JP2001502522A - 網膜芽細胞腫関連植物蛋白 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、網膜芽細胞腫蛋白をコードする植物細胞ＤＮＡ配列の分離と特性付けに基づく。かかる所見は、細胞周期、細胞成長および植物細胞分化の考えられる調節因子としての網膜芽細胞腫植物蛋白の構造的および機能的特性に基づく。この理由から、数ある態様の中でも特に、植物性細胞、植物および／または植物性ウイルスの増殖制御における網膜芽細胞腫蛋白あるいはそれをコードするＤＮＡ配列の使用、ならびに網膜芽細胞腫植物蛋白に基づく制御経路の操作を通して修飾されたベクター、細胞、植物あるいは動物、あるいは動物細胞の使用を特許請求する。

Description

【発明の詳細な説明】 網膜芽細胞腫関連植物蛋白 説明 本発明は、植物および動物系において生物活性を持つ蛋白、かかる蛋白の発現 をコードするポリヌクレオチド、これらの蛋白とポリヌクレオチドを同定し合成 する際に使用するためのオリゴヌクレオチド、組換え形態のポリヌクレオチドを 含むベクターおよび細胞、これらを含む植物および動物、ならびに植物の成長と ウイルスに対する植物の脆弱性の制御における該蛋白とポリヌクレオチドおよび それらの断片の使用に関する。 細胞周期の進行は正と負のエフェクターによって調節されている。後者の中で 、網膜芽細胞腫（retinoblastoma）感受性遺伝子（Ｒｂ）の産物は哺乳類細胞の Ｇ１期への移行を抑制する。哺乳類細胞では、Ｒｂは、細胞のＤＮＡ複製に必要 な遺伝子のプロモーター領域の配列と相互作用することが知られている、Ｅ２Ｆ ファミリーの転写因子の機能を阻害することによって、Ｇ１／Ｓの移行を調節す る（たとえば、Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ．Ｃｅｌｌ ８１，３２３（１９９５ ）；Ｎｅｖｉｎｓ，Ｊ． Ｒ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２５８，４２４（１９９２）参照）。動物細胞に感染する ＤＮＡ腫瘍ウイルスは、ＬＸＣＸＥモチーフを介してＲｂ蛋白と相互作用する腫 瘍蛋白を発現し、Ｒｂ−Ｅ２Ｆ複合体を破壊して、細胞をＳ期へと押し進める（ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ、同上；Ｌｕｄｌｏｗ，Ｊ．Ｗ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．７，８６６ （１９９３）；Ｍｏｒａｎ，Ｅ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．７，８８０（１９９３）；Ｖ ｏｕｓｄｅｎ，Ｋ．ＦＡＳＥＢ Ｊ．７，８７２（１９９３））。 本発明者は、植物ゲミニウイルス（geminivirus）の効率的な複製がウイルス ＲｅｐＡ蛋白におけるＬＸＣＸＥアミノ酸モチーフの完全性を必要とすること、 およびＲｅｐＡが酵母においてヒトＲｂファミリーのメンバーと相互作用しうる ことを明らかにした（Ｘｉｅ，Ｑ．，Ｓｕａｒｅｚ−Ｌｏｐｅｚ，Ｐ．およびＧ ｕｔｉｅｒｒｅｚ，Ｃ．ＥＭＢＯ Ｊ．１４，４０７３（１９９５））。植物Ｄ 型サイクリンにおけるＬＸＣＸＥモチーフの存在も報告されている（Ｓｏｎｉ， Ｒ．，Ｃａｒｍｉｃｈａｅｌ，Ｊ．Ｐ．，Ｓｈａｈ，Ｚ．Ｈ．およびＭｕｒｒａ ｙ，Ｊ．Ａ．Ｈ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７，８５−１０３（１９９５））。 本発明者は、初めて植物Ｒｂ蛋白およびかかる蛋白をコード する対応するポリヌクレオチドの特徴的配列を特定し、そのような蛋白とポリヌ クレオチドを分離し、特に、かかる蛋白を既知の動物Ｒｂ蛋白配列と識別する配 列を特定した。発明者は、トウモロコシから植物性Ｒｂ植物蛋白をコードする既 知のＤＮＡ配列を決定した。これを以後ＺｍＲｂ１と称する。発明者は、ＺｍＲ ｂ１が、その機能に必須のＬＸＣＸＥモチーフを含む植物ゲミニウイルス蛋白、 ＲｅｐＡと酵母において相互作用することを明らかにした。発明者はさらに、Ｚ ｍＲｂ１あるいはヒトＲｂファミリーのメンバーであるヒトｐ１３０のいずれか をコードするプラスミドでトランスフェクションした植物細胞では、ゲミニウイ ルスのＤＮＡ複製が減少することを測定した。 重要な点として、発明者の研究は、植物と動物の細胞が成長制御のために基本 的に同様の戦略を共有していると考えられること、従ってヒトＲｂ蛋白ならびに ＺｍＲｂ１のような植物Ｒｂ蛋白は、特に植物の治療、診断、成長制御あるいは 研究において有用性を持つことが期待されること、およびそのような多くの植物 蛋白が動物において同様の有用性を持つであろうことを示唆していることである 。 本発明の最初の態様では、植物細胞および／または植物ウイ ルスの増殖を制御する上での網膜芽細胞腫蛋白の使用を提供する。特に、本発明 は、ウイルスが正常な増殖のためにその蛋白のひとつたとえばウイルスＲｅｐＡ 蛋白中においてＬＸＣＸＥアミノ酸モチーフの完全性を必要とする、植物細胞に おけるウイルス感染および／または増殖の制御を提供する。そのようにして制御 される特定の植物ウイルスはゲミニウイルスである。 そのような蛋白を用いた制御の好ましい方法は、これらを直接に、あるいは処 理することを所望する植物細胞中にそれらの発現をコードするＤＮＡあるいはＲ ＮＡを導入することによって、植物細胞に適用することを含む。網膜芽細胞腫蛋 白を過剰発現すること、あるいはウイルスのＬＸＣＸＥモチーフと相互作用する が細胞の通常の機能には影響を及ぼさないＲｂ蛋白あるいはそのペプチド断片を 発現することにより、正常なウイルス増殖を阻害することができ、従ってその細 胞から近隣細胞へと感染を拡大させることも可能である。 あるいは、ＤＮＡあるいはＲＮＡ転写のために必要なプロモーターを含むベク ターの形態で植物細胞中にアンチセンスＤＮＡあるいはＲＮＡを導入することに より、Ｒｂ蛋白の発現、従ってＳ期への移行を阻害するために周知のアンチセン ス機序を利 用することも可能であろう。そのような植物は、数ある態様の中でも特に、たと えば酵母においてＤＮＡあるいはＲＮＡを高いレベルまで複製するのに役立つで あろう。細胞中にアンチセンスＤＮＡを導入する方法は当業者には周知である： たとえば、「遺伝子操作の原理−遺伝子工学入門（１９９４）Ｒ．Ｗ．Ｏｌｄ＆ Ｓ．Ｂ．Ｐｒｉｍｒｏｓｅ；Ｏｘｆｏｒｄ−Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎ ｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓ 第５版、ｐ３９８参照。 本発明の第二の態様では、植物に特徴的なＲｂ蛋白の発現をコードする、特に ＤＮＡあるいはｃＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の形態の組換え核酸を提供する。この核酸 は、既知の動物Ｒｂ蛋白の核酸とは異なるひとつまたはそれ以上の特徴的な領域 を特徴とし、本文中の配列番号１、塩基３１−２０７９によって例示される。 該ＤＮＡあるいはＲＮＡは、配列番号１中のコドンのヌクレオチドに改変され た置換を含む配列を持つことができ、かかるＲＮＡにおいてはＴはＵである。最 も好ましいＤＮＡあるいはＲＮＡは、低いストリンジェント性を条件として配列 番号１のポリヌクレオチドとハイブリダイズすることができ、これは好 ましくは高いストリンジェント性を条件として生じるハイブリダイゼーションで ある。 「低いストリンジェント性の条件」および「高いストリンジェント性の条件」 の表現は当業者には明白であるが、米国特許第５２０２２５７号、Ｃｏｌ−９− Ｃｏｌ １０の中で好都合に例示されている。何らかの修飾が為されて、異なる アミノ酸、好ましくは配列番号１に対応する同じ種類のアミノ酸を持つ蛋白の発 現が導かれる場合、それは保存的置換である。そのような置換は当業者には既知 であり、たとえば米国特許第５３８０７１２号が参照され、これは該蛋白が網膜 芽細胞腫蛋白に関して活性を持つ時にのみ想定される。 好ましいＤＮＡあるいはｃＲＮＡは、特にｐ１３０と比較してヒトＲｂ蛋白と ３０％−７５％の相同性、より好ましくは５０％−６４％の相同性を備えたＡお よびＢポケットサブ領域を持つ植物Ｒｂ蛋白をコードする。特にそのようにコー ドされた植物Ｒｂ蛋白は、保存されたヒトＲｂのＣ７０６アミノ酸を持つ。好ま しくはＡおよびＢポケットの間のスペーサー配列は動物Ｒｂ蛋白に関しては保存 されず、そのような動物蛋白で認められる同じ領域と５０％未満の相同性である ことが好ましい。 最も好ましくはそのようにコードされた蛋白は、ここに添付される配列表の配列 番号２の蛋白と８０％以上の相同性、より好ましくは９０％以上、最も好ましく は９５％以上の相同性を持つ。特に、配列番号１の塩基３１−２０７９、あるい は配列番号１全体の組換えＤＮＡ、あるいは配列番号２のＺｍＲｂ１をコードす るトウモロコシｃＤＮＡクローンをコードする対応するＲＮＡが提供される。 本発明の第三の態様では、第二の態様の組換えＤＮＡあるいはＲＮＡによって 発現される蛋白、そのようなＤＮＡあるいはＲＮＡから誘導される新規蛋白、お よび変異誘発性ＰＣＲプライマーの使用のような突然変異誘発手段によって自然 に生じるＤＮＡあるいはＲＮＡから誘導される蛋白を提供する。 第四の態様では、本発明のコレクトセンスあるいはアンチセンスの組換えＤＮ ＡあるいはＲＮＡを含むベクター、細胞、植物および動物を提供する。 第一態様の特に好ましい使用においては、第二あるいは第三態様のＤＮＡ、Ｒ ＮＡあるいは蛋白を細胞に投与することを含む、細胞あるいはウイルスの増殖を 制御する方法が提供される。かかる投与は、蛋白の場合には直接であってもよく 、あるいは ＤＮＡによる植物種子細胞のエレクトロポレーション、あるいは細胞またはウイ ルス増殖を抑制しうる本発明の蛋白あるいはその断片を発現するもしくは過剰発 現することができる発現ベクターによる細胞の形質転換のような間接的手段も含 みうる。 あるいは、該方法は本発明のｃＤＮＡのアンチセンスＲＮＡを生成することが できる発現ベクターを使用する。 該植物蛋白および核酸のもうひとつの特異的な特徴は、配列番号２のアミノ酸 １−９０の配列に対応するＮ末端領域および配列番号１の塩基３１−３００に対 応するヌクレオチド配列を含む。これらの配列は、動物の配列が３００以上のア ミノ酸と９００以上の塩基対を持つのに対し、１５０未満と４５０未満単位しか 有していないことを特徴とする。 制限を意図しない以下の実施例を参照して本発明をさらに例示する。当業者に は、これらに照らして、ここに添付される特許請求の範囲内に含まれるさらなる 具体例が想定されるであろう。 図 図１．図１中の図Ａは、本発明のＺｍＲｂ１蛋白とヒト網膜芽細胞腫蛋白の相対 的長さを示す。図１中の図Ｂは、ＺｍＲｂ１、 ツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ）、ニワトリ、ラットおよび３種類のヒト蛋白（Ｒ ｂ、ｐ１０７およびｐ１３０）のポケットＡとポケットＢのアミノ酸配列を示す 。 図２．この図は、ＷＤＶウイルスとＷＤＶから誘導されるｐＷｏｒｉベクターの 主要な特性と、ＬＸＣＸＥモチーフが植物細胞における複製に必要であることを 確認するために使用した欠失と突然変異の位置を示す地図である。実施例１ ＤＮＡおよび蛋白発現クローンの分離 トウモロコシの根と成葉から、基本的にＳｏｎｉら（１９９５）が述べたよう にして液体窒素中であらかじめ凍結しておいた材料を粉砕することにより、全Ｒ ＮＡを分離した。無作為プライミングした３２Ｐ標識ＰＳｔＩ内部断片（１．４ ｋｂ）にハイブリダイズして、主要と主要でないｐ７５ＺｍＲｂ１ ｍＲＮＡを 同定した。 その後ｐ１３０の相同トウモロコシの既知のＥＳＴ配列に相補的にデザインし た５’標識オリゴヌクレオチドにハイブリダイズして、１ＺＡＰＩＩ（Ｓｔｒａ ｔａｇｅｎｅ）中のトウモロコシｃＤＮＡライブラリーの部分（１０６ｐｆｕ） を スクリーニングした。これらのオリゴヌクレオチドは、５’−ＡＡＴＡＧＡＣＡ ＣＡＴＣＧＡＴＣＡＡ／Ｇ（Ｍ．５ｍ、ｎｔ位置１４１１−１４３８）と５’− ＧＴＡＡＴＧＡＴＡＣＣＡＡＣＡＴＧＧ（Ｍ．３ｃ、ｎｔ位置１６０６−１５９ ０）（Ｉｓｏｇｅｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）であった。 ２回目のスクリーニング後、製造者が勧めるプロトコールに従ってＥｘＡｓｓ ｉｓｔヘルパーファージ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）でのｉｎ ｖｉｖｏ切除によ り、陽性クローンからｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＳＫ−（ｐＢＳ）ファージミド を分離した。ＳｅｑｕｅｎａｓｅＴＭキット（ＵＳＢ）を用いてＤＮＡ塩基配列 決定を行った。 ｐ７５ＺｍＲｂ１をコードするｍＲＮＡの５’末端をＲＡＣＥ−ＰＣＲによっ て決定した。ポリ−Ａ＋ｍＲＮＡをオリゴ−ｄＴ−セルロース（Ａｍｅｒｓｈａ ｍ）でのクロマトグラフィーによって精製した。オリゴヌクレオチドＤｒａＩ３ ５（５’−ＧＡＴＴＴＡＡＡＡＴＣＡＡＧＣＴＣＣ、ｎｔ位置１１３−９６）を 用いて最初の鎖を合成した。９０℃で３分間変性した後、ＲＮアーゼ処理によっ てＲＮＡを取り除き、ｃＤＮＡを回収して、ターミナルトランスフェラーゼとｄ ＡＴＰで５’尾部を 付加した。その後、プライマーＤｒａＩ３５とＳｔｒａｔａｇｅｎｅ ｃＤＮＡ 合成キットのリンカー−プライマー（５０塩基対）を用いてＰＣＲ断片を増幅し た。 そのようにして生成した陽性クローンのひとつは、制限分析に従えば、使用し た発現配列タグに含まれる領域の５’および３’に伸びる〜４ｋｂ挿入部分を含 んでいた。最長のｃＤＮＡ挿入部分（３７４７塩基対）に対応するヌクレオチド 配列を配列番号１に示す。このＺｍＲｂ１ ｃＤＮＡは、６８３アミノ酸の蛋白 （予想上のＭｒ ７５２４７、ｐ７５ＺｍＲｂ１）をコードすることができる単 一オープンリーディングフレームとそれに続く１６４６塩基対の３’非翻訳領域 を含む。同様の長さの非翻訳領域は、哺乳類のＲｂ ｃＤＮＡにおいても認めら れている（Ｌｅｅ，Ｗ．−Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５，１３９４（１９８ ７）；Ｂｅｒｎａｒｄｓ，Ｒ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ ＳＡ ８６，６４７４（１９８９））。ノザンブロット分析は、根の分裂組織と 成葉の両方から誘導したトウモロコシ細胞が、長さ〜２．７±０．２ｋｂの主要 メッセージを含むことを示唆している。さらに、〜３．７±０．２ｋｂのマイナ ーメッセージも現われる。他の種で異種起源の転 写産物が検出されている（Ｄｅｓｔｒｅｅ，Ｏ．Ｈ．Ｊ．ら、Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ ．１５３，１４１（１９９２））。 ｐＷｏｒｉにおいてＷＤＶ蛋白をコードする配列の大部分を削除することによ り、プラスミドｐＷｏｒｉ△△を構築した（ＳａｎｚとＧｕｔｉｅｒｒｅｚ、未 発表）。ｐＢＳベクターにおいてＺｍＲｂ１ ｃＤＮＡの上流にＣａＭＶ ３５ Ｓプロモーター（ｐＷＤＶ３：３５ＳＧＵＳから得た）を挿入することにより、 プラスミドｐ３５Ｓ．Ｒｂ１を構築した。ＺｍＲｂ１配列の代わりにヒトｐ１３ ０の完全なコード配列をｐ３５Ｓ．Ｒｂ１に導入することにより、プラスミドｐ ３５Ｓ．１３０を構築した。ｐ３５Ｓ．Ｒｂ１プラスミドにおいてＺｍＲｂ１の 代わりにＷＤＶ ＲｅｐＡとＲｅｐＢ ＯＲＦｓをコードする配列に置換するこ とにより、プラスミドｐ３５．Ａ＋Ｂを構築した（Ｓｏｎｉ，Ｒ．とＭｕｒｒａ ｙ，Ｊ．Ａ．Ｈ．Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８，４７４−４７６（１９９ ４）参照）。 ヌクレオチド第３１位置のメチオニンコドン付近の配列はコンセンサス翻訳開 始を含む（Ｋｏｚａｋ，Ｍ．Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６，９４７（１９８７ ））。ｃＤＮＡが完全な長さのＺｍＲｂ１コード領域を含むかどうかを調べるた めに、 推定上のイニシエーターＡＵＧに近接する領域から誘導したオリゴヌクレオチド を用いたＲＡＣＥ−ＰＣＲによって、ｍＲＮＡの５’末端を増幅した。これは〜 １５０塩基対の断片を生じるはずである。結果は、完全なコード領域を含むＺｍ Ｒｂ１ｃＤＮＡクローンと一致している。 ＺｍＲｂ１蛋白は、Ｒｂファミリーのすべてのメンバーにおいて存在する「ポ ケット」のＡおよびＢサブ領域と相同な区域を含む。これらのサブ領域は保存さ れないスペーサーによって分けられている。ＺｍＲｂ１も、保存されていないＮ 末端とＣ末端領域を含む。全体として、ＺｍＲｂ１はＲｂファミリーのメンバー と〜２８−３０％のアミノ酸同一性（〜５０％の類似性）を共有し（Ｈａｎｎｏ ｎ，Ｇ．Ｊ．，Ｄｅｍｅｔｒｉｃｋ，Ｄ．＆ Ｂｅａｃｈ，Ｄ．Ｇｅｎｅｓ Ｄ ｅｖ．７，２３７８（１９９３）；Ｃｏｂｒｉｎｉｋ，Ｄ．，Ｗｈｙｔｅ，Ｐ． ，Ｐｅｅｐｅｒ，Ｄ．Ｓ．，Ｊａｃｋｓ，Ｔ．＆ Ｗｅｉｎｂｅｒｇ，Ｒ．Ａ． 同上、ｐ．２３９２（１９９３）、Ｅｗｅｎ，Ｍ．Ｅ．，Ｘｉｎｇ，Ｙ．Ｌａｗ ｒｅｎｃｅ，Ｊ．Ｂ．およびＬｉｖｉｎｇｓｔｏｎ，Ｄ．Ｍ．Ｃｅｌｌ ６６， １１５５（１９９１））（Ｌｅｅ Ｗ．Ｌ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３５，１３ ９４ （１９８７）；Ｂｅｒｎａｒｄｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６，６９７４（１９８９））、ＡおよびＢサブ領域が最も高い相同性 を示す（〜５０−６４％）。興味深いことに、その機能にとって極めて重要なヒ トＲｂのアミノ酸Ｃ７０６（Ｋａｙｅ，Ｆ．Ｊ．，Ｋｒａｔｚｋｅ Ｒ．Ａ．， Ｇｅｒｓｔｅｒ，Ｊ．Ｌ．およびＨｏｒｏｗｉｔｚ，Ｊ．Ｍ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，６９２２（１９９０））も、トウモロコ シｐ７５ＺｍＲｂ１中に保存されている。 注：５６１−５７７アミノ酸はプロリンに富む領域を含む。 ＺｍＲｂ１は、リン酸化の潜在的部位であるサブ領域Ａの５’尾部のひとつお よびＣ末端領域のいくつかと共に、サイクリン依存性キナーゼ（ＣＤＫｓ）によ るリン酸化のための１６のコンセンサス部位、ＳＰあるいはＴＰを含む。核酸は 、これらの部位のひとつまたはそれ以上が変化あるいは欠失していて、蛋白をリ ン酸化に対して、従ってその機能性に対してより抵抗性にしている、たとえばＥ ２Ｆあるいは同様のものに結合している蛋白をコードするものが好ましい。これ は、ＰＣＲによって行われる突然変異誘発によって容易に実施できる。実施例２ ｉｎ ｖｉｖｏ活性 コムギ矮小性ゲミニウイルス（ＷＤＶ）の複製は、ウイルスＲｅｐＡ蛋白の無 傷のＬＸＣＸＥモチーフに依存している。このモチーフは、酵母においてヒトＲ ｂファミリーのメンバーであるｐ１３０との相互作用を仲介することができる。 それ故、発明者は、酵母の２ハイブリッド系を用いることによりｐ７５ＺｍＲｂ １がＷＤＶ ＲｅｐＡと結合することができるかどうかを検討した（Ｆｉｅｌｄ ｓ，Ｓ．とＳｏｎｇ，Ｏ．Ｎａｔｕｒｅ３４０，２４５−２４６（１９８９）） 。酵母細胞を、融合ＧＡＬ４ＢＤ−ＲｅｐＡ蛋白をコードするプラスミドおよび 異なるＧＡＬ４ＡＤ融合蛋白をコードするプラスミドで同時形質転換した。ＧＡ Ｌ４ＡＤ−ｐ７５ＺｍＲｂ１融合も、ＧＡＬ４ＢＤ−ＲｅｐＡと結合して、ヒス チジン不在下でレシピエント酵母細胞を増殖させることができた。この相互作用 は、ヒトｐ１３０蛋白に関して見られるものよりもわずかに強かった。ＲｅｐＡ も、ｐ７５ＺｍＲｂ１のＮ末端切断形態にある程度まで結合することができた。 ＲｅｐＡ−ｐ７５ＺｍＲｂ１相互作用におけるＬＸＣＸＥモチーフの役割を、我 々が以前にヒトｐ１３０と の相互作用を破壊することを示したＷＤＶ ＲｅｐＡの点突然変異（Ｅ１９８Ｋ ）を用いて評価した。融合ＧＡＬ４ＢＤ−ＲｅｐＡ（Ｅ１９８Ｋ）をコードする プラスミドとＺｍＲｂ１の同時形質転換は、ＲｅｐＡとｐ７５ＺｍＲｂ１間の相 互作用がＬＸＣＸＥモチーフを通して起こることを示唆した。 これに関して、ＷＤＶ ＲｅｐＡのＥ１９８Ｋ突然変異体は、動物のウイルス 性腫瘍蛋白の類似点突然変異体と同様に行動する（Ｍｏｒａｎ，Ｅ．，Ｚｅｒｌ ｅｒ，Ｂ．，Ｈａｒｒｉｓｏｎ，Ｔ．Ｍ．およびＭａｔｈｅｗｓ，Ｍ．Ｂ．Ｍｏ ｌ．ＣｅｌｌＢｉｏｌ．６，３４７０（１９８６）；Ｃｈｅｒｉｎｇｔｏｎ，Ｖ ．ら、同上、ｐ．１３８０（１９８８）；Ｌｉｌｌｉｅ，Ｊ．Ｗ．，Ｌｏｗｅｎ ｓｔｅｉｎ，Ｐ．Ｍ．，Ｇｒｅｅｎ，Ｍ．Ｒ．およびＧｒｅｅｎ,Ｍ.Ｃｅｌｌ ５０，１０９１（１９８７）；ＤｅＣａｒｐｉｏ，Ｊ．Ａ．ら、同上、ｐ．２７ ５（１９８８））。 酵母２ハイブリッド系におけるトウモロコシｐ７５ＺｍＲｂ１とＷＤＶ Ｒｅ ｐＡの特異的相互作用（Ｆｉｅｌｄｓら）は、ＤＮＡ結合領域（ＧＡＬ４ＢＤ） と活性化領域（ＧＡＬ４ＡＤ）を含む２つの分離したＧＡＬ４融合蛋白から機能 的ＧＡＬ４活性を再形成する能力に依存した。酵母ＨＦ７ｃ細胞を、ＧＡＬ４Ｂ Ｄ −ＲｅｐＡあるいはＧＡＬ４ＢＤ−ＲｅｐＡ（Ｅ１９８Ｋ）融合を発現するプラ スミド、およびＧＡＬ４ＡＤ単独（Ｖｅｃ）またはヒトｐ１３０に融合したＧＡ Ｌ４ＡＤ、トウモロコシｐ７５（ｐ７５ＺｍＲｂ１）あるいはｐ７５の６９アミ ノ酸のＮ末端欠失（ｐ７５ＺｍＲｂ１−ＤＮ）を発現するプラスミドで同時形質 転換した。左上方の隅に示された分布に従って、ヒスチジンと共にあるいはヒス チジンなしで細胞を平板に線条接種した。ヒスチジンなしで増殖する能力は、融 合蛋白の相互作用に対するＧＡＬ４活性の機能的再形成に依存する。これが、Ｇ ＡＬ４応答因子の制御下にあるＨＩＳ３遺伝子の発現の引き金となるからである 。これらの酵母同時形質転換株の増殖特性はβ−ガラクトシダーゼ活性のレベル と相関する。 ２ハイブリッド分析の方法はＸｉｅら（１９９５）の中で述べられている。Ｇ ＡＬ４ＡＤ−ＺｍＲｂ１融合をｐＧＡＤ４２４ベクターにおいて構築した。実施例３ ｉｎ ｖｉｖｏ活性 ゲミニウイルスのＤＮＡ複製は、細胞ＤＮＡ複製の機序ならびに他のＳ期特異 的因子を必要とする（Ｄａｖｉｅｓ，Ｊ．Ｗ． とＳｔａｎｌｅｙ，Ｊ．Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．５，７７（１９８９）；Ｌ ａｚａｒｏｗｉｔｚ，Ｓ．Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｐｌａｎｔ Ｓｃｉ．１１，３２ ７（１９９２））。この必要条件と一致して、ゲミニウイルス感染は、通常は分 化細胞の核中には存在しない蛋白である増殖細胞核抗原（ＰＣＮＡ）の蓄積が示 すように、非増殖性細胞をＳ期へと推し進めると思われる（Ｎａｇａｒ，Ｓ．， Ｐｅｄｅｒｓｅｎ，Ｔ．Ｊ．，Ｃａｒｒｉｃｋ，Ｋ．Ｍ．，Ｈａｎｌｅｙ−Ｂｏ ｗｄｏｉｎ，Ｌ．およびＲｏｂｅｒｔｓｏｎ，Ｄ．Ｐｌａｎｔ Ｃｅｌｌ ７， ７０５（１９９５））。Ｒｂの植物相同体の発見と、効率的なＷＤＶ ＤＮＡ複 製がＲｅｐＡにおける無傷のＬＸＣＸＥモチーフを必要とするという発明者の所 見はとが一緒になって、動物細胞におけるように、ウイルスＲｅｐＡ蛋白による 植物Ｒｂの分離は感染細胞のＳ期への不適切な進行を促進するというモデルを裏 付けている。それ故、ｐ７５ＺｍＲｂ１の機能を検討するひとつの方法は、植物 細胞でのプロモーター機能下でＺｍＲｂ１配列を含むプラスミドでトランスフェ クションした細胞においてゲミニウイルスのＤＮＡ複製を測定することであった 。これは以前にヒト細胞において使用されたものに類似したアプローチ である（Ｕｚｖｏｌｇｉ，Ｅ．ら、Ｃｅｌｌ ＧｒｏｗｔｈＤｉｆｆ．２，２９ ７（１９９１））。ＷＤＶ複製蛋白の発現がＷＤＶプロモーターあるいはＣａＭ Ｖ ３５Ｓプロモーターのいずれかによって指令される時には、ｐ７５ＺｍＲｂ １あるいはヒトｐ１３０を発現するプラスミドでトランスフェクションしたコム ギ細胞において、新たに複製されるウイルス性プラスミドＤＮＡの蓄積が損なわ れた。 ＷＤＶ ＤＮＡ複製はＳ期細胞環境を必要とするので、ｐ７５ＺｍＲｂ１およ びヒトｐ１３０によるウイルスＤＮＡ複製への干渉は、植物でのＧ１／Ｓ移行の 制御における網膜芽細胞腫蛋白の役割を強く示唆している。植物Ｒｂ相同体の存 在は、それらの古来からの相違にもかかわらず、植物と動物の細胞が、少なくと も一部には、細胞周期の制御のために同様の調節蛋白と経路を用いていることを 意味する。 ２つの系の証拠がこのモデルを支持している。第一に、出芽酵母ｃｄｃ２８突 然変異体のＧ１／Ｓ移行を特異的に補完するが、Ｇ２／Ｍ移行は補完しない蛋白 をコードする遺伝子がアルファルファ細胞において同定された（Ｈｉｒｔ，Ｈ． ，Ｐａｙ，Ａ．，Ｂｏｇｒｅ，Ｌ．，Ｍｅｓｋｉｅｎｅ，Ｉ．および Ｈｅｂｅｒｌｅ−Ｂｏｒｓ，Ｅ．Ｐｌａｎｔ Ｊ．４，６１（１９９３））。第 二に、Ｄ型サイクリンの植物相同体がシロイスナズナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ ）から分離され、これらは、その哺乳類類縁と同様にＬＸＣＸＥモチーフを含ん でいる。ＣＤＫ４およびＣＤＫ６の植物バージョンと共に、植物Ｄ型サイクリン はＲｂ様蛋白のリン酸化状態を制御することによってＧ１期への移行を調節する と考えられる。 動物細胞においては、Ｒｂファミリーは腫瘍抑制および分化と発育の制御に関 係づけられてきた。従って、ｐ７５ＺｍＲｂ１も、植物細胞生存期間の他のレベ ルで鍵となる調節の役割を果たすと考えられる。植物細胞におけるＲｂ相同体の 存在によって提起されるひとつの重要な疑問は、動物におけるように、Ｒｂ経路 の分断は腫瘍を生じやすい状態を導くかどうかということである。これに関して 、発明者は、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓとＡ．ｒｈ ｙｚｏｇｅｎｅｓのＴｉプラスミドによってコードされているＶｉｒＢ４蛋白が ＬＸＣＸＥモチーフを含むことを認めた。腫瘍誘発にはＶｉｒＢ４蛋白が必要で あるが（Ｈｏｏｙｋａｓ，Ｐ．Ｊ．Ｊ．とＢｅｉｊｅｒｓｂｅｒｇｅｎ，Ａ．Ｇ ．Ｍ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｔｏ ｐａｔｈｏｌ．３２，１５７（１９９４））、この状況におけるＬＸＣＸＥモチ ーフの機能は今後の検討課題である。ゲミニウイルス感染は感染した植物におけ る腫瘍発現を伴わないが、一部の場合には活動中の異常発育が認められている（ Ｇ．ＤａｆａｌｌａとＢ．Ｇｒｏｎｅｎｂｏｒｎ、私的通信）。 培養したコムギ細胞におけるＺｍＲｂ１あるいはヒトｐ１３０によるコムギ矮 小性ゲミニウイルス（ＷＤＶ）のＤＮＡ複製の阻害を次のように実施した。Ａ． コムギ細胞を、指示されたように、ウイルスＤＮＡ複製に必要なＷＤＶ蛋白をコ ードする複製ＷＤＶベースのプラスミド、ｐＷｏｒｉ単独（０．５ｇ）（Ｘｉｅ ら、１９９５）で、ならびに対照プラスミド、ｐＢＳ（１０ｇ）あるいはＣａＭ Ｖ ３５Ｓプロモーターの制御下でＺｍＲｂ１配列をコードするｐ３５Ｓ．Ｒｂ １（１０ｇ）でトランスフェクションした。全ＤＮＡをトランスフェクション後 １日目と２日目に精製し、等しい量をアガロースゲルに分割して、エチジウムブ ロマイド染色し、サザンハイブリダイゼーションによってウイルスｐＷｏｒｉＤ ＮＡを同定した。プラスミドＤＮＡはもっぱら新たに複製されたプラスミドＤＮ Ａを表わす。これはＤｐｎＩ消化には完全に耐性で、Ｍｂｏｌに対して 感受性があるからである。ＭｂｏＩ消化したサンプルは、消化していないサンプ ルの約半分の長さであったことに留意しなければならない。Ｂ．ＷＤＶ ＤＮＡ 複製へのヒトｐ１３０の影響を調べるため、コムギ細胞をｐＷｏｒｉ（０．５ｇ ）およびプラスミドｐＢＳ（対照）、ｐ３５Ｓ．Ｒｂ１あるいはｐ３５Ｓ．１３ ０（各々１０ｇ）で同時トランスフェクションした。被検プラスミド（ｐＷｏｒ ｉ）の複製をトランスフェクションの２日後に分析し、エチジウムブロマイド染 色とサザンハイブリダイゼーションを用いてパートＡで述べたように検出した。 Ｃ．ウイルス蛋白の発現がＣａＭＶ ３５Ｓプロモーターによって指令された時 のＷＤＶ ＤＮＡ複製へのＺｍＲｂ１あるいはヒトｐ１３０の影響を調べるため 、被検プラスミドｐＷｏｒｉ△△（機能的ＷＤＶ複製蛋白をコードしていないが 、異なるプラスミド、すなわちｐＷｏｒｉによってそれらが与えられた時に複製 する）を使用した。コムギ細胞を、指示されたように、ｐＷｏｒｉ△△（０．２ ５ｇ）、ｐＷｏｒｉ（０．２５ｇ）、ｐ３５Ｓ．Ａ＋Ｂ（６ｇ）、ｐ３５Ｓ．Ｒ ｂ１（１０ｇ）および／またはｐ３５Ｓ．１３０（１０ｇ）で同時トランスフェ クションした。トランスフェクションの３６時間後に被検プラス ミド（ｐＷｏｒｉ△△）の複製を分析し、エチジウムブロマイド染色とサザンハ イブリダイゼーションを用いてパートＡで述べたように検出した。プラスミドｐ Ｗｏｒｉ（Ｍ１）とｐＷｏｒｉ△△（Ｍ２；ＳａｎｚとＧｕｔｉｅｒｒｅｚ，未 発表）、各々１００ｐｇをマーカーとして使用した。ＤＮＡ抽出をＳｏｎｉとＭ ｕｒｒａｙ，Ａｒｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２１８，４７４−４７６（１９９５ ）のように修正したことを除いて、コムギ細胞の懸濁培養、粒子衝撃によるトラ ンスフェクションおよびウイルスＤＮＡ複製の分析をＸｉｅら、（１９９５）が 述べたようにして実施した。 微生物の寄託に関する情報 開示の６ページで言及されている微生物は下記の施設に寄託された： ＣＯＬＥＣＣＩＯＮ ＥＳＰＡＮＯＬＡ ＤＥ ＣＵＬＴＩＶＯＳ ＴＩＰＯ（ ＣＥＣＴ） Ｄｅｐａｒｔａｍｅｎｔｏ ｄｅ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｉａ Ｆａｃｕｌｔ ａｄ ｄｅ Ｃｉｅｎｃｉａｓ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｓ ４６１００ ＢＵＲＪ ＡＳＯＴ（Ｖａｌｅｎｃｉａ）Ｓｐａｉｎ 寄託同定番号：ｐＢＳ．Ｒｂ１ 寄託日：１９９６年６月１２日 整理番号：４６９９ この情報は願書に同封される書式ＰＣＥ／ＲＯ／１３４に反映されていると思 われる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年７月１６日（１９９８．７．１６） 【補正内容】 請求の範囲 １．組換え核酸をその中に組み込むことによって植物細胞中の網膜芽細胞腫蛋白 のレベルおよび／または活性を上昇させるあるいは低下させることを含む、その 細胞内での植物細胞あるいは植物ウイルスの増殖を制御する方法。 ２．核酸が、細胞における網膜芽細胞腫蛋白の発現を上昇させるあるいは抑制す ることを特徴とする、請求項１に記載の方法。 ３．核酸が、細胞の通常の機能には影響を及ぼさずにウイルスのＬＸＣＸＥモチ ーフと相互作用する網膜芽細胞腫蛋白あるいは網膜芽細胞腫蛋白のペプチド断片 を発現することを特徴とする、請求項１に記載の方法。 ４．網膜芽細胞腫蛋白が、配列番号２において認められるひとつまたはそれ以上 のコンセンサスＳＰあるいはＴＰ部位の変化あるいは欠失によって、サイクリン 依存性キナーゼによるリン酸化に耐性となっていることを特徴とする、請求項３ に記載の方法。 ５．ＤＮＡあるいはＲＮＡが、ＤＮＡあるいはＲＮＡをコードする網膜芽細胞腫 蛋白に対してアンチセンスであり、網膜芽細 胞腫蛋白の発現を抑制することを特徴とする、請求項２に記載の方法。 ６．アンチセンスＲＮＡをコードする核酸を網膜芽細胞腫植物蛋白に導入するこ とを含む、細胞周期のＳ期を指令するように植物細胞を形質転換する方法。 ７．網膜芽細胞腫蛋白が、ここに添付される配列表の配列番号２の配列と８０％ 以上の相同性を備えたアミノ酸配列を持つことを特徴とする網膜芽細胞腫蛋白の 発現をコードする組換え核酸。 ８．配列番号１の塩基３１−２０７、その改変置換だけを持つ配列、あるいは高 いストリンジェント性の条件下で配列番号１のボリヌクレオチドとハイブリダイ ズすることができる配列を含むことを特徴とする、請求項７に記載の組換え核酸 。 ９．配列番号２に関して保存的に置換される網膜芽細胞腫蛋白をコードすること を特徴とする、請求項７または８に記載の組換え核酸。 １０．網膜芽細胞腫植物蛋白に対するアンチセンスＤＮＡあるいはＲＮＡを含む ことを特徴とする組換え核酸。 １１．配列番号２を含む網膜芽細胞腫植物蛋白あるいはそれと 少なくとも８０％の相同性を持つ配列に対するアンチセンスＤＮＡあるいはＲＮ Ａを含むことを特徴とする、請求項１０に記載の組換え核酸。 １２．配列番号１の配列あるいはそれと少なくとも８０％の相同性を持つ配列に 対するアンチセンスＤＮＡあるいはＲＮＡを含むことを特徴とする、請求項１０ または１１に記載の組換え核酸。 １３．植物細胞の通常の機能には影響を及ぼさずにウイルスのＬＸＣＸＥモチー フと相互作用する網膜芽細胞腫蛋白あるいは網膜芽細胞腫蛋白のペプチド断片を コードすることを特徴とする組換え核酸。 １４．配列番号２において認められるひとつまたはそれ以上のコンセンサスＳＰ あるいはＴＰ部位が変化あるいは欠失している網膜芽細胞腫植物蛋白をコードす ることを特徴とする、請求項１３に記載の組換え核酸。 １５．請求項７ないし９、１３および１４のいずれか一項に記載の組換えＤＮＡ あるいはＲＮＡの発現によって生成される蛋白。 １６．配列番号２において認められるひとつまたはそれ以上の コンセンサスＳＰあるいはＴＰ部位が変化あるいは欠失していることを特徴とす る、請求項１５に記載の蛋白。 １７．請求項７ないし９、１３および１４のいずれか一項に記載の組換え核酸を 含むことを特徴とする組換えベクター。 １８．網膜芽細胞腫蛋白の発現をコードする組換え核酸を含むことを特徴とする 植物細胞。 １９．請求項７ないし９、１３および１４のいずれか一項に記載の組換え核酸を 含むことを特徴とする、請求項１８に記載の植物細胞。 ２０．該核酸から網膜芽細胞腫蛋白を発現することを特徴とする、請求項１８ま たは１９に記載の植物細胞。 ２１．請求項１８ないし２０のいずれか一項に記載の細胞を含むことを特徴とす るトランスジェニック植物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ， ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 シー，チ スペイン国、エ―28049・カントブランコ、 ユニバーシダツド・オウトノーマ、セント ロ・デ・ビオロヒア・モレクラー“セベ ロ・オチヨアー”（セ・エセ・イ・セ― ウ・ア・エメ）（番地なし) (72)発明者 ペラヨ，サンス―ブルゴス・アンドレス スペイン国、エ―28049・カントブランコ、 ユニバーシダツド・オウトノーマ、セント ロ・デ・ビオロヒア・モレクラー“セベ ロ・オチヨアー”（セ・エセ・イ・セ― ウ・ア・エメ）（番地なし) (72)発明者 スアレス，ロペス・パウラ スペイン国、エ―28049・カントブランコ、 ユニバーシダツド・オウトノーマ、セント ロ・デ・ビオロヒア・モレクラー“セベ ロ・オチヨアー”（セ・エセ・イ・セ― ウ・ア・エメ）（番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．植物細胞および植物ウイルスの増殖および／または複製の制御のための網膜 芽細胞腫（retinoblastoma）（Ｒｂ）蛋白の使用。 ２．ウイルスが正常な増殖のためにその蛋白のひとつにおいてＬＸＣＸＥアミノ 酸モチーフの完全性を必要とすることを特徴とする、請求項１に記載の使用。 ３．ウイルスがゲミニウイルスである、請求項１に記載の使用。 ４．転写因子を放出するためにウイルスが網膜芽細胞腫（Ｒｂ）蛋白と結合する ことを特徴とする、請求項１に記載の使用。 ５．植物細胞における網膜芽細胞腫蛋白のレベルおよび／または活性の上昇ある いは低下を含む、その細胞内での植物細胞あるいは植物ウイルスの増殖および／ または複製を制御する方法。 ６．直接適用によって蛋白のレベルを上昇させることを特徴とする、請求項５に 記載の方法。 ７．蛋白の発現をコードするＤＮＡあるいはＲＮＡを、処理することを所望する 植物細胞内に導入することによって蛋白のレベルを上昇させることを特徴とする 、請求項５に記載の方法。 ８．蛋白が過剰発現される請求項５、６あるいは７に記載の方法。 ９．細胞の成長あるいは通常のウイルス増殖を抑制するように、ウイルスのＬＸ ＣＸＥモチーフと相互作用するが細胞の正常な機能には影響を及ぼさないＲｂ蛋 白あるいはそのペプチド断片を発現することを含む、植物細胞あるいは植物ウイ ルスの増殖および／または複製を制御する方法。 １０．動物Ｒｂ蛋白とは共通しない、ひとつまたはそれ以上の植物Ｒｂ蛋白の特 徴を持つＲｂ蛋白の発現をコードする組換え核酸。 １１．既知の動物Ｒｂ蛋白の核酸とは異なるひとつまたはそれ以上の特徴的領域 を含むことを特徴とする、請求項１０に記載の核酸。 １２．ヒトＲｂ蛋白と３０％−７５％の相同性を備えた配列を含むＡおよびＢポ ケットサブ領域を有する植物Ｒｂ蛋白をコードする、ＤＮＡあるいはｃＲＮＡ形 態の組換え核酸。 １３．ｐ１３０ Ｒｂ網膜芽細胞腫蛋白と３０％−７５％の相同性を備えた配列 を持つ、請求項１２に記載の核酸。 １４．動物あるいはｐ１３０ Ｒｂ網膜芽細胞腫蛋白と５０％ −６４％の相同性を持つことを特徴とする、請求項１２あるいは１３に記載の核 酸。 １５．ヒトＲｂのＣ７０６アミノ酸をコードする、請求項１２ないし１４のいず れか一項に記載の核酸。 １６．ＡとＢポケット間のスペーサー配列が動物Ｒｂ蛋白に関しては保存されな い、請求項１２ないし１５のいずれか一項に記載の核酸。 １７．スペーサー配列が、網膜芽細胞腫動物蛋白において認められる同じ領域と ５０％未満の相同性を持つ、請求項１６に記載の核酸。 １８．配列番号２と８０％以上の相同性を持つ、請求項１２ないし１７のいずれ か一項に記載の核酸。 １９．相同性が９０％以上である、請求項１８に記載の核酸。 ２０．配列番号１の塩基３１−２０７９に対応する配列を含む組換えＤＮＡ。 ２１．配列番号１に対応する配列を含む組換えＤＮＡ、あるいは配列番号２のＺ ｍＲｂ１をコードするトウモロコシｃＤＮＡクローンをコードする、対応するＲ ＮＡ。 ２２．請求項１２ないし２１のいずれか一項に記載の組換え ＤＮＡあるいはＲＮＡによってコードされる蛋白、あるいはかかるＤＮＡあるい はＲＮＡから誘導される新規蛋白、ならびに突然変異誘発手段によって変化させ た、自然に生じるＤＮＡあるいはＲＮＡから誘導される蛋白。 ２３．突然変異誘発手段が、突然変異誘発性ＰＣＲプライマーを用いた突然変異 誘発を含む、請求項２２に記載の蛋白。 ２４．請求項１０ないし２１のいずれか一項に記載されているものと同じ核酸配 列を有する遺伝子である、網膜芽細胞腫植物蛋白をコードする遺伝子のアンチセ ンスＤＮＡあるいはＲＮＡ。 ２５．請求項１２ないし２２のいずれか一項に記載のＤＮＡあるいはＲＮＡを含 むベクター、細胞、植物あるいは動物。 ２６．網膜芽細胞腫蛋白に対するアンチセンスＤＮＡあるいはＲＮＡを細胞に組 み込むことによってこの細胞中の網膜芽細胞腫植物蛋白のレベルを低下させるこ とを含む、植物性細胞あるいは植物ウイルスの増殖および／または増殖を制御す るための方法。 ２７．請求項２２に記載されている蛋白をコードするｃＤＮＡ。 ２８．ひとつまたはそれ以上の部位が変化あるいは欠失していて、蛋白をリン酸 化に対して、従ってその機能性に対してより 抵抗性にしている、たとえばＥ２Ｆあるいは同様のものに結合している蛋白をコ ードする核酸。 ２９．請求項２８に述べられている核酸によってコードされる蛋白。