CN113897387B - 一种具有促进毛发再生功能的基因重组msc及其外泌体样纳米材料的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开具有促进毛发再生功能的基因重组MSC及其外泌体样纳米材料的制备方法，包括：S101：制备脐带间充质干细胞(hU‑MSC)；S102：构建Jag1膜表面展示质粒(pDJag1)；S103：构建miR‑218‑5p miRNA过表达质粒；S104：在细胞膜表面表达Jagged 1蛋白质及细胞内表达miR‑218‑5p miRNA的基因重组MSC(JagmirMSC)细胞；S105：把JagmirMSC细胞进一步加工成为外泌体样纳米材料。本发明的JagmirMSC细胞及其外泌体样纳米材料都有促进毛发再生的功能。JagmirMSC细胞外泌体样纳米材料不但具有和JagmirMSC细胞一样促进毛发再生的功能，而且方便储存、运输、使用，也适于大量生产，具有更大的产业化潜力。

Description

一种具有促进毛发再生功能的基因重组MSC及其外泌体样纳 米材料的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种具有促进毛发再生功能的基因重组MSC及其外泌体样纳米材料的制备方法和应用。
背景技术
头顶毛发稀疏，毛发细软易落，发际线逐年退后，这些一直是困扰着很多中年男性和产后女性，随着工作生活学习压力的增大，不少正值盛年的男性也提前遭遇了脱发问题。有报道称，在35岁以前脱发患者占脱发人群的75.6％。
目前全世界有数以亿计的男性，女性甚至是儿童饱受脱发困扰，遗传、衰老、分娩、癌症治疗、烧伤以及压力等都可能导致脱发。脱发虽然不会造成严重的健康问题，但是因为影响美观，会导致个人形象问题，并因此带来情绪创伤甚至抑郁，尤其是对于年轻人，特别是年轻女性。尽管受脱发困扰的群体如此之大，但目前并没有有效的解决方法。
市面上现在关于防脱，育发类的产品主要以中药涂抹治疗，活血祛瘀，温通经络，益气养血生调理为主，这些产品使用周期长，而且长出的主要以绒毛为主，很难形成健康的头发。西药治疗虽然有明显的效果，但一旦停药就会有大面积脱发的危险，而且有一定的副作用，长期使用会给身体带来不利的影响。
除了自助治疗之外，药物治疗是传统的脱发治疗方法，临床认可的脱发药物疗法包括：局部外用米诺地尔以及口服非那雄胺。近几年兴起的新治疗方法包括，微针治疗、纳米技术等，这些疗法在动物实验上效果尤为显著，但要想在临床上使用纳米技术治疗脱发，还遥遥无期。还有近几年悄然兴起医疗机构植发，植发属于门诊手术，表皮局部麻醉，无痛苦，在经济条件允许的情况下，很多有脱发面积不大的患者会选择植发。但植发手术除了价格昂贵外，对手术技术要求高，若手术过程操作不当，很容易留下疤痕或损伤脑后神经后遗症，以及植发失败等一系列术后并症。此外，无论是单用生发药物治疗，或者是微针辅助药物治疗，都只能够在一定程度上缓解脱发症状，停药后头发又会再次开始脱落，且有一定副作用；而毛囊移植手术，是对自体的单个毛囊和毛囊单位进行移植，但毛囊资源不可再生，数量有限，且因技术原因，其存活率低。也就是说，如果头上没有足够数量的“活的”毛囊，按照现有的技术手段，很难“治愈”秃顶。
发明内容
本发明的主要目的是提供一种具有促进毛发再生功能的基因重组MSC 及其外泌体样纳米材料的制备方法和应用。此基因重组MSC及其外泌体样纳米材料不仅能促进毛发生长，而且更适于大规模生产制备和产业化。
为实现上述目的，本发明提出的具有促进毛发再生功能的基因重组 MSC及其外泌体样纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
S101：制备脐带间充质干细胞(hU-MSC)；
S102：构建Jag1膜表面展示质粒(pDJag1)；
S103：构建miR-218-5p miRNA过表达质粒；
S104：用基因重组技术制备在细胞膜表面表达Jagged 1蛋白质及细胞内表达miR-218-5p miRNA的基因重组MSC(JagmirMSC)细胞；
S105：把JagmirMSC细胞进一步加工成为不但具有与JagmirMSC细胞类似促进毛发生长的功能，而且还适于大规模生产制备的外泌体样纳米材料。
优选地，在所述的S101中，包括以下步骤：
S1011：无菌条件下采集脐带，把脐带剪成小段，每段约1cm，抽去动静脉(动脉两条，静脉1条)，在玻璃瓶中剪碎，装在15ml离心管中(每管装2小节，约2cm)，加胶原酶消化(IV型)8ml，消化3h后用100目过滤网过滤(或500rpm离心3-5分钟)，弃去未消化组织块，将上清液移至15ml离心管，每管约5ml，加PBS至10ml，高速离心(3000-4000rpm)，弃去上清，取沉淀移至培养皿中培养，置37℃，5％CO2饱和湿度孵箱内孵育，48h半量换液，4d后全量换液，弃去大量的悬浮细胞；
S1012：以后根据培养基颜色每3-4d换液，待原代细胞达到覆盖培养皿的60-80％后，给予1：2传代；
S1013：hU-MSC的鉴定及使用标准：采用第3-10代hU-MSC，当细胞数量达到108时，用PBS冲洗2次后，滴加0.05％的Trypsin-EDTA液消化，后加培养基终止消化，制成1-3×106的细胞悬液，用流式细胞仪进行检测显示： CD14或CD11b、CD79a或CD19、CD34、CD45、CD109、HLA-DR阴性<2％； CD29、CD44、CD73、CD90、CD105阳性率均>95％，EB病毒、巨细胞病毒、HIV病毒、乙肝病毒、支原体、细菌培养、真菌培养均阴性；
S1014：直接使用，或液氮保存备用。
优选地，在所述的S102中，包括：
S1021：引物设计
1)引物1Jag1upSfiI:
GACGTCGGCCGACGTGGCCatgcgttccccacggacgcgc；
2)引物2Jag1dnSalI:GACGTCGTCGACctatacgatgtactccattcg；
S1022：制备RNA：采志愿者外周血50ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞(PBMC)，再用TRIzol试剂制备总RNA；
S1023：RT-PCR：
1)以总RNA为模版，引物1和引物2为引物，用Invitrogen SuperScript IV一步法RT-PCR试剂盒制备IL35EBI3基因片段，用EZ Spin柱式PCR产物纯化试剂盒纯化；
2)以总RNA为模版，引物3和引物4为引物，用Invitrogen SuperScript IV一步法RT-PCR试剂盒制备Jag1基因片段，用EZ spin柱式PCR产物纯化试剂盒纯化；
S1024：限制性内切酶消化pDisplay载体及Jag1基因片段
分别用SfiI/SalI限制性内切酶消化pDisplay载体及Jag1基因片段，用 EZ-10Spin Column DNA PAGE Gel Extraction Kit分别纯化，获得pDisplay SfiI/SalI及Jag1 SfiI/SalI 2个酶切产物；
S1025：连接
用DNA连接酶连接pDisplay SfiI/SalI及Jag1 SfiI/SalI片段，获得pD-Jag1 连接产物；
S1026：转染感受态菌：
用pD-Jag1连接产物转染DH5α感受态细菌；
S1027：挑菌落及验证：
挑阳性菌落，小量培养，提取质粒DNA，用SfiI/SalI限制性内切酶切进行初选，最后测序确认；
S1028：保存pD-Jag1重组菌；
S1029：大量培养pD-Jag1重组菌，制备pD-Jag1重组质粒。
优选地，在所述的S103中，包括：
S1031：miR-218-5p miRNA基因片段克隆；
S1032：pCMV-MIR载体；
S1033：miR-218-5引物设计
引物3：miR-218-5pUPSgfI：
GAGGCGATCGCCttcggaagtgttccagtggaacccca
引物4：miR-218-5pDNMlu I：GCGACGCGTctgcctttggtgagttgagactggga
S1034：基因组DNA提取
采志愿者外周血50ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞(PBMC)，采用PureLinkTMGenomic DNA Mini Kit(Invitrogen)试剂盒提取基因组DNA；
S1035：PCR：以基因组DNA为模版，引物3和引物3为引物，用PCR 扩增miR-218-5p及其上下游侧翼共360bp的基因片段，用EZ Spin柱式PCR产物纯化试剂盒纯化；
S1036：限制性内切酶消化pCMV-MIR载体和miR-218-5p及其上下游侧翼基因片段：分别用SgfI/MluI限制性内切酶消化pCMV-MIR载体和 miR-218-5p及其上下游侧翼基因片段，琼脂糖凝胶电泳，用EZ-10Spin Column DNA PAGE Gel Extraction Kit分别纯化，获得pCMV-MIR SgfI/MluI 和miR-218-5p及其上下游侧翼基因片段2个酶切产物；
S1037：连接：用DNA连接酶连接pCMV-MIR SgfI/MluI和miR-218-5p 及其上下游侧翼基因SgfI/MluI片段，获得pCMV-miR-218-p连接产物；
S1038：转染感受态菌：用pCMV-miR-218-p连接产物转染DH5α感受态细菌；
S1039：挑菌落及验证：挑阳性菌落，小量培养，提取质粒DNA，用 SgfI/MluI限制性内切酶切进行初选，最后测序确认。保存pCMV-miR-218-p 重组菌；
S10310：大量培养pCMV-miR-218-p重组菌，制备pCMV-miR-218-p重组质粒。
优选地，在所述的S104中，包括：
S1041：准备细胞
以6孔板为例，转染前一天，把适量(5X105)上述MSC细胞悬浮在2ml 培养液中，细胞密度为50-80％满时进行转染；
S1042：把pD-Jag1及pCMV-miR-218-p质粒各1ug加入600ul Opti-MEM 低血清培养液中，混匀；轻轻混匀Lipofectamine LTX试剂，取5ul加入DNA 管中；轻轻混匀，室温孵育30min；
S1043：向每孔细胞加约100ul DNA-Lipofectamine LTX复合物，前后左右轻轻晃动培养板混匀；
S1044：37℃,5％CO2孵箱培养，24小时后取转染的JagmirMSC。
优选地，在所述的S105中，包括以下步骤：
S1051：悬浮细胞：用生理盐水把JagmirMSC细胞悬浮为2X107/ml，约 500ml；
S1052：冻融：液氮快速冷冻和37度水浴溶解5分钟，重复5次；
S1053：挤压：用Liposofast LF-50，经10um、1um、200nm 3个聚碳酸酯滤膜依次挤压5次；
S1054：浓缩纯化：合并上述挤压产物及JagmirMSC细胞培养上清液，用切向流过滤(TFF)系统，300K中空纤维纯化并浓缩至300ml，获得 80-150nm的JagmirMSC细胞外泌体样纳米颗粒。
本发明还公开了基因重组MSC及其外泌体样纳米材料在促进毛发再生中的应用。
本发明的JagmirMSC细胞及其类外泌体都有促进毛发再生的功能。其中JagmirMSC细胞不适于大量制备，由于是活细胞就必须超低温保存和运输，使用不方便；JagmirMSC细胞外泌体样纳米材料不但具有和JagmirMSC细胞一样促进毛发再生的功能，而且方便储存、运输、使用，也适于大量生产，更具有大规模产业化潜力。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图示出的结构获得其他的附图。
图1为本发明实施例提供的具有促进毛发再生功能的基因重组MSC及其外泌体样纳米材料的制备方法流程图；
图2为本发明实施例提供的pDisplay质粒图谱；
图3为本发明实施例提供的pCMV-MIR载体图；
图4为本发明实施例提供的hU-MSC及JagmirMSC中的miR-218-p表达水平图。
本发明目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明，本发明实施例中所有方向性指示(诸如上、下、左、右、前、后……)仅用于解释在某一特定姿态(如附图所示)下各部件之间的相对位置关系、运动情况等，如果该特定姿态发生改变时，则该方向性指示也相应地随之改变。
另外，在本发明中涉及“第一”、“第二”等的描述仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示其相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。另外，各个实施例之间的技术方案可以相互结合，但是必须是以本领域普通技术人员能够实现为基础，当技术方案的结合出现相互矛盾或无法实现时应当认为这种技术方案的结合不存在，也不在本发明要求的保护范围之内。
在本发明实施例中，参照图1，该具有促进毛发再生功能的基因重组MSC及其外泌体样纳米材料的制备方法，包括以下步骤：
S101：制备脐带间充质干细胞(hU-MSC)；
S102：构建Jag1膜表面展示质粒(pDJag1)；
S103：构建miR-218-5p miRNA过表达质粒；
S104：用基因重组技术制备在细胞膜表面表达Jagged 1蛋白质及细胞内表达miR-218-5p miRNA的基因重组MSC(JagmirMSC)细胞；
S105：把JagmirMSC细胞进一步加工成为不但具有与JagmirMSC细胞类似促进毛发生长的功能，而且还适于大规模生产制备的外泌体样纳米材料。
进一地，在所述的S101中，包括以下步骤：
S1011：无菌条件下采集脐带，把脐带剪成小段，每段约1cm，抽去动静脉(动脉两条，静脉1条)，在玻璃瓶中剪碎，装在15ml离心管中(每管装2小节，约2cm)，加胶原酶消化(IV型)8ml，消化3h后用100目过滤网过滤(或500rpm离心3-5分钟)，弃去未消化组织块，将上清液移至15ml离心管，每管约5ml，加PBS至10ml，高速离心(3000-4000rpm)，弃去上清，取沉淀移至培养皿中培养，置37℃，5％CO2饱和湿度孵箱内孵育，48h半量换液，4d后全量换液，弃去大量的悬浮细胞。
在本实施例中，脐带取自足月剖宫产健康孕妇，并且孕妇HBV抗原、抗HCV抗体、抗HIV抗体、抗梅毒螺旋体抗体、支原体、抗巨细胞病毒抗体等检测均阴性，孕妇孕期各项检查包括TORCH，唐氏筛查等均正常。
当然，本实施例不但不限于脐带来源的MSC，还包括胎盘，骨髓，牙髓，脂肪等来源的MSC；而且还不限于其它任何原代或传代细胞。
S1012：以后根据培养基颜色每3-4d换液，待原代细胞达到覆盖培养皿的60-80％后，给予1：2传代；
S1013：hU-MSC的鉴定及使用标准：采用第3-10代hU-MSC，当细胞数量达到108时，用PBS冲洗2次后，滴加0.05％的Trypsin-EDTA液消化，后加培养基终止消化，制成1-3×106的细胞悬液，用流式细胞仪进行检测显示： CD14或CD11b、CD79a或CD19、CD34、CD45、CD109、HLA-DR阴性<2％； CD29、CD44、CD73、CD90、CD105阳性率均>95％，EB病毒、巨细胞病毒、HIV病毒、乙肝病毒、支原体、细菌培养、真菌培养均阴性；
S1014：直接使用，或液氮保存备用。
进一步地，在所述的S102中，包括：
S1021：引物设计
1)引物1Jag1upSfiI:
GACGTCGGCCGACGTGGCCatgcgttccccacggacgcgc；
2)引物2Jag1dnSalI:GACGTCGTCGACctatacgatgtactccattcg；
S1022：制备RNA：采志愿者外周血50ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞(PBMC)，再用TRIzol试剂制备总RNA；
S1023：RT-PCR：
1)以总RNA为模版，引物1和引物2为引物，用Invitrogen SuperScript IV一步法RT-PCR试剂盒制备IL35EBI3基因片段，用EZ Spin柱式PCR产物纯化试剂盒纯化；
2)以总RNA为模版，引物3和引物4为引物，用Invitrogen SuperScript IV一步法RT-PCR试剂盒制备Jag1基因片段，用EZ spin柱式PCR产物纯化试剂盒纯化；
S1024：限制性内切酶消化pDisplay载体及Jag1基因片段
分别用SfiI/SalI限制性内切酶消化pDisplay载体及Jag1基因片段，用 EZ-10Spin Column DNA PAGE Gel Extraction Kit分别纯化，获得pDisplay SfiI/SalI及Jag1 SfiI/SalI 2个酶切产物；
S1025：连接
用DNA连接酶连接pDisplay SfiI/SalI及Jag1 SfiI/SalI片段，获得pD-Jag1 连接产物；
S1026：转染感受态菌：
用pD-Jag1连接产物转染DH5α感受态细菌；
S1027：挑菌落及验证：
挑阳性菌落，小量培养，提取质粒DNA，用SfiI/SalI限制性内切酶切进行初选，最后测序确认；
S1028：保存pD-Jag1重组菌；
S1029：大量培养pD-Jag1重组菌，制备pD-Jag1重组质粒。
在本实施例中，pDisplay图谱如图2所示，表达载体可以是膜表面表达载体，也可以是细胞内表达载体；可以是瞬时表达载体，也可以是稳定表达载体。
其中，Jag1氨基酸序列为：
MRSPRTRGRSGRPLSLLLALLCALRAKVCGASGQFELEILSMQNVNGELQNGNCCGGARNPGDRKCTRDECD TYFKVCLKEYQSRVTAGGPCSFGSGSTPVIGGNTFNLKASRGNDRNRIVLPFSFAWPRSYTLLVEAWDSSNDTVQPDSIIEKASHSGMINPSRQWQTLKQNTGVAHFEYQIRVTCDDYYYGFGCNKFCRPRDDFFGHYACDQNG NKTCMEGWMGPECNRAICRQGCSPKHGSCKLPGDCRCQYGWQGLYCDKCIPHPGCVHGICNEPWQCLCETNW GGQLCDKDLNYCGTHQPCLNGGTCSNTGPDKYQCSCPEGYSGPNCEIAEHACLSDPCHNRGSCKETSLGFEC ECSPGWTGPTCSTNIDDCSPNNCSHGGTCQDLVNGFKCVCPPQWTGKTCQLDANECEAKPCVNAKSCKNLIA SYYCDCLPGWMGQNCDININDCLGQCQNDASCRDLVNGYRCICPPGYAGDHCERDIDECASNPCLNGGHCQN EINRFQCLCPTGFSGNLCQLDIDYCEPNPCQNGAQCYNRASDYFCKCPEDYEGKNCSHLKDHCRTTPCEVID SCTVAMASNDTPEGVRYISSNVCGPHGKCKSQSGGKFTCDCNKGFTGTYCHENINDCESNPCRNGGTCIDGV NSYKCICSDGWEGAYCETNINDCSQNPCHNGGTCRDLVNDFYCDCKNGWKGKTCHSRDSQCDEATCNNGGTC YDEGDAFKCMCPGGWEGTTCNIARNSSCLPNPCHNGGTCVVNGESFTCVCKEGWEGPICAQNTNDCSPHPCY NSGTCVDGDNWYRCECAPGFAGPDCRININECQSSPCAFGATCVDEINGYRCVCPPGHSGAKCQEVSGRPCI TMGSVIPDGAKWDDDCNTCQCLNGRIACSKVWCGPRPCLLHKGHSECPSGQSCIPILDDQCFVHPCTGVGEC RSSSLQPVKTKCTSDSYYQDNCANITFTFNKEMMSPGLTTEHICSELRNLNILKNVSAEYSIYIACEPSPSA NNEIHVAISAEDIRDDGNPIKEITDKIIDLVSKRDGNSSLIAAVAEVRVQRRPLKNRTDFLVPLLSSVLTVA WICCLVTAFYWCLRKRRKPGSHTHSASEDNTTNNVREQLNQIKNPIEKHGANTVPIKDYENKNSKMSKIRTH NSEVEEDDMDKHQQKARFAKQPAYTLVDREEKPPNGTPTKHPNWTNKQDNRDLESAQSLNRMEYIV
Jag1基因序列为：
atgcgttccccacggacgcgcggccggtccgggcgccccctaagcctcctgctcgccctgctctgtgccctg cgagccaaggtgtgtggggcctcgggtcagttcgagttggagatcctgtccatgcagaacgtgaacggggagctgcagaacgggaactgctgcggcggcgcccggaacccgggagaccgcaagtgcacccgcgacgagtgtgac acatacttcaaagtgtgcctcaaggagtatcagtcccgcgtcacggccggggggccctgcagcttcggctca gggtccacgcctgtcatcgggggcaacaccttcaacctcaaggccagccgcggcaacgaccgcaaccgcatc gtgctgcctttcagtttcgcctggccgaggtcctatacgttgcttgtggaggcgtgggattccagtaatgac accgttcaacctgacagtattattgaaaaggcttctcactcgggcatgatcaaccccagccggcagtggcag acgctgaagcagaacacgggcgttgcccactttgagtatcagatccgcgtgacctgtgatgactactactat ggctttggctgcaataagttctgccgccccagagatgacttctttggacactatgcctgtgaccagaatggc aacaaaacttgcatggaaggctggatgggccccgaatgtaacagagctatttgccgacaaggctgcagtcct aagcatgggtcttgcaaactcccaggtgactgcaggtgccagtacggctggcaaggcctgtactgtgataag tgcatcccacacccgggatgcgtccacggcatctgtaatgagccctggcagtgcctctgtgagaccaactgg ggcggccagctctgtgacaaagatctcaattactgtgggactcatcagccgtgtctcaacgggggaacttgt agcaacacaggccctgacaaatatcagtgttcctgccctgaggggtattcaggacccaactgtgaaattgct gagcacgcctgcctctctgatccctgtcacaacagaggcagctgtaaggagacctccctgggctttgagtgt gagtgttccccaggctggaccggccccacatgctctacaaacattgatgactgttctcctaataactgttcc cacgggggcacctgccaggacctggttaacggatttaagtgtgtgtgccccccacagtggactgggaaaacg tgccagttagatgcaaatgaatgtgaggccaaaccttgtgtaaacgccaaatcctgtaagaatctcattgcc agctactactgcgactgtcttcccggctggatgggtcagaattgtgacataaatattaatgactgccttggc cagtgtcagaatgacgcctcctgtcgggatttggttaatggttatcgctgtatctgtccacctggctatgca ggcgatcactgtgagagagacatcgatgaatgtgccagcaacccctgtttgaatgggggtcactgtcagaat gaaatcaacagattccagtgtctgtgtcccactggtttctctggaaacctctgtcagctggacatcgattat tgtgagcctaatccctgccagaacggtgcccagtgctacaaccgtgccagtgactatttctgcaagtgcccc gaggactatgagggcaagaactgctcacacctgaaagaccactgccgcacgaccccctgtgaagtgattgac agctgcacagtggccatggcttccaacgacacacctgaaggggtgcggtatatttcctccaacgtctgtggt cctcacgggaagtgcaagagtcagtcgggaggcaaattcacctgtgactgtaacaaaggcttcacgggaaca tactgccatgaaaatattaatgactgtgagagcaacccttgtagaaacggtggcacttgcatcgatggtgtcaactcctacaagtgcatctgtagtgacggctgggagggggcctactgtgaaaccaatattaatgactgcagc cagaacccctgccacaatgggggcacgtgtcgcgacctggtcaatgacttctactgtgactgtaaaaatggg tggaaaggaaagacctgccactcacgtgacagtcagtgtgatgaggccacgtgcaacaacggtggcacctgc tatgatgagggggatgcttttaagtgcatgtgtcctggcggctgggaaggaacaacctgtaacatagcccga aacagtagctgcctgcccaacccctgccataatgggggcacatgtgtggtcaacggcgagtcctttacgtgc gtctgcaaggaaggctgggaggggcccatctgtgctcagaataccaatgactgcagccctcatccctgttac aacagcggcacctgtgtggatggagacaactggtaccggtgcgaatgtgccccgggttttgctgggcccgac tgcagaataaacatcaatgaatgccagtcttcaccttgtgcctttggagcgacctgtgtggatgagatcaat ggctaccggtgtgtctgccctccagggcacagtggtgccaagtgccaggaagtttcagggagaccttgcatc accatggggagtgtgataccagatggggccaaatgggatgatgactgtaatacctgccagtgcctgaatgga cggatcgcctgctcaaaggtctggtgtggccctcgaccttgcctgctccacaaagggcacagcgagtgcccc agcgggcagagctgcatccccatcctggacgaccagtgcttcgtccacccctgcactggtgtgggcgagtgt cggtcttccagtctccagccggtgaagacaaagtgcacctctgactcctattaccaggataactgtgcgaac atcacatttacctttaacaaggagatgatgtcaccaggtcttactacggagcacatttgcagtgaattgagg aatttgaatattttgaagaatgtttccgctgaatattcaatctacatcgcttgcgagccttccccttcagcg aacaatgaaatacatgtggccatttctgctgaagatatacgggatgatgggaacccgatcaaggaaatcact gacaaaataatcgatcttgttagtaaacgtgatggaaacagctcgctgattgctgccgttgcagaagtaaga gttcagaggcggcctctgaagaacagaacagatttccttgttcccttgctgagctctgtcttaactgtggct tggatctgttgcttggtgacggccttctactggtgcctgcggaagcggcggaagccgggcagccacacacac tcagcctctgaggacaacaccaccaacaacgtgcgggagcagctgaaccagatcaaaaaccccattgagaaa catggggccaacacggtccccatcaaggattatgagaacaagaactccaaaatgtctaaaataaggacacac aattctgaagtagaagaggacgacatggacaaacaccagcagaaagcccggtttgccaagcagccggcgtac acgctggtagacagagaagagaagccccccaacggcacgccgacaaaacacccaaactggacaaacaaacag gacaacagagacttggaaagtgcccagagcttaaaccgaatggagtacatcgtatag
进一步地，在所述的S103中，包括：
S1031：miR-218-5p miRNA基因片段克隆。hsa-miR-218-5p miRNA的 DNA序列为ttgtgcttgatctaaccatgt，是位于人染色体5克隆CTC-229B20 (AC027311)上的116743-116763片段。
S1032：pCMV-MIR载体，如图3所示，表达载体可以是膜表面表达载体，也可以是细胞内表达载体；可以是瞬时表达载体，也可以是稳定表达载体。
S1033：miR-218-5引物设计
引物3：miR-218-5pUPSgfI：
GAGGCGATCGCCttcggaagtgttccagtggaacccca
引物4：miR-218-5pDNMlu I：GCGACGCGTctgcctttggtgagttgagactggga
S1034：提取基因组DNA
采志愿者外周血50ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞(PBMC)，采用PureLinkTMGenomic DNA Mini Kit(Invitrogen)试剂盒提取基因组DNA；
S1035：PCR：以基因组DNA为模版，引物3和引物3为引物，用PCR 扩增miR-218-5p及其上下游侧翼共360bp的基因片段，用EZ Spin柱式PCR产物纯化试剂盒纯化；
S1036：限制性内切酶消化pCMV-MIR载体和miR-218-5p及其上下游侧翼基因片段：分别用SgfI/MluI限制性内切酶消化pCMV-MIR载体和 miR-218-5p及其上下游侧翼基因片段，琼脂糖凝胶电泳，用EZ-10Spin Column DNA PAGE Gel Extraction Kit分别纯化，获得pCMV-MIR SgfI/MluI 和miR-218-5p及其上下游侧翼基因片段2个酶切产物；
S1037：连接：用DNA连接酶连接pCMV-MIR SgfI/MluI和miR-218-5p 及其上下游侧翼基因SgfI/MluI片段，获得pCMV-miR-218-p连接产物；
S1038：转染感受态菌：用pCMV-miR-218-p连接产物转染DH5α感受态细菌；
S1039：挑菌落及验证：挑阳性菌落，小量培养，提取质粒DNA，用 SgfI/MluI限制性内切酶切进行初选，最后测序确认。保存pCMV-miR-218-p 重组菌；
S10310：大量培养pCMV-miR-218-p重组菌，制备pCMV-miR-218-p重组质粒。
进一步地，在所述的S104中，用pD-Jag1及pCMV-miR-218-p质粒组合转染hU-MSC。采用Lipofectamine LTX试剂转染法：转染的质粒为pD-Jag1及 pCMV-miR-218-p，转染后的细胞分别称为JagmirMSC。包括以下步骤：
S1041：准备细胞
以6孔板为例，转染前一天，把适量(5X105)上述MSC细胞悬浮在2ml 培养液中，细胞密度为50-80％满时进行转染；
S1042：把pD-Jag1及pCMV-miR-218-p质粒各1ug加入600ul Opti-MEM 低血清培养液中，混匀；轻轻混匀Lipofectamine LTX试剂，取5ul加入DNA 管中；轻轻混匀，室温孵育30min；
S1043：向每孔细胞加约100ul DNA-Lipofectamine LTX复合物，前后左右轻轻晃动培养板混匀；
S1044：37℃,5％CO2孵箱培养，24小时后取转染的JagmirMSC。
(1)检测Jag1蛋白质表达水平：加鼠抗人Jag1(Abcam)单克隆抗体， 37度孵育1小时，洗涤2次后加FITC荧光标记的兔抗鼠第二抗体(Abcam)，30 度孵育30分钟，洗涤2次后悬浮在50ul生理盐水中；荧光显微镜(奥林巴斯) 观察结果，表达Jag1蛋白质的JagmirMSC约为55％；对照组hU-MSC未见Jag1 蛋白质表达。
(2)检测miR-218-p表达水平：用RNA分离纯化试剂盒(Ambion)按厂家的说明分别制备hU-MSC及JagmirMSC的总RNA；用NanoDrop ND-1000 分光光度计(NanoDropTechnology Inc)作RNA定量；用10ng RNA，TaqMan MicroRNA逆转录试剂盒,TaqManUniversal PCR MasterMix,及hsa-miR-218-p的TaqMan microRNAAssay引物作qRT-PCR检测(ABI)；以 RNU6B作为内参，按2^-△△CT法计算miR-218-p表达水平(ABI)。结果见图4。miR-218-p在JagmirMSC中的表达水平是hU-MSC中的25倍左右，差别非常显著。
进一步地，在所述的S105中，包括以下步骤：
S1051：悬浮细胞：用生理盐水把JagmirMSC细胞悬浮为2X107/ml，约 500ml；
S1052：冻融：液氮快速冷冻和37度水浴溶解5分钟，重复5次；
S1053：挤压：用Liposofast LF-50，经10um、1um、200nm 3个聚碳酸酯滤膜依次挤压5次；
S1054：浓缩纯化：合并上述挤压产物及JagmirMSC细胞培养上清液，用切向流过滤(TFF)系统，300K中空纤维纯化并浓缩至300ml，获得 80-150nm的JagmirMSC细胞类外泌体样纳米颗粒。
本发明的JagmirMSC细胞及其类外泌体都有促进毛发再生的功能。其中JagmirMSC细胞不适于大量制备，由于是活细胞就必须超低温保存和运输，使用不方便；JagmirMSC细胞外泌体样纳米颗粒不但具有和JagmirMSC细胞一样促进毛发再生的功能，而且方便储存、运输、使用，也适于大量生产，更具有产业化潜力。
为了说明本发明的基因重组MSC及其外泌体样纳米材料在促进毛发再生中的作用，建立小鼠脱毛模型及随机对照试验。
1、建立小鼠脱毛模型：C57黑色18-20g小，给药前1d将小鼠背部用8％硫化钠脱毛,去毛面积4cm2(相当于体表总面积10％)，脊柱左右区各2cm2。
2、JagmirMSC细胞及其外泌体样纳米颗粒制剂配方
1)复合维生素B注射液【每支(2ml)含维生素B1 20mg、维生素B2 2mg、维生素B62mg、烟酰胺50mg、右旋泛酸钠1mg】50％
2)JagmirTreg细胞(1X106/ml)50％
3、小鼠分组及处理：50只小鼠随机分组，每组10只。各组左侧区不做处理作为自身对照；(1)阴性对照组(NC)动物右侧区涂复合维生素B注射液；(2)阳性对照组(PC)动物右区涂章光"101"；待测样品包括组包括(3)MSC细胞组、(4)JagmirMSC细胞、(5)JagmirMSC细胞外泌体样纳米颗粒制剂，分别涂于对应的MSC细胞(MSC)、JagmirMSC细胞 (JagmirMSC)组、JagmirMSC细胞外泌体样纳米颗粒制剂(JagmirTregEM) 组受试小鼠右区。
4、观察及分析：连续用药18d，停药后观察3d。试验结束后，麻醉状态下处死小鼠。在各组动物脊柱取皮肤一块(横跨左右区)，用4％甲醛固定，常规石蜡包埋切片，用苏木精-伊红染色，显微镜下观察皮肤全层、毛囊个数变化。主要观察指标：(1)观测左右侧(对照侧、实验侧)表皮毛囊细胞数量。(2)观测左右侧(对照侧、实验侧)表皮厚度，计数细胞层。对所得数据均采用t检验，以x±s表示。
5、结果：参与实验的50只小鼠均完成了测试。各组待测物对C57小鼠皮肤生长毛发的影响(见表1)：
1)与阴性对照组毛囊个数比较，(1)阳性对照组较多，但无显著差别(≥0.05)；(2)MSC细胞组比阴性对照组多，也比阳性对照组多，但仍无显著差别(≥0.05)；(3)JagmirMSC细胞组、JagmirMSC细胞类外泌体组的皮肤毛囊数都不但显著多于阴性对照组，而且也显著多于阳性对照组及MSC组(≤0.05)。
2)与阴性对照组皮肤层数比较，(1)阳性对照组较多，但无显著差别(≥0.05)；(2)MSC细胞组比阴性对照组多，也比阳性对照组多，但仍无显著差别(≥0.05)；(3)JagmirMSC细胞组、JagmirMSC细胞外泌体样纳米颗粒组的皮肤层数都不但显著多于阴性对照组，而且也显著多于阳性对照组及MSC组(≤0.01)。
表1.JagmirMSC细胞及其类外泌体对小鼠皮肤毛发生长的影响
由此可见，JagmirMSC细胞及其外泌体样纳米颗粒能使小鼠毛发明显增粗、增密，表皮层数增多，促进皮肤毛囊细胞激活。
以上所述仅为本发明的优选实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是在本发明的发明构思下，利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构变换，或直接/间接运用在其他相关的技术领域均包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 深圳市汉科生命工程有限公司
<120> 一种具有促进毛发再生功能的基因重组MSC及其外泌体样纳米材料的制备方法和应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
<210> 2
<211> 3657
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atgcgttccc cacggacgcg cggccggtcc gggcgccccc taagcctcct gctcgccctg 60
ctctgtgccc tgcgagccaa ggtgtgtggg gcctcgggtc agttcgagtt ggagatcctg 120
tccatgcaga acgtgaacgg ggagctgcag aacgggaact gctgcggcgg cgcccggaac 180
ccgggagacc gcaagtgcac ccgcgacgag tgtgacacat acttcaaagt gtgcctcaag 240
gagtatcagt cccgcgtcac ggccgggggg ccctgcagct tcggctcagg gtccacgcct 300
gtcatcgggg gcaacacctt caacctcaag gccagccgcg gcaacgaccg caaccgcatc 360
gtgctgcctt tcagtttcgc ctggccgagg tcctatacgt tgcttgtgga ggcgtgggat 420
tccagtaatg acaccgttca acctgacagt attattgaaa aggcttctca ctcgggcatg 480
atcaacccca gccggcagtg gcagacgctg aagcagaaca cgggcgttgc ccactttgag 540
tatcagatcc gcgtgacctg tgatgactac tactatggct ttggctgcaa taagttctgc 600
cgccccagag atgacttctt tggacactat gcctgtgacc agaatggcaa caaaacttgc 660
atggaaggct ggatgggccc cgaatgtaac agagctattt gccgacaagg ctgcagtcct 720
aagcatgggt cttgcaaact cccaggtgac tgcaggtgcc agtacggctg gcaaggcctg 780
tactgtgata agtgcatccc acacccggga tgcgtccacg gcatctgtaa tgagccctgg 840
cagtgcctct gtgagaccaa ctggggcggc cagctctgtg acaaagatct caattactgt 900
gggactcatc agccgtgtct caacggggga acttgtagca acacaggccc tgacaaatat 960
cagtgttcct gccctgaggg gtattcagga cccaactgtg aaattgctga gcacgcctgc 1020
ctctctgatc cctgtcacaa cagaggcagc tgtaaggaga cctccctggg ctttgagtgt 1080
gagtgttccc caggctggac cggccccaca tgctctacaa acattgatga ctgttctcct 1140
aataactgtt cccacggggg cacctgccag gacctggtta acggatttaa gtgtgtgtgc 1200
cccccacagt ggactgggaa aacgtgccag ttagatgcaa atgaatgtga ggccaaacct 1260
tgtgtaaacg ccaaatcctg taagaatctc attgccagct actactgcga ctgtcttccc 1320
ggctggatgg gtcagaattg tgacataaat attaatgact gccttggcca gtgtcagaat 1380
gacgcctcct gtcgggattt ggttaatggt tatcgctgta tctgtccacc tggctatgca 1440
ggcgatcact gtgagagaga catcgatgaa tgtgccagca acccctgttt gaatgggggt 1500
cactgtcaga atgaaatcaa cagattccag tgtctgtgtc ccactggttt ctctggaaac 1560
ctctgtcagc tggacatcga ttattgtgag cctaatccct gccagaacgg tgcccagtgc 1620
tacaaccgtg ccagtgacta tttctgcaag tgccccgagg actatgaggg caagaactgc 1680
tcacacctga aagaccactg ccgcacgacc ccctgtgaag tgattgacag ctgcacagtg 1740
gccatggctt ccaacgacac acctgaaggg gtgcggtata tttcctccaa cgtctgtggt 1800
cctcacggga agtgcaagag tcagtcggga ggcaaattca cctgtgactg taacaaaggc 1860
ttcacgggaa catactgcca tgaaaatatt aatgactgtg agagcaaccc ttgtagaaac 1920
ggtggcactt gcatcgatgg tgtcaactcc tacaagtgca tctgtagtga cggctgggag 1980
ggggcctact gtgaaaccaa tattaatgac tgcagccaga acccctgcca caatgggggc 2040
acgtgtcgcg acctggtcaa tgacttctac tgtgactgta aaaatgggtg gaaaggaaag 2100
acctgccact cacgtgacag tcagtgtgat gaggccacgt gcaacaacgg tggcacctgc 2160
tatgatgagg gggatgcttt taagtgcatg tgtcctggcg gctgggaagg aacaacctgt 2220
aacatagccc gaaacagtag ctgcctgccc aacccctgcc ataatggggg cacatgtgtg 2280
gtcaacggcg agtcctttac gtgcgtctgc aaggaaggct gggaggggcc catctgtgct 2340
cagaatacca atgactgcag ccctcatccc tgttacaaca gcggcacctg tgtggatgga 2400
gacaactggt accggtgcga atgtgccccg ggttttgctg ggcccgactg cagaataaac 2460
atcaatgaat gccagtcttc accttgtgcc tttggagcga cctgtgtgga tgagatcaat 2520
ggctaccggt gtgtctgccc tccagggcac agtggtgcca agtgccagga agtttcaggg 2580
agaccttgca tcaccatggg gagtgtgata ccagatgggg ccaaatggga tgatgactgt 2640
aatacctgcc agtgcctgaa tggacggatc gcctgctcaa aggtctggtg tggccctcga 2700
ccttgcctgc tccacaaagg gcacagcgag tgccccagcg ggcagagctg catccccatc 2760
ctggacgacc agtgcttcgt ccacccctgc actggtgtgg gcgagtgtcg gtcttccagt 2820
ctccagccgg tgaagacaaa gtgcacctct gactcctatt accaggataa ctgtgcgaac 2880
atcacattta cctttaacaa ggagatgatg tcaccaggtc ttactacgga gcacatttgc 2940
agtgaattga ggaatttgaa tattttgaag aatgtttccg ctgaatattc aatctacatc 3000
gcttgcgagc cttccccttc agcgaacaat gaaatacatg tggccatttc tgctgaagat 3060
atacgggatg atgggaaccc gatcaaggaa atcactgaca aaataatcga tcttgttagt 3120
aaacgtgatg gaaacagctc gctgattgct gccgttgcag aagtaagagt tcagaggcgg 3180
cctctgaaga acagaacaga tttccttgtt cccttgctga gctctgtctt aactgtggct 3240
tggatctgtt gcttggtgac ggccttctac tggtgcctgc ggaagcggcg gaagccgggc 3300
agccacacac actcagcctc tgaggacaac accaccaaca acgtgcggga gcagctgaac 3360
cagatcaaaa accccattga gaaacatggg gccaacacgg tccccatcaa ggattatgag 3420
aacaagaact ccaaaatgtc taaaataagg acacacaatt ctgaagtaga agaggacgac 3480
atggacaaac accagcagaa agcccggttt gccaagcagc cggcgtacac gctggtagac 3540
agagaagaga agccccccaa cggcacgccg acaaaacacc caaactggac aaacaaacag 3600
gacaacagag acttggaaag tgcccagagc ttaaaccgaa tggagtacat cgtatag 3657

Claims (7)

1.具有促进毛发再生功能的基因重组MSC外泌体样纳米材料的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S101：制备脐带间充质干细胞hU-MSC；
S102：构建Jag1膜表面展示质粒pD-Jag1；
S103：构建miR-218-5p miRNA过表达质粒；
S104：在细胞膜表面表达Jagged 1蛋白质及细胞内表达miR-218-5p miRNA的基因重组MSC JagmirMSC细胞；
S105：把JagmirMSC细胞进一步加工成为外泌体样纳米材料。
2.根据权利要求1所述的具有促进毛发再生功能的基因重组MSC外泌体样纳米材料的制备方法，其特征在于，在所述的S101中，包括：
S1011：无菌条件下采集脐带，把脐带剪成小段，每段1cm，抽去动静脉，在玻璃瓶中剪碎，装在15ml离心管中，加胶原酶，消化3h后用100目过滤网过滤或500rpm离心3-5分钟，弃去未消化组织块，将上清液移至15ml离心管，每管5ml，加PBS至10ml，高速离心，弃去上清，取沉淀移至培养皿中培养，置37℃，5%CO2饱和湿度孵箱内孵育，48h半量换液，4d后全量换液，弃去大量的悬浮细胞；
S1012：以后根据培养基颜色每3-4d换液，待原代细胞达到覆盖培养皿的60-80%后，进行1：2传代；
S1013：hU-MSC的鉴定及使用标准：取第3-10代hU-MSC，当细胞数量达到108时，用PBS冲洗2次后，滴加0.05%的Trypsin-EDTA液消化，后加培养基终止消化，制成（1-3）×106的细胞悬液，用流式细胞仪进行检测显示：CD14或CD11b、CD79a或CD19、CD34、CD45、CD109、HLA-DR阴性<2%；CD29、CD44、CD73、CD90、CD105阳性率均>95%，EB病毒、巨细胞病毒、HIV病毒、乙肝病毒、支原体、细菌培养、真菌培养均阴性；
S1014：直接使用，或液氮保存备用。
3.根据权利要求1所述的具有促进毛发再生功能的基因重组MSC外泌体样纳米材料的制备方法，其特征在于，在所述的S102中，包括：
S1021：引物设计
1）引物1 Jag1upSfiI: GACGTCGGCCGACGTGGCCatgcgttccccacggacgcgc；
2）引物2 Jag1dnSalI: GACGTCGTCGACctatacgatgtactccattcg；
S1022：制备RNA：采志愿者外周血50ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞PBMC，再用TRIzol试剂制备总RNA；
S1023：RT- PCR：
以总RNA为模版，引物1和引物2引物，用Invitrogen SuperScript IV一步法RT-PCR试剂盒制备Jag1基因片段，用EZ spin柱式PCR产物纯化试剂盒纯化；
S1024： 限制性内切酶消化pDisplay载体及Jag1基因片段
分别用SfiI/SalI限制性内切酶消化pDisplay载体及Jag1基因片段，用EZ-10 SpinColumn DNA PAGE Gel Extraction Kit分别纯化，获得pDisplay SfiI/SalI及Jag1 SfiI/SalI 2个酶切产物；
S1025：连接
用DNA连接酶连接pDisplay SfiI/SalI及Jag1 SfiI/SalI 片段，获得pD-Jag1连接产物；
S1026：转染感受态菌：
用pD-Jag1连接产物转染DH5α感受态细菌；
S1027： 挑菌落及验证：
挑阳性菌落，小量培养，提取质粒DNA，用SfiI/SalI限制性内切酶切进行初选，最后测序确认；
S1028：保存pD-Jag1重组菌；
S1029：大量培养pD-Jag1重组菌，制备pD-Jag1重组质粒。
4.根据权利要求1所述的具有促进毛发再生功能的基因重组MSC外泌体样纳米材料的制备方法，其特征在于，在所述的S103中，包括：
S1031：克隆miR-218-5p miRNA基因片段；
S1032：pCMV-MIR载体；
S1033：设计miR-218-5引物
引物3：miR-218-5pUPSgf I：GAGGCGATCGCCttcggaagtgttccagtggaacccca
引物4：miR-218-5pDNMlu I：GCGACGCGTctgcctttggtgagttgagactggga
S1034：基因组DNA提取
采志愿者外周血50ml，用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞PBMC，采用PureLink™Genomic DNA Mini Kit Invitrogen 试剂盒提取基因组DNA；
S1035：PCR：以基因组DNA为模版，引物3和引物4为引物，用PCR扩增miR-218-5p及其上下游侧翼共360bp的基因片段，用EZ Spin柱式PCR产物纯化试剂盒纯化；
S1036： 限制性内切酶消化pCMV-MIR载体和miR-218-5p及其上下游侧翼基因片段：分别用SgfI/MluI限制性内切酶消化pCMV-MIR载体和miR-218-5p及其上下游侧翼基因片段，琼脂糖凝胶电泳，用EZ-10 Spin Column DNA PAGE Gel Extraction Kit分别纯化，获得pCMV-MIR SgfI/MluI和miR-218-5p及其上下游侧翼基因片段 2个酶切产物；
S1037： 连接：用DNA连接酶连接pCMV-MIR SgfI/MluI和miR-218-5p及其上下游侧翼基因SgfI/MluI片段，获得pCMV-miR-218-p连接产物；
S1038：转染感受态菌：用pCMV-miR-218-p连接产物转染DH5α感受态细菌；
S1039：挑菌落及验证：挑阳性菌落，小量培养，提取质粒DNA，用SgfI/MluI限制性内切酶切进行初选，最后测序确认；保存pCMV-miR-218-p重组菌；
S10310：大量培养pCMV-miR-218-p重组菌，制备pCMV-miR-218-p重组质粒。
5.根据权利要求1所述的具有促进毛发再生功能的基因重组MSC外泌体样纳米材料的制备方法，其特征在于，在所述的S104中，包括：
S1041：准备细胞
以6孔板为例，转染前一天，把适量上述MSC细胞悬浮在2ml培养液中，细胞密度为50-80%满时进行转染；
S1042：把pD-Jag1及pCMV-miR-218-p质粒各1ug加入600ul Opti-MEM 低血清培养液中，混匀；轻轻混匀Lipofectamine LTX试剂，取5ul加入DNA管中；轻轻混匀，室温孵育30min；
S1043：向每孔细胞加100ul DNA-Lipofectamine LTX复合物，前后左右轻轻晃动培养板混匀；
S1044：37oC，5%CO2孵箱培养，24小时后取转染的JagmirMSC。
6.根据权利要求1所述的具有促进毛发再生功能的基因重组MSC外泌体样纳米材料的制备方法，其特征在于，在所述的S105中，包括以下步骤：
S1051：悬浮细胞：用生理盐水把JagmirMSC细胞悬浮为2X107/ml， 500ml；
S1052：冻融：液氮快速冷冻和37度水浴溶解5分钟，重复5次；
S1053：挤压：用Liposofast LF-50 ，经10um、1um、200nm 3个聚碳酸酯滤膜依次挤压5次；
S1054：浓缩纯化：合并上述挤压产物及JagmirMSC细胞培养上清液，用切向流过滤 TFF系统，300 K 中空纤维纯化并浓缩至300ml ，获得80-150nm的JagmirMSC细胞外泌体样纳米颗粒。
7.上述权利要求1至6任一项制备方法获得的外泌体样纳米材料在制备促进毛发再生药物中的应用。
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