TW202003011A - 抗ＰＤＬ１、ＩＬ－１５及ＴＧＦ－β受體組合分子 - Google Patents

抗ＰＤＬ１、ＩＬ－１５及ＴＧＦ－β受體組合分子 Download PDF

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Abstract

本發明的特徵在於多特異性蛋白質複合體，該複合體具有包括IL15或功能變異體、細胞因子受體或細胞因子配體的一個域，和特異於疾病抗原、免疫檢查點或訊號傳遞分子的結合域。

Description

抗PDL1、IL-15及TGF-β受體組合分子 相關申請案的交叉引用
本申請案依據35 U.S.C§119(e)主張2018年3月26日提交的美國臨時申請案62/648,373和2018年9月21日提交的美國臨時申請案62/734,994主張優先權的益處。這些申請的全部內容藉由引用方式將其全部整體併入本文。
本發明一般涉及多聚體融合分子領域。
目前，癌症免疫治療研究已證明黑素瘤患者和其他實體瘤患者亞組的臨床反應率很高。那些研究涉及單株抗體(MAb)檢查點抑制劑，如抗CTLA4、抗計畫性細胞死亡-1(PD-1)和抗計畫性細胞死亡蛋白質-1配體(PD-L1)、以及細胞因子例如IL-2和IL-15。1-5
針對PD-1/PD-L1的大多數抗體是IgG4同型，或工程化具有Fc域突變的IgG1同型的抗體，以損害抗體依賴性細胞毒性(ADCC)活性。然而，多種抗癌MAb，例如抗CTLA4(伊匹單抗(ipilimumab))、抗CD20(利妥昔單抗(rituximab))、抗HER2(曲妥珠單抗(trastuzumab))、帕 妥珠單抗(pertuzumab))和抗EGFR(西妥昔單抗(cetuximab))，是IgG1同型，因此具有介導ADCC的潛力。儘管其他研究尚未支持這發現，ADCC機制已意味有助於臨床療效9-11。阿特珠單抗(Atezolizumab)(TECENTRIQ®，Genentech)和阿維單抗(avelumab)(BAVENCIO®，EMD Serono)是已被FDA批准用於治療非小細胞肺癌(NSCLC)、膀胱癌、尿道上皮癌和轉移性Merkel細胞癌之IgG1同型的完全人類抗PD-L1療法12-15。
由於PD-L1表現在一些免疫細胞，使用全外周血單核細胞(PBMC)作為標靶進行研究以評估阿維單抗介導的ADCC。使用來自健康供體和癌症患者的自然殺手(NK)細胞，觀察到一系列人類腫瘤細胞類型的大量溶胞，但當人類PBMC亞群用作標靶時很少或沒有溶胞。在用多達9種劑量之阿維單抗治療的患者的PBMC的123個免疫細胞亞群的分析中還觀察到類似的結果13,16。此外，雖然在一系列人類腫瘤中觀察到使用阿維單抗的臨床益處，尚未觀察到超出了彼等在其他抗PD1/PD-L1 MAb觀察到之不良事件。3,14,17,18
儘管上述結果令人滿意，但僅有10至30%的患有大多數癌症的患者在接受抗PD-1/PD-L1單一療法治療時達到了客觀反應，即使僅彼等接受治療前腫瘤檢體表現PD-L1的患者參加的試驗中還是如此。19
在本文描述的發明之前，迫切需要開發新的策略以將各種效應分子靶向疾病部位，以提供治療益處而沒有與非特異性免疫活性相關的副作用。
本發明至少部分基於令人驚訝的發現，亦即，多特異性基於IL-15的蛋白質複合體增強免疫細胞的刺激並促進其對抗疾病細胞的活性，從而導致疾病的減少或預防。這些基於IL-15的蛋白質複合體還顯示出對疾病和目標抗原的增加的結合。本文提供了具有至少一個包括IL-15或功能變異體的域，轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)域以及特異於疾病抗原、免疫檢查點或訊號傳遞分子的結合域的多特異性蛋白質複合體。特別地，複合體包括與抗體或抗體結合片段融合的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc支架和結合至轉化生長因子-β(TGFβ)的TGFβRII域。具體地，本文描述了包括特異性結合至計畫性死亡配體1(PD-L1)、計畫性死亡1(PD-1)、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白質4(CTLA-4)、分化簇47(CD47)、T細胞免疫球蛋白和黏蛋白域-3(TIM-3、TIM3)或糖皮質激素誘發的腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族相關基因(GITR)之結合域之蛋白質複合體。這些複合體藉由向免疫細胞提供免疫刺激細胞因子來增大免疫活性。此等細胞因子是發明所屬技術領域已知者，而且可以單獨使用或與其他細胞因子或藥劑組合使用。這些複合體藉由經抗PD-L1、PD-1、CTLA-4、CD47、TIM3或GITR結合域的免疫檢查點阻斷進一步增大免疫反應。最後，複合體可以結合TGFβ並阻斷其免疫壓制活性，從而促進腫瘤生長和轉移以及其他疾病。
在某些情況下，這些複合體還辨識抗原，如PD-L1、單股去氧核糖核酸(ssDNA)、CD20、人類表皮生長因子受體2(HER2)、表皮生長因子受體(EGFR)、CD19、CD38、CD52、二唾液酸神經節苷脂(GD2)、CD33、Notch1、細胞間黏附分子1(ICAM-1)、組織因子或HIV外膜，在 疾病細胞表現並經由Fc結合域刺激對抗疾病細胞之抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)和補體依賴性細胞毒性(CDC)。
提供了包括至少兩種可溶性蛋白質的經單離的可溶性融合蛋白質複合體。例如，第一蛋白質包括介白素-15(IL-15)多肽，例如包括N72D突變(IL-15N72D)的變異體IL-15多肽。第二種蛋白質包括與免疫球蛋白Fc域(IL-15RαSu/Fc)融合的可溶性IL-15受體α sushi結合域(IL-15RαSu)。經單離的可溶性融合蛋白質複合體的第三組分包括辨識疾病抗原、免疫檢查點分子或訊號傳遞分子的結合域，例如PD-L1、PD-1、CTLA-4、CD47、TIM3或GITR，其中該結合域與IL-15N72D或IL-15RαSu/Fc蛋白質融合。可溶性融合免疫複合體的第四種組分包括細胞因子受體，例如TGFβRII或細胞因子。在一些態樣，這些結合域與IL-15N72D和IL-15RαSu/Fc蛋白質融合。在其他態樣，這些結合域之一者與IL-15N72D或IL-15RαSu/Fc蛋白質融合，並且第二結合域(亦即，特異於免疫檢查點或訊號傳遞分子或疾病抗原)與該蛋白質或其他蛋白質融合。在某些態樣，細胞因子受體(例如TGFβRII)與IL-15N72D及/或IL-15RαSu/Fc蛋白質融合。在某些態樣，細胞因子受體(例如TGFβRII)經連接子分子與IgG1 Fc融合或連接。另一態樣，細胞因子受體(例如，TGFβRII)是與IL-15N72D和IL-15RαSu/Fc蛋白質融合的二聚體。在一個態樣，疾病抗原係相關於贅瘤形成、傳染病或自體免疫疾病。在一些情況下，第一及/或第二可溶性蛋白質還包括辨識在疾病細胞表現之疾病抗原(例如PD-L1、ssDNA、CD20、HER2、EGFR、CD19、CD38、CD52、GD2、CD33、Notch1、細胞間黏附分子1(ICAM-1)、組織因子或HIV外膜或其他已知的抗原)的結合域。 或者，IL-15N72D或IL-15RαSu/Fc蛋白質包括特異於疾病抗原、免疫檢查點或訊號傳遞分子的結合域，而另一種蛋白質(分別為IL-15RαSu/Fc或IL-15N72D蛋白質)不包括另外的融合結合域。第一蛋白質的IL-15N72D域與第二種蛋白質的可溶性IL-15RαSu域結合，以形成可溶性融合蛋白質複合體。例示性融合蛋白質複合體包括IL-15N72D及/或IL-15RαSu/Fc融合蛋白質的抗PD-L1抗體。在其他態樣，細胞因子受體，例如TGFβRII及/或結合域與免疫球蛋白Fc域融合的可溶性IL-15受體αsushi結合域(IL-15RαSu)共價連接，而第二蛋白質包括共價連接的辨識疾病抗原的結合域和包括N72D突變(IL-15N72D)的變異體介白素-15(IL-15)多肽。於另一態樣，第二種蛋白質包括細胞因子受體，例如TGFβRII。
在某些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括至少兩種可溶性蛋白質，其中第一種可溶性蛋白質包括介白素-15(IL-15)多肽域，第二種可溶性蛋白質包括與免疫球蛋白Fc域融合之可溶性IL-15受體α sushi結合域(IL-15RαSu)，其中免疫球蛋白Fc(IgG Fc)域與糖基化或無糖基化之轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)域融合或連接；第一及/或第二可溶性蛋白質還包括特異性地結合至疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子的結合域，及第一可溶性蛋白質的IL-15域與第二可溶性蛋白質的IL-15RαSu域結合，以形成可溶性融合蛋白質複合體。無糖基化之TGFβRII胺基酸序列的實例如下：
Figure 108110496-A0202-12-0005-322
Figure 108110496-A0202-12-0005-321
(SEQ ID NO：35)。
在這具體實施例和其他具體實施例中，免疫球蛋白Fc域經連接子分子連接轉形生長因子-β受體第2型(TGFβRII)域。在這些和其他具體實施例中，免疫球蛋白Fc域是IgG Fc變異體，其包括在殘基位置70缺少游離半胱胺酸的鉸鏈區。在某些具體實施例中，半胱胺酸係在殘基位置70經絲胺酸取代(IgGFcC70S)。△游離半胱胺酸IL15RαSuFc胺基酸序列的實例如下：
Figure 108110496-A0202-12-0006-324
Figure 108110496-A0202-12-0006-323
(SEQ ID NO：36)。
在某些具體實施例中，免疫球蛋白Fc域是缺少鉸鏈區的IgG-Fc變異體。例如，IL15RαSuFc在位置66至70缺少胺基酸殘基EPKSC。△鉸鏈區IL15RαSuFc胺基酸序列的實例如下：
Figure 108110496-A0202-12-0006-325
Figure 108110496-A0202-12-0007-326
(SEQ ID NO：37)。
在這些和其他具體實施例中，第一或第二可溶性蛋白質之一者還包括特異性地結合至疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子的第二結合域。在這些和其他具體實施例中，IL-15多肽是IL-15變異體，其包括N72D突變(IL-15N72D)、IL-15K41Q突變、IL-15L45S突變、IL-15I67T突變、IL-15N79Y突變、IL-15E93A突變或其組合。IL-15-K41Q、L45S、I67T、N79Y、E93A胺基酸序列的實例如下：
Figure 108110496-A0202-12-0007-329
Figure 108110496-A0202-12-0007-327
(SEQ ID NO：38)。
在某些具體實施例中，IL-15多肽是包括L45S突變的IL-15變異體。IL15-L45S胺基酸序列的實例如下：
Figure 108110496-A0202-12-0007-330
Figure 108110496-A0202-12-0007-328
(SEQ ID NO：39)。
在某些具體實施例中，結合域包括藉由多肽連接子序列與免疫球蛋白重鏈可變域共價連接的免疫球蛋白輕鏈可變域。在這些和其他具體實施例中，結合域特異性地結合至一種或多種分子，包括計畫性死亡配體1(PD-L1)、計畫性死亡1(PD-1)、細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮質激素誘發之腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族相關基因(GITR)、淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)、組織因子(TF)、類δ蛋白4(DLL4)、單股DNA或T細胞免疫球蛋白和黏 蛋白域-3(Tim-3)。在某些具體實施例中，結合域特異性地結合至一種或多種分子，包括計畫性死亡配體1(PD-L1)。在這些和其他具體實施例中，TGFβRII域結合至轉形因子β(TGFβ)。在這些和其他具體實施例中，第一融合蛋白質複合體藉由二硫鍵而與第二融合蛋白質複合體共價連接，該二硫鍵連接第一可溶性融合蛋白質複合體的Fc域與第二可溶性融合蛋白質複合體的Fc域。
在某些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括至少兩種可溶性蛋白質，其中第一可溶性蛋白質包括介白素-15(IL-15)多肽域，及第二可溶性蛋白質包括與免疫球蛋白Fc域融合之可溶性IL-15受體α sushi結合域(IL-15RαSu)，第一及/或第二可溶性蛋白質還包括特異性地結合至疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子的結合域，以及第一可溶性蛋白質之IL-15域與第二可溶性蛋白質的IL-15RαSu域結合，以形成可溶性融合蛋白質複合體。在某些具體實施例中，免疫球蛋白Fc(IgG Fc)域還包括糖基化或無糖基化之轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)域，其經連接子分子融合或連接IgG Fc域。在某些具體實施例中，免疫球蛋白Fc(IgG Fc)域缺少TGFβRII域。在這些和其他具體實施例中，免疫球蛋白Fc域是包括在殘基位置70缺少游離半胱胺酸的鉸鏈區的IgG Fc變異體。在這些和其他具體實施例中，半胱胺酸在殘基位置70經絲胺酸取代(IgG-FcC70S)。在這些和其他具體實施例中，免疫球蛋白Fc域是缺少鉸鏈區的IgG-Fc變異體。在這些和其他具體實施例中，第一或第二可溶性蛋白質之一者還包括特異性地結合至疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子的第二結合域。在這些和其他具體實施例中，IL-15多 肽是IL-15變異體，其包括N72D突變(IL-15N72D)、IL-15K41Q突變、IL-15L45S突變、IL-15167T突變、IL-15N79Y突變、IL-15E93A突變或其組合。在這些和其他具體實施例中，結合域包括藉由多肽連接子序列與免疫球蛋白重鏈可變域共價連接的免疫球蛋白輕鏈可變域。在這些和其他具體實施例中，結合域特異性地結合至一種或多種分子，包括計畫性死亡配體1(PD-L1)、計畫性死亡1(PD-1)、細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮質激素誘發之腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族相關基因(GITR)、淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)、組織因子(TF)、類δ蛋白4(DLL4)、單股DNA或T細胞免疫球蛋白和黏蛋白域-3(Tim-3)。在某些具體實施例中，結合域特異性地結合至一種或多種分子，包括計畫性死亡配體1(PD-L1)。在某些具體實施例中，第一融合蛋白質複合體藉由二硫鍵與第二融合蛋白質複合體共價連接，該二硫鍵連接第一可溶性融合蛋白質複合體的Fc域與第二可溶性融合蛋白質複合體的Fc域。
在某些具體實施例中，結合域包括單鏈抗體(scAb或scFv)，其中免疫球蛋白輕鏈可變域係藉由多肽連接子序列與免疫球蛋白重鏈可變域共價連接。或者，結合域包括能夠作為免疫檢查點抑制劑或免疫促效劑的可溶性或細胞外配體或受體域。
例示性多核苷酸分子包括核酸序列，其包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、16、17、18、19或其組合。在一個態樣，核酸序列還包括可操作地連接編碼融合蛋白質序列的啟動子、轉譯起始訊號和前導序列。在某些具體實施例中，表現載體包括核酸序列，其包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、16、17、18、19或其組合。
例示性多肽分子包括胺基酸序列，其包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或其組合。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體係由與SEQ ID NO：1具有至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性的核酸序列編碼。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體係由與SEQ ID NO：3具有至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性的核酸序列編碼。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體係由與SEQ ID NO：5具有至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性的核酸序列編碼。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體係由與SEQ ID NO：7具有至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性的核酸序列編碼。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體係由與SEQ ID NO：9具有至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80 %，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性的核酸序列編碼。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體係由與SEQ ID NO：11具有至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性的核酸序列編碼。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體係由與SEQ ID NO：13具有至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性的核酸序列編碼。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體係由與SEQ ID NO：15具有至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性的核酸序列編碼。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體係由與SEQ ID NO：16具有至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性的核酸序列編碼。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體係由與SEQ ID NO：17具有至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性的核酸序列編碼。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體係由與SEQ ID NO：18具有至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性的核酸序列編碼。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體係由與SEQ ID NO：19具有至少50%，55%，60%，65%，70%，75%，80%，85%，86%，87%，88%，89%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%或99%的序列同一性的核酸序列編碼。
還提供了包括本文所述核酸序列的表現載體。例如，核酸序列係在用於複製、表現或兩者的載體中。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：2具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：4具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：6具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：8具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：10具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：12具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：14具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：20具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：21具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%， 90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：22具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：23具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：24具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：25具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括具有與SEQ ID NO：26至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：27具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：28具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：29具有至少約70%(諸如，至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：302具有至少約70%(例如至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：31具有至少約70%(例如至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：32具有至少約70%(例如至少約75%，80%，85%， 90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：33具有至少約70%(例如至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
在一些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括與SEQ ID NO：34具有至少約70%(例如至少約75%，80%，85%，90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，98%，99%或更高)的序列同一性的胺基酸序列。
還提供了可溶性融合蛋白質複合體，其包括與第二可溶性融合蛋白質複合體共價連接的第一可溶性融合蛋白質複合體。例如，本發明的可溶性融合蛋白質複合體經多聚合，例如二聚合、三聚合或其它多聚合(例如，4種複合體、5種複合體等)。例如，多聚體是同元多聚體或異元多聚體。可溶性融合蛋白質複合體藉由共價鍵聯結(join)，例如二硫鍵、化學交聯劑。在一些情況下，一種可溶性融合蛋白質藉由二硫鍵與另一種可溶性融合蛋白質共價連接，該二硫鍵連接第一可溶性蛋白質的Fc域與第二可溶性蛋白質的Fc域。
Fc域或其功能片段包含由IgG Fc域、人類IgG1 Fc域、人類IgG2 Fc域、人類IgG3 Fc域、人類IgG4 Fc域、IgA Fc域、IgD Fc域、IgE Fc域和IgM Fc域；小鼠IgG2A域，或其任何組合所成群組選擇之Fc域。視需要地，Fc域包含導致Fc域具有改變的補體或Fc受體結合特性或 改變的二聚合或糖基化型態(profile)的胺基酸變化。發明所屬技術領域中已知產生具有改變的補體或Fc受體結合特性或改變的二聚合或糖基化型態的Fc域之胺基酸變化。例如，以丙胺酸殘基(亦即，…PEAAGG…)取代IgG1 CH2的位置234和235(以抗體共有序列為基準之編號)的亮胺酸殘基(亦即，…PELLGG…)導致Fcγ受體結合的喪失，而丙胺酸殘基(亦即，…KCASL…)取代IgG1 CH2的位置322(以抗體共有序列為基準之編號)的離胺酸殘基(亦即，…KCKSL…)導致補體活化的喪失。在一些實例中，合併了這種突變。
在一些態樣，結合域及/或細胞因子受體域藉由多肽連接子序列共價連接IL-15多肽(或其功能片段)。類似地，結合域及/或細胞因子受體域藉由多肽連接子序列共價連接IL-15Rα多肽(或其功能片段)。視需要地，IL-15Rα多肽(或其功能片段)藉由多肽連接子序列共價連接Fc域(或其功能片段)。各多肽連接子序列可以獨立地選擇。視需要地，多肽連接子序列是相同的。或者，它們是不同的。
視需要地，提供本發明的可溶性融合蛋白質複合體，其中至少一種可溶性融合蛋白質包括可偵測標記。可偵測標記包括，但不限於，生物素、鏈黴抗生物素蛋白、酶或其催化活性片段，放射性核素、奈米粒子、順磁性金屬離子、或螢光、燐光或化學發光分子、或其任何組合。
本發明提供了用於製備本發明的可溶性融合蛋白質複合體的方法。該方法包括以下步驟：a)將具有編碼第一蛋白質的適當調控序列的DNA載體引入第一宿主細胞中；b)在足以於細胞或培養基中表現第一蛋白質的條件下於培養基培養第一宿主細胞；c)從宿主細胞或培養基純化第 一蛋白質，d)將具有編碼第二蛋白質的適當調控序列的DNA載體引入第二宿主細胞中，e)在足以於細胞或培養基中表現第二蛋白質的條件下於培養基培養第二宿主細胞；f)從宿主細胞或培養基純化第二蛋白質，以及g)在足以允許第一蛋白質的IL-15域與第二蛋白質的可溶性IL-15Rα域之間結合的條件下混合第一蛋白質和第二蛋白質，以形成可溶性融合蛋白質複合體。
在一些情況下，該方法還包括在足以允許在由表現載體表現的多肽之間形成二硫鍵的條件下，混合第一蛋白質和第二蛋白質。
或者，用於製備本發明的可溶性融合蛋白質複合體的方法係藉由以下者進行：a)將具有編碼第一蛋白質的適當調控序列的DNA載體和具有編碼第二蛋白質的適當調控序列的DNA載體引入宿主細胞中，b)在足以於細胞或培養基中表現蛋白質的條件下於培養基培養宿主細胞，並且允許第一蛋白質的IL-15域與第二蛋白質的可溶性IL-15Rα域之間締合以形成可溶性融合蛋白質複合體；以及c)從宿主細胞或培養基純化可溶性融合蛋白質複合體。
在一個態樣，該方法還包括在足以允許在由表現載體表現的多肽之間形成二硫鍵的條件下混合第一蛋白質和第二蛋白質。
還提供了用於製備可溶性融合蛋白質複合體的方法，包括a)將具有編碼第一蛋白質和第二蛋白質的適當調控序列的DNA載體引入宿主細胞中，b)在足以於細胞或培養基中表現蛋白質的條件下於培養基培養宿主細胞以允許第一蛋白質的IL-15域與第二蛋白質的可溶性IL-15Rα域之間的締合，以形成可溶性融合蛋白質複合體，並允許多肽之間形成二硫 鍵；c)從宿主細胞或培養基純化可溶性融合蛋白質複合體。
視需要地，該方法還包括在足以允許在由表現載體表現的多肽之間形成二硫鍵的條件下混合第一蛋白質和第二蛋白質。
在有其需求之個體治療贅瘤形成、傳染病或自體免疫疾病的方法係藉由向個體投予有效量的包括本文所述可溶性融合蛋白質複合體的醫藥組成物，例如可溶性抗PD-L1 scAb/IL-15N72D：TGFβRII/IL-15RαSu/Fc融合蛋白質複合體而進行，從而治療贅瘤形成、傳染病或自體免疫疾病。例如，在有其需求之個體治療實體或血液惡性腫瘤的方法係藉由向個體投予有效量的包括可溶性TGFβRII二聚體/huIL-15N72D：抗人類PD-L1 scAb/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc融合蛋白質複合體的醫藥組成物而進行，從而治療惡性腫瘤。
用本文描述的方法治療的合適的贅瘤形成包括膠質母細胞瘤、前列腺癌、急性髓性白血病、B細胞腫瘤、多發性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤、B細胞非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、皮膚T細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、實體瘤、尿道上皮癌/膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃癌和食道癌、頭頸癌、前列腺癌、胰臟癌、結直腸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌和鱗狀細胞頭頸癌。
包括融合蛋白質複合體的醫藥組成物係以有效量投予。例如，有效量的醫藥組成物為約1μg/kg至100μg/kg，例如1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100μg/kg。或者，TxM複合體係以固定劑量或以體表面積(亦即，每平方米)為基準投予。
包括融合蛋白質複合體的醫藥組成物每月至少投予一次，例如每月兩次，每週一次，每週兩次，每天一次，每天兩次，每8小時，每4小時，每2小時一次，或者每小時一次。醫藥組成物的合適投予方式包括全身投予、靜脈內投予、局部投予、皮下投予、肌肉內投予、腫瘤內投予、吸入以及腹膜內投予。
較佳地，融合蛋白質複合體增加干擾素γ(IFN-γ)的血清濃度，及/或刺激CD4+和CD8+ T細胞和NK細胞以殺死個體中的患病細胞或腫瘤細胞。
在某些具體實施例中，提供了在有其需求之個體誘發抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)或抗體依賴性細胞介導的吞噬作用(ADCP)的方法，包括向有其需求之個體投予有效量的本文所體現的可溶性融合蛋白質複合體的方法。
在某些具體實施例中，在體外或體內抑制轉形生長因子β(TGFβ)活性的方法包括體外接觸TGFβ-反應細胞或向有其需求之個體投予有效量的本文所體現的可溶性融合蛋白質複合體。
在某些具體實施例中，降低體內轉化生長因子β(TGFβ)的量的方法包括向有其需求之個體投予有效量的本文所體現的可溶性融合蛋白質複合體。
在某些具體實施例中，抑制轉化生長因子β(TGFβ)介導的體內SMAD多肽的磷酸化和活化的方法包括向有其需求之個體投予治療有效量的本文所體現的可溶性融合蛋白質複合體。
在本發明的可溶性融合蛋白質複合體的某些態樣，IL-15多 肽是具有與天然IL-15多肽不同的胺基酸序列的IL-15變異體。人類IL-15多肽在本文中稱為huIL-15、hIL-15、huIL15、hIL15、IL-15野生型(wt)，並且其變異體被認為係使用天然胺基酸，其在成熟序列中的位置及變異體胺基酸。例如，huIL15N72D是指包括位置72 N至D的取代的人類IL-15。在一個態樣，證明了IL-15變異體作用為IL-15促效劑，例如藉由與天然IL-15多肽相比，增加了IL-15/IL-2βγC受體(IL-15R)的結合活性。或者，IL-15變異體作用為IL-15拮抗劑，例如，藉由與天然IL-15多肽相比，降低了IL-15R的結合活性。
用於殺死標靶細胞的方法係藉由如下者進行：a)使複數個細胞與本發明的可溶性融合蛋白質複合體接觸，其中該等複數個細胞還包括攜帶IL-15域辨識的IL-15R鏈的免疫細胞、或具有由檢查點抑制劑、TGFβ分子或免疫促效劑結合域調節的檢查點及/或細胞因子受體或訊號傳遞分子的免疫細胞，及標靶疾病細胞；b)經由IL-15R或訊號傳遞分子、經由抑制TGFβ免疫壓制或經由阻斷檢查點分子而活化免疫細胞；以及c)以活化的免疫細胞殺死標靶細胞。例如，標靶疾病細胞是腫瘤細胞、自體免疫細胞或病毒感染的細胞。在一些情況下，結合域包括抗PD-L1抗體。
用於殺死標靶細胞的方法還包括a)使複數個細胞與本發明的可溶性融合蛋白質複合體接觸，其中該等複數個細胞還包括具有被Fc域辨識的Fc受體鏈的免疫細胞，並且標靶疾病細胞攜帶結合域辨識的抗原，諸如抗原特異性結痂及/或免疫刺激細胞因子或其受體；b)在標靶疾病細胞的抗原和免疫細胞的Fc受體鏈和足以結合和活化免疫細胞的免疫刺激細胞因子或其受體之間形成特異性結合複合體(橋)；以及c)以結合的活化免 疫細胞殺死標靶疾病細胞。例如，標靶疾病細胞是腫瘤細胞、自體免疫細胞或病毒感染的細胞。在一些情況下，結合域包括抗PD-L1抗體。
還提供了用於預防或治療患者疾病的方法，該方法包括以下步驟：a)向患者投予本發明的可溶性融合蛋白質複合體；b)活化患者的免疫細胞；以及c)經由足以預防或治療患者疾病的活化的免疫細胞破壞或殺死疾病細胞。
本發明還提供了預防或治療患者疾病的方法，該方法包括以下步驟：a)將攜帶IL-15R鏈的免疫細胞、細胞因子受體及/或檢查點或訊號傳遞分子與本發明的可溶性融合蛋白質複合體混合；b)活化免疫細胞；c)向患者投予活化的免疫細胞；以及d)經由足以預防或治療患者疾病的活化的免疫細胞破壞或殺死疾病細胞。免疫細胞還可以與特異的抗原接觸以擴充活化的免疫細胞數。
投予本發明的融合蛋白質複合體在個體誘發免疫反應。例如，投予本發明的融合蛋白質複合體誘發針對與贅瘤形成、傳染病或自體免疫疾病相關的細胞的免疫反應。在一個態樣，本發明的融合蛋白質複合體增加免疫細胞增殖。
本發明提供了藉由向哺乳動物投予有效量的本發明的可溶性融合蛋白質複合體，而刺激哺乳動物免疫反應的方法。本發明還提供了藉由向哺乳動物投予有效量的本發明任一項的可溶性融合蛋白質複合體，而壓制哺乳動物免疫反應的方法。
除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有發明所屬領域的技術人員通常理解的含義。以下參考文獻為發明所屬領域的 技術人員提供了本發明中使用的許多術語的一般定義：Singleton等人，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology(第二版，1994)；The Cambridge Dictionary of Science and Technology(Walker編輯，1988)；The Glossary of Genetics，第5版，R.Rieger等人(編輯)，Springer Verlag(1991)；以及Hale & Marham，The Harper Collins Dictionary of Biology(1991)。如本文所用，除非另有說明，否則如下術語具有後文所賦予的含義。
所謂「試劑」，是指肽、核酸分子或小化合物。
所謂「TxM」，是指包括與結合域連接的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc支架的複合體。例示性TxM是IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc複合體，其包括與特異性地辨識PD-L1(PD-L1 TxM)的結合域的融合物。
所謂「改善」，是指減少、壓制、衰減、減弱、阻止或穩定疾病的發展或進展。
所謂「類似物」，是指不相同，但具有類似功能或結構特徵的分子。例如，多肽類似物保留相應的天然存在的多肽的生物活性，同時相對於天然存在的多肽具有增強類似物功能的某些生物化學修飾。此等生物化學修飾可以增加類似物的蛋白酶抗性、膜滲透性或半衰期，而不改變例如配體結合。類似物可包括非天然胺基酸。
術語「結合域」旨在涵蓋抗體、單鏈抗體、Fab、Fv、T細胞受體結合域、配體結合域、受體結合域或發明所屬技術領域已知的其他抗原特異性多肽。
本發明包括抗體或此等抗體的片段，只要它們表現出所需的 生物活性即可。本發明還包括嵌合抗體，例如人源化抗體。通常，人源化抗體具有從非人類來源引入的一個或多個胺基酸殘基。例如，可以藉由用嚙齒動物互補決定區的至少一部分取代人類抗體的相應區域，使用發明所屬技術領域描述的方法進行人源化。
術語「抗體」或「免疫球蛋白」旨在包括多株抗體和單株抗體兩者。較佳的抗體是與抗原反應的單株抗體。術語「抗體」還旨在涵括超過一種與抗原反應的抗體的混合物(例如，與抗原反應的不同類型的單株抗體的混合物)。術語「抗體」還旨在涵括完整抗體、其生物功能性片段、單鏈抗體和遺傳改變的抗體，諸如包含來自超過一種物種的部分的嵌合抗體、雙功能抗體、抗體接合物、人源化抗體以及人類抗體。還可以使用的生物功能性抗體片段是自彼等足以結合抗原的抗體衍生的肽片段。如本文所用的「抗體」意指包括完整抗體以及能夠結合感興趣的表位、抗原或目標抗原片段的任何抗體片段(例如F(ab')2、Fab'、Fab、Fv)。
所謂「結合」分子，意味著對該分子具有物理化學親和力。
「偵測」是指辨識待偵測分析物的存在、不存在或量。
所謂「疾病」，是指損害或干擾細胞、組織或器官的正常功能的任何病況或病症。疾病的實例包括贅瘤形成、自體免疫疾病和病毒感染。
術語製劑或製劑組分的「有效量」和「治療有效量」是指足夠量的製劑或組分，單獨或其組合，以提供所期望的效果。例如，所謂「有效量」，是指相對於未治療的患者，改善疾病症狀所需的化合物單獨或組合的量。用於實施本發明治療疾病的活性化合物的有效量係根據投予方式、 個體的年齡、體重和一般健康狀況而變化。最終，主治醫師或獸醫將決定適當的量和劑量方案。此量稱為「有效」量。
所謂「片段」，是指多肽或核酸分子的一部分。此部分較佳含有參考核酸分子或多肽的全長的至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%或90%。例如，片段可含有10、20、30、40、50、60、70、80、90或100、200、300、400、500、600、700、800、900或1000個核苷酸或胺基酸。然而，本發明還包括多肽和核酸片段，只要它們分別表現出全長多肽和核酸的所期望的生物活性即可。採用幾乎任何長度的核酸片段。例如，總長度為約10,000，約5,000，約3,000，約2,000，約1,000，約500，約200，約100，約50個鹼基對長度(包括所有中間長度)的例示性多核苷酸區段包括在本發明的許多實施中。類似地，採用幾乎任何長度的多肽片段。例如，例示性多肽片段的總長度為約10,000，約5,000，約3,000，約2,000，約1,000，約5,000，約1,000，約500，約200，約100或約50個胺基酸長度(包括所有中間長度)包括在本發明的許多實施中。
術語「單離的」，「純化的」或「生物學上純的」是指在不同程度下不含其天然狀態下發現的通常伴隨的組分的材料。「單離」表示與原始來源或周圍環境分離的程度。「純化」表示高於單離的分離度。
「純化的」或「生物學純的」蛋白質充分地不含其他材料，使得任何雜質不會重大地影響蛋白質的生物性質或引起其他不利後果。亦即，若本發明的核酸或肽在藉由重組DNA技術產生時實質上不含細胞材料、病毒材料或培養基，或在化學合成時實質上不含化學前驅物或其他化學品，則本發明的核酸或肽係純化的。純度和均質性通常係使用分析化學 技術測定，例如聚丙烯醯胺凝膠電泳或高效液相層析術。術語「純化的」可以表示核酸或蛋白質基本上在電泳凝膠中產生一個條帶。對於可以進行修飾的蛋白質，例如磷酸化或糖基化，不同的修飾可以產生可以分別純化之不同的單離之蛋白質。
類似地，所謂「實質上純的」是指已經與天然伴隨的組分分離的核苷酸或多肽。通常，當至少60重量%、70重量%、80重量%、90重量%、95%或甚至99重量%核苷酸和多肽不含蛋白質和與其相伴之天然存在的有機分子時，其係基本上純的。
所謂「單離的核酸」，是指在衍生核酸的有機體的天然存在的基因組中不含與其側接的基因的核酸。該術語涵蓋，例如：(a)DNA，其是天然存在的基因組DNA分子的一部分，但不側接兩側的核酸序列，該核酸序列側接位於有機體基因組中天然存在的分子的那一部分；(b)以某種方式併入載體或併入原核生物或真核生物的基因組DNA中的核酸，使得所得分子與任何天然存在的載體或基因組DNA不同；(c)單獨的分子，諸如cDNA、基因組片段、藉由聚合酶連鎖反應(PCR)產生的片段、或限制性片段；以及(d)作為雜合基因之一部分的重組核苷酸序列，亦即，編碼融合蛋白的基因。根據本發明的單離的核酸分子還包括合成產生的分子，以及已化學改變及/或具有修飾的骨架的任何核酸。例如，單離的核酸是純化的cDNA或RNA多核苷酸。單離的核酸分子還包括傳訊核糖核酸(mRNA)分子。
所謂「單離的多肽」是指本發明的多肽已與其天然伴隨的組分分離。通常，當至少60重量%多肽不含與其天然相伴的蛋白質和天然 存在的有機分子時，多肽為單離的。較佳地，製劑為至少75%，更佳為至少90%，最佳為至少99重量%的本發明多肽。本發明的單離的多肽可以藉由例如從天然來源提取，藉由表現編碼此多肽的重組核酸；或藉由化學合成蛋白質而獲得。純度可以藉由任何合適的方法測量，例如管柱層析術、聚丙烯醯胺凝膠電泳或HPLC分析。
所謂「標記」，是指具有與疾病或病症相關的表現程度或活性改變的任何蛋白質或多核苷酸。
所謂「贅瘤形成」，是指以過度增殖或減少的細胞凋亡為特徵的疾病或病症。本發明可以使用的例示性贅生物包括，但不限於，白血病(例如，急性白血病、急性淋巴細胞白血病、急性髓細胞白血病、急性成髓細胞白血病、急性早幼粒細胞白血病、急性髓單核細胞白血病、急性單核細胞白血病、急性紅白血病、慢性白血病、慢性髓性細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病)、真性紅細胞增多症、淋巴瘤(霍奇金病、非霍奇金病)、華氏巨球蛋白血症、重鏈疾病、肉瘤和癌等實體瘤(如纖維肉瘤、黏液肉瘤、脂肪肉瘤、軟骨肉瘤、成骨肉瘤、脊索瘤、血管肉瘤、內皮肉瘤、淋巴管肉瘤、淋巴管內皮細胞瘤、滑膜瘤、間皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、橫紋肌肉瘤、結腸癌、胰臟癌、乳癌、卵巢癌、前列腺癌、鱗狀細胞癌、基底細胞癌、腺癌、汗腺癌、皮脂腺癌、乳頭狀癌、乳頭狀腺癌、囊腺癌、髓樣癌、支氣管癌、腎細胞癌、肝癌、膽管癌、絨毛膜癌、精原細胞瘤、胚胎癌、威爾姆氏瘤、子宮頸癌、子宮癌、睪丸癌、肺癌、小細胞肺癌、膀胱癌、上皮癌、神經膠質瘤、多形性膠質母細胞瘤、星形細胞瘤、成神經管細胞瘤、顱咽管瘤、室管膜瘤、松果體瘤、血管母細胞瘤、聽神經瘤、少 突神經膠質瘤、許旺氏瘤、腦膜瘤、黑素瘤、神經母細胞瘤和視網膜母細胞瘤)。在特定的具體實施例中，贅瘤形成是多發性骨髓瘤、β細胞淋巴瘤、尿道上皮癌/膀胱癌或黑素瘤。如本文所用，“獲得”如“獲得藥劑”包括合成、購買或以其他方式獲取代理。
所謂「減少」，是指至少5%、10%、25%、50%、75%或100%的負變化。
所謂「參考」，是指標準或對照條件。
「參考序列」是用作序列比較基礎的確定序列。參考序列可以是指定序列的子集或全部；例如，一段全長cDNA或基因序列，或完整的cDNA或基因序列。對於多肽，參考多肽序列的長度將通常為至少約16個胺基酸，較佳為至少約20個胺基酸，更佳為至少約25個胺基酸，甚至更佳為約35個胺基酸、約50個胺基酸、或約100個胺基酸。對於核酸，參考核酸序列的長度將通常為至少約50個核苷酸，較佳為至少約60個核苷酸，更佳為至少約75個核苷酸，甚至更佳為約100個核苷酸或約300個核苷酸或在它們周圍或之間的任何整數。
所謂「特異性地結合」，是指辨識和結合本發明多肽，但實質上不辨識和結合樣本中其他分子的化合物或抗體，例如天然包括本發明多肽的生物樣本。
可用於本發明方法的核酸分子包括編碼本發明多肽或其片段的任何核酸分子。此等核酸分子不需要與內源核酸序列100%相同，但將通常展現實質的同一性。與內源序列具有「實質同一性」的多核苷酸通常能夠與雙股核酸分子的至少一股雜交。可用於本發明方法的核酸分子包 含編碼本發明多肽或其片段的任何核酸分子。此等核酸分子不需要與內源核酸序列100%相同，但將通常展現實質的同一性。與內源序列具有「實質同一性」的多核苷酸通常能夠與雙股核酸分子的至少一股雜交。所謂「雜交」，是指在各種嚴格條件下在互補多核苷酸序列(例如，本文所述基因)或其部分之間形成雙股分子。(參見，例如，Wahl,G.M和S.L.Berger(1987)Methods Enzymol.152：399；Kimmel,A.R.(1987)Methods Enzymol.152：507)。
例如，嚴格的鹽濃度通常小於約750mM NaCl和75mM檸檬酸三鈉，較佳為小於約500mM NaCl和50mM檸檬酸三鈉，更佳為小於約250mM NaCl和25mM檸檬酸三鈉。在有機溶劑(例如甲醯胺)不存在的情況下可以獲得低嚴格程度雜交，而在至少約35%甲醯胺，更佳為至少約50%甲醯胺的存在下，可以獲得高嚴格程度雜交。嚴格的溫度條件通常包括至少約30℃，更佳為至少約37℃，最佳為至少約42℃的溫度。改變另外的參數，例如雜交時間、洗滌劑(例如十二烷基硫酸鈉(SDS))的濃度和載劑DNA的含括或排除是發明所屬技術領域的技術人員周知的。藉由根據需要組合這些不同的條件來實現各種嚴格程度。在較佳的具體實施例中，雜交將在30℃，於750mM NaCl、75mM檸檬酸三鈉和1%SDS中發生。在更佳的具體實施例中，雜交將在37℃，於500mM NaCl、50mM檸檬酸三鈉、1%SDS、35%甲醯胺和100μg/ml變性的鮭精DNA(ssDNA)中發生。在最佳的具體實施例中，雜交將在42℃，於250mM NaCl、25mM檸檬酸三鈉、1%SDS、50%甲醯胺和200μg/ml ssDNA中發生。對於發明所屬技術領域的技術人員而言，對這些條件的有用變化將是顯而易見的。
對於大多數應用，雜交後的洗滌步驟還將在嚴格程度方面變化。洗滌嚴格條件可以藉由鹽濃度和溫度來定義。如上所述，藉由降低鹽濃度或藉由升高溫度可以提高洗滌嚴格程度。例如，洗滌步驟的嚴格鹽濃度將較佳為小於約30mM NaCl和3mM檸檬酸三鈉，且最佳為小於約15mM NaCl和1.5mM檸檬酸三鈉。洗滌步驟的嚴格溫度條件將通常包括至少約25℃的溫度，更佳為至少約42℃，甚至更佳為至少約68℃。在較佳的具體實施例中，洗滌步驟將是在25℃，於30mM NaCl、3mM檸檬酸三鈉和0.1%SDS中發生。在更佳的具體實施例中，洗滌步驟將在42℃，於15mM NaCl、1.5mM檸檬酸三鈉和0.1%SDS中發生。在更佳的具體實施例中，洗滌步驟將在68℃，於15mM NaCl、1.5mM檸檬酸三鈉和0.1% SDS中發生。對於發明所屬技術領域的技術人員來說，對這些條件的另外變化將是顯而易見的。雜交技術是發明所屬技術領域的技術人員公知的，並且描述於例如Benton和Davis(Science 196：180,1977)；Grunstein和Hogness(Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 72：3961,1975)；Ausubel等人(Current Protocols in Molecular Biology,Wiley Interscience,New York,2001)；Berger和Kimmel(Guide to Molecular Cloning Techniques,1987,Academic Press,New York)；和Sambrooket al.,Molecular Cloning：A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,New York。
所謂「實質上相同」，是指與參考胺基酸序列(例如，本文所述任何一種胺基酸序列)或核酸序列(例如，本文所述任何一種核酸序列)具有至少50%同一性的多肽或核酸分子。較佳地，此序列在胺基酸水平或與用於比較的序列的核酸上，至少60%，更佳為80%或85%，更佳為90%、 95%或甚至99%相同。
通常使用序列分析軟體(例如，Sequencher，Gene Codes Corporation，775 Technology Drive，Ann Arbor，MI；Vector NTI，Life Technologies，3175 Staley Rd.Grand Island，NY)測量序列同一性。此軟體係藉由將同源性程度指定為各種取代、刪除及/或其他修飾，而匹配相同或相似的序列。保守取代通常包括以下群組內的取代：甘胺酸、丙胺酸；纈胺酸、異亮胺酸、亮胺酸；天冬胺酸、麩胺酸、天冬醯胺、麩胺醯胺；絲胺酸、蘇胺酸；離胺酸、精胺酸；以及苯丙胺酸、酪胺酸。在確定同一性程度的例示性方法中，可以使用BLAST程式，其中e-3和e-100之間的概率分數表示密切相關的序列。
所謂「個體」，是指哺乳動物，其包括，但不限於，人類或非人類哺乳動物，例如牛、馬、犬、綿羊或貓科動物。個體較佳為需要這種治療的哺乳動物，例如，已被診斷患有B細胞淋巴瘤或其傾向的個體。哺乳動物是任何哺乳動物，例如人類、靈長類動物、小鼠、大鼠、狗、貓、馬以及為食物消耗而種植的牲畜或動物，例如牛、羊、豬、雞、和山羊。在較佳的具體實施例中，哺乳動物是人類。
本文提供的範圍被理解為該等範圍內的所有值的簡寫。例如，1至50的範圍應理解為包括由1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50所組成群組中的任何數字、數字組合或子範圍。
本文所用術語「治療(treating)」和「治療(treatment)」是指將藥劑或製劑給予患有不良病況、病症或疾病的臨床有症狀個體，以便影響症狀嚴重性及/或頻率的降低，消除症狀及/或其根本原因，及/或促進損害的改善或補救。將理解，儘管不排除，但治療病症或病況不需要完全消除與其相關的病症、病況或症狀。
術語「預防(preventing)」和「預防(prevention)」是指向易患或有傾向患特定不良病況、病症或疾病的臨床無症狀個體投予藥劑或組成物，因此涉及預防症狀及/或其根本原因的發生。
除非特別說明或從上下文中顯而易見，否則如本文所用，術語「或」應理解為包括在內。除非特別說明或從上下文中顯而易見，否則如本文所用，術語「一(a)」、「一(an)」和「該」應理解為單數或複數。
除非特別說明或從上下文中顯而易見，否則如本文所用，術語「約」應理解為在發明所屬技術領域中的正常耐受範圍內，例如在平均值的2個標準偏差內。約可以理解為在註明的值的10%、9%、8%、7%、6%、5%、4%、3%、2%、1%、0.5%、0.1%、0.05%或0.01%的範圍內。除非上下文清楚，否則本文提供的所有數值均由術語「約」修飾。
本文中對變量的任何定義中的化學基團列表的敘述包括該變量作為任何單一群組或所列群組的組合的定義。本文對變量或態樣的具體實施例的描述包括作為任何單一具體實施例或與任何其他具體實施例或其部分組合的具體實施例。
本文提供的任何組成物或方法可以與本文提供的任何其他組成物和方法中的一者或多者組合。
與「包含」、「含有」或「特徵在於」同義的轉折語「包括」是包含邊值(inclusive)的或開放式的，並且不排除另外、未列舉的元素或方法步驟。相反，轉折短語「由…組成」排除了申請專利範圍中未指定的任何元素、步驟或組分。轉折短語「基本上由……組成」將申請專利範圍的範疇限制為指定的材料或步驟「和彼等不會對要求本發明的基本和新穎特徵產生實質影響的材料或步驟」。
本發明的其他特徵和優點將從以下其較佳具體實施例的描述和申請專利範圍變得顯而易見。除非另外定義，否則本文使用的所有技術和科學術語具有與發明所屬技術領域的普通技術人員通常理解者相同的含義。儘管與彼等本文描述者類似或相等的方法和材料可用於本發明的實踐或測試，下文描述了合適的方法和材料。本文引用的所有公開的外國專利和專利申請均藉由引用方式而併入本文。
由本文引用的以登錄號表示的Genbank和NCBI提交係藉由引用方式而併入本文。本文引用的所有其他公開的參考文獻、文件、手稿和科學文獻均係藉由引用方式而併入本文。在有衝突的情況下，本說明書(包括定義)將為優先。另外，材料、方法和實施例僅是闡示性，而非限制性。
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第1圖是闡釋構築體：αPDL1/TGFβRII/TXM之結構的一 個具體實施例的示意圖。
第2圖是rProtein A純化後之αPDL1/TGFβRII/TXM的分析性粒徑排阻層析術(SEC)。
第3圖是顯示αPDL1/TGFβRII/TXM的SDS PAGE結果降低的照片的掃描圖。
第4圖是闡釋構築體：TGFβRII/αPDL1/TXM之結構的具體實施例的示意圖。
第5圖是rProtein A純化後之TGFβRII/αPDL1/TXM的分析性SEC。
第6圖是顯示TGFβRII/αPDL1/TXM的SDS PAGE結果降低的照片的掃描圖。
第7圖是闡釋構築體：αPDL1/TxM/TGFβRII之結構的具體實施例的示意圖。
第8圖顯示TGFβRII/αPDL1/TxM和αPDL1/TGFβRII/TxM的降低的SDS-PAGE結果。
第9圖是早期蛋白質特徵化的表和示意圖。
第10圖是描繪使用IL-15活性測定法比較αPDL1/TxM/TGFβRII、αPDL1/TGFβRII/TxM、TGFβRII/αPDL1/TxM和ALT-803而獲得的結果的圖和表。
第11圖是描繪使用TGFβ活性阻斷測定法比較αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TxM和αPDL1/TGFβRII/TxM而獲得的結果的圖和表。
第12圖是描繪使用PDL1結合測定法比較αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TxM和αPDL1/TGFβRII/TxM而獲得的結果的圖和表。
第13圖是顯示TGFβRII/αPDL1/TXM與αPDL1/TGFβRII/TXM之間的整體比較的表。
第14A圖A是顯示用hTGFβRII/αPDL1/TxM或ALT-803刺激後的細胞增殖的圖。用hTGFβRII/αPDL1/TxM或ALT-803刺激IL-15依賴性32Dβ細胞3天，並使用PrestoBlue評估細胞增殖。IL-15的EC50係藉由使用ALT-803作為陽性對照而計算。結果為hαPDL1/TGFβRII/TxM具有IL-15活性，EC50約為188pM。
第14B圖是顯示用hαPDL1/TGFβRII/TxM或ALT-803刺激後的細胞增殖的圖。用hαPDL1/TGFβRII/TxM或ALT-803刺激IL-15依賴性32Dβ細胞3天，並使用PrestoBlue評估細胞增殖。IL-15的EC50係藉由使用ALT-803作為陽性對照而計算。結果為hαPDL1/TGFβRII/TxM具有IL-15活性，EC50約為376.5pM。
第15A圖是顯示由TGFβRII/αPDL1/TxM與人類肺乳頭狀腺癌細胞結合獲得的結果的圖。TGFβRII/αPDL1/TxM與PDL1+ H441人類肺乳頭狀腺癌細胞的結合係藉由使用對hIgG的Fc部分特異的APC標記的抗體之流式細胞術而分析。結果顯示TGFβRII/αPDL1/TxM對PDL1具有結合活性。
第15B圖是顯示hαPDL1/TGFβRII/TxM與人類肺乳頭狀腺癌細胞結合獲得的結果的圖。hαPDL1/TGFβRII/TxM與PDL1+H441人 類肺乳頭狀腺癌細胞的結合係藉由使用對hIgG的Fc部分特異的APC標記的抗體之流式細胞術而分析。結果顯示hαPDL1/TGFβRII/TxM對PDL1具有結合活性。
第16A圖是顯示以hTGFβRII/αPDL1/TxM阻斷TGFβ1介導的Smad2/3磷酸化獲得的結果的圖。用含有TGFβ/SMAD訊號傳遞路徑SBE報告基因(BPS Bioscience)的HEK293細胞評估用hTGFβRII/αPDL1/TxM阻斷由TGFβ1(100ng/mL)誘發的Smad2/3磷酸化。與IgG Fc融合的TGFβRII用作對照。結果顯示，hTGFβRII/αPDL1/TxM可有效阻斷TGFβ1介導的Smad磷酸化，IC50約為2.35nM。
第16B圖是顯示以hαPDL1/TGFβRII/TxM阻斷TGFβ1介導的Smad2/3磷酸化獲得的結果的圖。用含有TGFβ/SMAD訊號傳遞路徑SBE報告基因(BPS Bioscience)的HEK293細胞評估用hαPDL1/TGFβRII/TxM阻斷由TGFβ1(100ng/mL)誘發的Smad2/3磷酸化。與IgG Fc融合的TGFβRII用作對照。結果顯示，hαPDL1/TGFβRII/TxM可有效阻斷TGFβ1介導的Smad磷酸化，IC50約為0.38nM。
第17A圖是顯示以hTGFβRII/αPDL1/TxM阻斷TGFβ3介導的Smad2/3磷酸化獲得的結果的圖。用含有TGFβ/SMAD訊號傳遞路徑SBE報告基因(BPS Bioscience)的HEK293細胞評估使用hTGFβRII/αPDL1/TxM阻斷由TGFβ3(100ng/mL)誘發的Smad2/3磷酸化。與IgG Fc融合的TGFβRII用作對照。結果顯示，hTGFβRII/αPDL1/TxM可有效阻斷TGFβ3介導的Smad磷酸化，IC50約為0.355nM。
第17B圖是顯示以hαPDL1/TGFβRII/TxM阻斷TGFβ3介 導的Smad2/3磷酸化獲得的結果的圖。用含有TGF/SMAD訊號傳遞路徑SBE報告基因(BPS Bioscience)的HEK293細胞評估用hαPDL1/TGFβRII/TxM阻斷由TGFβ3(100ng/mL)誘發的Smad2/3磷酸化。與IgG Fc融合的TGFβRII用作對照。結果顯示，hαPDL1/TGFβRII/TxM可有效阻斷TGFβ3介導的Smad磷酸化，IC50約為0.029nM。
第18A圖是顯示hTGFβRII/αPDL1/TXM與TGF-β1結合獲得的結果的圖。進行ELISA以評估hTGFβRII/αPDL1/TXM與TGF-β1的結合。首先將孔用TGFβ1(0.5μg/ml)塗佈過夜，然後與連續稀釋的hTGFβRII/αPDL1/TXM一起培養。使用抗hIgG-辣根過氧化物酶(HRP)偵測蛋白質結合。結果顯示hTGFβRII/αPDL1/TXM可與結合盤的TGF-β1結合，EC50為1.28nM。
第18B圖是顯示hαPDL1/TGFβRII/TXM與TGF-β1結合獲得的結果的圖。進行ELISA以評估hαPDL1/TGFβRII/TXM與TGF-β1的結合。首先將孔用TGFβ1(0.5μg/ml)塗佈過夜，然後與連續稀釋的hαPDL1/TGFβRII/TXM一起培養。使用抗hIgG-辣根過氧化物酶(HRP)偵測蛋白質結合。結果顯示，hαPDL1/TGFβRII/TXM可與結合盤的TGF-β1結合，EC50為0.49nM。
第19A圖是顯示hTGFβRII/αPDL1/TXM與TGF-β3結合獲得的結果的圖。進行ELISA以評估hTGFβRII/αPDL1/TXM與TGF-β1的結合。首先將孔用TGFβ3(0.5μg/ml)塗佈過夜，然後與連續稀釋的hTGFβRII/αPDL1/TXM一起培養。使用抗hIgG-辣根過氧化物酶(HRP)偵測蛋白質結合。結果顯示hTGFβRII/αPDL1/TXM可與結合盤的TGFβ3結 合，EC50為3.617nM。
第19B圖是顯示hαPDL1/TGFβRII/TXM與TGF-β3結合獲得的結果的圖。進行ELISA以評估hαPDL1/TGFβRII/TXM與TGF-β3的結合。首先將孔用TGFβ3(0.5μg/ml)塗佈過夜，然後與連續稀釋的hαPDL1/TGFβRII/TXM一起培養。使用抗hIgG-辣根過氧化物酶(HRP)偵測蛋白質結合。結果顯示hαPDL1/TGFβRII/TXM可與結合盤的TGFβ3結合，EC50為2.447nM。
第20圖是顯示從評估hTGFβRII/αPDL1/TXM的抗腫瘤活性的實驗獲得的結果的圖。為了評估hTGFβRII/αPDL1/TXM蛋白質的抗腫瘤活性，將CellTrace標記的PD-L1+H441肺腫瘤細胞與人類NK細胞以10：1的E：T比在37℃，在所示的不同的蛋白質存在下培養20小時。然後洗滌細胞，並將其重新懸浮於2μg/ml PI溶液中。死亡PI+CellTrace+H441腫瘤細胞的百分比係以流式細胞術測定，並表示由不同蛋白質介導的腫瘤細胞之NK細胞依賴性殺傷。結果顯示，hTGFβRII/αPDL1/TXM蛋白可誘發針對腫瘤細胞的ADCC。
第21圖是顯示從評估hαPDL1/TGFβRII/TXM的抗腫瘤活性的實驗獲得的結果的圖。為了評估hαPDL1/TGFβRII/TXM蛋白質的抗腫瘤活性，將CellTrace標記的PD-L1+H441肺腫瘤細胞與人類NK細胞以10：1的E：T比在37℃，在所示的不同蛋白質的存在下培養20小時。然後洗滌細胞，並將其重新懸浮於2μg/ml PI溶液中。死亡PI+CellTrace+H441腫瘤細胞的百分比係以流式細胞術測定，並表示由不同蛋白質介導的腫瘤細胞之NK細胞依賴性殺傷。結果顯示，hαPDL1/TGFβRII/TXM蛋 白質可誘發針對腫瘤細胞的ADCC。
第22A圖是αPDL1/TxM/TGFβRII構築體的示意圖。第22B圖：αPD-L1/TxM、αPDL1/TxM/TGFβRII和對照抗體在還原(左)和非還原的條件(右)的SDS-PAGE上跑膠。第22C圖是αPDL1/TxM/TGFβRII和Rsbc6(αPDL1Ab)的SPR分析。以Fc捕獲將αPDL1/TxM/TGFβRII和Rsbc6固定在SPR感測器上。以Pioneer FE(Fortebio)的OneStep動力學分析測定對PD-L1的結合親和力。第22D圖是αPDL1/TxM/TGFβRII的SEC-HPLC的結果，顯示93%純度。第22E圖證明了針對PD-L1陽性腫瘤細胞(MDA-MB-231乳房腫瘤細胞)的αPD-L1/TxM、阿維單抗、Rsbc6(抗PD-L1)、αPDL1/TxM/TGFβRIIR的ADCC活性。αPD-L1/TxM顯示~85%的最高殺傷，而αPDL1/TxM/TGFβRII顯示~30%的最高殺傷。
第23圖是顯示TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3與αPDL1/TxM/TGFβRII結合的表面等離子共振(SPR)分析的一系列圖。以Fc捕獲將αPDL1/TxM/TGFβRII固定在SPR感測器上。以Pioneer FE(Fortebio)的OneStep動力學分析確定對TGFβ1(左圖)、TGFβ2(中圖)和TGFβ3(右圖)的結合親和力。
第24圖是用於評估蛋白質的免疫檢查點活性的標準化PD-L1阻斷測定法的示意圖。
第25A圖是顯示與αPDL1Ab相比，以hαPDL1/TGFβRII/TxM和hTGFβRII/αPDL1/TxM阻斷PD-L1介導的免疫細胞抑制獲得的結果的圖。第25B圖是顯示與αPDL1Ab相比，hαPDL1/TxM/TGFβRII和hTGFβRII/αPDL1/TxM阻斷PD-L1介導的免疫細胞抑 制所獲得的結果的圖。將增加濃度的hαPDL1/TGFβRII/TxM、hTGFβRII/αPDL1/TxM和hαPDL1/TxM/TGFβRII加入標準化的基於細胞的PD-L1阻斷測定法中(第24圖)。以T細胞活化測量複合體阻斷免疫抑制的能力，導致NFAT-RE介導的發光。抗PD-L1抗體和PD-L1/TxM蛋白質複合體(類似於TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM複合體，但缺少TGFβRII域)作為陽性對照。
第26A和26B圖是證明與親本對照分子(αPDL1/TxM，第26B圖)的活性相比較的每個分子(N-810，第26A圖)的人類TGFβ特異性阻斷活性的圖。將穩定的基於細胞螢光酶的報告系統(HEK-293T-luc2P/SBE)用以評估特異性TGFβ阻斷活性。在阻斷劑存在或不存在的情況下，用0.0175nM重組人類TGFβ1刺激培養的細胞20小時。對hTGFβ1的反應係由相對發光單位(RLU)±SD表示。
第27A圖和第27B圖是顯示與親本對照分子(αPDL1/TxM，第27B圖)的活性相比較的每個分子(N-810 Sorrento-Fc，第27A圖)的特異性hTGFβ1阻斷活性的圖。將穩定的基於細胞螢光酶的報告系統(HEK-293T-luc2P/SBE)用以評估特異性TGFβ阻斷活性。在阻斷劑存在或不存在的情況下，用0.0175nM重組人類TGFβ1刺激培養的細胞20小時。對hTGFβ1的反應係由相對發光單位(RLU)±SD表示。
第28A圖和第28B圖是顯示與親本對照分子(αPDL1/TxM，第28B圖)的活性比較的每個分子(N-810△C，第28A圖)的特異性hTGFβ1阻斷活性的圖。將穩定的基於細胞螢光酶的報告系統(HEK-293T-luc2P/SBE)以評估特異性TGFβ阻斷活性。在阻斷劑存在或不存在的情況 下，用0.0175nM重組人類TGFβ1刺激培養的細胞20小時。對hTGFβ1的反應係由相對發光單位(RLU)±SD表示。
第29A圖和第29B圖是顯示與親本對照分子(αPDL1/TxM，第29B圖)的活性相比較的每個分子(N-810D，第29A圖)的特異性hTGFβ1阻斷活性的圖。將穩定的基於細胞螢光酶的報告系統(HEK-293T-luc2P/SBE)用以評估特異性TGFβ阻斷活性。在阻斷劑存在或不存在的情況下，用0.0175nM重組人類TGFβ1刺激培養的細胞20小時。對hTGFβ1的反應係由相對發光單位(RLU)±SD表示。
第30圖是證明TxM構築體在乳癌細胞(MDA-MB-231)中的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)的圖。將抗體依賴性細胞毒性(ADCC)用以確定特異性αPD-L1活性。效應細胞：haNK(NK-92衍生物)。
第31A至31H圖是顯示各種構築體的示意圖。第31A圖：N-810A。第31B圖：N-810A無糖基化。第31C圖：N-810A無糖基化，△游離半胱胺酸。第31D圖：N-810A△鉸鏈。第31E圖：N-810A(IL15-K41Q、L45S、I67T、N79Y、E93A)。IL15中的突變增強了分子的溶解度和表現。第31F圖：N-810A(IL15-L45S)。IL15中的突變增強了分子的溶解度和表現。第31G圖：N-810D。第31H圖：N-810E。
第32圖是證明IL15突變增加蛋白質產量和減少凝聚的表。N-810D的變化還增加產量，並減少凝聚。
本發明至少部分基於令人驚訝的發現，亦即，多特異性基於 IL-15的蛋白質複合體增強免疫細胞的活性並促進其對抗疾病細胞的活性，從而導致疾病的減少或預防。這些蛋白質複合體還顯示出與疾病和標靶抗原的結合增加。本文提供了多特異性蛋白質複合體，其具有一個包括IL-15或功能性變異體之域、細胞因子受體或細胞因子配體，以及包括疾病特異性結合域、免疫檢查點抑制劑或免疫促效劑的結合域。此等蛋白質複合體可用於治療個體的贅瘤形成、傳染病或自體免疫疾病的方法。因此，本文提供了以PD-L1/TGFβRII/TxM為特徵的組成物和使用此等組成物增強針對贅瘤形成(例如，固態和血液腫瘤)的免疫反應的方法。
如本文所述，使用具有靶向患病細胞的宿主免疫辨識和反應能力的蛋白質是治療癌症、傳染病和自體免疫疾病的有效策略。如美國專利第8,507,222號(藉由引用方式併入本文)中所述，包括IL-15和IL-15受體α域的蛋白質支架已用於產生能夠辨識疾病細胞上的抗原和免疫細胞上的受體的多特異性蛋白質。參見美國專利第8,507,222號之實施例15。本文描述了包括與辨識免疫檢查點或訊號傳遞分子的一個或多個結合域連接之IL-15和IL-15受體α的可溶性多特異性蛋白質複合體的產生。在一些情況下，這些複合體還包括辨識抗原的結合域，例如PD-L1、ssDNA、CD20、HER2、EGFR、CD19、CD38、CD52、GD2、CD33、Notch1、細胞間黏附分子1(ICAM-1)、組織因子、HIV包膜或其他腫瘤抗原，在疾病細胞上表現。
在一些情況下，結合域包括單鏈抗體，其中免疫球蛋白輕鏈可變域藉由多肽連接子序列與免疫球蛋白重鏈可變域共價連接。單鏈抗體域可以以VH-連接子-VL或VL-連接子-VH形式排列。或者，結合域包括 能夠做為免疫檢查點抑制劑或免疫促效劑的可溶性或細胞外配體或受體域。無論有或沒有另外的連接子序列，辨識免疫檢查點或訊號傳遞分子的結合域與IL-15或IL-15受體α蛋白的N-或C末端連接，只要保持結合活性即可。較佳地，結合域與人類IL-15N72D超促效劑蛋白質(huIL-15N72D)的N末端連接。或者，結合域與人類IL-15N72D蛋白質的C末端連接。較佳地，結合域與人類IL-15受體α sushi域(huIL-15RαSu)的N末端連接。或者，結合域與huIL-15RαSuFc蛋白的C末端連接。在一些情況下，本發明的多特異性蛋白質複合體還包括IgG Fc域，以用於蛋白質二聚化和免疫細胞上CD16受體的辨識。此域介導針對標靶細胞的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)、抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)和補體依賴性細胞毒性(CDC)的刺激。在一些實例中，使用具有增強或降低的CD16結合活性的Fc域是有用的。在一個態樣，Fc域含有降低ADCC活性之胺基酸取代L234A和L235A(LALA)(Fc共有序列為基準的數目)，但保留形成二硫鍵結合的二聚體的能力。
因此，在某些具體實施例中，經單離的可溶性融合蛋白質複合體包括至少兩種可溶性蛋白質複合體，第一可溶性蛋白質複合體包括介白素-15(IL-15)多肽域，第二可溶性蛋白質包括與免疫球蛋白Fc域融合的結合的可溶性IL-15受體α sushi域(IL-15RαSu)，其中免疫球蛋白Fc域與轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)域融合或連接；第一可溶性蛋白質及/或第二可溶性蛋白質還包括特異性地結合疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子的結合域，以及第一可溶性蛋白質的IL-15域與第二可溶性蛋白質的IL-15RαSu域結合以形成可溶性融合蛋白質複合體。在某 些態樣，免疫球蛋白Fc域經由連接子分子與轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)域連接。
在某些具體實施例中，可溶性融合複合體包括至少兩種可溶性蛋白質，亦即，第一融合蛋白質和第二融合蛋白質，其中該第一融合蛋白質包括包含與第二TGFβRII域連接的第一TGFβRII域之轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)二聚體，其中該TGFβRII二聚體與介白素-15(IL-15)多肽域融合或連接；該第二融合蛋白質包括與免疫球蛋白Fc域融合的可溶性IL-15受體α sushi結合域(IL-15RαSu)；其中該第二融合蛋白質還包括特異性地結合疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子的結合域，以及其中該第一融合蛋白質的IL-15域與該第二融合蛋白的IL-15RαSu域結合以形成可溶性融合蛋白質複合體。
在某些具體實施例中，可溶性融合複合體包括至少兩種可溶性蛋白質，亦即，第一融合蛋白質和第二融合蛋白質，其中該第一融合蛋白質包括與特異性地結合疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子的結合域融合的介白素-15(IL-15)多肽域；該第二融合蛋白質包括包括與第二TGFβRII域連接的第一TGFβRII域之轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)二聚體，其中該TGFβRII二聚體和可溶性IL-15受體α sushi結合域(IL-15RαSu)與免疫球蛋白Fc域融合；其中該第一或第二TGFβRII域與IL-15RαSu域融合，其中該第一融合蛋白質的IL-15多肽域與第二融合蛋白質的IL-15RαSu域結合以形成可溶性融合蛋白質複合體。
在某些具體實施例中，第一可溶性蛋白質或第二可溶性蛋白質之一者還包括特異性地結合疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞 分子的第二結合域。
在某些具體實施例中，IL-15多肽包括N72D突變(IL-15N72D)的IL-15變異體。
在某些具體實施例中，結合域包括藉由多肽連接子序列與免疫球蛋白重鏈可變域共價連接的免疫球蛋白輕鏈可變域。
在某些具體實施例中，結合域特異性地結合一種或多種分子，包括：計畫性死亡配體1(PD-L1)、計畫性死亡1(PD-1)、細胞毒性T淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)、簇分化33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮質激素誘發的腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族相關基因(GITR)、淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)、組織因子(TF)、類δ蛋白質4(DLL4)、單股DNA或T細胞免疫球蛋白和黏蛋白域-3(Tim-3)。
在某些具體實施例中，結合域特異性地結合一種或多種分子，包括：計畫性死亡配體1(PD-L1)。在某些具體實施例中，TGFβRII域結合轉化因子β(TGFβ)。
在某些具體實施例中，第一融合蛋白質複合體藉由二硫鍵與第二融合蛋白質複合體共價連接，該二硫鍵將第一可溶性融合蛋白質複合體的Fc域與第二可溶性融合蛋白質複合體的Fc域連接。
介白素-15
介白素-15(IL-15)是效應子NK細胞和CD8+記憶T細胞的發育、增殖和活化的重要細胞因子。IL-15與IL-15受體α(IL-15Rα)結合，且在與效應細胞的IL-2/IL-15受體β-共同γ鏈(IL-15Rβγc)複合體橫越呈現。IL-15和IL-2共享與IL-15Rβyc的結合，並經由STAT3和STAT5途 徑發出訊號。然而，與IL-2不同，IL-15不支持CD4+CD25+FoxP3+調節性T(Treg)細胞的維持或誘發活化的CD8+T細胞的細胞死亡，其為可能限制IL-2對多發性骨髓瘤的治療活性。另外，IL-15是已知的唯一能夠為效應子CD8+T細胞提供抗細胞凋亡訊號傳遞傳遞的細胞因子，無論是單獨投予IL-15還是以其與IL-15Rα的複合體投予，在實驗動物模式中顯示出針對成熟的固態瘤的有效抗腫瘤活性，因此，已被確定為可能治癒癌症的最有希望的免疫治療藥物之一。首次人體臨床試驗發現，投予重組人類(rh)IL-15的患者γδT細胞、CD8+T細胞和NK細胞顯著增加，但高劑量導致毒性和受限的腫瘤反應受限。2還觀察到原核生物rhIL-15的半衰期相對較短。
為了促進基於IL-15的癌症治療劑的臨床開發，辨識了與IL-15相比具有增加的生物活性的IL-15突變異體(IL-15N72D)(Zhuet al.,J Immunol,183：3598-3607,2009)。這IL-15超促效劑(IL-15N72D)的藥物代謝動力學和生物活性係藉由產生IL-15N72D：IL-15Rα/Fc融合複合體(ALT-803)而進一步改善，使得超促效劑複合體具有體內原始細胞因子活性的至少25倍(Han等，Cytokine，56：804-810,2011)。
免疫檢查點抑制劑和免疫促效劑域
在其他具體實施例中，結合域對免疫檢查點或訊號傳遞分子或其配體特異，並且作為免疫檢查點抑制活性的抑制劑或作為免疫刺激活化性的促效劑。此等免疫檢查點和訊號傳遞分子和配體包括PD-1、PD-L1、PD-L2、CTLA-4、CD28、CD80、CD86、B7-H3、B7-H4、B7-H5、ICOS-L、ICOS、BTLA、CD137L、CD137、HVEM、KIR、4-1BB、OX40L、CD70、CD27、CD47、CIS、OX40、GITR、IDG、TIM3、GAL9、VISTA、 CD155、TIGIT、LIGHT、LAIR-1、Siglecs和A2aR(Pardoll)DM.2012.Nature rev Cancer 12：252-264,Thaventhiran Tet al.,2012.J Clin Cell Immunol S12：004)。另外，本發明的較佳抗體域可包括伊匹單抗及/或曲美木單抗(tremelimumab)(抗-CTLA4)、納武單抗(nivolumab)、派姆單抗(pembrolizumab)、皮地利珠單抗(pidilizumab)、TSR-042、ANB011、AMP-514以及AMP-224(配體-Fc融合體)(抗-PD1)、阿特珠單抗(MPDL3280A)、阿維單抗(avelumab)(MSB0010718C)、得瓦魯單抗(durvalumab)(MEDI4736)、MEDI0680以及BMS-9365569(抗PDL1)、MEDI6469(抗OX40促效劑)、BMS-986016、IMP701、IMP731、IMP321(抗LAG3)以及GITR配體。
細胞因子受體和細胞因子
與本文所體現的IL-15分子融合或連接的細胞因子受體與導致免疫活性增強之免疫刺激細胞因子結合。細胞因子的實例包括，但不限於，IL-2家族、干擾素(IFN)、IL-10、IL-1、IL-17、TGF以及TNF細胞因子家族、以及IL-1至IL-35、IFN-α、IFN-β、IFNγ、TGF-β、TNF-α和TNFβ。例示性受體是結合TGFβ之轉化生長因子β受體II(TGFβRII)。由這基因編碼的蛋白質是具有蛋白激酶域的跨膜蛋白，與TGF-β受體第1型形成異二聚體複合體，並結合TGF-β。這受體/配體複合體使蛋白質磷酸化，然後蛋白質進入細胞核並調節與細胞增殖、細胞週期停滯、傷口癒合、免疫抑制和腫瘤發生相關的基因的轉錄。這基因的突變與Marfan症候群、Loeys-Deitz主動脈瘤症候群以及各種類型腫瘤的發展有關。TGFβRII的細胞外域可與TGF-β結合且阻斷其活性。在腫瘤微環境中，TGF-β經由基 質修飾、血管生成和上皮-間質轉化(EMT)的誘發來促進腫瘤進展。TGF-β1可直接抑制T細胞增殖和反應以及自然殺手(NK)細胞活性。此外，骨髓細胞中的TGF-β訊號傳遞對於驅動轉移至關重要。
抗原特異性結合域
抗原特異性結合域係由特異性地結合患病細胞的標靶的多肽所組成。或者，這些域可以與支持疾病狀態的其他細胞的標靶結合，諸如支持腫瘤生長的基質細胞的標靶或支持疾病介導的免疫抑制的免疫細胞的標靶。抗原特異性結合域包括抗體、單鏈抗體、Fab、Fv、T細胞受體結合域、配體結合域、受體結合域、域抗體、單域抗體、微抗體、奈米抗體、肽體或各種其他抗體模擬物(例如阿非摩(affimer)、阿非廷(affitin)、阿爾發體(alphabody)、阿萃摩(atrimer)、CTLA4分子、阿德奈汀(adnectin)、抗運載蛋白(anticalin)、庫尼次(Kunitz)域蛋白、高親和性多聚體(avimer)、打結素(knottin)、非諾摩(fynomer)、錨蛋白重複蛋白(darpin)、親和體(affibody)，泛素(affilin)、單抗體(monobody)以及基於犰狳重複蛋白質之蛋白質(Weidle,UHet al.,2013.Cancer Genomics & Proteomics 10：155-168)。
在某些具體實施例中，抗原特異性結合域的抗原包括細胞表面受體或配體。在進一步的具體實施例中，抗原包括CD抗原、細胞因子或趨化因子受體或配體、生長因子受體或配體、組織因子、細胞黏附分子、MHC/類MHC分子、Fc受體、類Toll受體、NK受體、TCR、BCR、陽性/陰性共刺激受體或配體、死亡受體或配體、腫瘤相關抗原或病毒編碼的抗原。
較佳地，抗原特異性結合域能夠結合腫瘤細胞上的抗原。腫瘤特異性結合域可以源自批准用於治療癌症患者的抗體，包括利妥昔單抗、奧法木單抗以及奧比珠單抗(抗CD20抗體)；曲妥珠單抗和帕妥珠單抗(抗HER2抗體)；西妥昔單抗和帕尼單抗(抗EGFR抗體)；以及阿侖單抗(alemtuzumab)(抗CD52抗體)。類似地，可以使用來自批准的對CD20(90Y標記的替伊莫單抗(ibritumomab tiuxetan)、131I標記的托西莫單抗(tositumomab))、HER2(阿多曲妥珠單抗依酯(ado-ttastuzumab emtansine))、CD30(本妥昔單抗(brentuximab vedotin))和CD33(吉妥珠单抗奥咗咪星(gemtuzumab ozogamicin))特異的抗體-效應分子接合物的結合域(Sliwkowski MX,Mellman I.2013 Science 341：1192)。
另外，本發明的較佳結合域可包括發明所屬領域中已知的各種其他腫瘤特異性抗體域。用於治療癌症的抗體及其各自的標靶包括，但不限於，納武單抗(抗PD-1 Ab)，、A99(抗-gp75)、3F8(抗-GD2)、8H9(抗-B7-H3)、阿巴付單抗(abagovomab)(抗CA-125(仿造))、阿德木單抗(adecatumumab)(抗EpCAM)、阿夫土珠單抗(afutuzumab)(抗CD20)、培阿賽珠單抗(alacizumab pegol)(抗VEGFR2)、潘提奧單抗三胺五乙酸酯(penteomab pentetate)(抗CEA)、阿麥妥昔單抗(amatuximab)(抗間皮素)、AME-133(抗CD20)，麻安末單抗(anatumomab mafenatox)(抗TAG-72)、阿泊珠單抗(apolizumab)(抗HLA-DR)、阿西莫單抗(arcitumomab)(抗CEA)、巴維昔單抗(bavituximab)(抗磷脂醯絲胺酸)、貝妥莫單抗(bectumomab)(抗CD22)、貝利木單抗(belimumab)(抗-BAFF)、貝索單抗(besilesomab)(抗CEA相關抗原)，貝伐單抗(抗VEGF-A)、莫-比伐珠單抗 (bivatuzumab mertansine)(抗CD44 v6)、博納吐單抗(blinatumomab)(抗CD19)、BMS-663513(抗CD137)、本妥昔單抗(抗CD30(TNFRSF8))、美坎妥珠單抗(cantuzumab mertansine)(抗黏蛋白CanAg)、拉坎妥珠(cantuzumab ravtansine)(抗MUC1)、卡羅單抗噴地肽(capromab pendetide)(抗前列腺癌細胞)、卡魯單抗(carlumab)(抗MCP-1)、卡妥索單抗(catumaxomab)(抗EpCAM，CD3)、cBR96-多柔比星免疫接合物(抗Lewis-Y抗原)、CC49(抗-TAG-72)、西利珠單抗(cedelizumab)(抗-CD4)、Ch.14.18(抗-GD2)、ch-TNT(抗DNA相關抗原)、泊西他珠單抗(citatuzumab bogatox)(抗-EpCAM)、西妥木(cixutumumab)(抗-IGF-1受體)、替坦司可利妥珠單抗(clivatuzumab tetraxetan)(抗MUC1)、可那妥木單抗(conatumumab)(抗TRAIL-R2)、CP-870893(抗CD40)、達西珠單抗(dacetuzumab)(抗CD40)、達利珠單抗(daclizumab)(抗CD25)、達羅土珠單抗(dalotuzumab)(類抗胰島素)生長因子I受體)、達雷木單抗(daratumumab)(抗CD38(環狀ADP核糖水解酶))、登西珠單抗(demcizumab)(抗DLL4)、地莫單抗(detumomab)(抗B淋巴瘤細胞)、多茲圖單抗(drozitumab)(抗DR5)、杜力戈圖單抗(duligotumab)(抗HER3)、杜西吉土單抗(dusigitumab)(抗ILGF2)、依美昔單抗(ecromeximab)(抗GD3神經節苷脂)、依決洛單抗(edrecolomab)(抗EpCAM)、埃洛妥珠單抗(elotuzumab)(抗SLAMF7)，艾匹莫單抗(elsilimomab)(抗IL-6)、埃文單抗(enavatuzumab)(抗TWEAK受體)、恩替庫單抗(enoticumab)(抗-DLL4)、恩司昔單抗(ensituximab)(抗5AC)、西吐夕坦(epitumomab cituxetan)(抗組合蛋白)、依帕珠單抗(epratuzumab)(抗-CD22)、厄妥索單抗 (ertumaxomab)(抗HER2/neu，CD3)、埃達珠單抗(etaracizumab)(抗整聯蛋白αvβ3)、法拉莫單抗(faralimomab)(抗干擾素受體))、法勒珠單抗(farletuzumab)(抗葉酸受體1)、FBTA05(抗CD20)、芬克拉妥珠單抗(ficlatuzumab)(抗)-HGF)、芬妥木單抗(figitumumab)(抗IGF-1受體)、弗拉伏妥單抗(flanvotumab)(抗TYRP1(醣蛋白75))、夫蘇木單抗(fresolimumab)(抗TGFβ)、弗妥昔單抗(futuximab)(抗EGFR)、加利昔單抗(galiximab)(抗CD80)、甘尼妥單抗(ganitumab)(抗)-IGF-I)、吉妥珠单抗奥咗咪星(抗CD33)、吉瑞妥昔單抗(girentuximab)(抗碳酸酐酶9(CA-IX))、格萊木單抗-維多汀(glembatumumab vedotin)(抗GPNMB)、體古塞庫單抗(guselkumab)(抗IL13)、ibalizumab(抗CD4)，替伊莫單抗(抗CD20)、克盧庫單抗()(抗VEGFR-1)、伊戈伏單抗(igovomab)(抗CA-125)、IMAB362(抗CLDN18.2)、IMC-CS4(抗CSFIR)、IMC-TR1(TGFβRII)、英加妥珠單抗(imgatuzumab)(抗EGFR)、英克拉庫單抗(inclacumab)(抗選擇素P))、達西單抗(indatuximab ravtansine)(抗SDC1)、奥英妥珠單抗(inotuzumab ozogamicin)(抗CD22)、應妥木單抗(intetumumab)(抗CD51)、伊匹單抗(抗CD152)、伊妥木單抗)(抗CD30(TNFRSF8))、KM3065(抗CD20)、KW-0761(抗CD194)、LY2875358(抗MET)拉貝珠單抗(抗CEA)、彭博拉單抗(lambrolizumab)(抗PDCD1)、來沙木單抗(lexatumumab)(抗TRAIL-R2)、林妥珠單抗(lintuzumab)(抗CD33)、利麗單抗(lirilumab)(抗KIR2D)、莫-洛伏珠單抗(lorvotuzumab mertansine)(抗CD56)、鲁卡木單抗(lucatumumab)(抗CD40)、鲁昔單抗(lumiliximab)(抗CD23(IgE受體))、馬帕木單抗(mapatumumab)(抗TRAIL-R1)、馬吉妥昔 單抗(margetuximab)(抗ch4D5)、馬妥昔單抗(matuzumab)(抗EGFR)、馬夫利木單抗(mavrilimumab)(抗GMCSF受體α鏈)、米拉珠單抗(抗CD74)、米妥莫單抗(minretumomab)(抗TAG-72)、明瑞莫單抗(mitumomab)(抗GD3神經節苷脂)、莫加珠單抗(mogamulizumab)(抗CCR4)、莫西托莫單抗-帕蘇多托(moxetumomab pasudotox)(抗CD22)、他那可單抗(nacolomab tafenatox)(抗C242抗原)、他那莫單抗(naptumomab estafenatox)(抗5T4)、納那妥單抗(narnatumab)(抗RON)、耐昔妥珠單抗(necitumumab)(抗EGFR)、奈伐單抗(nesvacumab)(抗血管生成素2)、尼妥珠單抗(抗EGFR)、納武單抗(抗IgG4)、巰諾莫單抗(nofetumomab merpentan)、奥美珠單抗(ocrelizumab)(抗CD20)、維妥珠單抗(ocaratuzumab)(抗CD20)、奧拉單抗(olaratumab)(抗PDGF-Rα)、奧納土蘇單抗(onartuzumab)(抗c)-MET)、歐土希珠單抗(ontuxizumab)(抗-TEM1)、莫奥珠單抗(oportuzumab monatox)(抗-EpCAM)、奥戈伏單抗(oregovomab)(抗-CA-125)、奥特樂土珠單抗(otlertuzumab)(抗-CD37)、潘可單抗(pankomab)(MUC1的抗腫瘤特異性糖基化)、巴薩妥珠單抗(parsatuzumab)(抗EGFL7)，帕考珠單抗(抗IL-4)、帕曲土單抗(patritumab)(抗HER3)、培妥莫單抗(pemtumomab)(抗MUC1)，帕妥珠單抗(抗HER2/neu)、皮地利珠單抗(抗PD-1)、平尼土珠單抗(pinatuzumab vedotin)(抗CD22))、帕尼單抗(pintumomab)(抗腺癌抗原)、泊拉妥珠單抗維多汀(polatuzumab vedotin)(抗CD79B)、普托木單抗(pritumumab)(抗波形蛋白)、PRO131921(抗CD20)、奎利珠單抗(quilizumab)(抗IGHE)、雷妥莫單抗(racotumomab)(抗N-羥乙醯神經胺酸)、雷德圖單抗(radretumab)(抗纖連蛋白額外域-B)、雷莫蘆單抗 (ramucirumab)(抗VEGFR2)、利妥木單抗(rilotumumab)(抗HGF)、羅妥木單抗(robatumumab)(抗IGF-1受體)、羅勒杜單抗(roledumab)(抗RHD)、羅維珠單抗(rovelizumab)(抗CD11和CD18)、沙瑪立珠單抗(samalizumab)(抗CD200)、沙妥莫單抗噴地肽(satumomab pendetide)(抗-TAG-72)、賽巴坦單抗(seribantumab)(抗ERBB3)，SGN-CD19A(抗-CD19)，SGN-CD33A(抗-CD33)、西羅珠單抗(sibrotuzumab)(抗-FAP)、司妥昔單抗(siltuximab)(抗-IL-6)、索利托單抗(solitomab)(抗-EpCAM)、索土珠單抗(sontuzumab)(抗組合蛋白)、他貝魯單抗(tabalumab)(抗BAFF)、他珠單抗(tacatuzumab tetraxetan)(抗甲胎蛋白)、帕他普莫單抗(taplitumomab paptox)(抗CD19)、阿替莫單抗(telimomab aritox)、替妥莫單抗(tenatumomab)(抗肌腱蛋白C)、替奈昔單抗(teneliximab)(抗-CD40)、利妥昔單抗(teprotumumab)(抗-CD221)、TGN1412(抗-CD28)、替西木單抗(ticilimumab)(抗-CTLA-4)、替加珠單抗(tigatuzumab)(抗-TRAIL-R2)、TNX-650(抗-IL-13)、托西莫單抗(抗-CS20)、托維圖單抗(tovetumab)(抗-CD140a)、TRBS07(抗-GD2)、曲加立珠單抗(tregalizumab)(抗-CD4)、曲美木單抗(抗-CTLA-4)、TRU-016(抗-CD37)、西莫白介素單抗(tucotuzumab celmoleuki)(抗-EpCAM))、烏利昔單抗(ublituximab)(抗CD20)、烏瑞魯單抗(urelumab)(抗-4-1BB)、萬替珠單抗(vantictumab)(抗捲曲蛋白受體)、巴利昔單抗(vapaliximab)(抗AOC3(VAP-1))、伐特珠單抗(vatelizumab)(抗-ITGA2)、維妥珠單抗(veltzumab)(抗CD20)、維森庫單抗(vesencumab)(抗NRP1)、維西珠單抗(visilizumab)(抗CD3)、沃羅昔單抗(volociximab)(抗整聯蛋白α5β1)、司妥珠單抗-馬佛多汀(vorsetuzumab mafodotin)(抗CD70)、伏妥莫單抗(votumumab)(抗腫瘤抗原CTAA16.88)、扎盧木單抗(zalutumumab)(抗EGFR)、扎木單抗(zanolimumab)(抗CD4)、扎妥昔單抗(zatuximab)(抗HER1)、齊拉木單抗(ziralimumab)(抗CD147(basigin))、RG7636(抗ETBR)、RG7458(抗MUC16)、RG7599(抗NaPi2b)、MPDL3280A(抗PD-L1)、RG7450(抗STEAP1)以及GDC-0199(抗Bcl-2)。
可用於本發明的其他抗體域或腫瘤標靶結合蛋白質(例如TCR域)包括，但不限於，彼等結合以下抗原者(注意，所示癌症適應症代表非限制性實例)：胺肽酶N(CD13)、膜聯蛋白A1、B7-H3(CD276，各種癌症)、CA125(卵巢癌)、CA15-3(癌)、CA19-9(癌)、L6(癌)、Lewis Y(癌)、Lewis X(癌)、甲胎蛋白(癌)、CA242(結直腸癌)、胎盤鹼性磷酸酶(癌)、前列腺特異性抗原(前列腺)、前列腺酸性磷酸酶(前列腺)、表皮生長因子(癌)、CD2(霍奇金病、NHL淋巴瘤(霍奇金病多發性骨髓瘤)、CD3ε(T細胞淋巴瘤、肺癌、乳癌、胃癌、卵巢癌、自體免疫疾病、惡性腹水)、CD19(B細胞惡性腫瘤)、CD20(非霍奇金淋巴瘤、B細胞腫瘤、自體免疫疾病)、CD21(B細胞淋巴瘤)、CD22(白血病、淋巴瘤、多發性骨髓瘤、SLE)、CD30(霍奇金淋巴瘤)、CD33(白血病、自體免疫疾病)、CD38(多發性骨髓瘤)、CD40(淋巴瘤、多發性骨髓瘤、白血病(CLL))、CD51(轉移性黑色素瘤、肉瘤)、CD52(白血病)、CD56(小細胞肺癌、卵巢癌、Merkel細胞癌、及液態腫瘤、多發性骨髓瘤、CD66e(癌)、CD70(轉移性腎細胞癌和非霍奇金淋巴瘤)、CD74(多發性骨髓瘤)、CD80(淋巴瘤)、CD98(癌)、CD123(白血病)、黏蛋白(癌)、CD221(固態瘤)、CD227(乳癌、卵巢癌)、CD262(NSCLC 和其他癌症)、CD309(卵巢癌)、CD326(固態瘤)、CEACAM3(結直腸癌、胃癌)、CEACAM5(CEA、CD66e)(乳癌、結直腸癌和肺癌)、DLL4(A樣-4)、EGFR(各種癌症)、CTLA4(黑色素瘤)、CXCR4(CD184，血色素腫瘤學，固態腫瘤)、內皮醣蛋白(CD105、固態瘤)、EPCAM(上皮細胞黏附分子、膀胱癌、頭癌、頸癌、結腸癌、NHL前列腺癌和卵巢癌)、ERBB2(肺癌、乳癌、前列腺癌)、FCGR1(自體免疫疾病)、FOLR(葉酸受體、卵巢癌)、FGFR(癌)、GD2神經節苷脂(癌)、G-28(細胞表面抗原醣脂、黑色素瘤)、GD3獨特型(癌)、熱休克蛋白(癌)、HER1(肺癌、胃癌)、HER2(乳癌、肺癌和卵巢癌)、HLA-DR10(NHL)、HLA-DRB(NHL，B細胞白血病)、人類絨毛膜促性腺激素(癌)、IGF1R(固態瘤，血癌)、IL-2受體(T細胞白血病和淋巴瘤)、IL-6R(多發性骨髓瘤、RA、卡斯曼(Castleman)氏症、IL6依賴性腫瘤)、整聯蛋白(對於各種癌症之αvβ3、α5β1、α6β4、α11β3、α5β5、αvβ5))、MAGE-1(癌)、MAGE-2(癌)、MAGE-3(癌)、MAGE 4(癌)、抗轉鐵蛋白受體(癌)、p97(黑色素瘤)、MS4A1(跨膜4域亞家族成員1、非霍奇金B細胞淋巴瘤、白血病)、MUC1(乳癌、卵巢癌、子宮頸癌、支氣管癌和胃腸癌)、MUC16(CA125)(卵巢癌)、CEA(結直腸癌症)、gp100(黑色素瘤)、MARTI(黑色素瘤)、MPG(黑色素瘤)、MS4A1(跨膜4域亞家族A，小細胞肺癌，NHL)、核仁素、Neu癌基因產物(癌)、P21(癌))、連接蛋白-4(癌)、抗(N-羥乙醯神經胺酸、乳癌、黑色素癌)之互補位、PLAP樣睪丸鹼性磷酸酶(卵巢癌、睪丸癌)、PSMA(前列腺腫瘤)、PSA(前列腺)、ROB04、TAG 72(腫瘤相關醣蛋白72、AML、胃癌、結直腸癌、卵巢癌)、T細胞跨膜蛋白(癌)、Tie(CD202b)、組織因子、TNFRSF10B(腫瘤壞死因子受體超家族 成員10B、癌)、TNFRSF13B(腫瘤壞死因子受體超家族成員13B，多發性骨髓瘤、NHL、其他癌症、RA和SLE)、TPBG(滋養細胞醣蛋白、腎細胞癌)、TRAIL-R1(腫瘤壞死凋亡誘發配體受體1、淋巴瘤、NHL、結直腸癌、肺癌)、VCAM-1(CD106、黑素瘤)、VEGF、VEGF-A、VEGF-2(CD309)(各種癌症)。已經回顧了一些其他腫瘤相關抗原標靶(Gerberet al.,mAbs 2009 1：247-253；Novellinoet al.,Cancer Immunol Immunother.2005 54：187-207，Frankeet al.,Cancer Biother Radiopharm.2000,15：459-76，Guoet al.,Adv Cancer Res.2013；119：421-475,Parmianiet al.,J Immunol.2007 178：1975-9)。這些抗原的實例包括分化簇(CD4、CD5、CD6、CD7、CD8、CD9、CD10、CD11a、CD11b、CD11c、CD12w、CD14、CD15、CD16、CDw17、CD18，CD21、CD23、CD24、CD25、CD26、CD27、CD28、CD29、CD31、CD32，CD34、CD35、CD36、CD37、CD41、CD42、CD43、CD44、CD45，CD46、CD47、CD48、CD49b、CD49c、CD53、CD54，CD55、CD58、CD59、CD61、CD62E、CD62L、CD62P、CD63、CD68、CD69、CD71、CD72、CD79、CD81、CD82、CD83、CD86，CD87、CD88，CD89、CD90、CD91，CD95、CD96、CD100、CD103、CD105、CD106、CD109、CD117、CD120、CD127、CD133、CD134，CD135、CD138、CD141、CD142、CD143、CD144、CD147、CD151、CD152、CD154、CD156、CD158、CD163、CD166、CD168、CD184、CDw186、CD195、CD202(a、b)、CD209、CD235a、CD271、CD303、CD304)、膜聯蛋白A1、核仁素、內皮醣蛋白(CD105)、ROB04、胺基肽酶N、-樣-4(DLL4)、VEGFR-2(CD309)、CXCR4(CD184)、Tie2、B7-H3、 WT1、MUC1、LMP2、HPV E6 E7、EGFRvIII、HER-2/neu、獨特型、MAGE A3、p53非突變異體、NY-ESO-1、GD2、CEA、MelanA/MART1、Ras突變異體、gp100、p53突變異體、蛋白酶3(PR1)、bcr-abl、酪胺酸酶、存活蛋白、hTERT、肉瘤易位斷點、EphA2、PAP、ML-IAP、AFP、EpCAM、ERG(TMPRSS2 ETS融合基因)、NA17、PAX3、ALK、雄激素受體、細胞週期蛋白B1、聚唾液酸、MYCN、RhoC、TRP-2、GD3、岩藻糖基GM1、間皮素、PSCA、MAGE A1、sLe(a)、CYPIB I、PLAC1、GM3、BORIS、Tn、GloboH、ETV6-AML、NY-BR-1、RGS5、SART3、STn、碳酸酐酶IX、PAX5、OY-TES1、精子蛋白17、LCK、HMWMAA、AKAP-4、SSX2、XAGE 1、B7H3、天冬醯胺內肽酶(legumain)、Tie2、Page4、VEGFR2、MAD-CT-1、FAP、PDGFR-β、MAD-CT-2、Notch1、ICAM1以及Fos相關抗原1。
另外，本發明的較佳結合域包括彼等對發明所屬技術領域中已知與感染細胞相關的抗原和表位標靶特異的結合域。這些標靶包括，但不限於，衍生自如下感染因子的標靶：HIV病毒(特別是衍生自HIV包膜刺突(spike)及/或gp120和gp41表位的抗原)、人類乳頭瘤病毒(HPV)、結核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis)、無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、嗜肺軍團菌(Legionella pneumophilia)、化膿性鏈球菌(Streptococcus pyogenes)、大腸桿菌(Escherichia coli)、淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)、腦膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)、肺炎球菌(Pneumococcus)、新型隱球菌(Cryptococcus neoformans)、莢膜組織胞漿 菌(Histoplasma capsulatum)-乙型流感、梅毒螺旋體(Treponema pallidum)、萊姆病螺旋體、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)、流產布魯氏菌(Brucella abortus)、狂犬病病毒、流感病毒、巨細胞病毒、單純皰疹病毒I、單純皰疹病毒II、人類血清細小病毒、呼吸道合胞病毒、水痘-帶狀皰疹病毒、B型肝炎病毒、C型肝炎病毒、麻疹病毒、腺病毒、人類T-細胞白血病病毒、艾斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus)、鼠白血病病毒、腮腺炎病毒、水皰性口炎病毒、辛德畢斯病毒、淋巴細胞性脈絡叢腦膜炎病毒、疣病毒、藍舌病毒、仙台病毒、貓白血病病毒、呼腸孤病毒、脊髓灰質炎病毒、猿猴病毒40、小鼠乳腺腫瘤病毒、登革熱病毒、風疹病毒、西尼羅河病毒、惡性瘧原蟲(Plasmodium falciparum)、間日瘧原蟲(Plasmodium vivax)、弓形蟲(Toxoplasma gondii)，克氏錐蟲(Trypanosoma rangeli)、克氏錐蟲(Trypanosoma cruzi)、羅德西亞錐蟲(Trypanosoma rhodesiensei)、布氏錐蟲(Trypanosoma brucei)、曼氏血吸蟲(Schistosoma mansoni)、日本血吸蟲(Schistosoma japonicum)，巴貝蟲(Babesia bovis)、盲腸型球蟲(Elmeria tenella)、蟠尾絲蟲(Onchocerca volvulus)，、熱帶利什曼原蟲(Leishmania tropica)，旋毛蟲(Trichinella spiralis)、水泰勒原蟲(Theileria parva)、胞狀條蟲(Taenia hydatigena)、羊條蟲(Taenia ovis)，無鉤絛蟲(Taenia saginata)、猥粒條蟲(Echinococcus granulosus)、有線絛蟲(Mesocestoides corti)、山羊黴漿菌性關節炎(Mycoplasma arthritidis)、豬鼻黴漿菌(M.hyorhinis)、口腔黴漿菌(M.orale)、精胺酸黴漿菌(M.arginini)、(Acholeplasma laidlawii)、唾液黴漿菌(M.salivarium)以及肺炎黴漿菌(M. pneumoniae)。
T細胞受體(TCR)
T細胞是細胞的亞組，其與其他免疫細胞類型(多形核細胞、嗜酸性粒細胞、嗜鹼性粒細胞、肥大細胞、B細胞、NK細胞)一起構成免疫系統的細胞組分。在生理條件下，T細胞在免疫監視和消除外來抗原中起作用。然而，在病理條件下，有令人信服的證據表示T細胞在疾病的引起和傳播中起主要作用。在這些病症中，中樞或外周的T細胞免疫耐受性的破壞是自體免疫疾病的引起中的基本過程。
TCR複合體係由至少七種跨膜蛋白所組成。二硫鍵連接(αβ或γδ)的異二聚體形成單型抗原辨識單元，而由ε、γ、δ、ζ和η鏈所組成的CD3的非變異鏈負責將配體結合與造成T細胞活化和細胞免疫反應的顯現(elaboration)之訊號傳遞路徑耦合。儘管TCR鏈具有基因多樣性，所有已知的次單元均有兩種結構特徵。首先，它們是具有單個跨膜域(假設為α螺旋)的跨膜蛋白。其次，所有TCR鏈具有在所預測的跨膜域內具有帶電胺基酸的不尋常特徵。恆定鏈具有單個負電荷，在小鼠和人類之間保守，並且可變鏈具有一個(TCR-β)或兩個(TCR-α)正電荷。TCR-α的跨膜序列在許多物種中高度保守，因此在系統發育可能作為重要的功能性角色用。含有親水性胺基酸精胺酸和離胺酸的八肽序列在物種之間是相同的。
T細胞反應係藉由抗原結合TCR而調節。一種類型的TCR是膜結合異二聚體，其係由類似於免疫球蛋白可變(V)和恆定(C)區域的α和β鏈組成。TCRα鏈包括共價連接的V-α和C-α鏈，而β鏈包括與C-β鏈共價連接的V-β鏈。V-α和V-β鏈形成口袋或裂口，其可以在主要組織 相容性複合體(MHC)(在人類中稱為HLA複合體)的背景下結合超抗原或抗原。參見，Davis Ann.Rev.of Immunology 3：537(1985)；Fundamental Immunology 3rd Ed.,W.Paul Ed.Rsen Press LTD.New York(1993)。
TCR鏈的細胞外域(αβ或γδ)還可以被設計為與異源跨膜域融合以在細胞表面表現。此等TCR可包括與CD3、CD28、CD8、4-1BB及/或嵌合活化受體(CAR)跨膜或活化域的融合。TCR還可以是包括αβ或γδ鏈的一個或多個抗原結合域的可溶性蛋白質。此等TCR可包括具有或不具有TCR恆定域之TCR可變域或其功能片段。可溶性TCR可以是異二聚體或單鏈分子。
Fc域
本發明的蛋白質複合體可含有Fc域。例如，PD-L1 TxM包括抗PD-L1 scAb/huIL-15N72D：抗PD-L1 scAb/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc融合複合體。已報道了將IgG的Fc區與另一種蛋白質的域(諸如，各種細胞因子和可溶性受體)組合的融合蛋白質(參見，例如，Caponet al.,Nature,337：525-531,1989；Chamowet al.,Trends Biotechnol,14：52-60,1996)；美國專利第5,116,964和5,541,087號)。原型融合蛋白質是經由IgG Fc鉸鏈區中的半胱胺酸殘基連接的同型二聚體蛋白質，產生類似於沒有重鏈可變和CH1域和輕鏈的IgG分子。包括Fc域的融合蛋白質的二聚體性質可有利於提供與其他分子的更高級相互作用(亦即，二價或雙特異性結合)。由於結構同源性，Fc融合蛋白質顯示出與具有相似同型的人類IgG相當的體內藥物代謝動力學特徵IgG類別之免疫球蛋白是人類血液中含量最豐富的蛋白質，其循環半衰期可長達21天。為了延長IL-15或IL-15融合蛋白質 的循環半衰期及/或增加其生物活性，本文描述了含有與共價連接到人類重鏈IgG蛋白質之Fc部分的IL-15Rα非共價結合的IL-15域的融合蛋白質複合體。
術語「Fc」是指片段可結晶區域，其是抗體的恆定區域，與稱為Fc受體的細胞表面受體和補體系統的一些蛋白質相互作用。這種「Fc」是二聚體形式。儘管較佳為IgG1和IgG2，天然Fc的原始免疫球蛋白來源較佳為人類來源，並且可以是任何免疫球蛋白。天然Fc係由單體多肽所組成，該單體多肽可藉由共價(亦即，二硫鍵)和非共價連繫(association)而連接成二聚體或多聚體形式。取決於類別(例如，IgG、IgA、IgE)或亞類(例如，IgG1、IgG2、IgG3、IgA1、IgGA2)，天然Fc分子的單體次單元之間的分子間二硫鍵的數量範圍為1至4。天然Fc的一個實例是由木瓜蛋白酶切割IgG產生的二硫鍵鍵結的二聚體(參見Ellison等人(1982),Nucleic Acids Res.10：4071-9)。本文所用的術語「天然Fc」對於單體、二聚體和多聚體形式是通用的。Fc域含有蛋白A、蛋白G、各種Fc受體和補體蛋白的結合位點。在一些具體實施例中，複合體的Fc域能夠與Fc受體相互作用，以介導抗體依賴性細胞介導的細胞毒性(ADCC)及/或抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。在其他應用中，複合體包括不能有效介導ADCC或ADCP的Fc域(例如，IgG4 Fc)。
在一些具體實施例中，術語「Fc變異體」是指從天然Fc修飾的分子或序列，但仍包括補救受體FcRn的結合位點。國際申請案WO 97/34631和WO 96/32478描述了例示性Fc變異體，以及與補救受體的相互作用，並且藉由引用方式而併入本文。因此，術語「Fc變異體」包括從 非人類天然Fc人源化的分子或序列。此外，天然Fc包括可以被去除的位點，因為它們提供了本發明的融合分子不需要的結構特徵或生物活性。因此，在某些具體實施例中，術語「Fc變異體」包括改變一個或多個天然Fc位點或殘基的分子或序列，其影響或涉及(1)二硫鍵形成、(2)與選定的宿主細胞的不相容性、(3)在選定的宿主細胞中表現時的N末端異質性、(4)糖基化、(5)與補體的相互作用、(6)與補救受體以外的Fc受體的結合、(7)抗體依賴性細胞的細胞毒性(ADCC)或(8)抗體依賴性細胞吞噬作用(ADCP)。此等改變可以增加或減少這些Fc特性中任一者或多者。在某些具體實施例中，Fc區是人類IgG Fc區，且包括在Fc區內的任何位置引入的一個或多個胺基酸取代、刪除、插入或修飾(例如，碳水化合物化學修飾)。在某些具體實施例中，與不包括一個或多個胺基酸殘基突變異體的野生型Fc區相比，人類IgG Fc變異體包括一個或多個胺基酸殘基突變異體，並且對FcRn具有增加的結合親和力。Fc結合相互作用對於新生兒受體的結合是必需的，但不限於增加IgG的血清半衰期。因此，在某些具體實施例中，相對於具有相同胺基酸序列但不包括一個或多個胺基酸取代、刪除、插入或修飾的抗體(在本文中稱為「可比較的分子」)(例如，在Fc區中的相應位置含有天然存在的胺基酸殘基的未修飾的Fc區)，人類IgG Fc變異體對至少一種或多種Fc配體(例如，FcRns)展現改變的結合親和力。後文中進一步詳述Fc變異體。
術語「Fc域」涵蓋如上定義的天然Fc和Fc變異體分子和序列。與Fc變異體和天然Fc一樣，術語「Fc域」包括單體或多聚體形式的分子，無論是從完整抗體切割還是藉由重組基因表現或藉由其他手段而 產生。
融合蛋白質複合體
本發明提供融合蛋白質複合體。在一些情況下，第一蛋白質包括與介白素-15(IL-15)或其功能片段共價連接的第一生物活性多肽；以及第二蛋白質包括與可溶性介白素-15受體α(IL-15Rα)多肽或其功能片段共價連接的第二生物活性多肽，其中該第一蛋白質的IL-15域與第二蛋白質的可溶性IL-15Rα域結合，以形成可溶性融合蛋白質複合體。本發明的融合蛋白質複合體還包括與第一蛋白質和第二蛋白質中的一者或兩者連接的免疫球蛋白Fc域或其功能片段。較佳地，與融合蛋白質連接的Fc域相互作用以形成融合蛋白質複合體。此複合體可以藉由免疫球蛋白Fc域之間的二硫鍵形成而安定。在一個態樣，本發明的可溶性融合蛋白質複合體包括IL-15多肽、IL-15變異體或其功能片段和可溶性IL-15Rα多肽或其功能片段，其中IL-15和IL-15Rα多肽中的一者或兩者還包括免疫球蛋白Fc域或其功能片段。
在某些實例中，第一蛋白質和第二蛋白質中的一者或兩者包括抗體或其功能片段。例如，結合域之一包括可溶性抗PD-L1單鏈抗體或其功能片段。在另一個實例中，其他或第二結合域包括抗CTLA4單鏈抗體或疾病抗原特異性抗體或其功能片段。在一個具體實施例中，本發明提供PD-L1 TxM，其包括可溶性抗PD-L1 scAb/huIL-15N72D：抗PD-L1 scAb/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc融合蛋白質複合體。在這複合體中，huIL-15N72D和huIL-15RαSu域在兩個抗PD-L1 scAb/huIL-15RαSu/huIgG1 Fc融合蛋白質相互作用並且huIgG1 Fc域以形成多鏈融合蛋白質複合體。
如本文所用，術語「生物活性多肽」或「效應分子」是指可產生如本文所述所期望的功效的胺基酸序列，諸如蛋白質、多肽或肽；糖或多醣；脂質或醣脂，醣蛋白或脂蛋白。效應分子還包括化學試劑。還考慮了編碼生物活性或效應蛋白、多肽或肽的效應分子核酸。因此，合適的分子包括調節因子、酶、抗體或藥物以及DNA、RNA和寡核苷酸。生物活性多肽或效應分子可以是天然存在的，或者可以由已知組分合成，例如藉由重組或化學合成，並且可以包括異源組分。根據標準分子篩分技術(諸如，離心或SDS-聚丙烯醯胺凝胺電泳)判斷，生物活性多肽或效應分子通常為約0.1至100KD或更高至約1000KD，較佳為約0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、30和50KD之間。本發明的期望功效包括但不限於，例如，形成本發明的具有增加的結合活性的融合蛋白質複合體以殺死標靶細胞，例如，以誘發細胞增殖或細胞死亡、啟動免疫反應，而預防或治療疾病，或者用作診斷目的的偵測分子。對於這種偵測，可以使用測定法，例如包含培養細胞使其增殖的連續步驟，和使細胞與本發明的融合複合體接觸，然後評估融合複合體是否抑制細胞的進一步發育的測定。
根據本發明之將效應分子與本發明的融合蛋白質複合體共價連接提供了許多顯著的優點。可以產生本發明的含有單一效應分子的融合蛋白質複合體，該效應分子包括已知結構的肽。另外，可以在類似的DNA載體中產生多種效應分子。還就是說，不同效應分子的庫(library)可以與融合蛋白質複合體連接，用於辨識感染或患病細胞。此外，對於治療應用，不是將本發明的融合蛋白質複合體投予個體，而是可以投予編碼融合蛋白質複合體的DNA表現載體以用於體內表現融合蛋白質複合體。此方法避 免了通常與重組蛋白質的製備相關的昂貴的純化步驟，並避免了與傳統方法相關的抗原攝取和加工的複雜性。
如上所述，本文揭露的融合蛋白的組分，例如效應分子，諸如細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白質毒素、免疫球蛋白域或其他生物活性分子和任何肽連接子，可以以幾乎任何方式組織，前提是融合蛋白具有所欲的功能。特別地，若期望，融合蛋白質的每種組分可以藉由至少一種合適的肽連接子序列與另一種組分隔開。另外，融合蛋白質可包含標籤，例如，以促進融合蛋白的修飾、辨識及/或純化。更具體的融合蛋白質在下述實施例中。
連接子
在某些具體實施例中，本發明的融合複合體還包含插入IL-15或IL-15Rα域與生物活性多肽之間的柔性連接子序列。連接子序列應允許生物活性多肽相對於IL-15或IL-15Rα域的有效定位，以允許兩個域的功能活性。
在某些情況下，可溶性融合蛋白質複合體具有連接子，其中第一生物活性多肽藉由多肽連接子序列與IL-15(或其功能片段)共價連接。在其他態樣，如本文所述的可溶性融合蛋白質複合體具有連接子，其中第二生物活性多肽藉由多肽連接子序列與IL-15Rα多肽(或其功能片段)共價連接。
連接子序列較佳係由核苷酸序列編碼，該核苷酸序列產生能夠有效定位TCR分子的結合溝槽以辨認呈現抗原或抗體分子的結合域以辨識抗原的肽。如本文所用，短語「生物活性多肽相對於IL-15或IL-15Rα 域的有效定位」或其他類似短語旨在表示與IL-15或IL-15Rα域連接的生物活性多肽係定位成使得IL-15或IL-15Rα域能夠彼此相互作用而形成蛋白質複合體。例如，IL-15或IL-15Rα域係經有效定位以允許與免疫細胞的相互作用而啟動或抑制免疫反應，或抑制或刺激細胞發育。
本發明的融合複合體較佳還包括插入IL-15或IL-15Rα域和免疫球蛋白Fc域之間的柔性連接子序列。連接子序列應允許Fc域、生物活性多肽和IL-15或IL-15Rα域的有效定位，以允許每個域的功能活性。例如，Fc域被有效定位以允許適當的融合蛋白質複合體形成及/或與補體系統的免疫細胞或蛋白質的Fc受體相互作用以刺激Fc介導的功效，包括助噬作用、溶胞、肥大細胞脫粒子、嗜鹼性粒細胞以及嗜酸性粒細胞，以及其他Fc受體依賴性過程；活化補體路徑；以及增強的融合蛋白質複合體的體內半衰期。
連接子序列還可用於連接生物活性多肽的兩個或更多個多肽，以產生具有期望的功能活性的單鏈分子。
較佳地，連接子序列包括約7至20個胺基酸，更佳為約10至20個胺基酸。連接子序列較佳為柔性的，以不將生物活性多肽或效應分子保持在單一的非期望的構型中。連接子序列可用於例如使辨識位點與融合分子間隔開。具體地，肽連接子序列可以位於生物活性多肽和效應分子之間，例如，以使其化學交聯並提供分子靈活性。連接子較佳係主要包括具有小側鏈的胺基酸(例如甘胺酸、丙胺酸和絲胺酸)，以提供柔韌性。較佳地，約80%或90%或更高的連接子序列包括甘胺酸殘基、丙胺酸殘基或絲胺酸殘基，特別是甘胺酸殘基和絲胺酸殘基。
可以使用不同的連接子序列，包括已成功用於將抗體可變區聯結在一起的許多柔性連接子設計中任一者(參見，Whitlow,M.et al.,(1991)Methods：A Companion to Methods in Enzymology,2：97-105)。
醫藥治療劑
本發明提供了包括融合蛋白質複合體的醫藥組成物，用作治療劑。在一個態樣，本發明的融合蛋白質複合體，例如，配製在醫藥上可接受的緩衝液如生理鹽水中而全身投予。較佳的投予途徑包括，例如，滴注到膀胱、皮下、靜脈內、腹膜內、肌肉內、瘤內或皮內注射，其在患者體內提供連續、持續或有效程度的組成物。使用治療有效量的本文辨識的治療劑在生理上可接受的載體中進行人類患者或其他動物的治療。合適的載體及其配製係描述於例如E.W.Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中。欲投予的治療劑的量係根據投予方式、患者的年齡和體重以及腫瘤的臨床症狀而變化。通常，量將在彼等用於治療與贅瘤形成、自體免疫或傳染病相關的其他疾病的其他藥劑中使用的量的範圍內，儘管在某些情況下由於化合物的特異性增加將需要更低的量。如發明所屬領域技術人員已知的方法測定，化合物以增強個體免疫反應的劑量投予，或者降低個體的腫瘤、感染或自體免疫細胞的增殖、存活或侵襲性的劑量投予。
醫藥組成物的配製
用於治療贅瘤形成、感染性或自體免疫疾病的本發明的融合蛋白質複合體的投予係藉由導致治療劑的濃度與其他組分組合時，有效地改善、減少或穩定該贅瘤形成、傳染病或自體免疫疾病之任何合適的方式。本發明的融合蛋白質複合體可以任何合適的量包括在任何合適的載劑物質 中，並且通常以組成物總重量的1至95重量%的量存在。該組成物可以以適合腸胃外(例如，皮下、靜脈內、肌肉內、囊內、瘤內或腹膜內)投予途徑的劑型提供。例如，醫藥組成物係根據傳統醫藥實務配製(參見，例如，Remington：The Science and Practice of Pharmacy(20th ed.),ed.A.R.Gennaro,Lippincott Williams & Wilkins,2000和Encyclopedia of Pharmaceutical Technology,eds J.Swarbrick and JC Boylan,1988-1999,Marcel Dekker,New York)。
人類劑量最初藉由從小鼠或非人之靈長類動物中使用的化合物的量外推來確定，因為發明所屬技術領域的技術人員認知到與動物模式相比而修改人類劑量係發明所屬技術領域的常規修改。例如，劑量可以在約1μg化合物/kg體重至約5000mg化合物/kg體重之間變化；或者約5mg/kg體重至約4,000mg/kg體重或約10mg/kg體重至約3,000mg/kg體重；或約50mg/kg體重至約2000mg/kg體重；或者從約100mg/kg體重至約1000mg/kg體重；或者約150mg/kg體重至約500mg/kg體重。例如，劑量為約1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1,000、1,050、1,100、1,150、1,200、1,250、1,300、1,350、1,400、1,450、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,500、3,000、3,500、4,000、4,500或5,000mg/kg體重。或者，劑量範圍為約5mg化合物/Kg體重至約20mg化合物/kg體重。在另一個實例中，劑量為約8、10、12、14、16或18mg/kg體重。較佳地，融合蛋白質複合體以0.5mg/kg至約10mg/kg(例如，0.5、1、3、5、10mg/kg)投予。當然，取決於初始臨床試驗的結果和 特定患者的需要，如在此等治療方案中常規進行，該劑量可以向上或向下調節。
將醫藥組成物與合適的賦形劑一起配製成醫藥組成物，該醫藥組成物在投予後以受控方式釋放治療劑。實例包括單單位或多單位錠劑或囊劑組成物、油性溶液、懸浮液、乳液、微囊劑、微球體、分子複合體、奈米粒子、貼劑以及脂質體。較佳地，將融合蛋白質複合體配製在適於腸胃外投予的賦形劑中。
腸胃外組成物
包括本發明的融合蛋白質複合體的醫藥組成物係藉由注射、輸注或植入(皮下、靜脈內、肌肉內、瘤內、囊內、腹膜內)，以劑型、調配物或經由合適的遞送裝置或含有傳統、無毒的醫藥可接受的載劑和佐劑的植入物的腸胃外投予。此等組成物的配製和製備係醫藥調配領域的技術人員所熟知的。配製可見於上文中的Remington：The Science and Practice of Pharmacy。
包括用於腸胃外使用的本發明的融合蛋白質複合體的組成物係以單位劑型(例如，在單劑量安瓿中)提供。或者，將組成物提供在含有幾種劑量的小瓶中，並且其中可以加入合適的防腐劑(見下文)。該組成物為溶液、懸浮液、乳液、輸注裝置或用於植入的遞送裝置的形式，或者呈現為在使用前用水或其它合適的媒劑(vehicle)復水之乾粉劑。除了減少或改善贅瘤形成，傳染病或自體免疫疾病的活性劑外，該組成物還包括合適的腸胃外可接受的載劑及/或賦形劑。可將活性治療劑併入微球體、微囊劑、奈米粒子、脂質體中以控制釋放。此外，該組成物可包括懸浮劑、增溶劑、 安定劑、pH調節劑，張力調節劑及/或分散劑。
如上所述，包括本發明的融合蛋白質複合體的醫藥組成物可以是適用於無菌注射的形式。為了製備此組成物，將合適的活性治療劑溶解或懸浮在腸胃外可接受的液體載劑中。其中可以使用的可接受的載劑和溶劑是水，其係藉由加入適量的鹽酸、氫氧化鈉或合適的緩衝液、1,3-丁二醇、林格氏溶液以及等張氯化鈉溶液以及葡萄糖溶液而將將水調節到合適的pH值。含水調配物還可含有一種或多種防腐劑(例如，對羥基苯甲酸甲酯、對羥基苯甲酸乙酯或對羥基苯甲酸正丙酯)。在其中一種化合物僅微量或稍微溶於水的情況下，可以加入溶解增強劑或增溶劑，或者溶劑可以包括10至60%重量/重量的丙二醇。
本發明提供治療贅瘤形成、傳染病或自體免疫疾病或其症狀的方法，其包括向個體(例如哺乳動物，例如人類)投予治療有效量的包括本文式之化合物的醫藥組成物。因此，一個具體實施例是治療患有或易患贅瘤形成、傳染病或自體免疫疾病或其症狀的個體的方法。該方法包括在治療疾病或病症的條件下，向哺乳動物投予治療量的足以治療該疾病或病症或其症狀的量的化合物的步驟。
本文的方法包括向個體(包括辨識為需要此治療的個體)投予有效量的本文所述的化合物或本文所述的組成物以產生此功效。辨識需要此治療的個體可以是個體或健康護理專業人員的判斷，並且可以是主觀的(例如，意見)或客觀的(例如，可藉由測試或診斷方法測量的)。
本發明的治療方法(包括預防性治療)通常包括將治療有效量的本文化合物(諸如本文式之化合物)投予有其需求之個體(例如，動物、 人類)，包括哺乳動物，特別是人類。此治療將適當地向患有、具有、易患贅瘤形成、傳染病、自體免疫疾病、病症或其症狀或有患贅瘤形成、傳染病、自體免疫疾病、病症或其症狀的風險的個體，特別是人類投予。「有風險」的個體的確定可藉由診斷測試或個體或健康護理提供者的意見(例如，基因測試、酶或蛋白質標記物、標記物(Marker)(如本文所定義)、家族史等)進行任何客觀或主觀確定確定。本發明的融合蛋白質複合體可用於治療任何其他需要增加免疫反應的病症。
本發明還提供了一種監測治療進展的方法。該方法包括患有或易患與贅瘤形成相關的病症或其症狀之個體測定診斷標記物(標記物)(例如，本文中由本文化合物調節的任何標靶、蛋白質或其指示物等)或診斷測量(例如，篩選、測定)的程度的步驟，其中該個體已被投予治療量的足以治療該病症或其症狀的化合物。可以將該方法中測定的標記物程度與健康正常對照或其他患病患者中的已知標記物程度進行比較，以測定個體的疾病狀態。在一些情況下，在比第一程度的測定晚的時間點測定個體的第二程度的標記，並且比較這兩個程度以監測疾病的進程或治療的效力。在某些態樣，在根據本發明的治療開始之前測定個體的標記物的預處理程度；然後可以將個體的治療前的標記程度與治療開始後個體的標記程度進行比較，以確定治療的效力。
聯合療法
視需要地，本發明的融合蛋白質複合體與任何其他標準療法組合投予；此等方法是發明所屬領域技術人員已知的，並且在E.W.Martin的Remington's Pharmaceutical Sciences中描述。若期望，本發明的融合 蛋白質複合體與任何傳統抗腫瘤療法組合投予，該傳統抗腫瘤療法包括，但不限於，免疫療法、治療性抗體、標靶治療、手術，放射療法或化學療法。
套組或醫藥系統
包括本發明的融合蛋白質複合體的醫藥組成物可以組裝成用於改善贅瘤形成、傳染病或自體免疫疾病之套組或醫藥系統。根據本發明的這態樣的套組或醫藥系統包括其中具有封閉空間的一個或多個容器裝置，例如小瓶、管、安瓿、瓶子等之載子裝置，例如盒子、紙盒、管。本發明的套組或醫藥系統還可包括使用本發明的融合蛋白質複合體的相關說明書。
重組蛋白表現
通常，本發明的融合蛋白質複合體(例如TxM複合體的組分)的製備可以藉由本文揭露的方法和公認的重組DNA技術完成。
通常，藉由在合適的表現載體中用全部或部分編碼多肽的核酸分子或其片段轉化合適的宿主細胞而產生重組多肽。彼等分子生物學領域的技術人員將理解，可以使用廣泛多種表現系統中任一者來提供重組蛋白。使用的精確宿主細胞對本發明並不重要。重組多肽可以在幾乎任何真核宿主(例如釀酒酵母、昆蟲細胞，例如Sf21細胞，或哺乳動物細胞，例如NIH 3T3、HeLa或較佳為COS細胞)中產生。這些細胞可從大範圍的來源獲得(例如，American Type Culture Collection,Rockland,Md.；還參見，例如，Ausubelet al.,Current Protocol in Molecular Biology,New York：John Wiley and Sons,1997)。轉染方法和表現載體的選擇將取決於 所選擇的宿主系統。轉化方法描述於例如Ausubel等人的文獻(同上)中；表現載體可選自彼等於例如Cloning Vectors：A Laboratory Manual(P.H.Pouwels et al.,1985,Supp.1987)中提供者。
存在多種用於產生重組多肽的表現系統。可用於產生此等多肽的表現載體包括，但不限於染色體、附加體和病毒衍生的載體，例如衍生自細菌質粒、噬菌體、轉座子、酵母附加體、插入元件、酵母染色體元件、來自病毒如桿狀病毒、乳多泡病毒如SV40、痘苗病毒、腺病毒、禽痘病毒、偽狂犬病病毒和逆轉錄病毒之載體，以及衍生自其組合的載體。
一旦表現重組多肽，例如使用親和性層析術單離。在一個實例中，針對多肽產生的抗體(例如，如本文所述產生者)可以附加到管柱，並用於單離重組多肽。在親和性層析術之前，含有多肽的細胞的溶胞和分級可以藉由標準方法進行(參見，例如，Ausubel等人，同上)。一旦單離，若期望，可以例如藉由高效液相層析術進一步純化重組蛋白(參見，例如，Fisher,Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology,eds.,Work and Burdon,Elsevier,1980)。
如本文所用，本發明的生物活性多肽或效應分子可包括諸如細胞因子、趨化因子、生長因子、蛋白質毒素、免疫球蛋白域或如酶的因子之其他生物活性蛋白質。此外，生物活性多肽可包括與其他化合物(例如非蛋白質毒素、細胞毒性劑、化學治療劑、可偵測標記物、放射性物質等)的接合物。
本發明的細胞因子係由影響其他細胞的細胞產生的任何因子所定義，並且負責細胞免疫的許多多重功效中任一者。細胞因子的實例 包括，但不限於，IL-2家族、干擾素(IFN)、IL-10、IL-1、IL-17、TGF和TNF細胞因子家族、以及IL-1至IL-35、IFN-α、IFN-β、IFNγ、TGF-β、TNF-α和TNFβ。
在本發明的一個態樣，第一蛋白質包括與介白素-15(IL-15)域或其功能片段共價連接的第一生物活性多肽。IL-15是影響T細胞活化和增殖的細胞因子。在某些方面，IL-15在影響免疫細胞活化和增殖方面的活性與IL-2相似，儘管已經充分地特徵化基本差異(Waldmann,T A,2006,Nature Rev.Immunol.6：595-601)。
在本發明的另一態樣，第一蛋白質包括介白素-15(IL-15)域，其係IL-15變異體(在本文中還稱為IL-15突變體)。IL-15變異體較佳為包括與天然(或野生型)IL-15蛋白不同的胺基酸序列。IL-15變異體較佳為結合IL-15Rα多肽，並作用為IL-15促效劑或拮抗劑。較佳地，具有促效劑活性的IL-15變異體具有超促效劑活性。與IL-15變異體與IL-15Rα的結合無關，IL-15變異體可以作用為IL-15促效劑或拮抗劑。IL-15促效劑係例示為與野生型IL-15相比，具有相當或增加的生物活性。IL-15拮抗劑係例示為與野生型IL-15相比，具有降低的生物活性或有抑制IL-15介導的反應的能力。在一些實例中，IL-15變異體與IL-15RβγC受體的結合增加或降低活性。在一些情況下，IL-15變異體的序列具有至少一個胺基酸變化，例如，與天然IL-2序列相比之取代或刪除，此等變化造成IL-15促效劑或拮抗劑活性。較佳地，胺基酸取代/刪除係位於IL-15與IL-15Rβ及/或γC相互作用的域中。更佳地，胺基酸取代/刪除不影響與IL-15Rα多肽的結合或產生IL-15變異體的能力。可以基於如本文提供之推定或已知 的IL-15結構、IL-15與具有已知結構的同源分子例如IL-2之比較、經由合理或隨機誘變和功能測定或其他實驗方法，辨識合適的胺基酸取代/刪除以產生IL-15變異體。另外，合適的胺基酸取代可以是保守的或非保守的變化和額外胺基酸的插入。較佳地，本發明的IL-15變異體在成熟人類IL-15序列之第6、8、10、61、65、72、92、101、104、105、108、109、111或112個位置含有一個或或超過一個胺基酸取代/刪除；特別是，D8N(「D8」是指天然成熟人類IL-15序列中的胺基酸和殘基位置，而且「N」是指IL-15變異體中該位置的經取代之胺基酸殘基)、I6S、D8A、D61A、N65A、N72R、V104P或Q108A取代造成具有拮抗活性的IL-15變異體和N72D取代造成具有促效劑活性的IL-15變異體。
與細胞因子類似，趨化因子被定義為當暴露於其他細胞時，負責細胞免疫的許多多重功效中任一者之任何化學因子或分子。合適的趨化因子可包括，但不限於，CXC、CC、C和CX3C趨化因子家族以及CCL-1至CCL-28、CXC-1至CXC-17、XCL-1、XCL-2、CX3CL1、MIP-1b、IL-8、MCP-1和Rantes。
生長因子包括當暴露於特定細胞時誘發受影響的細胞的增殖及/或分化的任何分子。生長因子包括蛋白質和化學分子，其中一些包括：GM-CSF、G-CSF、人類生長因子和幹細胞生長因子。另外的生長因子還可適用於本文所述用途。
毒素或細胞毒性劑包括當暴露於細胞時對生長具有致死作用或抑制作用的任何物質。更具體地，效應分子可以是例如植物或細菌來源的細胞毒素，例如白喉毒素(DT)、志賀毒素、雞母珠毒素、霍亂毒素、 蓖麻毒素、皂草素、假單胞菌外毒素(PE)、商陸抗病毒素蛋白或白樹毒素。此等毒素的生物活性片段是發明所屬技術領域中眾所周知，包括例如DT A鏈和蓖麻毒素A鏈。另外，毒素可以是在細胞表面有活性的劑，例如磷脂酶(例如磷脂酶C)。
此外，效應分子可以是化學治療藥物，例如長春地辛、長春新鹼、長春鹼、甲胺蝶呤、阿黴素、博來黴素或順鉑。
另外，效應分子可以是適於診斷或成像研究的可偵測標記的分子。這些標記包括生物素或鏈黴親和蛋白/卵白素、可偵測的奈米粒子或晶體、酶或其催化活性片段、螢光標記如綠色螢光蛋白、FITC、藻紅蛋白、賽可(cychome)、得克薩斯紅或量子點；放射性核素，例如碘-131、釔-90、錸-188或鉍-212；磷光或化學發光分子或可藉由PET、超音波或MRI偵測的標記，諸如Gd--或順磁性金屬離子基造影劑。參見，例如，Moskaug et al.,J.Biol.Chem.264,15709(1989)；Pastan,I.et a.,Cell 47,641,1986；Pastan et al.,Recombinant Toxins as Novel Therapeutic Agents,Ann.Rev.Biochem.61,331,(1992)；“Chimerica Toxins”Olsnesand Phil,Pharmac.Ther.,25,355(1982；公開的PCT申請案第WO 94/29350號；公開的PCT申請案第WO 94/04689號；公開的PCT申請案第WO2005046449號和美國專利第5,620,939號之製備和使用包括效應物或標籤的蛋白質的揭示內容。
包括共價連接的IL-15域和IL-15Rα域的蛋白質融合物或接合物複合體具有幾個重要用途。例如，包括抗PD-L1 scAb的蛋白質融合物或接合物複合體可用於將IL-15：IL-15Rα複合體遞送至某些細胞，例 如表現PD-L1的腫瘤細胞。因此，蛋白質融合物或接合物複合體提供選擇性地破壞或殺死包括配體的細胞的手段。能夠被蛋白質融合或接合物複合體損傷或殺死的細胞或組織的實例包括腫瘤和表現一種或多種配體的病毒或細菌感染的細胞。易受損傷或殺死的細胞或組織可藉由本文揭露的方法輕易地測定。
本發明的IL-15和IL-15Rα多肽在胺基酸序列中適當地對應於天然存在的IL-15和IL-15Rα分子，例如，人類、小鼠或其他嚙齒動物或其他哺乳動物的IL-15和IL-15Rα分子。這些多肽和編碼核酸的序列在文獻中是已知的，包括人類介白素15(IL15)mRNA-GenBank：U14407.1(藉由引用方式併入本文)、小鼠介白素15(IL15)mRNA-GenBank：U14332.1(藉由引用方式併入本文)、人類介白素-15受體α鏈前體(IL15RA)mRNA-GenBank：U31628.1(藉由引用方式併入本文)、小鼠介白素15受體，α鏈-GenBank：BC095982.1(藉由引用方式併入本文))。
在一些設定下，使本發明的蛋白質融合或接合物複合體多價化是有用於，例如，增加sc-抗體的化合價。特別地，融合蛋白質複合體的IL-15域和IL-15Rα域之間的相互作用提供了產生多價複合體的手段。此外，多價融合蛋白質可以藉由使用例如標準生物素-鏈黴抗生物素蛋白標記技術，或藉由接合至合適的固體支持物(例如乳膠珠)，而共價或非共價連接在一至四種之間蛋白質(相同或相異)而製備。化學交聯的蛋白質(例如，與樹枝狀聚合物交聯)還是合適的多價物質。例如，蛋白質可以藉由包括編碼可經修飾的標籤序列的序列(例如生物素化BirA標籤或具有化學反應性側鏈的胺基酸殘基，例如Cys或His)而修飾。此等胺基酸標籤或化學反應性 胺基酸可位於融合蛋白質的多個位置，較佳為位於生物活性多肽或效應分子的活性位點的遠端。例如，可溶性融合蛋白質的C末端可以與包含此等反應性胺基酸的標籤或其他融合蛋白質共價連接。可以包括合適的側鏈以將兩種或更多種融合蛋白質化學連接至合適的樹枝狀聚合物或其他奈米粒子，以產生多價分子。樹枝狀聚合物是合成化學聚合物，其可以具有其表面的許多不同官能團中任一者(D.Tomaria,Aldrichimica Acta,26：91：101(1993))。根據本發明使用的例示性樹枝狀聚合物包括，例如，可以連接胱胺酸殘基之E9星爆流多胺樹枝狀聚合物和E9燃燒多胺樹枝狀聚合物，例示性奈米粒子包括脂質體、芯-殼粒子或基於PLGA的粒子。
在另一態樣，融合蛋白質複合體的一個或兩個多肽包括免疫球蛋白域。或者，蛋白質結合域-IL-15融合蛋白質可以進一步與免疫球蛋白域連接。較佳的免疫球蛋白域包括允許與其他免疫球蛋白域相互作用以形成如上提供的多鏈蛋白質的區域。例如，免疫球蛋白重鏈區，例如IgG1 CH2-CH3，能夠穩定地相互作用以產生Fc區。較佳的包括Fc域的免疫球蛋白域還包括具有效應功能的區域，包括Fc受體或補體蛋白質結合活性，及/或具有糖基化位點。在一些態樣，融合蛋白質複合體的免疫球蛋白域含有降低或增加Fc受體或補體結合活性或糖基化或二聚化的突變，從而影響所得蛋白質的生物活性。例如，含有降低與Fc受體結合的突變的免疫球蛋白域可用於產生本發明的融合蛋白質複合體，其對攜帶Fc受體的細胞具有較低的結合活性，這對於設計用於辨認或偵測特定抗原的試劑可能是有利的。
核酸和載體
本發明進一步提供了核酸序列，特別是編碼本發明融合蛋白質(例如，TxM的組分)的DNA序列。較佳地，DNA序列係由適合於染色體外複製的載體攜帶，例如噬菌體、病毒、質粒、噬菌粒、黏粒、YAC或附加體。特別地，編碼期望融合蛋白質的DNA載體可用於促進本文所述製備方法，及獲得顯著量的融合蛋白質。DNA序列可插入合適的表現載體中，亦即，含有插入的蛋白質編碼序列的轉錄和轉譯所需的元素的載體。多種宿主-載體系統可用以表現蛋白質編碼序列。這些包括感染病毒(例如，痘苗病毒、腺病毒等)的哺乳動物細胞株統；被病毒(例如，桿狀病毒)感染的昆蟲細胞株統；微生物如含有酵母載體的酵母、或用噬菌體DNA、質粒DNA或黏粒DNA轉化的細菌。取決於所用的宿主-載體系統，可以使用許多合適的轉錄和轉譯元素中任一者。參見Sambrook等人(同上)和Ausubel等人(同上)。
本發明包括製備可溶性融合蛋白質複合體的方法，該方法包括將本文所述編碼第一蛋白質和第二蛋白質的DNA載體引入宿主細胞，在足以在細胞或培養基中表現融合蛋白質及允許第一蛋白質的IL-15域與第二蛋白質的可溶性IL-15Rα域之間的連繫形成可溶性融合蛋白質複合體的條件下，在該培養基中培養宿主細胞，從宿主細胞或培養基純化可溶性融合蛋白質複合體。
通常，根據本發明的較佳DNA載體包括藉由磷酸二酯鍵連接的核苷酸序列，該磷酸二酯鍵係以5'至3'方向包括用於引入編碼生物活性多肽的第一核苷酸序列的第一選殖位點，該第一核苷酸序列可操作地連接至編碼效應分子的序列。
由DNA載體編碼的融合蛋白質組分可以以卡匣形式提供。所謂術語「卡匣」是指每種組分可藉由標準重組方法而輕易地取代為另一種組分。特別地，當編碼的融合複合體係用於對抗可能具有或具有發展血清型的能力的病原體時，特別期望以卡匣形式配置的DNA載體。
為了使載體編碼融合蛋白質複合體，藉由使用合適的連接酶將編碼生物活性多肽的序列與編碼效應肽的序列連接。編碼呈現肽的DNA可以藉由從天然來源例如從合適的細胞株中單離DNA或藉由已知的合成方法，例如磷酸三酯法而獲得。參見，例如，Oligonucleotide Synthesis,IRL Press(M.J.Gait,ed.,1984)。合成的寡核苷酸還可以使用市售的自動寡核苷酸合成儀製備。一旦單離，編碼生物活性多肽的基因可藉由聚合酶連鎖反應(PCR)或發明所屬技術領域已知的其他手段擴增。用於擴增生物活性多肽基因的合適的PCR引子可以向PCR產物添加限制性位點。PCR產物較佳包括效應肽和正常表現和分泌生物活性多肽-效應子融合複合體所需的前導序列的剪接位點。PCR產物還較佳包括編碼連接子序列的序列，或用於連接這種序列的限制酶位點。
本文所述融合蛋白質較佳藉由標準重組DNA技術產生。例如，一旦單離出編碼生物活性多肽的DNA分子，就可以將序列連接到編碼效應多肽的另一DNA分子。編碼生物活性多肽的核苷酸序列可以直接接合編碼效應肽的DNA序列，或者更典型地，本文所述編碼連接子序列的DNA序列可以插入編碼生物活性多肽的序列和編碼效應肽的序列之間，並用合適的聯接酶聯結。產生的雜合DNA分子可以在合適的宿主細胞中表現以產生融合蛋白質複合體。DNA分子以5'至3'方向相互聯接，使得在聯 接後，編碼多肽的轉譯框架不會改變(亦即，DNA分子在框內相互連接)。產生的DNA分子編碼框內融合蛋白質。
其他核苷酸序列還可包括在基因構築體中。例如，調控編碼與編碼效應肽融合的生物活性多肽的序列的表現的啟動子序列，或將融合蛋白質導向細胞或培養基表面的前導序列可包括在構築體中或存在於插入構築體的表現載體中。免疫球蛋白或CMV啟動子是特佳的。
在獲得變異型生物活性多肽、IL-15、IL-15Rα或Fc域編碼序列時，發明所屬技術中具有通常知識者將認知到可藉由某些胺基酸取代、加成、刪除和轉譯後修飾來修飾多肽，而不損失或減少生物活性。特別地，眾所周知保守胺基酸取代(亦即，用一個胺基酸取代相似大小、電荷、極性和構型的另一個胺基酸)不可能顯著改變蛋白質功能。作為蛋白質組分的20種標準胺基酸可大致分為如下四組保守胺基酸：非極性(疏水)群組包括丙胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、甲硫胺酸，苯丙胺酸、脯胺酸、色胺酸和纈胺酸；極性(不帶電的，中性的)群組包括天冬醯胺、半胱胺酸、麩胺醯胺、甘胺酸、絲胺酸、蘇胺酸和酪胺酸；帶正電荷的(鹼性)群組含有精胺酸、組胺酸和離胺酸；以及帶負電的(酸性)群組含有天冬胺酸和麩胺酸。在同一群組中將一種胺基酸的蛋白質取代為另一種胺基酸的蛋白質不太可能對蛋白質的生物活性產生不利影響。在其他情況下，可以對胺基酸位置進行修飾以降低或增強蛋白質的生物活性。此等變化可以基於標靶殘基的已知或假定的結構或功能特性質隨機引入或經由位點特異性突變引入。在表現變異體蛋白質後，可以使用結合或功能測定法輕易地評估由於修飾引起的生物活性的變化。
核苷酸序列之間的同源性可以藉由DNA雜交分析來確定，其中雙股DNA雜合體的安定性取決於發生的鹼基配對的程度。高溫及/或低鹽含量的條件降低了雜交體的安定性，並且可以改變以防止具有低於選定的同源性程度的序列的黏合。例如，對於具有約55%G-C含量、雜交和40至50℃、6×SSC(氯化鈉/檸檬酸鈉緩衝液)和0.1%SDS(十二烷基硫酸鈉)的洗滌條件的序列表示約60至70%的同源性，50至65℃、1×SSC和0.1%SDS的雜交和洗滌條件的序列表示約82至97%的同源性，及雜交和52℃、0.1×SSC和0.1%SDS的洗滌條件的序列表示約99至100%之同源性。還可獲得用於比較核苷酸和胺基酸序列(以及測量同源性程度)的各種電腦程式，並且在Ausubel等人(1999年)的文獻中提供了提供市售和自由軟體來源的列表。可輕易獲得的序列比較和多序列比對演算法分別是基本局部比對搜索工具(BLAST)(Altschul等人，1997)和ClustalW程式。BLAST可在ncbi.nlm.nih.gov的萬維網上獲得，ClustalW的版本可在2.ebi.ac.uk上獲得。
融合蛋白質的組分可以幾乎任何順序組織，只要每個組分能夠執行其預期的功能。例如，在一個具體實施例中，生物活性多肽位於效應分子的C或N末端。
本發明的較佳效應分子將具有有助於彼等域所針對的功能的大小。本發明的效應分子可以藉由多種方法製備並與生物活性多肽融合，包括眾所周知的化學交聯方法。參見，例如，Chemical Modification of Proteins,Holden-Day中之Means,G.E.and Feeney,R.E.(1974)。還參見Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking,CRC Press中之 S.S.Wong(1991)。然而，通常較佳為使用重組操縱來製備框內融合蛋白質。
如上所述，根據本發明的融合分子或接合物分子可以以數種方式組織。在例示性構型中，生物活性多肽的C末端與效應分子的N末端可操作地連接。若期望，可以藉由重組方法實現該連接。然而，在另一種構型中，生物活性多肽的N末端與效應分子的C末端連接。
或者，或另外，可根據需求將一種或多種另外的效應分子插入生物活性多肽或接合物複合體中。
載體和表現
可以採用許多策略來表現本發明的融合蛋白質複合體的組分(例如，TxM)。例如，限制酶可用以在載體中切割以插入構築體而將編碼本發明的融合蛋白質複合體的一種或多種組分的構築體併入合適的載體中，然後聯接。然後將含有基因構築體的載體引入合適的宿主中以表現融合蛋白質。通常參見Sambrook等人(同上)。可以基於與選殖實驗方案有關的因子憑實驗進行合適載體的選擇。例如，載體應與正在使採的宿主相同，並具有適合正在採用的宿主的複製子。載體必須能夠容納編碼待表現的融合蛋白質複合體的DNA序列。合適的宿主細胞包括真核細胞和原核細胞，較佳為彼等易於轉化並在培養基中表現出快速生長的細胞。具體地，較佳的宿主細胞包括原核生物，如大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等，和真核生物，如動物細胞和酵母菌株，如釀酒酵母。通常較佳為哺乳動物細胞，特別是J558、NSO、SP2-O或CHO。其他合適的宿主包括例如昆蟲細胞，例如Sf9。採用傳統培養條件。參見Sambrook(同上)。然後可以選擇安定的轉化或轉染的細胞株。表現本發明的融合蛋白質複合體的細胞可藉由已知方法測定。 例如，與免疫球蛋白連接的融合蛋白質複合體的表現可以藉由對連接的免疫球蛋白特異的ELISA及/或藉由免疫印跡而確定。用於檢測包括與IL-15或IL-15Rα域連接的生物活性多肽之測融合蛋白質表現的其他方法係在如下實施例部分中揭露。
如上所述，宿主細胞可用於製備目的以繁殖編碼所期望融合蛋白質的核酸。因此，宿主細胞可包括原核或真核細胞，其中具體旨在產生融合蛋白質。因此，宿主細胞特別包括酵母、蒼蠅、蠕蟲、植物、蛙、哺乳動物細胞和能夠繁殖編碼融合體的核酸的器官。可以使用的哺乳動物細胞株的非限制性實例包括CHO dhfr-細胞(Urlaub andChasm,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77：4216(1980))、293細胞(Graham et al.,J Gen.Virol.,36：59(1977))或骨髓瘤細胞如SP2或NSO(Galfre andMilstein,Meth.Enzymol.,73(B)：3(1981))。
能夠繁殖編碼所期望之融合蛋白質複合體的核酸的宿主細胞還包括非哺乳動物真核細胞，包括如Fleer,R.,Current Opinion in Biotechnology,3(5)：486-496(1992))綜述的昆蟲(例如，草地貪夜蛾(Sp.frugiperda))、酵母(例如釀酒酵母、粟酒裂殖酵母(S.pombe)、巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)、乳酸克魯維酵母(K.lactis)、多形漢遜酵母(H.polymorpha)；、真菌和植物細胞。還考慮了某些原核生物，例如大腸桿菌和芽孢桿菌。
可以藉由用於轉染細胞的標準技術將編碼所期望的融合蛋白質的核酸引入宿主細胞中。術語「轉染(transfecting)」或「轉染(transfection)」旨在涵蓋用於將核酸引入宿主細胞的所有傳統技術，包括 磷酸鈣共沉澱、DEAE-葡聚糖介導的轉染、脂質轉染、電穿孔、顯微注射、病毒轉導及/或整合。用於轉染宿主細胞的合適方法可以在Sambrook等人(同上)，和其他實驗室教科書中找到。
根據本發明可以使用各種啟動子(轉錄起始調節區)。適當啟動子的選擇取決於所提出的表現宿主。可以使用來自異源的啟動子，只要它們在所選宿主中起作用即可。
啟動子的選擇還取決於所期望的效率和肽或蛋白質產生水平。通常使用誘發型啟動子如tac，以顯著提高大腸桿菌中蛋白質表現的水平。蛋白質的過度表現可能對宿主細胞有害。結果，宿主細胞生長可能是有限的。誘發型啟動子系統的使用允許在誘發基因表現之前將宿主細胞培養至可接受的密度，從而促進更高的產物產量。
根據本發明可以使用各種訊號序列。可以使用與生物活性多肽編碼序列同源的訊號序列。或者，還可以使用已經選擇或設計成用於在表現宿主中有效分泌和加工的訊號序列。例如，合適的訊號序列/宿主細胞對包括用於在枯草芽孢桿菌中分泌的枯草芽孢桿菌sacB訊號序列，以及用於巴斯德畢赤酵母分泌的釀酒酵母α-交配因子或巴斯德畢赤酵母酸磷酸酶phoI訊號序列。訊號序列可以經由編碼訊號肽酶裂解(cleavage)位點的序列直接聯結到蛋白質編碼序列，或通經由通常少於10個密碼子組成的短核苷酸橋連接，其中該橋確保下游TCR序列的正確讀出框架。
已經辨識了用於增強真核蛋白質表現系統之轉錄和轉譯的元素。例如，將花椰菜花葉病毒(CaMV)啟動子定位在異源啟動子任一側的1,000個鹼基對可以在植物細胞中將轉錄水平提高10至400倍。表現構築 體還應包括合適的轉譯起始序列。修飾表現構築體以包括用於正確轉譯起始的Kozak共有序列可以將轉譯程度提高10倍。
通常採用選擇標記，其可以是表現構築體的一部分或與其分開(例如，由表現載體攜帶)，使得標記可以整合在與目標基因不同的位點。實例包括賦予抗生素抗性的標記(例如，bla賦予大腸桿菌宿主細胞的胺苄青黴素抗性、nptII賦予廣泛多種原核和真核細胞的卡那黴素對抗性)或允許宿主在基本培養基上生長(例如，HIS4使巴斯德畢赤酵母或His-釀酒酵母在沒有組胺酸的情況下生長)。選擇標記具有其自身的轉錄和轉譯起始和終止調節區，以允許標記的獨立表現。若使用抗生素抗性作為標記物，則用於選擇的抗生素的濃度將根據抗生素而變化，通常為10至600μg抗生素/mL培養基。
藉由採用已知的重組DNA技術組裝表現構築體(Sambrook等人，1989；；Ausubel等人，1999)。限制酶切割和聯接是用於聯結兩個DNA片段的基本步驟。DNA片段的端點可能需要在連接之前進行修飾，這可以藉由填充突出端，用核酸酶(例如，ExoIII)刪除片段的末端部分，定點誘變或藉由PCR添加新的鹼基對來實現。多重選殖點和銜接子可用來促進所選片段的聯結。表現構築體通常使用多輪限制、聯接和大腸桿菌轉化分階段組裝。適用於構建表現構築體的許多選殖載體是發明所屬技術領域中領域已知的(λZAP和pBLUESCRIPT SK-1、Stratagene、La Jolla、CA、pET,Novagen Inc.,Madison,WI，如Ausubel等人(1999)中所引用)且特定選擇對於本發明並不重要。選殖載體的選擇將受選擇用於將表現構築體引入宿主細胞的基因轉移系統的影響。在每個階段結束時，可以藉由限制、 DNA序列、雜交和PCR分析而分析產生的構築體。
表現構築體可以作為線性或環狀的選殖載體構築體而轉化到宿主中，或者可以從選殖載體中除去並按原樣使用或引入到遞送載體。遞送載體有助於在所選宿主細胞類型中引入和維持表現構築體。藉由許多已知的基因轉移系統中任一者將表現構築體引入宿主細胞中(例如，天然能力、化學介導的轉化、原生質體轉化、電穿孔、基因槍轉化、轉染或接合)(Ausubel等人，1999：Sambrook等人，1989)。選擇的基因轉移系統取決於所用宿主細胞和載體系統。
例如，可以藉由原生質體轉化或電穿孔而將表現構築體引入釀酒酵母細胞中。釀酒酵母的電穿孔係可輕易地實現，並產生與原生質球轉化相當的轉化效率。
本發明進一步提供了單離目標融合蛋白質的生產方法。在該過程中，已經將編碼與調節序列可操作地連接的目標蛋白質的核酸引入了宿主細胞(例如，酵母、真菌、昆蟲、細菌或動物細胞)以在培養基中生產規模成長，以刺激編碼目標融合蛋白質的核苷酸序列的轉錄。隨後，從採集的宿主細胞或培養基中單離目標融合蛋白質。標準蛋白質純化技術可用以從培養基或採集的細胞單離目標蛋白質。特別地，純化技術可用於將來自包含滾瓶、旋轉瓶、組織培養盤、生物反應器或發酵罐等各種實施工具的期望的融合蛋白質大規模(至少以毫克量計)表現和純化。
可以藉由已知方法單離和純化表現的蛋白質融合複合體。通常，將培養基離心或過濾，然後藉由親和力層析術或免疫親和力層析術純化上清液，例如包括使用結合表現的融合複合體的單株抗體之蛋白-A或蛋 白-G親和力層析術或免疫親和力層析實驗方案。已知技術的適當組合可用以分離和純化本發明的融合蛋白質。這些方法包括，例如，利用溶解度的方法(諸如，鹽沉澱和溶劑沉澱)、利用分子量差異的方法(諸如，透析、超濾、凝膠過濾和SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳)、利用電荷差異的方法(諸如，離子交換管柱層析術)、利用特異性親和力的方法(諸如，親和力層析術)、利用疏水性差異的方法(諸如，逆相高效液相層析術)和利用等電點差異的方法(諸如，等電聚焦電泳)、金屬親和力管柱(諸如，Ni-NTA)。一般參見Sambrook等人和Ausubel等人(同上)之涉及這些方法的揭示內容。
較佳為本發明的融合蛋白質實質上是純的。亦即，融合蛋白質已經從天然伴隨的細胞取代物中單離出來，因此融合蛋白質較佳為以至少80%或90%至95%的同質性(重量/重量)存在。具有至少98%至99%同質性(重量/重量)的融合蛋白質對於許多醫藥、臨床和研究應用是最較佳的。一旦實質上純化，融合蛋白質應實質上不含用於治療應用之污染物。一旦部分純化或達到實質純度，可溶性融合蛋白質可用於治療，或用於進行本文揭露的體外或體內測定法。實質純度可藉由多種標準技術如層析術和凝膠電泳而測定。
本發明的融合蛋白質複合體適用於多種癌細胞或被感染或可能被一種或多種疾病感染的細胞之體外或體內使用。
人類介白素-15(huIL-15)係藉由在抗原呈現細胞表現的人類IL-15受體α鏈(huIL-15Rα)橫越呈現至免疫效應細胞。IL-15Rα主要通過細胞外sushi域(huIL-15RαSu)以高親和力(38pM)結合huIL-15。如本文所述，huIL-15域和huIL-15RαSu域可用作支架以構建多域融合複合 體。
IgG域，特別是Fc片段，已成功用作許多治療分子的二聚體支架，包括已批准的生物藥物。例如，依那西普是與人類IgG1的Fc域連接的可溶性人類p75腫瘤壞死因子-α(TNF-α)受體(sTNFR)的二聚體。這種二聚化使依那西普在抑制TNF-α活性方面的效力比單體sTNFR高出達1000倍之多，並提供融合物的血清半衰期比單體形式多5倍。結果，依那西普在體內中和TNF-α的促炎活性方面是有效的，並且改善了許多不同自體免疫適應症(indication)的患者結果。
除了Fc片段之二聚化活性之外，Fc片段還經由補體活化和與天然殺死(NK)細胞、中性粒細胞、吞噬細胞和樹突細胞上展示的Fcγ受體的相互作用提供細胞毒性效應功能。在抗癌治療性抗體和其他抗體域-Fc融合蛋白的背景下，這些活性可能在動物腫瘤模式和癌症患者中觀察到的效力中發揮重要作用。然而，在許多治療應用中，這些細胞毒性效應物反應可能不充分。因此，對改善和擴展Fc域的效應活性以及開發經由靶向治療分子向疾病部位募集細胞溶解性免疫反應(包括T細胞活性)的其他方法產生了相當大的興趣。IgG域已被用作支架以形成雙特異性抗體，以改善由傳統雜交瘤融合技術產生的產物的品質和數量。儘管這些方法繞過了其他支架的缺點，在哺乳動物細胞中難以以足以支持臨床開發和使用的程度產生雙特異性抗體。
為了開發人源免疫刺激性多聚體支架，使用人類IL-15(huIL-15)域和IL-15受體域。huIL-15是四個小的α-螺旋束細胞因子家族的成員，其高結合親和力(平衡解離常數(KD)~1011M)與huIL-15受體α鏈 (huIL-15Rα)連繫。然後將產生的複合體橫越呈現在T細胞和NK細胞表面上展示的人類IL-2/15受體β/共同γ鏈(huIL-15RβγC)複合體。這種細胞因子/受體相互作用造成效應T細胞和NK細胞的擴增和活化，其在根除病毒感染和惡性細胞中發揮重要作用。通常，huIL-15和huIL-15Rα在樹突細胞中共同產生以在細胞內形成複合體，其隨後被分泌並在細胞表面顯示為異二聚體分子。因此，huIL-15和huIL-15Rα相互作用的特徵表示這些鏈間結合域可以用作人源免疫刺激支架，以製備能夠標靶特異性結合的可溶性二聚體分子。
如下文所詳述，使用基於huIL-15：huIL-15RαSu的支架產生PD-L1/TGFβRII/TxM。二聚體融合蛋白質複合體保留其huIL-15域和結合域的免疫刺激和標靶特異性生物活性，表示huIL-15和huIL-15Rα的添加沒有顯著改變融合域的空間排列並提供足夠的構型靈活性程度，而不影響細胞因子活性。因此，這支架可用於形成多價融合複合體，例如PD-L1 TxM，以增加分子的整體結合親和力。可溶性融合蛋白質在重組CHO細胞培養物中以相對高的水平產生(在沒有廣泛的細胞株篩選或優化的細胞培養物上清液中每公升之毫克)，並且可以輕易地從細胞培養物上清液純化。
除非另有說明，本發明的實踐採用分子生物學(包括重組技術)、微生物學、細胞生物學、生物化學和免疫學的傳統技術，這些技術完全在發明所屬技術領域之技術人員的知識範圍內。此等技術在文獻中有充分解釋，例如“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”,second edition(Sambrook,1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(Gait,1984)；“Animal Cell Culture”(Freshney,1987)；“Methods in Enzymology”“Handbook of Experimental Immunology”(Weir,1996)；“Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells”(Miller and Calos,1987)；“Current Protocols in Molecular Biology”(Ausubel,1987)；“PCR：The Polymerase Chain Reaction”,(Mullis,1994)；“Current Protocols in Immunology”(Coligan,1991)。這些技術適用於本發明的多核苷酸和多肽的產生，因此，可以在製備和實踐本發明時考慮這些技術。用於特定具體實施例的特別有用的技術將於如下部分中討論。
淋巴瘤
淋巴瘤是一種血癌，當B或T淋巴細胞比正常細胞分裂更快或比預期壽命更長時發生。例如，B細胞淋巴瘤包括霍奇金淋巴瘤和大多數非霍奇金淋巴瘤兩者。B細胞淋巴瘤表現CD20。
淋巴瘤可能在淋巴結、脾臟、骨髓、血液或其他器官中發展。這些惡性細胞通常起源於淋巴結，表現為淋巴結的增大，亦即淋巴細胞的固態瘤。淋巴瘤係藉由在顯微鏡下檢查淋巴結活檢(亦即，淋巴結的部分或全部切除)而確診。這檢查可揭露可能表示淋巴瘤的組織病理學特徵。治療可能涉及化學療法、放射療法及/或骨髓移植。
提出如下實施例以向發明所屬技術領域中具有通常知識者提供如何製造和使用本發明的測定法、篩選和治療方法的完整揭示內容和描述，並且不旨在限制發明人視為其發明的範疇。
實施例
實施例1：包括IL-15域、抗PDL1域和TGFβRII域的融合蛋白質複 合體的產生和特徵化
治療癌症或傳染病的重要治療方法依賴於增強針對患病細胞的免疫細胞活性。這策略包括離體刺激免疫細胞，然後過繼轉移及/或直接增加患者體內的免疫細胞程度或活性。參與這些方法的免疫細胞可以是先天性(亦即，NK細胞)或適應性(亦即，T細胞)免疫系統的免疫細胞。
一種增強免疫活性的方法是向免疫細胞提供免疫刺激細胞因子。此等細胞因子是發明所屬技術領域已知的，可以單獨使用或與其他細胞因子或因子組合使用。如下文所詳述，吾等產生融合蛋白質複合體，包括與可結合免疫檢查點蛋白質計畫性死亡配體1(PD-L1))之抗體(Ab)或抗體結合片段和能夠結合TGFβ之TGFβRII域融合的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc支架。這些融合蛋白質複合體具有與NK細胞結合和經由細胞因子受體訊號傳遞細胞反應的優點。Ig分子的Fc區形成二聚體以提供可溶性多肽複合體，可以結合蛋白質A以用於純化目的並且可以與NK細胞和巨噬細胞的Fcγ受體相互作用，能夠介導ADCC和ADCP。另外，IL-15N72D域和IL-15RαSu域之間的相互作用提供了將IL-15N72D域、TGFβRII域和抗PDL1抗體(Ab)域(以及可能的其他蛋白質域或因子)連接成單一免疫刺激性融合蛋白質複合體的手段。
具體地，將TGFβRII單體或二聚體或單鏈抗PDL1 Ab與IL-15N72D和IL-15RαSu/Fc鏈連接而製造構築體。在TGFβRII二聚體的情況下，肽係由可以經由柔性連接子序列連接以產生活性單鏈形式之兩個TGFβRII組成。在一些情況下，TGFβRII二聚體及/或抗PDL1 Ab係經由遺傳工程融合與IL-15N72D及/或IL-15RαSu/Fc鏈的N末端連接。在其 他情況下，TGFβRII多肽與有/無連接子的IL-15RαSu/Fc鏈的C末端連接。包括與TGFβRII融合的IL-15N72D：IL-15RαSu/Fc支架和抗PDL1結合域的特異性融合蛋白質複合體係如下述。
A：αPDL1/TGFβRII/TXM(N-810C)：產生包括TGFβRII二聚體/IL-15RαSu/Fc和抗PDL1-IL15N72D融合蛋白的融合蛋白質複合體。
A1：TGFβRII/IL-15RαSu/Fc：人類TGFβRII編碼序列獲自UniProt網站，並針對CHO細胞株轉染進行了優化。具體地，基因構築體係藉由連接體TGFβRII的編碼序列與另一個TGFβRII以產生編碼TGFβRII二聚體的序列，然後將該序列直接連接到編碼IL-15RαSu/Fc鏈的N末端的序列而製造。構築體的DNA序列係由Genewiz Inc合成，並用於分子選殖到表現載體中。
TGFβRII/IL-15RαSu/Fc構築體(包括訊號肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO：1)：(訊號肽)atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(人類TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0093-331
(連接子)ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
(人類TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0094-332
(人類IL-15R α sushi域)
Figure 108110496-A0202-12-0094-333
(人類IgG1 CH2-CH3(Fc)域)
Figure 108110496-A0202-12-0094-334
Figure 108110496-A0202-12-0095-335
TGFβRII/IL-15RαSu/Fc融合蛋白(包含訊號肽序列)之胺基酸序列如下(SEQ ID NO：2)：(訊號肽)MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人類TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0095-336
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(人類TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0095-337
(人類IL-15R α sushi域)ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(人類IgG1 CH2-CH3(Fc)域)
Figure 108110496-A0202-12-0095-338
Figure 108110496-A0202-12-0096-339
在一些情況下，前導肽從完整多肽上裂解，以產生可溶解或分泌的成熟形式。
A2：抗PDL1-15N72D：還經由重疊PCR將合成的單鏈抗PDL1抗體核苷酸序列與IL-15N72D的N末端編碼區連接以產生抗PDL1-15N72D而製備構築體。具體地，抗PDL1 Ab的輕鏈和重鏈可變域序列係藉由編碼柔性連接子的序列連接，以形成單鏈抗PDLI抗體構築體，然後單鏈抗PD-L1序列與編碼IL-15N72D的N末端之序列連接。單鏈抗PDL1 Ab的序列係由Genewiz Inc合成，然後經由重疊PCR與IL-15N72D的N末端編碼區連接。包括與IL15N72D的N末端連接的單鏈抗PDL1 Ab的構築體的核酸和蛋白質序列如下所示。
抗PDL1/IL-15N72D構築體(包括前導序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO：3)：(訊號肽)atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(抗PDL1單鏈)
(抗PDL1輕鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0096-340
Figure 108110496-A0202-12-0097-341
(連接子)ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
(抗PDL1重鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0097-342
(人類IL-15N72D)
Figure 108110496-A0202-12-0097-343
抗PDL1/IL-15N72D融合蛋白(包含前導序列)之胺基酸序列如下(SEQ ID NO：4)：(訊號肽)MKWVTFISLLFLFSSAYS
(抗PDL1單鏈)
(抗PDL1輕鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0097-344
Figure 108110496-A0202-12-0098-345
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(抗PDL1重鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0098-346
(人類IL-15N72D)
Figure 108110496-A0202-12-0098-347
在一些情況下，前導肽從完整多肽裂解，以產生可溶解或分泌的成熟形式。
共轉染和蛋白質純化。如前述(美國專利第8,507,222號，實施例1，其係藉由引用方式併入本文)將TGFβRII/IL-15RαSu/Fc和抗PDL1 IL15N72D構築體選殖到表現載體中，並將表現載體轉染到CHO細胞中。CHO細胞中之兩種構築體的共表現允許形成和分泌可溶性抗PDL1 IL15N72D：TGFβRII/IL-15RαSu/Fc融合蛋白質複合體(稱為抗PDL1/TGFβRII/TxM)。抗PDL1/TGFβRII/TxM蛋白質係藉由蛋白質A親和力層析術和粒徑排阻層析術從CHO細胞培養上清液中純化，產生由TGFβRII/IL-15RαSu/Fc二聚體和抗PDL1-IL15N72D融合蛋白質組成的 可溶性(非凝聚的)融合蛋白質複合體(第2圖)。
蛋白質A純化的抗PDL1-IL15N72D：TGFβRII/IL-15RαSu/Fc融合蛋白質複合體的還原SDS-PAGE分析顯示於第3圖中。觀察到對應於可溶性抗PDL1-IL15N72D：TGFβRII/IL-15RαSu/Fc融合蛋白質分別在~40kDa和~70kDa的的條帶(第3和8圖)。
B：TGFβRII/αPDL1/TXM(N-810B)
對於第二種方法，產生了類似的融合蛋白質複合體，其包括TGFβRIIIL15N72D：抗PDL1-15RαSu/Fc融合蛋白質。
B1：抗PDL1-15RαSu/Fc：經由重疊PCR將合成的單鏈抗PDL1 Ab核苷酸序列與IL-15RαSu/Fc的N末端編碼區連接，產生抗PDL1-15RαSu/Fc基因構築體。包括與IL-15RαSu/Fc的N末端連接的抗PDL1 Ab的構築體的核酸和蛋白質序列如下所示。
抗PDL1/IL-15RαSu/Fc構築體(包括訊號肽序列)的核酸序列如下(SEQ ID NO：5)：(訊號肽)atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(抗PDL1單鏈)
(抗PDL1輕鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0099-348
Figure 108110496-A0202-12-0100-349
(連接子)ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
(抗PDL1重鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0100-350
(人類IL-15R α sushi域)
Figure 108110496-A0202-12-0100-351
(人類IgG1 CH2-CH3(Fc)域)
Figure 108110496-A0202-12-0100-352
Figure 108110496-A0202-12-0101-353
抗PDL1/IL-15RαSu/Fc融合蛋白質(包括訊號肽序列)的胺基酸序列如下(SEQ ID NO：6)：(訊號肽)MKWVTFISLLFLFSSAYS
(抗PDL1單鏈)
(抗PDL1單鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0101-354
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(抗PDL1重鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0101-355
(人類IL-15R α sushi域)ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(人類IgG1 CH2-CH3(Fc)域)
Figure 108110496-A0202-12-0101-356
Figure 108110496-A0202-12-0102-357
在一些情況下，前導肽從完整多肽裂解，以產生可溶解或分泌的成熟形式。
B2：TGFβRIIIL15N72D：具體地，構築體係藉由連接子將TGFβRII與另一TGFβRII連接以產生TGFβRII二聚體，然後將TGFβRII二聚體序列直接連接至IL15N72D的N末端而製造。編碼TGFβRII-IL15N72D的DNA片段係由GENEWIZ合成。
TGFβRII-IL15N72D構築體的核酸序列(包括訊號肽序列)如下(SEQ ID NO：7)：(訊號肽)atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(人類TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0102-358
(連接子)ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
(人類TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0103-359
(人類IL-15N72D)
Figure 108110496-A0202-12-0103-360
TGFβRIIIL15N72D融合蛋白質(包括前導序列)的胺基酸序列如下(SEQ ID NO：8)：(訊號肽)MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人類TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0103-361
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(人類TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0104-362
(人類IL-15N72D)
Figure 108110496-A0202-12-0104-363
在一些情況下，前導肽從完整多肽裂解，以產生可溶解或分泌的成熟形式。
共轉染和蛋白質純化：如前述(美國專利第8,507,222號，實施例1，其係藉由引用方式併入本文)將TGFβRII二聚體/IL-15N72D和αPDL1/IL-15RαSu/Fc構築體選殖到表現載體中，並且將表現載體轉染到CHO細胞中。CHO細胞中兩種構築體的共表現允許形成和分泌可溶性TGFβRII/IL-15N72D：αPDL1/IL-15RαSu/Fc融合蛋白質複合體(稱為TGFβRII/αPDL1/TxM)。
TGFβRII/抗PDL1/TxM蛋白質係藉由蛋白質A親和力層析術和粒徑排阻層析術從CHO細胞培養上清液純化，產生可溶性(非凝聚的)融合蛋白質複合體(第5圖)。
蛋白質A純化的TGFβRII/抗PDL1/TxM融合蛋白質複合體的還原SDS-PAGE分析顯示於第6圖中。觀察到對應於可溶性抗PDL1-IL15N72D：TGFβRII/IL-15RαSu/Fc融合蛋白質分別在~50kDa和~60kDa 的條帶(第6和8圖)。
C：αPDL1/TXM/TGFβRII(N-810A)
還產生融合蛋白質複合體，其包括IL15N72D和抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII。在這些構築體中，TGFβRII與具有或不具有連接子的抗PDL1-IL-15RαSu/Fc的C末端融合(第7圖)。
C1：IL15N72D：如前述製備IL15N72D構築體(美國專利第8,507,222號，實施例1，其係藉由引用方式併入本文)。
IL15N72D構築體的核酸序列(包括訊號肽序列)如下(SEQ ID NO：9)：(訊號肽)atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(人類IL-15N72D)
Figure 108110496-A0202-12-0105-364
IL15N72D蛋白質之胺基酸序列(包含前導序列)如下(SEQ ID NO：10)：(訊號肽)MKWVTFISLLFLFSSAYS
(人類IL-15N72D)
Figure 108110496-A0202-12-0106-365
在一些情況下，前導肽從完整多肽裂解，以產生可溶解或分泌的成熟形式。
C2：抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII：為這融合蛋白質製備兩種構築體(第7圖)。在第一種構築體中，TGEβRII直接與抗PDL1/IL-15RαSu/Fc的C末端融合。在第二種構築體中，在TGFβRII和抗PDL1/IL-15RαSu/Fc之間加入連接子以增加靈活性。兩種編碼抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII的核酸序列之構築體係由Genewiz合成。在TGFβRII序列的第27位置進行核酸突變(G至T)，以在該位置產生Hap1限制酶切斷(cutting)位點，但是，胺基酸序列沒有改變。
C2A：抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII-無連接子：不具連接子的抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII構築體的核酸序列(包括訊號肽序列)如下(SEQ ID NO：11)：(訊號肽)atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(訊號肽)atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
(抗PDL1單鏈)
(抗PDL1輕鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0106-366
Figure 108110496-A0202-12-0107-367
(連接子)ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
(抗PDL1重鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0107-368
(人類IL-15R α sushi域)
Figure 108110496-A0202-12-0107-369
(人類IgG1 CH2-CH3(Fc)域)
Figure 108110496-A0202-12-0107-370
Figure 108110496-A0202-12-0108-371
(人類TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0108-372
抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII融合蛋白質(包括訊號肽序列)的胺基酸序列如下(SEQ ID NO：12)：(訊號肽)MKWVTFISLLFLFSSAYS
(抗PDL1單鏈)
(抗PDL1輕鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0108-373
(連接子) GGGGSGGGGSGGGGS
(抗PDL1重鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0109-374
(人類IL-15R α sushi域)ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(人類IgG1 CH2-CH3(Fc)域)
Figure 108110496-A0202-12-0109-375
(人類TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0109-376
C2B：具有連接子的抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII：具有連接子(包括訊號肽序列)的抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII構築體的核酸序列如下(SEQ ID NO：13)：(訊號肽) atgaagtgggtgaccttcatcagcctgctgttcctgttctccagcgcctactcc
抗PDL1單鏈
(抗PDL1輕鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0110-377
(連接子)ggaggtggcggatccggaggtggaggttctggtggaggtgggagt
(抗PDL1重鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0110-378
(人類IL-15R α sushi域)
Figure 108110496-A0202-12-0110-379
(人類IgG1 CH2-CH3(Fc)域)
Figure 108110496-A0202-12-0110-380
Figure 108110496-A0202-12-0111-381
(連接子)ggaggaggtggctccggaggcggtggctccggtggaggtggctccggaggtggcggttccggt
(人類TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0111-382
具有連接子融合蛋白質(包括訊號肽序列)的抗PDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII的胺基酸序列如下(SEQ ID NO：14)：(訊號肽)MKWVTFISLLFLFSSAYS
(抗PDL1單鏈)
(抗PDL1輕鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0112-383
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(抗PDL1重鏈可變域)
Figure 108110496-A0202-12-0112-384
(人類IL-15R α sushi域)ITCPPPMSVEHADIWVKSYSLYSRERYICNSGFKRKAGTSSLTECVLNKATNVAHWTTPSLKCIR
(人類IgG1 CH2-CH3(Fc)域)
Figure 108110496-A0202-12-0112-385
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(人類TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0113-386
共轉染和蛋白質純化：如前述(美國專利第8,507,222號，實施例1，其係藉由引用方式併入本文)將IL-15N72D和αPDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII構築體選殖到表現載體中，並將表現載體轉染到CHO細胞中。CHO細胞中兩種構築體的共表現允許形成和分泌可溶性IL-15N72D：αPDL1/IL-15RαSu/Fc/TGFβRII融合蛋白質複合體(稱為αPDL1/TxM/TGFβRII)，其可以藉由蛋白質A親和力和其他層析方法純化，並藉由SDS-PAGE和SEC方法分析，以確認純度和適當的條帶樣式(第22圖)。
在一些情況下，前導肽從完整多肽裂解，以產生可溶解或分泌的成熟形式。
本發明的其他序列包括：2x-TGFβRII-IL15(N72D)(SEQ ID NO：15)：
Figure 108110496-A0202-12-0113-387
Figure 108110496-A0202-12-0114-388
TGFβRII-IgG1-Fc(SEQ ID NO：16)：
Figure 108110496-A0202-12-0114-389
Figure 108110496-A0202-12-0115-74
TGFβRII-二聚體-IL15RaSu-IgG1-Fc(SEQ ID NO：17)：
Figure 108110496-A0202-12-0115-75
Figure 108110496-A0202-12-0116-141
IL15(N72D)(SEQ ID NO：18)：
Figure 108110496-A0202-12-0116-77
αPD-L1/SuFc/TGF-β(SEQ ID NO：19)：
Figure 108110496-A0202-12-0116-78
Figure 108110496-A0202-12-0117-79
Figure 108110496-A0202-12-0118-80
此外，上述融合蛋白還可以包括野生型IL-15的序列，而不是IL-15N72D變異體。例如，上述編碼IL-15N72D域的核酸序列可以用編碼野生型IL-15的核酸序列取代。本發明的核酸序列可以是天然序列或為彼等在宿主細胞中表現而優化的序列，亦即，密碼子優化的序列。
野生型IL15蛋白質域的胺基酸序列如下(SEQ ID NO：20)：(人類IL-15)
Figure 108110496-A0202-12-0118-81
N-810 A
N-810A(αPD-L1輕鏈Fv/連接子/αPD-L1重鏈Fv/連接子/IL15RαSuFc/連接子/TGFβRII)蛋白質之胺基酸序列如下(SEQ ID NO：21)：(IL-15(N72D))
Figure 108110496-A0202-12-0118-82
(αPD-L1輕鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0118-83
Figure 108110496-A0202-12-0119-84
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0119-85
(IL15RαSuFc)
Figure 108110496-A0202-12-0119-86
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0119-87
N-810A無糖基化之TGFβRII*(αPD-L1輕鏈Fv/連接子/αPD-L1重鏈Fv/連接子/IL15RαSuFc/連接子/TGFβRII)(SEQ ID NO：22) 的胺基酸如下：(IL-15(N72D))
Figure 108110496-A0202-12-0120-88
(αPD-L1輕鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0120-89
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0120-90
(IL15RαSuFc)
Figure 108110496-A0202-12-0120-91
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0121-92
N-810A
無糖基化之TGFβRII+△游離半胱胺酸*(αPD-L1輕鏈Fv/連接子/αPD-L1重鏈Fv/連接子/IL15RαSuFc/連接子/TGFβRII)(SEQ ID NO：23)的胺基酸如下：((IL-15(N72D))
Figure 108110496-A0202-12-0121-93
(αPD-L1輕鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0121-94
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0121-95
Figure 108110496-A0202-12-0122-96
(IL15RαSuFc)
Figure 108110496-A0202-12-0122-97
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0122-98
N-810A△絞鏈區**(αPD-L1輕鏈Fv/連接子/αPD-L1重鏈Fv/連接子/IL15RαSuFc/連接子/TGFβRII)(SEQ ID NO：24)之胺基酸如下：((IL-15(N72D))
Figure 108110496-A0202-12-0122-99
(αPD-L1輕鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0123-100
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0123-101
(IL15RαSuFc)
Figure 108110496-A0202-12-0123-102
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0123-103
N-810A+(IL15-K41Q、L45S、I67T、N79Y、E93A)*(αPD-L1輕鏈Fv/連接子/αPD-L1重鏈Fv/連接子/IL15RαSuFc/連接子/TGFβRII)(SEQ ID NO：25)的胺基酸如下：(IL-15-K41Q、L45S、I67T、N79Y、E93A)
Figure 108110496-A0202-12-0124-104
(αPD-L1輕鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0124-105
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0124-106
(IL15RαSuFc)
Figure 108110496-A0202-12-0124-107
Figure 108110496-A0202-12-0125-108
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0125-109
N-810A+(IL15-L45S)*(αPD-L1輕鏈Fv/連接子/αPD-L1重鏈Fv/連接子/IL15RαSuFc/連接子/TGFβRII)(SEQ ID NO：26)之胺基酸如下：(IL15-L45S)
Figure 108110496-A0202-12-0125-110
(αPD-L1輕鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0125-111
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0125-112
Figure 108110496-A0202-12-0126-113
(IL15RαSuFc)
Figure 108110496-A0202-12-0126-114
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0126-115
N-810D
αPD-L1輕鏈Fv/連接子/αPD-L1重鏈Fv/IL-15(N72D)(SEQ ID NO：27)：(αPD-L1輕鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0126-116
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0127-117
((IL-15(N72D))
Figure 108110496-A0202-12-0127-118
IL15RαSuFc/連接子/TGFβRII(SEQ ID NO：28)：(IL15RαSuFc)
Figure 108110496-A0202-12-0127-119
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0127-120
Figure 108110496-A0202-12-0128-121
N-810D
無糖基化之TGFβRII*
αPD-L1輕鏈Fv/連接子/αPD-L1重鏈Fv/IL-15(N72D)(SEQ ID NO：29)如下：(αPD-L1輕鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0128-122
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0128-123
((IL-15(N72D))
Figure 108110496-A0202-12-0128-124
IL15RαSuFc/連接子/TGFβRII(SEQ ID NO：30)：(IL15RαSuFc)
Figure 108110496-A0202-12-0128-125
Figure 108110496-A0202-12-0129-126
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSG
(TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0129-127
N-810E
αPD-L1輕鏈Fv/連接子/αPD-L1重鏈Fv/IL-15(N72D)(SEQ ID NO：31)：(αPD-L1輕鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0129-128
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0129-129
Figure 108110496-A0202-12-0130-130
((IL-15(N72D))
Figure 108110496-A0202-12-0130-131
TGFβRII/IL15RαSuFc(SEQ ID NO：32)：(TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0130-132
(IL15RαSuFc)
Figure 108110496-A0202-12-0130-133
N-810E
無糖基化之TGFβRII*
αPD-L1輕鏈Fv/連接子/αPD-L1重鏈Fv/IL-15(N72D)(SEQ ID NO：33)
(αPD-L1輕鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0131-134
(連接子)GGGGSGGGGSGGGGS
(αPD-L1重鏈Fv)
Figure 108110496-A0202-12-0131-135
(IL-15(N72D))
Figure 108110496-A0202-12-0131-136
TGFβRII/IL15RαSuFc(SEQ ID NO：34)：(TGFβRII)
Figure 108110496-A0202-12-0131-137
(IL15RαSuFc)
Figure 108110496-A0202-12-0131-138
Figure 108110496-A0202-12-0132-139
*新的點突變在序列內以劃底線的殘基的標記。
**刪除用刪除線表示。最終序列不包括這些殘基。
註：所有無糖基化之形式、突變的游離半胱胺酸及/或鉸鏈區刪除版本還可以與IL15-K41Q、L45S、I67T、N79Y、E93A突變組合。
實施例2.包括IL-15、抗PDL1和TGFβRII域的融合蛋白質複合體的生物學活性。多種方法用於特徵化本發明複合體的生物活性(第9圖)
IL-15免疫刺活化性：基於IL-15依賴性32Dβ細胞(其係小鼠造血細胞株)的增殖，評估αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白質複合體的IL-15免疫刺活化性。將增加程度的αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM或αPDL1/TGFβRII/TXM加入200μL RPMI：10%FBS培養基中的32Dβ細胞(104個細胞/孔)中，並將細胞在37℃培養3天。然後加入PrestoBlue細胞存活力試劑(20μL/孔)。4小時後，於570nm測量吸光度(具有600nm參考波長以用於標準化)，以基於藉由代謝活性細胞還原PrestoBlue(一種基於刃天青的溶液)而測定細胞增殖。然後基於吸光度和蛋白質濃度之間的關係，測定αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM的IL-15生物活性的半數最大有效濃度(EC50)。評估ALT-803的生物活性以作為陽性對照。
如第10、13、14A和14B圖所示，αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白質複合體能夠刺激32Dβ細胞的生長，證明這些蛋白質保留IL-15免疫刺活化性。
與PD-L1結合：將基於流式細胞術的測定用於評估體外αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM與PD-L1的結合。具體地，將αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM、αPDL1/TGFβRII/TXM和抗PD-L1抗體對照的連續稀釋液與表現PD-L1(2.5×105個細胞)的人類H441腫瘤細胞一起在黑暗於冰中培養2小時。然後洗滌細胞，重新懸浮並用APC抗人類IgG Fc抗體(殖株HP6017)在黑暗中於4℃染色30分鐘。洗滌兩次後，將細胞重新懸浮於250μl FACS緩衝液(1% BSA和0.05% NaN3於磷酸鹽緩衝鹽水)中，並保持在冰中，直到在BD FCSVerse流式細胞儀用BD FD FCS Suite V1.0.6進行分析。對每種蛋白質濃度定量平均螢光強度(MFI)。
如第12、13、15A和15B圖所示，αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白質複合體能夠結合在人類腫瘤細胞上表現的PDL1。類似地，第22圖顯示藉由表面等離子體共振(SPR)測定法，而將αPDL1/TxM/TGFβRII複合體與PD-L1結合。
抑制TGFβ活性：TGFβ蛋白質與細胞表面的受體結合，啟動訊號級聯反應，導致SMAD2和SMAD3的磷酸化和活化，然後SMAD2和SMAD3與SMAD4形成複合體。然後SMAD複合體易位至細胞核且與細胞核中的SMAD結合元素(SBE)結合，導致TGF-β/SMAD反應基因的轉錄和表現。評估了αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和 αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白質複合體抑制TGF-β誘發的Smad2/3訊號傳遞的能力。
攜帶TGFβ/SMAD訊號傳遞路徑SEB報告基因(BPS Bioscience，# 60653)的HEK293以每孔5×104個細胞的密度接種於100μl MEM培養基中的白色透明底96孔微孔板(Corning 3610)中，並且在37℃和5%CO2培養過夜。24小時後，將孔更換為80μl新鮮的測定培養基，並在37℃和5%CO2培養4小時。然後將10μlαPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM、αPDL1/TGFβRII/TXM或TGFβRII-Fc對照的連續稀釋液、加入到各孔，並培養1小時，接著藉由將10μl重組人類TGF-β1或TGF-β3(R & D Systems，100ng/mL)加到每孔，使總體積達到100μl。培養過夜後，將100μl的ONE-StepTM螢光酶試劑(BPS Bioscience，# 60690)加入，將盤在室溫培養至少5分鐘。將GloMax Explorer平板讀取機(Promega)用於測量基於TGF-β誘發的Smad2/3訊號傳遞的發光。接著，使用GraphpadPrism7軟體，以基於吸光度和蛋白質濃度之間的關係，測定αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM的TGF-β誘發的Smad2/3的訊號傳遞之半數最大抑制濃度(EC50)。
如第11、13、16A、16B、17A和17B圖所示，αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白質複合體能夠抑制TGF-β1誘發的Smad2/3訊號傳遞。類似地，TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白質複合體還能夠抑制TGF-β3誘發的Smad2/3訊號傳遞(第17A、17B圖)。因此，這些複合體作為TGF-β捕獲分子，並且預期阻斷TGF-β蛋白質的活性。值得注意的是， TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白質複合體均顯示出比陽性對照TGFβRII-Fc蛋白質更強的針對TGF-β1和TGF-β3的抑制活性。
先前已經顯示含有TGF-β捕獲域的蛋白質具有拮抗腫瘤細胞中TGF-β1誘發的間充質化(mesenchymalization)的能力(David et al.,2017,OncoImmunology.6：10,e1349589)。預期αPDL1/TxM/TGFβRII、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白質複合體保留這種生物學活性。這可以基於David等人提供的體外或體內腫瘤細胞間充質標記物表現(亦即，波形蛋白、纖連蛋白)、增殖抑制和化學治療抗性中TGF-β1介導的變化的抑制來評估。
蛋白質與TGFβ蛋白結合的評估：將ELISA方法用於評估TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白質複合體與TGFβ1和TGFβ3的結合。具體地，將96孔ELISA盤(Nunc Maxisorb Immunoplate)用TGFβ1和TGFβ3於含有10%C SF的PBS在4℃塗佈過夜。隔天，用洗滌緩衝液(PBS，0.05%Tween-20)洗滌盤三次，並用PBS中的1%牛血清白蛋白在室溫阻斷1小時。然後將盤與TGFβRII/αPDL1/TXM，αPDL1/TGFβRII/TXM或TGFβRII-Fc對照的連續稀釋液在室溫培養1小時。在洗滌步驟後，使用抗hIgG-辣根過氧化物酶(HRP)(Jackson Immuno Research，1：4,000稀釋)在室溫偵測蛋白質結合30分鐘。隨後進行受質顯影，然後使用BioTek讀取機於405nm讀取吸光度。
如第18A、18B、19A和19B圖所示，TGFβRII/αPDL1/TXM 和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白質複合體均能夠結合TGFβ1和TGFβ3，與具有阻斷TGFβ1-和TGFβ3介導的生物活性的蛋白質TXM能力一致。
類似地，第23圖顯示藉由表面等離子共振(SPR)測定法之αPDL1/TxM/TGFβRII複合體與TGFβ1、TGFβ2和TGFβ3結合。
針對PD-L1陽性腫瘤細胞的抗體依賴性細胞毒性：TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM蛋白質可藉由誘發自然殺傷和CD8 T細胞效應反應而有效對抗腫瘤，阻斷TFG-β蛋白質的免疫抑制作用或PD-1檢查點抑制劑及/或靶向針對PD-L1表現腫瘤細胞的免疫反應。為了評估這些蛋白質介導針對PD-L1陽性腫瘤細胞的抗體依賴性細胞毒性的能力，將以Celltrace標記的PD-L1陽性人類H441肺腫瘤細胞(2x105個細胞)與NK效應細胞在不同濃度的TGFβRII/αPDL1/TXM、αPDL1/TGFβRII/TXM、抗PD-L1抗體、非靶向TXM(101074/TXM)或其他對照的存在下，在37℃以1：10比進行二重複的培養。培養20小時後，採集細胞並重新懸浮於PI溶液(2μg/ml)中以標記死亡細胞。然後藉由流式細胞術測量死亡的Celltrace陽性PI陽性H441腫瘤細胞的百分比。
如第20和21圖所示，TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM融合蛋白質複合體均能夠介導針對表現PD-L1的腫瘤細胞之ADCC。事實上，TGFβRII/αPDL1/TXM展現比抗PD-L1 IgG1抗體的等莫耳濃度更高的ADCC。PD-L1陽性人類HCC4006肺癌細胞、CaSki子宮頸癌細胞和MDA-MB-231乳癌細胞中觀察到類似的結果。另外，αPDL1/TXM/TGFβRII複合體展現針對PD-L1陽性人類癌細胞之ADCC活性(第22圖)。
抑制PD-L1活性：除了評估PD-L1結合活性和針對PD-L1陽性腫瘤細胞的ADCC活性外，吾等還評估了TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM複合體抑制PD-L1對PD-1陽性效應細胞之免疫抑制(檢查點)的活性的能力。在標準化測定法中，表現人類PD-L1的人工抗原呈現細胞(aAPC)和以非抗原依賴性方式活化同源TCR的工程細胞表面蛋白與表現人類PD-1和由NFAT反應元素驅使之螢光酶報告基因的Jurkat T細胞混合。當共培養兩種細胞類型時，PD-1/PD-L1相互作用抑制TCR訊號傳遞和NFAT-RE介導的發光。加入阻斷PD-1/PD-L1相互作用的抗PD-1或抗PD-L1抗體域釋放抑制訊號並導致TCR活化和NFAT-RE介導的發光(第23圖)。使用標準程序在這測定中評估TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM複合體的活性(第24圖)。抗PD-L1抗體和PD-L1/TxM蛋白質複合體(類似於TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TGFβRII/TXM複合體，但缺少TGFβRII域)作為陽性對照。
如第25A和25B圖所示，αPDL1/TGFβRII/TXM、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TXM/TGFβRII複合體能夠以劑量依賴性方式誘發NFAT-RE介導的發光，具有與抗PD-L1 Ab對照相似的活性。這些結果證實αPDL1/TGFβRII/TXM、TGFβRII/αPDL1/TXM和αPDL1/TXM/TGFβRII複合體保留免疫檢查點阻斷活性。
N-810：第26A和26B圖證明與親本對照分子αPDL1/TxM的活性(第26B圖)相比，有針對N-810的人類TGFβ特異性阻斷活性(第26A圖)。將穩定的基於細胞螢光酶的報告系統(HEK-293T-luc2P/SBE)用以評估特異性TGFβ阻斷活性。在存在或不存在阻斷試劑的情況下，用 0.0175nM重組人類TGFβ1刺激培養的細胞20小時。對hTGFβ1的反應係由相對發光單位(RLU)±SD表示。
N-810 Sorrento-Fc：第27A和27B圖證明與親本對照分子αPDL1/TxM的活性(第27B圖)相比，針對N-810 Sorrento-Fc的特異性hTGFβ1阻斷活性(第27A圖)。將穩定的基於細胞螢光酶的報告系統(HEK-293T-luc2P/SBE)用以評估特異性TGFβ阻斷活性。在存在或不存在阻斷試劑的情況下，用0.0175nM重組人類TGFβ1刺激培養的細胞20小時。對hTGFβ1的反應係由相對發光單位(RLU)±SD表示。
N-810△C：第28A和28B圖證明與親本對照分子αPDL1/TxM的活性(第28B圖)相比，針對N-810△C的特異性hTGFβ1阻斷活性(第28A圖)。將穩定的基於細胞螢光酶的報告系統(HEK-293T-luc2P/SBE)以評估特異性TGFβ阻斷活性。在存在或不存在阻斷試劑的情況下，用0.0175nM重組人類TGFβ1刺激培養的細胞20小時。對hTGFβ1的反應係由相對發光單位(RLU)±SD表示。
N-810D：第29A和29B圖是證實與親本對照分子(αPDL1/TxM，第29B圖)的活性相比，針對N-810D的特異性hTGFβ1阻斷活性的圖(第29A圖)。將穩定的基於細胞螢光酶的報告系統(HEK-293T-luc2P/SBE)用以評估特異性TGFβ阻斷活性。在存在或不存在阻斷試劑的情況下，用0.0175nM重組人類TGFβ1刺激培養的細胞20小時。對hTGFβ1的反應係由相對發光單位(RLU)±SD表示。
TxM構築體的抗體依賴性細胞毒性(ADCC)：第30圖是證明TxM構築體在乳腺癌細胞(MDA-MB-231)中的抗體依賴性細胞毒性 (ADCC)的圖。將抗體依賴性細胞毒性(ADCC)用以測定特異性αPD-L1活性。效應細胞：haNK(NK-92衍生物)。
TxM構築體：第31A至31H圖是顯示各種構築體的示意圖。第31A圖：N-810A。第31B圖：N-810A無糖基化。第31C圖：N-810A無糖基化，△游離半胱胺酸。第31D圖：N-810A△鉸鏈區。圖第31E圖：N-810A(IL15-K41Q、L45S、I67T、N79Y、E93A)。IL15中的突變增強了分子的溶解度和表現。第31F圖：N-810A(IL15-L45S)。IL15中的突變增強分子的溶解度和表現。第31G圖：N-810D。第31H圖：N-810E。
第32圖和表1證明IL15突變增加蛋白質產率並減少凝聚。N-810D的變化也會增加產率並減少凝聚。
Figure 108110496-A0202-12-0139-140
其他具體實施例
雖然已經結合本發明的實施方式而描述了本發明，先前敘述的描述旨在闡釋，而不是限制由所附申請專利範圍之範疇限定之本發明的範疇。其他態樣、優點和修改皆落入如下申請專利範圍的範疇內。
本文提及的專利和科學文獻建立了發明所屬技術領域之技 術人員可獲得的知識。本文引用的所有美國專利和公開或未公開的美國專利申請係藉由引用方式併入本文中。本文引用的所有公開的外國專利和專利申請案係藉由引用方式併入本文中。由本文引用的登錄號表示的Genbank和NCBI提交物的文獻在此以引用方式併入。本文引用的所有其他公開的參考文獻、文獻、手稿和科學文獻在此以引入方式併入。
雖然已經參考本發明之較佳具體實施例而特別顯示和描述了本發明，發明所屬技術領域之技術人員將理解，在不悖離所附申請專利範圍所涵蓋的本發明的範疇的情況下，可以在形式和細節上進行各種改變。
<110> 艾爾特生物科技公司
<120> 抗PDL1、IL-15及TGF-β受體組合分子
<130> 055537-508001WO
<140> PCT/US2019/024077
<141> 2019-03-26
<150> 62/734,994
<151> 2018-09-21
<150> 62/648,373
<151> 2018-03-26
<160> 46
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1806
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 1
Figure 108110496-A0202-12-0141-143
Figure 108110496-A0202-12-0142-144
<210> 2
<211> 602
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 2
Figure 108110496-A0202-12-0142-146
Figure 108110496-A0202-12-0143-148
Figure 108110496-A0202-12-0144-149
Figure 108110496-A0202-12-0145-150
<210> 3
<211> 1123
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 3
Figure 108110496-A0202-12-0145-151
Figure 108110496-A0202-12-0146-152
<210> 4
<211> 374
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 4
Figure 108110496-A0202-12-0146-154
Figure 108110496-A0202-12-0147-155
<210> 5
<211> 1671
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 5
Figure 108110496-A0202-12-0148-156
Figure 108110496-A0202-12-0149-157
<210> 6
<211> 557
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 6
Figure 108110496-A0202-12-0149-158
Figure 108110496-A0202-12-0150-159
Figure 108110496-A0202-12-0151-160
<210> 7
<211> 1257
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 7
Figure 108110496-A0202-12-0151-161
Figure 108110496-A0202-12-0152-164
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 8
Figure 108110496-A0202-12-0152-163
Figure 108110496-A0202-12-0153-165
Figure 108110496-A0202-12-0154-166
<210> 9
<211> 396
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 9
Figure 108110496-A0202-12-0154-167
<210> 10
<211> 132
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 10
Figure 108110496-A0202-12-0155-169
<210> 11
<211> 2079
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 11
Figure 108110496-A0202-12-0155-168
Figure 108110496-A0202-12-0156-170
Figure 108110496-A0202-12-0157-171
<210> 12
<211> 693
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 12
Figure 108110496-A0202-12-0157-173
Figure 108110496-A0202-12-0158-174
Figure 108110496-A0202-12-0159-175
Figure 108110496-A0202-12-0160-176
<210> 13
<211> 2142
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 13
Figure 108110496-A0202-12-0160-177
Figure 108110496-A0202-12-0161-179
<210> 14
<211> 714
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 14
Figure 108110496-A0202-12-0161-178
Figure 108110496-A0202-12-0162-180
Figure 108110496-A0202-12-0163-181
Figure 108110496-A0202-12-0164-182
<210> 15
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 15
Figure 108110496-A0202-12-0165-183
<210> 16
<211> 1161
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 16
Figure 108110496-A0202-12-0165-184
Figure 108110496-A0202-12-0166-186
<210> 17
<211> 1809
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 17
Figure 108110496-A0202-12-0166-185
Figure 108110496-A0202-12-0167-187
<210> 18
<211> 342
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 18
Figure 108110496-A0202-12-0168-188
<210> 19
<211> 2148
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 19
Figure 108110496-A0202-12-0168-189
Figure 108110496-A0202-12-0169-191
<210> 20
<211> 114
<212> PRT
<213> 智人
<400> 20
Figure 108110496-A0202-12-0169-190
Figure 108110496-A0202-12-0170-192
<210> 21
<211> 810
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 21
Figure 108110496-A0202-12-0170-193
Figure 108110496-A0202-12-0171-194
Figure 108110496-A0202-12-0172-195
Figure 108110496-A0202-12-0173-196
<210> 22
<211> 810
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 22
Figure 108110496-A0202-12-0174-197
Figure 108110496-A0202-12-0175-198
Figure 108110496-A0202-12-0176-199
Figure 108110496-A0202-12-0177-200
<210> 23
<211> 810
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 23
Figure 108110496-A0202-12-0177-203
Figure 108110496-A0202-12-0178-204
Figure 108110496-A0202-12-0179-205
Figure 108110496-A0202-12-0180-206
Figure 108110496-A0202-12-0181-207
<210> 24
<211> 805
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 24
Figure 108110496-A0202-12-0181-209
Figure 108110496-A0202-12-0182-210
Figure 108110496-A0202-12-0183-211
Figure 108110496-A0202-12-0184-212
<210> 25
<211> 810
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 25
Figure 108110496-A0202-12-0185-213
Figure 108110496-A0202-12-0186-214
Figure 108110496-A0202-12-0187-215
Figure 108110496-A0202-12-0188-216
<210> 26
<211> 810
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 26
Figure 108110496-A0202-12-0188-217
Figure 108110496-A0202-12-0189-218
Figure 108110496-A0202-12-0190-219
Figure 108110496-A0202-12-0191-220
Figure 108110496-A0202-12-0192-221
<210> 27
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 27
Figure 108110496-A0202-12-0192-222
Figure 108110496-A0202-12-0193-223
<210> 28
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 28
Figure 108110496-A0202-12-0194-224
Figure 108110496-A0202-12-0195-225
<210> 29
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 29
Figure 108110496-A0202-12-0196-226
Figure 108110496-A0202-12-0197-227
<210> 30
<211> 454
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 30
Figure 108110496-A0202-12-0197-228
Figure 108110496-A0202-12-0198-229
Figure 108110496-A0202-12-0199-230
<210> 31
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 31
Figure 108110496-A0202-12-0200-231
Figure 108110496-A0202-12-0201-232
<210> 32
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 32
Figure 108110496-A0202-12-0201-233
Figure 108110496-A0202-12-0202-234
Figure 108110496-A0202-12-0203-235
<210> 33
<211> 356
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 33
Figure 108110496-A0202-12-0203-236
Figure 108110496-A0202-12-0204-237
Figure 108110496-A0202-12-0205-238
<210> 34
<211> 433
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 34
Figure 108110496-A0202-12-0205-240
Figure 108110496-A0202-12-0206-241
Figure 108110496-A0202-12-0207-242
<210> 35
<211> 136
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 35
Figure 108110496-A0202-12-0207-243
Figure 108110496-A0202-12-0208-244
<210> 36
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 36
Figure 108110496-A0202-12-0208-245
Figure 108110496-A0202-12-0209-246
<210> 37
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 37
Figure 108110496-A0202-12-0209-247
Figure 108110496-A0202-12-0210-248
Figure 108110496-A0202-12-0211-249
<210> 38
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 38
Figure 108110496-A0202-12-0211-250
<210> 39
<211> 114
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 39
Figure 108110496-A0202-12-0212-253
<210> 40
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成肽
<400> 40
Figure 108110496-A0202-12-0212-252
<210> 41
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成肽
<400> 41
Figure 108110496-A0202-12-0212-251
<210> 42
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成肽
<400> 42
Figure 108110496-A0202-12-0213-254
<210> 43
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成肽
<400> 43
Figure 108110496-A0202-12-0213-255
<210> 44
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成肽
<400> 44
Figure 108110496-A0202-12-0213-256
<210> 45
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 45
Figure 108110496-A0202-12-0213-258
Figure 108110496-A0202-12-0214-259
Figure 108110496-A0202-12-0215-260
<210> 46
<211> 810
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人工序列的敘述：合成多肽
<400> 46
Figure 108110496-A0202-12-0215-261
Figure 108110496-A0202-12-0216-262
Figure 108110496-A0202-12-0217-263
Figure 108110496-A0202-12-0218-264

Claims (64)

  1. 一種經單離之可溶性融合蛋白質複合體，包括至少兩個可溶性蛋白質，其中，第一可溶性蛋白質包括介白素-15(IL-15)多肽域，第二可溶性蛋白質包括與免疫球蛋白Fc域融合的可溶性IL-15受體α sushi結合域(IL-15RαSu)，其中該免疫球蛋白Fc域與轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)域融合或連接：第一可溶性蛋白質及/或第二可溶性蛋白質還包括特異性地結合疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子的結合域，以及該第一可溶性蛋白質之該IL-15域與該第二可溶性蛋白質之該IL-15RαSu域結合，以形成可溶性融合蛋白質複合體。
  2. 如申請專利範圍第1項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該免疫球蛋白Fc域經由連接子分子與轉化生長因子-β受體2型(TGFβRII)域連接。
  3. 如申請專利範圍第1項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該第一可溶性蛋白質或第二可溶性蛋白質之一者還包括特異性地結合疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子之第二結合域。
  4. 如申請專利範圍第1、2或3項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該IL-15多肽是包括N72D突變(IL-15N72D)之IL-15變異體。
  5. 如申請專利範圍第1至4項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域包括藉由多肽連接子序列與免疫球蛋白重鏈可 變域共價連接的免疫球蛋白輕鏈可變域。
  6. 如申請專利範圍第1至5項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域特異性地結合一種或多種分子，該分子包括：計畫性死亡配體1(PD-L1)、計畫性死亡1(PD-1)、細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮質激素誘發的腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族相關基因(GITR)、淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)、組織因子(TF)、類δ蛋白4(DLL4)、單股DNA或T細胞免疫球蛋白和含有黏蛋白域-3(Tim-3)。
  7. 如申請專利範圍第1至6項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域特異性地結合一種或多種分子，該分子包括：計畫性死亡配體1(PD-L1)。
  8. 如申請專利範圍第1至7項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該TGFβRII域結合轉化因子β(TGFβ)。
  9. 如申請專利範圍第1至8項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，第一融合蛋白質複合體藉由二硫鍵與第二融合蛋白質複合體共價連接，該二硫鍵將該第一可溶性融合蛋白質複合體之Fc域與該第二可溶性融合蛋白質複合體之Fc域連接。
  10. 一種可溶性融合複合體，包括至少兩個可溶性蛋白質，第一融合蛋白質和第二融合蛋白質，其中：該第一融合蛋白質包括轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)二聚體，該轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)二聚體包括與第二TGFβRII域連接之第一TGFβRII域，其中該TGFβRII二聚體與介白素-15(IL-15)多肽域 融合；該第二融合蛋白質包括與免疫球蛋白Fc域融合之可溶性IL-15受體α sushi結合域(IL-15RαSu)；其中該第二融合蛋白質還包括特異性地結合疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子之結合域，以及其中該第一融合蛋白質之該IL-15域與該第二融合蛋白質之該IL-15RαSu域結合，以形成可溶性融合蛋白質複合體。
  11. 如申請專利範圍第10項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該IL-15多肽是包括N72D突變(IL-15N72D)之IL-15變異體。
  12. 如申請專利範圍第10或11項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域包括藉由多肽連接子序列與免疫球蛋白重鏈可變域共價連接的免疫球蛋白輕鏈可變域。
  13. 如申請專利範圍第10至12項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域特異性地結合一種或多種分子，該分子包括：計畫性死亡配體1(PD-L1)、計畫性死亡1(PD-1)、細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮質激素誘發的腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族相關基因(GITR)、淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)、組織因子(TF)、類δ蛋白4(DLL4)、單股DNA或T細胞免疫球蛋白和含有黏蛋白域-3(Tim-3)。
  14. 如申請專利範圍第項10至13項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域特異性地結合一種或多種分子，該分子包括：計畫性死亡配體1(PD-L1)。
  15. 如申請專利範圍第10至14項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該TGFβRII特異性地結合轉化生長因子β(TGFβ)。
  16. 如申請專利範圍第10至15項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，第一融合蛋白質複合體藉由二硫鍵與第二融合蛋白質複合體共價連接，該二硫鍵將該第一可溶性融合蛋白質複合體之Fc域與該第二可溶性融合蛋白質複合體之Fc域連接。
  17. 一種可溶性融合複合體，包括至少兩個可溶性蛋白質，第一融合蛋白質和第二融合蛋白質，其中：該第一融合蛋白質包括與特異性地結合疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子之結合域融合之介白素-15(IL-15)多肽域；該第二融合蛋白質包括轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)二聚體，該轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)二聚體包括與第二TGFβRII域連接的第一TGFβRII域，其中該TGFβRII二聚體和可溶性IL-15受體α sushi結合域(IL-15RαSu)與免疫球蛋白Fc域融合；其中該第一或第二TGFβRII域與該IL-15RαSu域融合；其中該第一融合蛋白質之該IL-15多肽域與該第二融合蛋白質之該IL-15RαSu域結合，以形成可溶性融合蛋白質複合體。
  18. 如申請專利範圍第17項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該IL-15多肽是包括N72D突變(IL-15N72D)之IL-15變異體。
  19. 如申請專利範圍第17或18項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域包括藉由多肽連接子序列與免疫球蛋白重鏈可變域共價連接的免疫球蛋白輕鏈可變域。
  20. 如申請專利範圍第17至19項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中該結合域特異性地結合一種或多種分子，該分子包括：計畫性死亡配體1(PD-L1)、計畫性死亡1(PD-1)、細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮質激素誘發的腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族相關基因(GITR)、淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)、組織因子(TF)、類δ蛋白4(DLL4)、單股DNA或T細胞免疫球蛋白和含有黏蛋白域-3(Tim-3)。
  21. 如申請專利範圍第17至20項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域特異性地結合一種或多種分子，該分子包括：計畫性死亡配體1(PD-L1)。
  22. 如申請專利範圍第17至21項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該TGFβRII特異性地結合轉化生長因子β(TGFβ)。
  23. 如申請專利範圍第17至22項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，第一融合蛋白質複合體藉由二硫鍵與第二融合蛋白質複合體共價連接，該二硫鍵將該第一可溶性融合蛋白質複合體之Fc域與該第二可溶性融合蛋白質複合體之Fc域連接。
  24. 如申請專利範圍第1至23項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該疾病抗原與贅瘤形成、傳染病或自體免疫疾病相關。
  25. 一種核酸序列，包括SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、16、17、18、19或其組合。
  26. 如申請專利範圍第25項所述之核酸序列，其中該核酸序列還包括與編碼該可溶性蛋白質之序列可操作地連接的啟動子、轉譯起始訊 號和前導序列。
  27. 一種胺基酸序列，包括SEQ ID NO：2、4、6、8、10、12、14、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39或其組合。
  28. 一種表現載體，包括如申請專利範圍第25項所述之核酸序列或編碼如申請專利範圍第27項之胺基酸序列的核酸序列。
  29. 一種經單離之可溶性融合蛋白質複合體，包括至少兩個可溶性蛋白質，其中，第一可溶性蛋白質包括介白素-15(IL-15)多肽域和第二可溶性蛋白質包括與免疫球蛋白Fc域融合之可溶性IL-15受體α sushi結合域(IL-15RαSu)，其中該免疫球蛋白Fc(IgG Fc)域與糖基化或無糖基化之轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)域融合或連接；該第一可溶性蛋白質及/或第二可溶性蛋白質還包括特異性地結合疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子之結合域，以及該第一可溶性蛋白質之該IL-15域與該第二可溶性蛋白質之該IL-15RαSu域結合，以形成可溶性融合蛋白質複合體。
  30. 如申請專利範圍第29項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該免疫球蛋白Fc域經由連接子分子與轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)域連接。
  31. 如如申請專利範圍第29項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該免疫球蛋白Fc域是IgG Fc變異體，該IgG Fc變異體包括在殘基位置70缺少游離半胱胺酸之鉸鏈區。
  32. 如如申請專利範圍第31項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該半胱胺酸在殘基位置70經絲胺酸取代(IgG-FcC70S)。
  33. 如申請專利範圍第29項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該免疫球蛋白Fc域是缺少鉸鏈區的IgG-Fc變異體。
  34. 如申請專利範圍第29項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該第一可溶性蛋白質或第二可溶性蛋白質之一者還包括特異性地結合疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子之第二結合域。
  35. 如申請專利範圍第29、30、31、32或33項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中該IL-15多肽是包括N72D突變(IL-15N72D)、IL-15K41Q突變、IL-15L45S突變、IL-15I67T突變、IL-15N79Y突變、IL-15E93A突變或其組合之IL-15變異體。。
  36. 如申請專利範圍第35項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，IL-15多肽是包括L45S突變的IL-15變異體。
  37. 如申請專利範圍第29至35項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域包括藉由多肽連接子序列與免疫球蛋白重鏈可變域共價連接之免疫球蛋白輕鏈可變域。
  38. 如申請專利範圍第29至37項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域特異性地結合一個或多個分子，該一個或多個分子包括：計畫性死亡配體1(PD-L1)、計畫性死亡1(PD-1)、細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮質激素誘發的腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族相關基因(GITR)、淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)、組織因子(TF)、類δ蛋白4(DLL4)、單股DNA 或T細胞免疫球蛋白和含有黏蛋白域-3(Tim-3)。
  39. 如申請專利範圍第29至38項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域特異性地結合一個或多個分子，該一個或多個分子包括：計畫性死亡配體1(PD-L1)。
  40. 如申請專利範圍第29至39項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該TGFβRII域與轉化因子β(TGFβ)結合。
  41. 如申請專利範圍第29至40項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，第一融合蛋白質複合體藉由二硫鍵與第二融合蛋白質複合體共價連接，該二硫鍵將該第一可溶性融合蛋白質複合體之Fc域與該第二可溶性融合蛋白質複合體之Fc域連接。
  42. 一種經單離之可溶性融合蛋白質複合體，包括至少兩個可溶性蛋白質，其中，第一可溶性蛋白質包括介白素-15(IL-15)多肽域，而第二可溶性蛋白質包括與免疫球蛋白Fc域融合之可溶性IL-15受體α sushi結合域(IL-15RαSu)，該第一可溶性蛋白質及/或第二可溶性蛋白質還包括特異性地結合疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子之結合域，以及該第一種可溶性蛋白質之IL-15域與該第二可溶性蛋白質之IL-15RαSu域結合，以形成可溶性融合蛋白質複合體。
  43. 如申請專利範圍第42項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該免疫球蛋白Fc(IgG Fc)域還包括經由連接子分子與IgG Fc域融合或連接之糖基化或無糖基化之轉化生長因子-β受體第2型(TGFβRII)域。
  44. 如申請專利範圍第43項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該免疫球蛋白Fc(IgG Fc)域缺少TGFβRII域。
  45. 如申請專利範圍第43至44項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該免疫球蛋白Fc域是在殘基位置70缺少游離半胱胺酸之鉸鏈區之IgG Fc變異體。
  46. 如申請專利範圍第45項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該半胱胺酸在殘基位置70經絲胺酸取代(IgG-FcC70S)。
  47. 如申請專利範圍第42至46項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該免疫球蛋白Fc域是缺少鉸鏈區之IgG-Fc變異體。
  48. 如申請專利範圍第42至47項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該第一可溶性蛋白質或第二可溶性蛋白質之一者還包括特異性地結合疾病抗原、免疫檢查點分子或免疫訊號傳遞分子之第二結合域。
  49. 如申請專利範圍第42至48項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該IL-15多肽是包括N72D突變(IL-15N72D)、IL-15K41Q突變、IL-15L45S突變，、IL-15I67T突變、IL-15N79Y突變、IL-15E93A突變或其組合之IL-15變異體。
  50. 如申請專利範圍第42至49項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域包括藉由多肽連接子序列與免疫球蛋白重鏈可變域共價連接之免疫球蛋白輕鏈可變域。
  51. 如申請專利範圍第42至50項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域特異性地結合一個或多個分子，該一個或 多個分子包括：計畫性死亡配體1(PD-L1)、計畫性死亡1(PD-1)、細胞毒性T-淋巴細胞相關蛋白4(CTLA-4)、分化簇33(CD33)、分化簇47(CD47)、糖皮質激素誘發的腫瘤壞死因子受體(TNFR)家族相關基因(GITR)、淋巴細胞功能相關抗原1(LFA-1)、組織因子(TF)、類δ蛋白4(DLL4)、單股DNA或T細胞免疫球蛋白和含有黏蛋白域-3(Tim-3)。
  52. 如申請專利範圍第42至51項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，該結合域特異性地結合一個或多個分子，該一個或多個分子包括：計畫性死亡配體1(PD-L1)。
  53. 如申請專利範圍第42至52項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體，其中，第一融合蛋白質複合體藉由二硫鍵與第二融合蛋白質複合體共價連接，該二硫鍵將該第一可溶性融合蛋白質複合體之Fc域與該第二可溶性融合蛋白質複合體之Fc域連接。
  54. 一種刺激個體免疫反應之方法，包括對該個體投予有效量之如申請專利範圍第1、10、17、29或42項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體。
  55. 一種刺激個體免疫反應之方法，包括：從生物樣本中單離和分離免疫細胞；將該免疫細胞與如申請專利範圍第1、10、17、29或42項中任一項所述之可溶性融合蛋白質複合體接觸；將該免疫細胞重新輸入該個體；從而，刺激該個體免疫反應。
  56. 一種治療有其需求之個體之贅瘤形成及/或感染病之方法， 包括對該個體投予有效量之包括如申請專利範圍第1、10、17、29或42項所述之可溶性融合蛋白質複合體之醫藥組成物，從而治療該贅瘤形成或傳染病。
  57. 如申請專利範圍第56項所述之方法，其中，該贅瘤形成包括：成膠質細胞瘤、前列腺癌、血癌、B細胞腫瘤、多發性骨髓瘤、B細胞淋巴瘤、B細胞非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、慢性淋巴細胞白血病、急性髓性白血病、皮膚T細胞淋巴瘤、T細胞淋巴瘤、實體瘤，尿道上皮癌/膀胱癌、黑色素瘤、肺癌、腎細胞癌、乳癌、胃癌和食道癌、前列腺癌、胰臟癌、結直腸癌、卵巢癌、非小細胞肺癌、或鱗狀細胞頭頸癌。
  58. 如申請專利範圍第56項所述之方法，視需要地包括對個體投予一種或多種化學治療劑。
  59. 一種醫藥組成物，包括如申請專利範圍第1、10、17、29或42項所述之可溶性融合蛋白質複合體、如申請專利範圍第25項所述之核酸序列、如申請專利範圍第27項所述之胺基酸序列或如申請專利範圍第28項所述之表現載體。
  60. 一種在體外或體內抑制轉化生長因子β(TGFβ)活性之方法，包括體外接觸細胞或對有需求的個體投予有效量的如申請專利範圍第項1、10、17、29或42項所述之可溶性融合蛋白質複合體、如申請專利範圍第25項所述之核酸序列、如申請專利範圍第27項所述之胺基酸序列、如申請專利範圍第28項所述之表現載體或如申請專利範圍第59項所述醫藥組成物，從而在體外或在體內抑制轉化生長因子β(TGFβ)活性。
  61. 一種降低體內轉化生長因子β(TGFβ)之量之方法，包括對 有其需求之個體投予治療有效量之如申請專利範圍第1、10、17、29或42項所述之可溶性融合蛋白質複合體、如申請專利範圍第25項所述之核酸序列、如申請專利範圍第27項所述之胺基酸序列、如申請專利範圍第28項所述之表現載體或如申請專利範圍第59項所述之醫藥組成物，從而減少體內轉化生長因子β(TGFβ)之量。
  62. 一種在有其需求之個體誘發抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)之方法，包括對有其需求之個體投予有效量之如申請專利範圍第1、10、17、29或42項所述之可溶性融合蛋白質複合體、如申請專利範圍第25項所述之核酸序列、如申請專利範圍第27項所述之胺基酸序列、如申請專利範圍第28項所述之表現載體或如申請專利範圍第59項所述之醫藥組成物，從而在該個體誘發抗體依賴性細胞介導之細胞毒性。
  63. 一種抑制體內轉化生長因子β(TGFβ)介導之SMAD多肽之磷酸化和活化的之方法，包括對有其需求之個體投予治療有效量之如申請專利範圍第1、10、17、29或42項所述之可溶性融合蛋白質複合體、如申請專利範圍第25項所述之核酸序列、如申請專利範圍第27項所述之胺基酸序列、如申請專利範圍第28項所述之表現載體或如申請專利範圍第59項所述之醫藥組成物，從而抑制體內轉化生長因子β(TGFβ)介導之SMAD多肽之磷酸化和活化。
  64. 一種表現載體，包括包含SEQ ID NO：1、3、5、7、9、11、13、15、16、17、18、19或其組合之核酸序列。
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3305805A1 (en) * 2007-05-11 2018-04-11 Altor BioScience Corporation Fusion molecules and il-15 variants
WO2016004060A2 (en) 2014-06-30 2016-01-07 Altor Bioscience Corporation Il-15-based molecules and methods of use thereof
WO2018075989A1 (en) 2016-10-21 2018-04-26 Altor Bioscience Corporation Multimeric il-15-based molecules
CA3055156A1 (en) 2017-03-02 2018-09-07 National Research Council Of Canada Tgf-.beta.-receptor ectodomain fusion molecules and uses thereof
US11629340B2 (en) 2017-03-03 2023-04-18 Obsidian Therapeutics, Inc. DHFR tunable protein regulation
AU2018231170B2 (en) 2017-03-06 2020-07-16 Altor Bioscience Corporation IL-15-based fusions to IL-12 and IL-18
US20220257649A1 (en) * 2018-11-13 2022-08-18 Nantcell, Inc. Combination therapies for multiple myeloma
EP4021928A4 (en) * 2019-08-29 2023-09-20 NantBio, Inc. MODIFIED N-810 AND ASSOCIATED METHODS
CN113135996A (zh) * 2019-12-09 2021-07-20 启愈生物技术(上海)有限公司 一种双特异抗体及其应用
CN115135675A (zh) * 2020-02-18 2022-09-30 南京金斯瑞生物科技有限公司 融合蛋白及其用途
US20230340048A1 (en) * 2020-06-12 2023-10-26 Bristol-Myers Squibb Tgf Beta Inc. Transforming growth factor beta (tgfbeta) binding agents and uses thereof
WO2022174451A1 (zh) * 2021-02-22 2022-08-25 浙江道尔生物科技有限公司 一种具有抗癌活性的多结构域融合蛋白
TW202246357A (zh) * 2021-03-09 2022-12-01 加拿大商康爾義明生物製藥公司 雙功能同源二聚體抗PD-1及IL-15/IL-15Rα融合蛋白及其用途
WO2022188865A1 (zh) * 2021-03-12 2022-09-15 博际生物医药科技(杭州)有限公司 结合人TGFβ和PD-L1的双功能分子及其应用
EP4351320A1 (en) 2021-06-09 2024-04-17 ImmunityBio, Inc. Methods and systems for producing a protein of interest in a plant
CN115707716A (zh) * 2021-08-18 2023-02-21 丹生医药技术(上海)有限公司 一种TGF-β/VEGF双功能抗体融合蛋白
JP2024536716A (ja) * 2021-09-03 2024-10-08 ノヴァロック バイオセラピューティクス， リミテッド ＰＤ－Ｌ１、ＣＤ１３７及び／又はＴＧＦβへの二重特異性及び三重特異性結合タンパク質ならびにそれらの使用
WO2023133424A2 (en) * 2022-01-05 2023-07-13 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins and anti-pd-1 fusion peptides

Family Cites Families (29)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US1975A (en) 1841-02-12 Manner of constructing corn-shellers
US5116964A (en) 1989-02-23 1992-05-26 Genentech, Inc. Hybrid immunoglobulins
AU5098393A (en) 1992-08-14 1994-03-15 Government Of The United States Of America, As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services, The Recombinant toxin with increased half-life
US5747654A (en) 1993-06-14 1998-05-05 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant disulfide-stabilized polypeptide fragments having binding specificity
US5541087A (en) 1994-09-14 1996-07-30 Fuji Immunopharmaceuticals Corporation Expression and export technology of proteins as immunofusins
US6096871A (en) 1995-04-14 2000-08-01 Genentech, Inc. Polypeptides altered to contain an epitope from the Fc region of an IgG molecule for increased half-life
US20020182730A1 (en) 1995-07-26 2002-12-05 Micheal L. Gruenberg Autologous immune cell therapy: cell compositions, methods and applications to treatment of human disease
US5534592A (en) 1995-09-22 1996-07-09 The Goodyear Tire & Rubber Company High performance blend for tire treads
AU728657B2 (en) 1996-03-18 2001-01-18 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
NZ500284A (en) 1997-04-18 2001-09-28 Biogen Inc Type II TGF-beta receptor fusion proteins
US6392094B2 (en) * 2000-06-21 2002-05-21 Nippon Beet Sugar Mfg. Co., Ltd. Method for recovering amino acids
JP2004523205A (ja) * 2000-07-25 2004-08-05 イムノメディクス， インコーポレイテッド 多価標的結合タンパク質
US20030125251A1 (en) * 2001-06-21 2003-07-03 Wakefield Lalage M. Transforming growth factor beta (TGF-beta) antagonist selectively neutralizes "pathological" TGF-beta
KR101131297B1 (ko) 2003-11-10 2012-03-30 알토 바이오사이언스 코포레이션 가용성 티씨알 분자 및 이용 방법
EP1777294A1 (en) 2005-10-20 2007-04-25 Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale (Inserm) IL-15Ralpha sushi domain as a selective and potent enhancer of IL-15 action through IL-15Rbeta/gamma, and hyperagonist (IL15Ralpha sushi -IL15) fusion proteins
SG173364A1 (en) * 2006-07-10 2011-08-29 Biogen Idec Inc Compositions and methods for inhibiting growth of smad4-deficient cancers
BRPI0814465B1 (pt) * 2007-07-26 2021-11-23 Novagen Holding Corporation Proteína de fusão, dímero, método para produzir uma proteína de fusão, linhagem de célula, usos de uma proteína de fusão e de uma composição farmacêutica e composição farmacêutica
JP6066732B2 (ja) * 2010-03-05 2017-01-25 ザ・ジョンズ・ホプキンス・ユニバーシティー 標的免疫調節抗体および融合タンパク質に基づく組成物および方法
KR102070098B1 (ko) * 2010-09-21 2020-01-28 알토 바이오사이언스 코포레이션 다량체성 아이엘 15 용해성 융합 분자 및 그의 제조 및 사용 방법
PT3489254T (pt) * 2012-04-30 2022-12-30 Biocon Ltd Proteínas de fusão direcionadas/imunomoduladoras e seus métodos de fabrico
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
EP3071215B1 (en) 2013-11-21 2020-01-08 The Brigham and Women's Hospital, Inc. Compositions and methods for treating pulmonary hypertension
WO2016004060A2 (en) * 2014-06-30 2016-01-07 Altor Bioscience Corporation Il-15-based molecules and methods of use thereof
US20170088597A1 (en) 2015-09-25 2017-03-30 Altor Bioscience Corporation Interleukin-15 superagonist significantly enhances graft-versus-tumor activity
MX2018014602A (es) 2016-05-27 2019-06-10 Etubics Corp Composiciones de vacunas neoepitopos y metodos de uso de las mismas.
KR102463844B1 (ko) * 2016-05-27 2022-11-08 알토 바이오사이언스 코포레이션 Cd3 결합 도메인을 가지는 다량체 il-15 기반 분자의 구성 및 특성규명
US20190134195A1 (en) * 2016-06-03 2019-05-09 Etubics Corporation Compositions and methods for the treatment of human papillomavirus (hpv)-associated diseases
EP4353750A3 (en) 2016-06-24 2024-07-24 iCell Gene Therapeutics LLC Chimeric antigen receptors (cars), compositions and methods thereof
EP4021928A4 (en) * 2019-08-29 2023-09-20 NantBio, Inc. MODIFIED N-810 AND ASSOCIATED METHODS

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