640 Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys 645 650 655 Glu Pro Gln Gly Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 660 665 670 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Lys Gly Glu Glu 675 680 685 Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val 690 695 700 Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr 705 710 715 720 Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro 725 730 735 Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys 740 745 750 Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser 755 760 765 Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp 770 775 780 Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr 785 790 795 800 Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly 805 810 815 Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val 820 825 830 Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys 835 840 845 Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr 850 855 860 Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn 865 870 875 880 His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys 885 890 895 Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr 900 905 910 His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 915 920 <210> 5 <211> 1172 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> scIL12_fCD64_mGFP vector <400> 5 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 90 95 Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 125 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 165 170 175 Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu 180 185 190 Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 195 200 205 Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr 210 215 220 Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 225 230 235 240 Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp 245 250 255 Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr 260 265 270 Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg 275 280 285 Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala 290 295 300 Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 305 310 315 320 Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly 325 330 335 Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp 340 345 350 Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala 355 360 365 Val Ser Asn Met Leu Gln Lys Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro 370 375 380 Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr 385 390 395 400 Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser 405 410 415 Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu 420 425 430 Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile 435 440 445 Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala 450 455 460 Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met 465 470 475 480 Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu 485 490 495 Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr 500 505 510 Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val 515 520 525 Thr Ile Asp Arg Val Met Ser Tyr Leu Asn Ala Ser Gly Gly Gly Gly 530 535 540 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Val Asp Thr Thr 545 550 555 560 Lys Ala Val Ile Thr Leu Gln Pro Pro Trp Val Ser Val Phe Gln Glu 565 570 575 Glu Thr Val Thr Leu His Cys Glu Val Leu His Leu Pro Gly Ser Ser 580 585 590 Ser Thr Gln Trp Phe Leu Asn Gly Thr Ala Thr Gln Thr Ser Thr Pro 595 600 605 Ser Tyr Arg Ile Thr Ser Ala Ser Val Asn Asp Ser Gly Glu Tyr Arg 610 615 620 Cys Gln Arg Gly Leu Ser Gly Arg Ser Asp Pro Ile Gln Leu Glu Ile 625 630 635 640 His Arg Gly Trp Leu Leu Leu Gln Val Ser Ser Arg Val Phe Thr Glu 645 650 655 Gly Glu Pro Leu Ala Leu Arg Cys His Ala Trp Lys Asp Lys Leu Val 660 665 670 Tyr Asn Val Leu Tyr Tyr Arg Asn Gly Lys Ala Phe Lys Phe Phe His 675 680 685 Trp Asn Ser Asn Leu Thr Ile Leu Lys Thr Asn Ile Ser His Asn Gly 690 695 700 Thr Tyr His Cys Ser Gly Met Gly Lys His Arg Tyr Thr Ser Ala Gly 705 710 715 720 Ile Ser Val Thr Val Lys Glu Leu Phe Pro Ala Pro Val Leu Asn Ala 725 730 735 Ser Val Thr Ser Pro Leu Leu Glu Gly Asn Leu Val Thr Leu Ser Cys 740 745 750 Glu Thr Lys Leu Leu Leu Gln Arg Pro Gly Leu Gln Leu Tyr Phe Ser 755 760 765 Phe Tyr Met Gly Ser Lys Thr Leu Arg Gly Arg Asn Thr Ser Ser Glu 770 775 780 Tyr Gln Ile Leu Thr Ala Arg Arg Glu Asp Ser Gly Leu Tyr Trp Cys 785 790 795 800 Glu Ala Ala Thr Glu Asp Gly Asn Val Leu Lys Arg Ser Pro Glu Leu 805 810 815 Glu Leu Gln Val Leu Gly Leu Gln Leu Pro Thr Pro Val Trp Phe His 820 825 830 Val Leu Phe Tyr Leu Ala Val Gly Ile Met Phe Leu Val Asn Thr Val 835 840 845 Leu Trp Val Thr Ile Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys Lys Lys Trp Asp 850 855 860 Leu Glu Ile Ser Leu Asp Ser Gly His Glu Lys Lys Val Ile Ser Ser 865 870 875 880 Leu Gln Glu Asp Arg His Leu Glu Glu Glu Leu Lys Cys Gln Glu Gln 885 890 895 Lys Glu Glu Gln Leu Gln Glu Gly Val His Arg Lys Glu Pro Gln Gly 900 905 910 Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly 915 920 925 Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly 930 935 940 Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys 945 950 955 960 Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu 965 970 975 Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro 980 985 990 Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr 995 1000 1005 Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu 1010 1015 1020 Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr 1025 1030 1035 1040 Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg 1045 1050 1055 Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly 1060 1065 1070 His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala 1075 1080 1085 Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn 1090 1095 1100 Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr 1105 1110 1115 1120 Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser 1125 1130 1135 Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met 1140 1145 1150 Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp 1155 1160 1165 Glu Leu Tyr Lys 1170 <210> 6 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12B <400> 6 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 90 95 Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 125 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 165 170 175 Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu 180 185 190 Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 195 200 205 Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr 210 215 220 Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 225 230 235 240 Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp 245 250 255 Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr 260 265 270 Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg 275 280 285 Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala 290 295 300 Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 305 310 315 320 Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 325 <210> 7 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12A without signal peptide <400> 7 Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu 1 5 10 15 His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys 20 25 30 Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp 35 40 45 His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu 50 55 60 Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr 65 70 75 80 Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe 85 90 95 Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr 100 105 110 Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys 115 120 125 Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu 130 135 140 Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser 145 150 155 160 Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu 165 170 175 Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser 180 185 190 Tyr Leu Asn Ala Ser 195

Claims

목적 단백질 또는 펩타이드가 융합가능한 Fc 수용체 또는 이의 일부를 포함하는, 재조합 엑소좀.
제1항에 있어서,
상기 Fc 수용체 또는 이의 일부에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함하는, 재조합 엑소좀.
제1항 또는 제2항에 있어서,
항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하는, 재조합 엑소좀.
제2항에 있어서,
상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성을 나타내는, 재조합 엑소좀.
제2항에 있어서,
항체의 Fc 도메인에 대해 특이적으로 결합하고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 생리활성을 나타내는, 재조합 엑소좀.
제2항에 있어서,
상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부의 N-말단 또는 C-말단에 융합되는, 재조합 엑소좀.
제6항에 있어서,
상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부의 N-말단에 융합되는, 재조합 엑소좀.
제2항에 있어서,
신호 펩타이드가 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에 융합되는, 재조합 엑소좀.
제8항에 있어서,
상기 신호 펩타이드는 상기 목적 단백질 또는 펩타이드로부터 유래되거나 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부로부터 유래된 것인, 재조합 엑소좀.
제2항에 있어서,
상기 융합 폴리펩타이드는 상기 엑소좀의 막을 통과하여 위치하고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 엑소좀의 표면 상에 위치하는, 재조합 엑소좀.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 서열번호 1의 폴리펩타이드를 포함하는, 재조합 엑소좀.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 적어도 하나의 Fc 결합 도메인이 제거된, 재조합 엑소좀.
제12항에 있어서,
상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 2개 또는 3개의 Fc 결합 도메인이 제거된, 재조합 엑소좀.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 Fc 수용체 또는 이의 일부의 막관통 도메인을 포함하는, 재조합 엑소좀.
제14항에 있어서,
상기 막관통 도메인은 서열번호 2의 폴리펩타이드를 포함하는, 재조합 엑소좀.
제2항에 있어서,
상기 목적 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 포함하도록 유전적으로 조작 또는 변형된 세포로부터 생산되는, 재조합 엑소좀.
제16항에 있어서,
상기 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 외인성 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인을 코딩하는 핵산 서열과의 융합없이 상기 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물을 형질도입하여 수득되는, 재조합 엑소좀.
제16항 또는 제17항에 있어서,
상기 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부를 자연적으로 발현하지 못하는 세포인, 재조합 엑소좀.
제18항에 있어서,
상기 유전적으로 조작 또는 변형된 세포는 HEK293 세포, HEK293T 세포 또는 Expi293F 세포인 것을 특징으로 하는, 재조합 엑소좀.
제16항 또는 제17항에 있어서,
상기 Fc 수용체 또는 이의 일부는 엑소좀의 표면 상에 위치하는, 재조합 엑소좀.
제20항에 있어서,
상기 Fc 수용체 또는 이의 일부가 자체적으로 갖는 막관통 단백질 또는 이의 막관통 도메인에 의해 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부가 엑소좀 표면 상에 제시되는, 재조합 엑소좀.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IFITM1 단백질, IFITM2 단백질, IFITM3 단백질, ACE2(angiotensin-converting enzyme 2), sACE2(soluble angiotensin-converting enzyme 2), 바이러스 스파이크 단백질, 바이러스 스파이크 단백질 항체 또는 효소 중 적어도 1종인, 재조합 엑소좀.
제2항의 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 약학 조성물.
제23항에 있어서,
약리학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는, 약학 조성물.
제24항에 있어서,
항종양 효과 증진용, 항암효과 증진용 또는 항바이러스용인, 약학 조성물.
제25항에 있어서,
암세포 사멸물질 또는 항바이러스 물질을 포함하는, 약학 조성물.
제26항에 있어서,
상기 암세포 사멸물질 또는 항바이러스 물질은 상기 재조합 엑소좀 표면 또는 내부에 위치하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제27항에 있어서,
상기 암세포 사멸물질 또는 항바이러스 물질은 상기 목적 단백질 또는 펩타이드 및/또는 상기 Fc 수용체 또는 이의 일부에 융합되어 위치하는 것을 특징으로 하는, 약학 조성물.
제23항 내지 제28항 중 어느 한 항에 기재된 약학 조성물을 포함하는 약물 전달 시스템.
제29항에 있어서,
항체를 더 포함하는, 약물 전달 시스템.
제30항에 있어서,
상기 항체는 상기 재조합 엑소좀과 함께 병용 투여되는 것을 특징으로 하는, 약물 전달 시스템.
제2항의 재조합 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물.
제32항에 있어서,
샴푸, 비누, 린스, 계면활성제-함유 클렌징, 크림, 로션, 연고, 토닉, 트리트먼트, 컨디셔너, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 오일, 왁스, 스프레이, 에어졸, 미스트, 또는 파우더인, 화장료 조성물.