CN104177496B - 人IgG2抗体铰链区修饰体 - Google Patents

Abstract

本发明描述了一种铰链区修饰的重组人IgG2抗体，所述抗体重链铰链区缺失Glu216Arg217Lys218位氨基酸，且在Cys219和/或Cys220含有氨基酸的替换和/或删除。本发明另一方面还提供一种增强重组人IgG2抗体抗蛋白酶水解作用的方法。本发明所提供的IgG2型抗体消除了抗体铰链区二硫键引起的异质性，且具有增强的抗蛋白酶水解作用。

Description

人IgG2抗体铰链区修饰体

技术领域

本发明涉及抗体领域，更具体地，涉及一种重组人IgG2抗体铰链区修饰体，所述修饰体的铰链区特定位点的氨基酸残基被删除和/或替换。

背景技术

在开发抗体类药品时，其物理性质，尤其是均一性和稳定性极为重要。关于IgG2亚型，有人报道了由抗体铰链区的二硫键带来的异质性。如Amgen公司开发的靶向RANKL(核因子κB受体活化因子配体)的全人源单克隆抗体Denosumab，它是一种IgG2抗体，同许多血浆分离的天然IgG2亚型抗体一样，它存在三种形式的异构体IgG2-A、IgG2-A/B和IgG2-B，而导致终产品的非均一性（Wypych J等, J Biol Chem, 2008,283:29266-29272）。而抗体分子中重链、轻链间所含半胱氨酸残基(Cys)形成二硫键的配对方式、错配或配对不完全都会影响它对抗原的识别，会导致抗体与抗原的结合力下降甚至活性丧失。因而，抗体药物开发时应尽可能减少由二硫键所致异质性因素，获得均一性产物。

人免疫球蛋白各亚型间的恒定区的同源性高达95%以上，但铰链区序列长度及Cys残基的个数明显不同，IgG2铰链区由12个氨基酸组成，包含4个Cys残基，更特别的是，它有两个连续的Cys位点，Cys219和Cys220。IgG2的上游铰链区较IgG1少3个氨基酸，且 220位的Ser被Cys替换。此外，相对于IgG1，IgG2的重链(HC) CH1区域中131位Ser亦被Cys替换（由EU索引残基编码系统编码），Cys131通常与轻链(LC) Cys214配对形成二硫键。RP-HPLC分析IgG1和IgG2型的人源化单克隆抗体，IgG1呈单一峰，而IgG2则出现三个峰，可知IgG2抗体的异质性源于其一级结构的差异性，更具体地讲，由于IgG2抗体HC的Cys131、LC的Cys214以及上游铰链区的Cys219和Cys220之间可形成三种不同的分子间或分子内二硫键的配对方式，导致产生三种异构体，其中IgG2-A型的LC的Cys214仅与HC CH1域内Cys-131形成分子间二硫键（图1-1）；IgG2-B的LC Cys214和上游铰链区的Cys219形成分子间二硫键，CH1域内Cys131与HC 的Cys220形成分子内二硫键（图1-3）；而IgG2-A/B是两种异构体的中间体形式（图1-2）。将以上几个位点的Cys突变为Ser，如Cys131Ser、Cys219Ser、Cys220Ser和Cys219Ser/Cys220Ser几种突变体，毛细管凝胶电泳结果显示，图谱均呈现单一峰，且它们与Fcγ受体、FcRn受体或C1q的结合能力与野生型IgG2没有明显差异，抗体的结合亲和力也未受影响（Sandra Lightle等, Protein Science, 2010,19:753-762）。

另外，虽然IgG2较其他几种亚型的抗体，如IgG1的抗蛋白酶水解作用要强许多，但是依然存在被某些蛋白酶降解的可能，其铰链区所含三个氨基酸位点Glu216Arg217Lys218 (EU索引氨基酸残基编码系统)，是潜在的蛋白酶酶切位点，如内肽酶Glu-C切在Glu216之后，纤溶酶和胰蛋白酶酶切在Arg217或Lys218之后，Xa因子和内肽酶Arg-C切在Arg217之后，凝血酶和内肽酶Lys-C切在Lys218之后。这些潜在的蛋白酶水解位点，增加了IgG2型抗体对蛋白酶的水解作用的敏感性，稳定性降低。

上游铰链区（Upper hinge）是抗体Fab段和Fc段之间的柔性肽接头，允许Fab段绕其对称轴灵活转动，因而上游铰链区的氨基酸修饰，会改变铰链区的长度、区段柔性（segmental flexibility）以及抗体Fab段与Fc段间的相互作用，继而影响抗体与Fc受体的结合以及识别抗原的能力。IgG2抗体铰链区仅含12个氨基酸，且铰链区缺乏甘氨酸残基、并包含刚性的聚脯氨酸双螺旋，并通过额外的重链间二硫键来稳定。这些特性限定了IgG2分子的柔性，IgG2的柔性是4种IgG亚型中最低的。因而，本领域技术人员不会认真考虑将IgG2抗体上游铰链区截短的突变形式。我们创造性地将Glu216Arg217Lys218 (EU索引氨基酸残基编码系统)三个潜在的蛋白酶酶切位点删除、同时将上游铰链区Cys219和/或Cys220两个氨基酸进行替换或删除，获得了均一、稳定的IgG2抗体产物，同时抗体的抗原结合力和与受体的作用不受影响，这个技术效果是超出本领域技术人员预期的。

发明内容

本发明目的在于提供一种铰链区修饰的重组人IgG2抗体，所述抗体铰链区特定位点的一个或多个氨基酸被删除和/或替换，以获得均一、稳定的产品。本发明另一方面还提供一种增强重组人IgG2抗体抗蛋白酶水解作用的方法。本发明中所提及的氨基酸位点序号均按EU索引编码系统确定。

在本发明的一个方面，提供了一种铰链区修饰的重组人IgG2抗体，由轻链与含铰链区的重链组成，所述重链铰链区缺失Glu216Arg217Lys218位氨基酸，且在Cys219和/或Cys220含有氨基酸的取代/替换和/或删除/缺失，使得轻链C末端的半胱氨酸Cys214残基仅与重链非铰链区的Cys131形成分子间二硫键。

进一步地，所述Cys219和Cys220可被Ser或Thr取代/替换。

本发明所提供一种铰链区修饰的重组人IgG2抗体为野生型抗RANKL的IgG2抗体Denosumab（商品名为Prolia）的突变体，所述野生型抗RANKL的IgG2抗体的突变体的重链铰链区缺失Glu216Arg217Lys218位氨基酸，且在Cys219和/或Cys220含有氨基酸的替换和/或删除。其中，野生型抗RANKL的IgG2抗体的重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示，轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。铰链区未经修饰的野生型抗RANKL的IgG2抗体Denosumab，其铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

进一步地，本发明提供的突变体1，即野生型抗RANKL的IgG2抗体的重链铰链区Glu216Arg217Lys218Cys219Cys220被删除，其铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。图2-1为其铰链区二硫键配对方式的2D结构。其重链氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，见图3-1，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示，见图3-2。

本发明提供的突变体2，即野生型抗RANKL的IgG2抗体的重链铰链区Glu216Arg217Lys218Cys219被删除，其铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示，图2-2为其铰链区二硫键配对方式的2D结构。

本发明提供的突变体3，即野生型抗RANKL的IgG2抗体的重链铰链区Glu216Arg217Lys218Cys220被删除，其铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示，图2-3为其铰链区二硫键配对方式的2D结构。

本发明提供的突变体4，即野生型抗RANKL的IgG2抗体的重链铰链区Glu216Arg217Lys218被删除，且Cys219和Cys220被替换为Ser，其铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，图2-4为其铰链区二硫键配对方式的2D结构。

本发明提供的突变体5，即野生型抗RANKL的IgG2抗体的重链铰链区Glu216Arg217Lys218被删除，且Cys219被替换为Ser，其铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示，图2-5为其铰链区二硫键配对方式的2D结构。

本发明提供的突变体6，即野生型抗RANKL的IgG2抗体的重链铰链区Glu216Arg217Lys218被删除，且Cys220被替换为Ser，其铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示，图2-6为其铰链区二硫键配对方式的2D结构。

本发明提供的突变体7，即野生型抗RANKL的IgG2抗体的重链铰链区Glu216Arg217Lys218Cys219被删除，且Cys220被替换为Ser，其铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO：12所示，图2-7为其铰链区二硫键配对方式的2D结构。

本发明提供的突变体8，即野生型抗RANKL的IgG2抗体的重链铰链区Glu216Arg217Lys218Cys220被删除，且Cys219被替换为Ser，其铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示，图2-8为其铰链区二硫键配对方式的2D结构。

进一步地，本发明提供了编码权利要求4所述铰链区修饰的重组人IgG2抗体的分离核酸。

进一步地，本发明提供了含有上述核酸的表达载体。

进一步地，本发明提供了用上述表达载体转染的宿主细胞。

进一步地，提供了一种药物组合物，含有上述抗体和药物学上可接受的载体。

进一步地，提供了所述药物组合物的用途，优选该药物组合物用于调节OPG（骨保护蛋白）/RANKL/RANK系统，来治疗骨代谢疾病，如老年化、激素治疗和绝经后妇女的骨质疏松症以及骨转移和炎症引起的骨侵蚀等。

根据本发明的再一个方面，本发明提供了一种提高重组人IgG2抗体抗蛋白酶水解作用的方法，所述方法在于将重链铰链区Glu216Arg217Lys218位氨基酸删除/缺失。

附图说明

图1-1、野生型IgG2异构体IgG2-A二硫键配对方式的2D结构示意图。

图1-2、野生型IgG2异构体IgG2-A/B二硫键配对方式的2D结构示意图。

图1-3、野生型IgG2异构体IgG2-B二硫键配对方式的2D结构示意图。

图2-1、突变体1铰链区的二硫键配对方式的2D结构示意图。

图2-2、突变体2铰链区的二硫键配对方式的2D结构示意图。

图2-3、突变体3铰链区的二硫键配对方式的2D结构示意图。

图2-4、突变体4铰链区的二硫键配对方式的2D结构示意图。

图2-5、突变体5铰链区的二硫键配对方式的2D结构示意图。

图2-6、突变体6铰链区的二硫键配对方式的2D结构示意图。

图2-7、突变体7铰链区的二硫键配对方式的2D结构示意图。

图2-8、突变体8铰链区的二硫键配对方式的2D结构示意图。

图3-1、突变体1的重链氨基酸序列。

图3-2、突变体1的轻链氨基酸序列。

图4-1、直接法ELISA测定HRP标记的Denosumab与RANKL抗原结合能力。

图4-2、间接法ELISA测定野生型Denosumab与AB4与抗原结合亲和力比较。

图5、竞争法ELISA测定野生型Denosumab与AB4与抗原结合亲和力大小。

图6-1、野生型Denosumab抗体的RP-HPLC图谱。

图6-2、AB4抗体的RP-HPLC图谱。

图7、SDS-PAGE电泳分析Denosumab与AB4抗体的抗胰蛋白酶水解能力。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

以下实施例仅选取重链铰链区Glu216/Arg217/Lys218/Cys219/Cys220被删除的抗RANKL抗体突变体进行描述，其命名为AB4，其铰链区氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。其它几种突变体在下述实验中的方法及结果与AB4一致，在此不再赘述。

实施例1、野生型Denosumab与AB4与抗原结合亲和力测定

首先用直接ELISA法检测HRP标记的Denosumab抗体与抗原的结合能力。首先，以辣根过氧化物酶(HRP, Boehringer Ingelheim) 标记抗人RANKL的抗体Denosumab(Amgen)作为试剂(350μg/mL)，按比例进行梯度稀释。用与鼠IgG Fc融合的抗原RANKL-mFc (100 μl, 0.5μg/mL)包被酶标板(Corning)，室温过夜。弃去包被溶液，用溶解在PBS的脱脂奶封闭各孔0.5小时，再用含0.05% Tween-20的PBS洗孔。然后每孔加入50μl不同浓度的HRP标记的抗体Denosumab，反应1小时后，再用含0.05% Tween-20的PBS洗孔。最后用酶标仪（Thermo Fisher）在450nm和620nm双波长下，读取各孔的OD值。图4-1中表明HRP标记的Denosumab与RANKL抗原结合。

再用间接ELISA法比较AB4与野生型Denosumab抗体与抗原的结合亲和力。首先，用与鼠IgG Fc融合的抗原RANKL-mFc (100 μl, 0.5μg/mL)包被酶标板，室温过夜。弃去包被溶液，用溶解在PBS的脱脂奶封闭各孔0.5小时，再用含0.05% Tween-20的PBS洗孔。然后每孔加入50 μl AB4，反应1小时后，再用含0.05% Tween-20的PBS洗孔，再加入HRP标记的鼠抗人IgG Fc的二抗（Jackson，1：10000稀释），反应0.5小时后，用含0.05% Tween-20的PBS洗孔。以野生型Denosumab抗体和缓冲液作为阳性和阴性对照，其中待测抗体和对照抗体初始浓度为10μg/mL，然后按1:2比例进行梯度稀释。最后用酶标仪在450nm和620nm双波长下，读取各孔的OD值。图4-2中表明AB4和Denosumab都与抗原RANKL-mFc结合，且结合能力相当。

实施例2、与野生型Denosumab抗体的竞争结合测定

以HRP标记抗人RANKL的抗体Denosumab作为试剂(初始浓度350μg/mL，1:1000稀释)。用与鼠IgG Fc融合的抗原RANKL-mFc (100 μl, 0.5μg/mL)包被酶标板，室温过夜。弃去包被溶液，用溶解在PBS的脱脂奶封闭各孔0.5小时，再用含0.05%吐温Tween-20的PBS洗孔。然后每孔加入50 μl AB4与50μl HRP标记的抗体Denosumab (250ng/mL)的混合液，反应1小时后，再用含0.05%吐温-20(Tween-20)的PBS洗孔。以未标记的Denosumab和含抗另一种抗原的非相关抗体作为阳性与阴性对照，其中待测抗体和对照抗体初始浓度为30μg/mL，然后按1：2比例进行梯度稀释。最后用酶标仪在450nm和620nm双波长下，读取各孔的OD值。图5中表明AB4和Denosumab与抗原RANKL-mFc的结合表位一致，可竞争结合抗原。

实施例3、RP-HPLC分析野生型Denosumab抗体与AB4抗体的异质性

采用RP-HPLC分析AB4抗体与对照抗体即野生型Denosumab抗体的二硫键带来的异质性。采用伍丰HPLC LC100型高效液相色谱仪，配备P100 高压恒流泵与UV100紫外检测器和WS100色谱工作站。

分子筛HPLC色谱条件：凝胶色谱柱TSK gel G3000 SWXL（7.8mm×300mm）（TOSOH公司，Cat No. 0008541）；流动相：100mM 磷酸钠、500mM 氯化钠、5%乙醇，pH 7.0；流速：0.5mL/min；柱温：25°C；进样量：20μl。

RP-HPLC条件：Sephasil Peptide C8层析柱（4.6mm×250mm, 5μm，Pharmacia Biotech公司）；流动相A：0.1%三氟乙酸水溶液；流动相B：70%异丙醇、20%乙腈、0.1%三氟乙酸。柱温：25°C；进样量：20μl；流速：1mL/min。

如图6-1中所示，对照抗体野生型Denosumab抗体表现出异质性，呈现多个峰；而图6-2中，AB4抗体则呈均一性，只有单一峰。

实施例4、体外酶解法测定野生型Denosumab与AB4的抗胰蛋白酶水解能力

将100ul 的1.0mg/mL AB4和Denosumab抗体分别用2.5 mg/mL（40000 U/mL）的胰蛋白酶在37℃水浴中水解18小时，同时设置两个对照组，无关对照抗体AB2（Rituxan）和胰蛋白酶对照组（泳道1-4）；以在同样条件下，未被胰蛋白酶水解的抗体样品作为阴性对照（泳道6-8）。按上述条件处理各样品18小时后，用非还原SDS-PAGE电泳检测水解产物。各组在图7中的泳道位置及上样量表示在表1中，其中泳道5为蛋白Marker（NEB，CatNo.26630）。如图7所示，Denosumab抗体（泳道4）较AB4抗体（泳道3）在胰蛋白酶水解18小时后，电泳条带更杂、更为弥散，表明其降解产物较多，即抗胰蛋白酶水解作用不及铰链区修饰的AB4抗体。

表1：SDS-PAGE电泳样品泳道编号及上样量

虽然说明并描述了本发明的优选例，应理解本领域的技术人员可根据本文的教导，作出各种改变，这些改变不违背本发明的范围。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110>  安源生物科技（上海）有限公司

 

<120>  人IgG2抗体铰链区修饰体

 

<130>  2014

 

<160>  13   

 

<170>  PatentIn version 3.3

 

<210>  1

<211>  122

<212>  PRT

<213>  抗RANKL野生型抗体重链可变区氨基酸序列

 

<400>  1

 

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1                  5                      10                      15     

 

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

               20                     25                      30         

 

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

          35                     40                     45             

 

Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

     50                     55                      60                 

 

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                      70                     75                      80 

 

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                   85                      90                      95     

 

Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp

             100                     105                    110        

 

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

         115                    120        

 

<210>  2

<211>  108

<212>  PRT

<213>  抗RANKL野生型抗体轻链可变区氨基酸序列

 

<400>  2

 

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1                  5                      10                      15     

 

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg

               20                     25                      30         

 

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

          35                     40                      45             

 

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

     50                      55                     60                 

 

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65                      70                     75                      80 

 

Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

                   85                      90                     95     

 

Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

              100                    105            

 

<210>  3

<211>  12

<212>  PRT

<213>  抗RANKL野生型抗体重链铰链区氨基酸序列

 

<400>  3

 

Glu Arg Lys Cys Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1                  5                      10       

 

<210>  4

<211>  7

<212>  PRT

<213>  突变体1的铰链区氨基酸序列

 

<400>  4

 

Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1                  5          

 

<210>  5

<211>  443

<212>  PRT

<213>  突变体1重链氨基酸序列

 

<400>  5

 

Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1                  5                      10                      15     

 

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr

               20                     25                      30          

 

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

          35                     40                      45             

 

Ser Gly Ile Thr Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

     50                      55                     60                  

 

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr

65                      70                     75                      80 

 

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

                    85                     90                      95     

 

Ala Lys Asp Pro Gly Thr Thr Val Ile Met Ser Trp Phe Asp Pro Trp

              100                     105                    110        

 

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro

         115                     120                    125            

 

Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg Ser Thr Ser Glu Ser Thr

     130                    135                    140                

 

Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr

145                    150                     155                    160

 

Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro

                   165                    170                     175   

 

Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr

              180                    185                     190        

 

Val Pro Ser Ser Asn Phe Gly Thr Gln Thr Tyr Thr Cys Asn Val Asp

         195                     200                    205            

 

His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Thr Val Val Glu Cys Pro

     210                    215                    220                

 

Pro Cys Pro Ala Pro Pro Val Ala Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

225                    230                    235                     240

 

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

                   245                    250                    255    

 

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

              260                    265                     270        

 

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

         275                     280                    285            

 

Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

     290                    295                    300                 

 

Val His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

305                    310                    315                     320

 

Asn Lys Gly Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr Lys

                   325                    330                     335    

 

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu

              340                    345                     350        

 

Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

         355                     360                    365            

 

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

     370                    375                    380                

 

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Met Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

385                    390                    395                     400

 

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

                   405                    410                     415    

 

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

              420                    425                    430        

 

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

         435                     440            

 

<210>  6

<211>  215

<212>  PRT

<213>  突变体1轻链氨基酸序列

 

<400>  6

 

Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly

1                  5                      10                      15     

 

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Gly Arg

               20                     25                      30          

 

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

          35                     40                      45             

 

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser

     50                      55                     60                  

 

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu

65                      70                     75                      80 

 

Pro Glu Asp Phe Ala Val Phe Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Ser Ser Pro

                   85                      90                      95     

 

Arg Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

              100                     105                    110        

 

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

         115                     120                    125            

 

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

     130                    135                    140                

 

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser

145                    150                    155                     160

 

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

                   165                    170                     175    

 

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

              180                    185                     190        

 

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

         195                     200                    205            

 

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

     210                    215

 

<210>  7

<211>  8

<212>  PRT

<213>  突变体2的铰链区氨基酸序列

 

<400>  7

 

Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1                  5              

 

<210>  8

<211>  8

<212>  PRT

<213>  突变体3的铰链区氨基酸序列

 

<400>  8

 

Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1                  5              

 

 

<210>  9

<211>  9

<212>  PRT

<213>  突变体4的铰链区氨基酸序列

 

<400>  9

 

Ser Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1                  5                  

 

<210>  10

<211>  9

<212>  PRT

<213>  突变体5的铰链区氨基酸序列

 

<400>  10

 

Ser Cys Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1                  5                  

 

<210>  11

<211>  9

<212>  PRT

<213>  突变体6的铰链区氨基酸序列

 

<400>  11

 

Cys Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1                  5                  

 

<210>  12

<211>  8

<212>  PRT

<213>  突变体7的铰链区氨基酸序列

 

<400>  12

 

Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1                  5              

 

<210>  13

<211>  8

<212>  PRT

<213>  突变体8的铰链区氨基酸序列

 

<400>  13

 

Ser Val Glu Cys Pro Pro Cys Pro

1                  5              

 

 

Claims (11)

1.一种铰链区修饰的重组人IgG2抗体，由轻链与含铰链区的重链组成，其特征在于，所述重链铰链区缺失根据EU索引编号系统确定的Glu216Arg217Lys218位氨基酸，且在Cys219和/或Cys220含有氨基酸的替换和/或删除。

2.一种铰链区修饰的重组人IgG2抗体，由轻链与含铰链区的重链组成，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其特征在于，所述重链铰链区缺失根据EU索引编号系统确定的Glu216Arg217Lys218位氨基酸，且在Cys219和/或Cys220位的氨基酸以选自下组的方式被删除和/或替换：

（i）所述重链铰链区Cys219被删除；

（ii）所述重链铰链区Cys220被删除；

（iii）所述重链铰链区Cys219被替换为Ser；

（iv）所述重链铰链区Cys220被替换为Ser。

3.一种铰链区修饰的重组人IgG2抗体，由轻链与含铰链区的重链组成，其重链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:1，轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID NO:2，其特征在于，所述重链铰链区缺失根据EU索引编号系统确定的Glu216Arg217Lys218位氨基酸，且在Cys219和/或Cys220位的氨基酸以选自下组的方式被删除和/或替换：

（i）所述重链铰链区Cys219和Cys220位氨基酸被删除；

（ii）所述重链铰链区Cys219和Cys220被替换为Ser；

（iii）所述重链铰链区Cys219被删除，且Cys220被替换为Ser；

（iv）所述重链铰链区Cys219被替换为Ser，且Cys220被删除。

4.编码如权利要求2或3所述的铰链区修饰的重组人IgG2抗体的核酸。

5.一种载体，包含如权利要求4所述的核酸。

6.一种真核宿主细胞，其包含如权利要求5所述的载体，或者其用如权利要求5所述的载体转染。

7.如权利要求6所述的真核宿主细胞，其为CHO细胞。

8.一种药物组合物，其特征在于，该组合物含有如权利要求2或3所述的铰链区修饰的重组人IgG2抗体以及药物学上可接受的载体。

9.如权利要求8所述的药物组合物在制备用于治疗骨代谢疾病的药物中的用途。

10.如权利要求9所述的用途，其中骨代谢疾病包括老年化、激素治疗和绝经后妇女的骨质疏松症以及骨转移和炎症引起的骨侵蚀。

11.一种提高重组人IgG2抗体抗蛋白酶水解作用的方法，其特征在于，将所述重组人IgG2抗体的重链铰链区根据EU索引编号系统确定的Glu216Arg217Lys218位氨基酸删除或替换。