CN115181724A - 一种间充质干细胞来源的外泌体及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了转染miR‑143‑3p片段的人脐带间充质干细胞来源外泌体在制备治疗非小细胞肺癌药物或治疗肺癌中的应用,具体涉及将miR‑143‑3p转染到人脐带间充质干细胞,提取其产生的外泌体用于非小细胞肺癌的治疗。所述外泌体能有效抑制非小细胞肺癌肿瘤生长,且这种外泌体还具有保存和运输方便的优势,这就为非小细胞肺癌等肿瘤相关疾病的治疗提供了新的策略。
Description
技术领域
本发明涉及间充质干细胞来源的外泌体、外泌体的制备方法及其在制备治疗非小细胞肺癌药物或制剂中的用途,具体是用负载miR-143-3p的间充质干细胞产生的外泌体在非小细胞肺癌治疗中的应用。
背景技术
肺癌是最高发的肿瘤之一,也是全球死亡率最高的肿瘤。肺癌可以分为非小细胞肺癌(NSCLC)和小细胞肺癌,其中NSCLC占80%以上。目前NSCLC的治疗手段包括手术切除、化疗、靶向治疗和免疫治疗,在多种治疗手段下,非小细胞肺癌死亡率仍居高不下,患者5年生存率仅约15%。因此,急需开发新的有效的治疗手段。
间充质干细胞(MSCs)是一种存在于脐带、骨髓、胎盘、脂肪等多种组织的多能干细胞,具有低免疫原性、免疫调节能力和炎症、肿瘤归巢能力,易于在体外分离培养和迅速扩增,这使得MSCs在炎症、免疫和肿瘤相关疾病的细胞治疗领域备受关注。目前已有多个不同组织来源MSCs细胞药物上市,用于移植物抗宿主病(GVHD)、关节炎、脊髓侧索硬化症(ALS)等,此外,尚有1000多个MSCs相关的临床试验处于不同阶段,包括应用于肿瘤治疗。然而,间充质干细胞植入体内后存在恶性转变及致瘤的风险,而且细胞的存储和运输不便,限制了其临床应用。
值得关注的是,MSCs能够分泌大量的外泌体(exosome),这些MSCs来源外泌体携带了MSCs的重要信号分子,包括蛋白质、脂质和RNA等,并保持着与亲代MSCs相似的生物学活性,如调节免疫应答、向炎症肿瘤部位归巢等作用。外泌体的直径约50-200nm,是一种脂质双层结构的小细胞外囊泡(sEVs)。研究显示,外泌体可作为一种天然的药物递送载体,将具有治疗作用的核酸、蛋白质及小分子药物递送至靶细胞。与脂质体等人工载体相比,外泌体具有更高的生物相容性及安全性,可通过与细胞膜融合将药物输送至细胞质中,显著延长药物半衰期,提高易损分子的递送效率。外泌体还可穿过血脑屏障,其作用范围比细胞更加广泛。此外,外泌体便于储存和运输,同时也可避免直接注射MSCs可能产生的临床风险。MSCs来源外泌体与其他细胞来源外泌体相比,如肿瘤细胞来源外泌体,可能因携带PD-L1等蛋白存在较高的致瘤风险,免疫细胞来源的外泌体可能存在较高的免疫原性高、细胞较难培养,其他细胞如成纤维细胞来源外泌体还可能存在靶向性低、生物活性不足等问题,间充质干细胞来源外泌具有天然的低免疫原性、富含免疫调节因子、易向炎症与肿瘤部位富集和易于培养扩增等优势。因此,MSC细胞来源外泌体极具开发为无细胞非小细胞肺癌治疗药物或载体的潜力。
我们首次提取了转染miR-143-3p片段的MSCs产生的外泌体,应用于小鼠非小细胞肺癌的治疗中,取得了良好的治疗效果。与细胞治疗相比,外泌体具有稳定性好、存储及应用方便的特点。与人工合成的载体相比,外泌体具有生物活性丰富、生物相容性高等特点。与转染阴性对照片段的MSCs来源外泌体(NC-MSC-sEVs)相比,转染miR-143-3p片段的MSCs来源外泌体(miR143-MSC-sEVs)的治疗效果更强。
发明内容
本发明提供一种转染miR-143-3p片段的间充质干细胞来源外泌体(miR143-MSC-sEVs)、该外泌体的制备方法及其在治疗非小细胞肺癌中的应用。这种外泌体能抑制非小细胞肺癌小鼠肿瘤组织增殖,促进肿瘤组织凋亡,有效抑制小鼠肿瘤生长,且不影响小鼠体重。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
第一方面,本发明提供一种间充质干细胞来源的外泌体,所述间充质干细胞来源的外泌体是由转染miR-143-3p片段的间充质干细胞分泌得到。
第二方面,本发明提供一种上述间充质干细胞来源的外泌体的制备方法,所述方法为:
用miR-143-3p片段转染细胞融合至40%-60%的间充质干细胞,转染完成后,更换新鲜培养基进行细胞培养24-72小时(优选48-72小时),所得上清液(含外泌体的细胞培养基)经后处理,得到所述间充质干细胞来源的外泌体。
本发明所述外泌体来源于脐带间充质干细胞,经一定方法提取,可以在-80℃冰箱中长期保持活性(至少1年)。
进一步,所述miR-143-3p片段的转染终浓度为10~200nmol/L(优选100nmol/L)。
进一步,所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
优选地,所述间充质干细胞为传代3-6代的人脐带间充质干细胞。
具体地,所述人脐带间充质干细胞按如下方法分离获得:采集正常足月剖宫产胎儿脐带,剪取近胎盘端20cm左右,置于4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)保存备用,4小时内使用;在超净工作台内,使用4℃预冷的含0.01%青霉素和0.01%链霉素的PBS冲洗,去除残余血液;将所得脐带置于DMEM/F12培养基中,剥离脐动脉与脐静脉,随后将所得脐带剪成2mm3左右的组织碎块,4℃、300g离心10分钟,弃去上清,向所得组织沉淀中加入250U/mL的胶原酶II、100U/mL中性蛋白酶和10U/mL透明质酸酶,37℃振荡消化2-3小时至基本消化完全,4℃、300g离心10分钟,弃上清;所得一次沉淀用DMEM/F12培养基重悬离心洗涤3次,所得二次沉淀重悬于含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基中,接种于T25培养瓶,37℃,5%CO2培养箱培养3-4天后,轻轻晃动培养瓶,更换新鲜的含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基,待细胞生长融合达80%左右时,用2.5g/L的胰酶溶液消化,传代接种至(10cm)培养皿中,培养得到所述人脐带间充质干细胞,记为第1代,此后每传一次记为1代。再传代2-5次,即得3-6代的人脐带间充质干细胞。
本发明还提供一种转染的方法,所述转染的步骤如下:分离培养人脐带间充质干细胞,取3-6代的人脐带间充质干细胞,接种于(10cm的)培养皿中,加入细胞培养基,待细胞融合至40%-60%时,加入转染终浓度为10~200nmol/L(优选100nmol/L)的miR-143-3p片段,细胞培养箱(37℃,5%CO2)中培养4-6小时,即完成所述转染。
进一步,所述细胞培养为37℃、5%CO2下培养24-72小时(优选48-72小时)。
优选地,所述细胞培养的培养基是含10%的无外泌体胎牛血清的DMEM/F12培养基。
更换培养基时用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,再更换新鲜DMEM/F12培养基(含10%的无外泌体胎牛血清),细胞培养:继续培养24-72小时(优选48-72小时),无菌收集培养上清,用于外泌体的提取。
进一步,所述后处理为:将所述上清液4℃、300g离心10分钟,弃沉淀,所得第二次上清4℃、2000g离心10分钟,弃第三次沉淀,所得第三次上清4℃,10000g离心30分钟,弃第四次沉淀,所得第四次上清4℃、100000g离心70分钟,移除第五次上清,所得第五次沉淀用无菌PBS重悬后4℃、100000g离心70分钟,移除第六次上清,所得第六次沉淀即为所述间充质干细胞来源的外泌体。
各步骤的具体操作即作用——所述外泌体按以下方法制备:将收集至离心管中的上清液,4℃、300g离心10分钟,以去除死细胞;将上清液转移至新的离心管中,4℃、2000g离心10分钟,以去除大的碎片;将上清液转移至新的离心管中,4℃,10000g离心30分钟,以去除细胞器及小颗粒;小心将上清液转移至无菌超速离心管中,进行第一次超速离心,4℃、100000g离心70分钟。用移液器将上清小心的移除,离心管底的沉淀用无菌PBS重悬,进行第二次超速离心,4℃、100000g离心70分钟;用移液器将上清小心的移除,得到的沉淀为外泌体。根据收集培养基的体积,加入适量无菌PBS重悬,然后用0.22μM离心式过滤器(默克密理博)过滤,以避免超速离心过程可能造成的污染,获得的无菌外泌体重悬液于-80℃分装保存。
具体来说,本发明尤其推荐一种间充质干细胞来源的外泌体的制备方法,所述方法为:
(1)用miR-143-3p片段转染人脐带间充质干细胞:取3-6代的人脐带间充质干细胞接种于10cm培养皿中,加入DMEM/F12培养基进行细胞培养,待细胞融合至约40%-60%时,向人脐带间充质干细胞中加入含miR-143-3p片段的转染混合液,所述miR-143-3p的转染终浓度为10~200nmol/L(优选100nmol/L);转染4-6小时后,PBS清洗,更换含10%的无外泌体胎牛血清的DMEM/F12培养基,继续培养24-72小时(优选48-72小时),得到转染的间充质干细胞的细胞培养上清;无外泌体胎牛血清是将胎牛血清经100000g,18小时超速离心去除沉淀后获得。
所述含miR-143-3p片段的转染混合液按如下方法配置:Opti-MEM培养基分别稀释转染试剂Lipofectamine RNAiMAX、miR-143-3p片段,得到稀释液A,和稀释液B;将稀释液A和稀释液B轻柔吹打混匀,室温下避光静置18分钟,获得所述含miR-143-3p片段的转染混合液;所述转染试剂Lipofectamine RNAiMAX的体积以所述miR-143-3p片段的物质的量计为0.033μL/μmol-3×105μL/μmol;
(2)超速离心法收集外泌体:收集步骤(1)所述转染的间充质干细胞的细胞培养上清至离心管中,4℃、300g离心10分钟,弃沉淀,所得第二次上清液4℃、2000g离心10分钟,以去除大的碎片;弃第三次沉淀,所得第三次上清液4℃,10000g离心30分钟,以去除细胞器及小颗粒;弃第四次沉淀,所得第四次进行第一次超速离心,4℃、100000g离心70分钟;移除第五次上清,所得第五次沉淀用无菌PBS重悬,进行第二次超速离心,4℃、100000g离心70分钟;移除第六次上清,所得第六次沉淀即为负载miR-143-3p的人脐带间充质干细胞外泌体。根据收集培养基的体积,加入适量无菌PBS重悬(每50mL收集的培养基最终使用不超过50μL的PBS重悬),然后用0.22μM离心式过滤器过滤,以避免超速离心过程可能造成的污染,获得的无菌外泌体重悬液于-80℃分装保存。
步骤(2)中的上清都要小心移除,避免上清中掺入杂质或者沉淀中的外泌体损耗。
所述的外泌体平均粒径约70nm,表达标志性蛋白CD63、TSG101和Alix,透射电子显微镜分析颗粒形态符合外泌体的特征。
本发明首次通过细胞实验证明:转染miR-143-3p片段的间充质干细胞来源外泌体miR143-MSC-sEVs和转染阴性对照片段的间充质干细胞来源外泌体(NC-MSC-sEVs)都具有非小细胞肺癌细胞抑制活性,miR143-MSC-sEVs比NC-MSC-sEVs对非小细胞肺癌细胞抑制活性更强,能更有效地抑制非小细胞肺癌细胞增殖并促进非小细胞肺癌细胞凋亡;此外,与NC-MSC-sEVs相比,miR143-MSC-sEVs可以抑制非小细胞肺癌细胞迁移,并且不引起非小细胞肺癌细胞浸润和上皮间质转化,具有更高的安全性。
我们构建了A549非小细胞肺癌荷瘤小鼠模型,并通过尾静脉注射miR-143-MSC-sEVs和NC-MSC-sEVs,观察外泌体对非小细胞肺癌肿瘤生长的影响。
本发明首次通过动物实验证明:miR-143-MSC-sEVs和NC-MSC-sEVs都能够抑制A549肺癌小鼠体内肿瘤的生长,miR-143-MSC-sEVs比NC-MSC-sEVs抑制能力更强,能更有效的抑制肿瘤组织增殖、诱导肿瘤组织凋亡,降低肿瘤大小和质量。
第三方面,本发明还提供一种上述间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗肿瘤的药物或者制剂中的应用;所述肿瘤为miR-143低表达的肿瘤,如非小细胞肺癌、宫颈癌、卵巢癌、前列腺癌或结肠癌。
优选地,所述肿瘤为非小细胞肺癌。
所述外泌体通过抑制肿瘤组织增殖、促进肿瘤组织凋亡,抑制肿瘤生长,达到治疗非小细胞肺癌的目的,从而实现在制备治疗非小细胞肺癌的药物或者制剂中的应用。
进一步,所述应用为将所述的间充质干细胞来源的外泌体溶解在无菌PBS中制成针剂。所述的间充质干细胞来源的外泌体的给药方式为静脉注射。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
1.本发明将miR-143-3p片段转染进入MSCs,使得到的外泌体(miR-143-MSC-sEVs)比转染阴性对照片段(NC)的MSCs外泌体(NC-MSC-sEVs)肿瘤抑制效果更强,安全性更高,对非小细胞肺癌小鼠治疗效果更佳:miR-143-MSC-sEVs比NC-MSC-sEVs更有效的抑制肿瘤组织增殖、诱导肿瘤组织凋亡,抑制肿瘤生长。因此,miR-143-MSC-sEVs在非小细胞肺癌等肿瘤相关疾病的临床治疗领域具有非常可观的应用前景。
2.与传统的细胞治疗相比,本发明提供的外泌体可在-80℃长期保存(至少1年),溶解后即可使用,避免了MSCs冻存和复苏的不便,以及可能造成细胞活力和功能改变的风险。与脂质体等人工合成载体相比,本发明提供的外泌体具有更丰富的生物活性、天然肿瘤靶向性及生物相容性,应用前景更广阔。
3.本发明制备的间充质干细胞外泌体原料是脐带,其采集为无创性操作,且脐带属于废弃物再利用,不涉及法律伦理问题,脐带的来源广泛、数量充足,能够满足规模化生产需求。
附图说明:
图1为间充质干细胞来源外泌体的鉴定:(A)Western-blot法检测外泌体标志蛋白CD63、TSG101和Alix,GRP94为在外泌体中不表达;(B)透射电镜观察外泌体的形态;(C)纳米颗粒跟踪分析仪分析外泌体的粒径范围。
图2为转染miR-143-3p对MSCs细胞活性的影响:A为转染不同浓度miR-143-3p对MSCs细胞活性的影响;B为空白对照(PBS)、阴性对照和转染miR-143-3p对MSCs细胞活性的影响。
图3为miR143-MSC-sEVs、NC-MSC-sEVs和MSC-sEVs外泌体(A)中及外泌体处理的A549细胞(B)中miR-143-3p的含量。
图4为外泌体miR143-MSC-sEVs、NC-MSC-sEVs和MSC-sEVs外泌体对A549细胞增殖的影响。
图5为外泌体miR143-MSC-sEVs和NC-MSC-sEVs对A549细胞凋亡的影响:(A)流式图;(B)统计图。
图6为外泌体miR143-MSC-sEVs、NC-MSC-sEVs和MSC-sEVs对A549上皮间质转化的影响。
图7为外泌体miR143-MSC-sEVs和NC-MSC-sEVs对A549细胞迁移的影响:(A)流式图;(B)统计图。
图8为外泌体miR143-MSC-sEVs和NC-MSC-sEVs对A549细胞浸润的影响:(A)流式图;(B)统计图。
图9为外泌体miR143-MSC-sEVs和NC-MSC-sEVs对非小细胞肺癌小鼠肿瘤生长的影响:(A)模型小鼠治疗示意图;(B)小鼠肿瘤块图片;(C)小鼠肿瘤体积变化;(D)小鼠肿瘤质量;(E)小鼠体重。
图10为外泌体miR143-MSC-sEVs和NC-MSC-sEVs对非小细胞肺癌小鼠肿瘤组织的影响:(A)小鼠肿瘤组织HE染色;(B)小鼠肿瘤组织免疫组化Ki67染色;(C)小鼠肿瘤组织免疫荧光TUNEL染色。
具体实施方式:
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此:
实施例1间充质干细胞来源外泌体的提取与鉴定
1.分离培养人脐带间充质干细胞(MSCs)
采集自中国南京鼓楼医院的三名健康产妇。脐带采集前,产妇需经严格的病原体检测,包括艾滋病病毒、乙肝病毒、丙肝病毒、巨细胞病毒、梅毒螺旋体和支原体等微生物,确认安全后使用。经产妇知情同意,采集正常足月剖宫产胎儿脐带,剪取近胎盘端20cm左右脐带,置于4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)保存备用,4小时内使用完毕。
在超净工作台内,使用4℃预冷的含0.01%青霉素和链霉素(购于Gibco公司,下同)的PBS冲洗脐带,去除脐带残余血液。在DMEM/F12培养基(购于Gibco公司,下同)中,剥除脐带中脐动脉与脐静脉,随后将脐带剪成2mm3左右的组织碎块,4℃、300g离心10分钟,小心弃去离心管中的上清。向组织沉淀中加入250U/ml的胶原酶II、100U/ml中性蛋白酶和10U/ml透明质酸酶(购于Gibco公司),37℃振荡消化2-3小时至组织基本消化完全,4℃、300g离心10分钟,弃上清。然后用DMEM/F12培养基洗3次,将沉淀重悬于含10%胎牛血清(购于Gibco公司)的DMEM/F12完全培养基中,接种于T25培养瓶(购于Gibco公司),37℃,5%CO2培养箱培养。3-4天后,轻轻晃动培养瓶,更换新鲜的含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基,待细胞生长融合达80%左右时,用2.5g/L的胰酶(购于Gibco公司)消化,传代接种至10cm的培养皿中,记为第1代,此后每传代一次记为1代。
2.MSCs外泌体的提取
将MSCs培养上清液收集至50ml离心管(购于Corning公司)中,4℃、300g离心10分钟,以去除死细胞;将上清液转移至新的离心管中,4℃、2000g离心10分钟,以去除大的碎片;将上清液转移至新的离心管中,4℃,10000g离心30分钟,以去除细胞器及小颗粒;小心将上清液转移至无菌超速离心管(购于Beckman公司)中,进行第一次超速离心,4℃、100000g离心70分钟(Beckman超速离心机)。用移液器将上清小心的移除,离心管底的沉淀用无菌PBS重悬,进行第二次超速离心,4℃、100000g离心70分钟;用移液器将上清小心的移除,得到的沉淀为外泌体。根据收集培养基的体积,加入适量无菌PBS重悬(每50mL收集的培养基最终使用不超过50μL的PBS重悬),然后用0.22μM离心式过滤器(购于默克密理博公司)过滤,以避免超速离心过程可能造成的污染。获得的无菌外泌体重悬液用BCA蛋白浓度检测试剂盒(购于碧云天公司)检测总蛋白浓度后,-80℃分装保存。
3.MSCs外泌体的鉴定
用Western blot法检测MSCs来源外泌体的标志蛋白:将50μL稀释的外泌体悬液加入200μL EP管,向管中加入50μL蛋白裂解液裂解,充分均匀,4℃,裂解30min。BCA蛋白浓度检测试剂盒检测蛋白浓度。每个样本配置同等的蛋白上样量。每份样本分别取20μg蛋白,加5×蛋白上样缓冲液,95℃金属浴10min。10%SDS-PAGE电泳;70V转膜2小时;5%的BSA室温封闭1.5小时;TBST洗1次,分别加入5%的BSA稀释的抗CD63、TSG101、Alix和GRP94一抗(均购于Abcam公司),4℃摇床孵育过夜;TBST洗膜3次,每次5分钟,加入用5%BSA稀释的相应HRP二抗(1:3000),室温摇床孵育1.5小时;用TBST洗膜3次,每次5分钟,滴加混好的ECL发光液,化学发光凝胶成像仪内成像,拍照。结果如图1A所示,外泌体标志蛋白CD63、TSG101和Alix在外泌体中均有表达,非标志蛋白GRP94不表达。
用透射电镜观察外泌体的形态:将外泌体稀释后,取40μL置于铜网上,使用2%磷钨酸染色2min,再用滤纸吸走多余的液体并适度晾干,放入透射电子显微镜的设备中,进行拍照。结果如图1B所示,外泌体为圆形囊泡状结构,符合外泌体特征。
用NanoSight纳米颗粒跟踪分析仪(Malvern公司)分析外泌体的粒径范围:用无菌PBS缓冲液稀释外泌体,上样检测分析获得外泌体的粒径分布图。如图1C所示,粒径平均大小为69.6+/-6.6nm,符合外泌体特征。
该实施例结果说明,用超速离心法成功获取了MSCs来源的外泌体(MSC-sEVs),它表达标志蛋白CD63、TSG101和Alix,平均粒径在70nm左右,透射电子显微镜下观察到的形态符合外泌体的特征。
实施例2转染miR-143-3p的间充质干细胞外泌体(miR143-MSC-sEVs)及转染阴性对照片段的间充质干细胞外泌体(NC-MSC-sEVs)的制备
1.miR-143-3p转染片段浓度确定:
人脐带MSCs的获取同实施例1。取第3-6代的MSCs接种于10cm培养皿中,待细胞融合至约40%-60%时,将培养基更换为无血清、无青霉素和链霉素的新鲜DMEM/F12培养基。用500μL的Opti-MEM培养基(购于Gibco公司,下同)稀释20μL转染试剂LipofectamineRNAiMAX(购于Gibco公司,下同),轻柔吹打混匀;用500μL的Opti-MEM培养基稀释30μL母液浓度为20μmmol/L的miR-143-3p片段(购于锐博生物,下同),并轻柔吹打混匀;将上述转染试剂稀释液与转染片段稀释液轻柔吹打混匀,制成转染混合液,室温下避光静置18分钟;将上述转染混合液加入上述MSCs培养皿中,使miR-143-3p在培养皿中的终浓度分别为50nmol/L、100nmol/L、150nmol/L和200nmol/L;37℃,5%CO2培养箱,孵育4-6小时;取出培养皿,用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,更换新鲜含10%无外泌体胎牛血清的DMEM/F12培养基(无外泌体胎牛血清是将胎牛血清经100000g,18小时超速离心去除沉淀后获得),37℃,5%CO2培养箱继续孵育72小时,CCK-8实验(同仁化学)检测不同浓度miR-143-3p对MSCs细胞活力的影响,结果如图2A所示,转染72小时后,100nmol/L及以下浓度的miR-143-3p对MSCs细胞无毒性;
进一步的,按上述方法,分别向MSCs细胞中转染100nmol/L的miR-143-3p片段(货号R1127,购于锐博生物,下同)和阴性对照片段(货号R0516,购于锐博生物,下同),空白对照组为向MSCs细胞中加入无菌磷酸缓冲液(PBS),结果如图2B所示,100nmol/L的miR-143-3p片段和阴性对照片段均对MSCs细胞无毒性。后续实验miR-143-3p片段和阴性对照片段转染终浓度均为100nmol/L。
2.转染miR-143-3p的间充质干细胞外泌体及转染阴性对照片段的间充质干细胞外泌体制备:
取第3-6代的MSCs接种于10cm培养皿中,待细胞融合至约40%-60%时,将培养基更换为无血清、无青霉素和链霉素的新鲜DMEM/F12培养基。用Opti-MEM培养基稀释转染试剂Lipofectamine RNAiMAX,轻柔吹打混匀;用Opti-MEM培养基稀释miR-143-3p片段或阴性对照片段,并轻柔吹打混匀;将转染试剂稀释液与转染片段稀释液轻柔吹打混匀,制成转染混合液,室温下避光静置18分钟;分别将上述转染混合液加入上述MSCs培养皿中,miR-143-3p在培养皿中的终浓度为100nmol/L;37℃,5%CO2培养箱,孵育4-6小时;取出培养皿,用无菌磷酸盐缓冲液(PBS)清洗,更换新鲜含10%无外泌体胎牛血清的DMEM/F12培养基。根据实验需求,继续37℃,5%CO2培养箱孵育48-72小时。分别收集转染miR-143-3p片段的MSCs细胞培养上清、转染阴性对照片段的MSCs培养上清和不转染的MSCs培养上清至50mL离心管中,按实施例1所述方法,分别提取外泌体,获得转染miR-143-3p片段的MSCs外泌体(miR143-MSC-sEVs)、转染阴性对照片段的MSCs外泌体(NC-MSC-sEVs)和不转染的MSCs外泌体(MSC-sEVs)。
分别向上述三种外泌体miR143-MSC-sEVs、NC-MSC-sEVs和MSC-sEVs中加入Trizol裂解液(购于Thermo),提取外泌体中的RNA。用qPCR实验分析miR-143-3p在miR143-MSC-sEVs、NC-MSC-sEVs和MSC-sEVs中的含量。结果如图3A所示,miR143-MSC-sEVs中miR-143-3p的含量显著高于NC-MSC-sEVs和MSC-sEVs,约高75倍。
该实施例结果说明所述转染miR-143-3p的MSCs来源外泌体(miR143-MSC-sEVs)成功负载miR-143-3p片段。
实施例3转染miR-143-3p的间充质干细胞外泌体对非小细胞肺癌细胞的抑制作用
实验所用非小细胞肺癌细胞A549购于中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。转染miR-143-3p片段的MSCs外泌体(miR143-MSC-sEVs)和转染阴性对照片段的MSCs外泌体(NC-MSC-sEVs)获取方法同实施例2。不转染的间充质干细胞外泌体(MSC-sEVs)获取方法同实施例1。向A549细胞中分别加入miR143-MSC-sEVs、NC-MSC-sEVs和MSC-sEVs,24小时后,提取各组A549细胞RNA,qPCR实验分析A549细胞中miR-143-3p的含量,以U6作为内参。miR-143-3p的引物序列为:前向引物5’-ACACTCCAGCTGGGTGAGATGAAGCAC-3’,反向引物5’-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGGAGCTACA-3’;U6的引物序列为:前向引物5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,反向引物5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。结果如图3B所示,与NC-MSC-sEVs和MSC-sEVs处理组相比,miR143-MSC-sEVs处理组A549细胞中miR-143-3p表达水平上调约20倍。说明miR143-MSC-sEVs能够将miR-143-3p片段递送至A549细胞。
转染miR-143-3p的间充质干细胞外泌体(miR143-MSC-sEVs)对非小细胞肺癌细胞的具体作用如下:
1.对非小细胞肺癌细胞A549增殖的抑制作用
将生长状态良好的A549细胞接种于96孔板中,每孔加入95μL,细胞密度为105个/mL。观察到细胞贴壁后,实验组分别加入5μl miR143-MSC-sEVs、NC-MSC-sEVs或MSC-sEVs,外泌体终浓度为25μg/mL,对照组加入5μl PBS缓冲液。空白组不接种细胞,在培养孔中加入95μL培养基及5μl PBS缓冲液。各组分别培养24、48、72h后,向培养孔中加入10μl的CCK-8试剂,培养箱孵育1-2h。酶标仪检测450nm处的吸光度,并计算A549细胞存活率。细胞存活率公式如下:细胞存活率(%)=[(As-Ab)]/[(Ac-Ab)]×100%。实验组为AS,对照组为Ac,空白组为Ab。如图4所示,转染阴性对照片段的MSCs外泌体(NC-MSC-sEVs)与不转染的MSCs外泌体(MSC-sEVs)功能一致,均能抑制A549细胞增殖,说明转染阴性对照片段不影响MSCs外泌体的功能。结果还显示,与NC-MSC-sEVs和MSC-sEVs相比,miR143-MSC-sEVs具有更显著的抑制A549细胞增殖的活性。
2.对非小细胞肺癌细胞A549凋亡的促进作用:
将生长状态良好的A549细胞接种于6孔板中,细胞密度为105个/孔。观察到细胞贴壁后,分别加入miR143-MSC-sEVs或NC-MSC-sEVs,对照组加入等PBS缓冲液。48小时后,不含EDTA的胰酶消化细胞,并转移至至离心管中,250g,5min,4℃,弃上清。预冷的无菌PBS缓冲液250g,5min,4℃洗涤细胞沉淀两遍,细胞重悬后转移至流式管中。按照Annexin V/PI凋亡检测试剂盒(购于BD公司)说明书用CytoFLEX S流式细胞仪(Beckman)分析细胞凋亡情况。如图5所示,与对照组相比,NC-MSC-sEVs可以诱导A549细胞凋亡(21.32%),而miR143-MSC-sEVs诱导A549细胞凋亡(53.60%)的作用更加强。
3.对非小细胞肺癌细胞A549细胞迁移、浸润和EMT的作用:
细胞上皮间质转化(EMT)与肿瘤细胞的迁移、浸润过程密切相关。qPCR实验分析三种外泌体miR143-MSC-sEVs、NC-MSC-sEVs和MSC-sEVs对A549细胞上皮间质转化情况的影响:将生长状态良好的A549细胞接种于6孔板中,细胞密度为105个/孔。观察到细胞贴壁后,分别加入MSC-sEVs、NC-MSC-sEVs和miR143-MSC-sEVs处理,对照组加入PBS。24小时后,提取各组细胞RNA,qPCR仪(ABI公司荧光定量PCR仪)检测A549细胞中上皮标志物E-cadherin和间充质标志物N-cadherin和vimentin的表达情况。结果如图6所示,MSC-sEVs处理组与NC-MSC-sEVs处理组的变化一致,与对照组相比,这两组外泌体都使A549细胞中E-cadherin的含量减少,间充质标志物N-cadherin和vimentin的含量升高,说明两组外泌体均促进A549细胞发生EMT。而miR143-MSC-sEVs处理的A549细胞,E-cadherin的含量上调,N-cadherin和vimentin的含量下调,显著逆转了前两组MSCs外泌体对EMT的促进作用。
通过划痕实验分析A549迁移能力的变化:将生长状态良好的A549细胞接种于6孔板中,待培养孔中的细胞长满,用10μL吸头(购自Merck公司)在细胞层上划出一条直线,弃去原有的培养基,无菌PBS缓冲液清洗,以去除直线内残余细胞。重新加入2ml DMEM/F12培养基,实验组并分别加入miR143-MSC-sEVs或NC-MSC-sEVs,对照组加入等PBS缓冲液,拍摄划痕所在区域并用记号笔标记拍摄位置,记为0小时。将培养板置于培养箱中继续培养。24小时后,取出六孔板,在显微镜下寻找标记位置,进行第二次拍摄。细胞迁移率计算公式如下:细胞实际迁移距离=0小时细胞划痕宽度-24小时细胞划痕宽度;迁移率=实验组平均迁移距离/对照组平均迁移距离×100%。结果如图7所示,NC-MSC-sEVs对A549细胞迁移有促进作用,而miR143-MSC-sEVs处理组A549细胞迁移率显著低于对照组及NC-MSC-sEVs处理组,说明miR143-MSC-sEVs能够抑制A549细胞迁移,显著提高MSCs外泌体的安全性。
通过transwell实验分析A549侵袭能力的变化:将基质胶铺入悬挂于24孔板的Transwell小室,5小时后,向小室中加入200μL A549细胞悬液,细胞密度为1×105个/ml。孵育24小时后,4%多聚甲醛固定,结晶紫染色,显微镜拍摄侵袭的细胞。结果如图8所示,NC-MSC-sEVs对A549细胞浸润有促进作用,而miR143-MSC-sEVs处理组A549细胞浸润显著低于NC-MSC-sEVs处理组,略低于对照组,说明miR143-MSC-sEVs不促进A549细胞浸润,逆转了NC-MSC-sEVs对A549浸润的促进作用,显著提高了外泌体的安全性。
该实施例结果说明,miR143-MSC-sEVs在细胞水平比NC-MSC-sEVs更有效的抑制非小细胞肺癌A549细胞增殖,促进A549细胞凋亡。miR143-MSC-sEVs能够抑制A549细胞迁移,不诱导A549细胞浸润和EMT。与NC-MSC-sEVs相比,miR143-MSC-sEVs安全性大大提高。
实施例4转染miR-143-3p片段的间充质干细胞来源外泌体对非小细胞肺癌荷瘤小鼠的治疗作用
构建A549肺癌模型:实验所用4-6周龄雌性BALB/c裸鼠购于上海斯莱克实验动物有限责任公司,饲养于无病原体环境中。将处于对数生长期的A549细胞用无菌PBS缓冲液重悬,细胞浓度调整至107个/ml,在每只BALB/c裸鼠右侧皮下注射100μL细胞悬液,记为第0天。第7天,分组进行第一次尾静脉注射治疗。对照组:尾静脉注射100μL无菌PBS;miR143-MSC-sEVs治疗组:尾静脉注射50μg的miR143-MSC-sEVs(溶于100μL无菌PBS);NC-MSC-sEVs治疗组:尾静脉注射50μg的NC-MSC-sEVs(100μL无菌PBS)。第14天,各组进行第二次同样剂量的尾静脉注射治疗(图9A)。第21天,处死小鼠并剥离肿瘤。根据实验需要,将肿瘤组织存放于4%多聚甲醛、-80℃冰箱或液氮中。
1.小鼠体重及肿瘤大小和质量的观察
第7天开始,每隔48小时记录小鼠体重、肿瘤体积。第21天,以颈椎脱臼的方式处死小鼠,取出肿瘤块,称量肿瘤块质量。体积公式为:V=长×短径2/2。结果如图9B-D所示,与对照组相比,miR143-MSC-sEVs和NC-MSC-sEVs治疗组均可抑制小鼠体内肿瘤的生长;与NC-MSC-sEVs治疗组相比,miR143-MSC-sEVs治疗组抑制作用更强。此外,与对照组相比,miR143-MSC-sEVs治疗及NC-MSC-sEVs治疗均不影响小鼠的体重(图9E)。
2.小鼠的肿瘤组织HE染色、免疫组化染色
将保存于4%多聚甲醛的肿瘤组织,进行石蜡包埋,并进行HE染色。结果如图10A所示,miR143-MSC-sEVs治疗或NC-MSC-sEVs治疗的小鼠,其肿瘤组织内均出现出明显的坏死,miR143-MSC-sEVs治疗组比NC-MSC-sEVs治疗组效果更明显。
进一步将各组肿瘤组织用免疫组化的方法进行Ki-67(购于Roche公司)和TUNEL(购于武汉servicebio公司)标记。
Ki67用于标记增殖中的细胞,将保存于4%多聚甲醛的各组肿瘤组织,进行石蜡包埋,并进行免疫组化Ki-67标记,将封片之后的切片置于显微镜下,拍照记录。结果如图10B所示,与对照组相比,miR143-MSC-sEVs治疗后的小鼠肿瘤组织,Ki67阳性细胞比例显著减少,且优于NC-MSC-sEVs治疗组。说明在体内,miR143-MSC-sEVs具有比NC-MSC-sEVs更有效的抑制肿瘤细胞增殖的能力。
TUNEL用于标记凋亡的细胞,将保存于4%多聚甲醛的各组肿瘤组织,进行石蜡包埋,并进行免疫荧光TUNEL标记,将封片之后的切片置于荧光显微镜下,拍照记录。结果如图10C所示,与对照组相比,miR143-MSC-sEVs治疗组小鼠肿瘤组织中TUNEL阳性细胞比例明显增多,且优于NC-MSC-sEVs治疗组;说明在体内,miR143-MSC-sEVs具有比NC-MSC-sEVs更有效的诱导肿瘤细胞凋亡的能力。
该实施例结果说明,miR143-MSC-sEVs对非小细胞肺癌小鼠的治疗作用显著优于NC-MSC-sEVs,主要表现为miR143-MSC-sEVs比NC-MSC-sEVs更有效的抑制非小细胞肺癌小鼠肿瘤生长,抑制小鼠肿瘤组织增殖,促进小鼠肿瘤组织凋亡。
统计学分析
实验结果均重复三次以上,结果以平均值±标准差表示,应用Prism5软件统计分析并作图,组间比较采用单因素方差分析,两组比较采用t检验,*P<0.05,**P<0.001,***P<0.0001。
Claims (10)
1.一种间充质干细胞来源的外泌体,其特征在于:所述间充质干细胞来源的外泌体是由转染miR-143-3p片段的间充质干细胞分泌得到。
2.如权利要求1所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法,其特征在于所述方法为:
用miR-143-3p片段转染细胞融合至40%-60%的间充质干细胞,转染完成后,更换新鲜培养基进行细胞培养24-72小时,所得上清液经后处理,得到所述间充质干细胞来源的外泌体。
3.如权利要求2所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法,其特征在于:所述miR-143-3p片段的转染终浓度为10~200nmol/L。
4.如权利要求2所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法,其特征在于:所述间充质干细胞为人脐带间充质干细胞。
5.如权利要求4所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法,其特征在于:所述间充质干细胞为传代3-6代的人脐带间充质干细胞。
6.如权利要求5所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法,其特征在于所述人脐带间充质干细胞按如下方法分离获得:采集正常足月剖宫产胎儿脐带,剪取近胎盘端20cm,置于4℃预冷的无菌磷酸盐缓冲液保存备用,4小时内使用;在超净工作台内,用4℃预冷的含0.01%青霉素和0.01%链霉素的PBS冲洗去除残余血液;将所得脐带置于DMEM/F12培养基中,剥离脐动脉与脐静脉,随后将所得脐带剪成2mm3的组织碎块,4℃、300g离心10分钟,弃去上清,向所得组织沉淀中加入250U/mL的胶原酶II、100U/mL中性蛋白酶和10U/mL透明质酸酶,37℃振荡消化2-3小时至消化完全,4℃、300g离心10分钟,弃上清;所得一次沉淀用DMEM/F12培养基重悬离心洗涤3次,所得二次沉淀重悬于含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基中,接种于T25培养瓶,37℃,5%CO2培养箱培养3-4天后,轻轻晃动培养瓶,更换新鲜的含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培养基,待细胞生长融合达80%时,用2.5g/L的胰酶溶液消化,传代接种至培养皿中,培养得到所述人脐带间充质干细胞;再传代2-5次,即得3-6代的人脐带间充质干细胞。
7.如权利要求2所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法,其特征在于所述转染的步骤如下:分离培养人脐带间充质干细胞,取3-6代的人脐带间充质干细胞,接种于培养皿中,加入细胞培养基,待细胞融合至40%-60%时,加入转染终浓度为10~200nmol/L的miR-143-3p片段,细胞培养箱中培养4-6小时,即完成所述转染。
8.如权利要求2所述的间充质干细胞来源的外泌体的制备方法,其特征在于所述后处理为:将所述上清液4℃、300g离心10分钟,弃沉淀,所得第二次上清4℃、2000g离心10分钟,弃第三次沉淀,所得第三次上清4℃,10000g离心30分钟,弃第四次沉淀,所得第四次上清4℃、100000g离心70分钟,移除第五次上清,所得第五次沉淀用无菌PBS重悬后4℃、100000g离心70分钟,移除第六次上清,所得第六次沉淀即为所述间充质干细胞来源的外泌体。
9.如权利要求1所述的间充质干细胞来源的外泌体在制备治疗肿瘤的药物或者制剂中的应用;所述肿瘤为miR-143低表达的肿瘤。
10.如权利要求9所述的应用,其特征在于:所述肿瘤为非小细胞肺癌。
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