CN103260640A

CN103260640A - 活性蛋白酶抗性抗体Fc突变体

Info

Publication number: CN103260640A
Application number: CN2011800618085A
Authority: CN
Inventors: W.斯特罗尔; R.乔丹; R.布雷滋基
Original assignee: Centocor Ortho Biotech Inc
Current assignee: Janssen Biotech Inc
Priority date: 2010-12-23
Filing date: 2011-12-15
Publication date: 2013-08-21
Anticipated expiration: 2031-12-15
Also published as: CA2822366A1; MX347077B; AU2011349719B2; CN103260640B; HUE033205T2; US9611328B2; PT2654780T; NI201300057A; CY1118923T1; MX2013007291A; RS55906B1; LT2654780T; US20130011386A1; EP2654780B1; ECSP13012712A; KR20140003485A; GT201300167A; MY162489A; HRP20170595T1; IL226987A

Abstract

使用Fc区中公开的变异可构建单克隆抗体和其它含Fc的分子，所述Fc区中公开的变异引起对宿主和病原体衍生的蛋白酶的抗性增加，且显示出与Fcγ受体相互作用且起始补体指导的细胞毒性的能力，如通过功能测定法证实的。含Fc的分子用于治疗其中FcR驱动的宿主功能促成活性的疾病和病症。

Description

活性蛋白酶抗性抗体Fc突变体

优先权申请

本申请要求于2010年12月23日提交的美国申请序列号61/426,619和于2011年9月29日提交的美国申请序列号61/540,882的优先权，所述美国申请以引用的方式整体并入本文。

技术领域

本发明涉及人抗体IgG恒定区，尤其是Fc区，所述恒定区如此突变以便改变蛋白水解切割位点，赋予对内源和病原体衍生的蛋白酶的抗性，并且进一步改变为特异性结合Fcγ受体并通过Fc受体介导的补体级联交联或活化来活化通过免疫细胞的促有丝分裂应答。新型序列可掺入其中期望蛋白水解抗性和细胞毒效应功能性的治疗抗体组合物中。

背景技术

人抗体的IgG同种型由亚型IgG1、IgG2、IgG3和IgG4组成，所述亚型各含有通过铰链区连接至单个Fc结构域的两个抗原结合臂(Fabs)。IgG1，治疗单克隆抗体中代表的占优势亚类，被视为在循环中具有17.6-56.2天的长半衰期的稳定分子。(Salfeld，Nat Biotechnol《自然·生物技术》25(12)：1369-72，2007)。然而，IgG1对通过许多生理学相关的蛋白酶在铰链区中的蛋白水解敏感，所述蛋白酶与侵袭性癌症(例如基质金属蛋白酶)和病理微生物相关。在重链之间的二硫键(核心铰链)上的切割释放单价Fab，并且在二硫键下的双向切割释放二价结构，F(ab′)₂片段。几种金属蛋白酶和两种细菌酶，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的谷氨酰基内肽酶V8(GluV8)和化脓性链球菌(Streptococcus pyogenes)的免疫球蛋白降解酶(IdeS)，作用于下铰链(二硫键下(图1)中的IgG1，并且最终产生F(ab′)₂和Fc片段(Ryan等人，Mol Immunol《分子免疫学》45(7)：1837-462008)。

当针对细胞表面抗原的治疗单克隆抗体(mAbs)的功效与靶细胞的消除相关时，通过Fc结构域赋予的抗体“效应子功能”确实受牵涉并且在抗体的总体疗效中是重要的。(Bibeau等人，J Clin Oncol《临床肿瘤学杂志》27：1122-11292009；Cartron等人，Blood《血液》99：754-7582002；和Musolino等人，J Clin Oncol《临床肿瘤学杂志》26：1789-17962008)。与免疫细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)相互作用的抗体的Fc结构域，以及与补体相互作用的Fc结构域被认为促成针对细胞表面抗原的几种单克隆抗体(mAbs)的作用。这些相互作用可通过抗体依赖细胞的细胞毒性(ADCC)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)和补体依赖性细胞毒性(CDC)导致mAb靶向细胞的消除。

近来，已显示IgG1的重链多肽之一中的单次蛋白水解切割不破坏链的结合，并且因此维持循环抗原结合能力中的寿命；但引起IgG1结合FcγRs的能力的丧失并驱动Fc-介导的效应子功能(Brezski等人，Proc Natl AcadSci USA《美国国家科学院院刊》106：17864-178692009)。治疗单克隆抗体的单次和多次切割可导致结合靶但已丧失一些或全部功效的种类。因此，在其中期望靶细胞或组织的破坏的其它用途中，改造蛋白酶抗性但效应子功能增强的Fc-平台可提供用于改善抗癌和抗传染病治疗的显著优点。

发明内容

本发明提供在抗体或抗体样治疗剂的改造中有用的修饰的免疫球蛋白恒定结构域的组合物。包含Fc区和靶向细胞表面配体的用作治疗剂的IgG种类的免疫球蛋白是用于使用本发明的组合物修饰的具体候选物。本发明的修饰的免疫球蛋白对通过IgG的抗原结合结构域靶向的环境中的蛋白水解酶是抗性的，但保留与抗体的Fc区相关的重要效应子功能，所述环境例如包含癌细胞或肿瘤脉管系统相关抗原的瘤内环境。

根据本发明，提供通过在IgG1 Fc区中掺入赋予蛋白酶抗性的突变来生成蛋白酶抗性IgG1单克隆抗体的方法。在进一步方面，通过在Fc区中的远端位置上引入另外的氨基酸变化，可恢复含有此类突变的IgGs的功能活性。

本发明的组合物是在IgG1的下铰链中包含改变的氨基酸残基的蛋白酶抗性的IgG1抗体，所述残基具有在FcγR的Fc接合中的牵涉并且已鉴定为生理学相关的蛋白水解切割的位点。在一个方面，将人IgG1亚类的残基替换为人IgG2的相应下铰链残基。在一个实施例中，将人IgG1的E233-L234-L235-G236序列替换为具有G236缺失的IgG2 P233-V234-A235(EU编号(Edelman等人，Proc Natl Acad Sci USA《美国国家科学院院刊》63：78-851969))。在另一个实施例中，将IgG1残基E233-L234-L235-G236-G237替换为具有G236缺失的P233-V234-A235，并且将G237替换为选自A、D、P、Q或S的氨基酸。在另外一个实施例中，将IgG1恒定结构域中对应于残基214-236的所有残基KVEPKSCDKT HTCPPCPAPEL LG(SEQID NO：3)替换为人IgG2中的相应位置的序列或TVERKCCVECPPCPAPPVA(SEQ ID NO：4)。

在第二个方面，通过掺入进一步的突变可恢复本发明的蛋白酶抗性IgG1突变体接合FcγR和/或补体的能力。因此，如果没有此类进一步的替换，则将包括包含具有G236缺失的P233-V234-A235的蛋白酶抗性铰链区的蛋白酶抗性的IgG1突变体，或其中残基214-236的所有IgG1恒定区序列替换为来自IgG2的相应序列(SEQ ID NO：4)的突变体，具有减少的接合FcγR的能力。为了克服与FcR和C1q接合相关的效应子功能的丧失，将另外的突变掺入非铰链恒定区中，使得与野生型人IgG1相比较，修饰的IgG1分子保留可测量或甚至增强的接合FcγR的能力。因此，在本发明的一个实施例中，蛋白酶抗性IgG1包括约EU残基214至约残基330包含在铰链和CH2区中具有人IgG1的序列的Fc结构域的那些分子，其中将至少残基233-237替换为PVA/(G236缺失)和另外的选自下列的特定替换S239D/I332E；K326A/E333A；H268F/S324T/I332E；F243L/R292P/Y300L；S239D/H268F/S324T/I332E；S267E/H268F/S324T/I332E；E333A/K334A；G237A/S239D/I332E；和G237S/S239D/I332E；S298A/E333A/K334A；S239D/K326A/E333A和S267E/I332E。在具体的实施方案中，衍生自野生型IgG1恒定结构域序列的IgG分子包含SEQ ID NO：6。在另一个实施例中，蛋白酶抗性的IgG衍生自具有在S239D和I332E处的替换的野生型IgG2恒定结构域。因此，这些另外的突变的包括允许Fc功能，同时维持蛋白酶抗性，并且在一些情况下，在体外FcγR结合测定法以及体外细胞测定法例如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)中改善Fc介导的效应子功能超过IgG1野生型。本发明掺入Fc结构域的具有效应子功能的蛋白酶抗性的单克隆抗体对于抗癌和抗微生物治疗是有用的，其中IgG由于在肿瘤生长或感染部位处升高的局部蛋白酶存在而切割。

在另一方面，如本文所述的组合物作为施用于有此需要的哺乳动物受试者的治疗分子的组分有用。在使用该组合物的一种方法中，修饰在治疗有此需要的受试者中使用的包含野生型人IgG1序列和配体结合结构域的抗体，以掺入具有G236缺失的蛋白酶抗性铰链序列P233-V234-A235，和需要时，选自下列的效应子功能恢复修饰S239D/I332E；K326A/E333A；H268F/S324T/I332E；F243L/R292P/Y300L；K326A/I332E/E333A、S239D/K326A/E333A和S267E/I332E S239D/H268F/S324T/I332E；S267E/H268F/S324T/I332E；E333A/K334A；G237A/S239D/I332E；和G237S/S239D/I332E。在一个实施例中，IgG1Fc突变体组合物用于其中与免疫和效应子功能相关的FcγRs活化是组合物的功效必须的适应症中，所述免疫和效应子功能例如i)抗体依赖性细胞毒性(ADCC)、ii)补体依赖性细胞毒性(CDC)、iii)抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)、iv)FcR-介导的细胞活化(例如通过FcR交联的细胞因子释放)，和v)和FcR-介导的血小板活化/耗尽。在一个方面，将IgG1Fc突变掺入靶向细胞上的配体的多价粘合剂的治疗抗体或Fc-融合物内，所述细胞是增殖性病症的细胞例如肿瘤细胞；肿瘤脉管系统细胞；成纤维细胞；活化的B细胞或T细胞，或致病宿主或非宿主衍生的细胞尤其是细菌细胞。

在另一个实施例中IgG1Fc突变体构成药物组合物。在另一个实施例中，IgG1Fc突变体构成药物活性分子的一部分。包含IgG1Fc突变体的药物组合物或包含活性IgG1Fc突变体的分子用于治疗特征在于不希望或不受控制的细胞增殖或迁移的疾病。在一个方面，使用全身递送方法或局部递送方法使用对于体室的施用途径，将与配体结合结构域组合的本发明的蛋白酶抗性恒定结构域施用于有此需要的受试者，在所述体室中发现能够降解IgG1亚类分子的一种或多种蛋白酶。

附图说明

图1是伴随在铰链区中发现的氨基酸序列和制图的蛋白酶切割点的人IgG1抗体的描述，所述铰链区是与FcγRs和补体相互作用关键的区域。

图2显示了与新构建体2h S239D/I332E(SEQ ID NO：8)和2hE333A/K334A(SEQ ID NO：9)比对的野生型人IgG1(SEQ ID NO：1)和IgG2(SEQ ID NO：2)的恒定区一部分的氨基酸序列的比对，显示了各个残基相应的EU编号；其中IgG1和IgG2的铰链区均包含在EU残基226和229处的半胱氨酸残基，与新构建体一样。

图3A-B显示了在不同时间点，包含不同IgG同种型的抗体(A)及其如图2中所述的新构建体(B)用蛋白酶IdeS的消化分析。

图4A-D显示了在24小时温育后(n＝2)，IgG构建体用IdeS(A)、GluV8(B)、MMP-3(C)和MMP-12(D)的消化。

图5A-G显示了对于蛋白酶抗性mAb构建体组来自

分析的FcγR结合结果：FcγRI(A)、FcγRIIa(B和C)、FcγRIIb(D和E)、和FcγRIIIa(F和G)，其中距离最大信号％的减少代表未标记的构建体与生物素化的IgG1竞争结合的能力(n＝2)。

图6A-C是来自用蛋白酶抗性mAb构建体以及野生型IgG₁和IgG₂执行的分开ADCP分析的图，其中在Y轴上的％吞噬作用相对于取样细胞的总数目。

图7A-C是来自用蛋白酶抗性mAb构建体以及野生型IgG₁和IgG₂执行的分开ADCP分析的图，其中在Y轴上的溶解％相对于相同数目的细胞通过洗涤剂的100溶解％(n＝2)。

图8是来自用蛋白酶抗性mAb构建体以及野生型IgG₁和IgG₂执行的CDC测定法的图，其中在Y轴上的溶解％相对于相同数目的细胞通过洗涤剂的100溶解％(n＝2)。

序列表简述

SEQ ID NO：	描述
		1	IgG1-Fc；人Igγ类、亚类、铰链、CH2和CH3结构域
2	IgG2-Fc；人Igγ类、亚类2的铰链、CH2和CH3结构域
		3	IgG1铰链区，EU214-236
4	IgG2铰链区(2hc)，EU214-235
		5	IgG杂交铰链区(2h)，IgG2EU233-235
6	2hc(EU214-447)
		7	2h(EU214-447)
8	2h S239D/I332E
		9	2h E333A/K334A
10	2h F243L/R292P/Y300L
		11	2h H268F/S324T/I332E
12	2h S239D/H268F/S324T/I332E
		13	2h S267E/H268F/S324T/I332E
14	2h K326A/E333A
		15	2h G237X/S239D/I332E，其中X为A、D、P、Q或S
16	2hc S239D/I332E
		17	IgG2 S239D/I332E
18	2h K326A/I332E/E333A
		19	2h S239D/K326A/E333A
20	2h S267E/I332E

具体实施方式

缩写

ADCC＝抗体依赖性细胞的细胞毒性；ADCP＝抗体依赖性细胞吞噬作用；CDC＝补体依赖性细胞毒性；FDCR＝Fc依赖性细胞因子释放；FcγR或FcγR＝Fcγ受体；GluV8＝金黄色葡萄球菌的谷氨酰基内肽酶V8；IdeS＝化脓性链球菌的免疫球蛋白降解酶IgG＝免疫球蛋白G；ITAM＝免疫受体基于酪氨酸的活化基序；ITIM＝免疫受体基于酪氨酸的抑制基序；Mab＝单克隆抗体；MMP＝基质金属蛋白酶；术语蛋白酶等价于蛋白酶并可互换使用；PR＝蛋白酶抗性。

定义与术语解释

“抗体依赖性细胞的细胞毒性”、“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”是指细胞毒性形式，其中所分泌的Ig与某些细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)上存在的Fc受体(FcR)结合，使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合有抗原的靶细胞，并且随后借助细胞毒素杀死靶细胞。指向靶细胞表面的配体特异高亲和性IgG抗体可刺激细胞毒性细胞，是完成此类毒杀作用所必需的。靶细胞的溶解过程发生于细胞外，其需要细胞与细胞的直接接触，此过程不需要补体。

可对任何具体抗体通过ADCC方式介导靶细胞溶解的能力进行检测。要检测ADCC的活性，将所关注的抗体加入到展示靶配体的靶细胞内，使靶配体与免疫效应子细胞结合，所述免疫效应细胞可由抗原抗体复合物活化，从而使靶细胞发生细胞溶解。通常根据从溶解细胞中释放的标记物(例如放射性底物、荧光染料或天然细胞内蛋白质)来检测细胞溶解。可用于此类检测的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和自然杀伤(NK)细胞。体外ADCC测定法的具体例子在如下文献中描述：Wisecarver等人，1985，19：211；Bruggemann等人，1987，J Exp Med《实验医学杂志》166：1351；Wilkinson等人，2001，J Immunol Methods《免疫学方法杂志》258：183；Patel等人，1995J Immunol Methods《免疫学方法杂志》184：29)(每个文献均以引用方式并入)。作为另外一种选择或除此之外，可在体内例如在动物模型中评估所关注的抗体的ADCC活性，所述动物模型例如Clynes等人，1998，PNAS USA《美国国家科学院院刊》95：652中所公开的那种，该文献内容全文以引用方式并入。当效应细胞在很大程度上通过吞噬作用起作用时，该过程可描述为抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)。

“补体引导的细胞毒性”或CDC是指通过使补体成分C1q与抗体Fc结合来活化补体级联的细胞毒性形式。

术语“效应子功能”包括Fc与免疫细胞上表达的Fcγ受体(FcγR)的相互作用，以及Fc结构域与补体的相互作用，导致通过溶解过程或通过效应细胞和补体组分的吞噬作用的抗原表达细胞消除。

本文所用的术语“Fc”、“含Fc的蛋白质”或“含Fc的分子”是指具有至少一个免疫球蛋白CH2和CH3结构域的单体、二聚体或异二聚体蛋白质。CH2和CH3结构域可以形成蛋白质/分子(例如抗体)的二聚体区域的至少一部分。

如本文所用的术语“抗体”是特定形式的含Fc的蛋白质，所述蛋白质包含至少一个配体结合结构域，所述配体结合结构域含有或保留与至少一种动物抗体的至少一个重链或轻链抗体可变结构域的基本同源性。

野生型人IgG亚类恒定序列在可在线获得的UniProt数据库中分类为P01857(IgG1)、P01859(IgG2)、P01860(IgG3)和P01861(IgG4)。如本文所用，“野生型人IgG1Fc区”是指包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列或其片段的人IgG Fc区，所述区域是人IgG重链的残基K214至残基K447，根据Kabat的EU编号。恒定区中的氨基酸通过与人IgG1抗体EU的比对进行编号(参见Cunningham等人，1970Biochemistry《生物化学》.，9：3161-70)。也就是说，将抗体的重链和轻链与EU的重链和轻链进行排列，以达到最大的氨基酸序列同一性，然后给抗体的各个氨基酸分配与EU中对应的氨基酸相同的编号。本领域习惯上使用EU编号系统(通常参见Kabat等人，Sequences of Protein of Immunological Interest《具有免疫学重要性的蛋白序列》，NIH公开号91-3242，美国卫生与公共服务部(USDepartment of Health and Human Services)(1991))。根据本发明，在野生型IgG2恒定区和EU恒定区之间的比对导致在位置221-223和236处的空氨基酸(图2，SEQ ID NO：2)。

哺乳动物IgG重链的恒定结构域序列在序列中指定为CH1-铰链-CH2-CH3。IgG的“铰链”、“铰链区”或“铰链结构域”通常定义为根据Kabat系统包括Glu216且在人IgG1的Pro230处终止，但在功能上，链的弹性部分可视为包括称为上和下铰链区的另外残基，例如Glu216至Gly237(Roux等人J.Immunol.《免疫学杂志》1998，161：4083)，并且下铰链指的是FcγR结合一般归于其的Fc区的残基233-239。通过放置第一个和最后一个半胱氨酸残基形成重链间S--S键，其它IgG同种型的铰链区可与IgG1序列进行比对。尽管如根据Kabat系统编号的，边界可轻微不同，但CH1结构域与VH结构域相邻，并且氨基末端与免疫球蛋白重链分子的铰链区相邻，并且包括免疫球蛋白重链的第一个(大多数是氨基末端)恒定区结构域，例如约EU位置118-215。Fc结构域从氨基酸231延伸到氨基酸447；CH2结构域是约Ala231至Lys340或Gly341，并且CH3是约Gly341或Gln342至Lys447。CH1区的IgG重链恒定区的残基在Lys处终止。

术语“蛋白酶抗性的”是指包含肽键的分子在蛋白水解酶的存在下抵抗其肽键中的一个或多个的水解切割的能力。针对蛋白水解酶的抗性是相对性质，并且与经过指定时间段和在指定条件下较不能够经受住其肽键中的一个或多个的水解切割的分子相比较，所述指定条件包括在其下测试切割抗性的pH或温度。指示切割已发生的蛋白水解切割的一个结果是与完整未切割的亲本分子的分子量相比较，较小片段(较低分子量)的生成。

术语“治疗有效量”是指如本文所述的包含Fc结构域的治疗剂的量，所述治疗剂可以是抗体、抗体片段或衍生物，以治疗受试者中的疾病或病症。

综述

本发明的目的在于鉴定Fc结构域用于在治疗抗体、Fc融合物和类似生物药品的制造中使用，所述治疗抗体、Fc融合物和类似生物药品具有针对原位蛋白水解的改善抗性，且保留引起细胞因子释放或损害或者杀死展示靶抗原的细胞和靶细胞周围的组织的能力。

蛋白酶根据催化位点的结构和对于其活性必需的氨基酸(作为组成成分之一)分成五个主要组：丝氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶、半胱氨酸(硫醇)蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和金属蛋白酶。

多种细胞外蛋白酶在身体各处和体室中起作用，执行关键调节和代谢过程。分泌到胃内的酸抗性蛋白酶(例如胃蛋白酶)和十二指肠中存在的丝氨酸蛋白酶(胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶)使得能够降解胃肠道内的食物蛋白质；血液或血清中存在的蛋白酶(凝血酶、纤溶酶、哈格曼因子等)在血液凝固以及凝块的溶解和免疫系统细胞的调节中起重要作用。蛋白酶存在于白细胞中或从白细胞中释放(弹性蛋白酶、组织蛋白酶G)。蛋白酶决定其它蛋白质的寿命，因此发挥重要的代谢作用。与激素、白介素或趋化因子不同，不需要蛋白质表达机制中的细胞内发信号或改变，使得蛋白水解控制最快的调节转换机制之一。进一步地，如在级联反应中的蛋白酶的协同作用导致生物对生理学信号的应答的快速和有效扩增。

人IgG同种型(成熟的γ球蛋白G类抗体的亚类；IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)显示出召募免疫功能的差异能力。例如，抗体依赖细胞的细胞毒性(ADCC)通过IgG1和IgG3得到促进，抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP)通过IgG1、IgG2、IgG3和IgG4得到促进，并且补体依赖性细胞毒性(CDC)通过IgG1和IgG3得到促进。此类免疫功能的同种型特异性接合是基于对不同免疫细胞上的Fc受体的选择性和结合C1q的能力，从而活化膜攻击复合物(MAC)的装配。在多个同种型中，关于Fcγ受体的相对亲和力对于IgG1和IgG3很高，所述Fcγ受体包括FcγRI、FcγRIIa/b/c和FcγRIIIa/b。然而，对于IgG2的Fcγ亲和力是相当低的，除FcγRIIa H131多态性之外，并且IgG4对于FcγRI仅具有可测量的亲和力。使用比较序列分析和共晶体结构，对于受体结合的关键接触残基已对跨越下铰链和CH2区的氨基酸残基作图(Hezereh等人，J Virol《病毒学杂志》75：12161-121682001；Shields等人，J Biol Chem《生物化学杂志》276：6591-66042001)。

许多先前研究得出结论在IgG2的下铰链残基(EU位置233-235)中的替换取消FcγR-介导的功能和补体活化。在一篇报道中，在IgG1的下铰链中具有G236缺失的E233P-L234V-L235A的替换是显示已丧失Fc-介导的效应子功能的人IgG1的Fc构建体实验对象组之一(Armour等人，1999Eur JImmunol《欧洲免疫学杂志》29：2613-2624)。这个信息暗示用相应IgG2残基替换IgG1铰链中或附近的残基导致对于结合FcγRs的亲和力的显著丧失以及影响补体固定和细胞杀死的能力的丧失。

其次，相同残基位置中的几个是其中蛋白酶切割IgG1(图1)序列并由更多蛋白水解抗性的IgG2序列中的不同氨基酸占据的，如通过人IgG1和IgG2的比对中显示的(图2)。本发明人使用这个信息作为起始点来设计蛋白酶抗性但效应子功能完全的IgG-Fc。

本发明是IgG1恒定区(Fc)的多个位置中的替换的首次证实，所述替换出乎意料地提供蛋白酶抗性和功能(FcgR-接合)Fc结构域。如本领域理解的，一旦具有特定氨基酸序列的Fc-结构域的性质是已知的，该信息就可应用于现有抗体改造或Fc-多肽融合物的构建或修饰。通过本发明的组合物赋予的蛋白酶抗性包括例如在IgG1铰链区的残基处切割的蛋白酶，所述残基由衍生自相应IgG2残基的备选氨基酸替换，所述蛋白酶例如MMP-3、MMP-7、MMP-12、HNE、纤溶酶、组织蛋白酶G、胃蛋白酶、IdeS或来自金黄色葡萄球菌的谷氨酰基内肽酶I(图1)(Ryan等人2008同上)。

基于其对人FcRs(通过

竞争测定法评估的FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb、FcγRIIIa)的相对亲和力来选择多替换的IgG1突变体。这些突变体还在适当的细胞系统中测试其通过PBMCs诱导ADCC和通过体外分化的巨噬细胞诱导ADCP的能力。在本文提供的实验数据中，具有指定的引入突变(表2)的IgG1是具有Fc增强突变的衍生自IgG1的改造的蛋白酶抗性mAbs。

赋予蛋白酶抗性的使用野生型(wt)人IgG1(SEQ ID NO：1)制备的EU编号系统中的IgG1铰链区残基214-237(SEQ ID NO：3)的备选组合物，包括完全IgG2序列(SEQ ID NO：4)铰链或嵌合铰链(SEQ ID NO：5)仅由改变的残基233-235的替换，如表1中所示的。

表1：

效应子功能增强区中的补偿突变可选自如下表2中所示的先前描述的替换。

表2：

突变(EU编号的位置)	参考文献
		S239D/I332E	1
E333A/K334A	5
		F243L/R292P/Y300L	3
H268F/S324T/I332E	4
		S239D/H268F/S324T/I332E	4
S267E/H268F/S324T/I332E	4
		K326A/E333A	2
K326A/I332E/E333A	1、2
		S239D/K326A/E333A	1、2
S267E/I332E	1、4
		G237X/S239D/I332E，其中X为A、D、P、Q或S	1
S298A/E333A/K334A	5

增加的Fc功能构建体先前通过下列引用：

1.Lazar，Proc Natl Acad Sci USA《美国国家科学院院刊》103：4005-4010(2006)

2.Idusogie，J Immunol《免疫学杂志》166：2571-2575(2001)

3.Stavenhagen，Cancer Res《癌症研究》67(18)：8882-90(2007)

4.Moore等人，MAbs2(2)：181-189(2010)

5.Shields等人，J Biol Chem《生物化学杂志》276：6591-6604(2001)

使用基于Fc-功能的体外测定法的多种测量，鉴定几个蛋白酶抗性Fc序列，当掺入完全IgG构建体(H2L2)内时，所述序列提供对在下铰链残基(EU232-237)处起作用的一种或多种蛋白酶的抗性，同时具有结合FcγR或促进细胞溶解的能力。包含在铰链处以及在CH2区中的变化且通过受体亲和力和体外生物活性分类的所选构建体的Fc-相关活性中的变化显示于表3中。

表3：

制备含改变的Fc的分子的方法

根据需要选择用于替换的位点以产生组合物，所述组合物具有天然抗体Fc的结构特点，维持稳定性，保留FcR结合和刺激补体级联、细胞溶解、细胞吞噬或细胞因子释放的能力。具有改变或突变的氨基酸的蛋白质特别是长多肽链多聚体方便地通过编码亲本序列的表达载体内的核酸修饰产生，以便改变关于所需氨基酸的相应遗传密码。遗传密码和此类方法是本领域熟知的。当产生嵌合序列例如包含IgG1部分和IgG2部分的本发明的Fc时，各自编码核酸的较大区段可剪切在一起或可通过标准克隆技术替换区段。

蛋白水解测试

为了测定一种含Fc组合物或抗体是否比另一种或野生型组合物更多蛋白水解抗性，评估蛋白水解酶降解不同的分离的含Fc组合物或抗体的速率或程度。在一段时间以后，使用能够直接测定链分裂的方法，例如独特的切割位点结构的形成或新近形成的片段的测量，来测量对于不同组合物的降解。作为另外一种选择，当切割导致活性丧失时，可执行功能测定法包括结合测定法。

IgG1的蛋白水解切割可在二聚的异二聚结构的四条多肽链的任何处发生。IgG的切割导致具有近似但独特分子量的充分表征的片段例如Fab、F(ab’)₂和Fc片段的生成。如先前描述的(WO2007024743A2、WO2009045894A1)，在使用PNGase F(肽N-糖苷酶F)去糖基化后，在蛋白水解实验过程中生成的此类片段的分离可使用尺寸排阻层析(SEC)、凝胶电泳、MALDI-TOF-MS(基质辅助激光/解吸飞行时间质谱法)分析来完成。

因此，提及对蛋白水解切割抗性的含Fc组合物意指在暴露于蛋白水解酶后，该组合物比竞争分子例如野生型人IgG1更不可能被降解，丧失活性，丧失对于Fc结合配偶体例如FcR的亲和力。

突变体的生物学表征

可通过若干个熟知的体外测定法来比较含Fc的蛋白质的功能性。具体地说，所关注的是Fcγ受体的FcγRI、FcγRII和FcγRIII家族的成员的亲和力。可利用重组可溶形式的受体或细胞结合形式的受体进行这些测量。此外，例如可使用采用重组可溶性FcRn的配体结合珠形式例如“ALPHASCREEN”测量对FcRn(负责IgGs的延长循环半衰期的受体)的亲和力。用于高通量筛选中的

是均相测定技术，其允许检测分子事件例如结合。包被的“供体”和“受体”珠是

测定技术的基础。

基于珠的测定法，通过彼此接近的珠的相互作用进行操作，导致作用于产生极大扩增的信号的化学反应级联。可应用直接或间接例如竞争性结合测量来评估在蛋白质中的相对亲和力和亲合力。

已存在人IgG同种型(例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)的自然进化，各自显示出召募免疫功能的不同能力谱，例如抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC，例如IgG1和IgG3)、抗体依赖性细胞吞噬作用(ADCP，例如IgG1、IgG2、IgG3和IgG4)、和补体依赖性细胞毒性(CDC，例如IgG1、IgG3)。这些功能的同种型特异性接合是基于对于位于不同免疫细胞中的Fc受体的差异选择性，以及结合C1q且活化膜攻击复合物(MAC)装配的能力，导致通过在效应巨噬细胞上的特定受体结合补体成分的CDC和CDP(补体依赖性吞噬作用)。尽管已有充分证据证明微生物感染中由IgG2和IgG4进行的补体活化，但结合人同种型的补体级联的初始成分C1q的能力层级为IgG1＞IgG3＞IgG2＞IgG4。

基于细胞的功能分析(例如ADCC测定法和CDC测定法)提供特定构建体结构的可能功能结果的了解。抗体依赖细胞介导的细胞毒性(ADCC)是细胞介导的反应，在这个反应过程中，表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如自然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合抗体并随后将靶细胞溶解。在一个实施例中，ADCC测定法被配置成具有NK细胞作为主要效应细胞，反映对FcγRIIIa(已知由这些细胞表达的唯一活化Fcγ型受体)的功能作用。

吞噬作用测定法也可用于比较不同突变体的免疫效应子功能，而测量细胞应答(例如过氧化物或炎性介质释放)的测定法也可用于进行比较。例如在使用抗CD3抗体的突变体的情况下，可使用体内模型来测量小鼠中T细胞活化，依赖于接合特定配体例如Fcγ受体的Fc结构域的活性。抗体引导的巨噬细胞活化介导抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP)，导致所调理的靶细胞被巨噬细胞吞噬和消化。使用INFγ或GM-CSF可使表达高水平FcRs的体外分化的巨噬细胞分化成M1表型，以相对于单核细胞表达升高水平的所有FcR(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIIa)。

抗体突变体的产生

本发明的组合物是最方便地通过改造的宿主细胞产生的复杂蛋白质。如本文所述，选择用于表达重组的含Fc的蛋白质或单克隆抗体的宿主细胞对最终组成至关重要，包括但不限于免疫球蛋白CH2结构域中装饰蛋白质的低聚糖部分的组成的变化。因此，本发明的一个方面涉及包含编码本发明的含Fc构建体的多核苷酸序列的适当宿主细胞的选择，用于作为表达所需治疗蛋白质的生产细胞使用或开发表达所需治疗蛋白质的生产细胞。

此外，宿主细胞可具有哺乳动物来源，或可选自COS-1、COS-7、HEK293、BHK21、CHO、BSC-1、Hep G2、653、SP2/0、293、海拉细胞、骨髓瘤、淋巴瘤、酵母、昆虫或植物细胞，或它们的任何衍生的、永生的或转化的细胞。

作为另外一种选择，宿主细胞可选自不能使多肽糖基化的物种或生物体，例如原核细胞或生物体，例如天然或已改造的大肠杆菌属物种(E.colispp.)、克雷白氏杆菌属物种(Klebsiella spp.)或假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)的原核细胞或生物体。

在IgG重链内天然存在的糖基化位点处(N297，EU编号)的糖基化还促成对于FcγR的Fc结合亲和力。因为恒定区随着同种型而改变，所以每个同种型具有N联碳水化合物结构的独特排列，其可变地影响蛋白质装配、分泌或功能活性(Wright，A.和Morrison，S.L.，Trends Biotech.《生物技术趋势》15：26-32(1997)。取决于加工程度，附着的N联碳水化合物的结构相当大地改变，并且可包括高甘露糖、多分枝以及双触角的复杂寡糖和唾液酸(N-乙酰神经氨酸或NANA)、岩藻糖、半乳糖和GlcNAc(N-乙酰葡糖胺)残基作为末端糖。已认识到对宿主细胞的效应子功能和抗体的寡糖含量的影响(Lifely，M.R.等人，1995Glycobiology《糖生物学》5：813-822；Jefferis，R.等人，1998Immunol Rev.《免疫学评论》163：59-76；Wright，A.和Morrison，S.L.，同上；Presta L.2003.Curr Opin Struct Biol.《结构生物学新见》13(4)：519-25)。此外，关于抗体中的糖链，据报道在抗体N-糖苷连接的糖链中的还原端上的近端N-乙酰葡糖胺处的岩藻糖添加或修饰显著改变抗体的ADCC活性(WO00/61739)。

进一步地，双触角寡糖的糖基化的相对贡献、二分GlcNac的存在和岩藻糖基化指示与对于N联双触角寡糖结构的其它修饰相比较，非岩藻糖基化的Mabs展示更大的增强ADCC的能力，如在体外和体内测量的(Shields等人2002.J Biol Chem.《生物化学杂志》277：26733-40；Niwa等人2004.Cancer Res.《癌症研究》64：2127-2133)。

使用宿主细胞表达或制造蛋白酶抗性mAb在本发明的范围内，所述宿主细胞改造为(如通过特定酶的敲除或击倒Shinkawa等人2003J.Biol.Chem.《生物化学杂志》278：3466-3473；EP1176195A1)或例如通过环境或营养操作诱导为能够产生具有低岩藻糖含量的mAb。

抗体、Fc和Fc-融合蛋白

抗体结合结构域或其片段可使用本领域技术人员已知的方法产生，并且与本文提供的信息组合的可包括任何哺乳动物的序列或衍生自任何哺乳动物，所述哺乳动物例如但不限于人、小鼠、兔、大鼠、啮齿类动物、灵长类动物、山羊或其任何组合。此类抗体可提供在产生本发明的抗体构建体中有用的结合结构域的基础架构和组分。在一个方面，从通过用靶肽、细胞或组织提取物免疫接种小鼠或其它动物而制备的杂交瘤中获得抗体结合结构域。抗体可使用本领域熟知的任何杂交瘤技术获得，参见例如以引用的方式整体并入本文的Harlow和Lane，antibodies，a Laboratory Manual《抗体：实验室手册》，Cold Spring Harbor，NY(1989)，或通过使用本领域已知的技术选择抗体生产淋巴细胞且克隆编码结合结构域的核酸序列来获得。

本发明涉及人IgG的恒定区。因此，本发明包括包含人Fc-结构域的任何抗体或融合蛋白，其中期望最终组合物展示蛋白水解抗性(如本文所述)和在体外测定法中结合FcgR并促进ADCC、ADCP和/或CDC的能力。根据需要靶向部分包括但不限于抗体Fv或单个可变结构域可融合至Fc组合物。“Fv”由紧密、非共价结合的一个重链和一个轻链可变区结构域的二聚体组成。由这两个结构域的折叠散发六个高变环(各自来自H和L链的3个环)，所述高变环促成用于抗原结合的氨基酸残基且对抗体赋予抗原结合特异性。然而，即使单个可变结构域(或一半Fv仅包含对于抗原特异性的三个CDRs)也具有识别并结合抗原的能力，尽管通常以低于整个结合位点的亲和力。也缩写为“sFv”或“scFv”的“单链Fv”是包含连接为单条多肽链的VH和VL抗体结构域的抗体片段。scFv多肽通常包含在VH和VL之间的多肽接头。当构建体完全通过重组方法产生时，靶向部分还可选自抗体的互补位(结合残基并不限于CDRs或可变结构域结构)；酶；激素；受体；细胞因子；免疫细胞表面抗原；和粘附分子。靶向部分还可具有非蛋白质性质，例如碳水化合物、脂质、脂多糖、有机分子或金属或金属络合物。一般地，当存在时，靶向分子将通过接头连接至Fc，所述接头可以是多肽或非多肽。

通过本领域熟知的若干方法可衍生本文描述的含Fc蛋白质或Fc片段。抗体结合结构域或Fc融合蛋白或其组分和结构域也可通过从此类结构域或组分的文库(例如噬菌体文库)中选择来获得。可通过插入随机寡核苷酸的文库或含所关注序列的多核苷酸的文库来构建噬菌体文库，如来自免疫接种的动物或人的B细胞(Smith，G.P.1985.Science《科学》228：1315-1317)。抗体噬菌体文库在一个噬菌体中含有重链(H)和轻链(L)可变区对，从而可表达单链Fv片段或Fab片段(Hoogenboom等人，2000，Immunol.Today《今日免疫学》21(8)371-8)。可操纵噬菌粒文库的多样性来增加和/或改变该文库中单克隆抗体的免疫特异性，以生产和随后鉴定另外的期望的人单克隆抗体。例如，可将重链(H)和轻链(L)免疫球蛋白分子编码基因随机混合(改组)，以在装配的免疫球蛋分子中产生新的HL对。另外，可在免疫球蛋白多肽可变区的互补决定区(CDR)中对重链和轻链编码基因中的一条和两条进行诱变，随后进行筛选以获得期望的亲和力和中和能力。还可如下合成产生抗体或Fc文库：选择一个或多个人构架序列，并引入衍生自人抗体储库(repertoires)的CDR盒的集合或通过所设计的变型(Kretzschmar和von Ruden2000，Current Opinion in Biotechnology《生物技术新见》，13：598-602)。多样性的位置不限于CDR，而是还可包括可变区的构架区段或可包括除抗体可变区之外的区段，例如肽。在一个方面，如申请人共同未决的申请(美国序列号61/261767)中所述的能够展示连接至噬菌体外壳蛋白质pIX的二聚Fc结构的噬菌体文库可用于选择根据本发明的新型含Fc结构。

可包括除了抗体可变区外的靶结合组分的靶结合组分文库可包括核糖体展示文库、酵母展示文库、和细菌展示文库。核糖体展示是一种将mRNA翻译为它们的同源蛋白质的同时保持蛋白质附接到RNA的方法。通过RT-PCR回收核酸编码序列(Mattheakis，L.C.等人1994.Natl.Acad.Sci.USA《美国科学院院刊》91，9022)。酵母展示是基于膜相关α-凝集素酵母粘附受体aga1和aga2的融合蛋白的构建，所述aga1和aga2是交配型系统的部分(Broder等人，1997Nature Biotechnology《自然.生物技术》，15：553-7)。细菌展示是基于靶与输出的与细胞膜或细胞壁缔合的细菌蛋白的融合(Chen和Georgiou2002.Biotechnol Bioeng《生物技术与生物工程》，79：496-503)。

本发明还提供编码本发明的组合物的核酸，其作为分离的多核苷酸或作为表达载体的部分，所述表达载体包括与所述组合物或它们的定向诱变剂的原核生物、真核或丝状噬菌体表达、分泌和/或展示相容的载体。

含Fc的分子的用途

通过任何上述方法生产的组合物(抗体、Fc融合物、Fc片段)可用于诊断、治疗、检测或调节人疾病或细胞、组织、器官、体液或通常是宿主的具体病理。如本文教导的，抗体的Fc部分、Fc-融合蛋白或Fc片段的修饰(以减少或取消蛋白水解降解，同时保留可测量的Fcγ受体结合或指定的效应子功能)可与结合结构域例如抗体或配体结合结构域的互补位组合，所述结合结构域保留原始靶向特异性和生物活性。示例性结合结构域是抗体、一个或多个抗体CDRs、或一个或多个抗体可变结构域的互补位；酶；激素；受体；膜受体的细胞外结构域；细胞因子；免疫细胞表面抗原；和粘附分子。所得的构建体提供抗体和Fc-构建体，其具有极佳的活性、生物物理性质、稳定性和在宿主体内持续的能力的谱。

申请人的Fc序列的发现提供在指定适应症中实现结合分子的最大功效的能力，所述Fc序列具有对生理学相关蛋白酶的抗性和接合一种或多种Fcγ受体的能力或无能和/或通过效应细胞或补体的活化影响细胞溶解的能力的独特组合。例如，靶向异常宿主细胞的能力通过包含能够ADCC和ADCP的本发明的真核蛋白酶抗性Fc的分子最佳适合，所述异常宿主细胞例如涉及瘤形成或其它不需要的增殖的细胞，例如在不适当的血管生成、不适当的纤维化中。相比之下，细菌细胞通过补体介导的机制容易地破坏。因此，细菌感染可通过本发明合适的Fc-构建体进行治疗，所述Fc-构建体对细菌蛋白酶是抗性的并具有诱发CDC的能力。

申请人已鉴定选择具有合适的性质组合的Fc的方法，并提供目的特定含修饰的Fc的分子的工作实例。真核蛋白酶抗性且能够具有ADCC、ADCP和CDC中的一种或多种的分子包括约EU残基214至约残基330在铰链和CH2区中具有人IgG1的序列的Fc结构域，其中至少残基233-237由PVA/(G236缺失)替换，并且还包含在CH2结构域中的一个或多个替换，由此该分子无法具有ADCC、ADCP和CDC中的一种或多种，包括构建体5、7、8、9、10、11、12、14、15、16和17。在具体实施例中，此类分子包括与其它替换组合的选自I332E的替换，所述其它替换例如S239D/I332E(5、14)、S239D/H268F/I332E(未制备)、H268F/S324T/I332E(8)、S239D/H268F/S324T/I332E(9)、S267E/H268F/S324T/I332E(10)、G237X/S239D/I332E(其中X为A或S(12))；、K326A/I332E/E333A(15)和S267E/I332E(17)。

对原核蛋白酶抗性且能够具有CDC的分子包括约EU残基214至约残基330包含Fc结构域的那些分子，所述Fc结构域在铰链和CH2区中具有人IgG1的序列，其中至少残基233-237由PVA/(G236缺失)替换，并且还包含选自下列的在CH2结构域中的一个或多个替换：K326A/E333A(11)、S267E/H268F/S324T/I332E(10)、K326A/I332E/E333A(15)、S239D/K326A/E333A(16)和S267E/I332E(17)。

其为真核蛋白酶抗性但不促进靶细胞溶解的分子也可有利地用于治疗疾病或状况，其中靶细胞调节而不是靶细胞破坏是目的，例如通过使用如本文教导的抗体或其它Fc-构建体，其是蛋白酶抗性的且具有与野生型IgG1相比较减少的ADCC、ADCP或CDC。其为蛋白酶抗性的包含非天然、非野生型Fc结构域的分子包括约EU残基214至约残基330包含Fc结构域的分子，所述Fc结构域在铰链和CH2区中具有人IgG1的序列，其中至少残基233-237由PVA/(G236缺失)替换。

因此，基于本文的教导和实例，证实对哺乳动物受试者中出现的蛋白酶的增强抗性且任选具有靶向细胞上的抗原的能力的目前能够的含Fc构建体提供相对于并非蛋白酶抗性的治疗分子改善的治疗分子。

给药

因为蛋白水解酶根据其形成或积聚速率而局部化，例如在消化道中的胃蛋白酶，或在组织重建或恶性生长区域中的基质金属蛋白酶(MMPs)，所以本发明的组合物特别适合于在其中体室已知含有蛋白酶或异常高的蛋白酶含量的用途。

本发明提供蛋白酶抗性IgG组合物例如抗体的稳定制剂，其优选为含水磷酸盐缓冲盐水或混合盐溶液，以及保存溶液和制剂以及适合于药物或兽医学用途的多用途保存制剂，所述制剂包含在药用制剂中的至少一种蛋白酶抗性抗体。合适的媒介物及其制剂，包含其它人蛋白如人血清白蛋白在内，描述于例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy《制药科学与实践》，第21版，Troy，D.B.编辑，美国宾西法尼亚州费城的利平科特·威廉斯·威尔金斯出版公司(Lipincott Williams and Wilkins，Philadelphia，PA)2006，第5部分，Pharmaceutical Manufacturing《药物制造》第691-1092页，特别参见第958-989页。

如本文所述或本领域已知的在稳定或保存制剂中具有效应子功能的蛋白酶抗性IgG组合物可经由多种递送方法依照本发明施用于患者，所述递送方法包括静脉内(I.V.)；肌内(I.M.)；皮下(S.C.)；经皮；经肺；经粘膜；使用在植入物、渗透泵、药筒、微型泵中的制剂；或技术人员理解、本领域熟知的其它方式。

对于体室或体腔的位点特异性施用，施用可以是关节内、支气管内、腹内、囊内、软骨内、腔内、体腔内、小脑内、脑室内、结肠内、颈内、胃内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直肠内、肾内、视网膜内、脊柱内、滑膜内、胸内、子宫内、膀胱内、病灶内、阴道、直肠、颊、舌下、鼻内或经皮方式。

可顺应使用由本发明提供的组合物的治疗的疾病或病理状态包括但不限于其中不需要的细胞增殖、活化或迁移是有害的疾病，例如恶性肿瘤、高活跃或不平衡的免疫应答、纤维化组织形成或感染，因为该组合物通过FcγR驱动的机制提供宿主免疫系统的细胞毒性或细胞溶解机制的活化。此类疾病包括恶性肿瘤：白血病、急性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、B细胞、T细胞或FAB ALL、急性髓样白血病(AML)、慢性髓性白血病(CML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、毛细胞白血病、骨髓增生异常综合征(MDS)、淋巴组织增生病、皮肤T细胞淋巴瘤、何杰金氏病、Castleman氏病、神经胶质瘤、成胶质细胞瘤、星形细胞瘤、恶性淋巴瘤、非何杰金氏淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、多发性骨髓瘤、卡波西氏肉瘤、结肠直肠癌、胰腺癌、肾细胞癌、乳腺癌、导管癌、脂肪瘤、鼻咽癌、前列腺癌、睾丸癌、卵巢癌、成视网膜细胞瘤、恶性组织细胞增多症、恶性肿瘤的血钙过多、浆细胞瘤、软骨肉瘤、肉瘤、默克细胞癌、肝细胞癌、肝瘤、基底细胞癌、腺癌、鳞状细胞癌、肉瘤(例如尤因、卡波济、儿童期软组织、成人)、黑素瘤、转移性黑素瘤、血管瘤、转移性疾病、骨肉瘤、横纹肌肉瘤、胸腺瘤和胸腺癌、癌相关骨再吸收、子宫内膜癌、阴道癌、子宫癌、肾母细胞瘤、癌症相关骨痛等。

能够结合恶性淋巴细胞上的抗原的靶向分子包括B细胞抗原例如CD19、CD20和CD22。衍生自上皮组织的实体瘤通常展示上皮生长因子受体，且通过与称为ErbB1、ErbB2、ErbB3的上皮生长因子受体和其它受体的配体结合受刺激，所述其它受体能够发信号或引起增殖性应答或抗细胞凋亡应答，导致未经检查的肿瘤生长。在实体瘤上的其它常见抗原是组织因子或RON。

当与适当的靶结合结构域组合时，组合物也用于治疗由下列引起的传染病：细菌(例如链球菌属(Streptococcus)、葡萄球菌属(Staphylococcus)和大肠杆菌(E.coli.))、病毒(例如流感、AIDS、RSV、SARS和西尼罗河病毒)、真菌(例如曲霉菌病、球孢子菌病、隐球菌病或念珠菌病)或原生动物感染(例如锥虫病、弓形体病、贾第虫病或疟疾)。

该组合物用于治疗一般的免疫和自身免疫病症，包括但不限于风湿性疾病、牛皮癣和硬皮病。

该组合物用于治疗与不适当的血管生成相关的病症。血管生成是生成新毛细血管的过程，并且它起源于内皮细胞的活化增殖。新生血管形成是紧密调节的，并且仅在胚胎发育、组织重建、伤口愈合和黄体发育的周期性循环过程中出现(Folkman和Cotran，Relation of vascular proliferation to tumorgrowth《血管增殖与肿瘤生长的关联》，Int.Rev.Exp.Pathol.′16，207-248(1976))。内皮细胞通常比身体中的其它类型细胞慢得多地增殖。然而，如果这些细胞的增殖速率变得未调节，则可导致病理性血管生成。病理性血管生成涉及许多疾病中。例如，心血管疾病例如血管瘤、血管纤维瘤、血管畸形、动脉粥样硬化、虹膜粘连和edemic硬化症；以及眼疾病例如角膜植入后的新生血管形成、新生血管性青光眼、糖尿病性视网膜病变、血管生成的角膜疾病、黄斑变性、翼状胬肉、视网膜变性、晶状体后纤维增生和颗粒性结膜炎与血管生成相关。慢性炎性疾病例如关节炎；皮肤病学疾病例如牛皮癣、毛细管扩张、脓性肉芽肿、皮脂溢性皮炎、静脉溃疡、粉刺、酒糟鼻(红斑痤疮或erythematosa)、疣(瘊)、湿疹、血管瘤、淋巴管生成也是血管生成依赖性的。

糖尿病性视网膜病变可采取两种形式之一，非增殖性或增殖性的。增殖性视网膜病变的特征在于异常的新血管形成(新生血管形成)，其在玻璃质表面上生长或延伸到玻璃质腔内。黄斑变性同样采取两种形式，干燥和湿润的。在较不常见的渗出性黄斑变性(湿润形式)中，存在脉络膜新生血管形成的视网膜下网络的形成，通常与视网膜内出血、视网膜下液体、色素上皮脱离和色素沉着过度相关。新生血管性青光眼在具有糖尿病或视网膜中央静脉阻塞或拉动虹膜向上进入角内的与葡萄膜炎相关的炎性沉淀物的患者中出现(第99章The Merck Manual《默克诊疗手册》第17版1999)。

类风湿性关节炎，炎性疾病，也导致不适当的血管生成。滑液腔中的血管内皮细胞的生长通过炎性细胞因子活化，并且导致关节中的软骨破坏和由关节翳的替换(Koch AK，Polverini PJ和Leibovich SJ，Arth；15Rhenium《关节炎与风湿病》，29，471-479(1986)；Stupack DG，Storgard CM和Cheresh DA，Braz.J.Med.Biol.Res.《医学与生物学研究杂志》，32，578-581(1999)；Koch AK，Arthritis Rheum《关节炎与风湿病》，41，951962(1998))。

该组合物用于治疗通过不受控制的皮肤细胞增殖引起的牛皮癣。快速生长的细胞要求足够的血液供应，并且异常血管生成在牛皮癣中被诱导(Folkman J.，J.Invest.Dermatol.《皮肤病学研究杂志》59，40-48(1972))。

许多因子涉及导致血管生成的过程和事件：细胞粘附分子、整联蛋白、血管内皮生长因子(VEGF)、TNFα、bFGF和细胞因子包括IL-6和IL-12。例如，紧密相关但不同的整联蛋白αVβ3和aVb5已显示介导血管生成过程中的独立途径。针对αVβ3生成的抗体阻断碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)诱导的血管生成，而对aVb5特异性的抗体抑制血管内皮生长因子(VEGF)诱导的血管生成(Eliceiri等人，J.Clin.Invest.《临床研究杂志》103：1227-1230(1999)；Friedlander等人，Science《科学》270：1500-1502(1995))。因此，本发明包含在本发明的组合物中针对这些靶的靶向结合结构域用于在治疗其中指示血管生成的抑制的疾病中使用的用途。

在此以引用方式并入本申请内的申请人共同未决的公开的国际专利申请WO2009023457A1，公开了使用抗铰链切割位点表位特异性单克隆抗体恢复切割的IgGs的效应子功能的策略。掺入根据本发明的蛋白酶抗性和效应子功能完全的Fc与抗铰链结构域以产生二价抗体，将产生能够恢复切割的IgGs的Fc效应子功能同时致使治疗剂对通过蛋白水解切割的沉默有抗性的治疗mAb。相应地，本发明包含本发明的蛋白酶抗性Fc恒定区与如所述的抗铰链可变区mAb的掺入。

虽然已用一般的术语描述了本发明，但是本发明的实施例还将在以下的实例中公开，所述实例不应理解为对本权利要求所保护的范围的限制。

实例1：Fc突变体的构建和测试

使用标准重组技术生成一系列构建体(图2中所示的且组合表1的铰链区与选自表2的在CH2区中的活性恢复突变)。名称2hc代表214至236的对应于EU抗体的Kabat编号(EU编号)的IgG1恒定结构域(SEQ IDNO：3)已替换为相应IgG2序列(SEQ ID NO：4)。名称2h代表IgG1E233-L234-L235-G236的残基替换为具有G235缺失的IgG2P233-V234-A235的相应残基。

表4：

一组抗体构建体的可变区结合CD142(组织因子)，其允许在使用表达组织因子的MDA-MB-231(ATCC，HTB-26^TM)的细胞测定法中测试抗体的Fc依赖性细胞杀死(Brezski等人，Proc Natl Acad Sci USA《美国国家科学院院刊》106：17864-178692009)。用结合CD20的可变区生成另外的实验对象组，其允许使用展示CD20的WIL2-S细胞(ATCC，CRL-8885)测试CDC活性(Brezski等人，Proc Natl Acad Sci USA《美国国家科学院院刊》106：17864-178692009)。所有抗体均使用标准克隆方法和程序在293T细胞中瞬时表达。MAbs在实验分析前使用蛋白A柱纯化至大于95％纯度。

野生型和mAb构建体的蛋白酶消化

纯化的IgGs的蛋白酶消化在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中在pH7.5执行，或对于MMPs(MMP-3、MMP-7、MMP-12和MMP-13均得自Enzo生命科学公司(Enzo Life Sciences))，在Tris缓冲盐水缓冲液中在37℃执行。IdeS得自Genovis，并且GluV8得自Pierce。对于测试的所有MMPs，CaCl₂以5mM包括在MMP反应中。抗体浓度是0.5mg/mL，并且通过添加酶至与IgG约1-2％(w/w)比率来起始反应，除非另外指明。通过在Agilent Biosizing微毛细管电泳(安捷伦科技有限公司(AgilentTechnologies))后分析电泳图来评估IgG切割。所有消化均一式两份执行。

竞争结合测定法

竞争结合研究在一半孔体积96孔不透明板(康宁公司(Corning))中在测定缓冲液(PBS、0.05％BSA、0.01％Tween-20)中在pH7.4执行。所有竞争研究均针对以固定浓度的生物素化的IgG1(1IgG：2生物素，使用EZ Link^TM NHS-LC-生物素，Pierce)和以系列3倍稀释的竞争野生型和蛋白酶抗性构建体执行。FcγR浓度在测定法的终浓度中是0.2μg/ml。生物素化的IgG1(最终0.2μg/ml)以及野生型和蛋白酶抗性抗体(10μl)一式两份地序贯加入96孔板的每行中。其后加入指定的FcγRs，随后序贯加入各10μl的1/50稀释的镍螯合物(Ni)-受体珠和链霉抗生物素蛋白(SA)-供体珠。将不透明的板用铝密封覆盖，以在轨道摇动器上摇动30分钟时维持高安全条件。其后去除密封，并且在配备

激发/发射光谱的合适滤光器组的ENVISION^TM板阅读器(PerkinElmer)上阅读荧光。将原始数据转移至GraphPad PRISM^TM软件并且对于最大信号标准化，并且使用非线性回归曲线拟合软件标绘竞争曲线。

结果

最初目的是测定mAb构建体对许多生理学相关蛋白酶的敏感性，所述蛋白酶先前显示在下铰链区中切割IgG1；MMP--3、MMP-7、MMP-12、MMP-13、GluV8和IdeS。构建体1-5、7、9-11、12(G237A)、13-14作为CD142结合抗体进行测试。蛋白酶经过24小时将IgG1切割至不同程度。虽然MMP-3、MMP-12、IdeS在24小时内消除所有完整的IgG1(构建体1)，但MMP-7切割约30％，MMP-13切割约40％并且GluV8切割约60％。构建体4(2h)和具有2h下铰链修饰的那些构建体对所有MPs抵抗至大致相同的程度。构建体4对GluV8而不是IdeS有抗性。构建体2也对GluV8消化更有抗性。

IdeS已显示切割所有人IgG同种型(von Pawel-Rammingen等人，EMBO21：1607-16152002)。来自时间曲线研究(图3A)的数据指示IdeS将IgG1(1)和IgG2(2)快速转化为F(ab′)2片段(在5分钟温育内)，而IgG1样品2h(4)通过120分钟具有单次切割的中间产物。在测试的构建体中，2h S239D/I332E(5)是对IdeS最多蛋白水解抗性的构建体(图3B)，即使在24小时温育后也检测到完整的IgG(其它的抗体构建体到5分钟时没有可检测的完整IgG)。与IgG1 2h(4)。

相比较，在(5)中的接近在G236和G237之间的IdeS切割点的S239D突变可促成另外的蛋白酶抗性。12种抗CD142抗体构建体(1-5、7、9-13和14)的实验对象组连同其野生型IgG1和IgG2配对物就针对通过IdeS、GluV8、MMP-3和MMP-12的蛋白水解的敏感性进行测试。由电泳图计算在24小时温育后剩余的完整IgG的数据并显示于图4A-D中。

数据证实IgG1wt(1)、IgG2wt(2)、2hc(3)、IgG12h(4)、2hc S239D/I332E(13)、IgG2S239D/I332E(14)和2h K326A/E333A(11)在24小时温育后对通过IdeS的蛋白水解是敏感的。相比之下，构建体2h S239D/I332E(5)、2h G237A/S239D/I332E(12)、2hF243L/R292P/Y300L(7)、2h S239D/H268F/S324T/I332E(9)和2hS267E/H268F/S324T/I332E(10)对通过IdeS的蛋白水解是有抗性的。令人惊讶的是，具有更多IgG2铰链区替换的构建体(包含SEQ ID NO：4)对IdeS蛋白水解不是抗性的。构建体IgG2S239D/I332E在用IdeS的24小时消化后具有小于40％的完整IgG剩余。

用来自金黄色葡萄球菌的GluV8蛋白酶的消化指示构建体IgG2S239D/I332E(14)、2h S239D/I332E(5)、2h G237A/S239D/I332E(12)和2h F243L/R292P/Y300L(7)在24小时消化后具有40-60％范围的完整IgG剩余，类似于对于IgG1wt(1)可见的切割水平。相对于IgG1wt，构建体IgG2wt(2)、2hc(3)、2hc S239D/I332E(14)、IgG12h(4)、IgG12h K326A/E333A(11)、2h S239D/H268F/S324T/I332E(9)和2hS267E/H268F/S324T/I332E(10)显示对通过GluV8的蛋白水解的抗性增加(均具有大于75％的完整IgG剩余)。

MMP-3和MMP-12代表两类癌症相关蛋白酶。在用MMP-3和MMP-12消化后检测到小于5％的完整IgG1wt。相比之下，如通过在24小时消化后大于60％的完整IgG剩余证实的，人IgG2wt和测试的所有构建体均展示对MMP-3和MMP-12增加的蛋白酶抗性。

Fcγ受体结合结果

评估一些Fc-构建体与wt IgG1竞争结合Fcγ受体家族的能力。构建体减少通过生物素化的IgG1产生的最大信号的能力显示于图5A-G中。初始筛选包括构建体1-2、4-6。对于测试的初始构建体组，IgG2(2)、IgG12h(4)和2h E333A/K334A(6)未显示与高亲和力FcγRI的可检测结合，而野生型IgG1显示强结合。与IgG1相比较，2h S239D/I332E(5)显示可检测但减少的与FcγRI的结合。IgG12h(4)和2h E333A/K334A(6)未显示与FcγRIIa的可检测结合，而2h S239D/I332E(5)构建体显示与IgG1wt可比较的结合(图5B)。三种构建体：IgG2(2)、IgG12h(4)和2hE333A/K334A(6)未显示与FcγRIIb的可检测结合，而IgG1(1)和2hS239D/I332E(5)显示可比较的结合(图5D)。与IgG1相比较，IgG2(2)、IgG12h(4)和2h E333A/K334A(6)显示可比较但减少的与FcγRIIIa的结合。2h S239D/I332E(5)构建体展示最高水平的与FcγRIIIa的结合，甚至高于IgG1wt(图5F)。

另外，2h S239D/H268F/S324T/I332E(9)构建体展示与IgG1可比较的结合，而与IgG1wt相比较，2h S267E/H268F/S324T/I332E(10)构建体具有增加的与FcγRIIa的结合(图5C)。相对于IgG1wt，构建体2hS239D/H268F/S324T/I332E(9)和2h S267E/H268F/S324T/I332E(10)都展示与FcγRIIb增加的结合(图5E)。构建体2h K326A/E333A(11)显示与FcγRIIa(图5C)和FcγRIIb(图5E)的最小可检测结合。

与IgG1wt相比较，构建体2h S267E/H268F/S324T/I332E(10)显示轻微减少的与FcγRIIIa的结合，而构建体2h S239D/H268F/S324T/I332E(9)具有增加的与FcγRIIIa的结合(图5G)。与IgG1wt相比较，2hK326A/E333A(11)展示与FcγRIIIa的弱结合(图5G)。

总结

这些结果指示蛋白水解抗性构建体包含2h S239D/I332E(5)、2hS239D/H268F/S324T/I332E(9)和2h S267E/H268F/S324T/I332E(10)能够与FcγRIIa、IIb和IIIa结合至不同程度，并且相对于单独的2h(4)突变，所有这三种构建体均具有增加的结合。与其它CH2突变组合的在IgG1的下铰链中的残基突变是出乎意料的结果，所述其它CH2突变与构建体hS267E/H268F/S324T/I332E(10)一样增强FcγRIIa结合亲和力超过IgG1wt，增强2h S239D/H268F/S324T/I332E(9)和2hS267E/H268F/S324T/I332E(10)对于FcγRIIb的亲和力，与构建体2hS239D/I332E(5)和2h S239D/H268F/S324T/I332E(9)一样增强FcγRIIIa结合亲和力超过IgG1wt。

实例2：抗体依赖细胞吞噬作用(ADCP)

为了测试蛋白酶抗性mAbs介导Fc-依赖性体外细胞杀死的能力，执行ADCP测定法。在这个测定法中，通过抗体结合将蛋白水解细胞召募至靶抗原展示细胞并测量靶细胞破坏。

步骤

使用Ficoll梯度离心从正常人供体中分离PBMCs。使用不耗尽CD16pos单核细胞的CD14分离试剂盒(Stem Cell Technologies)，通过阴性耗尽从PBMCs中纯化CD14pos单核细胞。将单核细胞以0.1×10⁶细胞/cm²在含有10％FBS和20ng/ml GM-CSF(R&D Systems)的X-VIVO-10培养基(Lonza)中铺平板7天。加入100ng/ml IFNγ(R&D Systems)用于最终的24小时分化。关于ADCP测定法的靶细胞是表达GFP的MDA-MB-231细胞。使分离的巨噬细胞与表达GFP的MDA-MB-231以4∶1的比率连同或不连同野生型和蛋白酶抗性mAb构建体一起在96孔U形底部板中温育4小时。在温育后，使用Accutase(西格玛公司(Sigma))从96孔板中回收细胞。用耦合到AlexaFluor647(英杰公司(Invitrogen))的抗CD11b和抗CD14抗体(都来自BD Biosciences)鉴定巨噬细胞，并且随后在FACsCalibur(BD Biosciences)上获得细胞。使用FloJo软件(Tree Star)分析数据。通过下列等式测定吞噬作用百分比：((GFPpos、CD11bpos、CD14pos细胞)/(GFPpos、CD11bpos、CD14pos细胞加上单独的GFPpos细胞))×100％。

如所述的使用GM-CSF和IFNγ在体外分化分离的单核细胞。如由其它人显示的，分化的巨噬细胞表达所有FcγRs(FcγRI、FcγRIIa、FcγRIIb和FcγRIIIa)(数据未显示)。

结果

图6A中所示的数据指示IgG1wt(1)和2h S239D/I332E(5)达到最高水平的ADCP。IgG2wt(2)、IgG1 2h(4)和2h E333A/K334A(6)的ADCP能力产生低但可检测的ADCP能力。这些结果指示蛋白酶抗性构建体2h S239D/I332E(5)能够以与IgG1wt可比较的水平吞噬肿瘤细胞。在分开的实验中，就ADCP能力测试含有IgG12h铰链区的CH2构建体的另外实验对象组(图6B)。在这个组中，构建体2h S239D/I332E(5)、2hF243L/R292P/Y300L(7)和2h S239D/H268F/S324T/I332E(9)具有与IgG1wt(1)相似的ADCP，而相对于IgG1wt，构建体2hS267E/H268F/S324T/I332E(10)、2h H268F/S324T/I332E(8)和2hG237A/S239D/I332E(12)具有轻微减少的最大吞噬作用。构建体2hK326A/E333A(11)具有低但可检测的ADCP，类似于IgG2wt(2)和IgG12h(4)。最后，就ADCP测试含有IgG2的完全铰链的构建体。构建体IgG2S239D/I332E(14)展示与IgG1wt相似的ADCP，而构建体2hc(3)和2hc S239D/I332E(13)展示低但可检测的ADCP。

实例3：抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)

在这个测定法中，将单核细胞召募至靶抗原展示细胞并测量靶细胞破坏。

程序

ADCC测定法如先前所述执行(Scallon等人，Mol Immunol《分子免疫学》44：1524-15342007)。简言之，通过Ficoll梯度从人血液中纯化PBMCs，并且用作用于ADCC测定法的效应细胞。MDA-MB-231人乳腺癌细胞ATCC HTB-26)用作靶细胞，以1个靶细胞与50个效应细胞的比率。将靶细胞用BATDA(PerkinElmer)在37℃预标记20分钟，洗涤两次并重悬浮于DMEM、10％热灭活的FBS、2mM L-谷氨酰胺(均来自英杰公司)中。组合靶(1×10⁴细胞)和效应细胞(0.5×10⁶细胞)，并且将100μl细胞加入96孔U形底部板的孔中。加入另外100μl连同或不连同野生型和蛋白酶抗性mAb构建体。所有样品均一式两份执行。将板以200g离心3分钟，在37℃温育2小时，随后再次以200g离心3分钟。从每个孔中取出总共20μl的上清液，然后加入200μl基于DELPHIA Europium的试剂(PerkinElmer)并测定细胞溶解。使用Envision2101多标记微孔板检测仪(PerkinElmer)来测定荧光。使数据针对使用0.67％Triton X-100(西格玛奥德里奇公司(Sigma Aldrich))的最大细胞毒性和通过在不存在任何抗体的情况下来自靶细胞的BATDA自发释放测定的最小对照标准化。使用GraphPad Prism v5将数据拟合至S形剂量响应模型。

结果

如此标绘数据，使得在Y轴上显示根据抗体浓度的细胞溶解水平。图7A中所示的数据指示2h S239D/I332E(5)构建体具有最高水平的ADCC能力，其是在所述测定法中超过IgG1wt的大约8倍(如通过表观EC50中的转变证明的)改善。

在另一实验中，比较构建体的延伸实验对象组的ADCC能力。图7B描述了通过数据生成的曲线。相对于IgG1wt，三种构建体(2h S239D/I332E(5)、2h F243L/R292P/Y300L(7)和2h S239D/H268F/S324T/I332E(9)具有增加的ADCC能力。2h G237A/S239D/I332E(12)和2hH268F/S324T/I332E(8)构建体具有超过IgG1wt的轻微增加的ADCC，而相对于IgG1wt，构建体2h K326A/E333A(11)和2hS267E/H268F/S324T/I332E(10)具有可检测但减少的ADCC。图7C描述了来自含有IgG2的完全铰链区的构建体实验对象组的ADCC结果。IgG2S239D/I332E(14)构建体具有低于IgG1wt的EC50，以及更低的最大溶解。构建体2hc(3)和2hc S239D/I332E(13)具有超过IgG2wt但低于IgG1wt的可检测的ADCC。总之，这些结果证实在下铰链中的关键残基的突变可通过许多CH2突变补偿，以恢复ADCC和FcγR-结合。然而，相对于IgG1wt，并非对测试的IgG12h(3)主链作出的所有CH2突变均能够恢复/增强ADCC。

这些结果与显示2h S239D/I332E(5)和2h S239D/H268F/S324T/I332E(9)的增强亲和力的FcγRIIIa结合测定法(图5F-G)一致，因为表达FcγRIIIa的NK细胞被认为是ADCC中的相关效应细胞。

实例4：补体依赖性细胞毒性(CDC)

在这个测定法中，将补体组分召募至靶抗原展示细胞并测量靶细胞破坏。

程序

CDC测定法如先前所述执行(Brezski等人J Immunol.《免疫学杂志》181(5)：3183-31922008)。WIL2-S细胞用作用于CDC测定法的靶细胞。将50μl细胞加入96孔板的孔中用于8×10⁴细胞/孔的终浓度，在RPMI、5％热灭活的FBS、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸钠(均来自英杰公司)中。将另外50μl加入含或不含抗体的孔中，并将板在室温孵育2小时。将50μl10％兔补体(英杰公司)加入孔中，并将板在37℃温育20分钟。所有样品均一式两份执行。在200g下对培养板离心3分钟，将50μl上清液移取到分开的培养板，使用LDH细胞毒性检测试剂盒(Roche)检测CDC。使用Spectra max Plus384(PerkinElmer)检测吸光度。将数据归一化到使用Triton X-100(Sigma Aldrich)的最大细胞毒性和仅含细胞和单独补体的最小对照。使用GraphPad Prism v5将数据拟合至S形剂量响应模型。

结果

图8中所示的数据指示构建体2h S267E/H268F/S324T/I332E(10)和2h K326A/E333A(11)都达到与IgG1wt相似水平的细胞溶解。构建体IgG12h(4)、2h S239D/I332E(5)、2h F243L/R292P/Y300L(7)和2hS239D/H268F/S324T/I332E(9)具有最小CDC能力，其类似于对于IgG2wt(2)测量的那种。

实例5：另外的蛋白酶抗性构建体

仅与具有G236缺失的E233P/L234V/L235A组合的两种CH2突变能够具有与IgG1wt可比较的CDC活性，即2h K326A/K334A(11)和2hS267E/H268F/S324T/I332E(10)。然而，2h K326A/K334A(11)具有最小的ADCC和ADCP活性，并且相对于IgG1wt，2hS267E/H268F/S324T/I332E(10)具有减少的ADCC活性。改造具有所有三种活性(ADCC、ADCP和CDC)的蛋白酶抗性构建体将是有利的。单独的H268F/S324T突变先前未显示增加对FcγRs的亲和力(Moore等人)，而构建体2h H268F/S324T/I332E具有相对于2h增加的ADCC。因此，单独的I332E突变可恢复2h蛋白酶抗性铰链构建体的ADCC。因此，将生成组合ADCC/ADCP恢复与CDC恢复至2h亲本铰链的构建体，包括2hK326A/I332E/E333A(15)(SEQ ID NO：18)、S239D/K326A/E333A(SEQ ID NO：19)(16)和S267E/I332E(17)(SEQ ID NO：20)。

使用实例1中所述的材料与方法测试三种构建体。与IgG1wt相比较，三种构建体展示对MMP-3和MMP-12的抗性。

如先前证实的，IgG2wt(2)对GluV8有抗性，而IgG1wt(1)在24小时消化后具有小于60％的完整IgG剩下。与IgG1wt相比较，三种构建体具有增加的对GluV8的抗性。然而，与IgG2wt相比较，构建体2hK326A/I332E/E333A(15)和2h S267E/I332E(17)具有减少的对GluV8的抗性，而2h S239D/K326A/E333A(16)具有与IgG2wt可比较的抗性。这些数据暗示与下铰链突变组合的将另外的Glu引入CH2内的突变产生新型GluV8切割位点(例如2h S239D/I332E(5)、2h K326A/I332E/E333A(15)和2h S267E/I332E(17))，而不将另外的Glu引入CH2内的突变展示类似于IgG2wt的对GluV8的抗性(例如2h K326A/E333A(11)和2hS239D/K326A/E333A(16))。

IgG1wt和IgG2wt都对通过IdeS的蛋白水解敏感。两种构建体2hK326A/I332E/E333A(15)和2h S267E/I332E(17)在与IdeS的24小时温育后都具有大于90％的完整IgG剩余，而构建体2h S239D/K326A/E333A(16具有小于20％的完整IgG剩余。这些结果暗示与下铰链突变组合的Glu加入CH2内增加对IdeS的蛋白酶抗性，这是单独的下铰链突变2h(4)不赋予的性质。

就其执行ADCP、ADCC和CDC的能力测试三种构建体。三种构建体具有与IgG2wt和2h(4)相比较增加的ADCP能力，但与IgG1wt相比较减少的最大ADCP。两种构建体2h K326A/I332E/E333A(15)和2hS239D/K326A/E333A(16)具有相对于IgG1wt轻微增加的ADCC。构建体2h S267E/I332E(17)具有相对于IgG1wt减少的ADCC，但相对于IgG2wt和2h(4)增加的ADCC。所有三种构建体均具有相对于IgG2wt和2h(4)增加的CDC能力；然而，关于所有三种的CDC相对于IgG1wt均轻微减少。

实例6：有利突变的概述

下列十一种Fc变体显示提供抗体组合物，所述抗体组合物对能够在下铰链中切割IgG1的一种或多种蛋白酶有抗性，同时提供由野生型人IgG1显示的一种或多种效应子功能。符号2h命名具有E233P/L234V/L235A-G236缺失的IgG1。

表5：

构建体	缩写(#)
		IgG1 2h S239D/I332E	2h DE(5)
IgG1 2h F243L/R292P/Y300L	2h LPL(7)
		IgG1 2h H268F/S324T/I332E	2h FTE(8)
IgG1 2h S239D/H268F/S324T/I332E	2h DFTE(9)
		IgG1 2h S267E/H268F/S324T/I332E	2h EFTE(10)
IgG1 2h K326A/E333A	2h AA(11)
		IgG1 2h G237A/S239D/I332E	2h XDE(12)
IgG2S239D/I332E	IgG2DE(14)
		IgG1 2h K326A/I332E/E333A	2h AEA(15)
IgG1 2h S239D/K326A/E333A	2h DAA(16)
		IgG1 2h S267E/I332E	2h EE(17)

当足够的数据可获得时，当细胞杀死对于用作多种效应子功能的代理的体外测定法完全或接近完全时，计算EC50值。表6A和6B中所示的数据在相同条件下生成，除了供体PBMC来源不同外。因此，在每个实验中距离IgG1wt(1)的倍数变化用于标准化相对生物活性。

表6A：

表6B：

n/a＝不可用(不足够的结合曲线数据以测定EC50)，*达到的亚最大溶解。

n.d.＝无数据

倍数＝EC50IgG1wt/EC50构建体

使用下表7中列出的构建体，检查除了S239D/I332E和233PVA/236外在下铰链中的G237处的另外修饰对ADCC和ACDP的作用。测试G237A构建体且发现具有针对MMPs、IdeS和GluV8的抗性。在消化测定法中未评价其它构建体。这些数据指示Ala(A)和Ser(S)在237处是耐受的，但未增加Fc的细胞溶解活性超过由亲本分子2h DE(5)展示的那种。

表7：

构建体	ADCC	ADCP
			IgG1 2hDE	++++++	+++++
IgG1 2h ADE	++++++	++++
			IgG1 2hDDE	+	+
IgG1 2hPDE	++	+
			IgG1 2h QDE	+	+
IgG1 2h SDE	+++++	++

组合的对特定生理学相关蛋白酶的相对蛋白酶抗性(PR)和指示潜在效应子功能(ADCC、ADCP和CDC)的代理测定法的体外结果的概述显示于下表8中，其中具有组合的蛋白酶抗性和一种或多种可证实的效应子活性的那些构建体以白色表示。

表8：

同种型/构建体

PR MMPs

PRIdeS

PR Glu V8

ADCC

ADCP

CDC

IgG1wt(1)

-

+

+++++

IgG2wt(2)

+++++

-

+++++

-

++

-

IgG1 2hc(3)

+++++

-

+++++

+

++

n.d.

IgG1 2hc DE(13)

+++++

-

+++++

+

++

n.d.

IgG1 2h(4)

+++++

-

+++++

+

++

-

IgG1 2h DE(5)

+++++

++++

++

++++++

+++++

-

IgG1 2h LPL(7)

+++++

++++

++

++++++

+++++

-

IgG1 2h FTE(8)

+++++

++++

+++++

++++++

+++

-

IgG1 2h DFTE(9)

+++++

++++

++++++

+++++

-

IgG1 2h EFTE(10)

+++++

++++

+

++++

+++++

2h AA(11)

+++++

-

+++++

+++

++

+++++

2h ADE(12)

+++++

++++

++

++++++

++++

n.d.

IgG2DE(14)

+++++

+++

++

++++++

++++

n.d.

2h AEA(15)

++++

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2h DAA(16)

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2h EE(17)

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结果总结

本文呈现的Fc构建体的研究证实残基EU233-236由PVA/(蛋白酶显示在其中切割IgG1分子的位点)的替换产生对MMP-3、MMP-12和GluV8抗性的Fc；所述MMP-3、MMP-12和GluV8是在残基232和234之间切割的蛋白酶(图1)。当与这些替换组合时，产生对葡萄球菌属蛋白酶IdeS的抗性的另外修饰(不论替换的残基位置)包括在假定的切割位点(EU236-237)或更遥远的位置上的修饰。

单独的残基EU233-236由PVA/的替换(2h，构建体4)导致通过对于ADCC、ADCP和CDC描述的体外测定法可测量的细胞溶解功能的丧失。关于先前报道为增强一种或多种效应子功能的IgG1Fc修饰(表2)与下铰链PVA/替换的组合，出乎意料地恢复体外细胞溶解活性的一个或多个方面。因此，没有单一构建体是蛋白酶抗性的且对于所有三种效应子功能具有可测量的或增强的活性，如通过体外细胞杀死或关于ADCC、ADCP和CDC的细胞溶解测定法测量的。

1.八种构建体具有蛋白酶抗性和与IgG1wt相比较增强或可比较的ADCC：5、7、8、9、12、14、15和16。这些中的六种掺入I332E替换：包括IgG1 2h DE(5)、IgG1 2h FTE(8)、IgG1 2h DFTE(9)、IgG1 2h ADE(12)、IgG2DE(14)和IgG1 2h AEA(15)。

2.三种PR构建体具有与IgG1wt相比较相似的ADCP，包括IgG1 2hDE(5)、IgG1 2h LPL(7)和IgG1 2h DFTE(9)。三种构建体具有与IgG1wt相比较轻微减少的ADCP，包括IgG1 2h FTE(8)、IgG1 2h EFTE(10)、IgG1 2h ADE(12)和IgG2DE(14)。

3.五个PR突变恢复CDC能力，IgG1 2h AA(11)、IgG2h EFTE(10)、2h AEA(15)、2h DAA(16)和2h EE(17)。此外，所有五个均具有与IgG1wt相比较可检测但减少的ADCP。与IgG1wt(1)相比较，两种变体2h AEA(15)、2h DAA(16)也已增强ADCC。

当存在蛋白酶抗性铰链时，包含H268F/S324T突变的两种构建体(8和9)仍未恢复CDC。S267E突变(EFTE(10))恢复CDC但减少FcγRIIIa结合(也由Moore等人mAbs20102(2)：181.指出)。S267E突变增加对FcγRIIb的亲和力。

Claims

1. 一种与含IgG1野生型Fc的分子相比较对蛋白水解降解具有抗性的含修饰的Fc的分子，包含具有突变的IgG1恒定区的抗体Fc结构域，其中人IgG1的E233-L234-L235-G236序列被替换为具有G236缺失的P233-V234-A235，所述编号由EU编号所定义，并且所述含修饰的Fc的分子还包含来自野生型人IgG1序列的一种或多种替换，所述替换选自：S239D/I332E；K326A/E333A；E333A/K334A；H268F/S324T/I332E；F243L/R292P/Y300L；S239D/H268F/S324T/I332E；S267E/H268F/S324T/I332E；K326A/I332E/E333A；S239D/K326A/E333A；S267E/I332E；和G237X/S239D/I332E，其中X为A、D、P、Q或S。

2. 根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述含Fc的分子对蛋白酶的降解具有抗性，所述蛋白酶能够在残基222-237（EU编号）之间切割IgG1分子。

3. 根据权利要求2所述的含Fc的分子，其中与野生型IgG1相比较，所述含Fc的分子对MMP-3、MMP-7、MMP-12、MMP-13、HNE、纤溶酶、组织蛋白酶G、胃蛋白酶、来自化脓性链球菌（Strep. Pyrongenes）的免疫球蛋白降解酶（IdeS）、或来自金黄色葡萄球菌（Staph. aureus）的谷氨酰基内肽酶I（GluV8）的降解具有抗性。

4. 根据权利要求3所述的含Fc的分子，其中与野生型IgG1相比较，所述含Fc的分子对MMP-3、MMP-7、IdeS、或GluV8中的一种或多种的降解具有抗性。

5. 根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述含Fc的分子能够促进ADCP，所述ADCP在CD14 pos和/或CD11b pos血液单核细胞的存在下测量，其中所述分子包含选自SEQ ID NO: 8、10-15和17-20的序列。

6. 根据权利要求5所述的含Fc的分子，其中分子包含野生型IgG1的铰链结构域或包含SEQ ID NO: 3，所述野生型IgG1的铰链结构域被替换为具有G236缺失的P233-V234-A235，所述编号由EU编号所定义；其中另外I332E由EU编号系统所定义。

7. 根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述含Fc的分子能够促进ADCC，所述ADCC在血液单核细胞的存在下测量。

8. 根据权利要求7所述的含Fc的分子，其中分子包含野生型IgG1的铰链结构域或包含SEQ ID NO: 3，所述野生型IgG1的铰链结构域被替换为具有G236缺失的P233-V234-A235，所述编号由EU编号所定义；其中另外I332E由EU编号系统所定义。

9. 根据权利要求7所述的含Fc的分子，其中所述分子包含选自SEQ ID NO: 8和10-12、和15、17-20的序列。

10. 根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述含Fc的分子能够促进补体依赖性细胞毒性（CDC），所述CDC在补体的存在下通过细胞溶解测量。

11. 根据权利要求10所述的含Fc的分子，其中所述含Fc的分子包含选自SEQ ID NO: 13、14和18-20的序列。

12. 根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述含Fc的分子能够以与野生型IgG2 Fc结构域可比较或更大的亲和力结合Fcγ受体。

13. 根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述含Fc的分子能够以与野生型IgG1 Fc结构域可比较或更大的亲和力结合Fcγ受体。

14. 根据权利要求7所述的含Fc的分子，包含SEQ ID NO: 8。

15. 根据权利要求1-14中任一项所述的含Fc的分子，其中所述含Fc的分子为抗体或Fc融合蛋白。

16. 根据权利要求15所述的抗体，其中所述抗体结合到在肿瘤细胞、肿瘤基质、或肿瘤脉管系统上的抗原。

17. 根据权利要求16所述的抗体，其中所述抗体结合到CD20、ErbB1、ErbB2、ErbB3、VEGF、RON和组织因子中的一个。

18. 根据权利要求1所述的含Fc的分子，其中所述Fc结构域序列在EU编号系统中残基214至约残基340与野生型人IgG1具有至少90%的同一性。

19. 一种分离的结合分子，所述结合分子为包含下列的重组多肽：（i）能够结合在细胞上或与细胞结合的靶分子的结合结构域，和（ii）具有与人IgG1重链的CH2和CH3恒定结构域的全部或部分基本同源的氨基酸序列的Fc结构域，并且其中由EU编号系统所定义的残基214-238包含选自SEQ ID NO: 4和5的序列；其特征在于所述结合分子能够结合在靶细胞上的靶分子，并且所述分子产生可测量的补体依赖性溶解，或在必要的效应细胞类型的存在下细胞介导的靶细胞破坏。

20. 根据权利要求19所述的结合分子，其中所述Fc结构域还包含来自野生型人IgG1序列的一种或多种替换，所述替换选自：S239D/I332E；K326A/E333A；E333A/K334A；H268F/S324T/I332E；F243L/R292P/Y300L；S239D/H268F/S324T/I332E；S267E/H268F/S324T/I332E；K326A/I332E/E333A；S239D/K326A/E333A；S267E/I332E；和G237X/S239D/I332E，其中X为A、D、P、Q或S。

21. 根据权利要求19所述的结合分子，其中所述Fc结构域对蛋白酶的降解具有抗性，所述蛋白酶能够在残基222-237（EU编号）之间切割IgG1分子。

22. 根据权利要求21所述的含Fc的分子，其中与野生型IgG1相比较，所述含Fc的分子对MMP-3、MMP-7、MMP-12、MMP-13、HNE、纤溶酶、组织蛋白酶G、胃蛋白酶、IdeS、或GluV8的降解具有抗性。

23. 根据权利要求19所述的结合分子，其中所述结合结构域选自含有下列的结构域：抗体的互补位；酶；激素；受体；细胞因子；免疫细胞表面抗原；和粘附分子。

24. 根据权利要求23所述的结合分子，其中所述分子包含两个或更多个靶结合结构域并且显示出亲合力。

25. 根据权利要求24所述的结合分子，其中所述结合结构域包含抗体的互补位，所述抗体结合到在肿瘤细胞或肿瘤脉管系统上的抗原。

26. 根据权利要求25所述的结合分子，其中所述结合分子结合到CD20、ErbB1、ErbB2、ErbB3、VEGF、RON和组织因子中的一个。

27. 一种药物组合物，包含权利要求1或26的含Fc的分子。

28. 一种治疗特征在于不需要的细胞增殖或迁移的疾病的方法，包括给受试者或患者施用权利要求25的药物组合物。

29. 根据权利要求28所述的方法，其中所述疾病为恶性疾病、纤维化疾病或特征在于不需要的血管生成的疾病。

30. 根据权利要求29所述的方法，其中所述Fc包含单独地选自I332E或选自I332E与其它替换的组合的替换，所述其它替换例如S239D/I332E；S239D/H268F/I332E；S239D/H268F/S324T/I332E；S267E/H268F/S324T/I332E；G237X/S239D/I332E，其中X为A或S；K326A/E333A；和F243L/R292P/Y300L。

31. 根据权利要求29所述的方法，其中所述Fc包含单独地选自S239D或选自S239D与其它替换的组合的替换，所述其它替换例如S239D/I332E；S239D/H268F/I332E；S239D/H268F/S324T/I332E；S267E/H268F/S324T/I332E；G237X/S239D/I332E，其中X为A或S；K326A/E333A；和F243L/R292P/Y300L。

32. 一种治疗特征在于原核生物感染的疾病的方法，所述方法包括施用权利要求19的结合分子。

33. 根据权利要求31所述的方法，其中所述Fc对原核蛋白酶具有抗性并且能够具有CDC。

34. 根据权利要求31所述的方法，其中所述Fc结构域在约EU残基214至约残基330在铰链和CH2区中具有人IgG1的序列，其中至少残基233-237被替换为PVA/（G236缺失），并且还包含CH2结构域中的一种或多种替换，所述替换选自：K326A/E333A；S267E/H268F/S324T/I332E；K326A/I332E/E333A；S239D/K326A/E333A；和S267/I332E。

35. 根据权利要求31所述的方法，其中所述结合分子包含选自SEQ ID NO: 13、14和18-20的序列。