KR101900280B1 - 활성 프로테아제-저항성 항체 Fc 돌연변이체 - Google Patents

Abstract

모노클로널 항체 및 다른 Fc-함유 분자는 숙주 및 병원체-유도된 프로테아제에 대한 저항성의 증가를 야기하고, 기능 검정법에 의해 입증되는 바와 같이, Fcγ 수용체와 상호작용하고 보체 유도 세포독성을 개시하는 능력을 나타내는 Fc 영역 내의 개시된 변이를 사용하여 구축될 수 있다. Fc-함유 분자는 다양한 질환 및 장애의 치료에 유용하며, FcR-유도 숙주 기능은 활성을 제공한다.

Description

활성 프로테아제-저항성 항체 Fc 돌연변이체{ACTIVE PROTEASE-RESISTANT ANTIBODY Fc MUTANTS}

선출원

본 출원은 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 미국 특허 출원 제61/426,619호 (출원일: 2010년 12월 23일) 및 미국 특허 출원 제61/540,882호 (출원일: 2011년 9월 29일)에 대한 우선권을 주장한다.

본 발명은 내인성 및 병원체-유도 프로테아제에 대한 저항성을 부여하는 단백질 가수분해에 의한 절단 부위가 변경되도록 돌연변이되고, Fcγ 수용체에 특이적으로 결합하고 보체 캐스케이드 (cascade)의 Fc 수용체 매개의 교차-결합 또는 활성화에 의한 면역 세포에 의한 미토겐 반응을 활성화시키도록 추가로 변경된 인간 항체 IgG 불변 영역, 특히 Fc 영역에 관한 것이다. 신규한 서열은 치료 항체 조성물에 혼입될 수 있으며, 여기서, 단백질 가수분해 저항성 및 세포독성 이펙터 (effector) 작용성이 요망된다.

인간 항체의 IgG 아이소형은 하위유형 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4로 이루어지며, 각각은 힌지 영역에 의해 단일 Fc 도메인에 연결된 2개의 항원 결합 아암 (arm) (Fab)을 함유한다. 치료적 모노클로널 항체에서 나타난 우세한 하위분류인 IgG1은 17.6 내지 56.2일의 긴 순환 반감기를 갖는 안정한 분자로 여겨진다 (문헌[Salfeld, Nat Biotechnol 25(12):1369-72, 2007]). 그러나, IgG1은 침습적 암 (예를 들어, 매트릭스 메탈로프로테이나제) 및 병원성 미생물과 관련된 생리적으로 관련있는 다수의 프로테아제에 의해 힌지 영역에서 단백질 가수분해되기 쉽다. 중쇄 간의 이황화 결합 (코어 힌지) 위의 절단에 의해, 1가 Fab가 유리되고, 이황화 결합 아래의 양측 절단에 의해, 2가 구조, F(ab')₂ 단편이 유리된다. 몇몇 메탈로프로테이나제 및 2가지 박테리아 효소, 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus)의 글루타밀 엔도펩티다제 V8 (GluV8) 및 스트렙토코커스 피오게네스 (Streptococcus pyogenes)의 면역글로불린 분해 효소 (IdeS)는 하위 힌지에서 IgG1 상에 작용하며 (이황화 결합 아래 (도 1)), 궁극적으로 F(ab')₂ 및 Fc 단편을 생성한다 (문헌[Ryan et al., Mol Immunol 45(7):1837-46 2008]).

세포 표면 항원에 대해 유도된 치료적 모노클로널 항체 (mAb)의 효능이 표적 세포의 제거와 관련이 있는 경우, Fc 도메인에 의해 부여되는 항체 "이펙터 기능"은 항체의 전체 치료적 효과에 명백히 관련되며, 중요하다 (문헌[Bibeau et al., J Clin Oncol 27:1122-1129 2009]; 문헌[Cartron et al., Blood 99:754-758 2002]; 및 문헌[Musolino et al., J Clin Oncol 26:1789-1796 2008]). 면역 세포 상에서 발현되는 Fc 감마 수용체 (FcγR)와 상호작용하는 항체의 Fc 도메인뿐 아니라 보체와의 Fc 도메인 상호작용은 세포 표면 항원에 대하여 유도된 몇몇 모노클로널 항체 (mAb)의 작용에 기여하는 것으로 여겨진다. 이들 상호작용은 항체-의존성 세포 독성 (ADCC), 항체-의존성 세포의 식작용 (ADCP) 및 보체-의존성 세포독성 (CDC)에 의해 mAb 표적화된 세포의 제거를 야기할 수 있다.

최근에, IgG1의 중쇄 폴리펩티드 중 하나의 단일의 단백질 가수분해에 의한 절단이 사슬의 회합에 파괴적이지 않으며, 이에 따라 순환 항원 결합 능력에서 수명을 유지시키나; FcγR에 결합하는 IgG1의 능력의 소실을 야기하며, Fc-매개의 이펙터 기능을 유도하는 것으로 나타났다 (문헌[Brezski et al., Proc Natl Acad Sci USA 106:17864-17869 2009]). 치료적 모노클로널 항체의 단일 및 다중의 절단 둘 모두는 표적에 결합하나 몇몇 또는 모든 효능이 소실된 종을 야기할 수 있다. 따라서, 프로테아제-저항성이나, 이펙터 기능-증진된 Fc 플랫폼의 엔지니어링은 표적 세포 또는 조직의 파괴가 요망되는 다른 용도 중에, 항암 및 항감염 질환 치료제의 효능의 향상에 상당한 이점을 제공할 수 있다.

본 발명은 항체 또는 항체-유사 치료제의 엔지니어링에 유용한 변형된 면역글로불린 불변 도메인의 조성물을 제공한다. Fc 영역 및 표적화 세포 표면 리간드를 포함하는 치료제로서 사용되는 IgG 분류의 면역글로불린은 본 발명의 조성물을 사용하는 변형에 대한 특정 후보물질이다. 본 발명의 변형된 면역글로불린은 IgG의 항원 결합 도메인에 의해 표적화된 환경, 예를 들어, 암 세포 또는 종양 맥관구조 관련 항원을 포함하는 종양내 환경에서 단백질 가수분해 효소에 대하여 저항성이 있으나, 여전히 항체의 Fc 영역과 관련된 중요한 이펙터 기능을 보유한다.

본 발명에 따르면, 프로테아제-저항성을 부여하는 IgG1 Fc 영역 내에 돌연변이를 혼입함으로써 프로테아제-저항성 IgG1 모노클로널 항체를 생성하는 수단이 제공된다. 추가의 태양에서, Fc 영역 내의 원위 위치에서 추가의 아미노산 변화의 도입에 의해 이러한 돌연변이를 함유하는 IgG에 기능적 활성이 복원될 수 있다.

본 발명의 조성물은 IgG1의 하위 힌지에서 변경된 아미노산 잔기를 포함하는 프로테아제-저항성 IgG1 항체이며, 이 잔기는 FcγR의 Fc 참여에 수반될 뿐 아니라 생리학적으로 관련있는 단백질 가수분해에 의한 절단 부위로 동정된다. 일 태양에서, 인간 IgG1 하위분류의 잔기는 인간 IgG2의 해당하는 하위 힌지 잔기로 대체된다. 일 실시형태에서, 인간 IgG1의 E233-L234-L235-G236의 서열은 G236이 결실된 IgG2 P233-V234-A235로 대체된다 (EU 넘버링 (문헌[Edelman et al., Proc Natl Acad Sci USA 63:78-85 1969])). 다른 실시형태에서, IgG1 잔기 E233-L234-L235-G236-G237은 G236이 결실된 P233-V234-A235로 대체되며, G237은 A, D, P, Q 또는 S로부터 선택되는 아미노산으로 치환된다. 또 다른 실시형태에서, 잔기 214 내지 236에 해당하는 IgG1 불변 도메인 내의 모든 잔기, KVEPKSCDKT HTCPPCPAPEL LG (서열 번호 3)는 인간 IgG2 내의 해당하는 위치의 서열 또는 TVERKCCVEC PPCPAPPVA (서열 번호 4)로 대체된다.

제2 태양에서, FcγR 및/또는 보체를 참여시키는 본 발명의 프로테아제-저항성 IgG1 돌연변이체의 능력은 추가의 돌연변이를 혼입시킴으로써 복원될 수 있다. 따라서, 이러한 추가의 치환 없이, G236이 결실된 P233-V234-A235를 포함하는 프로테아제-저항성 힌지 영역을 포함하는 프로테아제-저항성 IgG1 돌연변이체 또는 잔기 214 내지 236의 모든 IgG1 불변 영역 서열이 IgG2로부터의 해당하는 서열 (서열 번호 4)로 대체되는 돌연변이체는 FcγR를 참여시키는 능력이 감소된다. FcR 및 C1q 참여와 관련된 이펙터 기능의 소실을 극복하기 위하여, 추가의 돌연변이가 비-힌지 불변 영역에 혼입되어, 변형된 IgG1 분자가 야생형 인간 IgG1에 비하여 FcγR을 참여시키는 측정가능한 또는 심지어는 증진된 능력을 보유하게 한다. 따라서, 본 발명의 일 실시형태에서, 프로테아제 저항성 IgG1은 EU 잔기 약 214 내지 잔기 약 330의 힌지 및 CH2 영역 내의 인간 IgG1의 서열을 갖는 Fc 도메인을 포함하는 분자를 포함하며, 적어도 잔기 233 내지 237은 PVA/ (G236 결실), 및 추가로 S239D/I332E; K326A/E333A; H268F/S324T/I332E; F243L/R292P/Y300L; S239D/H268F/S324T/I332E; S267E/H268F/S324T/I332E; E333A/K334A; G237A/S239D/I332E; 및 G237S/S239D/I332E; S298A/E333A/K334A; S239D/K326A/E333A 및 S267E/I332E로부터 선택되는 특정 치환으로 치환된다. 구체적 실시형태에서, 야생형 IgG1 불변 도메인 서열로부터 유도된 IgG 분자는 서열 번호 6을 포함한다. 다른 실시형태에서, 프로테아제-저항성 IgG는 S239D 및 I332E의 치환을 갖는 야생형 IgG2 불변 도메인으로부터 유도된다. 따라서, 이들 추가의 돌연변이의 포함은 프로테아제 저항성을 유지시키면서 Fc 기능을 가능하게 하며, 일부 경우에, 시험관내 FcγR-결합 검정법뿐 아니라 시험관내 세포 검정법, 예를 들어, 항체-의존성 세포 독성 (ADCC) 둘 모두에서, IgG1 야생형에 대하여 Fc-매개의 이펙터 기능을 향상시킨다. 본 발명의 Fc 도메인을 혼입시킨 이펙터 기능이 있는 프로테아제-저항성 모노클로널 항체는 항암 및 항미생물 치료제에 유용하며, IgG는 종양 성장 또는 감염의 부위에서의 증가된 국소 프로테아제 존재에 기인하여 절단된다.

다른 태양에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 그를 필요로 하는 포유류 대상체에 투여되는 치료 분자의 성분으로 사용된다. 조성물을 사용하는 하나의 방법에서, 그를 필요로 하는 대상체의 치료에 사용되는 리간드 결합 도메인 및 야생형 인간 IgG1 서열을 포함하는 항체를 변형시켜, G236이 결실된 프로테아제-저항성 힌지 서열 P233-V234-A235 및 필요에 따라, S239D/I332E; K326A/E333A; H268F/S324T/I332E; F243L/R292P/Y300L; K326A/I332E/E333A, S239D/K326A/E333A 및 S267E/I332E S239D/H268F/S324T/I332E; S267E/H268F/S324T/I332E; E333A/K334A; G237A/S239D/I332E; 및 G237S/S239D/I332E로부터 선택되는 이펙터 기능 복원 변형을 혼입시킨다. 일 실시형태에서, IgG1 Fc 돌연변이 조성물은 i) 항체 의존성 세포독성 (ADCC), ii) 보체 의존성 세포독성 (CDC), iii) 항체 의존성 세포 식작용 (ADCP), iv) FcR-매개의 세포 활성화 (예를 들어, FcR 교차-결합을 통한 사이토카인 분비) 및 v) FcR-매개의 혈소판 활성화/고갈과 같은 면역 및 이펙터 기능과 관련된 FcγR의 활성화가 조성물의 효능에 필수적인 용법 (indication)에서 사용된다. 일 태양에서, IgG1 Fc 돌연변이는 증식 장애의 세포, 예를 들어, 종양 세포; 종양 맥관구조 세포; 섬유아세포; 활성화된 B-세포 또는 T-세포, 또는 병원성 숙주 또는 비-숙주 유도 세포, 특히 박테리아 세포 상의 리간드를 표적화하는 다가 결합제의 Fc-융합 또는 치료적 항체로 혼입된다.

다른 실시형태에서, IgG1 Fc 돌연변이체는 약제학적 조성물을 구성한다. 다른 실시형태에서, IgG1 Fc 돌연변이체는 약제학적 활성 분자의 일부분을 구성한다. IgG1 Fc 돌연변이체 또는 활성 IgG1 Fc 돌연변이체-포함 분자를 포함하는 약제학적 조성물은 세포의 원치않거나 조절되지 않는 증식 또는 이동을 특징으로 하는 질환의 치료에 유용하다. 일 태양에서, 리간드 결합 도메인과 조합된 본 발명의 프로테아제-저항성 불변 도메인 조성물은 신체 구획으로의 투여 경로를 사용하여 그를 필요로 하는 대상체에게 투여되며, 신체 구획에서, 전신 전달 방법 또는 국소 전달 방법을 사용하여 IgG1 하위분류 분자를 분해시킬 수 있는 하나 이상의 프로테아제가 관찰된다.

<도 1>
도 1은 힌지 영역, FcγR 및 보체와의 상호작용에 중요한 영역, 및 맵핑된 프로테아제 절단 지점에서 관찰되는 아미노산 서열에 의해 동반되는 인간 IgG1 항체의 도시이다.
<도 2>
도 2는 각 잔기에 대한 해당하는 EU 넘버링을 보여주는 새로운 구축물 2h S239D/I332E (서열 번호 8) 및 2h E333A/K334A (서열 번호 9)와 정렬되는 야생형 인간 IgG1 (서열 번호 1) 및 IgG2 (서열 번호 2)의 불변 영역의 일부의 아미노산 서열의 정렬을 보여주며, 여기서, IgG1 및 IgG2 둘 모두의 힌지 영역은 새로운 구축물이 그러한 바와 같이, EU 잔기 226 및 229에서 시스테인 잔기를 포함한다.
<도 3a 및 3b>
도 3a 및 3b는 상이한 시점에 프로테아제 IdeS를 사용하는, 상이한 IgG 아이소형 (a) 및 도 2에 기재된 바와 같은 그의 새로운 구축물 (b)을 포함하는 항체의 분해 분석을 보여준다.
<도 4a 내지 4d>
도 4a 내지 4d는 24시간 인큐베이션 후에 IdeS (a), GluV8 (b), MMP-3 (c) 및 MMP-12 (d)를 갖는 IgG 구축물의 분해를 보여준다 (n=2).
<도 5a 내지 5g>
도 5a 내지 5g는 프로테아제-저항성 mAb 구축물 FcγRI (a), FcγRIIa (b 및 c), FcγRIIb (d 및 e), 및 FcγRIIIa (f 및 g)의 그룹에 대한 알파스크린 (AlphaScreen) (등록 상표) 분석으로부터의 FcγR-결합 결과를 보여주며, 여기서, 최대 신호%로부터의 감소는 비표지화 구축물이 결합으로부터 비오티닐화 IgG1과 경쟁하는 능력을 나타낸다 (n=2).
<도 6a 내지 6c>
도 6a 내지 6c는 프로테아제-저항성 mAb 구축물 및 야생형 IgG1 및 IgG2를 사용하여 수행되는 개별 ADCP 검정법으로부터의 그래프이며, 여기서, Y-축 상의 식작용%는 시료추출된 세포의 총 개수에 비한 것이다.
<도 7a 내지 7c>
도 7a 내지 7c는 프로테아제-저항성 mAb 구축물 및 야생형 IgG1 및 IgG2를 사용하여 수행되는 개별 ADCC 검정법으로부터의 그래프이며, 여기서, Y-축 상의 용해%는 세제에 의한 동일한 개수의 세포의 100% 용해에 비한 것이다 (n=2).
<도 8>
도 8은 프로테아제-저항성 mAb 구축물 및 야생형 IgG1 및 IgG2를 사용하여 수행되는 CDC 검정법으로부터의 그래프이며, 여기서, Y-축 상의 용해%는 세제에 의한 동일한 개수의 세포의 100% 용해에 비한 것이다 (n=2).

약어

ADCC = 항체 의존성 세포 독성; ADCP, 항체 의존성 세포 식작용; CDC = 보체 의존성 세포독성; FDCR = Fc 의존성 사이토카인 분비; FcγR 또는 FcgammaR = Fc 감마 수용체; GluV8 = 스타필로코커스 아우레우스의 글루타밀 엔도펩티다아제 V8; IdeS = 스트렙토코커스 피오게네스의 면역글로불린 분해 효소; IgG = 면역글로불린 G; ITAM = 면역수용체 티로신 기반의 활성화 모티프; ITIM = 면역수용체 티로신 기반의 억제 모티프; Mab = 모노클로널 항체; MMP = 매트릭스 메탈로프로테이나제; 용어 프로테아제는 프로테이나제와 동등하며, 상호교환가능하게 사용됨; PR = 프로테아제 저항성.

정의 및 & 용어의 설명

"항체-의존성 세포 독성", "항체-의존성 세포-매개의 세포독성" 또는 "ADCC"는 소정의 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 살해 (Natural Killer; NK) 세포, 호중구 및 대식세포) 상에 존재하는 Fc 수용체 (FcR)에 결합하는 분비된 Ig가 이들 세포독성 이펙터 세포가 항원-보유 표적 세포에 특이적으로 결합하여 후속적으로 표적 세포를 세포독소로 살해하는 것을 가능하게 하는 형태의 세포독성을 말한다. 표적 세포의 표면으로 유도된 리간드 특이적 고친화성 IgG 항체는 세포독성 세포를 자극하고 이러한 살해에 절대적으로 필요하다. 표적 세포의 용해는 세포외적인 것이며, 직접적인 세포-대-세포 접촉을 필요로 하고, 보체를 수반하지 않는다.

임의의 특정 항체가 ADCC에 의해 표적 세포의 용해를 매개하는 능력이 분석될 수 있다. ADCC 활성을 평가하기 위하여, 관심있는 항체는 면역 이펙터 세포와 조합된 표적 리간드를 디스플레이하는 표적 세포에 첨가되며, 이는 항원 항체 복합체에 의해 활성화되어 표적 세포의 세포용해를 야기할 수 있다. 일반적으로, 세포용해는 용해된 세포로부터의 표지 (예를 들어, 방사능 기질, 형광 염료 또는 천연 세포내 단백질)의 분비에 의해 검출된다. 이러한 분석에 유용한 이펙터 세포는 말초 혈액 단핵 세포 (peripheral blood mononuclear cell; PBMC) 및 자연 살해 (NK) 세포를 포함한다. 시험관 내 ADCC 분석법의 구체적인 예가 문헌[Wisecarver et al, 1985, 19:211]; 문헌[Bruggemann et al, 1987, J Exp Med 166:1351]; 문헌[Wilkinson et al, 2001, J Immunol Methods 258:183]; 문헌[Patel et al, 1995 J Immunol Methods 184:29] (이들 각각은 참고로 포함됨)에 기재되어 있다. 대안적으로 또는 부가적으로, 대상 항체의 ADCC 활성은 생체 내에서, 예를 들어, 동물 모델에서 예컨대, 문헌[Clynes et al, 1998, PNAS USA 95:652]에 개시된 것에서 평가될 수 있으며, 상기 문헌의 내용은 그 전문이 참고로 포함된다. 이펙터 세포가 대체로 식작용을 통해 작용하는 경우, 상기 과정은 항체 의존성 세포의 식작용 (ADCP)으로 기재될 수 있다.

"보체 유도 세포독성 (Complement-directed cytotoxicity)" 또는 CDC는 보체 캐스케이드 (cascade)가 항체 Fc로의 보체 성분 C1q의 결합에 의해 활성화되는 형태의 세포독성을 말한다.

용어 "이펙터 기능"은 Fc와, 면역 세포 상에서 발현되는 Fc 감마 수용체 (FcγR)의 상호작용뿐 아니라, 이펙터 세포 및 보체 성분에 의한 용해 과정 또는 식작용에 의하여 항원-발현 세포의 제거를 야기하는 보체와 Fc 도메인의 상호작용을 포함한다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "Fc", "Fc-함유 단백질" 또는 "Fc-함유 분자"는 적어도 면역글로불린 CH2 및 CH3 도메인을 갖는 모노머, 다이머 또는 헤테로다이머 단백질을 말한다. CH2 및 CH3 도메인은 단백질/분자 (예를 들어, 항체)의 다이머 영역의 적어도 일부분을 형성할 수 있다.

본 명세서에 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 동물 항체의 적어도 하나의 종의 중쇄 또는 경쇄 항체 가변 도메인의 적어도 하나를 함유하거나, 이에 대하여 상당한 상동성을 보유하는 적어도 하나의 리간드 결합 도메인을 포함하는 Fc-함유 단백질의 특정한 형태이다.

야생형 인간 IgG 하위분류 불변 서열은 온라인에서 P01857 (IgG1), P01859 (IgG2), P01860 (IgG3) 및 P01861 (IgG4)로 이용가능한 UniProt 데이터베이스에 카탈로그화되어 있다. 본 명세서에서 사용되는 "야생형 인간 IgG1 Fc 영역"은 서열 번호 1의 아미노산 서열 또는 그의 단편을 포함하는 인간 IgG Fc 영역을 말하며, 이는 카바트 (Kabat)의 EU 넘버링에 따르면 인간 IgG 중쇄의 잔기 K214 내지 잔기 K447이다. 불변 영역 내의 아미노산은 인간 IgG1 항체, EU와의 정렬에 의해 넘버링된다 (문헌[Cunningham et al., 1970Biochemistry., 9: 3161-70] 참조). 즉, 항체의 중쇄 및 경쇄는 아미노산 서열 동일성이 최대화되도록 EU의 중쇄 및 경쇄와 정렬되며, 항체에서의 각각의 아미노산은 EU에서의 상응하는 아미노산과 동일한 번호를 할당받는다. EU 넘버링 시스템은 당업계에서 통상적으로 사용된다 (일반적으로, 문헌[Kabat et al, Sequences of Protein of Immunological Interest, NIH Publication No. 91-3242, US Department of Health and Human Services (1991)] 참조). 협약에 따르면, 야생형 IgG2 불변 영역과 EU의 것의 정렬은 위치 221 내지 223 및 236 (도 2, 서열 번호 2)에서 비어 있는 아미노산을 야기한다.

포유류 IgG 중쇄의 불변 도메인 서열은 서열에서 CH1-힌지-CH2-CH3으로 지정된다. IgG의 "힌지", "힌지 영역" 또는 "힌지 도메인"은 일반적으로 카바트 시스템에 따라 Glu216을 포함하며 인간 IgG1의 Pro230에서 종결되는 것으로 정의되나, 작용적으로, 사슬의 가요성 부분은 상위 및 하위 힌지 영역으로 명명된 추가의 잔기, 예를 들어, Glu216 내지 Gly237을 포함하는 것으로 고려될 수 있으며 (문헌[Roux et al. J. Immunol. 1998, 161:4083]), 하위 힌지는 FcgammaR 결합이 일반적으로 귀속되는 Fc 영역의 잔기 233 내지 239로 지칭된다. 다른 IgG 아이소형의 힌지 영역은 중쇄간 S-S 결합을 형성하는 처음의 시스테인 잔기 및 마지막 시스테인 잔기를 대체함으로써 IgG1 서열과 정렬될 수 있다. 비록 카바트 시스템에 따라 넘버링됨에 따라 경계가 약간 달라질 수 있지만, CH1 도메인은 VH 도메인에 인접하며, 면역글로불린 중쇄 분자의 힌지 영역에 대하여 아미노 말단이고, 면역글로불린 중쇄의 제1 (가장 아미노 말단인) 불변 영역 도메인, 예를 들어, EU 위치 약 118 내지 215를 포함한다. Fc 도메인은 아미노산 231로부터 아미노산 447로 연장되며; CH2 도메인은 약 Ala231 내지 Lys340 또는 Gly341이며, CH3은 약 Gly341 또는 Gln342 내지 Lys447이다. CH1 영역의 IgG 중쇄 불변 영역의 잔기는 Lys에서 종결된다.

용어 "프로테아제 저항성"은 펩티드 결합으로 이루어진 분자가 단백질 가수분해 효소의 존재 하에서 그의 펩티드 결합 중 하나 이상의 가수분해에 의한 절단에 저항하는 능력을 말한다. 단백질 가수분해 효소에 대한 저항성은 상대적인 특성이며, 특정 기간에 걸쳐 그리고 절단 저항성이 시험되는 pH 및/또는 온도를 포함하는 특정 조건 하에서, 그의 펩티드 결합 중 하나 이상의 가수분해에 의한 절단을 더 적게 견딜 수 있는 분자와 비교된다. 절단이 발생하는 것을 나타내는 단백질 가수분해에 의한 절단의 하나의 결과는 무손상, 비-절단된 모 분자의 분자량에 비하여 더 작은 단편 (더 낮은 분자량)의 생성이다.

용어 "치료적 유효량"은 대상체에서 질환 또는 장애를 치료하기 위한 항체, 항체 단편 또는 유도체일 수 있는 Fc-도메인을 포함하는 본 명세서에 기재되는 바와 같은 치료제의 양을 말한다.

개관

본 발명은 동소에서 단백질 가수분해에 대한 저항성이 향상되고, 사이토카인 분비를 야기하거나 표적 항원 디스플레이 세포 및 표적화 세포를 둘러싸고 있는 조직을 손상시키거나 또는 살해하는 능력이 유지되는 치료 항체, Fc-융합 및 유사 바이오의약품의 제조에서 사용하기 위한 Fc 도메인을 동정하는데 있어서의 관심에 의해 동기가 부여되었다.

프로테아제는 촉매 부위의 구조 및 그의 활성에 필수적인 아미노산 (구성요소 중 하나로서)에 따라 5개의 주요 그룹으로 나뉜다: 세린 프로테이나제, 트레오닌 프로테이나제, 시스테인 (티올) 프로테이나제, 아스파르트산 프로테이나제 및 메탈로프로테이나제.

다양한 세포외 프로테아제는 신체 도처에서와, 중요한 조절 및 대사 과정을 수행하는 신체 구획에서 기능한다. 위로 분비되는 산-저항성 프로테아제 (예를 들어, 펩신) 및 십이지장에 존재하는 세린 프로테아제 (트립신 및 키모트립신)는 위장관 내에서 음식물 단백질의 분해를 가능하게 하며; 혈액 또는 혈청에 존재하는 프로테아제 (트롬빈, 플라스민, 하게만 (Hageman) 인자 등)는 혈액-응고뿐 아니라 응괴 (clot)의 용해 및 면역계의 세포의 조절에서 중요한 역할을 수행한다. 프로테아제는 백혈구에 존재하거나 그로부터 분비된다 (엘라스타제 (elastase), 카텝신 G). 프로테아제는 다른 단백질의 수명을 결정하며, 이에 따라 중요한 대사 역할을 수행한다. 호르몬, 인터류킨 또는 케모카인과 달리, 단백질 발현 기작에서의 변경 또는 세포내 신호전달이 필요하지 않으며, 이는 단백질 가수분해에 의한 조절이 가장 빠른 조절 전환 메카니즘 중 하나이게 한다. 추가로, 캐스케이드 반응에서와 같은 프로테아제의 협동 작용은 생리적 신호에 대한 유기체의 반응의 신속하고 효율적인 증폭을 야기한다.

인간 IgG 아이소형 (성숙 감마 글로불린 분류 G 항체의 하위분류; IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)은 면역 기능을 동원하는 상이한 능력을 나타낸다. 예를 들어, 항체-의존성 세포 독성 (ADCC)은 IgG1 및 IgG3에 의해 촉진되며, 항체-의존성 세포의 식작용 (ADCP)은 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4에 의해 촉진되고, 보체 의존성 세포독성 (CDC)은 IgG1 및 IgG3에 의해 촉진된다. 이러한 면역 기능의 아이소형-특이적 참여는 별개의 면역 세포 상의 Fc 수용체에 대한 선택성 및 C1q에 결합하여 막 공격 복합체 (membrane attack complex; MAC)의 어셈블리 (assembly)를 활성화시키는 능력을 기반으로 한다. 다양한 아이소형 중에, IgG1 및 IgG3에 대하여 FcγRI, FcγRIIa/b/c 및 FcγRIIIa/b를 포함하는 Fcγ 수용체에 대한 상대적 친화성이 높다. 그러나, IgG2에 대한 Fcγ 친화성은 FcγRIIa H131 다형성을 제외하고 상당히 더 낮으며, 오직 IgG4만이 FcγRI에 대하여 측정가능한 친화성을 갖는다. 비교에 의한 서열 분석 및 공동-결정 구조를 사용하여, 수용체 결합을 위한 주요 접촉 잔기를 하위 힌지 및 CH2 영역을 스패닝하는 아미노산 잔기로 맵핑하였다 (문헌[ (Hezereh et al., J Virol 75:12161-12168 2001]; 문헌[Shields et al., J Biol Chem 276:6591-6604 2001]).

많은 이전의 연구에 의해, IgG2의 하위 힌지의 잔기 (EU 위치 233 내지 235)에서의 치환이 FcγR-매개의 기능 및 보체 활성화를 없애는 것으로 결론지어졌다. 하나의 보고에서, IgG1의 하위 힌지에서 G236이 결실된 E233P-L234V-L235A의 치환은 Fc-매개의 이펙터 기능이 소실되는 것으로 보이는 인간 IgG1의 Fc 구축물의 패널 중 하나였다(문헌[Armour et al., 1999 Eur J Immunol 29:2613-2624]). 이러한 정보에 의해, IgG1의 힌지 내의 또는 그 근처의 잔기를 해당하는 IgG2 잔기로 대체하여, FcγR로의 결합에 대한 친화성의 엄청난 소실 및 보체 고정 및 세포 사멸에 영향을 미치는 능력의 소실이 야기됨이 시사된다.

두번째로, 몇몇 동일한 잔기 위치는 프로테아제가 인간 IgG1 및 IgG2의 정렬에 의해 나타난 바와 같이 (도 2), 단백질 가수분해 저항성이 더 큰 IgG2 서열에서 상이한 아미노산에 의해 점유되는 IgG1 (도 1) 서열을 절단하는 위치이다. 본 발명자들은 이러한 정보를 프로테아제-저항성이나 이펙터-기능이 유능한 IgG-Fc를 설계하기 위한 출발점으로 사용하였다.

본 발명은 프로테아제-저항성 및 작용성 (FcgR-참여) Fc 도메인을 예기치 않게 제공하는 IgG1 불변 영역 (Fc)의 다수의 위치의 초회의 치환에 대한 입증이다. 해당 분야에 인식되는 바와 같이, 일단 특정 아미노산 서열을 갖는 Fc-도메인의 특성이 알려지면, 정보를 기존의 항체 엔지니어링 또는 Fc-폴리펩티드 융합의 구축 또는 변형에 적용할 수 있다. 본 발명의 조성물에 의해 부여되는 프로테아제-저항성은 예를 들어, 상응하는 IgG2 잔기로부터 유래된 대안의 아미노산에 의해 치환되는 IgG1 힌지 영역의 잔기에서 절단하는 프로테아제, 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스로부터의 MMP-3, MMP-7, MMP-12, HNE, 플라스민, 카텝신 G, 펩신, IdeS 또는 글루타밀 엔도펩티다제 I을 포함한다 (도 1) (상기 문헌[Ryan et al. 2008 ]).

다중 치환된 IgG1 돌연변이체는 인간 FcR (알파스크린 (등록 상표) 경쟁 분석법에 의해 평가되는 FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb, FcγRIIIa)에 대한 그의 상대적인 친화성을 바탕으로 하여 선택되었다. 이들 돌연변이체는 적절한 세포계에서 PBMC에 의하여 ADCC를 유도하고 시험관 내 분화된 대식 세포에 의하여 ADCP를 유도하는 그들의 능력에 대하여 추가로 시험하였다. 본 명세서에 제공된 실험 데이터에서, 특정 돌연변이 (표 2)가 도입된 IgG1은 Fc 증진 돌연변이가 있는 IgG1으로부터 유래되는 엔지니어링된 프로테아제-저항성 mAb였다.

EU 넘버링 시스템에서 IgG1 힌지 영역 잔기 214 내지 237 (서열 번호 3)에 대한 대안의 조성물을 완전한 IgG2 서열 (서열 번호 4) 힌지 또는 오직 잔기 233 내지 235만이 표 1에 나타낸 바와 같이 변경된 키메라 힌지 (서열 번호 5) 중 어느 하나의 교체를 포함하는 프로테아제-저항성을 부여하는 야생형 (wt) 인간 IgG1 (서열 번호 1)을 사용하여 제조하였다.

[표 1]

이펙터 기능 증진 영역에서의 보상 돌연변이는 하기의 표 2에 나타낸 바와 같이 이전에 기재된 치환으로부터 선택될 수 있다.

[표 2]

Fc 기능이 증가된 구축물은 이전에 하기의 문헌에 의해 기재되어 있다:

1. 문헌[Lazar, Proc Natl Acad Sci USA 103:4005-4010 (2006)]

2. 문헌[Idusogie, J Immunol 166:2571-2575 (2001)]

3. 문헌[Stavenhagen, Cancer Res 67(18):8882-90 (2007)]

4. 문헌[Moore, et al. MAbs 2(2):181-189 (2010)]

5. 문헌[Shields et al., J Biol Chem 276:6591-6604 (2001)].

시험관 내 검정법에 기초하여, Fc-기능의 다양한 척도를 사용하여, 완전한 IgG 구조 (H2L2)에 혼입되는 경우, 하위 힌지 영역 (EU232 내지 237)에서 작용하는 하나 이상의 프로테아제에 대하여 저항성을 제공하는 한편, FcγR에 결합하거나 세포용해를 증진시키는 능력을 갖는 몇몇 프로테아제-저항성 Fc 서열이 동정되었다. 수용체 친화성 및 시험관 내 생활성에 의해 카테고리화된, 힌지뿐 아니라 CH2 영역에서 변화를 포함하는 선택된 구축물의 Fc-관련 활성의 변화는 표 3에 나타나 있다.

[표 3]

변경된 Fc -함유 분자의 제조 방법

천연 항체 Fc의 구조적 특징, 안정성 유지, FcR 결합의 보유 및 보체 캐스케이드, 세포 용해, 세포 식작용 또는 사이토카인 분비의 자극 능력을 갖는 조성물을 생성하고자 함에 기초하여 치환 부위를 선택하였다. 단백질, 특히 아미노산이 변경되거나 돌연변이된 긴 폴리펩티드 쇄 멀티머는 모 서열을 암호화하는 발현 벡터 내의 핵산의 변형에 의해 통상적으로 생성되어, 요망되는 아미노산에 대하여 해당하는 유전자 코돈을 변경시킨다. 유전자 코드 및 이러한 방법은 해당 분야에 널리 공지되어 있다. 키메라 서열, 예를 들어, IgG1의 부분 및 IgG2의 부분을 포함하는 본 발명의 Fc가 생성되는 경우, 각 암호화 핵산의 더 큰 세그먼트는 함께 스플라이싱되거나, 세그먼트가 표준 클로닝 기법에 의해 대체될 수 있다.

단백질 가수분해 시험

하나의 Fc-함유 조성물 또는 항체가 다른 것보다 또는 야생형 조성물보다 단백질 가수분해 저항성이 더 큰 지의 여부를 결정하기 위하여, 단백질 가수분해 효소가 상이한 단리된 Fc-함유 조성물 또는 항체를 분해하는 비율 또는 정도가 평가된다. 소정의 기간 후에, 분해는 직접적으로 쇄의 절단, 예를 들어, 독특한 절단 부위 구조의 형성 또는 새로이 형성된 단편의 측정 중 어느 하나를 결정할 수 있는 방법을 사용하여 상이한 조성물에 대해 측정된다. 대안적으로, 절단이 활성의 소실을 야기하는 경우, 결합 검정법을 포함하는 기능 검정법이 수행될 수 있다.

IgG1의 단백질 가수분해에 의한 절단은 다이머 헤테로다이머 구조의 4개의 폴리펩티드 쇄 중 임의의 것에서 발생할 수 있다. IgG의 절단은 널리 특성화되어 있는 단편, 예를 들어, Fab, (Fab )₂ 및 비슷하나 독특한 분자량의 Fc 단편의 생성으로 이어진다. 단백질 가수분해 실험 동안 생성되는 이러한 단편의 분리는 크기 배제 크로마토그래피 (SEC)를 사용하여, 겔 전기영동에 의해, (WO2007024743A2호, WO2009045894A1호)에 이전에 기재된 바와 같이 PNGase F (펩티드 N-글리코시다제 F)를 사용한 탈글리코실화 (deglycosylation) 후의 MALDI-TOF-MS (matrix-assisted laser/desorption ionization time- of-flight mass spectrometry) 분석에 의해 달성될 수 있다.

따라서, 단백질 가수분해에 의한 절단에 저항성이 있는 Fc-함유 조성물에 대한 참조가 의미하는 것은 조성물이 가수분해 효소에 대한 노출 시에, 비교 분자, 예를 들어, 야생형 인간 IgG1보다 덜 분해될 것 같으며, 활성이 덜 소실될 것 같고, Fc-결합 파트너, 예를 들어, FcR에 대한 친화성이 덜 소실될 것 같다는 것이다.

돌연변이체의 생물학적 특성화

Fc-함유 단백질은 몇몇의 잘 알려진 시험관 내 검정법에 의해 기능에 대하여 비교될 수 있다. 특히, Fcγ 수용체의 FcγRI, FcγRII, 및 FcγRIII 패밀리의 구성원에 대한 친화성이 관심있다. 이들 측정은 재조합 용해성 형태의 수용체 또는 세포-회합된 형태의 수용체를 이용하여 행해질 수 있다. 게다가 IgG의 장기간 순환 반감기에 책임이 있는 수용체인 FcRn에 대한 친화성은 예를 들어 재조합 용해성 FcRn을 이용한 "알파스크린"과 같은 리간드 결합 비드 포맷을 이용하여 측정될 수 있다. 높은 처리량의 스크리닝에 사용되는 알파스크린 (등록 상표)은 결합과 같은 분자적 사건의 검출을 허용하는 균질적 검정 기술이다. 코팅된 "공여자 (donor)" 및 "수용자 (acceptor)" 비드는 알파스크린 (등록 상표) 검정법 기술의 기초이다. 비드 기반 분석법으로서, 알파스크린 (등록 상표)은 서로 근접하게 되는 비드들의 상호 작용을 통하여 작동하며, 이는 크게 증폭된 신호를 생성하는 작용을 하는 화학 반응의 캐스케이드로 이어진다. 직접적인 또는 간접적인, 예를 들어 경쟁적인 결합의 측정은 단백질들 중에서 상대적인 친화성 및 친화력을 평가하는 데 적용될 수 있다.

인간 IgG 아이소형 (예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4)의 자연의 진화가 존재하며, 각각은 면역 기능, 예를 들어 항체 의존성 세포 독성 (ADCC, 예를 들어 IgG1 및 IgG3), 항체 의존성 세포 식작용 (ADCP, 예를 들어 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4), 및 보체 의존성 세포독성 (CDC, 예를 들어 IgG1, IgG3)을 동원하는 상이한 스펙트럼의 능력을 나타낸다. 이들 기능의 아이소형-특이적 참여는 별개의 면역 세포 상에 존재하는 Fc 수용체에 대한 차등적인 선택성과, C1q에 결합하고 막 공격 복합체 (MAC)의 어셈블리를 활성화시키는 능력을 기반으로 하는데, 이는 이펙터 대식세포 상의 특정 수용체 결합 보체 성분을 통한 CDC 및 CDP (보체 의존성 식작용)로 이어진다. 인간 아이소형의, 보체 캐스케이드의 처음 성분, C1q에 결합하는 능력의 계급은, 미생물 감염에 있어서 IgG2 및 IgG4에 의한 보체 활성화가 잘 입증되어 있기는 하지만, IgG1>IgG3>IgG2>IgG4 이다.

세포 기반의 기능 검정법, 예를 들어 ADCC 검정법 및 CDC 검정법은 특정 구축물 구조의 가능한 기능적 결과로의 통찰을 제공한다. 항체 의존성 세포 매개 세포독성 (ADCC)은 Fc 수용체 (FcR)를 발현하는 비특이적 세포독성 세포 (예를 들어, 자연 살해 (NK) 세포, 호중구 및 대식세포)가 표적 세포 상의 결합된 항체를 인식하고 후속적으로 표적 세포의 용해를 야기하는 세포-매개의 반응이다. 일 실시형태에서, ADCC 검정법은 일차 이펙터 세포로서 NK 세포를 갖도록 구성되며, 이는 이들 세포에 의해 발현되는 것으로 공지된 유일한 활성화 Fcγ형 수용체인 FcγRIIIa에 대한 기능적 영향을 반영한다.

또한 식작용 검정법을 이용하여 상이한 돌연변이체들의 면역 이펙터 기능을 비교할 수 있으며, 이는 세포 반응, 예를 들어 수퍼옥사이드 (superoxide) 또는 염증 매개자 분비를 측정하는 검정법이 그러할 수 있는 바와 같다. 예를 들어, 마우스에서 T 세포 활성화, 즉, 특정 리간드를 참여시키는 Fc 도메인, 예를 들어, Fcγ 수용체에 의존적인 활성을 측정하기 위하여 항-CD3 항체의 돌연변이체를 사용하는 경우에, 생체 내 모델이 사용될 수 있다. 대식세포의 항체 유도 활성화는 항체 의존성 세포 식작용 (ADCP)을 매개하며, 이는 옵소닌화된 표적 세포가 대식세포에 의해 휩싸여져서 소화되게 한다. 시험관 내에서, 높은 수준의 FcR을 발현하는 분화된 대식세포는 INFγ 또는 GM-CSF를 이용하여 단핵구에 비하여 상승된 수준의 모든 FcR (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIIa)이 발현되게 M1 표현형으로 분화될 수 있다.

항체 돌연변이체의 생성

본 발명의 조성물은 엔지니어링된 숙주 세포에 의해 가장 통상적으로 생성되는 복합 단백질이다. 본 명세서에 기재된 바와 같이, 재조합 Fc-함유 단백질 또는 모노클로널 항체의 발현용으로 선택된 숙주 세포는 제한 없이 면역글로불린 CH2 도메인에서 단백질을 장식하는 올리고당 부분 (moiety)의 조성에서의 변이를 비롯하여 최종 조성에의 중요한 기여자이다. 따라서, 본 발명의 일 태양은 원하는 치료 단백질을 발현하는 생성 세포로서의 사용을 위한 또는 그의 개발을 위한 본 발명의 Fc-함유 구축물을 암호화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 적절한 숙주 세포의 선택을 포함한다.

또한, 숙주 세포는 포유류 기원의 것일 수 있거나, 또는 COS-1, COS-7, HEK293, BHK21, CHO, BSC-1, Hep G2, 653, SP2/0, 293, HeLa, 골수종, 림프종, 효모, 곤충 또는 식물 세포, 또는 이들의 임의의 유도체, 불멸화 또는 형질전환 세포로부터 선택될 수 있다.

대안적으로, 숙주 세포는 폴리펩티드를 글리코실화할 수 없는 종 또는 유기체, 예를 들어 원핵 세포 또는 유기체, 예를 들어 천연 또는 엔지니어링된 이. 콜라이 (E. coli) 종, 클레브시엘라 (Klebsiella) 종, 또는 슈도모나스 (Pseudomonas) 종, 엔지니어링된 식물 또는 곤충 세포로부터 선택될 수 있다.

또한, IgG 중쇄 내의 자연 발생 글리코실화 부위 (N297, EU 넘버링)에서의 글리코실화는 FcγR에 대한 Fc-결합 친화성에 기여한다. 불변 영역이 아이소형에 따라 달라지기 때문에, 각 아이소형은 독특한 N-결합 탄수화물 구조의 어레이를 가지며, 이는 단백질 어셈블리, 분비 또는 기능적 활성에 다양하게 영향을 미친다 (문헌[Wright, A., and Morrison, S. L., Trends Biotech. 15:26-32 (1997)]). 부착된 N-결합 탄수화물의 구조는 처리의 정도에 따라 상당이 달라지며, 고-만노스, 다중-분지형뿐 아니라 양분형 (biantennary) 복합 올리고당 및 말단 당으로서 시알산 (N-아세틸 뉴라민산 또는 NANA), 푸코스, 갈락토스 및 GlcNAc N-아세틸 글루코사민) 잔기를 포함할 수 있다. 숙주 세포의 이펙터 기능 및 항체의 올리고당 함량에 대한 영향이 인식되었다 (문헌[Lifely, M. R., et al., 1995 Glycobiology 5:813-822]; 문헌[Jefferis, R., et al., 1998 Immunol Rev. 163:59-76]; 문헌[Wright, A. and Morrison, S. L., supra]; 문헌[Presta L. 2003. Curr Opin Struct Biol. 13(4):519-25)]). 추가로, 항체 내의 당 쇄에 관하여, 항체의 N-글리코시드-결합 당 쇄 내의 환원 말단에서 인접한 N-아세틸글루코사민에서 푸코스의 부가 또는 변형이 항체의 ADCC 활성을 유의미하게 변화시키는 것으로 보고되었다 (WO00/61739호).

추가로, 양분형 올리고당의 갈락토실화의 상대적 분포, 양분성 (bisecting) GlcNac의 존재 및 푸코실화 (fucosylation)는 비-푸코실화된 Mab가 시험관 내 및 생체 내에서 측정시 N-결합 양분형 올리고당 구조에 대한 다른 변형보다 더 크게 ADCC를 증가시키는 능력을 보이는 것을 나타낸다 (문헌[Shields, et al. 2002. J Biol Chem. 277:26733-40]; 문헌[Niwa, et al. 2004. Cancer Res. 64:2127-2133]).

예를 들어, 푸코스 함량이 낮은 mAb를 생성할 수 있거나, 그를 생성하도록 엔지니어링되거나 (특정 효소의 낙-아웃 또는 낙 다운에 의해서와 같이, 문헌[Shinkawa, et al. 2003 J. Biol. Chem., 278: 3466-3473]; EP1176195A1호), 그를 생성하도록 예를 들어, 환경 또는 영양의 조작에 의해 유도되는 숙주 세포를 사용하는 본 발명의 프로테아제-저항성 mAb의 발현 또는 제조가 본 발명의 범주 내에 있다.

항체, Fc 및 Fc-융합 단백질

항체 결합 도메인 또는 그의 단편은 당업자에게 공지되어 있는 방법을 사용하여 생성될 수 있으며, 본 명세서에 제공된 정보와 함께, 임의의 포유류, 예를 들어, 비제한적으로, 인간, 마우스, 토끼, 랫트, 설치류, 영장류, 염소 또는 그들의 임의의 조합으로부터의 서열을 포함하거나 그들로부터 유래될 수 있다. 이러한 항체는 본 발명의 항체 구축물을 생성하는데 유용한 결합 도메인의 성분 및 기본 구조를 제공할 수 있다. 일 태양에서, 항체 결합 도메인은 마우스 또는 기타 동물을 표적 펩티드, 세포 또는 조직 추출물로 면역화함으로써 제조되는 하이브리도마로부터 얻어진다. 항체는 당업계에 널리 알려져 있는 임의의 하이브리도마 기술 (예를 들어, 본 명세서에 전문이 참고로 포함되는 문헌[Harlow and Lane, antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY (1989)] 참조)을 사용하여 또는 항체 생성 림프구의 선택 및 당업계에 공지되어 있는 기술을 사용하는 결합 도메인을 암호화하는 핵산 서열의 클로닝에 의해 수득될 수 있다.

본 발명은 인간 IgG의 불변 영역에 관한 것이다. 따라서, 최종 조성물이 시험관 내 검정법에서 단백질 가수분해-저항성 (본 명세서에 기재된 바와 같은) 및 FcgR에 결합하고 ADCC, ADCP 및/또는 CDC를 증진시키는 능력 둘 모두를 나타내는 것이 바람직한 인간 Fc 도메인을 포함하는 임의의 항체 또는 융합 단백질이 본 발명에 포함된다. 항체 Fv 또는 단일 가변 도메인을 포함하나 이들에 한정되지 않는 표적화 부분이 필요에 따라 Fc-조성물에 융합될 수 있다. "Fv"는 단단한 비공유적 회합의, 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역 도메인의 다이머로 이루어진다. 이들 2개의 도메인이 폴딩되어 6개의 초가변 루프 (H 쇄 및 L 쇄로부터 각각 3개의 루프)가 형성되는데, 상기 루프는 항원 결합을 위한 아미노산 잔기를 제공하고, 항체에 항원 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 심지어 단일 가변 도메인 (또는 항원에 특이적인 오직 3개의 CDR만을 포함하는 Fv의 절반)은 전체 결합 부위보다 종종 친화성이 낮지만 항원을 인식하고 항원에 결합하는 능력을 갖는다. "sFv" 또는 "scFv"로도 약칭되는 "단쇄 Fv"는 단일 폴리펩티드 쇄로 연결된 VH 및 VL 항체 도메인을 포함하는 항체 단편이다. scFv 폴리펩티드는 일반적으로, VH와 VL 사이에 폴리펩티드 링커를 포함한다. 또한, 표적화 부분은 항체의 파라토프 (CDR 또는 가변 도메인 구조에 제한되지 않는 결합 잔기); 효소; 호르몬; 수용체; 사이토카인; 면역 세포 표면 항원; 및 구축물이 재조합 방법에 의해 전체가 생성되는 경우 부착 분자로부터 선택될 수 있다. 또한, 표적화 부분은 비-단백질 성질의 것, 예를 들어, 탄수화물, 지질, 지질다당류, 유기 분자 또는 금속 또는 금속 복합체일 수 있다. 일반적으로, 표적화 분자는 존재하는 경우, 폴리펩티드 또는 비폴리펩티드일 수 있는 링커에 의해 Fc-에 연결될 것이다.

본 명세서에 기재된 Fc-함유 단백질 또는 Fc 단편은 당업계에 잘 알려진 몇몇 방식으로 유도될 수 있다. 항체 결합 도메인 또는 Fc-융합 단백질 또는 이들의 구성요소 및 도메인이 또한 이러한 도메인 또는 구성요소의 라이브러리, 예를 들어 파지 라이브러리로부터의 선택에 의해 얻어질 수 있다. 파지 라이브러리는 면역화된 동물 또는 인간의 B-세포 유래의 것과 같은 관심있는 서열을 함유하는 폴리뉴클레오티드의 라이브러리 또는 랜덤 올리고뉴클레오티드의 라이브러리를 삽입함으로써 생성될 수 있다 (문헌[Smith, G.P. 1985. Science 228: 1315-1317]). 항체 파지 라이브러리는 하나의 파지 내에 중쇄 (H) 및 경쇄 (L) 가변 영역 쌍을 함유하는데, 이는 단쇄 Fv 단편 또는 Fab 단편의 발현을 허용한다 (문헌[Hoogenboom, et al. 2000, Immunol. Today 21(8) 371-8]). 파지미드 라이브러리의 다양성은 추가의 바람직한 인간 모노클로널 항체를 생성하고 후속적으로 확인하기 위하여 라이브러리의 모노클로널 항체의 면역특이성을 증가시키고/시키거나 변경하도록 조작될 수 있다. 예를 들어, 중쇄 (H) 및 경쇄 (L) 면역글로불린 분자 암호화 유전자는 어셈블링된 면역글로불린 분자에서 새로운 HL 쌍을 생성하도록 랜덤하게 혼합될 (셔플링될) 수 있다. 부가적으로, 어느 하나의 또는 둘 모두의 H 및 L 쇄 암호화 유전자는 면역글로불린 폴리펩티드의 가변 영역의 상보성 결정 영역 (complementarity determining region; CDR)에서 돌연변이되고, 후속적으로 바람직한 친화성 및 중화 능력에 대하여 스크리닝될 수 있다. 또한, 항체 또는 Fc 라이브러리는 하나 이상의 인간 프레임워크 (framework) 서열을 선택하고, 인간 항체 레퍼토리로부터 유래된 또는 설계된 변이를 통하여 유래된 CDR 카세트의 콜렉션 (collection)을 도입함으로써 합성에 의해 생성될 수 있다 (문헌[Kretzschmar and von Ruden 2000, Current Opinion in Biotechnology, 13:598-602]). 다양성의 위치는 CDR에 한정되지 않지만, 가변 영역의 프레임워크 세그먼트를 또한 포함할 수 있거나, 또는 펩티드와 같은 항체 가변 영역 이외의 것을 포함할 수도 있다. 일 태양에서, 출원인의 공동-계류 중인 출원 (미국 출원 제61/261767호)에 기재된 바와 같이 파지 코트 단백질 pIX에 결합된 다이머 Fc 구조를 디스플레이할 수 있는 파지 라이브러리를 사용하여, 본 발명에 따른 신규한 Fc-함유 구조를 선택할 수 있다.

항체 가변 영역 이외의 표적 결합 구성요소를 포함할 수 있는 표적 결합 구성요소의 라이브러리는 리보솜 디스플레이 라이브러리, 효모 디스플레이 라이브러리 및 박테리아 디스플레이 라이브러리를 포함할 수 있다. 리보솜 디스플레이는 단백질이 RNA에 부착되어 유지되게 하면서 mRNA를 그의 동계 (cognate) 단백질로 번역하는 방법이다. 핵산 암호화 서열은 RT-PCR에 의해 회복된다 (문헌[Mattheakis, L.C. et al. 1994. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 9022]). 효모 디스플레이는 교배형 시스템의 일부인 막-회합된 알파-응집소 효모 부착 수용체, aga1 및 aga2의 융합 단백질의 구축을 기반으로 한다 (문헌[Broder, et al. 1997. Nature Biotechnology, 15:553-7]) 박테리아 디스플레이는 세포막 또는 세포벽과 회합된 배출된 (exported) 박테리아 단백질에의 표적의 융합을 기반으로 한다 (문헌[Chen and Georgiou 2002. Biotechnol Bioeng, 79:496-503]).

또한 본 발명은 본 발명의 조성물을 암호화하는 핵산을 조성물 또는 그의 유도된 돌연변이원의 원핵, 진핵 또는 사상 파지 발현, 분비 및/또는 디스플레이와 상용성인 벡터를 포함하는 발현 벡터의 부분으로서 또는 단리된 폴리뉴클레오티드로서 제공한다.

Fc -함유 분자의 용도

임의의 상기에 기재된 방법에 의해 생성된 조성물 (항체, Fc-융합물, Fc 단편)은 세포, 조직, 기관, 유체, 또는 일반적으로 숙주에서 인간 질환 또는 특정 병상을 진단, 치료, 검출 또는 조정하기 위하여 사용될 수 있다. 본 명세서에 교시된 바와 같이, 측정가능한 Fc 감마 수용체 결합 또는 특정 이펙터 기능을 유지하면서, 단백질 가수분해에 의한 절단을 줄이거나 제거하기 위한 항체의 Fc 부분, Fc-융합 단백질 또는 Fc 단편의 변형은 결합 도메인, 예를 들어, 항체의 파라토프 또는 원래의 표적화 특이성과 생물학적 활성을 유지하는 리간드 결합 도메인과 조합될 수 있다. 예시적인 결합 도메인은 항체의 파라토프, 하나 이상의 항체 CDR 또는 하나 이상의 항체 가변 도메인; 효소; 호르몬; 수용체; 막 수용체의 세포외 도메인; 사이토카인; 면역 세포 표면 항원; 및 부착 분자이다. 생성된 구축물은 활성의 스펙트럼, 생물물리학적 특성, 안정성 및 숙주의 체내에서 지속되는 능력이 뛰어난 항체 및 Fc-구축물을 가능하게 한다.

생리학적으로-관련이 있는 프로테아제에 대한 저항성 및 하나 이상의 FCgamma 수용체를 참여시키는 능력 또는 불능 및/또는 이펙터 세포 또는 보체의 활성화에 의해 세포 용해에 영향을 미치는 능력의 독특한 조합이 있는 Fc 서열의 본 출원인들의 발견은 결합 분자가 특정 용법에서 최대 유효성의 목적을 가지는 능력을 제공한다. 예를 들어, 비정상 숙주 세포, 예를 들어, 신생물 또는 부적절한 혈관신생 (angiogenesis), 부적절한 섬유증에서와 같은 기타 원치않는 증식에 수반되는 세포를 표적화하는 능력은 ADCC 및 ADCP일 수 있는 본 발명의 진핵 프로테아제-저항성 Fc를 포함하는 분자가 최적으로 적합할 것이다. 대조적으로, 박테리아 세포는 보체-매개의 메카니즘에 의해 용이하게 파괴된다. 따라서, 박테리아 감염은 박테리아 프로테아제에 대하여 저항성이 있으며, CDC를 유도하는 능력을 갖는 본 발명의 적절한 Fc-구축물로 치료될 수 있다.

본 출원인들은 적절한 특성의 조합을 갖는 Fc를 선택하는 방법을 동정하고, 목적 특이적으로 변형된 Fc-함유 분자의 작용예를 제공한다. 진핵 프로테아제-저항성이 있으며, 하나 이상의 ADCC, ADCP 및 CDC일 수 있는 분자는 힌지 및 CH2 영역 내에 EU 잔기 약 214 내지 잔기 약 330의 인간 IgG1의 서열 (여기서, 적어도 잔기 233 내지 237은 PVA/ (G236 결실)로 치환된다)을 갖고 CH2 도메인 내의 하나 이상의 치환을 추가로 포함하는 Fc 도메인을 포함하고(이에 의해 분자가 ADCC, ADCP 및 CDC 중 하나 이상일 수 있다), 구축물 5, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 14, 15, 16 및 17을 포함한다. 특정 실시형태에서, 이러한 분자는 다른 치환과 조합된 I1332E, 예를 들어, S239D/I332E (5, 14), S239D/H268F/I332E (제조되지 않음), H268F/S324T/I332E (8), S239D/H268F/S324T/I332E (9), S267E/H268F/S324T/I332E (10), G237X/S239D/I332E(여기서, X는 A 또는 S이다) (12); K326A/I332E/E333A (15) 및 S267E/I332E (17)로부터 선택되는 치환을 포함한다.

진핵 프로테아제에 대해 저항성이 있으며, CDC일 수 있는 분자는 힌지 및 CH2 영역 내에 EU 잔기 약 214 내지 잔기 약 330의 인간 IgG1의 서열 (여기서, 적어도 잔기 233 내지 237은 PVA/(G236 결실)로 치환된다)을 갖고, K326A/E333A (11), S267E/H268F/S324T/I332E (10), K326A/I332E/E333A (15), S239D/ K326A/E333A (16), 및 S267E/I332E (17)로부터 선택되는 CH2 도메인 내의 하나 이상의 치환을 추가로 포함하는 Fc 도메인을 포함하는 분자를 포함한다.

진핵 프로테아제-저항성이나, 표적 세포 용해를 증진시키지 않는 분자는 또한 질환 또는 증상을 치료하기 위하여 유리하게 사용될 수 있으며, 여기서, 야생형 IgG1에 비하여, 프로테아제-저항성이나 ADCC, ADCP 또는 CDC가 감소된 본 명세서에 교시된 바와 같은 항체 또는 기타 Fc-구축물을 사용함에 의해서와 같이 표적 세포 조절이 목적이며, 표적 세포 파괴는 목적이 아니다. 프로테아제-저항성인 비-천연, 비-야생형, Fc 도메인을 포함하는 분자는 힌지 및 CH2 영역 내에 EU 잔기 약 214 내지 잔기 약 330으로부터의 인간 IgG1의 서열을 갖는 Fc 도메인을 포함하는 분자를 포함하며, 여기서, 적어도 잔기 233 내지 237은 PVA/ (G236 결실)로 치환된다.

따라서, 본 명세서의 교시 및 예에 기초하여, 포유류 대상체에서 발생하는 프로테아제에 대한 증가된 저항성을 나타내며, 임의로, 세포 상의 항원을 표적화하는 능력을 갖는 본 명세서에서 가능해진 Fc-함유 구축물은 프로테아제 저항성이 아닌 치료 분자에 비하여 향상된 치료 분자를 제공한다.

투여

단백질 가수분해 효소가 그들의, 예를 들어, 소화관 내의 펩신 또는 조직 리모델링 또는 악성 성장 영역 내의 매트릭스 메탈로프로테이나제 (MMP)의 형성 또는 축적 속도에 따라 국소화됨에 따라, 본 발명의 조성물은 신체 구획이 프로테아제를 함유하며, 프로테아제 함량이 비정상적으로 높은 것으로 알려져 있는 이용에 특히 적합하다.

본 발명은 약제학적으로 허용되는 제형 중의 적어도 하나의 프로테아제-저항성 항체를 포함하는 바람직하게는 수성 인산염 완충된 염수 또는 혼합된 염 용액뿐 아니라 보존 용액 및 제형뿐 아니라 약제학적 또는 수의학적 용도에 적합한 다용도 보존 제형인 프로테아제-저항성 IgG 조성물, 예를 들어, 항체의 안정한 제형을 제공한다. 기타 인간 단백질, 예를 들어, 인간 혈청 알부민을 포함하는 적절한 비히클 및 그들의 제형은 예를 들어, 문헌[Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 21^st Edition, Troy, D.B. ed., Lipincott Williams and Wilkins, Philadelphia, PA 2006, Part 5, Pharmaceutical Manufacturing pp 691-1092, 특히 pp. 958-989 참조]에 기재되어 있다.

본 명세서에 기재되거나 해당 분야에 공지되어 있는 안정한 또는 보존된 제형 중의 이펙터 작용을 갖는 프로테아제-저항성 IgG 조성물은 정맥내 (I.V.); 근육내 (I.M.); 피하 (S.C.); 경피; 폐; 경점막 (transmucosal); 이식물, 삼투 펌프, 카트리지, 마이크로펌프 내의 제형의 사용; 또는 당업계에 널리 알려져 있는 바와 같은 당업자에게 인식되는 다른 수단을 포함하는 다양한 전달 방법을 통하여 본 발명에 따라 환자에게 투여될 수 있다.

신체 구획 또는 공동으로의 부위 특이적 투여에 대하여, 투여는 관절내, 기관지내, 복강내, 관절낭내, 연골내, 강내, 체강내, 소뇌내, 뇌실내, 결장내, 경부내, 위내, 간내, 심근내, 골내, 골반내, 심장주위내, 복막내, 흉막내, 전립선내, 폐내, 직장내, 신장내, 망막내, 척수내, 활막내, 흉부내, 자궁내, 방광내, 병변내, 질, 직장, 협측, 설하, 비강내, 또는 경피 수단에 의해 이루어질 수 있다.

본 발명에 의해 제공되는 조성물을 사용한 치료를 잘 받아들일 수 있는 질환 또는 병적 상태는 원치않는 세포의 증식, 활성화 또는 이동이 해로운 질환, 예를 들어, 악성, 과다활성 또는 불균형 면역 반응, 섬유성 조직 형성 또는 감염을 포함하나 이들에 한정되지 않는데, 이는 조성물이 FcγR-유도 메카니즘을 통하여 숙주 면역계의 세포독성 또는 세포용해성 메카니즘의 활성화를 가능하게 하기 때문이다. 이러한 질환은 악성 종양을 포함한다: 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병 (ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병 (AML), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 림프구성 백혈병 (CLL), 모발 세포 백혈병, 골수형성이상증후군 (MDS), 림프구증식 질환, 피부 T-세포 림프종, 호지킨병, 캐슬만병, 신경아교종, 교모세포종, 별아교세포종, 악성 림프종, 비호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 카포시 육종, 대장암종, 췌장암종, 신세포 암종, 유방암, 도관암종, 지방종, 비인두암종, 전립선암, 고환암, 난소암, 망막모세포종, 악성 조직구증, 악성 고칼슘혈증, 형질세포종, 연골육종, 육종, 메르켈 세포암, 간세포 암종, 간암, 기저세포암, 선암종, 편평 세포 암종, 육종 (예를 들어, 유잉 (Ewings), 카포시, 소아 연조직, 성인), 흑색종, 전이성 흑색종, 혈관종, 전이 질환, 골육종, 횡문근육종, 흉선종 및 흉선암종, 암 관련 골흡수, 자궁내막암, 질암, 자궁암, 빌름스 종양, 암 관련 뼈 통증 등.

악성 림프종 상의 항원에 결합할 수 있는 표적화된 분자는 B-세포 항원, 예를 들어, CD19, CD20 및 CD22를 포함한다. 상피 조직으로부터 유도된 고형 종양이 종종 디스플레이되며, ErbB1, ErbB2, ErbB3으로 공지되어 있는 상피 성장 인자 수용체 및 증식 반응 또는 항-아폽토시스 반응을 신호전달하거나 야기하여 종양의 억제되지 않은 성장을 초래할 수 있는 다른 수용체에 대한 리간드 결합에 의해 자극된다. 고형 종양 상의 다른 통상의 항원은 조직 인자 또는 RON이다.

또한, 조성물은 적절한 표적 결합 도메인과 조합되는 경우, 박테리아 (예를 들어, 스트렙토코커스, 스타필로코커스 및 이. 콜라이), 바이러스 (예를 들어, 인플루엔자, AIDS, RSV, SARS 및 웨스트 나일 바이러스), 진균류 (예를 들어, 아스페르질루스증, 콕시디오이데스증(coccidiodomycosis), 크립토콕쿠스증 또는 칸디다증), 또는 원생동물 감염 (예를 들어, 트리파노소마증, 톡소플라스마증, 지아르디아 또는 말라리아)에 의해 야기되는 감염성 질환의 치료에 유용하다.

조성물은 류마티스 질환, 건선 및 경피증을 포함하나 이들에 한정되지 않는 일반적인 면역학적 및 자가면역 장애를 치료하는데 유용하다.

조성물은 부적절한 혈관신생과 관련된 장애를 치료하는데 유용하다. 혈관신생은 새로운 모세 혈관을 생성하는 과정이며, 이는 내피 세포의 활성화된 증식으로부터 야기된다. 신혈관형성은 단단히 조절되며, 배아 발생, 조직 리모델링, 상처 치유 및 주기적 사이클의 황체 발생 동안만 발생한다 (문헌[Folkman and Cotran, Relation of vascular proliferation to tumor growth, Int. Rev. Exp. Pathol.'16, 207-248(1976)]). 내피 세포는 보통 체 내에서 다른 유형의 세포보다 훨씬 더 느리게 증식한다. 그러나, 이들 세포의 증식 속도가 조절되지 않는다면, 병적인 혈관신생이 야기될 수 있다. 병적인 혈관신생은 많은 질환에 수반된다. 예를 들어, 심혈관 질환, 예를 들어, 맥관종, 맥관섬유종, 혈관 변형, 죽상동맥경화증, 유착증 및 고유 경화증 (edemic sclerosis); 및 안과 질환, 예를 들어, 각막 이식 후의 신혈관형성, 신혈관형성 녹내장, 당뇨병성 망막병증, 혈관신생 각막 질환, 황반변성, 익상편, 망막 변성, 수정체후 섬유증식증 및 과립성 결막염이 혈관신생과 관련이 있다. 만성 염증성 질환, 예를 들어, 관절염; 피부 질환, 예를 들어, 건선, 모세관확장증, 화농성 육아종, 지루성피부염, 정맥성 궤양, 여드름, 주사 (주사성 여드름 또는 홍반 (erythematosa)), 사마귀 (warts, verrucas), 습진, 혈관종, 림프관신생은 또한 혈관신생-의존적이다.

당뇨병성 망막병증은 2가지 형태, 즉 비-증식성 또는 증식성 중 하나를 취할 수 있다. 증식성 망막병증은 유리질 표면 상에서 성장하거나 유리질 공동으로 연장되는 비정상적인 새로운 혈관 형성 (신혈관형성)을 특징으로 한다. 황반 변성도 마찬가지로 2가지 형태, 즉 건성 및 습성을 취한다. 훨씬 덜 통상적인 삼출성 황반 변성 (습성 형태)에서, 종종 망막내 출혈, 망막하액, 망막세포상피박리 및 과색소침착과 관련이 있는 맥락막 신혈관형성의 망막하 네트워크의 형성이 존재한다. 신혈관형성 녹내장은 당뇨병 또는 망막 중심정맥 폐쇄가 있거나 홍채를 소정의 각도로 당기는 포도막염과 관련된 염증성 침착을 가진 환자에서 발생한다 (문헌[Ch. 99. The Merck Manual 17th Ed. 1999]).

류마티스성 관절염, 염증성 질환은 또한 부적절한 혈관신생을 야기한다. 활액강 내의 혈관 내피 세포의 성장은 염증성 사이토카인에 의해 활성화되며, 연골 손상 및 관절 내의 판누스로의 대체를 야기한다 (문헌[Koch AK, Polverini PJ and Leibovich SJ, Arth; 15 Rhenium, 29, 471-479 (1986)]; 문헌[Stupack DG, Storgard CM and Cheresh DA, Braz. J. Med. Biol. Res., 32, 578-581(1999)]; 문헌[Koch AK, Arthritis Rheum, 41, 951 962(1998)]).

성물은 조절되지 않은 피부 세포의 증식에 의해 야기되는 건선의 치료에 유용하다. 신속하게 성장하는 세포는 충분한 혈액 공급을 필요로 하며, 비정상적인 혈관신생이 건선에서 유도된다 (문헌[Folkman J., J. Invest. Dermatol. 59, 40- 48 (1972)]).

많은 인자가 혈관신생을 야기하는 과정 및 사건에서 수반된다: 세포 부착 분자, 인테그린, 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), TNF알파, bFGF, 및 IL-6 및 IL-12를 포함하는 사이토카인. 예를 들어, 밀접한 관련이 있으나 별개의 인테그린 alphaVbeta3 및 aVb5는 혈관신생 과정에서 독립적인 경로를 매개하는 것으로 보인다. alphaVbeta3에 대하여 생성되는 항체는 기본 섬유아세포 성장 인자 (bFGF) 유도성 혈관신생을 차단하는 한편, aVb5에 특이적인 항체는 혈관 내피 성장 인자 (VEGF) 유도성 혈관신생을 억제한다 (문헌[Eliceiri, et al., J. Clin. Invest.103: 1227-1230 (1999]); 문헌[Friedlander et al., Science 270: 1500-1502 (1995)]). 따라서, 본 발명은 혈관신생의 억제가 지시되는 질환의 치료에서 사용하기 위한 본 발명의 조성물에서의 이들 표적에 대해 유도되는 표적화 결합 도메인의 이용을 포함한다.

본 출원에 참고로 포함되는 본 출원인의 공동-계류중인 국제 특허 출원 공개 WO2009023457A1호에는 항-힌지 절단 부위 에피토프 특이적 모노클로널 항체를 사용하여 이펙터 기능을 절단된 IgG로 복원시키는 전략이 개시되어 있다. 본 발명에 따른 프로테아제-저항성 및 이펙터 기능이 유능한 Fc를 항-힌지 도메인에 혼입시켜, 2가 항체를 생성하면, 절단된 IgG에 Fc-이펙터 기능을 복원시키면서, 치료제가 단백질 가수분해에 의한 절단에 의한 침묵화(silencing)에 저항성이게 할 수 있는 치료적 mAb가 생성될 것이다.따라서, 본 발명은 본 발명의 프로테아제-저항성 Fc 불변 영역의 기재된 바와 같은 항-힌지 가변 영역 mAb로의 혼입을 포함한다.

본 발명을 일반적인 개념으로 개시하였지만, 본 발명의 실시형태는 특허청구범위의 범주를 제한하는 것으로 이해되어서는 안 되는 하기 실시예에서 추가로 개시될 것이다.

실시예 1: Fc 돌연변이체의 제작 및 시험

일련의 구축물 (도 2에 나타나 있으며, 표 1의 힌지 영역과 표 2로부터 선택되는 CH2 영역 내의 활성 복원 돌연변이의 조합)을 표준 재조합 기법을 사용하여 생성하였다. 명칭 2hc는 214 내지 236 (서열 번호 3)의 EU 항체 (EU 넘버링)의 카바트 넘버링에 해당하는 IgG1 불변 도메인이 상응하는 IgG2 서열 (서열 번호 4)로 대체되는 것을 나타낸다. 명칭 2h는 IgG1 E233-L234-L235-G236의 잔기가 G235가 결실된 IgG2 P233-V234-A235의 해당하는 잔기로 대체되는 것을 나타낸다.

[표 4]

항체 구축물의 하나의 세트의 가변 영역은 CD142 (조직 인자)에 결합하며, 이는 조직 인자를 발현하는 MDA-MB-231 (ATCC, HTB-26 (상표명))을 사용하는 세포 검정법에서 항체의 Fc-의존성 세포-사멸의 시험을 가능하게 하였다 (문헌[Brezski et al., Proc Natl Acad Sci USA 106:17864-17869 2009]). 추가의 패널을 CD20에 결합하는 가변 영역으로 생성하였으며, 이는 CD20을 디스플레이하는 WIL2-S 세포 (ATCC, CRL-8885)를 사용하는 CDC 활성의 시험을 가능하게 하였다 (문헌[Brezski et al., Proc Natl Acad Sci USA 106:17864-17869 2009]). 모든 항체는 표준 클로닝 방법 및 절차를 사용하여 293T 세포에서 일시적으로 발현되었다. MAb를 단백질 A 컬럼을 사용하여 실험 분석 전에 95% 초과의 순도로 정제하였다.

야생형 및 mAb 구축물의 프로테아제 분해

정제된 IgG의 프로테아제 분해를 인산염-완충 염수 (PBS) 중에 pH 7.5에서, MMP (MMP-3, MMP-7, MMP-12 및 MMP-13은 모두 엔조 라이프 사이언스즈 (Enzo Life Sciences)로부터 수득하였다)에 대해서는 37℃에서 트리스-완충 염수 완충제 중에서 수행하였다. IdeS를 게노비스 (Genovis)로부터 수득하였으며, GluV8을 피어스 (Pierce)로부터 수득하였다. CaCl₂를 시험된 모든 MMP에 대하여 5 mM로 MMP 반응에 포함시켰다. 달리 특정되지 않는 한, 항체 농도는 0.5 mg/㎖이었으며, 효소를 대략 1 내지 2% (w/w) 비로 IgG에 첨가함으로써 반응을 개시하였다. IgG 절단을 아질런트 바이오시징(Agilent Biosizing) 모세관 전기영동 (아질런트 테크놀로지즈 (Agilent Technologies)) 후에 전기영동도 (electrophorogram)의 분석에 의해 평가하였다. 모든 분해를 2벌로 수행하였다.

알파스크린 (등록 상표) 경쟁 결합 검정법

경쟁 결합 연구를 pH 7.4에서 검정 완충제 (PBS, 0.05% BSA, 0.01% Tween-20) 중에 96-웰 불투명 플레이트 (코닝 (Corning))의 웰-절반 부피에서 수행하였다. 모든 경쟁 연구를 고정된 농도의 비오티닐화된 IgG1 (1 IgG: 2 비오틴, EZ Link (상표명) NHS-LC-비오틴 사용, 피어스) 및 연속 3배 희석으로 경쟁적 야생형 및 프로테아제-저항성 구축물에 대하여 수행하였다. FcγR 농도는 최종 검정법 농도 중에 0.2 ㎍/㎖이었다. 비오티닐화된 IgG1 (0.2 ㎍/㎖ 최종), 및 야생형 및 프로테아제-저항성 항체 (10 ㎕)를 2벌로 순차적으로 각 96-웰 플레이트의 열에 첨가하였다. 이후에 지정된 FcγR을 첨가하고, 각 10 ㎕의 1/50 희석된 니켈 킬레이트 (Ni)-수용자 비드 및 스트렙트아비딘 (SA)-공여자 비드의 순차적 첨가로 이어졌다. 불투명한 플레이트를 알루미늄 밀봉물질로 덮어, 차광 조건을 유지하면서 오비탈 쉐이커 (Orbital shaker) 상에서 30분 동안 쉐이킹하였다. 이후에 밀봉물질을 제거하고, 형광을 적절한 알파스크린 (등록 상표) 여기/방출 스펙트럼의 필터 세트가 장착된 엔비젼 (ENVISION) (상표명) 플레이트 판독기 (퍼킨엘머 (PerkinElmer))에서 판독하였다. 미가공 데이터를 그래프패드 프리즘 (GraphPad PRISM) (상표명) 소프트웨어로 옮기고, 최대 신호에 대하여 정규화하고, 경쟁 곡선을 비-선형 회귀 곡선-핏팅 소프트웨어를 사용하여 플롯팅하였다.

결과

처음의 관심은 하위 힌지 영역에서 IgG1을 절단하는 것으로 이전에 나타난 많은 생리학적으로 관련이 있는 프로테아제에 대한 mAb 구축물의 감수성을 결정하는 것이었다: MMP-3, MMP-7, MMP-12, MMP-13, GluV8 및 IdeS. 구축물 1 내지 5, 7, 9 내지 11, 12 (G237A), 13 및 14를 CD142 결합 항체로서 시험하였다. 프로테아제는 24시간에 걸쳐 IgG1을 다양한 정도로 절단하였다. 24시간 내에 MMP-3, MMP-12, IdeS가 모든 무손상 IgG1 (구축물 1)을 제거하는 한편, MMP-7은 약 30%를 절단하고, MMP-13은 약 40%를 절단하였으며, GluV8은 약 60%를 절단하였다. 구축물 4 (2h) 및 2h 하위 힌지 변형이 있는 구축물은 거의 동일한 정도로 모든 MMP에 대해 저항성이 있었다. 구축물 4는 GluV8에 대해 저항성이 있으나, IdeS에 대해서는 아니었다. 또한, 구축물 2는 GluV8 분해에 대하여 더욱 저항성이 있었다.

IdeS는 모든 인간 IgG 아이소형을 절단하는 것으로 나타났다 (문헌[von Pawel-Rammingen et al., EMBO 21:1607-1615 2002]). 경시적 연구로부터의 데이터 (도 3a)는 IdeS가 IgG1 (1) 및 IgG2 (2)를 F(ab')₂ 단편으로 신속하게 분해하는 한편 (인큐베이션 5분 내에), IgG1 시료 2h (4)가 120분 내내 단일-절단된 중간체를 갖는 것을 나타냈다. 시험한 구축물 중에, 2h S239D/I332E (5)는 IdeS에 대하여 가장 단백질 가수분해 저항성이 있는 구축물이었으며 (도 3b), 무손상 IgG가 심지어 24시간의 인큐베이션 후에도 검출되었다 (다른 항체 구축물은 5분까지 검출가능한 무손상 IgG를 갖지 않았다). G236과 G237 사이의 IdeS 절단점 근처에 있는 (5) 내의 S239D의 돌연변이는 IgG1 2h (4)에 비하여 추가의 프로테아제 저항성에 기여할 수 있다.

12개의 항-CD142 항체 구축물 (1 내지 5, 7, 9 내지 13 및 14)의 패널을 IdeS, GluV8, MMP-3 및 MMP-12에 의한 단백질 가수분해에 대한 감수성에 대하여 그들의 야생형 IgG1 및 IgG2 대응물과 함께 시험하였다. 24시간 인큐베이션 후에 남아있는 무손상 IgG에 대한 데이터를 전기영동도로부터 계산하고, 도 4a 내지 d에 나타내었다.

데이터에 의해, IgG1 야생형 (1), IgG2 야생형 (2), 2hc (3), IgG1 2h (4), 2hc S239D/I332E (13), IgG2 S239D/I332E (14) 및 2h K326A/E333A (11)가 24시간 인큐베이션 후에 IdeS에 의한 단백질 가수분해에 감수성이었음이 입증되었다. 대조적으로, 구축물 2h S239D/I332E (5), 2h G237A/S239D/I332E (12), 2h F243L/R292P/Y300L (7), 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9) 및 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10)는 IdeS에 의한 단백질 가수분해에 대하여 저항성이 있었다. 놀랍게도, 더 많은 IgG2 힌지 영역 치환 (서열 번호 4 포함)이 있는 구축물은 IdeS 단백질 가수분해에 대하여 저항성이 없었다. 구축물 IgG2 S239D/I332E는 IdeS를 사용한 24시간 분해 후에 남아있는 40% 미만의 무손상 IgG를 가졌다.

스타필로 아우레우스로부터의 GluV8 프로테아제를 사용한 분해에 의해, 구축물 IgG2 S239D/I332E (14), 2h S239D/I332E (5), 2h G237A/S239D/I332E (12) 및 2h F243L/R292P/Y300L (7)이 24시간 분해 후에 남아 있는 40 내지 60% 범위의 무손상 IgG를 갖는 것이 나타났으며, 이는 IgG1 야생형 (1)에 대하여 관찰되는 절단 수준과 유사한 것이다. 구축물 IgG2 야생형 (2), 2hc (3), 2hc S239D/I332E (14), IgG1 2h (4), IgG1 2h K326A/E333A (11), 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9) 및 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10)는 GluV8에 의한 단백질 가수분해에 대하여, IgG1 야생형에 비하여 증가된 저항성을 보였다 (모두는 75% 초과의 무손상 IgG가 남아있음).

MMP-3 및 MMP-12는 2가지 유형의 암 관련 프로테아제를 나타낸다. 5% 미만의 무손상 IgG1이 MMP-3 및 MMP-12 둘 모두를 사용한 분해 후에 검출되었다. 대조적으로, 인간 IgG2 야생형 및 시험한 모든 구축물은 24시간 분해 후에 남아있는 60% 초과의 무손상 IgG에 의해 입증되는 바와 같이, MMP-3 및 MMP-12 둘 모두에 대하여 증가된 프로테아제-저항성을 디스플레이하였다.

Fc γ 수용체 결합 결과

Fcγ 패밀리의 수용체에 대한 결합을 위해 야생형 IgG1과 경쟁하는 일부 Fc-구축물의 능력을 평가하였다. 비오티닐화된 IgG1에 의해 생성되는 최대 신호를 줄이는 구축물의 능력은 도 5a 내지 g에 나타나 있다. 초기의 스크린에는 구축물 1 내지 2, 4 내지 6이 포함되었다. 시험한 구축물의 초기 그룹에 대하여, IgG2 (2), IgG1 2h (4) 및 2h E333A/K334A (6)는 고 친화성 FcγRI에 대한 검출가능한 결합을 보이지 않는 한편, 야생형 IgG1는 강력한 결합을 보였다. 2h S239D/I332E (5)는 IgG1에 비하여 FcγRI에 대한 검출가능하지만 감소된 결합을 보였다. IgG1 2h (4) 및 2h E333A/K334A (6)는 FcγRIIa에 대한 검출가능한 결합을 보이지 않은 한편, 2h S239D/I332E (5) 구축물은 IgG1 야생형 (도 5b)에 대한 유사한 결합을 보였다. 3가지 구축물, IgG2 (2), IgG1 2h (4) 및 2h E333A/K334A (6)는 FcγRIIb에 대한 검출가능한 결합을 보이지 않은 한편, IgG1 (1) 및 2h S239D/I332E (5)는 유사한 결합을 보였다 (도 5d). IgG2 (2), IgG1 2h (4) 및 2h E333A/K334A (6)는 IgG1에 비하여 FcγRIIIa에 대한 유사하나 감소된 결합을 보였다. 2h S239D/I332E (5) 구축물은 심지어 IgG1 야생형 (도 5f)보다 더 높은 가장 높은 수준의 FcγRIIIa에 대한 결합을 디스플레이한다.

추가로, 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9) 구축물은 IgG1에 대한 유사한 결합을 디스플레이하는 한편, 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10) 구축물은 IgG1 야생형에 비하여 FcγRIIa에 대한 증가된 결합을 가졌다 (도 5c). 구축물 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9) 및 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10) 둘 모두는 IgG1 야생형에 비하여 FcγRIIb에 대한 증가된 결합을 디스플레이하였다 (도 5e). 구축물 2h K326A/E333A (11)는 FcγRIIa (도 5c) 및 FcγRIIb (도 5e) 둘 모두에 대한 최소의 검출가능한 결합을 보였다.

구축물 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10)는 IgG1 야생형에 비하여 FcγRIIIa에 대한 약간 감소된 결합을 보이는 한편, 구축물 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9)는 FcγRIIIa에 대한 증가된 결합을 보였다 (도 5g). 2h K326A/E333A (11)는 IgG1 야생형에 비하여 FcγRIIIa에 대한 약한 결합을 디스플레이하였다 (도 5g).

요약

이들 결과에 의해, 2h S239D/I332E (5), 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9) 및 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10)를 포함하는 단백질 가수분해 저항성 구축물이 다양한 정도로 FcγRIIa, IIb 및 IIIa에 결합할 수 있었음이 나타났으며, 이들 구축물의 모든 3개는 단독의 2h (4) 돌연변이에 비하여 증가된 결합을 가졌다. 구축물 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10)와 같이 IgG1 야생형에 비하여 FcγRIIa 결합 친화성이 증가되고, FcγRIIb에 대하여 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9) 및 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10)의 친화성이 증가되고, 구축물 2h S239D/I332E (5) 및 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9)에서와 같이 IgG1 야생형에 비하여 FcγRIIIa 결합 친화성이 증가된 다른 CH2 돌연변이와 조합된 IgG1의 하위 힌지 내의 잔기의 돌연변이는 예기치 않은 결과였다.

실시예 2. 항체 의존성 세포 식작용 ( ADCP )

Fc-의존성 시험관 내 세포 사멸을 매개하는 프로테아제-저항성 mAb의 능력을 시험하기 위하여, ADCP 검정법을 수행하였다. 이러한 검정법에서, 식작용 세포는 항체 결합에 의해 표적 항원 디스플레이 세포에 동원되며, 표적 세포 파괴를 측정한다.

절차

PBMC를 피콜 (Ficoll) 구배 원심분리를 사용하여 정상의 인간 공여자로부터 단리하였다. CD14pos 단핵구를 CD16pos 단핵구를 고갈시키지 않는 CD14 단리 키트를 사용하여 음성 고갈에 의해 PBMC로부터 정제하였다. 단핵구를 7일 동안 10% FBS 및 20 ng/㎖ GM-CSF (알앤디 시스템즈 (R&D Systems))를 함유하는 X-VIVO-10 배지 (론자 (Lonza))에서 0.1x10⁶개 세포/cm²로 플레이팅하였다. 100 ng/㎖의 IFNγ (알앤디 시스템즈)를 마지막 24시간의 분화를 위해 첨가하였다. ADCP 검정법을 위한 표적 세포는 GFP-발현 MDA-MB-231 세포였다. 단리된 대식구를 96 웰 U-바닥 플레이트에서 야생형 및 프로테아제-저항성 mAb 구축물과 함께 또는 이것 없이, 4시간 동안 4:1의 비로 GFP-발현 MDA-MB-231과 함께 인큐베이션시켰다. 인큐베이션 후에, 세포를 아큐타제 (Accutase) (시그마 (Sigma))를 사용하여 96 웰 플레이트로부터 제거하였다. 대식구를 알렉사플루오르 (AlexaFluor) 647 (인비트로겐)에 커플링된 항-CD11b 및 항-CD14 항체 (비디 바이오사이언스즈 (BD Biosciences)로부터의 것)로 동정한 다음, 세포를 팩스 칼리부르 (FACs Calibur) (비디 바이오사이언스즈) 상에서 수집하였다. 데이터를 플로조 (FloJo) 소프트웨어 (트리 스타 (Tree Star))를 사용하여 분석하였다. 식작용 백분율을 하기의 식에 의해 결정하였다: ((GFPpos, CD11bpos, CD14pos 세포) / (GFPpos, CD11bpos, CD14pos 세포 + 단독의 GFPpos 세포) × 100%.

단리된 단핵구를 기재된 바와 같이, GM-CSF 및 IFNγ를 사용하여 시험관 내에서 분화시켰다. 다른 것들에 의해 나타난 바와 같이, 분화된 대식구는 FcγR (FcγRI, FcγRIIa, FcγRIIb 및 FcγRIIIa) 모두를 발현하였다 (데이터 미도시).

결과

도 6a에 나타낸 데이터에 의해, IgG1 야생형 (1) 및 2h S239D/I332E (5)가 가장 높은 수준의 ADCP를 달성하였음이 나타났다. IgG2 야생형 (2), IgG1 2h (4) 및 2h E333A/K334A (6)의 ADCP 능력은 낮으나 검출가능한 ADCP 능력을 생성하였다. 이들 결과에 의해, 프로테아제-저항성 구축물 2h S239D/I332E (5)가 IgG1 야생형과 유사한 수준으로 종양 세포를 식작용시킬 수 있는 것이 나타났다. 개별 실험에서, IgG1 2h 힌지 영역을 함유하는 CD2 구축물의 추가의 패널을 ADCP 능력에 대하여 시험하였다 (도 6b). 이러한 그룹에서, 구축물 2h S239D/I332E (5), 2h F243L/R292P/Y300L (7) 및 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9)는 IgG1 야생형 (1)과 유사한 ADCP를 갖는 한편, 구축물 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10), 2h H268F/S324T/I332E (8) 및 2h G237A/S239D/I332E (12)는 IgG1 야생형에 비하여 약간 감소된 최대 식작용을 가졌다. 구축물 2h K326A/E333A (11)는 IgG2 야생형 (2) 및 IgG1 2h (4)와 유사하게, 낮으나 검출가능한 ADCP를 가졌다. 마지막으로, IgG2의 완전한 힌지를 함유하는 구축물을 ADCP에 대하여 시험하였다. 구축물 IgG2 S239D/I332E (14)는 IgG1 야생형과 유사한 ADCP를 디스플레이하는 한편, 구축물 2hc (3) 및 2hc S239D/I332E (13)는 낮으나 검출가능한 ADCP를 디스플레이하였다.

실시예 3. 항체-의존성 세포 독성 ( ADCC )

이러한 검정법에서, 단핵 세포는 표적 항원 디스플레이 세포에 동원되며, 표적 세포 파괴를 측정한다.

절차

ADCC 검정법을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌[Scallon et al., Mol Immunol 44:1524-1534 2007]). 약술하면, PBMC를 피콜 구배에 의해 인간 혈액으로부터 정제하고, ADCC 검정법을 위한 이펙터 세포로 사용하였다. MDA-MB-231 인간 유방암종 세포 (ATCC HTB-26)를 표적 세포 1 대 이펙터 세포 50의 비로, 표적 세포로 사용하였다. 표적 세포를 37℃에서 20분 동안 BATDA (퍼킨엘머)로 사전-표지하고, 2회 세정하고, DMEM, 10% 열-불활성화 FBS, 2mM L-글루타민 (모두 인비트로겐으로부터의 것) 중에 재현탁화시켰다. 표적 (1 × 10⁴개 세포) 및 이펙터 세포 (0.5 × 10⁶개 세포)을 합하고, 100㎕의 세포를 96-웰 U-바닥 플레이트의 웰에 첨가하였다. 추가의 100㎕를 야생형 및 프로테아제-저항성 mAb 구축물과 함께 또는 이것 없이 첨가하였다. 모든 시료를 2벌로 수행하였다. 플레이트를 200 g에서 3분 동안 원심분리하고, 37℃에서 2시간 동안 인큐베이션시킨 다음, 200g에서 3분 동안 다시 원심분리하였다. 웰 당 총 20 ㎕의 상층액을 제거하고, 200 ㎕의 델피아 (DELPHIA) 유로퓸(Europium)-기반 시약 (퍼킨엘머)의 첨가에 의해 세포 용해를 측정하였다. 엔비전 2101 멀티라벨 리더(Envision 2101 Multilabel Reader) (퍼킨엘머)를 이용하여 형광을 측정하였다. 데이터를 0.67% 트리톤 (Triton) X-100 (시그마 알드리치 (Sigma Aldrich))을 사용한 최대 세포독성 및 임의의 항체의 부재 하에 표적 세포로부터의 BATDA의 자발적인 분비에 의해 결정한 최소 대조군으로 정규화하였다. 데이터를 그래프패드 프리즘(GraphPad Prism) v5를 이용하여 S자형 용량-반응 모델에 피팅시켰다.

결과

세포 용해 수준이 항체 농도의 함수로서 Y-축 상에 표현되도록 데이터를 플롯팅하였다. 도 7a에 나타낸 데이터에 의해, 2h S239D/I332E (5) 구축물이 도시된 검정법에서 IgG1 야생형에 비하여 대략 8배 (분명한 EC50의 이동에 의해 입증되는 바와 같은)의 향상이었던 가장 높은 수준의 ADCC 능력을 갖는 것이 나타났다.

다른 실험에서, 연장된 패널의 구축물의 ADCC 능력을 비교하였다. 도 7b는 데이터에 의해 생성되는 곡선을 나타낸다. 3가지 구축물 (2h S239D/I332E (5), 2h F243L/R292P/Y300L (7) 및 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9))은 IgG1 야생형에 비하여 증가된 ADCC 능력을 가졌다. 2h G237A/S239D/I332E (12) 및 2h H268F/S324T/I332E (8) 구축물은 IgG1 야생형에 비하여 약간 증가된 ADCC를 갖는 한편, 구축물 2h K326A/E333A (11) 및 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10)는 IgG1 야생형에 비하여 검출가능하나 감소된 ADCC를 가졌다. 도 7c는 IgG2의 완전한 힌지 영역을 함유하는 구축물의 패널으로부터의 ADCC 결과를 도시한다. IgG2 S239D/I332E (14) 구축물은 IgG1 야생형보다 더 낮은 EC50, 또한 더 낮은 최대 용해를 가졌다. 구축물 2hc (3) 및 2hc S239D/I332E (13)는 IgG2 야생형을 초과하나 IgG1 야생형보다 더 낮은 검출가능한 ADCC를 가졌다. 함께 취하면, 이들 결과에 의해, 하위 힌지에서의 중요한 잔기의 돌연변이가 수많은 CH2 돌연변이에 의한 FcγR-결합 및 ADCC의 복원을 위해 보충될 수 있음이 입증된다. 그러나, 시험한 IgG1 2h (3) 백본에 대하여 이루어진 CH2 돌연변이가 반드시 IgG1 야생형에 비하여 ADCC를 복원/증진시킬 수 있었던 것은 아니었다.

이들 결과는 2h S239D/I332E (5) 및 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9)의 증진된 친화성을 보이는 FcγRIIIa 결합 검정법과 일치하는데(도 5f 및 g), 이는 FcγRIIIa-발현 NK 세포가 ADCC에서 관련이 있는 이펙터 세포인 것으로 생각되기 때문이다.

실시예 4. 보체 의존성 세포독성 ( CDC )

이러한 검정법에서, 보체 성분은 표적 항원 디스플레이 세포에 동원되며, 표적 세포 파괴를 측정한다.

절차

CDC 검정법을 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다 (문헌[Brezski et al. J Immunol. 181(5):3183-3192 2008]). WIL2-S 세포를 CDC 검정법에 대한 표적 세포로 사용하였다. 50㎕의 세포를 RPMI, 5% 열-불활성화된 FBS, 0.1 mM 비필수 아미노산, 1 mM 피루브산나트륨 (모두 인비트로겐으로부터의) 중에 웰당 8 × 10⁴개 세포의 최종 농도로 96-웰 플레이트의 웰에 첨가하였다. 추가의 50 ㎕를 항체와 함께 또는 항체 없이 웰에 첨가하고, 플레이트를 실온에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. 50㎕의 10% 토끼 보체 (인비트로겐)를 웰에 첨가하고, 플레이트를 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시켰다. 모든 시료를 2벌로 수행하였다. 플레이트를 3분 동안 200 g에서 원심분리하고 50 ㎕의 상층액을 제거하여 플레이트를 분리하고 LDH 세포독성 검출 키트 (로슈)로 CDC를 측정하였다. 스펙트라 (Spectra) 맥스 플러스 (max Plus) 384 (퍼킨엘머)를 이용하여 흡광도를 측정하였다. 데이터를 트리톤 X-100 (시그마 알드리치)을 이용하여 최대 세포독성에 대하여 정규화시키고 단지 세포 및 보체 단독을 함유한 최소 대조군에 대하여 정규화시켰다. 데이터를 그래프패드 프리즘 v5를 이용하여 S자형 용량-반응 모델에 피팅시켰다.

결과

도 8에 나타낸 데이터에 의해, 구축물 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10) 및 2h K326A/E333A (11) 둘 모두가 IgG1 야생형과 유사한 수준의 세포 용해를 달성하는 것이 나타났다. 구축물 IgG1 2h (4), 2h S239D/I332E (5), 2h F243L/R292P/Y300L (7) 및 2h S239D/H268F/S324T/I332E (9)는 IgG2 야생형 (2)에 대하여 측정된 것과 유사한 최소 CDC 능력을 가졌다.

실시예 5: 추가의 프로테아제-저항성 구축물

G236이 결실된 E233P/L234V/L235A와 조합된 오직 2개의 CH2 돌연변이, 즉, 2h K326A/K334A (11) 및 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10)는 IgG1 야생형과 유사한 CDC 활성일 수 있었다. 그러나, 2h K326A/K334A (11)는 최소의 ADCC 및 ADCP 활성을 가졌으며, 2h S267E/H268F/S324T/I332E (10)는 IgG1 야생형에 비하여 감소된 ADCC 활성을 가졌다. 모든 3가지 활성 (ADCC, ADCP 및 CDC)을 갖는 프로테아제-저항성 구축물을 엔지니어링하는 것이 유익할 것이다. 단독의 H268F/S324T 돌연변이는 FcγR에 대하여 친화성을 증가시키는 것으로 이전에 나타나지 않았던 한편 (문헌[Moore et al.]), 구축물 2h H268F/S324T/I332E는 2h에 비하여 증가된 ADCC를 가졌다. 따라서, 단독의 I332E 돌연변이는 2h 프로테아제-저항성 힌지 구축물에 ADCC를 복원시킬 수 있다. 따라서, 2h K326A/I332E/E333A (15) (서열 번호 18), S239D/K326A/E333A (서열 번호 19) (16) 및 S267E/I332E (17) (서열 번호 20)를 포함하는 2h 모 힌지에 대하여 둘 모두의 ADCC/ADCP의 복원과 CDC 복원을 조합하는 구축물이 생성될 것이다.

실시예 1에 기재된 재료 및 방법을 사용하여 3개의 구축물을 시험하였다. 3가지 구축물은 IgG1 야생형에 비하여 MMP-3 및 MMP-12에 대하여 저항성을 디스플레이하였다.

이전에 입증된 바와 같이, IgG2 야생형 (2)은 GluV8에 대하여 저항성이 있었던 한편, IgG1 야생형 (1)은 24시간 분해 후에 남겨진 60% 미만의 무손상 IgG를 가졌다. 3가지 구축물은 IgG1 야생형에 비하여, GluV8에 대하여 증가된 저항성을 가졌다. 그러나, 구축물 2h K326A/I332E/E333A (15) 및 2h S267E/I332E (17)는 IgG2 야생형에 비하여 GluV8에 대하여 감소된 저항성을 갖는 한편, 2h S239D/K326A/E333A (16)는 IgG2 야생형과 유사한 저항성을 가졌다. 이들 데이터에 의해, 하위 힌지 돌연변이와 조합되는 추가의 Glu를 CH2에 도입하는 돌연변이에 의해, 신규한 GluV8 절단 부위 (예를 들어, 2h S239D/I332E (5), 2h K326A/I332E/E333A (15) 및 2h S267E/I332E (17))가 생성되는 한편, Glu를 CH2로 도입하지 않는 돌연변이 (예를 들어, 2h K326A/E333A (11) 및 2h S239D/K326A/E333A (16))는 IgG2 야생형과 유사한 GluV8에 대한 저항성을 디스플레이하는 것이 제시되었다.

IgG1 야생형 및 IgG2 야생형 둘 모두는 IdeS에 의해 단백질 가수분해되기 쉬웠다. 2가지 구축물 2h K326A/I332E/E333A (15) 및 2h S267E/I332E (17)는 IdeS와의 24시간 인큐베이션 후에 90% 초과의 무손상 IgG가 남아있는 한편, 구축물 2h S239D/K326A/E333A (16)는 20% 미만의 무손상 IgG가 남아있었다. 이들 결과에 의해, 하위 힌지 돌연변이와 조합된 Glu의 CH2로의 부가가 IdeS에 대한 프로테아제-저항성을 증가시키는 것이 시사되었으며, 이는 단독의 하위 힌지 돌연변이 2h (4)가 부여하지 않는 특성이다.

3가지 구축물을 ADCP, ADCC 및 CDC를 수행하는 그들의 능력에 대하여 시험하였다. 3가지 구축물은 IgG2 야생형 및 2h (4) 둘 모두에 비해 ADCP 능력이 증가되었으나, IgG1 야생형에 비해 최대 ADCP가 감소되었다. 2가지 구축물, 2h K326A/I332E/E333A (15) 및 2h S239D/K326A/E333A (16)는 IgG1 야생형에 비하여 ADCC가 약간 증가되었다. 구축물 2h S267E/I332E (17)는 IgG1 야생형에 비해 ADCC가 감소되었으며, IgG 야생형 및 2h (4)에 비해 ADCC가 증가되었다. 모든 3가지 구축물은 IgG2 야생형 및 2h (4)에 비해 CDC 능력이 증가되었으나; 모든 3가지에 대한 CDC는 IgG1 야생형에 비해 약간 감소하였다.

실시예 6: 유익한 돌연변이의 요약

하기의 11개의 Fc 변이체는 야생형 인간 IgG1에 의해 나타나는 하나 이상의 이펙터 기능을 제공하면서, 하위 힌지 내의 IgG1을 절단할 수 있는 하나 이상의 프로테아제에 대하여 저항성이 있는 항체 조성물을 제공하는 것으로 나타났다. 기호 2h는 E233P/L234V/L235A - G236 결실이 있는 IgG1을 나타낸다.

[표 5]

충분한 데이터가 이용가능한 경우, 다양한 이펙터 기능에 대한 대용으로 사용되는 시험관 내 검정법에 대하여 세포 사멸이 완료되거나 거의 완료된 경우에 계산된 EC50 값이 하기에 나타나 있다. 표 6a 및 6b에 나타낸 데이터는 공여자 PBMC 공급원이 상이하다는 것을 제외하고는 동일한 조건 하에서 생성하였다. 따라서, 각 실험에서, IgG1 야생형(1)으로부터의 배수 변화를 사용하여, 상대적 생물학적 활성을 표준화하였다.

[표 6A]

[표 6B]

S239D/I332E 및 233PVA/236에 더하여, 하위 힌지 내의 G237에서 추가의 변형의 ADCC 및 ACDP에 대한 영향을 하기 표 7에 열거된 구축물을 사용하여 시험하였다. G237A 구축물을 시험하였으며, MMP, IdeS 및 GluV8에 대하여 저항성을 갖는 것으로 관찰되었다. 다른 구축물은 분해 검정법에서 평가하지 않았다. 이들 데이터에 의해, Ala(A) 및 Ser(S)이 237에서 허용되나, 모 분자, 2h DE(5)에 의해 디스플레이되는 것을 초과하여 Fc의 세포용해 활성을 증가시키지 않음이 나타났다.

[표 7]

유력한 이펙터 기능(ADCC, ADCP 및 CDC)을 나타내는 대용의 검정법에 대한 시험관내 결과 및 특정 생리학적으로 관련이 있는 프로테아제에 대한 상대적 프로테아제 저항성(PR)의 조합의 요약이 하기 표 8에 나타나 있으며, 여기서, 프로테아제 저항성 및 하나 이상의 입증할 수 있는 이펙터 활성이 조합된 구축물은 백색으로 존재한다.

[표 8]

결과의 요약

본 명세서에 제시된 Fc 구축물의 연구에 의해, 프로테아제가 IgG1 분자를 절단하는 것으로 보이는 부위인 잔기 EU 233 내지 236의 PVA/로의 치환이 MMP-3, MMP-12 및 GluV8; 잔기 232와 234 사이를 절단하는 프로테아제에 대하여 내성이 있는 Fc를 생성함이 입증된다(도 1). 이들 치환과 조합되는 경우, 치환되는 잔기 위치가 추정된 절단 부위(EU236-237)에서 변형을 포함하든지 더욱 원위의 위치에서 변형을 포함하든지, 추가의 변형에 의해 스타필로코커스 프로테아제 IdeS에 대한 저항성이 생성된다.

잔기 EU 233-236의 단독의 PVA/(2h, 구축물 4)로의 치환에 의해, ADCC, ADCP 및 CDC에 대해 기재된 시험관 내 검정법에 의해 측정가능한 세포용해 기능의 소실이 야기된다. 하나 이상의 이펙터 기능(표 2)을 증진시키는 것으로 이전에 보고된 IgG1 Fc 변형과 하위 힌지 PVA/ 치환의 조합에 관하여, 시험관내 세포용해 활성의 하나 이상의 태양이 예기치않게 복원된다. 따라서, 단일의 구축물은 프로테아제-저항성이면서 ADCC, ADCP 및 CDC에 대한 세포 용해 검정법 또는 시험관 내 세포 사멸에 의해 측정시 모든 3가지 이펙터 기능에 대한 측정가능하거나 증진된 활성을 갖지 않았다.

1. 8가지 구축물은 프로테아제-저항성을 가졌으며, IgG1 야생형에 비하여 ADCC가 증진되거나 유사하였다: 5, 7, 8, 9, 12, 14, 15 및 16. IgG1 2h DE(5), IgG1 2h FTE(8), IgG1 2h DFTE(9), IgG1 2h ADE(12), IgG2 DE(14) 및 IgG1 2h AEA(15)를 포함하는 이들 중 6개에는 I332E개 치환이 혼입된다.

2. IgG1 2h DE(5), IgG1 2h LPL(7) 및 IgG1 2h DFTE(9)를 포함하는 3가지 PR 구축물은 IgG1 야생형에 비하여 유사한 ADCP를 가졌다. IgG1 2h FTE(8), IgG1 2h EFTE(10), IgG1 2h ADE(12) 및 IgG2 DE(14)를 포함하는 3가지 구축물은 IgG1에 비하여 약간 감소된 ADCP를 가졌다.

3. IgG1 2h AA(11), IgG 2h EFTE(10), 2h AEA(15), 2h DAA(16) 및 2h EE(17)의 5가지 PR 돌연변이에 의해, CDC 능력이 복원되었다. 또한, 5가지 모두는 검출가능하나 IgG1 야생형에 비하여 감소된 ADCP를 가졌다. 또한, 2가지 변이체, 2h AEA(15), 2h DAA(16)는 IgG1 야생형(1)에 비하여 ADCC가 증가되었다.

H268F/S324T 돌연변이를 포함하는 2가지 구축물(8 및 9)은 프로테아제-저항성 힌지가 존재하는 경우에 CDC가 복원되지 않았다. S267E 돌연변이(EFTE (10))는 CDC를 복원하였으나, FcγRIIIa 결합이 감소되었다(또한, 문헌[Moore et al. mAbs 2010 2(2):181]에 나타낸 바와 같이) S267E 돌연변이는 FcγRIIb에 대한 친화성이 증가되었다.

SEQUENCE LISTING <110> Janssen Biotech, Inc. Brezski, Randall Jordan, Robert Strohl, William <120> ACTIVE PROTEASE-RESISTANT ANTIBODY Fc MUTANTS <130> CEN5304WOPCT <140> TBD <141> Herewith <150> 61/426619 <151> 2010-12-23 <150> 61/540882 <151> 2011-09-29 <160> 20 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 234 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 20 25 30 Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 35 40 45 Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 50 55 60 Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 65 70 75 80 Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 85 90 95 His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 100 105 110 Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly 115 120 125 Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu 130 135 140 Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser 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Val Glu Phe Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 80 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 85 90 95 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Thr Asn Lys 100 105 110 Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 115 120 125 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 14 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> human IgG constant region sequence variant <400> 14 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 80 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 85 90 95 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala 100 105 110 Ala Leu Pro Ala Pro Ile Ala Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 115 120 125 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 15 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> human IgG constant region sequence variant <220> <221> MUTAGEN <222> (23)..(23) <223> X may be Ala, Asp, Pro, Gln, or Ser <400> 15 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Pro Val Ala Xaa Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 80 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 85 90 95 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys 100 105 110 Ala Leu Pro Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 115 120 125 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 16 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> human IgG constant region sequence variant <400> 16 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5 10 15 Pro Val Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn 65 70 75 80 Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp 85 90 95 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 17 <211> 230 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> human IgG constant region sequence variant <400> 17 Thr Val Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro 1 5 10 15 Pro Val Ala Gly Pro Asp Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp 20 25 30 Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp 35 40 45 Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly 50 55 60 Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn 65 70 75 80 Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Val His Gln Asp Trp 85 90 95 Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro 100 105 110 Ala Pro Glu Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys Gly Gln Pro Arg Glu 115 120 125 Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu Met Thr Lys Asn 130 135 140 Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile 145 150 155 160 Ser Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr 165 170 175 Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys 180 185 190 Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys 195 200 205 Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu 210 215 220 Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230 <210> 18 <211> 233 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> human IgG constant region sequence variant <400> 18 Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 1 5 10 15 Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys 20 25 30 Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val 35 40 45 Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr 50 55 60 Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu 65 70 75 80 Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His 85 90 95 Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Ala 100 105 110 Ala Leu Pro Ala Pro Glu Ala Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln 115 120 125 Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 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Leu 130 135 140 Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro 145 150 155 160 Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn 165 170 175 Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu 180 185 190 Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val 195 200 205 Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln 210 215 220 Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 225 230

Claims (35)

1. 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 서열번호 1의 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하되, EU 넘버링(numbering)을 기초로 (a) 상기 힌지 내 E233-L234-L235-G236의 서열이 G236이 결실된 P233-V234-A235로 대체되고; (b) 상기 CH2 도메인이 S239D/I332E; K326A/E333A; H268F/S324T/I332E; F243L/R292P/Y300L; S239D/H268F/S324T/I332E; S267E/H268F/S324T/I332E; K326A/I332E/E333A; S239D/K326A/E333A; S267E/I332E; 및 G237X/S239D/I332E(여기서, X는 A, D, P, Q 또는 S이다) 중에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는, 변형된 Fc-함유 분자.
2. 제1항에 있어서, Fc-함유 분자가 EU 넘버링을 기초로 잔기 222 내지 237에서 IgG1 분자를 절단시킬 수 있는 프로테아제(protease)에 의한 단백질 가수분해에 대하여 저항성이 있는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
3. 제2항에 있어서, Fc-함유 분자가 야생형 IgG1에 비하여, MMP-3, MMP-7, MMP-12, MMP-13, HNE, 플라스민, 카텝신 G, 펩신, 스트렙토코커스 파이론게네스(Strep. Pyrongenes)로부터의 면역글로불린 분해 효소(IdeS) 또는 스타필로코커스 아우레우스(Staph. aureus)로부터의 글루타밀 엔도펩티다아제 I(GluV8)에 의한 분해에 대하여 저항성이 있는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
4. 제3항에 있어서, Fc-함유 분자가 야생형 IgG1에 비하여, MMP-3, MMP-7, IdeS 또는 GluV8 중 하나 이상에 의한 분해에 대하여 저항성이 있는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
5. 제1항에 있어서, Fc-함유 분자가 CD14 양성, CD11b 양성, 또는 둘 다 모두 양성인 혈액 단핵구의 존재 하에 측정되는 ADCP를 증진시킬 수 있으며, 서열 번호 8, 10 내지 15 및 18 내지 20의 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
6. 제5항에 있어서, EU 넘버링을 기초로 G236이 결실된 P233-V234-A235로 치환된 야생형 IgG1의 힌지 도메인을 포함하거나, 서열 번호 3을 포함하며; EU 넘버링을 기초로 I332E 치환을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
7. 제1항에 있어서, Fc-함유 분자가 혈액 단핵구의 존재 하에 측정되는 ADCC를 증진시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
8. 제7항에 있어서, EU 넘버링을 기초로 G236이 결실된 P233-V234-A235로 치환된 야생형 IgG1의 힌지 도메인을 포함하거나, 서열 번호 3을 포함하며; EU 넘버링을 기초로 I332E 치환을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
9. 제7항에 있어서, Fc-함유 분자가 서열 번호 8 및 10 내지 12 및 15, 18 내지 20의 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
10. 제1항에 있어서, Fc-함유 분자가 보체의 존재 하에서 세포 용해에 의해 측정되는 보체-의존성 세포독성(CDC)을 증진시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
11. 제10항에 있어서, Fc-함유 분자가 서열 번호 13, 14 및 18 내지 20의 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
12. 제1항에 있어서, Fc-함유 분자가 야생형 IgG2 Fc-도메인과 유사하거나 그보다 더 큰 친화성으로 Fcγ 수용체에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
13. 제1항에 있어서, Fc-함유 분자가 야생형 IgG1 Fc-도메인과 유사하거나 그보다 더 큰 친화성으로 Fcγ 수용체에 결합할 수 있는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
14. 제7항에 있어서, 서열 번호 8을 포함하는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
15. 제1항에 있어서, Fc-함유 분자가 항체 또는 Fc 융합 단백질인 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
16. 제15항에 있어서, Fc-함유 분자가 항체이고, 상기 항체가 종양 세포, 종양 매트릭스 또는 종양 맥관구조 상의 항원에 결합하는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
17. 제16항에 있어서, 항체가 CD20, ErbB1, ErbB2, ErbB3, VEGF, RON 및 조직 인자 중 하나에 결합하는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
18. 제1항에 있어서, Fc 도메인 서열이 EU 넘버링을 기초로 잔기 214 내지 잔기 340의 야생형 인간 IgG1과 적어도 90% 동일성이 있는 것을 특징으로 하는, Fc-함유 분자.
19. (ⅰ) 세포 상의 또는 세포에 결합된 표적 분자에 결합할 수 있는 결합 도메인; 및
    (ⅱ) 힌지, CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함하는 서열번호 1의 야생형 인간 IgG1 Fc 영역을 포함하되, EU 넘버링을 기초로 (a) 상기 힌지 내 E233-L234-L235-G236의 서열이 G236이 결실된 P233-V234-A235로 대체되고; (b) 상기 CH2 도메인이 S239D/I332E; K326A/E333A; H268F/S324T/I332E; F243L/R292P/Y300L; S239D/H268F/S324T/I332E; S267E/H268F/S324T/I332E; K326A/I332E/E333A; S239D/K326A/E333A; S267E/I332E; 및 G237X/S239D/I332E(여기서, X는 A, D, P, Q 또는 S이다) 중에서 선택되는 하나 이상의 치환을 포함하는 변형된 Fc 도메인;
    을 포함하는 재조합 폴리펩티드인 단리된 결합 분자로서, 표적 세포 상의 상기 표적 분자에 결합할 수 있고, 필수 이펙터 세포 유형의 존재 하에서 상기 표적 세포의 측정가능한 보체 의존성 용해 또는 세포 매개된 파괴를 일으키는 것을 특징으로 하는, 단리된 결합 분자.
20. 제19항에 있어서, Fc 도메인이 서열 번호 8, 10 내지 15 및 18 내지 20의 군으로부터 선택되는 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 결합 분자.
21. 제19항에 있어서, Fc 도메인이 EU 넘버링을 기초로 잔기 222 내지 237에서 IgG1 분자를 절단할 수 있는 프로테아제에 의한 단백질 가수분해에 대하여 저항성이 있는 것을 특징으로 하는, 결합 분자.
22. 제21항에 있어서, Fc 도메인이 야생형 IgG1에 비하여, MMP-3, MMP-7, MMP-12, MMP-13, HNE, 플라스민, 카텝신 G, 펩신, IdeS 또는 GluV8에 의한 분해에 대하여 저항성이 있는 것을 특징으로 하는, 결합 분자.
23. 제19항에 있어서, 결합 도메인이 항체의 파라토프(paratope)를 함유하는 도메인; 효소; 호르몬; 수용체; 사이토카인; 면역 세포 표면 항원; 및 부착 분자로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 결합 분자.
24. 제23항에 있어서, 분자가 둘 이상의 표적 결합 도메인을 포함하며, 친화력(avidity)을 나타내는 것을 특징으로 하는, 결합 분자.
25. 제24항에 있어서, 결합 도메인이 종양 세포 또는 종양 맥관 구조 상의 항원에 결합하는 항체의 파라토프를 포함하는 것을 특징으로 하는, 결합 분자.
26. 제25항에 있어서, 결합 분자가 CD20, ErbB1, ErbB2, ErbB3, VEGF, RON 및 조직 인자 중 하나에 결합하는 것을 특징으로 하는, 결합 분자.
27. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 Fc-함유 분자; 또는 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 분자를 포함하는, 원치않는 세포의 증식 또는 이동을 특징으로 하는 질환의 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 질환은 악성 질환, 섬유성 질환(fibrotic disease) 또는 원치않는 혈관신생을 특징으로 하는 질환으로서, 악성 종양, 백혈병, 급성 백혈병, 급성 림프모구성 백혈병(ALL), B-세포, T-세포 또는 FAB ALL, 급성 골수성 백혈병(AML), 만성 골수성 백혈병(CML), 만성 림프구성 백혈병(CLL), 모발 세포 백혈병, 골수형성이상증후군(MDS), 림프구증식 질환, 피부 T-세포 림프종, 호지킨병, 캐슬만병, 신경아교종, 교모세포종, 별아교세포종, 악성 림프종, 비호지킨 림프종, 버킷 림프종, 다발성 골수종, 카포시 육종, 대장암종, 췌장암종, 신세포 암종, 유방암, 도관암종, 지방종, 비인두암종, 전립선암, 고환암, 난소암, 망막모세포종, 악성 조직구증, 악성 고칼슘혈증, 형질세포종, 연골육종, 육종, 메르켈 세포암, 간세포 암종, 간암, 기저세포암, 선암종, 편평 세포 암종, 흑색종, 전이성 흑색종, 혈관종, 전이 질환, 골육종, 횡문근육종, 흉선종 및 흉선암종, 암 관련 골흡수, 자궁내막암, 질암, 자궁암, 빌름스 종양, 암 관련 뼈 통증, 류마티스 질환, 건선, 경피증, 맥관종, 맥관섬유종, 혈관 변형, 죽상동맥경화증, 유착증 및 고유 경화증(edemic sclerosis), 각막 이식 후의 신혈관형성, 신혈관형성 녹내장, 당뇨병성 망막병증, 혈관신생 각막 질환, 황반변성, 익상편, 망막 변성, 수정체후 섬유증식증, 과립성 결막염, 관절염, 모세관확장증, 화농성 육아종, 지루성피부염, 정맥성 궤양, 여드름, 주사(rosacea), 사마귀(warts, verrucas), 습진, 혈관종 및 림프관신생 중에서 선택되는, 약제학적 조성물.
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32. 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항의 Fc-함유 분자; 또는 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항의 결합 분자를 포함하는, 감염 치료용 약제학적 조성물.
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