CN109689097A

CN109689097A - 包含具有fc结合能力的融合蛋白的细胞外囊泡

Info

Publication number: CN109689097A
Application number: CN201780045139.XA
Authority: CN
Inventors: O.维克兰德; A.格根斯; D.古普塔
Original assignee: Medical Fox Therapy Co Ltd
Current assignee: Medical Fox Therapy Co Ltd
Priority date: 2016-07-21
Filing date: 2017-07-21
Publication date: 2019-04-26
Anticipated expiration: 2037-07-21
Also published as: EP4299137A3; JP2023026440A; JP7254016B2; EP3487529A1; BR112019001099A2; SG11201811151PA; CA3031183A1; US11236143B2; US20220098267A1; KR20190032480A; WO2018015535A1; SG10202100598RA; SG11201811152YA; EP3487528A1; GB2552473A; WO2018015539A1; SG10202100597TA; GB201612643D0; EP3487528B1; JP7140743B2

Abstract

本发明涉及细胞外囊泡(EV)治疗剂，其中所述EV包被有含有Fc结构域的蛋白质(如抗体)以用于i.a.靶向和治疗应用。所述EV的包被是经由对EV多肽进行本发明的蛋白质工程化而实现的。本发明因此涉及用于包被EV的方法、EV本身、以及这样的包被有含有Fc的蛋白质的EV的药物组合物和医学应用。

Description

包含具有FC结合能力的融合蛋白的细胞外囊泡

技术领域

本发明涉及细胞外囊泡(EV)治疗剂，其中所述EV包被有包含Fc结构域的蛋白质(如抗体)以用于i.a.靶向和治疗应用。

背景技术

蛋白质生物制剂常规用于治疗和/或预防广泛的疾病，包括癌症、遗传性病症以及自身免疫性疾病。当中可以发现当今许多轰动一时的药物的抗体和嵌合受体通常是以裸形式，即不使用任何递送载体来施用的。细胞外囊泡(EV)是由EV产生细胞释放到细胞外环境中的纳米级囊泡。EV，特别是外泌体已经被证实为能够将蛋白质生物制剂，如抗体和诱饵受体转运到靶细胞中，从而使得能够实现一种全新形式的先进生物治疗剂，其利用EV的特性与重组蛋白的特异性的组合。

使用EV来递送蛋白质治疗剂与生物制剂的常规直接施用相比提供了许多优势。举例来说，当使用EV递送生物治疗剂时，它们受到保护而免于降解并且更稳定；EV构成了多价药物递送模式，其可以引起功效增强；EV可以改进蛋白质生物制剂的药物代谢动力学和药效动力学；EV可以靶向所关注的组织和细胞；EV可以具有反映它们的细胞起源的固有治疗作用；并且EV还使得能够穿透血脑屏障并且提高CNS递送。

尽管具有它们所有的优势，但是将大而复杂的蛋白质生物制剂负载到EV中以随后向靶细胞递送尚未被证实是十分简单的。WO2013/084000和WO2014/168548这两者都描述了成功地将基于蛋白质的生物制剂(如抗体和诱饵受体)负载到EV中和EV上。WO2013/084000公开了所谓的将例如抗体内源性和外源性负载到诸如外泌体的EV中。外源性负载指的是经由在EV从培养物中的EV产生细胞中分离之后将蛋白质运载分子直接引入所述EV中来对EV进行负载。蛋白质的外源性引入可以如WO2013/084000中那样，在从亲本细胞中分离后，使用例如所关注的多肽的电穿孔或转染来进行。另一方面，内源性负载涉及如例如由WO2014/168548所教导，用编码所关注的治疗性蛋白质的多核苷酸构建体对EV产生细胞进行转染。WO2015/058148教导了所关注的蛋白质的内源性负载的实例，即用编码诸如CD64、CD32以及CD16的Fc受体的构建体对NK细胞进行遗传工程化。然而，对例如NK细胞进行遗传修饰以表达Fc受体并不是负载所关注的蛋白质的特别有效的方式，这是因为它将仅产生每个EV低数量的Fc受体。因此，由WO2015/058148所教导的方法完全没有解决与将EV用多种大而复杂的蛋白质生物制剂有效负载，特别是以可控的、可预测的、可按比例缩放的、以及有成本效益的方式有效负载相关的挑战。

发明内容

因此，本发明的目的在于克服与将EV用蛋白质生物制剂负载，特别是负载抗体和包含Fc结构域的其它蛋白质以用于后续治疗应用相关的上述问题。此外，本发明旨在满足本领域内的其它现有需求，例如使得能够将EV用大量多种治疗性抗体、靶向抗体、或抗清除抗体和包含Fc结构域的其它蛋白质(天然包含或由于蛋白质工程化而包含)进行高亲和力和高密度包被，以显著增强EV用于治疗性蛋白质递送的治疗潜力。

本发明通过利用融合构建体实现了这些目的和其它目的，所述融合构建体包含与人类来源和/或非人类来源的Fc结合多肽(在本文常常被称为Fc结合剂)融合的外泌体蛋白。使用外泌体蛋白作为用于负载EV的模式使得能够在EV的表面上展示大量的Fc结合剂，这对于能够将EV用包含Fc结构域的蛋白质(在本文常常被称为含有Fc的蛋白质)致密包被是重要的，所述包含Fc结构域的蛋白质经由所述Fc结合剂与所述包含Fc结构域的蛋白质之间的相互作用与EV结合(在有利的实施方案中，这样的含有Fc的蛋白质可以是抗体)。可以融合到天然缺乏Fc结构域的蛋白质上的人类来源和/或哺乳动物来源的Fc结构域可以选自替代物的以下非限制性清单：人类IGHM(作为非限制性实例，登录号：P01871)、人类IGHA1(作为非限制性实例，登录号：P01876)、人类IGHA2(作为非限制性实例，登录号：P01877)、人类IGKC(作为非限制性实例，登录号：P01834)、人类IGHG1(作为非限制性实例，登录号：P01857)、人类IGHG2(作为非限制性实例，登录号：P01859)、人类IGHG3(作为非限制性实例，登录号：P01860)、人类IGHG4(作为非限制性实例，登录号：P01861)、人类IGHD(作为非限制性实例，登录号：P01880)、人类IGHE(作为非限制性实例，登录号：P01854)、以及其任何结构域、衍生物、或组合。使用非人类Fc结合多肽，如蛋白A/G以及所谓的Z结构域和二聚体ZZ结构域可以使得所述Fc结合剂与它的一个或多个相互作用配偶体，即含有Fc的蛋白质的Fc结构域之间的结合亲和力更高。此外，非人类Fc结合剂的尺寸常常小于人类Fc结合蛋白。另一方面，人类来源和/或哺乳动物来源的Fc结合蛋白和多肽结构域，如人类FCGRI(CD64)(作为非限制性实例，SEQ ID NO 31)、FCGR2A(CD32A)(作为非限制性实例，登录号：P12318)、FCGR2B(CD32B)(作为非限制性实例，登录号：P31994)、FCGR2C(CD32C)(作为非限制性实例，登录号：P31995)、FCGR3A(CD16A)(作为非限制性实例，登录号：P0837)、FCGR3B(CD16B)(作为非限制性实例，登录号：O75015)、FCAMR(作为非限制性实例，SEQ ID NO 28)、FCERA(作为非限制性实例，SEQ ID NO 30)、FCAR(作为非限制性实例，SEQ ID NO 29)、或小鼠FCGRI(作为非限制性实例，SEQ ID NO 79)、FCGRIIB(作为非限制性实例，SEQ ID NO 80)、FCGRIII(作为非限制性实例，SEQ ID NO 81)、FCGRIV(作为非限制性实例，SEQ ID NO 82)、FCGRn(作为非限制性实例，SEQ ID NO 83)可以提供优势，这是因为它们是哺乳动物蛋白质并且因而可以具有更小的免疫刺激性。无论如何，关键的是，对EV进行工程化以确保它们包含Fc结合多肽的融合构建体，而不仅仅是结合Fc结构域的过表达的蛋白质，以确保在EV上展示足够数量的Fc结合多肽并且使得能够进行可控的生产。

此外，本发明的Fc结合多肽可以被工程化以小于天然表达的Fc结合蛋白，这使得更容易借助于与EV蛋白的融合构建体将它们引导到EV表面。此外，非人类Fc结合剂(其可以是例如细菌来源的)与人类Fc结合剂之间的一个显著差异是以下事实，即这样的非人类Fc结合剂在某些情况下可以同时结合多于一个Fc结构域，这可以引起包含Fc结构域的所关注的蛋白质对EV的表面包被增加。举例来说，蛋白A/G是源自于金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的蛋白A与源自于停乳链球菌(Streptococcus dysgalactiae)的蛋白A之间的融合蛋白，其具有用于IgG抗体的Fc结构域的七个结合区。这种多价性可以使得多个包含Fc结构域的蛋白质，如抗体与每一个Fc结合剂(在这种情况下，是蛋白A/G)结合，从而使得EV能够被含有Fc结构域的蛋白质，如抗体更致密地包被。重要的是，将EV用Fc结合剂更致密地包被还可以例如使得例如抗体与它们的相应抗原之间的亲合力能够更高，这意味着将增强与所关注的靶标的结合，这从靶向和/或治疗角度来看，可能是有益的。

在一个方面，本发明涉及包含融合蛋白的EV，其中所述融合蛋白包含与外泌体多肽融合的至少一种基于多肽的Fc结合剂。由于与EV蛋白融合，因此所述Fc结合剂以高数量有效地展示在EV的表面上，从而使得能够将EV用含有Fc结构域的蛋白质，如抗体致密包被。将EV用抗体和包含Fc结构域的其它蛋白质(天然包含或由于分子生物学工程化而包含)包被出于以下几个原因是有利的：(1)靶向特定细胞类型、组织和/或器官的抗体或其它蛋白质代表了重新引导基于EV的治疗剂的分布和优化基于EV的治疗剂的递送的非常有用的方法；(2)与所关注的靶抗原相互作用的治疗性抗体或其它含有Fc结构域的蛋白质可以使用EV有效地递送到所关注的组织(例如递送到CNS或脑)；(3)在EV的表面上多重化的抗体或其它含有Fc结构域的蛋白质在结合靶标，如靶抗原方面可能显著更好；(4)EV是用于递送抗体-药物缀合物(ADC)或受体-药物缀合物的有利模式，这是因为ADC的多重化可以显著增强它们的治疗功效并且它们在EV上的存在意味着它们也可以进入靶细胞中；(5)包含Fc结合剂的EV促进含有Fc结构域的蛋白质的细胞内化，所述蛋白质诸如抗体、ADC或包含Fc结构域的基本上任何蛋白质(天然包含或由于工程化而包含)；以及(6)将EV用抗体或含有Fc结构域的蛋白质包被可以减少EV的调理作用和/或免疫介导的清除，这可能进而对它们的治疗活性是重要的。

在另一个方面，本发明涉及根据本发明的融合蛋白与含有Fc结构域的蛋白质(如抗体和可以与Fc结构域融合的几乎任何生物药物，例如细胞内活性酶，如NPC1或核酸酶Cas9)之间的复合物。如上所述，所述融合蛋白包含与外泌体多肽融合的Fc结合多肽，并且所述Fc结合剂与所述复合物中的所述含有Fc结构域的蛋白质的Fc结构域结合，所述含有Fc结构域的蛋白质可以是所关注的任何蛋白质，例如抗体或包含Fc结构域的任何其它蛋白质(天然包含或由于所考虑的蛋白质的工程化而包含)。由于EV蛋白质的EV运输能力，因此融合蛋白与含有Fc结构域的蛋白质之间的这样的非共价复合物通常存在，例如锚定在EV的膜中，从而使得EV被多个含有Fc结构域的蛋白质包被，所述含有Fc结构域的蛋白质能够发挥它们的生物作用。所述复合物可以另外地或可选地存在于EV内部。

在另一个方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的EV和/或非共价复合物，如纳米颗粒复合物(即在内部、在外部和/或在EV膜中被多个至少一种类型的含有Fc的蛋白质修饰的EV)和药学上可接受的载体。在另外的方面，本发明因此还涉及EV、EV-蛋白质复合物、和/或包含这样的EV和EV-蛋白质复合物的药物组合物，其用于医学中，优选地用于治疗将受益于基于抗体或含有Fc结构域的蛋白质的治疗、基于ADC的治疗、和/或抗体介导的靶向的疾病。

在另外的方面，本发明涉及用于产生能够与包含Fc结构域的蛋白质结合的EV的方法。这样的方法可以包括以下步骤：(i)向EV来源细胞中引入编码融合蛋白的多核苷酸构建体，所述融合蛋白包含至少一种Fc结合多肽和至少一种外泌体多肽；以及(ii)收获由所述EV来源细胞分泌的EV，所述EV包含所述所关注的融合蛋白。此外，本发明涉及用于将EV用包含Fc结构域的至少一种蛋白质包被的方法，所述方法包括以下步骤：(i)提供包含融合蛋白的EV，所述融合蛋白包含至少一种Fc结合剂和至少一种外泌体多肽；以及(ii)使所述融合蛋白的Fc结合剂结合包含Fc结构域的至少一种蛋白质的Fc结构域。

最终，本发明还涉及包含至少一种Fc结合剂和至少一种外泌体多肽的融合蛋白、以及编码这样的融合蛋白的多核苷酸构建体、以及包含这样的构建体的载体、EV和细胞。

附图说明

图1：包含融合蛋白的EV的示意图，所述融合蛋白包含与Fc结合多肽(即Fc结合结构域)融合的外泌体蛋白。所述Fc结合剂能够结合例如抗体和/或包含Fc结构域的任何其它蛋白质，从而将EV转变成蛋白质治疗剂的多价递送载体。

图2：EV的电子显微镜照片，包含Fc结合多肽的EV(A)被纳米金标记的抗体(即含有Fc的蛋白质)修饰，而缺乏Fc结合多肽的对照EV(B)没有与它们的表面结合的任何抗体。

图3：流式细胞术数据，所述流式细胞术数据显示包含Fc结合多肽的EV结合所关注的含有Fc的蛋白质(人类IgG)。所述结合对于试剂盒中所包括的所有珠粒群体都是非常有效的，包括非特异性/同种型/阴性对照珠粒群体。

图4：抗HER2抗体仅在高表达HER2的细胞系MDA-MB-361中与同种型对照修饰的EV和野生型EV相比增加抗体修饰的EV的摄取，而在低表达HER2的细胞系MDA-MB-231中不是这样。

图5：与野生型EV或对照修饰的EV相反，依那西普(etanercept)包被的EV保护小鼠防止体重减轻，并且显示出比裸依那西普更高的活性，这可能是因为当依那西普被多重化时和/或当Fc结合多肽与它的Fc结构域结合时依那西普与TNFα之间的亲和力更高。

图6：在经过Fc结合EV处理的细胞中明显存在荧光标记的抗体的信号，所述Fc结合EV已经与它们的包含Fc结构域的表面抗体连接，而在未处理的细胞(1)或对照EV处理的细胞(2)中不存在荧光信号，这是通过荧光显微镜术(A)和流式细胞术(B)测量的。这表明诸如抗体的含有Fc的蛋白质可以通过Fc结合EV细胞内递送，并且与EV结合显著增加细胞对抗体的摄取。

图7：当通过Fc结合EV(即包含与至少一种外泌体多肽融合的至少一种Fc结合多肽的EV)将抗NFkB抗体递送到细胞中时成功抑制NFkB介导的细胞内信号。

图8：对照EV以及用抗整合素-4a抗体进行单次处理在小鼠中显示出防止EAE发展的中度保护作用，而包被有相同的抗整合素-4a抗体的zz结构域EV几乎完全消除体内EAE的发展。

图9：用于靶向基因组编辑的CRISPR-Cas9向导RNA复合物的细胞内递送，图表显示在经由Fc结合结构域-Lamp2b工程EV递送Fc Cas9向导RNA复合物之后的靶向基因组切割。

图10：与Fc结构域融合并且与包含Fc结合多肽的HEK衍生的EV结合的溶酶体贮积症酶GBA的细胞内递送。

图11：在用与Lamp2b-ZZ结构域EV的表面连接的负载siRNA的Ago2对U2OS细胞进行处理之后的细胞周期蛋白D水平，引起显著的靶标沉默。

具体实施方式

本发明涉及关于包含融合蛋白的EV的各个方面和实施方案，所述融合蛋白包含与外泌体多肽融合的至少一种Fc结合剂，以使得能够将EV用抗体和其它含有Fc结构域的蛋白质致密包被，所述抗体和其它含有Fc结构域的蛋白质可以被所述Fc结合剂多价螯合并且用于治疗各种疾病和病症的治疗应用。

为了方便和清楚起见，在下文收集和描述了本文使用的某些术语。除非另外定义，否则本文所用的所有技术和科学术语的含义与本发明所属领域的普通技术人员通常所了解的含义相同。

在本发明的特征、方面、实施方案、或替代方案是用马库什组(Markush group)来描述的情况下，本领域技术人员将认识到的是，本发明也因此用马库什组的任何单个成员或成员的子组来描述。本领域技术人员将进一步认识到的是，本发明也因此用马库什组的单个成员或成员的子组的任何组合来描述。此外，应当指出的是，关于本发明的方面和/或实施方案中的一个所述的实施方案和特征在加以必要的变更的情况下也适用于本发明的所有其它方面和/或实施方案。举例来说，在本文关于包含含有Fc结合多肽的融合蛋白的EV所述的这样的Fc结合多肽应当被理解成公开了本文的所有其它方面、教导以及实施方案，与其相关，并且与其相容，例如涉及用于产生或包被EV的方法或涉及本文所述的多核苷酸和多肽构建体的方面和/或实施方案。此外，关于某些方面所述的某些实施方案，例如，如关于涉及治疗某些医学适应症的方面所述的包含含有Fc结合多肽和外泌体多肽的融合蛋白的EV的施用途径当然也可以与其它方面和/或实施方案相关，如涉及本发明的药物组合物和/或Fc结合多肽-含有Fc的蛋白质复合物的那些。此外，本文所鉴定的所有多肽和蛋白质都可以使用用于将多肽融合的常规策略自由地组合成融合蛋白。作为非限制性实例，本文所述的所有Fc结合多肽都可以与一种或多种外泌体多肽自由地组合成任何组合。此外，Fc结合多肽可以彼此组合以产生包含多于一种Fc结合多肽的构建体。此外，任何和所有特征(例如马库什组的任何和所有成员)都可以与任何和所有其它特征(例如任何其它马库什组的任何和所有成员)自由组合，例如任何Fc结合蛋白可以与任何含有Fc的蛋白质，如任何抗体组合，或任何外泌体多肽可以与任何Fc结合多肽组合。此外，当本文的教导涉及呈单个形式的EV(和/或EV锚定的融合蛋白-含有Fc的蛋白质复合物)和/或作为离散的天然纳米颗粒样囊泡的EV时，应当了解的是，所有这样的教导都同样关于和适用于多个EV和EV群体以及包被有含有Fc的蛋白质的EV。作为一般说明，根据本发明的Fc结合多肽、含有Fc的蛋白质(如抗体)、EV产生细胞来源、外泌体蛋白、以及所有其它方面、实施方案、和替代方案可以在不背离本发明的范围和精神的情况下自由组合成任何和所有可能的组合。此外，本发明的任何多肽或多核苷酸或任何多肽序列或多核苷酸序列(分别是氨基酸序列或核苷酸序列)可以与原始多肽、多核苷酸以及序列显著不同，只要任何给定分子保留实现与其相关的所期望的技术效果的能力即可。只要维持它们的生物学特性，根据本申请的多肽序列和/或多核苷酸序列就可以与天然序列相比相差多达50％(使用例如BLAST或ClustalW计算)，尽管尽可能高的序列同一性是优选的(例如60％、70％、80％、或例如90％或更高)。例如至少一种Fc结合多肽和至少一种外泌体蛋白的组合(融合)意味着对应多肽的某些片段可以被置换和/或修饰和/或所述序列可以因其它氨基酸段的插入而中断，这意味着与天然序列的差异可能是相当大的，只要保留关键特性(例如Fc结合特性、运输到外泌体的表面、治疗活性等)即可。类似的推理因此当然适用于编码这些多肽的多核苷酸序列。本文关于肽、多肽以及蛋白质提到的所有登录号和SEQ ID NO仅应当被看作是实例并且仅供参考，并且所有肽、多肽以及蛋白质都应当被给予它们的如本领域技术人员将对它们所了解的普通含义。因此，如上所述，本领域技术人员还将了解的是，本发明不仅包括本文提到的具体SEQ ID NO和/或登录号，而且还包括其变体和衍生物。本文提到的所有登录号都是根据2017年6月22日版本的数据库的UniProtKB登录号，并且本文提到的所有蛋白质、多肽、肽、核苷酸以及多核苷酸都应当根据它们的如本领域技术人员所了解的常规含义来解释。

术语″细胞外囊泡″或″EV″或″外泌体″在本文可互换使用并且应当被理解成涉及可以任何形式从细胞中获得的任何类型的囊泡，例如微囊泡(例如从细胞的质膜脱落的任何囊泡)、外泌体(例如源自于内溶酶体途径的任何囊泡)、凋亡小体(例如可从凋亡细胞中获得)、微粒(其可能源自于例如血小板)、核外粒体(可源自于例如血清中的中性粒细胞和单核白细胞)、前列腺体(prostatosome)(例如可从前列腺癌细胞中获得)、或心脏体(cardiosome)(例如可源自于心脏细胞)等。EV的尺寸可以显著变化，但是EV通常具有纳米级流体动力学半径，即小于1000nm的半径。显然，EV可以在体内、离体、以及体外源自于任何细胞类型。此外，所述术语还应当被理解为涉及细胞外囊泡模拟物、经由例如膜挤出、超声处理、或其它技术等获得的基于细胞膜的囊泡。对于本领域技术人员来说将清楚的是，当描述EV的医学和科学用途和应用时，本发明通常涉及多个EV，即EV的群体，其可能包含数千个、数百万个、数十亿个或甚至数万亿个EV。如可以从以下实验部分中看到的是，EV可以诸如每单位体积(例如每毫升)10⁵个、10⁸个、10¹⁰个、10¹¹个、10¹²个、10¹³个、10¹⁴个、10¹⁵个、10¹⁸个、10²⁵个、10³⁰个EV(常常被称作″颗粒″)、或更大、更小或介于两者之间的任何其它数量的浓度存在。同样，术语″群体″应当被理解成包括构成这样的群体的多个实体，所述术语″群体″可以例如涉及包含外泌体多肽与Fc结合多肽之间的某种融合蛋白的EV，所述Fc结合多肽进而可以与所关注的含有Fc的蛋白质结合。换句话说，当以多个存在时，单个EV构成EV群体。因此，当然，本发明涉及单个EV和包含EV的群体这两者，如对于本领域技术人员来说将清楚的那样。当体内施用时EV的剂量当然可以根据待治疗的疾病、施用途径、所关注的含有Fc的蛋白质、EV上存在的任何靶向部分、药物制剂等而显著变化。此外，除了可以与EV表面结合的含有Fc的蛋白质之外，本发明的EV还可以包含另外的治疗剂。在一些实施方案中，所述另外的治疗剂可以是至少一种治疗性小分子药物。在一些实施方案中，所述治疗性小分子药物可以选自由以下各项组成的组：DNA损伤剂、抑制DNA合成的药剂、微管和微管蛋白结合剂、抗代谢物、氧化损伤诱导剂、抗血管生成剂、内分泌治疗、抗雌激素剂、免疫调节剂，如Toll样受体激动剂或拮抗剂；组蛋白脱乙酰酶抑制剂；信号转导抑制剂，如激酶抑制剂；热休克蛋白抑制剂、类视色素、生长因子受体抑制剂、抗有丝分裂化合物、抗炎剂、细胞周期调节剂、转录因子抑制剂、和细胞凋亡诱导剂、以及其任何组合。在另外的实施方案中，所述另外的治疗剂可以是基于治疗性核酸的药剂。这样的基于核酸的治疗剂可以选自包括以下各项的组：单链RNA或DNA、双链RNA或DNA、寡核苷酸，如siRNA；剪接转换RNA、CRISPR向导链、短发夹RNA(shRNA)、微小RNA、反义寡核苷酸、多核苷酸，如mRNA；质粒、或任何其它RNA或DNA载体。特别令人关注的是基于核酸的药剂，其是化学合成的和/或包含化学修饰的核苷酸，如2′-O-Me、2′-O-烯丙基、2′-O-MOE、2′-F、2′-CE、2′-EA 2′-FANA、LNA、CLNA、ENA、PNA、硫代磷酸酯、三环DNA等。在又另外的实施方案中，根据本发明的EV可以包含另外的治疗剂，所述另外的治疗剂可以是蛋白质和/或肽。这样的蛋白质和/或肽可以存在于EV内部、插入EV膜中或与EV膜缔合，或可以从EV突出到囊泡外环境中。这样的治疗性蛋白质和/或肽药剂可以选自包括以下各项的非限制性实例的组：抗体、胞内抗体、单链可变片段(scFv)、亲和体、双特异性和多特异性抗体或结合剂、亲和体、设计的锚蛋白重复蛋白(darpin)、受体、配体、用于例如酶替代治疗或基因编辑的酶、肿瘤抑制因子、病毒或细菌抑制剂、细胞组分蛋白、DNA和/或RNA结合蛋白、DNA修复抑制剂、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、细胞凋亡抑制剂和诱导剂、毒素(例如假单胞菌外毒素)、结构蛋白、神经营养因子，如NT3/4、脑源性神经营养因子(BDNF)以及神经生长因子(NGF)和它的单个亚基，如2.5Sβ亚基；离子通道、膜转运蛋白、蛋白内稳态因子、参与细胞信号传导的蛋白质、翻译和转录相关蛋白、核苷酸结合蛋白、蛋白质结合蛋白、脂质结合蛋白、糖胺聚糖(GAG)和GAG结合蛋白、代谢蛋白、细胞应激调节蛋白、炎症和免疫系统调节蛋白、线粒体蛋白、以及热休克蛋白等。在一个优选的实施方案中，所述治疗剂可以是具有完整核酸酶活性的CRISPR相关(Cas)多肽(如Cas9(作为非限制性实例，登录号：Q99ZW2))，其与RNA链缔合(即携带它)，所述RNA链使得所述Cas多肽一旦由EV递送就能够在靶细胞中实现它的核酸酶活性。或者，在另一个优选的实施方案中，Cas多肽可以是无催化活性的，以使得能够进行靶向遗传工程化。又另一个替代方案可以是任何其它类型的CRISPR效应物，如单RNA引导的核酸内切酶Cpfl(来自诸如氨基酸球菌属(Acidaminococcus)或毛螺旋菌科(Lachnospiraceae)的物种)(作为非限制性实例，登录号：U2UMQ6和A0Q7Q2)。另外的优选的实施方案包括选自包括以下各项的组的治疗性蛋白质：用于溶酶体贮积症的酶，例如葡萄糖脑苷脂酶，如伊米苷酶、α-半乳糖苷酶、α-L-艾杜糖苷酸酶、艾杜糖醛酸-2-硫酸酯酶和艾杜硫酶(idursulfase)、芳基硫酸酯酶、加硫酶(galsulfase)、酸性α葡萄糖苷酶、鞘磷脂酶、半乳糖脑苷脂酶、半乳糖神经酰胺酶、葡萄糖神经酰胺酶(作为非限制性实例，登录号：P04062)、神经酰胺酶、α-N-乙酰氨基半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、溶酶体酸性脂肪酶、酸性鞘磷脂酶、NPC1(作为非限制性实例，登录号：O15118)、NPC2(作为非限制性实例，登录号：P61916)、乙酰肝素磺酰胺酶、N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、乙酰肝素-α-氨基葡糖苷-N-乙酰转移酶、N-乙酰葡糖胺6-硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、半乳糖-6-硫酸硫酸酯酶、透明质酸酶、α-N-乙酰神经氨酸酶、GlcNAc磷酸转移酶、粘脂蛋白1、棕榈酰蛋白硫酯酶、三肽基肽酶I、棕榈酰蛋白硫酯酶1、三肽基肽酶1、battenin(CLN3编码蛋白)、linclin、α-D-甘露糖苷酶、β-甘露糖苷酶、天冬氨酰氨基葡萄糖苷酶、α-L-岩藻糖苷酶、胱氨酸病蛋白(cystinosin)、组织蛋白酶K、唾液酸转运蛋白(sialin)、LAMP2、以及氨基己糖苷酶。在其它优选的实施方案中，所述治疗性蛋白质可以是例如调节炎症反应的细胞内蛋白，例如表观遗传蛋白，如甲基化酶和布罗莫结构域；或调节肌肉功能的细胞内蛋白，例如转录因子，如MyoD(作为非限制性实例，登录号：P15172)或Myf5；调节肌肉收缩性的蛋白质，例如肌球蛋白、肌动蛋白、钙/结合蛋白，如肌钙蛋白；或结构蛋白，如抗肌萎缩蛋白(dystrophin)(作为非限制性实例，登录号：P11532)、迷你抗肌萎缩蛋白(作为非限制性实例，登录号：P15172)、肌营养相关蛋白(utrophin)、肌联蛋白、伴肌动蛋白(nebulin)、抗肌萎缩蛋白相关蛋白，如异连蛋白(dystrobrevin)、互生蛋白(syntrophin)、中间丝蛋白(syncoilin)、肌间线蛋白(desmin)、肌聚糖蛋白(sarcoglycan)、肌养蛋白聚糖(dystroglycan)、肌长蛋白(sarcospan)、集聚蛋白(agrin)、和/或福山蛋白(fukutin)。重要的是，所有上述治疗性蛋白质都可以被工程化以含有Fc结构域，以使得能够与EV上存在的Fc结合多肽结合。另一个非限制性实例是Fc结构域融合到酶NPC1上以用于后续递送到靶细胞中。可以用于提高EV递送的含有Fc的蛋白质(例如Fc-Cas9或抗体)的细胞内生物活性的又另一个非限制性实例是使Fc结构域与以下各项融合：内体逃逸肽或蛋白质，如HA2；细胞穿膜肽(CPP)，如TAT肽、转运素、穿膜素(peneratin)、聚赖氨酸、或gp41；霍乱毒素、志贺毒素、皂草素、白喉毒素肽等。在EV的表面上展示这样的内体逃逸结构域可以增强向靶细胞中的内化和后续的内体逃逸。如何可以将Fc结构域融合到所关注的蛋白质上的有利的非限制性实例是将Fc结构域融合到Cas9、Cpf1、非切割Cas变体、或任何其它类型的基因编辑蛋白或核糖核蛋白(RNP)上以用于EV介导的向靶细胞中的递送。在一个优选的实施方案中，Fc结构域在N末端或C末端与Cas9融合，所述Cas9已经在体外预先负载单向导RNA(sgRNA)链(预先负载RNA的Cas形成所谓的核糖核蛋白(RNP)复合物)。然后使由此形成的所得的含有Fc结构域的RNP复合物由合适的EV的Fc结合多肽结合以使它们与EV表面连接，继而递送到靶细胞中。RNP复合物的形成可以通过不同的方式并且使用不同的RNA组分实现，如常规的单向导RNA、包含crRNA和tracrRNA这两者的合成向导RNA，任选地与发夹环、crRNA、tracrRNA、以及其各种组合相组合。用于同源定向重组或非同源末端连接或任何其它修复或置换机制的修复模板也可以被包括在预先形成的RNP中，然后可以使用Fc结构域-Fc结合多肽连接使其与EV连接。

如本文所述的术语″抗体″和″mAb″和″Ab″应当被理解为包括完整抗体(即全抗体)以及其具有抗原结合特性的任何衍生物。常规上，抗体指的是包含由二硫键相互连接的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的糖蛋白、或其抗原结合部分。每一条重链包含重链可变区(在本文缩写为V_H)和重链恒定区。每一条轻链包含轻链可变区(在本文缩写为V_L)和轻链恒定区。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。V_H区和V_L区可以进一步细分成被称为互补决定区(CDR)的高变区，与被称为框架区(FR)的更保守的区域交替。重要的是，出于本发明的目的，所关注的抗体优选地具有Fc结构域或其衍生物，所述Fc结构域或其衍生物可以与本发明的Fc结合多肽结合以使得能够包被EV表面。用于本发明中的抗体可以是单克隆抗体(mAb)或多克隆抗体，优选地是mAb。在本发明中特别有用的抗体可以是嵌合抗体、CDR移植抗体、纳米抗体、人类或人源化抗体或其任何衍生物，只要它可以由Fc结合多肽结合即可，所述Fc结合多肽通常包含在根据本发明的融合蛋白中。抗体的产生在本发明的范围之外，但是通常，单克隆抗体和多克隆抗体这两者都是由实验性非人类哺乳动物，如山羊、兔、美洲驼、骆驼科动物、大鼠或小鼠产生的，但是合适的抗体也可以是其它产生方法的结果，例如Kohler和Milstein的标准体细胞杂交技术。在例如小鼠中产生杂交瘤是非常完善的程序并且可以使用本领域公知的技术实现。用于本发明中的抗体可以是人类抗体、人源化抗体、和/或任何类型的嵌合抗体。如本文所用的术语″人类抗体″意图包括具有可变区的抗体，其中框架区和CDR区这两者都源自于人类生殖系免疫球蛋白序列。用于本发明中的人类抗体可以包括并非由人类生殖系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如在体外通过随机诱变或位点特异性诱变或在体内通过体细胞突变引入的突变)。术语″抗体衍生物″指的是抗体的任何修饰形式，例如具有以任何方式修饰的氨基酸序列的抗体、或抗体和另外的药剂或抗体的缀合物、双特异性抗体、多特异性抗体、抗体结构域等。术语″人源化抗体″指的是如下抗体，其中源自于另一种哺乳动物物种，如小鼠、骆驼科动物、美洲驼等的CDR序列已经移植到人类框架序列上。可以在人类框架序列内进行另外的框架区修饰。根据本发明的抗体可以包括所有同种型和亚型，如IgG(例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG2a、IgG2d、以及IgG2c)、IgA、IgM、IgM、IgD等、以及其单体、二聚体、和低聚物。此外，根据本发明的抗体在展示在EV上时可以具有以下几种功能：(1)抗体可以靶向特定的细胞类型、组织、和/或器官以重新引导基于EV的治疗剂的分布和优化基于EV的治疗剂的递送；(2)与所关注的靶抗原相互作用的治疗性抗体可以使用EV有效地递送到所关注的组织(例如递送到CNS或脑)；(3)EV表面上多重化的抗体在结合靶抗原方面可以是显著更好的；(4)抗体-药物缀合物(ADC)可以在EV上被多重化以显著增强它们的治疗功效；(5)由Fc结合多肽结合的抗体对靶标可以具有更高的亲和力；(6)包被到根据本发明的EV上的抗体可以细胞内递送；以及(7)将EV用抗体包被可以减少EV的调理作用和/或免疫介导的清除，这可能进而对治疗活性是重要的。

术语″含有Fc的蛋白质″和″包含Fc结构域的蛋白质″和″含Fc结构域的蛋白质″和″含有Fc结构域的蛋白质″和″Fc结构域蛋白″和类似术语在本文可互换使用并且应当被理解为涉及任何蛋白质、多肽、或肽(即包含氨基酸序列的任何分子)，其天然包含至少一个Fc结构域或由于对所考虑的蛋白质进行工程化以引入Fc结构域而包含至少一个Fc结构域。Fc表示″可结晶片段″，它是抗体尾区的名称。然而，也可以形成Fc结构域并且将其用于其它蛋白质上，而不仅仅是抗体。这样的含有Fc结构域的蛋白质的非限制性实例包括抗体和抗体衍生物、Fc修饰的诱饵受体和/或信号转导蛋白，如IL1、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6(如信号转导蛋白gp130(作为非限制性实例，登录号：P40189))、IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12、IL13、IL14、IL15、IL17(如IL17R，其中作为非限制性实例，登录号：Q96F46)、IL23(如IL23R，其中作为非限制性实例，登录号：Q5VWK5)等的白细胞介素诱饵受体、含有Fc结构域的双特异性和多特异性结合剂、任何类型的含有Fc结构域的受体或配体、用于例如酶替代治疗或基因编辑的Fc结构域修饰的酶、上面已经移植有Fc结构域的核酸酶，如Cas和Cas9；与Fc结构域融合的肿瘤抑制因子等。可以与天然缺乏Fc结构域的所关注的蛋白质融合的合适的Fc结构域包括以下非限制性实例：人类IGHM(作为非限制性实例，登录号：P01871)、人类IGHA1(作为非限制性实例，登录号：P01876)、人类IGHA2(作为非限制性实例，登录号：P01877)、人类IGKC(作为非限制性实例，登录号：P01834)、人类IGHG1(作为非限制性实例，登录号：P01857)、人类IGHG2(作为非限制性实例，登录号：P01859)、人类IGHG3(作为非限制性实例，登录号：P01860)、人类IGHG4(作为非限制性实例，登录号：P01861)、人类IGHD(作为非限制性实例，登录号：P01880)、人类IGHE(作为非限制性实例，登录号：P01854)、以及其任何结构域、衍生物、或组合。基本上，所关注的任何蛋白质可以被修饰以包含Fc结构域。上面可以引入有Fc结构域的蛋白质的非限制性实例包括例如肿瘤抑制因子、病毒或细菌抑制剂、细胞组分蛋白、DNA和/或RNA结合蛋白、DNA修复抑制剂、核酸酶、蛋白酶、整合酶、转录因子、生长因子、细胞凋亡抑制剂和诱导剂、毒素(例如假单胞菌外毒素)、结构蛋白、神经营养因子，如NT3/4、脑源性神经营养因子(BDNF)以及神经生长因子(NGF)和它的单个亚基，如2.5Sβ亚基；离子通道、膜转运蛋白、蛋白内稳态因子、参与细胞信号传导的蛋白质、翻译和转录相关蛋白、核苷酸结合蛋白、蛋白质结合蛋白、脂质结合蛋白、糖胺聚糖(GAG)和GAG结合蛋白、代谢蛋白、细胞应激调节蛋白、炎症和免疫系统调节蛋白、线粒体蛋白、以及热休克蛋白等。所关注的蛋白质的上述清单不是详尽的并且其它蛋白质也可能是相关的，只要所述蛋白质包含Fc结构域即可或只要有可能将所考虑的蛋白质进行工程化以包含Fc结构域即可。这样的将蛋白质进行工程化以引入Fc结构域的一个非限制性实例包括将Fc结构域添加到诱饵受体中，例如将Fc结构域添加到Cas酶或Cas9酶上以用于生物活性递送到靶细胞中以使得能够进行基因编辑。这样的将蛋白质进行工程化以引入Fc结构域的另一个非限制性实例包括将Fc结构域添加到用于酶替代治疗的酶上(例如Fc结构域-葡萄糖脑苷脂酶或Fc结构域-α-半乳糖苷酶或Fc结构域-NPC1)。可商购获得的Fc结构域修饰的蛋白质的公知实例是依那西普，其是用于治疗各种自身免疫性疾病的生物药物，包含融合到TNF受体2上的IgG的Fc结构域。因此，如从上文可以清楚地看出，根据本发明的含有Fc结构域的蛋白质可以基本上是天然含有Fc结构域或由于引入Fc结构域而含有Fc结构域的任何所关注的蛋白质。

含有Fc的蛋白质在本文常常被描述为与EV和/或Fc结合多肽″连接″。或者，EV有时被称为被含有Fc的蛋白质″包被″或被称为具有″与它们的表面结合″或″与它们的表面连接″的含有Fc的蛋白质。这些术语在Fc结合多肽与Fc结构域之间的常规相互作用的背景下应当被理解为这两种多肽以产生在Fc结合剂与Fc结构域之间形成的化学键(通常是非共价键)的方式彼此相互作用。因此，这通常意味着包含Fc结合多肽的EV因此具有借助于化学键与它连接的含有Fc的蛋白质的Fc结构域。如本领域技术人员所将了解的那样，当在EV表面上发生结合时，EV因此可以具有与它结合(连接)的多个这样的含有Fc的蛋白质，从而产生包被形式。

术语″Fc结合多肽″和″Fc结合蛋白(Fc binding protein)″和″Fc结合剂″和″Fc结合蛋白(Fc-binding protein)″和″结合剂″在本文可互换使用并且应当被理解为涉及可以结合任何所关注的蛋白质的Fc结构域的任何蛋白质、多肽或肽(即包含氨基酸序列的任何分子)。通常，本发明的Fc结合多肽源自于人类或非人类(例如哺乳动物来源、细菌等)的各种来源，它们对各种抗体同种型、亚型、以及种类(例如IgG(在IgG的情况下，作为非限制性实例，IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgG2a、IgG2d、和/或IgG2c)、IgA、IgM、IgM、IgD等)的Fc结构域具有高亲和力，并且它们可以与EV蛋白融合。除了由本申请所提到的其它Fc结合多肽之外，根据本发明的Fc结合多肽的非限制性实例还包括蛋白A(作为非限制性实例，SEQ ID NO77)、蛋白G(作为非限制性实例，SEQ ID NO 78)、蛋白A/G(作为非限制性实例，SEQ ID NO72)、Z结构域(作为非限制性实例，SEQ ID NO 73)、ZZ结构域(作为非限制性实例的SEQ IDNO 73的两个可操作连接的拷贝，即作为非限制性实例，SEQ ID NO 74)、人类FCGRI(作为非限制性实例，SEQ ID NO 31)、人类FCGRIIA(作为非限制性实例，SEQ ID NO 33)、人类FCGRIIB(作为非限制性实例，登录号：31994)、人类FCGRIIC(作为非限制性实例，登录号：31995)、人类FCGRIIIA(作为非限制性实例，登录号：P08637)、人类FCGR3B(作为非限制性实例，登录号：O75015)、人类FCAMR(作为非限制性实例，SEQ ID NO 28)、人类FCERA、人类FCAR、小鼠FCGRI(作为非限制性实例，SEQ ID NO 79)、小鼠FCGRIIB(作为非限制性实例，SEQ ID NO 80)、小鼠FCGRIII(作为非限制性实例，SEQ ID NO 81)、小鼠FCGRIV(作为非限制性实例，SEQ ID NO 82)、小鼠FCGRn(作为非限制性实例，SEQ ID NO 83)、以及其各种组合、衍生物、或替代物。

术语″EV蛋白″和″EV多肽″和″外泌体多肽″和″外泌体蛋白″在本文可互换使用并且应当被理解为涉及可以用于将多肽构建体(除了EV蛋白之外，其通常还包含Fc结合多肽)转运到合适的囊泡结构，即转运到合适的EV的任何多肽。更确切地说，这些术语应当被理解为包括使得能够将融合蛋白构建体转运、运输或穿梭到囊泡结构，如EV的任何多肽。这样的外泌体多肽的实例是例如CD9(作为非限制性实例，SEQ ID NO 1)、CD53(作为非限制性实例，SEQ ID NO 2)、CD63(作为非限制性实例，SEQ ID NO 3)、CD81(作为非限制性实例，SEQID NO 4)、CD54(作为非限制性实例，SEQ ID NO 5)、CD50(作为非限制性实例，SEQ ID NO6)、FLOT1(作为非限制性实例，SEQ ID NO 7)、FLOT2(作为非限制性实例，SEQ ID NO 8)、CD49d(作为非限制性实例，SEQ ID NO 9)、CD71(也被称为转铁蛋白受体)(作为非限制性实例，SEQ ID NO 10)和它的内体分选结构域，即转铁蛋白受体内体分选结构域(作为非限制性实例，SEQ ID NO 23)、CD133(作为非限制性实例，SEQ ID NO 11)、CD138(多配体蛋白聚糖-1)(作为非限制性实例，SEQ ID NO 12)、CD235a(作为非限制性实例，SEQ ID NO 13)、ALIX(作为非限制性实例，SEQ ID NO 14)、多配体蛋白聚糖结合蛋白-1(作为非限制性实例，SEQ ID NO 15)、多配体蛋白聚糖结合蛋白-2(作为非限制性实例，SEQ ID NO 16)、Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 17)、多配体蛋白聚糖-2(作为非限制性实例，SEQID NO 20)、多配体蛋白聚糖-3(作为非限制性实例，SEQ ID NO 21)、多配体蛋白聚糖-4(作为非限制性实例，SEQ ID NO 22)、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白、MHC-I组分或MHC-II组分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19(作为非限制性实例，SEQ ID NO 26)、CD30(作为非限制性实例，SEQ ID NO 27)、TSG101、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其它外泌体多肽、以及其任何组合，但是能够将多肽构建体转运到EV的许多其它多肽被包括在本发明的范围内。通常，在本发明的许多实施方案中，至少一种外泌体多肽与至少一种Fc结合多肽融合，以形成存在于EV中的融合蛋白。这样的融合蛋白还可以包含各种其它组分以优化它们的一种或多种功能，包括接头、跨膜结构域、胞质结构域、多聚化结构域等。

术语″来源细胞″或″EV来源细胞″或″亲本细胞″或″细胞来源″或″EV产生细胞″或任何其它类似术语应当被理解为涉及能够在合适的条件下，例如在悬浮培养中或在贴壁培养中或在任何其它类型的培养系统中产生EV的任何类型的细胞。根据本发明的来源细胞还可以包括在体内产生外泌体的细胞。根据本发明的来源细胞可以选自广泛的细胞和细胞系，例如间充质干细胞或基质细胞或成纤维细胞(可从例如骨髓、脂肪组织、脐带胶样组织(Wharton′s jelly)、围产期组织、牙蕾、脐带血、皮肤组织等获得)、羊膜细胞，更确切地说是任选地表达各种早期标志物的羊膜上皮细胞；髓系抑制细胞、M2极化巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞、成纤维细胞等。特别令人关注的细胞系包括人类脐带内皮细胞(HUVEC)、人类胚肾(HEK)细胞、内皮细胞系，如微血管或淋巴管内皮细胞；软骨细胞、不同来源的MSC、气道或肺泡上皮细胞、成纤维细胞、内皮细胞等。此外，免疫细胞，如B细胞、T细胞、NK细胞、巨噬细胞、单核白细胞、树突状细胞(DC)也在本发明的范围内，并且能够产生EV的基本上任何类型的细胞也被包括在本文中。一般来说，EV可以源自于基本上任何细胞来源，无论它是原代细胞来源还是永生化细胞系。EV来源细胞可以是任何胚胎干细胞、胎儿干细胞、以及成体干细胞类型，包括诱导多潜能干细胞(iPSC)和通过任何方法获得的其它干细胞。当治疗神经系统疾病时，可以考虑使用例如原代神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、小胶质细胞、以及神经祖细胞作为来源细胞。来源细胞在性质上对于待治疗的患者来说可以是同种异体的、自体的、或甚至异种的，即所述细胞可以来自患者本身或来自无关、匹配或不匹配的供体。在某些情况下，从医学角度来看，同种异体细胞可能是优选的，这是因为它们可以提供免疫调节作用，这可能不可从患有某种适应症的患者的自体细胞获得。举例来说，在治疗全身性、外周和/或神经系统炎症的情况下，同种异体MSC可能是优选的，这是因为可从这些细胞获得的EV可以使得能够经由例如巨噬细胞和/或中性粒细胞表型转换(分别从促炎性M1表型或N1表型转换成抗炎性M2表型或N2表型)来进行免疫调节。

在第一个方面，本发明涉及包含融合蛋白的EV，其中所述融合蛋白包含与外泌体多肽融合的至少一种Fc结合多肽。由于与EV蛋白融合，因此Fc结合多肽被有效地转运到EV并且以高数量展示在EV的表面上，这使得能够随后将EV用各种类型的含有Fc的蛋白质包被，所述含有Fc的蛋白质通常是具有Fc结构域的治疗性蛋白质、靶向抗体、治疗性抗体、抗体-药物缀合物、和/或在体内被动结合或有意选择以减少免疫细胞的调理作用和识别(以延长EV的循环时间)的抗体。

因此，在一个实施方案中，根据第一个方面的EV具有与它结合的多个含有Fc的蛋白质，所述结合是经由Fc结合多肽与所述多个含有Fc的蛋白质的Fc结构域之间的相互作用而实现的，其中所述多个含有Fc的蛋白质可以是相同的或不同的。所述EV可以经由Fc结合剂与包含Fc结构域的至少一种蛋白质之间的非共价相互作用而包被有多个包含Fc结构域的蛋白质。所述多个可以是至少10个、至少20个或至少30个包含Fc结构域的蛋白质。

在本发明的一个实施方案中，所述Fc结合剂是非人类来源的，它们可以例如从细菌、病毒、或非人类哺乳动物获得。在另一个实施方案中，所述Fc结合剂是人类或哺乳动物来源的。在优选的实施方案中，所述至少一种Fc结合多肽可以选自包括以下各项的组：蛋白A(作为非限制性实例，SEQ ID NO 77)、蛋白G(作为非限制性实例，SEQ ID NO 78)、蛋白A/G(作为非限制性实例，SEQ ID NO 72)、Z结构域(作为非限制性实例，SEQ ID NO 73)、ZZ结构域(作为非限制性实例，SEQ ID NO 74)、蛋白L(作为非限制性实例，pdb id no 1HEZ)、蛋白LG、人类FCGRI(作为非限制性实例，SEQ ID NO 31)、人类FCGR2A(作为非限制性实例，登录号：P12318)、人类FCGR2B(作为非限制性实例，登录号：P31994)、人类FCGR2C(作为非限制性实例，登录号：P31994)、人类FCGR3A(作为非限制性实例，登录号：P08637)、人类FCGR3B(作为非限制性实例，登录号：O75015)、人类FCGRB(作为非限制性实例，登录号：Q92637)(作为非限制性实例，SEQ ID NO 32)、人类FCAMR(作为非限制性实例，SEQ ID NO 28)、人类FCERA(作为非限制性实例，SEQ ID NO 30)、人类FCAR(作为非限制性实例，SEQ ID NO 29)、小鼠FCGRI(作为非限制性实例，SEQ ID NO 79)、小鼠FCGRIIB(作为非限制性实例，SEQ ID NO80)、小鼠FCGRIII(作为非限制性实例，SEQ ID NO 81)、小鼠FCGRIV(作为非限制性实例，SEQ ID NO 82)、小鼠FCGRn(作为非限制性实例，SEQ ID NO 83)、以及上述Fc结合多肽中的任一种的任何组合。已经由例如噬菌体展示筛选和经由生物信息学获得的其它合适的Fc结合多肽包括Fc结合肽SPH(作为非限制性实例，SEQ ID NO 57)、SPA(作为非限制性实例，SEQID NO 58)、SPG2(作为非限制性实例，SEQ ID NO 59)、SpA模拟物1(作为非限制性实例，SEQID NO 60)、SpA模拟物2(作为非限制性实例，SEQ ID NO 61)、SpA模拟物3(作为非限制性实例，SEQ ID NO 62)、SpA模拟物4(作为非限制性实例，SEQ ID NO 63)、SpA模拟物5(作为非限制性实例，SEQ ID NO 64)、SpA模拟物6(作为非限制性实例，SEQ ID NO 65)、SpA模拟物7(作为非限制性实例，SEQ ID NO 66)、SpA模拟物8(作为非限制性实例，SEQ ID NO 69)、SpA模拟物9(作为非限制性实例，SEQ ID NO 70)、SpA模拟物10(作为非限制性实例，SEQ ID NO71)、Fcγ模拟物1(作为非限制性实例，SEQ ID NO 67)、以及Fcγ模拟物2(作为非限制性实例，SEQ ID NO 68)、以及其任何组合或衍生物。用于特定构建体的最合适的Fc结合多肽的选择在很大程度上取决于所期望的结合特征、亲和力、当与外泌体多肽融合时Fc结合多肽的取向、以及各种其它因素。

蛋白A/G是包含7个Fc结合结构域EDABC-C1C3的重组遗传工程蛋白，其中蛋白A部分是从金黄色葡萄球菌片段E、D、A、B以及C获得的，并且蛋白G部分是从链球菌片段C1和C3获得的。有利的是，蛋白A/G(作为非限制性实例，SEQ ID NO 72)比单独的蛋白A(作为非限制性实例，SEQ ID NO 77)或蛋白G(作为非限制性实例，SEQ ID NO 78)具有更广泛的结合能力并且它对来自各种物种的抗体具有广泛的结合亲和力。蛋白A/G结合各种人类、小鼠以及大鼠IgG亚类，如人类IgG1、IgG2、IgG3、IgG4；小鼠IgG2a、IgG2b、IgG3；以及大鼠IgG2a、IgG2c。此外，蛋白A/G结合来自牛、山羊、绵羊、马、兔、豚鼠、猪、狗以及猫的总IgG。蛋白A/G已经被工程化以去除细胞壁结合区、细胞膜结合区以及白蛋白结合区以使得能够与所关注的蛋白质的Fc结构域进行强结合。因此，在根据本发明的有利的实施方案中，Fc结合剂包含多于一个Fc结合区，蛋白A、蛋白G、以及蛋白A/G也是这样。在一个替代性实施方案中，Fc结合剂可以倍增以使得能够与所关注的抗体的多于一个拷贝结合。举例来说，短Z结构域Fc结合剂可以经由可操作的连接以多于一个拷贝包括在融合蛋白中，从而允许与多于一个Fc结构域结合。通过这种方式，有可能不仅在单独的融合蛋白之间，而且还在一个单一的融合蛋白内，将抗体和其它含有Fc结构域的蛋白质多重化，从而可以结合多于一个抗体。举例来说，当将Fc结合多肽引入属于四次跨膜蛋白家族的EV蛋白(如CD63)中时，可能有利的是，将一个Fc结合剂插入在蛋白质的一个环上并且将另一个Fc结合剂(其可以是相同的或不同的)插入在蛋白质的另一个环上。Fc结合剂可以被放置在面向内和/或面向外的环上，这取决于含有Fc的蛋白质是意图负载到EV的内腔中还是负载到EV的表面上。根据本发明的融合蛋白的一些非限制性实例可以如下示意性地描述(以下符号不应当被视为说明任何C末端和/或N末端方向，它仅意图用于说明目的)：

外泌体多肽-Fc结合多肽-Fc结合多肽

外泌体多肽结构域-Fc结合多肽-外泌体多肽结构域-Fc结合多肽

外泌体多肽结构域-Fc结合多肽A-外泌体多肽结构域-Fc结合多肽B

在一些实施方案中，包含外泌体多肽和Fc结合多肽的融合蛋白还可以含有另外的多肽、多肽结构域或序列。这些另外的多肽结构域可以发挥各种功能，例如这些结构域可以(i)有助于增强融合蛋白的EV表面展示；(ii)引起融合蛋白聚簇，从而提高Fc结合多肽的亲合力；(iii)充当接头以优化外泌体多肽与Fc结合多肽之间的相互作用；和/或(iv)提高在EV膜中的锚定、以及各种其它功能。可以有利地部分或全部包括在本发明的融合蛋白中的两种这样的另外的多肽是gp130(作为非限制性实例，SEQ ID NO 18)和肿瘤坏死因子受体1(TNFR1)(作为非限制性实例，SEQ ID NO 19)。具体来说，这些另外的多肽的跨膜结构域对于优化向EV膜中的插入和Fc结合多肽的展示可能是非常有用的。总之，各种跨膜结构域作为融合蛋白中的另外的结构域可能是非常有利的。举例来说，当使用外泌体蛋白多配体蛋白聚糖结合蛋白时，非常有利的是，在融合蛋白的多配体蛋白聚糖结合蛋白与Fc结合多肽之间插入另外的多肽结构域，如TNFR的跨膜结构域或gp130的跨膜结构域。另外的其它结构域可以包括多聚化结构域，如fold-on结构域、亮氨酸拉链结构域和/或三聚化结构域，以增加表面展示和/或亲合力。其非限制性示意性实例示于下文中：

多配体蛋白聚糖结合蛋白-胞质TNRF-Foldon三聚化结构域-跨膜TNFR结构域-Z结构域-细胞外TNFR结构域

多配体蛋白聚糖-亮氨酸拉链结构域-gp130胞质结构域-gp130跨膜结构域-Fc结合多肽-gp130细胞外结构域

在另一个实施方案中，外泌体多肽可以选自包括以下各项的组：CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、多配体蛋白聚糖结合蛋白-1、多配体蛋白聚糖结合蛋白-2、Lamp2b、TSPAN8、多配体蛋白聚糖-1、多配体蛋白聚糖-2、多配体蛋白聚糖-3、多配体蛋白聚糖-4、TSPAN14、CD37、CD82(作为非限制性实例，SEQ ID NO 24)、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白、MHC-I组分或MHC-II组分、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8(作为非限制性实例，SEQ ID NO 25)、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其它外泌体多肽、以及其任何组合。

根据本发明的特别有利的融合蛋白可以包含人类外泌体蛋白CD63、CD81、CD9、CD71(转铁蛋白受体)、Lamp2、以及多配体蛋白聚糖结合蛋白，其与以下Fc结合多肽的至少一个拷贝融合：Z结构域、蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、FCGRI、人类FCGR2A、人类FCGR2B、人类FCGR2C、人类FCGR3A、人类FCGR3B、人类FCGR3C、人类FCAMR、人类FCAR、以及人类FCERA。确切地说，使两个Z结构域与EV蛋白CD63(作为非限制性实例，SEQ ID NO 3)融合会产生非常强效的Fc结合剂，其由于Z结构域的小尺寸和CD63的高EV表面表达而在EV的表面上大量展示。Fc结合剂在EV的外表面上展示当然是优选的以使得能够外源性结合含有Fc结构域的所关注的蛋白质。在CD63-ZZ结构域融合蛋白的情况下，Z结构域可以插入CD63的第一环和第二环中，以使得能够在CD63锚定到EV膜中之后在外EV表面上展示。此外，如上所述，合适的另外的多肽和多肽结构域和接头也可以被包括在融合蛋白中，所述融合蛋白通常包含外泌体多肽和Fc结合多肽。这些另外的多肽包括来自各种细胞因子受体(如TNFR1和TNFR2)、IL6信号转导蛋白gp130、以及各种其它细胞因子和细胞因子相关多肽的结构域。在某些情况下，细胞因子和细胞因子相关多肽(如各种细胞因子受体)可能单独能够将Fc结合多肽转运到EV。特别有用的接头是多个小而具有柔性的氨基酸和/或小而具有柔性的氨基酸的组合，如甘氨酸(G)和丝氨酸(S)，通常表示为GS，例如2×GS或4×GS。也可以在C末端和N末端添加用于简化纯化和测定的His标签，并且也可以添加各种荧光蛋白，如GFP。以下是融合蛋白的特别有利的非限制性实例，所述融合蛋白包含至少一种外泌体多肽和至少一种Fc结合多肽，其常常经由接头连接并且任选地包括一种或多种另外的多肽或多肽结构域：

·CD81-蛋白A/G CD81第二环(作为非限制性实例，SEQ ID NO 75)

·CD9-ZZ结构域CD9第二环(作为非限制性实例，SEQ ID NO 76)

·FCAR细胞外结构域-2×GGGgS接头-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 55)

·FCAR细胞外结构域-4×GS接头-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 54)

·FCGR1A细胞外结构域-2×GGGgS接头-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO49)

·FCGR1A细胞外结构域-4×GS接头-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 48)

·FcRN细胞外结构域-4×GS接头-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 39)

·FcRN-2×GGGgS接头-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 40)

·Gp130细胞外结构域-2×GGGGS接头-FCAR细胞外结构域-Gp130跨膜结构域-亮氨酸拉链-N末端多配体蛋白聚糖结合蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 52)

·Gp130细胞外结构域-2×GGGGS接头-FCGR1A细胞外结构域-Gp130跨膜结构域-亮氨酸拉链-N末端多配体蛋白聚糖结合蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 46)

·Gp130细胞外结构域-2×GGGGS接头-FcRN细胞外结构域-Gp130跨膜结构域-亮氨酸拉链-N末端多配体蛋白聚糖结合蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 43)

·Gp130细胞外结构域-2×GGGGS接头-Z结构域-Gp130跨膜结构域-亮氨酸拉链-N末端多配体蛋白聚糖结合蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 34)

·转铁蛋白受体-2×GGGGS接头-FCAR细胞外结构域(作为非限制性实例，SEQ IDNO 56)

·转铁蛋白受体-2×GGGGS接头-FCGR1A细胞外结构域(作为非限制性实例，SEQID NO 50)

·转铁蛋白受体-2×GGGGS接头-FcRN细胞外结构域(作为非限制性实例，SEQ IDNO 41)

·转铁蛋白受体-2×GGGGS接头-Z结构域(作为非限制性实例，SEQ ID NO 38)

·CD63-FCAR细胞外结构域CD63第一环和CD63第二环(作为非限制性实例，SEQ IDNO 53)

·CD63-FCGR1A细胞外结构域CD63第一环和CD63第二环(作为非限制性实例，SEQID NO 47)

·CD63-FcRN细胞外结构域CD63第一环和CD63第二环(作为非限制性实例，SEQ IDNO 44)

·CD63-Z结构域CD63第一环和CD63第二环(作为非限制性实例，SEQ ID NO 35)

·TNFR细胞外结构域-2×GGGGS接头-FCAR细胞外结构域-TNFR跨膜结构域-foldon-N末端多配体蛋白聚糖结合蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 51)

·TNFR细胞外结构域-2×GGGGS接头-FCGRlA细胞外结构域-TNFR跨膜结构域-foldon-N末端多配体蛋白聚糖结合蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 45)

·TNFR细胞外结构域-2×GGGGS接头-FcRN细胞外结构域-TNFR跨膜结构域-foldon-N末端多配体蛋白聚糖结合蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 42)

·TNFR细胞外结构域-2×GGGGS接头-Z结构域-TNFR跨膜结构域-foldon-N末端多配体蛋白聚糖结合蛋白(作为非限制性实例，SEQ ID NO 33)

·Z结构域-2×GGGgS接头-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 37)

·Z结构域-4×GS接头-Lamp2b(作为非限制性实例，SEQ ID NO 36)

·转铁蛋白受体-蛋白AG(作为非限制性实例，可操作地与作为非限制性实例的SEQ ID NO 72融合的SEQ ID NO 10)

上述融合蛋白仅仅是本发明允许的许多工程化可能性的实例，并且因而，它们仅仅是本发明的非限制性实施方案。根据本发明的融合蛋白的所有组分都可以自由组合，例如，所述融合蛋白可以含有一个或几个外泌体多肽，其可以被放置在融合蛋白的C末端、N末端、或这两者、或任何位置处。此外，所述融合蛋白还可以含有一个或几个Fc结合多肽，其可以被放置在融合蛋白的C末端、N末端、或这两者、或例如跨膜部分的任何环中的一个或多个上、或任何位置处。为了清楚起见，在单个构建体中可以包含多于一种类型的外泌体多肽和多于一种类型的Fc结合多肽。此外，可以包括另外的氨基酸段，如接头(常常包含氨基酸甘氨酸和丝氨酸)和His标签以简化纯化、测定以及可视化。此外，在融合蛋白序列中的任何位置处还可以包括其它肽和多肽结构域。举例来说，可以有利地包括来自各种细胞因子受体的各种结构域和区域，例如TNFR1、TNFR2、IL17R、IL23R、gp130、IL6R等的各种结构域。

在另一个实施方案中，Fc结合多肽可以如上所述与包含Fc结构域的任何蛋白质结合，所述蛋白质不仅可以是抗体，而且还可以是包含Fc结构域的其它蛋白质，它们可以是天然存在的和工程化的含有Fc结构域的蛋白质，如上文在几个实例中提到的蛋白质。有利的是，本发明产生包被有多个包含Fc结构域的蛋白质的EV，所述包被是经由Fc结合多肽与至少一种含有Fc的蛋白质之间的相互作用而实现的。Fc结合剂与含有Fc的蛋白质之间的相互作用通常是基于Fc结合多肽与含有Fc的蛋白质的Fc结构域之间的非共价键。当然，一个单一的EV可以包被有多于一种类型的含有Fc结构域的蛋白质。在一个非限制性实例中，Fc结合EV包被有沿PD1轴靶向合适的靶标的一种抗体，而另一种抗体沿CTLA4轴靶向合适的靶标。在另一个非限制性实例中，Fc结合EV包被有靶向肿瘤细胞表面受体的抗体和与Fc结构域融合的Cas9。正如通常情况那样，一个单一的EV也可以包含很多个一种单一类型的含有Fc结构域的蛋白质，如一种类型的单克隆抗体。靶向抗体、治疗性抗体、含有Fc的所关注的非抗体治疗性蛋白质、抗体-药物缀合物(ADC)、以及用于减少调理作用和/或免疫细胞介导的清除的抗体的各种组合构成本发明的优选的实施方案。在有利的实施方案中，根据本发明的EV包被有多个包含Fc结构域的蛋白质。举例来说，当使用高表达的EV蛋白，如CD63或CD81或多配体蛋白聚糖结合蛋白时，可以实现EV表面的非常致密的包被。因此，本发明可以包被有至少10个包含Fc结构域的蛋白质，优选地至少20个包含Fc结构域的蛋白质，甚至更优选地至少30个包含Fc结构域的蛋白质。这些蛋白质可以是相同蛋白质的拷贝(例如50个依那西普分子包被一个EV)或多于一种蛋白质的拷贝(例如30个依那西普分子和30个gp130-Fc结构域融合蛋白包被一个EV)。通过选择EV蛋白和Fc结合剂的最佳组合，有可能进一步增加展示，在某些情况下，有可能将EV用多于50个包含Fc结构域的蛋白质，或甚至多于约75个包含Fc结构域的蛋白质包被。

在另一个方面，本发明还涉及包含展示多肽与Fc结合多肽之间的融合蛋白的细胞。展示多肽通常可以是跨膜蛋白。各种外泌体多肽可以用于该目的，并且常规的细胞跨膜蛋白，如T细胞受体跨膜结构域；白细胞介素受体、转铁蛋白受体、锡蛋白、肌脂蛋白、受磷蛋白、以及各种其它膜蛋白，如通道和同向转运蛋白/内向转运蛋白也可以用于该目的，它们可以将Fc结合多肽转运到细胞膜以用于在细胞膜的外部或内部展示，这取决于所关注的含有Fc的蛋白质将要存在于细胞内部还是展示在细胞表面上。在一个优选的实施方案中，含有Fc的蛋白质是抗体并且所述细胞是预期用于细胞治疗的细胞，如嵌合抗原受体(CAR)T细胞。使用这种方法，细胞可以靶向所关注的特定组织，在CAR-T细胞的情况下，所述所关注的组织可能是肿瘤组织。在免疫调节细胞，如MSC的情况下，所述所关注的组织可能是炎症和/或损伤的部位。本文的所有抗体和其它含有Fc的蛋白质出于与对于EV相同的原因同样适用于展示在细胞上。

在另一个方面，本发明涉及一种复合物，所述复合物是在融合蛋白与包含Fc结构域的蛋白质之间形成的，所述融合蛋白包含(i)外泌体多肽和(ii)Fc结合多肽。根据本发明的EV因此通常包含多个这样的复合物，并且通常，更高数量的这样的复合物在EV上展示而没有与例如空间位阻相关的问题，从治疗和/或靶向观点来看，所述EV变得更强效。这样的融合蛋白-含有Fc的蛋白质复合物通常存在于EV的脂质膜中，这是借助于介导向外泌体膜中的转运和锚定的外泌体蛋白的存在而实现的。然而，所述复合物也可以存在于其它脂质膜中，例如细胞膜或细胞器的膜。根据本发明的EV还与含有Fc的蛋白质形成一种类型的纳米颗粒复合物。通常，如上所述，包含Fc结合多肽的每一个EV与多个含有Fc的蛋白质结合，这产生包被(修饰)有和/或含有多个所关注的含有Fc的蛋白质的EV。其实例是允许经由与抗体一起孵育而与这样的抗体结合的Fc结合EV在它们的表面上被多个抗体修饰，例如每个EV至少10个抗体，或更经常，每个EV至少20个或30个抗体。因此，这种EV-抗体复合物构成一种类型的纳米颗粒复合物，其对于靶向、治疗、以及细胞内递送具有显著的效用。

重要的是，本发明还提供了一种以内源性方式将含有Fc的蛋白质负载到EV中的方法。这样的内源性负载方法包括使以下各项在EV产生细胞中共表达：(i)包含外泌体多肽和Fc结合多肽的融合蛋白；以及(ii)包含Fc结构域的所关注的蛋白质。与Fc结合结构域融合的外泌体多肽使得能够将融合蛋白主动分选到EV产生细胞中的EV中，并且Fc结合蛋白的存在使得所述融合蛋白能够将含有Fc的蛋白质拖曳(转运)到EV中。如上所述，各种外泌体蛋白可以用于将融合蛋白分选到EV中，特别是在内源性负载的情况下，蛋白质的选择是非常重要的。可溶性EV蛋白，如Alix和多配体蛋白聚糖结合蛋白可以适用于负载意图可溶于靶环境中的含有Fc的蛋白质，如优选地可溶于靶细胞内的Cas9。然而，含有Fc的蛋白质的内源性负载也可以使用跨膜和/或膜相关EV蛋白，如CD9、CD81、CD63等来实现。当使用膜结合的外泌体蛋白进行内源性负载时，Fc结合多肽改为被放置在EV膜的内腔侧上的环上而不是囊泡外侧上，从而使得能够进行内腔负载而不是囊泡外负载。根据本发明的EV因此通常包含多个这样的融合蛋白-含有Fc结构域的蛋白质复合物(″多个″应当被理解为涉及相同的含有Fc结构域的蛋白质的多个拷贝或几个不同的含有Fc结构域的蛋白质)，其在内部或外部锚定在EV膜中或与EV膜缔合，或在EV的内腔中呈基本上可溶形式。

在另一个方面，本发明涉及用于产生EV的方法，所述EV能够与包含Fc结构域的蛋白质结合，如抗体和被工程化以包含Fc结构域的蛋白质。这样的方法通常包括以下步骤：(i)向EV来源细胞中引入编码融合蛋白的多核苷酸构建体，所述融合蛋白包含至少一种Fc结合多肽和至少一种外泌体多肽；以及(ii)收集已经由所述EV产生来源细胞分泌的EV，其中所述EV包含已经从所述多核苷酸构建体表达的融合蛋白。在后续的步骤中，可以使用合适的纯化技术将包含融合蛋白的EV纯化，继而使其暴露于含有Fc结构域的蛋白质，如抗体，以使得能够经由Fc结合多肽与所关注的蛋白质的Fc结构域之间的相互作用来结合含有Fc的蛋白质。如上所述，在一个替代性实施方案中，步骤(i)还可以包括在相同的EV来源细胞中从多核苷酸构建体表达所关注的含有Fc的蛋白质，从而实现EV的内源性负载。所述融合蛋白(在外泌体多肽与Fc结合多肽之间)和含有Fc的蛋白质可以从同一多核苷酸构建体或不同的多核苷酸构建体表达，这取决于构建体设计。

在又另一个方面，本发明涉及一种用于使至少一种包含Fc结构域的蛋白质，如抗体与EV连接的方法。在一个实施方案中，所述方法用于将EV用所述至少一种包含Fc结构域的蛋白质包被。这样的方法包括以下步骤：(i)提供包含融合蛋白的EV，所述融合蛋白包含与至少一种外泌体多肽融合的至少一种Fc结合蛋白；以及(ii)使所述融合蛋白的Fc结合蛋白结合至少一种包含Fc结构域的蛋白质的Fc结构域。用于产生根据本发明的包含融合蛋白的EV的EV来源细胞可以用产生携带融合蛋白-含有Fc的蛋白质复合物的EV所需的多核苷酸构建体稳定转染或瞬时转染。稳定的转染是有利的，这是因为它能够建立主细胞库(MCB)和工作细胞库(WCB)。然而，瞬时转染在某些情况下也是有利的，例如当评估不同的构建体时或例如当快速建立包括从患者自身的EV产生细胞获得的EV的自体治疗时。

在另一个方面，本发明涉及用于在体外、离体或体内将所关注的蛋白质递送到靶细胞的细胞内环境中的方法。这样的方法包括以下步骤：(i)提供包含至少一种Fc结合多肽的EV；(ii)使所述包含Fc结合多肽的EV与含有Fc的蛋白质接触，以使得EV中所包含的Fc结合多肽与含有Fc的蛋白质的Fc结构域之间能够结合；以及(iii)使EV与一种或多种含有Fc的蛋白质之间形成的复合物(即经由Fc结合多肽与Fc结构域之间的相互作用而连接有至少一种含有Fc的蛋白质的EV)与一种或多种靶细胞接触。在一个优选的实施方案中，在融合蛋白中包含Fc结合多肽以及至少一种外泌体多肽，但是任选地还包含其它多肽和结构域。由于EV内化到靶细胞中的独特能力，因此含有Fc的蛋白质也将被内化。这是非常有利的并且开放了细胞内空间以递送几乎任何基于蛋白质的治疗剂。如上所述，含有Fc的蛋白质的EV介导的内化在体内和体外都发生，并且这些方法因此可以对治疗开发具有显著的影响，而且也用于研究和诊断目的。

在另一个方面，本发明涉及EV用作抗体和其它所关注的含有Fc结构域的蛋白质的递送载体的用途。此外，本发明还提供了与含有Fc的蛋白质连接的EV用作其它所关注的治疗剂的递送载体的用途。作为非限制性实例，在表面上连接有靶向抗体的EV还可以含有另外的治疗剂，所述另外的治疗剂可以存在于EV内部和/或EV膜中。举例来说，抗体包被的EV可以用于将RNA治疗剂运载物(如mRNA、siRNA、寡核苷酸等)递送到靶细胞、组织和/或器官中。在另一个非限制性实例中，在表面上连接有含有Fc的靶向蛋白(如已经被工程化以含有Fc结构域的scFv)并且在EV内部或在EV膜中/上包含治疗性蛋白质，如用于基因编辑的Cas9，任选地连同CRISPR RNA向导链一起的EV。

在另外的方面，本发明的方法还可以包括使EV来源细胞暴露于血清饥饿、缺氧、巴弗洛霉素(bafilomycin)、或细胞因子，如TNF-α和/或IFN-γ，以影响所得的EV的产量或特性。EV的生产规模和时间线将在很大程度上取决于EV产生细胞或细胞系并且因此可以由本领域技术人员相应地进行调整。根据本发明的方法还可以包括EV纯化步骤，其可以在将包含融合蛋白的EV与待连接到(例如包被到)EV上的含有Fc结构域的蛋白质(如抗体)共孵育之前进行。EV可以经由选自包括以下各项的一组技术的程序纯化：液相色谱法(LC)、高效液相色谱法(HPLC)、珠粒洗脱色谱法、旋转过滤、切向流过滤(TFF)、中空纤维过滤、离心、免疫沉淀、流场分级分离、透析、基于微流体的分离等、或其任何组合。在一个有利的实施方案中，使用过滤(优选地是超滤(UF)、切向流过滤或中空纤维过滤)和尺寸排阻液相色谱法(LC)或珠粒洗脱色谱法的顺序组合进行EV的纯化。纯化步骤的这种组合产生优化的纯化，这进而产生优越的治疗活性。此外，与常规用于纯化外泌体的超速离心(UC)相比，顺序的过滤-色谱法显著更快并且有可能按比例放大到更高的制造量，这是在现有技术中占主导地位的当前UC方法的显著缺点。另一种有利的纯化方法是切向流过滤(TFF)，其提供可按比例缩放性和纯度，并且可以与任何其它类型的纯化技术组合。

在又另一个方面，本发明涉及药物组合物，所述药物组合物包含根据本发明的EV，所述EV通常呈EV群体的形式。通常，根据本发明的药物组合物包含一种类型的治疗性EV(即包含某种类型的融合蛋白并且被一种或多种类型的含有Fc的蛋白质包被的EV群体，所述含有Fc的蛋白质诸如抗体；Cas9-Fc融合蛋白和Fc-RNP融合复合物；与Fc结构域融合的溶酶体贮积症酶等)，其与至少一种药学上可接受的赋形剂一起配制。然而，在单一药物组合物中当然可以包含多于一种类型的EV群体，例如在期望组合抗体治疗的情况下。然而，当然，如上所述，单个EV或单个EV群体可以包含与EV表面结合的多于一个含有Fc的蛋白质(例如抗体)。所述至少一种药学上可接受的赋形剂可以选自包括以下各项的组：任何药学上可接受的材料、组合物或媒介物，例如固体或液体填充剂、稀释剂、赋形剂、载体、溶剂或封装材料，其可以参与例如悬浮EV群体、维持EV群体的活性、或将EV群体从一个器官或身体的一部分携带或转运到另一个器官或身体的另一部分(例如从血液到所关注的任何组织和/或器官和/或身体部分)。

本发明还涉及EV的美容应用。因此，本发明可以涉及皮肤护理产品，如霜膏、洗剂、凝胶、乳液、软膏、糊剂、粉剂、搽剂、防晒剂、洗发剂等，其包含合适的EV以改善和/或缓解诸如皮肤干燥、皱纹、皱褶、起皱和/或皮肤褶痕的症状和问题。在一个实施方案中，EV(携带与例如所关注的抗体结合的融合蛋白)是从具有再生特性的合适的EV产生细胞来源(例如MSC)获得的，其被包含在美容霜膏、洗剂或凝胶中以用于皱纹、褶皱、皱褶、起皱和/或皮肤褶痕的美容或治疗缓解。

在又另一个方面，本发明涉及用于医学的根据本发明的EV。当然，当包含与所关注的蛋白质(如抗体)的Fc结构域结合的融合蛋白的EV用于医学时，它实际上通常是正使用的EV的群体。向患者施用的EV的剂量将取决于例如已经包被在EV表面上的所关注的抗体的数量、待治疗或缓解的疾病或症状、施用途径、治疗性蛋白质本身的药理作用、EV的固有特性、任何靶向抗体或其它靶向实体的存在、以及本领域技术人员已知的各种其它相关参数。

携带含有Fc的蛋白质的本发明的EV可以用于几个不同的治疗和药物方面。在一个实施方案中，EV被靶向特定细胞类型、组织、和/或器官的抗体或其它含有Fc的蛋白质覆盖。这是使EV(除了含有Fc的蛋白质之外，其还可以包含其它药剂)靶向所关注的组织的非常强效的方式，并且可以代表靶向药物递送中的阶跃变化。在另一个实施方案中，与所关注的靶抗原相互作用的治疗性抗体或其它含有Fc结构域的蛋白质可以使用具有穿过生物屏障的能力的EV有效地递送到通常难以到达的所关注的组织。这种方法可以例如使得能够将单克隆抗体递送到中枢神经系统或脑中。在又另一个实施方案中，将EV用含有Fc的蛋白质包被是将所关注的含有Fc的蛋白质进行多重化的方式，以增强或影响它的靶标亲合力或它与所关注的靶标结合的构象。在又另一个实施方案中，根据本发明的EV使得能够提高抗体-药物缀合物(ADC)或受体-药物缀合物的递送和功效，这是因为ADC的多重化可以显著增强它们的治疗功效并且它们在EV上的存在意味着它们也可以进入靶细胞中。在另一个实施方案中，EV进入靶细胞中的能力意味着本发明的EV打开了整个细胞内空间并且使得可通过基本上任何包含Fc结构域的蛋白质和/或上面可以融合Fc结构域的任何蛋白质(如用于酶替代治疗的酶；核酸酶，如Cas9；或肿瘤抑制因子，如p53、pVHL、APC、CD95、ST5、YPEL3、ST7、以及ST14中的任-种)进行给药。

根据本发明的EV和其EV群体因此可以用于预防和/或治疗目的，例如用于预防和/或治疗和/或缓解各种疾病和病症。其中可以施用根据本发明的EV的疾病的非限制性实例包括克罗恩氏病(Crohn′s disease)、溃疡性结肠炎、强直性脊柱炎、类风湿性关节炎、多发性硬化症、系统性红斑狼疮、类肉瘤病、特发性肺纤维化、银屑病、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关周期性综合征(TRAPS)、白细胞介素-1受体拮抗因子缺乏症(DIRA)、子宫内膜异位症、自身免疫性肝炎、硬皮病、肌炎、中风、急性脊髓损伤、血管炎、格林-巴利综合征(Guillain-Barré syndrome)、急性心肌梗塞、ARDS、败血病、脑膜炎、脑炎、肝衰竭、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪肝病(NAFLD)、肾衰竭、心力衰竭或任何急性或慢性器官衰竭和相关潜在病因学、移植物抗宿主病、杜氏肌营养不良症(Duchenne muscular dystrophy)和其它肌营养不良症、溶酶体贮积病，如戈谢病(Gaucher disease)、法布里病(Fabry′sdisease)、MPS I、MPS II(亨特氏综合征(Hunter syndrome))和MPS III、尼-皮二氏病(Niemann-Pick disease)、庞贝氏病(Pompe disease)等；神经退行性疾病，包括阿尔茨海默氏病(Alzheimer′s disease)、帕金森氏病(Parkinson′s disease)、亨廷顿氏病(Huntington′s disease)和其它三核苷酸重复序列相关疾病、痴呆；ALS、癌症诱发的恶病质、厌食、2型糖尿病、以及各种癌症。几乎所有类型的癌症都是本发明的相关疾病靶标，例如急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性髓系白血病、肾上腺皮质癌、AIDS相关癌症、AIDS相关淋巴瘤、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、小脑或大脑基底细胞癌、胆管癌、膀胱癌、骨肿瘤、脑干神经胶质瘤、脑癌、脑肿瘤(小脑星形细胞瘤、大脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、室管膜瘤、成神经管细胞瘤、幕上原始神经外胚层肿瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤)、乳腺癌、支气管腺瘤/类癌、伯基特氏淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)、类癌肿瘤(儿童期、胃肠道)、原发灶不明癌、中枢神经系统淋巴瘤、小脑星形细胞瘤/恶性神经胶质瘤、宫颈癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、结缔组织增生性小圆细胞肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(眼内黑色素瘤、成视网膜细胞瘤)、胆囊癌、胃(Gastric/Stomach)癌、胃肠道类癌肿瘤、胃肠道间质瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤(颅外、性腺外、或卵巢)、妊娠期滋养细胞肿瘤、神经胶质瘤(脑干神经胶质瘤、大脑星形细胞瘤、视觉通路和下丘脑神经胶质瘤)、胃类癌、毛细胞白血病、头颈部癌、心脏癌、肝细胞癌(肝癌)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)、下咽癌、眼内黑色素瘤、胰岛细胞癌(内分泌胰腺)、卡波西氏肉瘤(Kaposi sarcoma)、肾癌(肾细胞癌)、喉癌、白血病((急性成淋巴细胞性(也被称作急性淋巴细胞性白血病)、急性髓系(也被称作急性骨髓性白血病)、慢性淋巴细胞性(也被称作慢性淋巴细胞性白血病)、慢性骨髓性(也被称作慢性髓系白血病)、毛细胞白血病))、唇和口腔癌、脂肪肉瘤、肝癌(原发性)、肺癌(非小细胞、小细胞)、淋巴瘤、AIDS相关淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、成神经管细胞瘤、梅克尔细胞癌(Merkel Cell Carcinoma)、间皮瘤、原发灶不明的颈部转移性鳞癌、口腔癌、多发性内分泌腺瘤综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞瘤、蕈样真菌病、骨髓增生异常/骨髓增生性疾病、骨髓性白血病、慢性髓系白血病(急性、慢性)、骨髓瘤、鼻腔和鼻旁窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤/骨恶性纤维组织细胞瘤、卵巢癌、卵巢上皮癌(表面上皮-间质瘤)、卵巢生殖细胞肿瘤、卵巢低度恶性潜能肿瘤、胰腺癌、胰岛细胞癌、甲状旁腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、松果体星形细胞瘤、松果体生殖细胞瘤、成松果体细胞瘤和幕上原始神经外胚层肿瘤、垂体腺瘤、胸膜肺母细胞瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞癌(肾癌)、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤(尤文氏家族肿瘤肉瘤(Ewing family of tumorssarcoma)、卡波西氏肉瘤、软组织肉瘤、子宫肉瘤)、塞扎里综合征(Sézary syndrome)、皮肤癌(非黑色素瘤、黑色素瘤)、小肠癌、鳞状细胞癌、颈部鳞癌、胃癌、幕上原始神经外胚层肿瘤、睾丸癌、咽喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(macroglobulinemia)、和/或肾母细胞瘤(Wilm′s tumor)。

根据本发明的EV可以经由各种不同的施用途径向人类或动物受试者施用，例如经耳(耳部)、颊面、结膜、皮肤、牙齿、电渗、宫颈内、窦内、气管内、肠内、硬膜外、羊膜外、体外、血液透析、浸润、间质、腹内、羊膜内、动脉内、关节内、胆道内、支气管内、囊内、心内、软骨内、尾部内、海绵体内、腔内、脑内、脑池内、角膜内、冠内(牙齿)、冠状动脉内、阴茎海绵体内、真皮内、椎间盘内、导管内、十二指肠内、硬膜内、表皮内、食道内、胃内、牙龈内、回肠内、病灶内、管腔内、淋巴管内、髓内、脑膜内、肌内、眼内、卵巢内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、窦内、脊柱内、滑膜内、腱内、睾丸内、鞘内、胸内、小管内、肿瘤内、鼓室内、子宫内、血管内、静脉内、静脉内推注、静脉内滴注、心室内、膀胱内、玻璃体内、离子电渗疗法、灌注、经喉、经鼻、鼻胃、封闭敷料技术、眼科、口服、口咽、其它、肠胃外、经皮、关节周、硬膜外、神经周、牙周、经直肠、呼吸道(吸入)、眼球后、软组织、蛛网膜下、结膜下、皮下、舌下、粘膜下、局部、透皮、经粘膜、经胎盘、经气管、经鼓室、输尿管、尿道、和/或阴道施用、和/或上述施用途径的任何组合，其通常取决于待治疗的疾病和/或抗体或EV群体本身的特征。

根据本发明的合适的靶向抗体可以靶向源自于例如肿瘤、实体器官、身体结构、细胞或组织类型的抗原。可以由靶向抗体靶向的抗原的来源的非限制性实例包括肝、肺、肾、心脏、胰腺、肾上腺、甲状腺、甲状旁腺、脑，包括所有脑区域(例如丘脑、下丘脑、纹状体等)；血脑屏障、CNS、PNS、骨髓、皮肤、血管系统、淋巴系统(包括脾)、关节、眼睛、肌肉组织、炎症部位、损伤部位、以及细胞类型，如脂肪细胞、肌细胞(成肌细胞和肌管)、卫星细胞、心脏细胞、内皮细胞、成纤维细胞、肝细胞、肾细胞、周细胞、神经元、胶质细胞、星形胶质细胞、少突胶质细胞、巨噬细胞、DC细胞、B细胞、T细胞、NK细胞、软骨细胞、成骨细胞、骨细胞、上皮细胞、红细胞、早期祖细胞，如多能造血干细胞/血胚细胞、髓系祖细胞、淋巴祖细胞等。与靶向癌症相关的抗原的非限制性实例包括腺癌抗原、甲胎蛋白、BAFF、C242抗原、CA-125、碳酸酐酶9(CA-IX)、二唾液酸神经节苷脂(GD2)、4-IBB、5T4、CD22、CD221、CD23(IgE受体)、CD28、CD30(TNFRSF8)、CD33、CD4、CD40、CD44 v6、CD51、CD52、CD56、CD74、CD80、CEA、CNT0888、CTLA-4、DR5、EGFR、EpCAM、CD3、FAP、纤连蛋白胞外结构域-B、叶酸受体1、GD2、GD3神经节苷脂、糖蛋白75、GPNMB、HER2/neu、HGF、人类分散因子受体激酶、IGF-1受体、IGF-I、IgGl、LI-CAM、IL-13、IL-6、胰岛素样生长因子I受体、整合素α5 β1、整合素αυ β3、豆荚蛋白、MORAb-009、MS4A1、MUC1、粘蛋白CanAg、C-MET、CCR4、CD 152、CD 10、CD 19、CD20、CD200、N-羟乙酰神经氨酸、NPC-IC、PDGF-R a、PDL192、磷脂酰丝氨酸、肿瘤抗原CTAA16.88、VEGF-A、VEGFR-1、VEGFR2、波形蛋白、RANKL、RON、ROR1、SCH 900105、SDC1、SLAMF7、TAG-72、生腱蛋白C、TGFβ2、TGF-β、TRAIL-R1、TRAIL-R2、叶酸受体、转铁蛋白受体以及其任何组合。

根据本发明的包被EV以防止或减少调理作用和/或免疫细胞介导的EV清除的抗体或其它含有Fc结构域的蛋白质可以是基本上任何含有Fc的蛋白质，如抗体，其天然地存在于血清或任何其它体液中。这些抗体因此可以是任何类型的，例如IgG、IgA、IgM、IgE和/或IgD，但是包含Fc结构域并且具有在体内防止EV的调理作用的能力的任何其它蛋白质也可以用于包被EV。因此，可以主动或被动进行EV的包被以避免或减少免疫清除，其中主动包被可以涉及在体内施用之前将所考虑的EV用合适的包含Fc结构域的蛋白质修饰。用于该目的的合适的含有Fc的蛋白质包括与Fc结构域融合的因子H和/或因子I。因子H和因子I是补体系统的负调节剂(通过抑制C3转化成C3b)，从而当与Fc结构域融合并且经由Fc结合多肽与融合蛋白的Fc结构域之间的结合而与EV表面连接时，引起EV清除减少。另一方面，被动包被可能需要允许所考虑的EV用它的可用的未结合的Fc结合剂在体内多价螯合蛋白质。

在另一个实施方案中，根据本发明的治疗性和/或靶向抗体的合适的非限制性实例可以是以下各项中的任一种或多种：阿巴伏单抗(Abagovomab)、阿昔单抗(Abciximab)、阿克序单抗(Actoxumab)、阿达木单抗(Adalimumab)、阿德木单抗(Adecatumumab)、阿多-曲妥珠单抗-艾美坦辛(Adotrastuzumab emtansine)、阿度奴单抗(Aducanumab)、阿非莫单抗(Afelimomab)、阿托珠单抗(Afutuzumab)、阿珠单抗(Alacizumab)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、阿利库单抗(Alirocumab)、喷替酸阿妥莫单抗(Altumomab pentetate)、阿麦妥昔单抗(Amatuximab)、马安莫单抗(Anatumomab mafenatox)、安弗鲁单抗(Anifrolumab)、安芦珠单抗(Anrukinzumab)、阿泊珠单抗(Apolizumab)、阿西莫单抗(Arcitumomab)、阿塞珠单抗(Aselizumab)、阿特珠单抗(Atezolizumab)、阿堤努单抗(Atinumab)、阿利单抗(Atlizumab)、阿托木单抗(Atorolimuma)、阿维单抗(Avelumab)、巴匹珠单抗(Bapineuzumab)、巴利昔单抗(Basiliximab)、巴维昔单抗(Bavituximab)、贝妥莫单抗(Bectumomab)、贝利单抗(Belimumab)、本雷利珠单抗(Benralizumab)、柏替木单抗(Bertilimumab)、贝索单抗(Besilesomab)、贝伐单抗(Bevacizumab)、贝洛序单抗(Bezlotoxumab)、比西单抗(Biciromab)、比马单抗(Bimagrumab)、莫比伐珠单抗(Bivatuzumab mertansine)、博纳吐单抗(Blinatumomab)、博索珠单抗(Blosozumab)、本妥昔单抗-维度汀(Brentuximab vedotin)、布雷奴单抗(Briakinumab)、布罗达单抗(Brodalumab)、卡那单抗(Canakinumab)、莫坎妥珠单抗(Cantuzumab mertansine)、拉坎妥珠单抗(Cantuzumab ravtansine)、卡普赛珠单抗(Caplacizumab)、卡罗单抗喷地肽(Capromab pendetide)、卡鲁单抗(Carlumab)、卡妥索单抗(Catumaxomab)、cBR96-多柔比星免疫缀合物、西利珠单抗(Cedelizumab)、聚乙二醇化赛妥珠单抗(Certolizumabpegol)、西妥昔单抗(Cetuximab)、泊西他珠单抗(Citatuzumab bogatox)、西妥木单抗(Cixutumumab)、克莱赞珠单抗(Clazakizumab)、克立昔单抗(Clenoliximab)、替可利妥珠单抗(Clivatuzumab tetraxetan)、可那木单抗(Conatumumab)、可丝珠单抗(Concizumab)、克仁珠单抗(Crenezumab)、CR6261、达西珠单抗(Dacetuzumab)、达利珠单抗(Daclizumab)、达罗妥珠单抗(Dalotuzumab)、达雷木单抗(Daratumumab)、登西珠单抗(Demcizumab)、地诺单抗(Denosumab)、地莫单抗(Detumomab)、地努图希单抗(Dinutuximab)、阿托度单抗(Dorlimomab aritox)、德罗图单抗(Drozitumab)、杜利妥单抗(Duligotumab)、度匹鲁单抗(Dupilumab)、度伐鲁单抗(Durvalumab)、杜氏图单抗(Dusigitumab)、依美昔单抗(Ecromeximab)、艾库组单抗(Eculizumab)、埃巴单抗(Edobacomab)、依决洛单抗(Edrecolomab)、依法利珠单抗(Efalizumab)、依夫单抗(Efungumab)、依德鲁单抗(Eldelumab)、埃罗妥珠单抗(Elotuzumab)、艾西莫单抗(Elsilimomab)、依那妥珠单抗(Enavatuzumab)、聚乙二醇化恩莫单抗(Enlimomab pegol)、依诺珠单抗(Enokizumab)、恩曲单抗(Enoticumab)、恩司昔单抗(Ensituximab)、西依匹妥莫单抗(Epitumomabcituxetan)、依帕珠单抗(Epratuzumab)、厄利珠单抗(Erlizumab)、厄马索单抗(Ertumaxomab)、依那西普、埃达珠单抗(Etaracizumab)、埃图力珠单抗(Etrolizumab)、依伏库单抗(Evolocumab)、艾韦单抗(Exbivirumab)、法索单抗(Fanolesomab)、法拉莫单抗(Faralimomab)、法利珠单抗(Farletuzumab)、法希姆单抗(Fasinumab)、FBTA05、非维珠单抗(Felvizumab)、非扎奴单抗(Fezakinumab)、芬克拉妥珠单抗(Ficlatuzumab)、芬妥木单抗(Figitumumab)、弗兰托单抗(Flanvotumab)、芳妥珠单抗(Fontolizumab)、弗罗鲁单抗(Foralumab)、福拉韦单抗(Foravirumab)、夫苏木单抗(Fresolimumab)、弗兰单抗(Fulranumab)、弗妥昔单抗(Futuximab)、加利昔单抗(Galiximab)、盖尼塔单抗(Ganitumab)、更汀芦单抗(Gantenerumab)、加维莫单抗(Gavilimomab)、吉妥珠单抗奥唑米星(Gemtuzumab ozogamicin)、吉伏珠单抗(Gevokizumab)、吉瑞妥昔单抗(Girentuximab)、戈利巴图木单抗-维度汀(Glembatumumab vedotin)、戈利木单抗(Golimumab)、戈利昔单抗(Gomiliximab)、古塞库单抗(Guselkumab)、伊巴珠单抗(Ibalizumab)、替坦异贝莫单抗(Ibritumomab tiuxetan)、依库单抗(Icrucumab)、伊戈伏单抗(Igovomab)、IMAB362、英西单抗(Imciromab)、英加妥珠单抗(Imgatuzumab)、英克拉库单抗(Inclacumab)、拉茚达昔单抗(Indatuximab ravtansine)、英夫利昔单抗(Infliximab)、英妥木单抗(Intetumumab)、伊诺莫单抗(Inolimomab)、伊珠单抗奥唑米星(Inotuzumab 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merpentan)、奥卡拉妥珠单抗(Ocaratuzumab)、奥瑞珠单抗(Ocrelizumab)、奥度莫单抗(Odulimomab)、奥法木单抗(Ofatumumab)、奥拉单抗(Olaratumab)、奥鲁凯珠单抗(Olokizumab)、奥马珠单抗(Omalizumab)、奥那妥珠单抗(Onartuzumab)、奥妥希珠单抗(Ontuxizumab)、莫奥珠单抗(Oportuzumab monatox)、奥戈伏单抗(Oregovomab)、奥泰单抗(Orticumab)、奥昔珠单抗(Otelixizumab)、奥乐妥珠单抗(Otlertuzumab)、欧西鲁单抗(Oxelumab)、奥扎尼珠单抗(Ozanezumab)、奥佐利珠单抗(Ozoralizumab)、帕昔单抗(Pagibaximab)、帕利珠单抗(Palivizumab)、帕尼单抗(Panitumumab)、帕尼库单抗(Pankomab)、帕诺库单抗(Panobacumab)、帕沙珠单抗(Parsatuzumab)、帕考珠单抗(Pascolizumab)、帕特立珠单抗(Pateclizumab)、帕图单抗(Patritumab)、派姆单抗(Pembrolizumab)、培图莫单抗(Pemtumomab)、帕科珠单抗(Perakizumab)、帕妥珠单抗(Pertuzumab)、培克珠单抗(Pexelizumab)、匹迪丽珠单抗(Pidilizumab)、匹那珠单抗-维度汀(Pinatuzumabvedotin)、平妥莫单抗(Pintumomab)、普拉库鲁单抗(Placulumab)、泊拉珠单抗-维度汀(Polatuzumab vedotin)、普恩珠单抗(Ponezumab)、普立昔单抗(Priliximab)、普陀昔单抗(Pritoxaximab)、普立木单抗(Pritumumab)、PRO 140、坤立珠单抗(Quilizumab)、雷库图单抗(Racotumomab)、雷德图单抗(Radretumab)、雷韦单抗(Rafivirumab)、雷莫芦单抗(Ramucirumab)、雷珠单抗(Ranibizumab)、雷昔库单抗(Raxibacumab)、瑞加韦单抗(Regavirumab)、瑞利珠单抗(Reslizumab)、利妥木单抗(Rilotumumab)、利克珠单抗(Risankizumab)、利妥昔单抗(Rituximab)、罗妥木单抗(Robatumumab)、罗勒杜单抗(Roledumab)、罗姆苏珠单抗(Romosozumab)、罗利珠单抗(Rontalizumab)、罗维珠单抗(Rovelizumab)、鲁利珠单抗(Ruplizumab)、萨马利珠单抗(Samalizumab)、沙鲁单抗(Sarilumab)、沙妥莫单抗喷地肽(Satumomab pendetide)、苏金单抗(Secukinumab)、司里班妥单抗(Seribantumab)、斯图希单抗(Setoxaximab)、司韦单抗(Sevirumab)、西罗珠单抗(Sibrotuzumab)、西法木单抗(Sifalimumab)、司妥昔单抗(Siltuximab)、西姆妥珠单抗(Simtuzumab)、西利珠单抗(Siplizumab)、希瑞库单抗(Sirukumab)、苏兰珠单抗(Solanezumab)、索利托单抗(Solitomab)、索耐珠单抗(Sonepcizumab)、松妥珠单抗(Sontuzumab)、司他芦单抗(Stamulumab)、硫索单抗(Sulesomab)、索维单抗(Suvizumab)、他巴卢单抗(Tabalumab)、替他珠单抗(Tacatuzumab tetraxetan)、他度珠单抗(Tadocizumab)、他利珠单抗(Talizumab)、他尼珠单抗(Tanezumab)、帕他莫单抗(Taplitumomab paptox)、替非珠单抗(Tefibazumab)、阿替莫单抗(Telimomab aritox)、替妥莫单抗(Tenatumomab)、替奈昔单抗(Teneliximab)、替利珠单抗(Teplizumab)、替普单抗(Teprotumumab)、替西木单抗(Ticilimumab)、蒂尔他昔单抗(Tildrakizumab)、替加珠单抗(Tigatuzumab)、托珠单抗(Tocilizumab)、托利珠单抗(Toralizumab)、托西莫单抗(Tositumomab)、百克沙(Bexxar)、托维图单抗(Tovetumab)、曲洛青木单抗(Tralokinumab)、曲妥珠单抗(Trastuzumab)、曲加立珠单抗(Tregalizumab)、替西木单抗(Tremelimumab)、妥克妥珠单抗-西莫白介素(Tucotuzumab celmoleukin)、妥韦单抗(Tuvirumab)、乌妥昔单抗(Ublituximab)、优卢单抗(Urelumab)、乌珠单抗(Urtoxazumab)、优特克单抗(Ustekinumab)、万替珠单抗(Vantictumab)、伐利昔单抗(Vapaliximab)、瓦替利珠单抗(Vatelizumab)、维多珠单抗(Vedolizumab)、维妥珠单抗(Veltuzumab)、维帕莫单抗(Vepalimomab)、维西库单抗(Vesencumab)、维西珠单抗(Visilizumab)、伏洛昔单抗(Volociximab)、伏司妥珠单抗-马佛多汀(Vorsetuzumab mafodotin)、伏妥昔单抗(Votumumab)、扎鲁木单抗(Zalutumumab)、扎木单抗(Zanolimumab)、扎妥昔单抗(Zatuximab)、齐拉木单抗(Ziralimumab)、阿佐莫单抗(Zolimomab aritox)、或其任何组合。重要的是，本发明提供了任何抗体的递送，无论它的靶标在细胞内和/或细胞外。本发明的EV有效内化抗体的能力代表了单克隆抗体发展中的阶跃变化并且可以使得能够靶向靶细胞的整个细胞内隔室内的抗原和靶标。重要的是，根据本发明的抗体和含有Fc的蛋白质可以有利地被标记以用于检测和成像目的，例如使用荧光团、MRI剂、PET剂、放射剂、酶、纳米颗粒、金属、有机和无机化合物等。

应当了解的是，可以在不脱离本发明的范围的情况下对上述示例性方面、实施方案、替代方案、以及变化方案进行修改。现在将通过所附实施例进一步举例说明本发明，所述实施例当然也可以在不脱离本发明的范围和精神的情况下进行相当大的修改。

实验部分

材料和方法

构建体设计和克隆：已经构建了包含至少一种外泌体多肽和至少一种Fc结合多肽的各种融合蛋白，将其克隆到载体中并且在几种不同的EV产生细胞来源中产生。通常通过合成产生ORF并且将其克隆到哺乳动物表达载体pSF-CAG-Amp中。简单地说，根据制造商的说明书(NEB公司)，用酶NotI和SalI消化合成的DNA和载体质粒。根据制造商的说明书(NEB公司)，使用T4连接酶将限制的纯化的DNA片段连接在一起。通过在补充氨苄西林(ampicillin)的平板上进行细菌转化来选择成功的连接事件。根据制造商的说明书，通过′大量制备法(maxi-prep)′产生用于转染的质粒。

在含有Fc的蛋白质在表达融合蛋白的相同的EV产生细胞来源中内源性产生的情况下，购买ORF序列(傲锐东源科技公司(Origene Technologies，Inc.))并且将其扩增和克隆到pIRES双顺反子表达载体(Clonetech Laboratories公司)的MSC A位点中以使得在翻译时，外泌体多肽在一个构建体中与Fc结合多肽融合，而所关注的含有Fc的蛋白质被单独翻译(从单独的构建体或从同一构建体)并且转运到待在EV产生细胞来源中形成的EV中。使用NEBuilder高保真度DNA组装克隆试剂盒(NEB公司)进行大部分的克隆并且使用桑格测序(Sanger sequencing)(Source BioScience公司)确认。pIRES载体使得能够同时双顺反子表达这两个转基因，从而确保EV产生细胞将同时表达融合蛋白和所关注的含有Fc的蛋白质这两者。根据制造商的建议，将质粒转化到NEB 5-α感受态大肠杆菌细胞(NEB公司)中并且在振荡孵育箱中培养过夜。根据制造商的说明书，使用′大量制备质粒DNA纯化试剂盒′(快而精公司(Qiagen))分离和纯化质粒。

·细胞培养和转染

根据实验设计和测定，在某些情况下，在常规的二维细胞培养物中进行非病毒瞬时转染和外泌体产生，而在其它情况下，使用病毒介导的转导来产生稳定的细胞系，通常将其培养在不同类型的生物反应器中。为简明起见，在本文仅提到几个实例。

通常将HEK293T细胞接种到15cm培养皿(每个培养皿9×10⁶个细胞)中并且在如由ATCC所推荐的含有血清的DMEM中静置过夜。第二天，将细胞用直接添加到细胞上的脂质复合DNA瞬时转染。简单地说，将DNA和聚乙烯亚胺(PEI)分别在OptiMEM中孵育5分钟，之后在室温下组合在一起20分钟。将脂质复合DNA和细胞共孵育6小时，之后，将条件培养基更换成OptiMEM，持续48小时。在培养皿、烧瓶以及其它细胞培养容器中评价的其它细胞和细胞系包括骨髓来源的间充质基质细胞(BM-MSC)和脐带胶样组织来源的MSC(WJ-MSC)、羊膜细胞、成纤维细胞、各种内皮和上皮细胞、以及各种免疫细胞和细胞系。

在病毒转导和产生用于融合蛋白和所关注的含有Fc的蛋白质的各种组合的稳定细胞系的情况下，通常使用慢病毒(LV)对细胞来源进行病毒转导，如BM-MSC、WJ-MSC、成纤维细胞、羊膜细胞、成纤维细胞、各种内皮和上皮细胞。通常，在感染之前24小时，将100.000个细胞(例如成纤维细胞、MSC等)或200.000个细胞(例如HEK293T)平板接种在6孔板中。添加2μL的LV和任选的凝聚胺(Polybrene)(或海地美溴铵(hexadimethrine bromide)，孔中的最终浓度是8μg/mL)，并且在转导后24小时，将转导细胞的细胞培养基更换成新鲜的完全培养基。在转导后72小时，进行嘌呤霉素选择(4μg/ml-6μg/ml)，通常持续7天，继而分析包含外泌体多肽和Fc结合多肽的融合蛋白构建体的稳定表达。

在二维培养物中或在生物反应器(通常是中空纤维生物反应器或搅拌釜式生物反应器)中培养稳定的细胞，随后收获条件培养基以用于外泌体制备。进行各种制备和纯化步骤。标准工作流程包括以下步骤：预先清除上清液；基于过滤进行浓缩；基于色谱法去除蛋白质污染物；以及任选地在合适的缓冲液中配制所得的外泌体组合物以用于体外和/或体内测定。

·测定和分析

蛋白质印迹法是评价EV中融合蛋白的富集的非常方便的分析方法。简单地说，根据制造商的说明书(英杰公司(Invitrogen)，Novex PAGE 4％-12％凝胶)进行SDS-PAGE，其中每个孔上样1×10¹⁰个外泌体和20μg的细胞裂解物。根据制造商的说明书(Immobilon，英杰公司)将蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移到PVDF膜。将膜在Odyssey封闭缓冲液(Licor公司)中封闭并且根据供应商的说明书(一抗：艾博抗公司(Abcam)，二抗：Licor公司)用针对Fc结合多肽和/或外泌体蛋白的抗体探测。将分子探针在680nm和800nm波长处可视化。

对于EV尺寸确定，使用配备有分析软件的NanoSight仪器进行纳米颗粒跟踪分析(NTA)。对于所有记录，我们使用13或15的照相机级别和自动功能以用于所有采集后设置。电子显微镜术和荧光显微镜术经常用于了解细胞内位置和释放以及定量和分析EV。

使用多种方法来分离和纯化EV，通常使用过滤(如TFF)和LC(特别是珠粒洗脱LC)的组合。通常，收集合有EV的培养基并且以300g进行低速旋转5分钟，继而进行2000g旋转10分钟以去除较大的颗粒和细胞碎片。然后用0.22μm注射式过滤器过滤上清液并且进行不同的纯化步骤。使用具有100kDa截止过滤器的Vivaflow 50R切向流(TFF)装置(赛多利斯公司(Sartorius))或具有100kDa或300kDa截止中空纤维过滤器的KR2i TFF系统(SpectrumLabs公司)将大体积渗滤和浓缩到约20ml。随后将预浓缩的培养基加到与plus或Pure 25色谱系统(通用电气医疗集团生命科学部(GE Healthcare LifeSciences))连接的珠粒洗脱柱(HiScreen或HiTrap Capto Core 700柱，通用电气医疗集团生命科学部)上。根据制造商的说明书选择用于柱平衡的流速设置、样品加载以及柱就地清洗程序。根据UV吸光度色谱图收集样品并且使用Amicon Ultra-15 10kDa分子量截止旋转过滤器(密理博公司(Millipore))浓缩到100μl的最终体积并且储存在-80℃以用于进一步的下游分析。为了评估蛋白质和RNA洗脱曲线，使用KR2i TFF系统，使用100kDa和300kDa中空纤维过滤器浓缩和渗滤培养基并且在Tricorn 10/300琼脂糖凝胶4快速流动(S4FF)柱(通用电气医疗集团生命科学部)上分析样品。

·实施例

实施例1：使IgG与包含Fc结合多肽的EV(Fc结合EV)结合

使用300kd中空纤维柱进行切向流过滤来从来自工程化的HEK293T细胞(对照或稳定表达Gp130细胞外结构域-2×GGGGS接头-Z结构域-Gp130跨膜结构域-亮氨酸拉链-N末端多配体蛋白聚糖结合蛋白-His标签的Fc结合构建体)的条件培养基中分离EV，继而使用10kd旋转过滤器进行超滤以浓缩。然后使用电子显微镜术和流式细胞术评估Fc结合EV对IgG的结合能力。

对于电子显微镜术，在37℃将1×10^9个EV与和金纳米颗粒缀合的兔抗山羊10nm抗体一起孵育2小时。如图2中所示，Fc结合EV(A)被纳米金标记的抗体(即含有Fc的蛋白质)修饰，而对照EV(B)没有结合任何抗体。

对于流式细胞术，将1×10^8个EV在轨道振荡器上以450rpm在120μl的PBS中与来自人类MACSPlex外泌体试剂盒(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotec)，订单号：130-108-813)的15μl抗体包被的捕捉珠粒一起孵育过夜，持续16小时。在洗涤之后，将3μg的AlexaFluor647缀合的人类IgG Fc片段(杰克逊实验室公司(Jackson Laboratories)，目录号009-600-008)添加到没有EV的对照(A)、对照EV(B)、或Fc结合EV(多配体蛋白聚糖结合蛋白-gp130-z结构域-gp130)(C)中。在室温下孵育1小时之后，洗掉未结合的Fc片段并且经由流式细胞术分析样品。在图3中，对应的左侧点图示出了使用B1-A(激发：488nm，发射滤光片：500nm-550nm；面积)或B2-A(激发：488nm，发射滤光片：565nm-605nm，面积)参数的硬染色的捕捉珠粒群体。对应的右图示出了R1-A(激发：635nm，发射滤光片：655nm-730nm，面积)或B2-A参数，证实了仅在(C)中AlexaFluor647标记的Fc片段与EV结合，所述EV已经与捕捉珠粒结合。图3显示Fc结合EV与AlexaFluor647标记的Fc片段(人类IgG)结合并且也非常有效地与试剂盒中所包括的由制造商在所有捕捉珠粒群体上包被的所有39种不同抗体的Fc结构域结合，包括两个阴性对照珠粒群体在内。

实施例2：用于递送抗HER2抗体的FCGR1A Lamp2B EV

使用超滤和尺寸排阻色谱法从HEK293T细胞(稳定表达FCGR1A细胞外结构域-4×GS接头-Lamp2b或它们的野生型对照)中分离EV。将EV用PKH26红色荧光染料标记，并且通过将EV和抗体在37℃共孵育1小时来用抗HER2抗体或它的同种型对照修饰。通过尺寸排阻色谱法去除未结合的抗体。使用流式细胞术在低表达HER2的细胞系MDA-MB-231中和在高表达HER2的细胞系MDA-MB-361中对抗体修饰的EV的摄取进行表征。图4显示抗HER2抗体仅在高表达HER2的细胞系MDA-MB-361中与同种型对照修饰的EV和野生型EV相比增加修饰的EV的摄取，而在低表达HER2的细胞系MDA-MB-231中不是这样。使用表达CD63-ZZ融合蛋白的EV获得类似的结果。

实施例3：包含CD81-蛋白A/G融合蛋白的EV对依那西普的递送

使用超滤和尺寸排阻色谱法从HEK293T细胞(稳定表达CD81-蛋白A/G CD81第二环融合蛋白或它们的野生型对照)中分离EV。通过将EV和依那西普在37℃共孵育1小时来将EV用依那西普或对照抗体修饰。通过尺寸排阻色谱法去除未结合的依那西普。为了研究依那西普修饰的EV的抗炎作用，使用经过充分研究的TNBS诱发的结肠炎小鼠模型。该模型模拟了与IBD患者相关的肠道炎症、细胞因子风暴和体重减轻。将24只小鼠分成四个处理组，每组有6只小鼠。在诱发结肠炎之前1周，通过在皮肤上施用150μl的含有2％TNBS的橄榄油乙酸盐溶液来对小鼠进行预致敏。然后通过给予100μl在40％乙醇中含有1.5％TNBS的溶液的直肠输注来诱发结肠炎。在诱发结肠炎后立即，在尾静脉中静脉内施用200μl的10E10个EV/g的EV。图5显示与野生型EV或对照修饰的EV相反，依那西普包被的EV保护小鼠防止体重减轻，并且显示出比裸依那西普更高的活性，这可能是因为当依那西普被多重化时和/或当Fc结合多肽与它的Fc结构域结合时依那西普与TNFα之间的亲和力更高。

实施例4：抗体经由Fc结合EV的细胞内摄取和递送

使用超滤和尺寸排阻色谱法从脐带胶样组织来源的MSC(稳定表达TNFR细胞外结构域-2×GGGGS接头-Z结构域-TNFR跨膜结构域-foldon-N末端多配体蛋白聚糖结合蛋白融合蛋白或对照)的条件培养基中分离EV。为了研究Fc结合EV是否可以用于细胞内递送Ab，将4×10^11个EV在400μl中与总共3μg的AlexaFluor488标记的抗Lamin B2 IgG[abcamab200426，兔单克隆EPR9701(B)]一起孵育16小时(过夜)。对于摄取实验，将Huh7细胞以每孔30,000个细胞平板接种到48孔板中并且孵育16小时，之后添加0.675×10^11个抗体标记的EV。将细胞在加湿气氛中在37℃和5％CO₂下孵育2小时，之后对它们进行胰蛋白酶消化并且通过荧光显微镜术(A)和流式细胞术(B)分析，如图6；A)中所示，显示了与相衬图像合并的绿色荧光信号。B)中的直方图示出了x轴上对数刻度上的绿色荧光强度和y轴上的归一化频率。1：没有经过任何抗体或EV处理的HuH7细胞。2：经过与抗Lamin B2抗体一起孵育的对照EV处理的HuH7细胞。3：经过与抗Lamin B2抗体一起孵育的Fc结合EV处理的HuH7细胞。图6显示在经过Fc结合EV加上抗体处理的细胞中明显存在荧光抗体的信号，而在未处理细胞(1)或对照EV处理的细胞(2)中不存在荧光信号。这表明抗体可以经由Fc结合EV细胞内递送，并且与EV结合显著增加了细胞对抗体的摄取。

为了证实功能性细胞内递送，将抗NFkB抗体(抗NFkB-Ab)与对应的EV在37℃一起孵育1小时。将报告细胞系，即稳定表达NFkB-荧光素酶的HEK细胞用5ng/ml的hTNF-α和EV-Ab混合物处理。在处理6小时之后，测量荧光素酶活性。图7显示了当通过Fc结合EV递送抗NFkB-ab时的成功抑制。

实施例5：使用被抗整合素-4-α-Ab修饰的Fc结合EV治疗EAE

通过在免疫接种后两天并且在同一天皮下注射100μl的MOG_35-55-CFA乳液并且腹膜内注射400ng的百日咳毒素对C57BL/6小鼠诱发实验性自身免疫性脑炎(EAE)。如实施例1中所述，从骨髓来源的MSC(稳定表达CD9-ZZ(融合构建体，包含与作为非限制性实例的SEQ IDNO 74可操作地连接的作为非限制性实例的SEQ ID NO 1)结构域融合蛋白或它们的野生型对照)的条件培养基中分离EV。将抗整合素-4-α抗体(Ab)与对应的EV(zzEV或对照EV)一起孵育。在第7天时在存在或不存在EV的情况下向EAE小鼠注射抗整合素-4a-Ab。图8显示对照EV以及抗整合素-4a-Ab本身显示出中度的防止EAE发展的保护作用，而与抗整合素-4a-Ab一起孵育的zzEV显示出对EAE发展的几乎完全抑制。

实施例6：通过使用Fc结合EV递送Fc-Cas9核酸内切酶进行靶向基因组缺失

如实施例1中所述，从获自脂肪细胞(稳定转染FCGR1A细胞外结构域-4×GS接头-Lamp2b融合蛋白或作为对照的Lamp2b GFP)的细胞培养基中纯化EV。使用不同量的EV(100μg、500μg、2.5mg、5mg以及10mg)，而靶向HPRT的Fc(IGHG1)标记的Cas9向导RNA复合物(所谓的RNP复合物)的量保持在100μg。Cas9复合物与EV的最终重量比分别是1∶1、1∶5、1∶25、1∶50以及1∶100并且在22℃孵育60分钟。使用1∶5的Cas9复合物与EV的重量比获得了Cas9在EV上的最大负载，通过超滤去除游离的Cas9复合物。然后使用负载Cas9的Fc+脂肪细胞-EV以不同的浓度处理Huh7细胞。在24小时之后，收获细胞并且根据制造商的方案使用GeneArt基因组切割检测试剂盒(赛默科技公司(Thermo scientific))以制备样品基因组切割测定并且在2％琼脂糖凝胶上进行电泳。然后使用Image J软件定量插入缺失。图9显示靶细胞中的剂量依赖性基因编辑。还在相同的设置中评价了各种其它对的Fc结合多肽和与Cas9融合的Fc结构域。还在相同的设置中评价了人类FCAMR(IgA和IgM结合)、人类FCGR3A(IgG结合)、以及人类FCGRB(IgG结合)，它们与CD83融合并且与和几种不同的人类Fc结构域(例如IGHM、IGHA1、IGHG1等)融合的Cas9组合。总之，所有构建体都显示出基因编辑活性，但是与FCGR1A细胞外结构域-4×GS接头-Lamp2b融合蛋白相比，具有更低的效能(数据未示)。

实施例7：使用人类Fc/pH值感受蛋白G复合物用可溶性溶酶体蛋白修饰EV

评价与各种外泌体蛋白，如CD63、Lamp2、以及转铁蛋白受体融合的蛋白G的C2结构域的表达和EV展示水平。为了促进溶酶体蛋白拴系到EV的表面，使人类Fc结构域(源自于IgG)(hFc)与酶GBA的N末端或C末端融合。在N末端融合构建体的情况下，在GBA原生的信号肽之后插入hFc结构域。使这两种构建体共表达引起EV对GBA的显著富集，比野生型GBA的过表达更多。除了蛋白G的野生型C2结构域之外，pH值感受C2结构域也以先前所述的方式展示在EV表面上。虽然pH值感受C2结构域具有有效结合人类Fc区的能力，但是在pH 4下，复合物形成的亲和力下降超过一千倍。在由pH值感受C2结构域EV修饰的GBA被细胞摄取后，它们被运输到溶酶体隔室。在所述隔室的低pH值内，拴系的GBA和pH值感受c2结构域解离，从而有助于游离的未拴系的GBA在溶酶体的内腔内存在。

在37℃将从产生野生型外泌体、蛋白G的C2结构域修饰的外泌体或蛋白G的pH值感受C2结构域修饰的外泌体的Hek293T细胞中分离的条件培养基与来自表达野生型GBA或人类Fc-GBA融合体的Hek293T细胞的条件培养基组合1小时。此外，进行共孵育，其中将条件培养基酸化到pH 4。然后通过超滤和珠粒洗脱色谱法分离EV。为了评估外泌体拴系的GBA的水平，通过蛋白质印迹法分析纯化的囊泡并且探测GBA的存在。为了评估携带GBA的外泌体的GBA活性，将患者来源的GBA缺陷型成纤维细胞与GBA富集的外泌体共孵育并且在48小时后分析葡萄糖神经酰胺水平。图10显示了该实验的结果：WT：野生型Hek293t外泌体；GBA：野生型GBA；hFc-GBA：人类Fc片段-GBA融合体；PG：用蛋白G的C2结构域修饰的外泌体；PGpH：用pH值感受蛋白G的C2结构域修饰的外泌体。n＝3。在类似的实验中，还在相同的设置中评价了作为Fc结合多肽的蛋白L和蛋白LG，产生类似的结果(数据未示)。

实施例8：包被有与人类Fc结构域融合的负载siRNA的Ago2的EV产生包含Lamp2b与Fc结合多肽ZZ之间的融合蛋白的EV并且使用超滤和珠粒洗脱色谱法从Hek293T细胞中分离。使hFc-Ago2融合蛋白在Hek293T细胞中表达并且通过亲和色谱法分离，之后，将所述融合蛋白在分子过量的针对细胞周期蛋白D的siRNA中孵育过夜。通过第二轮的亲和纯化去除过量的siRNA。将5×10⁶个负载的EV与10⁵个U2OS细胞共孵育过夜，之后在48小时之后，收获细胞并且评估细胞周期蛋白D水平。对于体内研究，将1×10⁶个A549细胞与1∶1比率的基质胶混合并且皮下注射到NCRNU小鼠体内。每隔一天，使用尾静脉施用，用10⁷个负载siRNA的外泌体对荷瘤小鼠进行处理。在研究过程中，使用卡尺测量来计算肿瘤体积。在用展示在Lamp2b-ZZ结构域EV表面上的负载siRNA的Ago2处理U2OS细胞之后的细胞周期蛋白D水平显示出显著的靶标沉默，如图11中所示。对于+ve对照，直接转染siCyclin D。hFc表示外泌体表面展示；siCyclin表示抗细胞周期蛋白D siRNA；siScr：乱序序列。n＝3。

Claims

1.一种EV，所述EV包含至少一种融合蛋白，其中所述至少一种融合蛋白包含与至少一种外泌体多肽融合的至少一种Fc结合多肽。

2.根据权利要求1所述的EV，其中所述至少一种Fc结合多肽选自包括以下各项的组：蛋白A、蛋白G、蛋白A/G、蛋白L、蛋白LG、Z结构域、ZZ结构域、人类FCGRI、人类FCGR2A、人类FCGR2B、人类FCGR2C、人类FCGR3A、人类FCGR3B、人类FCGRB、人类FCAMR、人类FCERA、人类FCAR、小鼠FCGRI、小鼠FCGRIIB、小鼠FCGRIII、小鼠FCGRIV、小鼠FCGRn、SPH肽、SPA肽、SPG2、SpA模拟物1、SpA模拟物2、SpA模拟物3、SpA模拟物4、SpA模拟物5、SpA模拟物6、SpA模拟物7、SpA模拟物8、SpA模拟物9、SpA模拟物10、Fcγ模拟物1、Fcγ模拟物2、以及其任何组合。

3.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述至少一种Fc结合多肽包含多于一个Fc结合区。

4.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述至少一种外泌体多肽选自包括以下各项的组：CD9、CD53、CD63、CD81、CD54、CD50、FLOT1、FLOT2、CD49d、CD71、CD133、CD138、CD235a、ALIX、多配体蛋白聚糖结合蛋白-1、多配体蛋白聚糖结合蛋白-2、Lamp2b、TSPAN8、TSPAN14、CD37、CD82、CD151、CD231、CD102、NOTCH1、NOTCH2、NOTCH3、NOTCH4、DLL1、DLL4、JAG1、JAG2、CD49d/ITGA4、ITGB5、ITGB6、ITGB7、CD11a、CD11b、CD11c、CD18/ITGB2、CD41、CD49b、CD49c、CD49e、CD51、CD61、CD104、Fc受体、白细胞介素受体、免疫球蛋白、CD2、CD3ε、CD3ζ、CD13、CD18、CD19、CD30、CD34、CD36、CD40、CD40L、CD44、CD45、CD45RA、CD47、CD86、CD110、CD111、CD115、CD117、CD125、CD135、CD184、CD200、CD279、CD273、CD274、CD362、COL6A1、AGRN、EGFR、GAPDH、GLUR2、GLUR3、HLA-DM、HSPG2、L1CAM、LAMB1、LAMC1、LFA-1、LGALS3BP、Mac-1α、Mac-1β、MFGE8、SLIT2、STX3、TCRA、TCRB、TCRD、TCRG、VTI1A、VTI1B、其它外泌体多肽、以及其任何组合。

5.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述至少一种Fc结合多肽展示在所述EV的外表面上。

6.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述至少一种Fc结合多肽与至少一种含有Fc的蛋白质结合。

7.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述EV具有与它结合的多个含有Fc的蛋白质，所述结合是经由所述Fc结合多肽与所述多个含有Fc的蛋白质的Fc结构域之间的相互作用而实现的，其中所述多个含有Fc的蛋白质可以是相同的或不同的。

8.根据前述权利要求中任一项所述的EV，其中所述至少一种含有Fc的蛋白质是抗体和/或被工程化以包含Fc结构域的蛋白质。

9.根据权利要求8所述的EV，其中所述抗体是靶向抗体、治疗性抗体、抗体-药物缀合物(ADC)、或用于减少调理作用和/或免疫细胞介导的清除的抗体。

10.根据权利要求6至9中任一项所述的EV，其中所述结合有至少一种含有Fc的蛋白质的EV具有与它结合的至少10个，优选地至少20个，甚至更优选地至少30个含有Fc的蛋白质。

11.根据权利要求6至10中任一项所述的EV，其中所述至少一种含有Fc的蛋白质存在于所述EV内部、所述EV的脂质膜中和/或与所述EV的外表面连接。

12.一种(i)融合蛋白与(ii)含有Fc的蛋白质之间的非共价复合物，其特征在于所述融合蛋白包含与至少一种外泌体多肽融合的至少一种Fc结合多肽，其中所述Fc结合多肽与所述含有Fc的蛋白质结合。

13.根据权利要求12所述的非共价复合物，其中所述非共价复合物存在于EV的脂质膜中和/或EV内部。

14.一种药物组合物，所述药物组合物包含根据权利要求1至11中任一项所述的EV和/或根据权利要求12至13中任一项所述的非共价复合物、以及任选的药学上可接受的载体。

15.根据权利要求1至11中任一项所述的EV、和/或根据权利要求12至13中任一项所述的非共价复合物、和/或根据权利要求14所述的药物组合物，其用于医学中。

16.一种用于使至少一种含有Fc的蛋白质与细胞外囊泡(EV)连接的方法，所述方法包括以下步骤：

(i)提供包含融合蛋白的EV，所述融合蛋白包含至少一种Fc结合多肽和至少一种外泌体多肽；

(ii)使所述融合蛋白的Fc结合多肽结合所述至少一种含有Fc的蛋白质的Fc结构域。

17.一种多肽构建体，所述多肽构建体包含融合蛋白，所述融合蛋白包含至少一种Fc结合多肽和至少一种外泌体多肽。

18.一种多核苷酸构建体，所述多核苷酸构建体编码至少一种根据权利要求17所述的多肽构建体。

19.一种细胞，所述细胞包含至少一种根据权利要求17所述的多肽构建体、至少一种根据权利要求18所述的多核苷酸构建体、至少一种根据权利要求1至11中任一项所述的EV和/或至少一种根据权利要求12至13中任一项所述的非共价复合物。

20.一种用于将至少一种含有Fc的蛋白质递送到靶细胞的方法，所述方法包括(i)使所述至少一种含有Fc的蛋白质的Fc结构域与包含在EV中的Fc结合多肽连接；以及(ii)使所述连接有所述至少一种含有Fc的蛋白质的EV与所述靶细胞接触。

21.根据权利要求20所述的方法，其中所述方法在体外、体内和/或离体进行。

22.根据权利要求20至21中任一项所述的方法，其中所述EV的Fc结合多肽是与至少一种外泌体多肽的融合蛋白的一部分。

23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中将所述含有Fc的蛋白质递送到靶细胞中。