CN112285195A - 一种牛奶外泌体的特征性糖蛋白标志物和牛奶外泌体的特征性标志物分离方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种牛奶外泌体的特征性标志物和牛奶外泌体的特征性标志物分离方法，所述标志物为N‑连接糖蛋白，所述N‑连接糖蛋白分别为血小板糖蛋白4(CD36)，钠依赖的磷酸转运蛋白2B(NPT2B)，二者均未被检测到在乳清蛋白中。本发明筛选得到了2种可靠的牛奶外泌体特征性N‑连接糖蛋白作为牛奶外泌体的标志物，利用该2种特征性N‑连接糖蛋白能够实现简便、快速的鉴定外泌体，对于临床靶向载药的研究具有实际意义。

Description

一种牛奶外泌体的特征性糖蛋白标志物和牛奶外泌体的特征 性标志物分离方法

技术领域

本发明涉及外泌体鉴定技术领域，特别是涉及一种牛奶外泌体的特征性糖蛋白标志物和牛奶外泌体的特征性标志物分离方法。

背景技术

外泌体是由几乎所有哺乳动物细胞类型，包括肥大细胞、树突细胞、B淋巴细胞、上皮细胞、内皮细胞、脂肪细胞和神经元等分泌的约30-150nm的生物纳米囊泡。目前研究已经确定外泌体可以通过在许多生物过程中递送功能性货物如蛋白质、mRNA和微小RNA(miRNA)并促进细胞通讯。外泌体在生理条件和病理条件下的各种组份可作为治疗靶标，也可在疾病中作为药物或基因递送载体，而牛奶外泌体因为其生物来源和较易获得的优势具有成为完美的靶向药物载体的潜力。蛋白质糖基化是一种重要的翻译后修饰，在哺乳动物中将近50％的蛋白经过糖基化修饰，并且发挥着许多生物学功能，例如细胞通信，病毒感染，免疫反应等。如果糖基化修饰出现缺陷,就会发生先天性糖基化缺陷疾病(CDG),症状表现为:智力发育迟钝、小脑发育不全、运动性共济失调、骨骼畸形等。现在在临床诊断中常用的标志物甲胎蛋白(AFP)也是一种糖蛋白，且带有α-1,6核心岩藻糖修饰的AFP具有更高的灵敏性及特异性。据文献报道，外泌体靶向载药的机制可能是通过外泌体表面糖蛋白与靶向细胞的特异性识别，因此牛奶外泌体N-连接糖蛋白的分析对研究外泌体靶向载药机理至关重要。

由于糖蛋白自身的复杂性(微观不均一性及宏观不均一性)，先前对于蛋白质的糖基化研究多会侧重蛋白或分离的糖链结构上，缺乏糖蛋白糖链结构与功能关系的研究。随着质谱技术在生物大分子上的发展和应用，通过软电离及碰撞诱导裂解等技术进一步将完整糖肽裂解成小片段，测定肽段的分子量，结合分析软件可以同时获得糖链结构，蛋白，位点特异性的糖肽信息等，对于靶向载体上的蛋白质特异性识别提供更加丰富的理论基础。目前对于完整糖肽的分析，仍然存在一些问题例如糖肽富集过程繁琐，耗时长，质谱检测过程离子化效率低，数据分析复杂等，因此对牛奶外泌体糖蛋白进行解析，寻找糖蛋白特征性标志物，为快速、简便鉴定牛奶外泌体提供一种新方法，对于临床靶向载药的研究具有实际意义。

发明内容

本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。在本部分以及本申请的说明书摘要和发明名称中可能会做些简化或省略以避免使本部分、说明书摘要和发明名称的目的模糊，而这种简化或省略不能用于限制本发明的范围。

鉴于上述和/或现有外泌体标志物中存在的问题，提出了本发明。

因此，本发明其中一个目的是，克服现有产品的不足，提供一种牛奶外泌体的特征性标志物，其中：所述牛奶包括外泌体和乳清，所述牛奶外泌体的特征性标志物为外泌体N-连接糖蛋白。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，其中，外泌体N-连接糖蛋白为血小板糖蛋白4(CD36)和钠依赖的磷酸转运蛋白2B(NPT2B)。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，其中，乳清的特征性标志物为乳白蛋白(LALBA)。

本发明另一个目的是，提供一种牛奶外泌体的特征性标志物分离方法，其特征在于：包括如下步骤：

牛奶外泌体的提取：牛奶进行离心，加入等体积的水，调节pH，经离心，上清为乳清，沉淀用PBS重悬后得到外泌体溶液；

蛋白的前处理：得到的外泌体溶液加入尿素后混匀，加入DTT后培育，再加入IAM溶液，超滤后加入碳酸氢铵，去除流出液，加入胰酶，充分混匀后高速离心，收集的流出液，加入碳酸氢铵后超高速离心，合并流出液；

N-连接糖肽的富集：纯化柱中加入ACN、缓冲液、TFA。流出液加入纯化柱中，洗脱，收集洗脱液，洗脱完成后，改变洗脱液组成，再次洗脱，收集洗脱液，得到糖肽；

质谱分析：使用质谱仪对于糖肽进行分析。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，其中质谱分析中特征性标志物为N-连接糖蛋白，包括血小板糖蛋白4(CD36)，钠依赖的磷酸转运蛋白2B(NPT2B)。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，其中外泌体的提取中滤膜为0.22μm滤膜。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，其中蛋白的前处理中胰酶与流出液的质量比为1:40。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，其中N-连接糖肽的富集中洗脱先进行清洗，再洗脱收集，得到非糖肽，再洗脱收集得到糖胎。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，其中N-连接糖肽的富集：纯化柱中加入1mL纯ACN 3次、100mM三乙基乙酸铵缓冲液3次、1％TFA/95％ACN 5次、1％TFA 5次。

为解决上述技术问题，根据本发明的一个方面，其中得到清洗使用的洗脱试剂为1mL 1％TFA，重复4次；得到非糖肽使用的洗脱试剂为1mL的1％TFA/95％ACN，重复3次；所述得到糖肽使用的洗脱试剂为500μL 0.1％TFA/50％ACN。

本发明筛选得到了2种可靠的牛奶外泌体特征性N-连接糖蛋白作为牛奶外泌体的标志物，利用此2种特征性N-连接糖蛋白能够实现简便、快速的鉴定外泌体，对于临床靶向载药的研究具有实际意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。其中：

图1为本发明牛奶外泌体、乳清蛋白分离的实验流程图；

图2为本发明牛奶外泌体电镜图；

图3为本发明牛奶外泌体、乳清N-连接糖肽富集的实验流程图

具体实施方式

为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合说明书实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。

在下面的描述中阐述了很多具体细节以便于充分理解本发明，但是本发明还可以采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似推广，因此本发明不受下面公开的具体实施例的限制。

其次，此处所称的“一个实施例”或“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。在本说明书中不同地方出现的“在一个实施例中”并非均指同一个实施例，也不是单独的或选择性的与其他实施例互相排斥的实施例。

实施例1

牛奶外泌体的提取：取新鲜牛奶200mL，在4℃的条件下13000g离心30min，除去脂肪球和部分酪蛋白，得到脱脂奶。得到的脱脂奶加入等体积的蒸馏水，然后加入2M的HCl调节pH值4.6，沉淀酪蛋白。将浑浊液在4℃，135000g的条件下离心60min，弃上清，得到的沉淀使用无菌PBS溶液清洗3次，并用预冷的PBS重悬，得到外泌体溶液。

蛋白的前处理(变性，还原烷基化，酶切)：去含蛋白量500μg对应的牛奶外泌体溶液，加入150μL的8M尿素溶液，充分混匀。加入DTT溶液，使溶液终浓度为10mmol/L,于56℃孵育45min。加入IAM溶液，使溶液终浓度为20mmol/L，避光室温45min。将样品溶液转移至10kD的超滤管中，12000rpm离心5分钟，去除流出液。加入200μL的40mM碳酸氢铵溶液，12000rpm离心5分钟，去除流出液，重复上述操作3次。更换新的收集管，向超滤管中加入胰酶(1：50，即蛋白量比值)，37℃过夜振荡孵育。继续加入胰酶至终浓度为1：40，37℃振荡孵育4小时。超滤管12000rpm离心5分钟，收集流出液。向超滤管中加入200μL的40mM碳酸氢铵溶液，12000rpm离心5分钟，合并流出液。

N-连接糖肽的富集：依次向纯化柱(上层C18填料，下层MAX填料)中加入1mL纯ACN(3次)、100mM三乙基乙酸铵缓冲液(3次)、1％TFA/95％ACN(5次)、1％TFA(5次)。将糖肽流出液加入纯化柱中，反复上样一次。再加入1mL 1％TFA，反复清洗4次。加入1mL的1％TFA/95％ACN，重复3次，收集洗脱液，即非糖肽。再加入500μL 0.1％TFA/50％ACN，收集洗脱液，即糖肽。

N-连接糖肽样品的质谱解析：用Thermo Scientific公司的EASY-nLC 1200纳升液相系统和高分辨的Orbitrap Fusion Lumos质谱解析牛奶外泌体的N-连接糖肽。将糖肽质谱数据在GPquest 2.0软件中获取。

牛奶乳清N-连接糖蛋白的质谱分析：冻干的牛奶乳清蛋白溶于8M尿素，后续处理参照外泌体实验方法。

本发明得到的外泌体的N-连接糖蛋白分布的质谱数据分析如下：

(1)发现牛奶外泌体中糖蛋白86种，乳清中糖蛋白33种

(2)所有牛奶外泌体86种N-连接糖蛋白，其中血小板糖蛋白4(CD36)，钠依赖的磷酸转运蛋白2B(NPT2B)丰度较高，且未被检测到在乳清蛋白中

(3)所有乳清33种糖蛋白，其中乳白蛋白(LALBA)丰度较高，且未被检测到在外泌体糖蛋白中。

乳清糖蛋白及外泌体糖蛋白共同鉴定到5种糖蛋白，例如粘蛋白-1(MUC1)，粘蛋白-15(MUC15),糖基化依赖的黏附分子1(GLCM1)。

2种外泌体的特征性N-连接糖蛋白，详细信息分别如下：

糖蛋白1(G1)：血小板糖蛋白4(CD36)

糖蛋白2(G2)：钠依赖的磷酸转运蛋白2B(NPT2B)

1种乳清的特征性N-连接糖蛋白，详细信息分别如下：

糖蛋白3(G3)：乳白蛋白(LALBA)。

质谱分析数据如表1和表2所示：

表1牛奶外泌体中特征性标志物钠依赖的磷酸转运蛋白2B(NPT2B)和血小板糖蛋白4(CD36)的质谱监测数据

表2乳清中特征性标志物乳白蛋白(LALBA)的质谱检测数据

本发明筛选得到了2种可靠的牛奶外泌体特征性N-连接糖蛋白，1种可靠的乳清特征性N-连接糖蛋白；利用特征性N-连接糖蛋白，能够实现简便、快速的鉴定外泌体，对于临床靶向载药的研究具有实际意义。

应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。

Claims (10)

1.一种牛奶外泌体的特征性糖蛋白标志物，其特征在于：所述牛奶包括外泌体和乳清，所述牛奶外泌体的特征性标志物为外泌体N-连接糖蛋白。

2.根据权利要求1所述牛奶外泌体的特征性糖蛋白标志物，其特征在于：所述外泌体N-连接糖蛋白为血小板糖蛋白4(CD36)和钠依赖的磷酸转运蛋白2B(NPT2B)。

3.根据权利要求1所述的牛奶外泌体的特征性糖蛋白标志物，其特征在于：所述牛奶还包括乳清，所述乳清的特征性标志物为乳白蛋白(LALBA)。

4.根据权利要求1～3所述的牛奶外泌体的特征性标志物分离方法，其特征在于：包括如下步骤：

牛奶外泌体的提取：牛奶进行离心，加入等体积的水，调节pH，经离心，上清为乳清，沉淀用PBS重悬后得到外泌体溶液；

蛋白的前处理：得到的外泌体溶液加入尿素后混匀，加入DTT后培育，再加入IAM溶液，超滤后加入碳酸氢铵，去除流出液，加入胰酶，充分混匀后高速离心，收集的流出液，加入碳酸氢铵后高速离心，合并流出液；

N-连接糖肽的富集：纯化柱中加入ACN、缓冲液、TFA。流出液加入纯化柱中，两次不同洗脱分别获得非糖肽及糖肽溶液；

质谱分析：使用质谱仪对于糖肽进行分析。

5.根据权利要求1或4所述的牛奶外泌体的特征性标志物分离方法，其特征在于：所述分析中特征性标志物为N-连接糖蛋白，血小板糖蛋白4(CD36)，钠依赖的磷酸转运蛋白2B(NPT2B)。

6.根据权利要求4所述的牛奶外泌体的特征性标志物分离方法，其特征在于：所述外泌体的提取中滤膜为0.22μm滤膜。

7.根据权利要求4所述的牛奶外泌体的特征性标志物分离方法，其特征在于：所述蛋白的前处理中胰酶与流出液的质量比为1:40。

8.根据权利要求4所述的牛奶外泌体的特征性标志物分离方法，其特征在于：所述N-连接糖肽的富集中，肽段结合在柱子上，先进行清洗，再洗脱收集，得到非糖肽，再洗脱收集得到糖肽。

9.根据权利要求8所述的牛奶外泌体的特征性标志物分离方法，其特征在于：所述N-连接糖肽的富集：纯化柱中加入1mL纯ACN 3次、100mM三乙基乙酸铵缓冲液3次、1％TFA/95％ACN 5次、1％TFA 5次。

10.根据权利要求8所述的牛奶外泌体的特征性标志物分离方法，其特征在于：所述得到清洗使用的洗脱试剂为1mL 1％TFA，重复4次；得到非糖肽使用的洗脱试剂为1mL的1％TFA/95％ACN，重复3次；所述得到糖肽使用的洗脱试剂为500μL 0.1％TFA/50％ACN。

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