CN116473938B - 一种血液肿瘤靶向外泌体递送载体及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种血液肿瘤靶向外泌体递送载体及其应用，涉及生物医药技术领域。本发明公开的外泌体递送载体其膜上表达有CD123抗体和CLL‑1抗体。该外泌体可靶向急性髓系血液肿瘤细胞，能够实现血液肿瘤细胞的靶向药物递送，同时该外泌体治疗又能降低细胞免疫治疗或者抗体相关治疗产生的副作用与免疫排斥反应。

Description

一种血液肿瘤靶向外泌体递送载体及其应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体而言，涉及一种血液肿瘤靶向外泌体递送载体及其应用。
背景技术
急性髓细胞白血病( AML )是髓系血细胞来源的肿瘤，其特征是异常细胞在骨髓和血液中迅速积累增长，严重干扰正常的血细胞生产。AML进展迅速，如果不及时治疗，患者通常在数周或数月内死亡。目前60岁以下患者五年生存率约为35 %，60岁以上患者五年生存率约为10 %。AML的一线治疗主要是化疗，分为诱导和巩固两个阶段。诱导治疗的目标是将白血病肿瘤细胞的数量减少到检测不到的水平来达到完全缓解，巩固治疗的目标是消除任何残留的无法检测的病灶从而实现治愈。随着生命科学与医学技术发展，靶向突变基因的靶向治疗、靶向细胞凋亡通路的治疗和靶向细胞表明抗原的免疫治疗为患者提供了更为精准的AML治疗方案。
发明内容
本发明的目的在于提供一种血液肿瘤靶向外泌体递送载体及其应用，以实现对急性髓细胞白血病的靶向治疗。
在恶性血液肿瘤治疗中，CD123(Interleukin 3 receptor subunit alpha)和CLL-1(C-type lectin-like molecule 1)是临床试验阶段或上市药物治疗AML的重要靶点。Elzonris是一种白介素-3(IL-3)与白喉毒素(DT)偶联形成的融合蛋白。该药物是CD123靶向的细胞毒素，用于治疗成人和2岁及以上儿童患者的母细胞性浆细胞样树突状细胞肿瘤。塔妥珠单抗(Talacotuzumab)是靶向CD123的单克隆抗体，2021年的临床试验数据表明该单抗并未改善老年AML患者的疗效。通过CLL-1单抗对AML进行治疗目前有一项临床I期的研究正在进行。IMGN632是一种CD123抗体偶联药物，目前临床前和临床I期的试验数据表明该药物对复发的AML 患者有一定的疗效。伏妥珠单抗(Flotetuzumab)是同时靶向CD3和CD123的单克隆抗体，该抗体目前在I/II期的临床试验数据表明在CD123阳性的复发AML的患者中，获得了30%的完全缓解率，展示了良好的治疗前景。针对CD123和CLL-1的CAR-T细胞也有多项临床试验在I和II期临床阶段，针对复发难治的AML患者，展现了一定的客观缓解，但该方法在CAR-T细胞进入患者体内后会产生严重的副作用，包括细胞因子释放综合征和神经毒性。由于CAR有部分非人源的单克隆抗体制备，因此还会引起免疫反应。此外，CAR-T细胞的脱靶效应会导致CAR-T细胞攻击人体内非肿瘤来源的健康细胞，不良反应的严重程度可以从B细胞再生障碍性贫血到导致死亡的极端毒性。
外泌体又称为小细胞外囊泡，是一种直径30-150nm的微囊泡，具有典型的磷脂双分子层膜结构以及低免疫原性。在自然的生理状态下，发挥着细胞间核酸、蛋白、脂类等信号分子的运输和通讯作用。由于外泌体能够携带具有抗肿瘤作用的生物分子，且外泌体自身的低免疫原性能够大大降低现有细胞及免疫治疗方案可能引发的严重副作用，并且通过对外泌体生产的细胞进行基因工程改造，赋予其优异的靶向性等特点。外泌体目前被认为是一种新兴的天然药物递送系统，有望成为新一代的肿瘤治疗技术。目前在外泌体作为药物递送系统的研究中，通过基因工程改造，赋予外泌体膜上同时表达抗CD3和抗EGFR，能够发挥类似双抗体的免疫治疗效果。或者赋予外泌体膜上表达肿瘤细胞靶向肽，能够实现特定肿瘤细胞的靶向性。
但目前仍然没有靶向急性髓系血液肿瘤细胞的基因工程化外泌体。通过可外泌体实现急性髓系血液肿瘤细胞靶向，进而实现血液肿瘤细胞靶向药物递送，同时外泌体治疗又能降低当前细胞免疫治疗或者抗体相关治疗产生的副作用与免疫排斥反应。
一方面，本发明提供一种外泌体递送载体，其包括外泌体，所述外泌体的膜上表达有第一靶向抗体和第二靶向抗体，所述第一靶向抗体特异性结合CD123抗原，所述第二靶向抗体特异性结合CLL-1抗原。
目前还没有靶向急性髓系血液肿瘤细胞的外泌体，现有的基因工程外泌体针对肿瘤细胞仅能实现单一类抗原靶向，或者同时靶向免疫细胞和单一类抗原阳性的肿瘤细胞。由于急性髓系血液肿瘤细胞的来源复杂性，需要复合型靶向的外泌体才能更加高效地实现抗肿瘤药物的递送。而非外泌体递送的抗肿瘤生物治疗中，抗体或抗体偶联毒素药物和CAR-T细胞免疫治疗造成的副作用以及免疫反应造成的不安全性可以通过外泌体药物递送系统实现极大改善。
本发明首次提供了双重靶向的急性髓系血液肿瘤细胞的基因工程化外泌体，该外泌体同时负载特异性结合CD123和CLL-1的抗体，能够靶向急性髓系血液肿瘤细胞，有利于实现抗急性髓系血液肿瘤药物的高效递送，其该外泌体递送载体在动物模型中未引起免疫毒性事件，具有良好的安全性，本发明为靶向精准治疗急性髓细胞白血病提供了更多选择的递送材料。
可选地，在一些实施方案中，所述第一靶向抗体和所述第二靶向抗体均为scFv(single chain variable fragment，单链抗体)。
需要说明的是，在其他的实施方案中，第一靶向抗体和第二靶向抗体的结构形式包括但不限于scFv，只要是能够与抗原靶点特异性结合的抗体结合片段均可，例如Fab、F(ab')2、Fc融合蛋白、二硫键稳定性抗体(disulfide-stabilized Fv fragment，dsFv)、双链特异性抗体diabody或三链特异性抗体triabody等。
可选地，在一些实施方案中，所述第一靶向抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
可选地，在一些实施方案中，所述第二靶向抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
使用上述SEQ ID NO.1所示的CD123单链抗体和SEQ ID NO.2所示的CLL-1单链抗体，相较于选用其他序列的CD123抗体和CLL-1抗体，具有更高的递送和抗肿瘤效果。
需要说明的是，在其他的实施例方式中，将SEQ ID NO.3所示和SEQ ID NO.4所示两个抗体序列的重链可变区和轻链可变区交换位置，以形成的新的单链抗体也属于本发明的保护范围。
可选地，在一些实施方案中，在所述外泌体上，所述第一靶向抗体和所述第二靶向抗体与所述外泌体的膜蛋白的胞外段融合以融合蛋白形式存在于所述外泌体的膜上。
可选地，在一些实施方案中，所述膜蛋白为CD47。
CD47为外泌体的膜蛋白种类之一，第一靶向抗体和第二靶向抗体与CD47的胞外段融合，结构更稳定，不易脱靶。
可选地，在一些实施方案中，所述融合蛋白从N端到C端依次包括：信号肽、所述第一靶向抗体、所述第二靶向抗体和所述膜蛋白。
可选地，在一些实施方案中，所述第一靶向抗体与所述第二靶向抗体之间，以及第二靶向抗体与膜蛋白之间均通过柔性连接肽连接。
可选地，在一些实施方案中，所述柔性连接肽的氨基酸序列为SEQ ID NO. 1。
可选地，在一些实施方案中，所述外泌体源自HEK293细胞。
HEK293基因工程化的细胞系能够稳定分泌表达CD123和CLL-1单链抗体的外泌体。来自基因工程化的HEK293细胞系的外泌体，均能检测到外泌体标志蛋白TSG101，CD47和CD63的表达。
另一方面，本发明提供上述的外泌体递送载体在制备用于治疗血液肿瘤的药物中的应用。
可选地，在一些实施方案中，所述血液肿瘤为急性髓细胞白血病。
另一方面，本发明提供一种用于治疗血液肿瘤的药物，其包括如上所述的外泌体递送载体以及存在于所述外泌体内的肿瘤治疗剂。
可选地，在一些实施方案中，所述血液肿瘤为急性髓细胞白血病。
可选地，在一些实施方案中，所述肿瘤治疗剂为蛋白多肽类生物大分子药物。
可选地，在一些实施方案中，所述肿瘤治疗剂包括但不限于RDR1多肽(Qi Y, DingL, Zhang S, Yao S, Ong J, Li Y, Wu H, Du P. A plant immune protein enablesbroad antitumor response by rescuing microRNA deficiency. Cell. 2022 May 26;185(11):1888-1904.e24. doi: 10.1016/j.cell.2022.04.030. PMID: 35623329.)。
当然需要说明的是，在其他实施方案中，选用其他的的多肽类生物分子作为本发明的肿瘤治疗剂也属于本发明的保护范围。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为实施例1中在外泌体膜上表达的融合蛋白结构示意图。
图2为pCMV-T7-EGFP质粒载体图谱。
图3A为慢病毒转染用的pMDLg/pRRE工具载体图谱。
图3B为慢病毒转染用的pRSV-Rev工具载体图谱。
图3C为慢病毒转染用的pEGFP-VSVG工具载体图谱)。
图4为本发明实施例制备的工程化外泌体能够检测到CD123和CLL-1单链抗体的表达。
图5为透射电子显微镜对靶向AML细胞的工程化外泌体对EGFP蛋白装载前(beforeEGFP and exosome sonication)和装载后(after EGFP and exosome sonication)的成像结果。
图6为蛋白免疫印迹实验证明靶向AML细胞的工程化外泌体通过本发明实施例实现了EGFP的有效装载。
图7为纳米颗粒追踪分析显示EGFP蛋白装载前(红色)和装载后(黑色)的靶向AML细胞的工程化外泌体主峰直径(分布图)和外泌体浓度(柱状图)均未展示出统计学意义上的生理性改变。
图8为流式细胞仪对HL-60、KG-1a和THP-1三种细胞系CD123抗原和CLL-1抗原表达情况的鉴定。实验数据证实HL-60是CD123抗原低表达的细胞系(A)，KG-1a是CLL-1抗原低表达的细胞系(B)，THP-1是CD123抗原和CLL-1抗原高表达的细胞系(A和B)。
图9为靶向AML细胞系的装载EGFP和未装载EGFP蛋白的工程化外泌体与HL-60及THP-1细胞系共孵育(图A)，KG-1a及THP-1细胞系共孵育(图B) 情况的荧光显微镜成像结果。蓝色代表DAPI染料对细胞核染色，绿色代表EGFP蛋白通过外泌体被细胞内吞至细胞质中。
图10为靶向AML细胞系的装载抗肿瘤多肽RDR1和未装载抗肿瘤多肽RDR1的工程化外泌体与HL-60及THP-1细胞系共孵育后，对两种AML肿瘤细胞凋亡情况的流式细胞图(A，Q2和Q3象限代表凋亡细胞)。HL-60细胞系在仅有空载靶向AML细胞外泌体共孵育时的凋亡率平均约33.5%，与装载抗肿瘤多肽RDR1的外泌体共孵育时的凋亡率平均约45.9%，同比上升0.37倍，THP-1细胞系在仅有空载靶向AML细胞外泌体共孵育时的凋亡率平均约11.4%，与装载抗肿瘤多肽RDR1的外泌体共孵育时的凋亡率平均约49.5%，同比上升3.34倍(B)。
图11为靶向AML细胞系的装载抗肿瘤多肽RDR1和未装载抗肿瘤多肽RDR1的工程化外泌体与KG-1a及THP-1细胞系共孵育后，对两种AML肿瘤细胞增殖情况的细胞计数图(A)。KG-1a细胞系在仅有空载靶向AML细胞外泌体共孵育时，CCK-8法检测OD450的平均值是2.76，THP-1细胞系在仅有空载靶向AML细胞外泌体共孵育时，OD450的平均值是2.79。在装载抗肿瘤多肽RDR1的外泌体共孵育时，CCK-8法检测KG-1a细胞的OD450的平均值是2.24，THP-1细胞系在RDR1装载下靶向AML细胞外泌体共孵育时，OD450的平均值在72小时是1.45(B)。
图12为人源化免疫小鼠通过尾静脉注射靶向AML细胞系的基因工程化空载外泌体不同时间期内外周血中免疫细胞(B细胞，自然杀伤细胞和单核细胞)数量和相关细胞因子(γ干扰素，α肿瘤坏死因子和白介素10)浓度统计。在注射至注射后24小时内，本发明实施例提供的工程化外泌体并未引起小鼠显著的免疫反应。
图13为四种单靶向的工程化外泌体与THP-1细胞共孵育24小时后，对细胞内488nm荧光平均强度的统计结果。其中αCD123-外泌体-1的靶向性显著高于αCD123-外泌体-2，αCLL-1-外泌体-1的靶向性显著高于αCLL-1-外泌体-2。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
制备靶向急性髓系血液肿瘤细胞的外泌体：
1 载体构建
将编码图1所示的融合蛋白片段的核酸片段连接至pCMV-T7-EGFP载体上，插入位点NotI和AgeI(见图2)，并将新的载体命名为pCMV-CD123/CLL-1-CD47。
上述融合蛋白片段包括：信号肽-linker-CD123单链抗体-linker-CLL-1单链抗体-linker-CD47膜蛋白。
融合蛋白片段全长氨基酸序列（SEQ ID NO.1）：
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNKGGGGSGGGGSGGGGS QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIF TGYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSGLRSDDPAVYYCARDMNILAT VPFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPK LLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTVNSLQPEDFATYYCQQGDSVPLTFGGGTKVEIK GGGGSGGGGSGGGGSQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSK NQFSLKLSSVTAADTAVYYCVSLVYCGGDCYSGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSAS VGDRVSFTCQASQDINNFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQ YGNLPFTFGGGTKVEIKGGGGSGGGGSGGGGSTKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTF DGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENIL IVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKT。
其中，各元件氨基酸序列如下。
信号肽的氨基酸序列：
MWPLVAALLLGSACCGSAQLLFNK（SEQ ID NO.2）。
CD123单链抗体(命名为αCD123抗体)的氨基酸序列：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYIFTGYYIHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTMTRDTSISTAYMELSGLRSDDPAVYYCARDMNILATVPFDIWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTVNSLQPEDFATYYCQQGDSVPLTFGGGTKVEIK（SEQ ID NO.3）。
CLL-1单链抗体(命名为αCLL-1抗体)的氨基酸序列：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGGSISSYYWSWIRQPPGKGLEWIGYIYYSGSTNYNPSLKSRVTISVDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCVSLVYCGGDCYSGFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQLTQSPSSLSASVGDRVSFTCQASQDINNFLNWYQQKPGKAPKLLIYDASNLETGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCQQYGNLPFTFGGGTKVEIKR（SEQ ID NO.4）。
CD47膜蛋白的氨基酸序列：
TKSVEFTFCNDTVVIPCFVTNMEAQNTTEVYVKWKFKGRDIYTFDGALNKSTVPTDFSSAKIEVSQLLKGDASLKMDKSDAVSHTGNYTCEVTELTREGETIIELKYRVVSWFSPNENILIVIFPIFAILLFWGQFGIKTLKYRSGGMDEKT（SEQ ID NO.5）。
融合片段中linker的氨基酸序列：
GGGGSGGGGSGGGGS（SEQ ID NO.6）。
2慢病毒转染HEK293细胞系
2.1 病毒包装。
本实施例使用HEK293细胞进行慢病毒包装、大肠杆菌菌株DH5α扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
将对数生长期的HEK293细胞使用胰蛋白酶 消化后重新接种于10cm细胞培养皿(每个平皿接种细胞约为2.5×106)，培养至细胞密度达60％至70％时进行转染。各质粒溶液(慢病毒包装工具载体pMDLg/pRRE 、pRSV-Rev、pEGFP-VSVG和穿梭载体pCMV-CD123/CLL-1-CD47，工具载体图谱见3)中加入CaCl2(2.5mol/L)和2×BBS缓冲盐溶液,室温放置20min后加入HEK293细胞培养液中，培养8h后弃去含有转染混和物的培养液，PBS洗涤2次，加入含10%胎牛血清培养液，继续培养48小时。
收集转染后的细胞上清液，4℃，4000g离心10 min，除去细胞碎片；以 0.45 μm滤器过滤上清液于40mL 超速离心管中，分别配平样品，25000rpm，4℃离心1.5h，收集病毒分装，进行病毒滴度测定。
2.2 病毒转染并建立膜稳定表达CD123和CLL-1单链抗体的外泌体的HEK293细胞系。
取对数生长期HEK293细胞，按5×104细胞/孔的浓度接种于24孔板中，每孔加入100μL培养基，培养至细胞融合度70％左右时进行病毒感染。
感染细胞：取出4℃保存的病毒，使用台式离心机离心20s，将pCMV-CD123/CLL-1-CD47慢病毒以5×感染复数(MOI)感染HEK293细胞，加入浓度为8μg/mL的聚凝胺提高病毒的感染效率，混匀后放于二氧化碳培养箱(37℃，5%CO2)孵育过夜。观察感染后细胞生长状态，继续培养至第6天。
收集转染稳定的HEK293细胞株，在倒置荧光显微镜观察荧光，估算慢病毒感染目的细胞的效率，收集稳定表达的pCMV-CD123/CLL-1-CD47的HEK293细胞，保存于80℃。
3.利用His标签纯化培养基中外泌体：
制备Ni-NTA层析柱(Ni-NTA 6FF 琼脂糖纯化树脂，生工生物，货号C600033-0100)，并用结合缓冲液进行层析柱平衡，并确保缓冲液覆盖树脂上方；
将步骤2.2中的细胞培养液缓慢加入层析柱中，确保CD123单链抗体偶联的His标签蛋白与Ni充分结合；
用润洗缓冲溶液分两次加入层析柱中流动，确保非特异性结合的杂质蛋白被充分去除；
用洗脱缓冲溶液加入层析柱中流动，并用EP管收集下口流出的溶液，每管收集1毫升溶液，此时表达CD123和CLL-1单链抗体的外泌体溶于该溶液内。
4.外泌体质控：
将步骤3中纯化得到的外泌体进行透射电子显微镜成像，纳米颗粒追踪分析对外泌体数量和直径进行定量，用蛋白免疫印迹对CD63，CD9，TSG101，CytochromeC，CD47，CD123和CLL-1蛋白进行检测。
结果见图4(αCD123/αCLL-1 Exosome 代表表达CD123单链抗体- CLL-1单链抗体-CD47 融合蛋白的外泌体（图1），αCLL-1/αCD123 Exosome代表表达CLL-1单链抗体-CD123单链抗体-CD47 融合蛋白的外泌体（相对于图1基础上，CD123scFv与CLL-1scFv位置交换）)。通过病毒包装以及病毒感染HEK293细胞系，基因工程化的细胞系能够稳定分泌表达CD123和CLL-1单链抗体的外泌体。在原始HEK293细胞系和基因工程化的HEK293细胞系的外泌体上，均能检测到外泌体标志蛋白TSG101，CD47和CD63的表达。由于基因工程化的细胞系能够表达带His标签蛋白的CD123和CLL-1单链抗体的基因工程化外泌体，因此只在基因工程化的HEK293细胞系外泌体中检测到His标签蛋白的表达。本实施成功制备出膜上共表达CD123和CLL-1单链抗体的外泌体即双靶向的外泌体(为方便描述，后文实施例简称为基因工程化外泌体或工程化外泌体)。
实施例2
基因工程化外泌体装载蛋白多肽：使用超声方法将蛋白多肽装载至外泌体内。将重组EGFP蛋白(增强绿色荧光蛋白，货号ab134853)与实施例1步骤3中经过质控的外泌体混合孵育。设置超声仪器(Qsonica Sonicator Q700)工作条件为500伏特，2k赫兹，振幅20%，超声4秒后停顿2秒，重复5个循环后将混合溶液放置于冰上2分钟。冷却后再次进行5个超声4秒停顿2秒的程序。
装载后外泌体质控方法：
完成蛋白装载的基因工程化外泌体再次经过实施例1步骤3进行纯化并进行步骤4的各项指标质控，质控合格的基因工程化外泌体可以实现急性髓系血液肿瘤细胞靶向，其装载的蛋白可以进入急性髓系血液肿瘤细胞。
通过投射电子显微镜成像表明，装载蛋白多肽前的基因工程化外泌体和通过超声方法装载蛋白多肽后的基因工程化外泌体具有相似的典型外泌体结构。对装载蛋白多肽后再次纯化的基因工程化外泌体与装载前的基因工程化外泌体进行外泌体标志性蛋白的免疫印迹实验表明，阳性和阴性标志性蛋白的表达量几乎不变，但装载的蛋白多肽在装载后的基因工程化外泌体内具有极高的表达量。通过纳米颗粒追踪分析对基因工程化外泌体进行数量和直径的统计证实，通过His标签蛋白纯化装载蛋白多肽的基因工程化外泌体相比超声方法装载前，总数量损失率约15%，但直径仅有8%的增长，增长后的直径主峰仍然未超过150nm。表达CD123和CLL-1单链抗体的基因工程化外泌体的质控实验证明超声方法装载蛋白多肽没有改变的其基础性质(见图5-图7)。
实施例3
验证外泌体在急性髓系血液肿瘤细胞的靶向性：选择HL-60，KG-1a和THP-1三种急性髓系白血病细胞系，通过流式细胞实验证明，CD123和CLL-1在THP-1细胞系中高表达(CD123表达率约90.9%，CLL-1表达率约71.6%)，CD123在HL-60细胞系中低表达(CD123表达率约26.4%)，CLL-1在KG-1a细胞系中低表达(CLL-1表达率约38.2%)。
随后将实施例1提供的表达CD123和CLL-1单链抗体的基因工程化外泌体(未装载EGFP外源蛋白，图9以αCD123/αCLL-1 Exosome表示)分别加入含这三种细胞系的培养基中并进行共孵育。并将上述装载EGFP蛋白的基因工程化外泌体(实施例2的工程化外泌体，图9中以) αCD123/αCLL-1 EGFP encapsulated Exosome表示)，加入含这三种细胞系的培养基中并进行共孵育。通过对这三种细胞的细胞核进行DAPI染色(蓝色)，在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白在细胞质的数量与荧光强度。绿色荧光与蓝色荧光共定位代表基因工程化外泌体实现了血液肿瘤细胞的靶向性，并且将装载的蛋白多肽释放至血液肿瘤细胞质中。从实验结果可以看到(见图8-图9)，THP-1细胞的绿色荧光积累数量和亮度最高，证明表达CD123和CLL-1单链抗体的外泌体能够THP-1细胞的高效靶向与递送，而CD123和CLL-1低表达的HL-60和KG-1a细胞中，绿色荧光的数量和强度均显著低于THP-1细胞，再次证明本发明的外泌体对特定细胞系(如CD123和CLL-1高表达的细胞系)具有靶向性。
实施例4
验证外泌体在装载抗肿瘤多肽的急性髓系血液肿瘤细胞凋亡影响：RDR1多肽具有广谱抗肿瘤的效果，其氨基酸序列如下（SEQ ID NO.7）：
MGKTIQVFGFPNGVSAEEVKKFLERLTGSGTVYAIKVRQPKKGGPRVYAIVQFTSERHTRLIITAAAERLYYGRSYLKAFEVEQDIVPKPRASLHTISGLKMFFGCQVSTKKFLTLWSAQDVCVSFGIGMRKLHFSFSWYQKDYRLELSYENIWQIDLHSPQGRSSKFLVIQVIGAPKIFEKEDQPINLLFGIMDFYSDGSDEQWIRTTDFTSSSCIGQSTAFCLELPVHLNVPDFRENFANYAEHRASSFLIESGSSYSSNANTLVPVVDPPPGFSLPFEILFKLNTLVQNACLSGPALDLDFYRLLNQKKYDRALIDHCLEKLFHLGECCYEPAHWLRDEYKKWISKGKLPLSPTISLDDGLVYMYRVQVTPARVYFSGPEVNVSNRVLRHYSKYINNFLRVSFVDEDLEKVRSMDLSPRSSTQRRTKLYDRIYSVLRDGIVIGDKKFEFLAFSSSQLRENSAWMFAPIDRITAAHIRAWMGDFDHIRNVAKYAARLGQSFSSSRETLNVRSDEIEVIPDVEIISLGTRYVFSDGIGKISAEFARKVARKCGLTEFSPSAFQIRYGGYKGVVAVDPNSSKKLSLRKSMSKFESENTKLDVLAWSKYQPCYMNRQLITLLSTLGVTDSVFEKKQREVVDRLDAILTHPLEAHEALGLMAPGENTNILKALILCGYKPDAEPFLSMMLQNFRASKLLELRTKTRIFISGGRSMMGCLDETRTLEYGQVVVQYSDPMRPGRRFIITGPVVVAKNPCLHPGDVRVLQAVNVPALNHMVDCVVFPQKGLRPHPNECSGSDLDGDIYFVCWDQELVPPRTSEPMDYTPEPTQILDHDVTIEEVEEYFANYIVNDSLGIIANAHTAFADKEPLKAFSDPCIELAKKFSTAVDFPKTGVAAVIPQHLYVKEYPDFMEKPDKPTYESKNVIGKLFREVKERAPPLISIKSFTLDVASKSYDKDMEVDGFEEYVDEAFYQKANYDFKLGNLMDYYGIKTEAEILSGGIMRMSKSFTKRRDAESIGRAVRALRKETLSLFNASEEEENESAKASAWYHVTYHSSYWGLYNEGLNRDHFLSFAWCVYDKLVRIKKTNLGRRQRQETLERLDHVLRFG。
本实施例选择将RDR1多肽装载至靶向CD123和CLL-1的基因工程化外泌体(实施例1提供)内。分别将未装载任何抗肿瘤多肽的靶向CD123和CLL-1的基因工程化外泌体与HL-60(CD123抗原低表达的细胞系)和THP-1(CD123和CLL-1抗原同时高表达的细胞系)急性髓系血液肿瘤细胞进行共培养并用流式细胞仪检测装载RDR1多肽前后的细胞凋亡情况。
从实验结果可以看到(见图10，以αCD123/αCLL-1 empty Exosome表示未装载RDR1多肽的靶向CD123和CLL-1的基因工程化外泌体，以αCD123/αCLL-1 encapsulated Exosome表示装载了RDR1多肽的靶向CD123和CLL-1的基因工程化外泌体)，HL-60细胞系的基础凋亡率约33.5%，在与装载了RDR1多肽的基因工程化外泌体共孵育后，凋亡率提升至45.9%，二者相比并不显著。THP-1细胞的基础凋亡率约11.4%，在与装载了RDR1多肽的基因工程化外泌体共孵育后，凋亡率提升至49.5%，二者相比极其显著(p值＜0.001)。说明本发明实施例1提供的靶向CD123和CLL-1的基因工程化外泌体在实现肿瘤细胞靶向的同时，若装载具有抗肿瘤活性的多肽能够发挥促进肿瘤细胞凋亡功能。
实施例5
验证外泌体在装载抗肿瘤多肽后对急性髓系血液肿瘤细胞增殖的影响：将RDR1多肽装载至靶向CD123和CLL-1的基因工程化外泌体(实施例1提供)内。分别将未装载任何抗肿瘤多肽的基因工程化外泌体与装载了RDR1多肽的基因工程化外泌体与KG-1a(CLL-1抗原低表达的细胞系)和THP-1(CD123和CLL-1抗原同时高表达的细胞系)急性髓系血液肿瘤细胞进行共孵育，并在0小时和72小时分别对肿瘤细胞增殖情况进行计数统计。
从实验结果可以看到(见图11)，KG-1a和THP-1细胞系在0h与工程化外泌体孵育时，起始细胞总量基本一致。在72小时后，由于KG-1a是CLL-1抗原低表达细胞系，靶向递送至该细胞系的外泌体总量少，因此RDR1多肽对肿瘤细胞增殖的影响较低(图A)。而THP-1是CLL-1抗原高表达细胞系，实施例1提供的靶向CD123和CLL-1的基因工程化外泌体可以高效实现该细胞系的靶向，因此通过该基因工程化外泌体递送至THP-1细胞系的RDR1抗肿瘤多肽能够发挥功能，显著抑制了肿瘤细胞的增殖(图A)。通过CCK-8法对工程化外泌体孵育时间不同的KG-1a和THP-1细胞的增殖情况检测也证实(见图B)，仅有靶向AML细胞的工程化外泌体空载不能实现KG-1a或THP-1细胞的增殖抑制，OD450平均数值均高于2.7。装载了RDR1抗肿瘤多肽的工程化外泌体对KG-1a细胞的增殖抑制效果有限，OD450平均数值在72小时约2.24。在本发明实施例的基因工程化外泌体对THP-1细胞能够实现有效靶向的前提下，该基因工程化外泌体递送的RDR1抗肿瘤能够在72小时内显著抑制THP-1细胞的增殖，OD450平均数值在72小时约1.45(p值＜0.01)。说明本发明提供的基因工程化外泌体在实现肿瘤细胞靶向的同时，装载具有抗肿瘤活性的多肽能够发挥肿瘤细胞增殖抑制的功能。
实施例6
验证外泌体在小鼠动物模型中的免疫毒性：选择PBMC-NPG的人源化免疫系统小鼠，以1011个未装载外源蛋白的靶向AML细胞系的工程化外泌体/小鼠的剂量进行尾静脉注射。在外泌体注射前对PBMC-NPG小鼠进行采血，在注射后4小时，24小时收集小鼠的血浆与外周血单个核细胞(PBMC)。并检测PBMC中NK细胞、单核细胞和B细胞的数量以及血浆中IFN-γ，TNF-α，IL-10浓度。其中NK细胞、单核细胞和B细胞计数使用CountBright™ 绝对计数微珠 (ThermoFisher，货号C36950)，以及LSR II 流式细胞仪(BD Biosciences) 以及软件FACSDiva，计数分析使用软件Flowjo version 10。IFN-γ用IFN gamma Human ELISA Kit,High Sensitivity (ThermoFisher，货号BMS228HS)，TNF-α用TNF alpha Human ELISAKit, High Sensitivity (ThermoFisher，货号BMS223HS)，IL-10用IL-10 Human ELISAKit, High Sensitivity(ThermoFisher，货号BMS215HS)按照试剂盒使用说明书操作，每只小鼠使用50微升血浆，并用酶标仪(Biotek品牌的Synergy™ 4 多功能酶标仪)对上述三个细胞因子进行定量检测。
从实验结果可以看出(见图12)，本发明实施例制备的基因工程化外泌体在免疫系统人源化的小鼠体内，并未引起明显的免疫毒性，在基因工程化外泌体进行静脉注射前以及注射后当即，4小时和24小时内，小鼠体内的免疫细胞数量以及证实出现免疫毒性的IFN-γ，TNF-α和IL-10的浓度均未有明显提升。
实施例7
比较不同人源CD123单链抗体和CLL-1单链抗体的工程化外泌体的AML靶向效率：(1)参照实施例1的方法，更换单链抗体序列，采用本实施例提供的第二单链抗体序列，构建单靶向CD123的工程化外泌体(αCD123-外泌体-2)，和单靶向CLL-1的工程化外泌体(αCLL-1-外泌体-2)；
第二CD123单链抗体，氨基酸序列如下：
QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTGYYMHWVRQAPGQGLEWMGWINPNSGGTNYAQKFQGRVTLTRDTSISTVYMELSRLRSDDTAVYYCARDMNILATVPFDIWGQGTMVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTVNSLQPEDFATYYCQQGDSVPLTFGGGTRLEIK（SEQ ID NO.8）：
第二CLL-1单链抗体，氨基酸序列如下：
QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCVVSGGSISSSNWWSWVRQPPGKGLEWIGEIYHSGSPDYNPSLKSRVTISVDKSRNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAKVSTGGFFDYWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSEIELTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISSYLNWYQQKPGKAPKLLIYAASSLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQSYSTPPTFGPGTKVEIKR（SEQ ID NO.9）。
(2)采用实施例1的CD123单链抗体（即第一CD123单链抗体）或CLL-1单链抗体（即第一CLL-1单链抗体），参照实施例1的方法，构建单靶向CD123的工程化外泌体(αCD123-外泌体-1)，和单靶向CLL-1的工程化外泌体(αCLL-1-外泌体-1)；
(3)将步骤(1)和(2)的四种单靶向外泌体按照实施例2的方法装载EGFP，与 THP-1细胞共孵育检测靶向效率。
结果见图13，可以看出，不同的单链抗体序列具有不同的靶向效率，αCD123-外泌体-1和αCLL-1-外泌体-1检测到更多的EGFP荧光单位，靶向效率明显更高。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种外泌体递送载体，其特征在于，其包括外泌体，所述外泌体的膜上表达有第一靶向抗体和第二靶向抗体，所述第一靶向抗体特异性结合CD123抗原，所述第二靶向抗体特异性结合CLL-1抗原；所述第一靶向抗体和所述第二靶向抗体均为scFv；所述第一靶向抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；所述第二靶向抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示；在所述外泌体上，所述第一靶向抗体和所述第二靶向抗体与所述外泌体的膜蛋白的胞外段融合以融合蛋白形式存在于所述外泌体的膜上；
所述膜蛋白为CD47；所述融合蛋白从N端到C端依次包括：信号肽、所述第一靶向抗体、所述第二靶向抗体和所述膜蛋白；所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述外泌体源自HEK293细胞。
2.权利要求1所述的外泌体递送载体在制备用于治疗血液肿瘤的药物中的应用，所述血液肿瘤为急性髓细胞白血病。
3.一种用于治疗血液肿瘤的药物，其特征在于，其包括权利要求1所述的外泌体递送载体以及存在于所述外泌体内的肿瘤治疗剂；所述血液肿瘤为急性髓细胞白血病。
4.根据权利要求3所述的药物，其特征在于，所述肿瘤治疗剂为蛋白多肽类生物大分子药物。
5.根据权利要求4所述的药物，其特征在于，所述肿瘤治疗剂为RDR1多肽。
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