JPH06501160A

JPH06501160A - 細胞の増殖をコントロールするための方法及び組成物

Info

Publication number: JPH06501160A
Application number: JP3517250A
Authority: JP
Inventors: ブレッデセン　デイル　イー．
Original assignee: ザリージェンツオブザユニバーシティオブカリフォルニア
Priority date: 1990-09-17
Filing date: 1991-09-11
Publication date: 1994-02-10
Also published as: US5324654A; EP0556231A1; CA2091759A1; WO1992005272A1; EP0556231A4

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】細胞の増殖をコントロールするための方法及び組成物の！、ｘ更Ω五里分団本発明は、概していうと細胞が増殖する速度や、細胞の増殖能力をコントロールするために用いられる方法及び組成物に関する。更に特定していうと、本発明は、細胞に悪性腫瘍をもたらしたり、他の変質を引き起こしたりすることな（、完全に可逆的な方法で細胞の増殖を増加させるのに用いられる方法及び組成物に関するものである。

２、笑遷沃亙Ω朦男特殊な細胞の変性は、多くの病気に関係している。このような病気には、デュシエン（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ）の筋ジストロフイー病やインシュリン依存性の真性糖尿病、パーキンソン病、ハンチングトン病、アルツハイマー病、オリプ橋小脳皮質の萎縮など、他の多くの病気が含まれる。これらの病気に対して考えられる治療としては、同系統のものから細胞を採取し、それらを患者に導入することを行う方法が挙げられる。しかしながら、外来の細胞を拒絶することが、そのような治療法を進めるにつれて生じる、あるいは生じる可能性のある繰り返し起こる問題である。（バートリッジ　ティー、エイ、らの文献（Ｐｒｔｒｉｄｇｅ、　Ｔ、　Ａ、、　ａｔ　ａｌ、　（１９８９）　Ｎａｔｕｒｅ　３３７：１７６−１７９）の記載参照。）上記と同一の病気を治療する他のアプローチとしては、患者自身の細胞を用いる方法である。患者自身の細胞を使用することは、免疫学的に完全に適合するので、その結果、細胞を拒絶することに関連して起こる問題を解決することができる。このような方法においては、患者の細胞を患者自身から採取し、一般的には適当なタンパク質が生産されるような工業的手法を用いてインビトロＯｎ　ｖｒｔｒｏ）で成長させてから、患者への再導入が行われる。

上記のアプローチに伴って生じる重大な問題は、全ての正常な細胞（悪性腫瘍性でない細胞）に！！瘍サプレッサー遺伝子が発現することである。これらの腫瘍サプレッサー遺伝子は、細胞の増殖を阻害するようなタンパク質を生産する。ウィルスやトランスフォーミング遺伝子は阻害性のタンパク質に結合するように用いられており、それによって細胞の増殖は影響されてきた。しかしながら増殖している細胞は悪性！！瘍性であり、従って患者に導入するにはふされしいものではない。例えばパピローマウィルス（乳頭腫ウィルス）等のウィルスは、ａｍサプレッサー遺伝子の多彩なタンパク質生産物と結合したり、不活性化させたりすることによって、少な（とも部分的に細胞の成長を助長する。Ｒｂ（レチノプラストーマ遺伝子生産物（網膜芽腫遺伝千生Ｍ物））及びｐ５３は、腫瘍サプレッサー遺伝子によって生産される二種の特殊な遺伝子生産物である。これらの二種の生産物が結合すると、細胞が悪性腫瘍になる。しかしながら、Ｒｂのみが結合している場合には、細胞は顕著に増殖するものの永久に増殖するわけではなく、細胞が悪性腫瘍になることはない。（ホーレイーネルソン　ビー、らの文献（Ｈａｗｌｅｙ−Ｎｅｌｓｏｎ　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、　（＋９８９）　ＥＩＩＢＯＪ　８　（＋２：３９０５−３９１０））の記載参照。）Ｒｈ遺伝子生産物の発現を妨げて、インビトロで患者の細胞を増殖するための方法を確立することが望まれる。更に、Ｒｂ遺伝子生産物の発現を防止することが、ウィルスやオンコ遺伝子（腫瘍遺伝子）を使用することなく行うことができるのであれな望ましいであろう。加えて、Ｒｂ遺伝子生産物の発現を抑制することは可逆的であって、かつ比較的短い期間でなされるべきである。

の本発明にかかる方法は、細胞群の非−悪性腫瘍性の増殖を助長する方法である。

この方法は、例えばＲｂ遺伝子生産物などの腫瘍サプレッサー遺伝子生産物の発現を、ウィルスやオンコ遺伝子を用いることな（インビトロで特異的にかつ可逆的に抑制するものである。本発明は、例えばＲｂ遺伝子などの腫瘍サプレッサー遺伝子に対して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて細胞群をインビトロで処理することは、遺伝子生産物の発現を特異的にかつ可逆的に阻害するという発見に基づいてなされている。その結果として細胞群の非−悪性腫瘍性の増殖が助長される。

本発明の特徴は、細胞群を、８個から３０個のヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチド（ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ）を用いてインビトロで処理することである。そのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトのＲｂのｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇずｒａｇｅ）である初めの３０個のヌクレオチドの部分にアンチセンスである。これらの特殊なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、さまざまなタイプの細胞においてＲｂ遺伝子生産物の発現を特異的かつ可逆的に阻害するものである。例えば本発明は、細胞群の非−悪性ｇ瘍性の増殖を助長することができる点で有用である。ここで細胞群としては、ヒトのあるいはヒトのでない繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）　、ケラチン生成細胞（ｋｅｒａｔ　１ｎｏｃｙｔｅｓ）、神経側芽細胞（ｇｌ　１ｏｂｌａｓｔｓ）　ｓ肝細胞（ｈｅｐａＨｃ　ｃｅｌｌｓ）、腎細胞（ｒｅｎａｌ　ｃｅｌｌｓ）　、膵臓の島の細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃ　ｃｅｌｌｓ）、筋原細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔｓ）、神経芽細胞（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｓ）　、及び内皮性細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌ　ｃｅｌｌｓ）が挙げられる。これらの細胞群は、本発明に従ってアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理した場合に、増殖が助長されかつ完全に可逆的となる。

本発明の他の特徴としては、Ｒｂ遺伝子生産物の生産を可逆的及び特異的に阻害する点で効果的である二種の特定のアンチセンスオリゴヌクレオチドを明らかにしたことである。この二種のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３’　−ＴＡＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＴＧＧ−５“及び３’　−ＧＧＧＧＣＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧ−５′で示すようなヌクレオチド配列を持っている。これらの二個のアンチセンスオリゴヌクレオチドは、薬物学的に適合するキャリアの中に存在させた形態で、細胞群の処理を行うことによって皮−悪性腫瘍性の細胞を増殖するために用いられる。

また本発明は、細胞の変性を生じるような種々の病気に対して患者を治療するのに用いられる。そのような患者に対しては、特殊な細胞群をその患者から採取して、本発明に従ってインビトロでその細胞の増殖を行うための処理を行い、続いてその増殖した細胞を患者に再導入する操作が行われる。望ましい場合には、インビトロで増殖された細胞群を、再移植を行う前の欠陥のある遺伝子生産物を置換する目的で、通常では遺伝子操作が行われるであろう。本発明の有する上記に記載したような特徴や付随する効果、更に他の多くの特徴や付随する効果は、以下の詳細な説明を参照することによってより良（理解することができるであろう。

の　な　１本発明は、広くさまざまな細胞群あるいは細胞培養物の非−悪性腫瘍性の増殖を助長するのに有用である。本発明に従って増殖を行うことのできる典型的な細胞群には、ヒトのあるいはヒトのでない繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、神経側芽細胞、肝細胞、腎細胞、膵臓の島の細胞、筋原細胞、神経芽細胞、及び内皮性細胞が含まれる。これらの全ての細胞は、ｓｒｉ芽ＩＩ（Ｒｈ）遺伝子生産物を発現する腫瘍サプレッサー遺伝子を含んでいる。本発明には、細胞によってＲｂ遺伝子生産物が生産されるのを抑制するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、インビトロにおいて細胞群を処理することが関与して埴る。その結果として、細胞群の増殖は、細胞を悪性腫瘍化させることなく増進される。

本発明を実施するために、細胞群あるいは培養物を、細胞の増殖や成長を促進するような正常の状態の条件のもとにインビトロで維持する必要がある。そのような成長を促進するのに必要とされる覆々の培養培地や条件は、処理が行われる細胞群のタイプに応じて広（さまざまに変えられる。インビトロでの細胞群の培養や成長に要求される条件は、個々のタイプの細胞についてよく知られており、詳細に説明は行わないことにする。

本発明によると、インビトロで存在している細胞培養物あるいは細胞群は、細胞の！！瘍サプレッサー遺伝子によるＲｂ遺伝子生産物の発現を阻害する目的で、充分量のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理が行われる。アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた細胞の処理は、コーエン　ジェイエス（Ｉｉ集）の書籍である「オリゴヌクレオチド：遺伝子発現のアンチセンス阻害Ｊ　（１９８９年フロリダ州、ポカレイトン所在のＣＲＣプレスインコーポレイテッド社発行）　（Ｃｏｈｅｎ　ＪＳ（ｅｄ）：　Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｒｉｄｅｓ：　Ａｎｔｉｓａｎｓｅ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒｓ　ｏｆ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ A　ＣＲＣＰｒｅｓｓ　Ｉｎｃ、、　Ｂｏｃａ　Ｒａｔｏｎ、　Ｆｌｏｒｉｄａ、　１９８９．）に詳細に記述されている手法で行われる。

本発明に従って用いられる好適なオリゴヌクレオチドは、ヒトのＲｂのｍＲＮＡによるＲｂ遺伝子生産物の発現をうまく阻害することのできるアンチセンスヌクレオチドを含んでいなくてはならない。好ましくはそのアンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトのＲｂのｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ｏｐａｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａ■ｅ）である初めの３０個のヌクレオチドの部分にアンチセンスであるような、８個から３０個までのヌクレオチドを含むであろう。

ヒトのｌｌｊ！＋芽層（Ｒｂ）のｍＲＮＡは、多くの研究者によって研究されており、そのヌクレオチド配列はよく知られている。（リー　イーーワイらの文献（Ｌｅｅ、　Ｅ−Ｙ、　ｅｔ　ａｔ、　Ｐｒ。

ｃ、　Ｎａｔｌ、＾ｃａｄ、　Ｓｃｉ、　ｕｓＡ　１９８８；８５．６０１７− ６０２１）参照。）　二種の好適なアンチセンスオリゴヌクレオチドは、３’− ＴＡＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＴＧＧ−５’及び３’−ＧＧＧＧＣＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧ−５’で示すようなヌクレオチド配列を持っている。Ｒｂ遺伝子生産物の発現を阻害するような、他のアンチセンスオリゴヌクレオチドも用いることができる。これらには、リポザイム（ｒｉｂｏｚｙｍｅｓ）の他に、オリゴデオキシヌクレオチド（通常の形態のもの、フォスフオワチオネート類、メチルーフｔスフォネート類、あるいは他の誘導体）やオリゴ（リポ）ヌクレオチドが含まれる。

アンチセンスオリゴヌクレオチドの細胞培養物への投与は、従来の手法に従って行われる。典型的には細胞への導入は、５μＭから２００μＭ１あるいはそれ以上のアンチセンスオリゴヌクレオチド（修飾されたいくつかのオリゴヌクレオチドではそれ以下の含有量であってもよいかもしれない。）を含む培地中に細胞を浸漬することによって、あるいはリポソーム（Ｉｉｐｓｏ■ｅ）や幻影細胞（ｒｅｄ　ｅｅｌＩ　ｇｈｏｓｔ）にそのオリゴヌクレオチドを封入することによって、あるいは縦胞内にそのオリゴヌクレオチドを注入することによって行うことができる。抗体やリガンドを、特殊な細胞にオリゴヌクレオチドを封入したリポソームを取り込ませるために用いることができる。

本発明は、通常、インビトロにて細胞群の非−悪性腫瘍的な増殖を助長するために用いることが可能である。しかしながら本発明は、特定の細胞が変性を起こしているような病気を治療することにおいて特に有効である。これらの病気としては、デ二シエンの筋ジストロフイー病やインシュリン依存性の真性糖尿病、パーキンソン病、ハンチングトン病、アルツハイマー病、オリプ橋小脳皮質の萎縮病、更に他の多くの病気が含まれる。本発明に従って行われるこれらの病気の治療では、患者の細胞を採取し、前記に記載したアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる手法を利用してインビトロでそれらを増殖させることが行われる。増殖させた細胞は、続いて患者にそのまま再移植されるか、あるいは例えばデュシエンの筋ジストロフイー病におけるシストロフィン（ｄｙｓｔｒｏｐｈｉｎ）などの欠陥のある遺伝子生産物を置換するための技術が一般的には施される。その後、一般的に操作が行われた増殖させた細胞は、再移植される。

次に実際に行われた実施例を記述する。

９６ウエル（ｗｅｌｌ）に植え付けられた１６番目のバブセージ（ｐａｓｓａｇｅ）のヒトのフィブロプラスト（繊維芽細胞：ＡＴＣＣ＃ＣＲＬ　１４７７）を、ｌウェルあたり２０００：　５０００；　１０，０００及び２０，０００の密度になるように移植を行う。それらを、１０％のウシ胎児の血清（ＦＢＳ）を含有するダルベツコのイーグル培地を応用した培地（ＤＭＥ：ライタブカー　バイオプロダクツ（Ｗｈｉｔｔａｋｅｒ　Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ））を用いて、５％のインキュベーター中、３７℃で培養を行った。細胞を１６時間放置した後、その細胞を、上記に記述した二種の継続的なアンチセンスオリゴヌクレオチドがそれぞれ、０．５．１Ｏ１１５，２０１３０、あるいは４０μＭの濃度に調整しであるもののうちのいずれかのアンチセンスオリゴヌクレオチド溶液を用いて処理した。これらの二種のオリゴヌクレオチドは、ＨＲＢ−１及びＨＲＢ−２とラベルされていて、下記の表において、Ｒｂ遺伝子の関連ある部位に対応させて示されている。

表５′−＾ＧＧＣＧＴＣＡＴＧＣＣＧＣＣＣＡ＾＾＾ＣＣＣＣＧＣ＾＾＾＾＾ＣＧＧＣＣＧＣＣＡＣＣＧＣＣ〜３′Ｒｂ　ｍＲＮＡ３’−ＴＡＣＧＧＣＧＧＧＴＴＴＴＧＧ−５’ＢＲ−１３’−ＧＧＧＧＣＴＴＴＴＴＧＣＣＧＧ−５’ＢＲ−２Ｒｂ遺伝子の関連のある部分と対応しているアンチセンスオリゴヌクレオチド（ＨＲＢ−１及びＨＲＢ−２）が、血清を含有していない培地へ、１ウエルあたり３５μｍの体積となるように添加された。更に３２時間たった後、アンチセンスオリゴヌクレオチドを、同Ｌ：’１ＭＫで再び加えた。３２時間たってから、三種の分析が行われた。その分析では、（１）ジメチルチアゾール　ジフェニルテトラゾリウムブロマイド（ＭＴ　Ｔ　：　ｄｉｍｅｔｈｙｌｔｈｔａｚｏｌ　ｄｉｐｈｅｎｙｌ　ｔｅｔｒａｚｏｌｉｕｍ　ｂｒｏｌｉｄｅ）の分析：　（２）ブロモデオキシクリジン（ＢｒｄＵ：　ｂｒａｍｏｄｅｏｘｙｕｒｔｄＩｎｅ）の導入の分析；　（３）細胞の数、の三種が調べられた。ＢｒｄＵの分析では、導入されたブロモデオキシウリジンの検出を行うためのモノクローナル抗体（アメルザム　インコーホレイテッド社製（Ａ■ｅｒｓｈａ■、Ｉｎｃ、））を用いることによって測定がなされた。

三種すべての分析結果において、１−３０μＭのコントロールのアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理を行った細胞に対して得られた結果と、処理を行わなかった細胞に対して得られた結果との間に差異はなかった。これに対して、ＲｂｍＲＮＡに二種のアンチセンスオリゴヌクレオチドのそれぞれ１５μＭを組み合わせたものを用いて細胞の処理を行った場合では、ＭＴＴ分析を分光測定法で測定を行うと、生産物の形成が増加していることが明らかであった。増加の割合は、アンチセンスの濃度と植え付けられた細胞の数とに依存しており、最大５０％に至っていた。原糸分裂に起因するこの増加を、ＢｒｄＵの導入及び細胞の数の両者によって確認を行った。ＢｒｄＵの導入は、ＲｂｍＲＮＡにアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理をした細胞においては３倍の増加が見られた。ＢｒｄＵ導入における増加は、アンチセンスを適用した２４時間以内に生じ、そして４８時間後には減少した。この育糸分裂の増加速度は、細胞数の増加を反映していた。

濃度依存性は、ＢｒｄＵの導入及び細胞の数の両者分析において、アンチセンスオリゴヌクレオチドの効果として観察された。最高の効果は、２０μＭのトータルのオリゴヌクレオチド濃度（ＨＲＢ−１及びＨＲＢ−２のそれぞれがＩＯμＭずつ）で生じた。６０μＭ及びそれ以上の濃度では、この研究で用いられた全てのオリゴデオキシヌクレオチドは、Ｂ　ｒ　ｄ　Ｕの導入及びＭＴＴから生じる生産物の形成が減少することから、細胞障害性であると考えられる。６０μＭの限界点は、オリゴデオキシヌクレオチドを更に精製することによって増大されるであろう。

細胞のＲｂレベルにおけるアンチセンスオリゴヌクレオチドの効果を測定するために、処理が行われた細胞と処理が行われていない細胞についてイムノフルオレッセンス染色（１ｍ５ｎｏｆ　Ｉｕｏｒｅｓｃｅｎｔ　ｓｔａｉｎｉｎｇ）を行った。その染色は、ヒトＲｂに対して直接的に作用するモノクローナル抗体（ファーミンゲン（Ｐｈａｒ■ｉｎｇｅｎ）から得られたモノクローナル抗体　Ｍｈ −Ｒｂ−０２）を用いて行われた。この抗体は、Ｒｂのフォスフォリル化された形態と、フｔスフｔリル化されていない形態の両方に結合する。核の染色は、処理を行わなかったグループの全ての細胞において観察されたが、Ｒｂ−１アンチセンスオリゴヌクレオチドを用！１１で処理を行った細胞においては顕著に減少していた。

同様の手法が、他の二種の推定的な腫瘍サプレッサー遺伝子であるｐ５３（アール、ザクトーホーリ、ビー、ビエンツータドマー、デー、ジボール、エム、オージンらの文献（Ｒ，Ｚａｋｕｔ−Ｈｏｕｒｉ、　Ｂ、　Ｂｊｅｎｚ−Ｔａｄｍｏｒ、　Ｄ、　Ｇｉｖｏｌ、　Ｉ４．０ｒｅｎ、　ＥＭＢＯＪ、　４．１２５１　（１９８５）参照）及びＤＣＣ（イー、アール、フエーロンらの文献（Ｅ。

Ｒ，Ｆｅａｒｏｎ　ａｔ　ａｌ、、　５ｃｉｅｎｃｅ　２４７．４９　（＋９９０）参照）に対して、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて行われた。Ｒｂ遺伝子でなされたのと同様に、ｐ５３遺伝子においても、そのオープンリーディングフレームである初めの３０個のヌクレオチドに対する二種の１５個のヌクレオチドからなるアンチセンスオリゴヌクレオチドが合成された。ＤＣＣにおいては、ＤＣＣアンチセンスオリゴヌクレオチドとＲｂアンチセンスオリゴヌクレオチドとの間で、インターオリゴヌクレオチド　ハイブリダイセージジン（１ｎｔｅｒｏｌ　ｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｈｙｂｒ　１ｄｉｚａｔ４ｏｎ）を行う可能性があるために、二種の１５個のヌクレオチド、すなわちイニシェーク− ＡυＧ（１４）に関して一６番目から＋２４２４番目クレオチドにアンチセンスであるような二種のヌクレオチドが合成された。イニシエータ−ＡＵＧに関してナンバーリングすると、ナンバー２３から２８番目のＲｂアンチセンスヌクレオチド（３’　−ＡＡＡＣＣＣ−５’　）は、ナンバー７から１２番目のアンチセンスヌクレオチド（３’−ＧＧＧＴＴＴ−５”）に相捕的である。ｐ５３　ｍＲＮＡに対するアンチセンスヌクレオチドを３０μＭ１及びＤＣＣに対するアンチセンスヌクレオチドを１０−３０μＭ用いた場合においてＭＴＴの分析を行うと、ＲＢ−１アンチセンスヌクレオチドから結果として生じる増加と同様の増加が認められた。これに対して、ＲＢ−１アンチセンスヌクレオチドと同様でない点は、ｐ５３　ｍＲＮＡ及びＤＣＣｍＲＮＡに対するアンチセンスヌクレオチドにおいては、ＢｒｄＵの導入あるいは細胞の数のどちらも変化を生じないことであった。

しかしながら、ＤＣＣｍＲＮＡに対するアンチセンスヌクレオチドは、細胞の肥大（ハイパートロピー（ｈｙｐｅｒ　ｔｒｏｐｙ））に影響を及ぼしていた。細胞が肥大していることは、フローサイトメトリー（ｆｌｏｗ　ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を行うことによって、１細胞あたりのタンパク質容量が増加したり細胞の大きさが増大したりすることから明らかにされる。

上記これらの結果から、Ｒｂのレベルが減少することによって細胞の増殖が生じることが分かる。同様の実験が、筋原細胞や神経芽細胞を用いても行われた。

更に、全ての細胞種の中にＲｂが存在していること、また、ウィルス生産物がこれらのいたるところにある腫瘍サプレッサー遺伝子生産物と結合して実質的にすべての細胞種を不滅化するように作用すること（フレデリクセン　デー、らの文献（Ｆｒｅｄｅｒｔｋｓｅｎ　Ｄ、　ａｔ　ａｌ、　Ｎｅｕｒｏｎ　１９８８　；　ｌ：４３９−４４８）、及びワーネス　ビーエイ、レビン　エイ　ジェイ、ハクレイ　ビー　エムの、ヒトのパピローマウィルスのタイプ１６及び１８　Ｅ６プロテインと、Ｉ）５３との関連（Ｗｅｒｎｅｓｓ　ＢＡ。

Ｌｅｖｉｎｅ　ＡＪ、　Ｍｏｔｌｅｙ　ＰＮ、　Ａｓ５ｏｃｉａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｈｕｍａｎ　Ｐａｐｉｌｌｏ＊ａｖｉｒｕｓ　Ｔｙｐｅｓ@１８　ａｎｄ　１８　Ｅ８　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｐ５３．５ｃｉｅｎｃｅ　ｌ５ｓｏ：　２４８　：　７６−８３）の記載参照。）がよく知られていることから、同様のアンチセンス効果が、他の細胞においても生じるであろうということが予測される。そのうえ数種の細胞種においては、−個以上の！！瘍サプレッサー遺伝子を同時に阻害することによって、より大きく成長する可能性がある。例えば、Ｒｂアンチセンスを経て分裂を増加させることやＤＣＣアンチセンスを経て代謝を増加させることによって、あるいは増殖を助長する目的で二種の腸瘍サプレッサー遺伝子にアンチセンスを組み合わせることによっても、増殖は増大する。

この明細書に引用されている文献の内容は、参照文献としてここに紐み入れろれる。

このように、ここでは本発明の例示としての実施例を記述したが、この実施例の記載は説明をするだけのものであって、本発明は別記した請求の範囲の記載によってのみ限定がなされるものであることを、当業者においては理解されたい。

この明細書に記述された文献及び他の参唄論文は、参考文献としてここに組み入れられる。

国際調査報告一一劇４ｍ＃−”’　ＰＡＴ１０５９１１０６５７４

Claims

【特許請求の範囲】

１．細胞群の増殖をコントロールための方法において、前記細胞群の細胞は腫瘍サプレツサー遺伝子生産物を発現するような腫瘍サプレッサー遺伝子を含んでいて、前記方法が、前記細胞群を充分量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理を行うことによって前記腫瘍サプレッサー遺伝子による前記腫瘍サプレッサー遺伝子生産物の発現を阻害し、それによって前記細胞群の非−悪性腫瘍性の増殖を増加させる段階を含むことを特徴とする細胞群の増殖をコントロールするための方法。
２．前記腫瘍ＤＢサプレッサー遺伝子生産物が、網膜芽腫（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）遺伝子生産物であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の細胞群の増殖をコントロールするための方法。
３．前記細胞群が、ヒトのあるいはヒトのでない繊維芽細胞（ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔｓ）、ケラチン生成細胞（ｋｅｒａｔｉｎｏｃｙｔｅｓ）、神経膠芽細胞（ｇｌｉｏｂｌａｓｔｓ）、肝細胞（ｈｅｐａｔｉｃｃｅｌｌｓ）、腎細胞（ｒｅｎａｌｃｅｌｌｓ）、膵臓の島の細胞（ｐａｎｃｒｅａｔｉｃｃｅｌｌｓ）、筋原細胞（ｍｙｏｂｌａｓｔｓ）、神経芽細胞（ｎｅｕｒｏｂｌａｓｔｓ）、及び内皮性細胞（ｅｎｄｏｔｈｅｒｉａｌｃｅｌｌｓ）からなるグループから選択された細胞であることを特徴とする請求の範囲第１項記載の細胞群の増殖をコントロールするための方法。
４．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒトの網膜芽腫（ｒｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａ）ｍＲＮＡにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドのグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第２項記載の細胞群の増殖をコントロールするための方法。
５．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒトの網膜芽腫ｍＲＮＡのオープンリーディングフレーム（ｏｐｅｎｒｅａｄｉｎｇｆｒａｍｅ）である初めの３０個のヌクレオチドの部分に対してアンチセンスである８個から３０個の範囲にあるヌクレオチドを含有することを特徴とする請求の範囲第２項記載の細胞群の増殖をコントロールするための方法。
６．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、３′【配列があります】５′あるいは３′【配列があります】５′で示すようなヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求の範囲第５項記載の細胞群の増殖をコントロールするための方法。
７．患者の体内にある細胞群の増殖を行ってその患者を治療するための方法であって、その方法が以下の段階、即ち：前記患者から細胞群を採取してインビトロにおける細胞培養物を生成させる段階であって、そのインビトロにおける細胞培養物の細胞が腫瘍サプレッサー遺伝子生産物を発現するような腫瘍サプレッサー遺伝子を含んでいることを特徴とする段階；前記インビトロにおける細胞群を充分量のアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて処理を行うことによって前記腫瘍サプレッサー遺伝子による前記腫瘍サプレッサー遺伝子生産物の発現を阻害し、それによってインビトロにおける処理が行なわれた細胞培養物中での前記細胞の増殖を増加させる段階；前記インビトロにおける処理が行われた細胞培養物を、生化学的に好適な条件のもとに充分な時間だけ維持することによって、前記患者から採取した前記細胞群よりも多くの細胞を含有するインビトロにおける成熟した細胞培養物を生成させる段階；及び前記インビトロにおけル成熟した細胞群を前記患者に導入する段階、を含むことを特徴とする患者を治療するための方法。
８．患者に導入する段階の前に、前記インビトロにおける細胞群を遺伝子的に操作する段階を更に含むことを特徴とする請求の範囲第７項記載の患者を治療するための方法。
９．前記腫瘍サプレッサーい伝子生産物が、網膜芽腫（ｒｅｔｉｎｏｂ１ａｓｔｏｍａ）遺伝子生産物であることを特徴とする請求の範囲第７項記載の患者を治療するための方法。
１０．前記患者から採取された前記細胞群が、ヒトのあるいはヒトのでない繊維芽細胞、ケラチン生成細胞、神経膠芽細胞、肝細胞、腎細胞、膵臓の島の細胞、筋原細胞、神経芽細胞、及び内皮性細胞からなるグループから選択された細胞であることを特徴とする請求の範囲第７項記載の患者を治療するための方法。
１１．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒトの網膜芽腫（ｒｅｔｉｎｏｂ１ａｓｔｏｍａ）ｍＲＮＡにアンチセンスであるオリゴヌクレオチドからなるグループから選択されることを特徴とする請求の範囲第７項記載の患者を治療するための方法。
１２．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、ヒトの網膜芽腫ｍＲＮＡのオーブンリーディングフレーム（ｏｐｅｎ　ｒｅａｄｉｎｇ　ｆｒａｍｅ）である初めの３０個のヌクレオチドの部分に対してアンチセンスである８個から３０個の範囲にあるヌクレオチドを含有することを特徴とする請求の範囲第１１項記載の患者を治療するための方法。
１３．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、３′【配列があります】５′あるいは３′【配列があります】５′で示すようなヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求の範囲第１２項記載の患者を治療するための方法。
１４．ヒトの網膜芽腫ｍＲＮＡにアンチセンスである８個から３０個の範囲にあるヌクレオチドを含有するアンチセンスオリゴヌクレオチドと、そのアンチセンスオリゴヌクレオチドに対して薬物学的に好適なキャリアとを含むことを特徴とする組成物。
１５．前記アンチセンスオリゴヌクレオチドが、３′【配列があります】５′あるいは３′【配列があります】５′で示すようなヌクレオチド配列を有することを特徴とする請求の範囲第１４項記載の組成物。