CN114681387B - 一种动物来源外泌体组合物及其在皮肤创伤修复中的应用 - Google Patents
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- A61K2800/00—Properties of cosmetic compositions or active ingredients thereof or formulation aids used therein and process related aspects
- A61K2800/40—Chemical, physico-chemical or functional or structural properties of particular ingredients
- A61K2800/59—Mixtures
- A61K2800/592—Mixtures of compounds complementing their respective functions
- A61K2800/5922—At least two compounds being classified in the same subclass of A61K8/18
Abstract
本申请涉及生物医药技术领域，具体公开了一种动物来源外泌体组合物及其在皮肤创伤修复中的应用。一种动物来源外泌体组合物，按照重量份数计，包括外泌体10‑20份，小球藻生长因子10‑20份，生育酚乙酸酯0.5‑0.8份，乳清蛋白6‑10份。所述动物来源外泌体组合物能够促进成纤维细胞的增殖，增加Ⅰ型胶原蛋白的含量，使Ⅰ型胶原蛋白的含量提高46.88%以上，减小增生性瘢痕的面积。所述动物来源外泌体组合物能够用在皮肤创伤修复中，减小由创伤引起的增生性瘢痕的面积。
Description
技术领域
本申请涉生物医药技术领域，更具体地涉及一种动物来源外泌体组合物及其在皮肤创伤修复中的应用。
背景技术
增生性瘢痕(hypertrophic scars)是皮肤各类创伤、烧伤、感染、手术等原因引起的病理性变化，因其影响美观，可能造成患者心理上的负担。目前还不能控制创面愈合于适度的状态而避免瘢痕形成，特别是大面积深度皮肤损伤的更为复杂，涉及多种细胞及细胞因子参与细胞组织分化、血管形成等。
有报道指出，间充质干细胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)是一种多功能的自我更新细胞，在再生医学中具有巨大的应用潜力，可用于多种疾病的治疗。间充质干细胞发挥作用的主要原因是间充质干细胞能够分泌一种直径为40-100nm的微小囊泡，这种微小囊泡被称为外泌体。外泌体中含有蛋白质、mRNAs、miRNAs和DNA，具有稳定、安全和便于保存的特点。因此，本申请以外泌体为研究对象，再通过与其它组分的相互配合，促进成纤维细胞、上皮细胞等多种细胞的增殖、分化及血管生成因子的分泌，提高Ⅰ型胶原蛋白的含量，从而修复受损的皮肤。
发明内容
为了提高Ⅰ型胶原蛋白的含量，减小增生性瘢痕的面积，本申请提供了一种动物来源外泌体组合物及其在皮肤创伤修复中的应用。
第一方面，本申请提供了一种动物来源外泌体组合物，按照重量份数计，包括外泌体10-20份，小球藻生长因子10-20份，生育酚乙酸酯0.5-0.8份，乳清蛋白6-10份。
在本申请中，动物来源外泌体组合物主要由外泌体、小球藻生长因子、生育酚乙酸酯和乳清蛋白构成，通过这四种元素的组成，可以促进成纤维细胞等生长细胞的增殖活性，提高Ⅰ型胶原蛋白的含量，从而减小增生性瘢痕的面积。
所述外泌体是间充质干细胞分泌的一种纳米级的小囊泡。外泌体具有多种与间充质干细胞相似的功能和作用。外泌体相较间充质干细胞而言，外泌体具有较高的稳定性，没有免疫原性。因此，外泌体可以用于化妆品领域中，具有广泛的应用前景。
据相关报道，间充质干细胞的来源较为广泛，主要存在于组织和器官中，如骨髓、肝脏、脾脏、肺肾、胃肠、骨骼肌、外周血、脂肪、韧带、胎盘、脐带、脐血、牙髓和皮肤等组织中。在本申请中，外泌体提取于胎生动物的脐带中，胎生动物选自羊、牛和猪。经过多次实验的验证，在保证动物来源外泌体组合物中组分的用量相同时，从羊脐带中获取的外泌体与小球藻生长因子、生育酚乙酸酯和乳清蛋白的协同能力较高，成纤维细胞的增殖活性和Ⅰ型胶原蛋白的含量较高，Ⅰ型胶原蛋白的含量提高72.88％；其次是从猪脐带中获取的外泌体，Ⅰ型胶原蛋白的含量提高65.99％；最后是从牛脐带中获取的外泌体，Ⅰ型胶原蛋白的含量提高64.87％。综上所述，在减小增生性瘢痕的面积上，外泌体优先选择在羊的脐带获得，其次是猪的脐带，最后是牛的脐带。
本申请所述外泌体的制备方法包括以下步骤：
S1，选用胎生动物的脐带培养带间充质干细胞，进行纯化，待细胞增殖融合至85％以上时，用胰蛋白酶消化传代培养；
S2，选取P3代脐带间充质干细胞继续传代培养，利用P4代细胞制备外泌体；
S3，外泌体的分离，去除细胞碎片，过滤后保存。
小球藻(Chlorella)为绿藻门小球藻属普生性单细胞绿藻，是一种球形单细胞淡水藻类，直径3-8微米。小球藻是地球上最早的生命之一，是世界上生长最快的植物之一，是一种高效的光合植物，以光合自养生长繁殖，分布极广。小球藻内包含有小球藻生长因子，这也是小球藻能够快速繁殖的原因。
所述小球藻生长因子的制备方法包括以下步骤：
S1，温浴：将原料为小球藻粉或小球藻泥放入40-50℃的水中浸泡，浸泡时间为12-15小时，使小球藻细胞壁扩张和软化；
S2，破壁：在温浴后的小球藻浆中加入果胶酶，将温度控制在40±3℃，使小球藻细胞壁发生水解反应，获得破壁的小球藻泥，其中原料与果胶酶的重量比为1：(1-3)；
S3，酶解：再向步骤S2中加入核酸酶和蛋白酶，温度控制在45℃-55℃，使破壁的小球藻泥水解为小球藻生长因子的混合物，其中原料(原料为小球藻泥或小球藻粉)、核酸酶和蛋白酶的重量比为1：(0.5-0.8)：(0.5-0.8)；
S4，分离：用离心设备将小球藻生长因子的混合物离心分离，得到小球藻生长因子的液体。
在步骤S2中，所述小球藻粉或小球藻泥与所述果胶酶的重量比最低为1:1，当果胶酶的重量小于小球藻粉或小球藻泥的重量时，无法使小球藻粉或小球藻泥的细胞壁完全破碎。当果胶酶的重量大于小球藻粉或小球藻泥的重量的3倍时，小球藻粉或小球藻泥的细胞壁已经完全破碎，继续添加果胶酶，造成果胶酶的浪费。同理，在步骤S3中，所述小球藻粉或小球藻泥、核酸酶和蛋白酶的重量比为1：(0.5-0.8)：(0.5-0.8)，可以达到完全水解的目的，且不会造成核酸酶和蛋白酶的浪费。
在本申请中，动物来源外泌体组合物中外泌体、小球藻生长因子、生育酚乙酸酯和乳清蛋白按照(10-20份)/(10-20份)/(0.5-0.8份)/(6-10份)进行配合，能使这四种组分充分发挥增殖能力，抑制受损细胞的继续凋亡，再生细胞的快速增殖，Ⅰ型胶原蛋白的含量提高46.88％以上，减小增生性瘢痕的面积。
此外，将动物来源外泌体组合物中任一组分更换为其他组分时，比如，将生育酚乙酸酯更换为烟酰胺；将乳清蛋白更换为乙酰基六肽。动物来源外泌体组合物中的组分不能发挥相互促进作用，成纤维细胞的增殖活性不能得到提高，Ⅰ型胶原蛋白的含量也没有增加，所以增生性瘢痕的面积不能减小。
优选地，所述动物来源外泌体组合物包括外泌体15-20份，小球藻生长因子10-15份，生育酚乙酸酯0.5-0.6份，乳清蛋白6-8份。
在一个具体的实施方案中，所述动物来源外泌体组合物包括外泌体15份，小球藻生长因子15份，生育酚乙酸酯0.6份，乳清蛋白8份。该动物来源外泌体组合物能够使Ⅰ型胶原蛋白的含量提高72.88％以上。
优选地，所述动物来源外泌体组合物还包括丝素蛋白3-5份，类人胶原蛋白5-10份。
在本申请中，所述动物来源外泌体组合物还加入了丝素蛋白和类人胶原蛋白，使皮肤充满弹性、润泽、细腻、光滑。其中丝素蛋白中含有多种氨基酸成分，能够补充人体所需氨基酸，改变皮肤的状态。类人胶原蛋白的pH值为6.5-7.5，呈中性，不会破坏皮肤本身酸碱平衡，还能够促进成纤维细胞的增殖，进一步增加Ⅰ型胶原蛋白的含量，从而减小增生性瘢痕的面积。
第二方面，本申请提供了一种动物来源外泌体组合物在皮肤创伤修复中的应用，所述动物来源外泌体组合物用于护肤品中。
所述护肤品为膏剂、乳液或喷剂。
在本申请中，通过外泌体、小球藻生长因子、生育酚乙酸酯和乳清蛋白按照相应的比例进行混合制备动物来源外泌体组合物。动物来源外泌体组合物可以促进成纤维细胞等生长细胞的增殖活性，抑制受损组织细胞的凋亡，从而提高Ⅰ型胶原蛋白的含量，达到减小或淡化增生性瘢痕的目的。本申请制备的外泌体组合可以用于护肤品中，所述护肤品为膏剂、乳液或喷剂，便于日常使用。
综上所述，本申请具有以下有益效果：
1、本申请中动物来源外泌体组合物主要通过外泌体、小球藻生长因子、生育酚乙酸酯和乳清蛋白四种组分的相互促进和协同，能够提高成纤维细胞等多种细胞的增殖活性，增加Ⅰ型胶原蛋白的含量，减小增生性瘢痕的面积；
2、本申请所述动物来源外泌体组合物包括外泌体15份，小球藻生长因子15份，生育酚乙酸酯0.6份，乳清蛋白8份，使Ⅰ型胶原蛋白的含量提高72.88％；
3、本申请所述动物来源外泌体组合物可以用于护肤品中，将护肤品制备成膏剂、乳液或喷剂，便于日常的使用。
具体实施方式
以下结合实施例对本申请作进一步详细说明。
1、外泌体的提取
包括以下步骤：
选择新生羊的脐带，利用含1％双抗的PBS进行洗涤，去除残血并去除脐动、静脉，将新生羊脐带剪成0.8-1.0cm的脐带组织段；将脐带组织段贴壁接种在培养皿中，向培养皿中加入4mL的培养基，培养基选择含有10％胎牛血清和1％双抗的DMEM/F12培养基，在37℃、5％CO2、饱和湿度条件下进行培养，每3-4d换液1次。在倒置显微镜下观察细胞的形态和生长情况。待细胞增殖融合至90％时，胰蛋白酶消化传代培养。
取培养P3代脐带血干细胞于10cm培养皿中，待细胞增殖融合至90％时，按照1:4进行传代；P4细胞融合至对数生长期时，弃培养基，PBS漂洗两次，加入无FBS的DMEM/F12培养基6mL/皿，24h后收取培养基于离新管中，进行外泌体的分离：①预冷低温离心机，超速离心机至4℃；②300g，4℃离心10min，除细胞碎片；③将离心后上清液移植超速离心管中，用PBS补齐；④29500g，4℃离心20min，进一步去除细胞及碎片；⑤0.22μm滤器过滤离心后留上清液，去除大于200nm的粒子；⑥过滤后上清液于另一超速离心管中，120000g，4℃离心90min；⑦弃上清，无菌滤纸吸净管壁液体，管底即为外泌体，加入相应液体，-80保存待用。
2、小球藻生长因子的制备
S1，温浴：将30mg的小球藻泥放入45℃的水中浸泡，浸泡时间为15小时，使小球藻的细胞壁充分扩张和软化，获得小球藻浆；
S2，破壁：向小球藻浆中加入60mg的果胶酶，将温度控制在40±3℃，使小球藻细胞壁发生水解反应，获得破壁的小球藻泥；
S3，酶解：再向步骤S2中加入20mg的核酸酶和20mg的蛋白酶，将温度升温至50℃，使破壁的小球藻泥水解为小球藻生长因子的混合物；
S4，分离：用离心设备将小球藻生长因子的混合物离心分离，得到小球藻生长因子。
实施例
实施例1
将通过上述制备方法获得的外泌体15mg，小球藻生长因子15mg以及生育酚乙酸酯0.6mg，乳清蛋白8mg进行混合制备得到动物来源外泌体混合物。
实施例2-9与实施例1的区别如表2所示。
表2实施例2-9与实施例1的区别(单位：mg)
| 类别 | 外泌体 | 小球藻生长因子 | 生育酚乙酸酯 | 乳清蛋白 |
| 实施例1 | 15 | 15 | 0.6 | 8 |
| 实施例2 | 10 | 15 | 0.6 | 8 |
| 实施例3 | 20 | 15 | 0.6 | 8 |
| 实施例4 | 15 | 10 | 0.6 | 8 |
| 实施例5 | 15 | 20 | 0.6 | 8 |
| 实施例6 | 15 | 15 | 0.5 | 8 |
| 实施例7 | 15 | 15 | 0.8 | 8 |
| 实施例8 | 15 | 15 | 0.6 | 6 |
| 实施例9 | 15 | 15 | 0.6 | 10 |
实施例10
实施例10与实施例1不同之处在于，实施例10中所述外泌体源自猪的脐带。
实施例11
实施例11与实施例1不同之处在于，实施例11中所述外泌体源自牛的脐带。
实施例12
实施例12与实施例1不同之处在于，实施例12中所述动物来源外泌体组合物还包括4mg的丝素蛋白，7mg的类人胶原蛋。
实施例13
实施例13与实施例1不同之处在于，实施例13中所述动物来源外泌体组合物还包括5mg的丝素蛋白，10mg的类人胶原蛋。
对比例
对比例1-12与实施例1的区别如表2所示。
表2对比例1-12与实施例1的区别(单位：mg)
| 类别 | 外泌体 | 小球藻生长因子 | 生育酚乙酸酯 | 乳清蛋白 |
| 对比例1 | 8 | 15 | 0.6 | 8 |
| 对比例2 | 22 | 15 | 0.6 | 8 |
| 对比例3 | 15 | 8 | 0.6 | 8 |
| 对比例4 | 15 | 22 | 0.6 | 8 |
| 对比例5 | 15 | 15 | 0.3 | 8 |
| 对比例6 | 15 | 15 | 1.0 | 8 |
| 对比例7 | 15 | 15 | 0.6 | 4 |
| 对比例8 | 15 | 15 | 0.6 | 12 |
| 对比例9 | 0 | 15 | 0.6 | 8 |
| 对比例10 | 15 | 0 | 0.6 | 8 |
| 对比例11 | 15 | 15 | 0 | 8 |
| 对比例12 | 15 | 15 | 0.6 | 0 |
对比例13
对比例13与实施例1的区别在于，对比例13中将生育酚乙酸酯更换为烟酰胺。
对比例14
对比例14与实施例1的区别在于，对比例14中将乳清蛋白更换为乙酰基六肽。
性能检测试验
一、Ⅰ型胶原蛋白的含量测定
皮肤是机体重要的屏障，皮肤受损后，成纤维细胞等生长细胞增殖活性降低，导致Ⅰ型胶原蛋白的含量降低，进而大面积的形成增生性瘢痕。
1、成纤维细胞的培养
利用购自武汉普诺赛生命科技有限公司的人真皮成纤维细胞进行增殖活性测定。首先将人真皮成纤维细胞按照要求进行初步培养；然后取生长状态良好的对数生长期人真皮成纤维细胞，调整细胞浓度至1105个/mL，混匀后接种于96孔板中并加入含10％胎牛血清和1％双抗的DMEM高糖培养基。待人真皮成纤维细胞完全贴壁后，分别加入实施例1-13和对比例1-14制备的动物来源1外泌体组合物，对人真皮成纤维细胞进行培养，记为27组实验组并进行编号。设置对照，对照组内正常培养，培养基中不加入动物来源外泌体组合物。
2、人真皮成纤维细胞中蛋白的提取
将96孔板中的培养基去除，利用PBS清洗2次。每孔内加入100μL的RIPA裂解液(南京森贝伽生物科技有限公司)和1μL的PMSF蛋白酶抑制剂，在4℃下裂解20min。然后在4℃、12000r/min条件下离心30min。吸取上清液在-20℃储存备用。
3、Ⅰ型胶原蛋白的含量检测
利用购自上海酶联生物科技有限公司的人I型胶原蛋白(ColⅠ)ELISA试剂盒检测Ⅰ型胶原蛋白的含量，具体检测结果如表3所示。
表3Ⅰ型胶原蛋白的含量
结合实施例1-13和对比例1-14并结合表3可以看出，本申请制备的实施例1-13能够提高Ⅰ型胶原蛋白的含量，使Ⅰ型胶原蛋白的含量提高46.88％以上。
结合实施例1-9和对比例1-8并结合表3可以看出，所述动物来源外泌体组合物中外泌体、小球藻生长因子、生育酚乙酸酯和乳清蛋白按照(10-20份)/(10-20份)/(0.5-0.8份)/(6-10份)进行配合时，动物来源外泌体组合物能增加Ⅰ型胶原蛋白的含量，使Ⅰ型胶原蛋白的含量提高46.88％以上。
当外泌体组合物中小球藻生长因子、生育酚乙酸酯和乳清蛋白的用量一定时，随着外泌体用量的逐渐增加，Ⅰ型胶原蛋白的含量先增高后减少。
结合实施例1-9和对比例9-12并结合表3可以看出，所述动物来源外泌体组合物中外泌体、小球藻生长因子、生育酚乙酸酯和乳清蛋白相互配合时，使Ⅰ型胶原蛋白的含量提高46.88％以上。尤其是实施例1，动物来源外泌体组合物使Ⅰ型胶原蛋白的含量提高72.88％。
二、外泌体组合物的应用
根据Ⅰ型胶原蛋白的含量测定的结果，将实施例1、实施例8、对比例2、对比例10和对比例13制备成膏剂护肤品。选择无特定病原体级(SPF级)BALB/c小鼠50只，雄性，6-8周，饲养于无菌、恒温及暗明交替的清洁级环境中，可自由饮食、饮水及进行日常活动。
采用10％的水合氯醛(0.15mL/10g)将小鼠麻醉，剃去背部手术区域毛发，采用75％的酒精进行消毒处理，制备1cm1cm大小的全层皮肤缺损，采用3M辅料覆盖创面1天后暴露创面，小鼠背部创伤模型建立完成。
将50只小鼠分成5组，每组10只，创伤模型建立3d后将本申请实施例1、实施例8、对比例2、对比例10和对比例13制备的膏剂护肤品分别涂抹于小鼠创伤处，每天早晚各涂膜一次，记录涂抹前，涂抹后1个月，3个月和6个月创伤的面积(平均值)。具体检测结果如表4所示。
表4小鼠创伤的面积(单位：cm2)
| 组别 | 涂抹前 | 1个月 | 3个月 | 6个月 |
| 实施例1 | 0.987 | 0.754 | 0.461 | 0.127 |
| 实施例8 | 0.998 | 0.791 | 0.517 | 0.226 |
| 对比例2 | 0.986 | 0.973 | 0.941 | 0.912 |
| 对比例10 | 0.989 | 0.962 | 0.953 | 0.944 |
| 对比例13 | 0.993 | 0.980 | 0.973 | 0.962 |
结合实施例1、实施例8、对比例2、对比例10和对比例13并结合表4可以看出，实施例1和实施例8对小鼠的创伤修复有明显的作用，说明本申请制备的膏剂护肤品能够减小增生性瘢痕的面积。反观对比例2、对比例10和对比例13在6个月后小鼠的创伤面积和涂抹前相差不大，说明对比例2、对比例10和对比例13对小鼠的创伤修复作用不明显。
本具体实施例仅仅是对本申请的解释，其并不是对本申请的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本申请的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (7)
1.一种动物来源外泌体组合物，其特征在于，按照重量份数计，包括外泌体10-20份，小球藻生长因子10-20份，生育酚乙酸酯0.5-0.8份，乳清蛋白6-10份；
所述动物来源外泌体源自胎生动物的脐带；
所述胎生动物选为羊。
2.根据权利要求1所述的动物来源外泌体组合物，其特征在于，所述动物来源外泌体组合物包括外泌体15-20份，小球藻生长因子10-15份，生育酚乙酸酯0.5-0.6份，乳清蛋白6-8份。
3.根据权利要求1所述的动物来源外泌体组合物，其特征在于，所述动物来源外泌体组合物包括外泌体15份，小球藻生长因子15份，生育酚乙酸酯0.6份，乳清蛋白8份。
4.根据权利要求1-3任一项所述的动物来源外泌体组合物，其特征在于，所述动物来源外泌体组合物还包括丝素蛋白3-5份，类人胶原蛋白5-10份。
5.一种权利要求1-4任意一项所述的动物来源外泌体组合物在制备用于皮肤创伤修复的组合物中的应用。
6.根据权利要求5所述的动物来源外泌体组合物在制备用于皮肤创伤修复的组合物中的应用，其特征在于，所述动物来源外泌体组合物用于护肤品中。
7.根据权利要求6所述的动物来源外泌体组合物在制备用于皮肤创伤修复的组合物中的应用，其特征在于，所述护肤品为膏剂、乳液或喷剂。
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