CN102711449A

CN102711449A - 生产重链抗体的小鼠

Info

Publication number: CN102711449A
Application number: CN2010800618127A
Authority: CN
Inventors: L·麦克唐纳; S·史蒂文斯; A·J·莫菲
Original assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Regeneron Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2009-12-10
Filing date: 2010-12-10
Publication date: 2012-10-03
Anticipated expiration: 2030-12-10
Also published as: CA2782936C; IL257822B; JP2017140058A; HK1220865A1; CY1121608T1; CY1118163T1; ES2724975T3; PT2509409T; HRP20190820T1; RU2012128856A; CN110079550A; CN102711449B; LT2954779T; US20150196015A1; KR20130055556A; IL237819A; US20110145937A1; CN104131035A; JP6615830B2; US20150197555A1

Abstract

提供了遗传修饰的非人动物及用于产生和使用其的方法和组合物，其中的遗传修饰包括在IgG、IgA、IgD和/或IgE的免疫球蛋白恒定区CH1基因内的删除（可选的在铰链区内的删除），其中小鼠能够表达功能性IgM。描述了经遗传修饰的小鼠，包括具有功能性IgM基因并修饰为在不是IgM的重链恒定结构域（例如，在IgG重链恒定结构域中）中具有CH1结构域及铰链区的删除的小鼠。提供了经遗传修饰的小鼠，其产生人可变区/小鼠恒定区嵌合重链抗体（缺少轻链的抗体）、完全小鼠重链抗体或完全人重链抗体。

Description

生产重链抗体的小鼠

发明领域

本发明的领域为生产重链抗体的遗传修饰的非人动物，尤其是在其编码免疫球蛋白γ（IgG）基因的CH1结构域（或CH1结构域及铰链区）的序列内包含核苷酸序列删除却能够表达不缺少功能性CH1结构域的IgM的遗传修饰的非人动物，具体而言为能够产生野生型IgM分子（即，具有CH1结构域）但产生不含功能性CH1结构域（或CH1结构域以及铰链区）的重链IgG抗体的小鼠。

发明背景

在大多数动物中，正常的免疫球蛋白重链只在与其同源轻链相偶联时会有很好的表达。在人类中，单独的重链发现于重链疾病中，这些疾病的表征为重链功能失调，其缺少可变重链、CH1或可变重链及CH1结构域的序列。不含轻链的重链可见于鱼的特定物种以及骆驼中。这些重链缺少功能性CH1结构域并且在其重链可变结构域中具有非人的特征。已有人尝试通过修饰小鼠以表达模拟骆驼或鱼的特定物种中发现的VHH结构域的骆驼化基因而产生骆驼化抗体，部分地通过移除IgM和IgG的CH1结构域并使重链可变区的构象变为与骆驼和/或特定鱼物种类似。然而，预期骆驼化抗体可诱导非骆驼动物中产生免疫应答。

本领域有对遗传修饰的非人动物的需要，其可用于产生具有非骆驼VH结构域的重链抗体。

附图简述

图1示例说明了小鼠中的野生型IgG1基因座（locus）（IgG1，上图），显示了JH区域基因片段，其融合至CH1基因片段，其后为铰链区域、CH2基因片段及CH3基因片段；由删除CH1结构域的构建体靶向的IgG1位点（IgG1ΔCH1，中图）；由删除CH1结构域及铰链区域的构建体靶向的IgG1位点（IgG1ΔCH1-Δhinge，下图）。

图2示例说明了靶向小鼠IgG1基因以产生表达缺少CH1结构域的IgG1的经遗传修饰的基因座。

图3示例说明了靶向小鼠IgG1基因以产生表达缺少CH1结构域并缺少铰链区域的IgG1的经遗传修饰的基因座。

图4示例说明了靶向小鼠重链恒定区基因座以产生表达缺少CH1结构域的IgG1而不表达IgG2b或IgG2a的经遗传修饰的基因座。

图5示例说明了由删除CH1结构域并删除铰链区且删除IgG2b基因及IgG2a基因的构建体靶向的小鼠重链恒定区。

图6示例说明了经遗传修饰的小鼠的重链恒定区，其具有缺少CH1结构域或缺少CH1结构域和铰链区的IgG1（上图），以及经遗传修饰的小鼠的重链恒定区，其具有缺少CH1结构域或缺少CH1结构域和铰链区的IgG1，且其缺少IgG2a基因并缺少IgG2b基因（下图）。

图7显示了对不同CHO细胞上清进行的Western印迹，其中CHO细胞分别经工程改造为独立地表达：对照（与小鼠Fc融合的细胞因子胞外域）、缺少CH1结构域的嵌合（人VR）/（小鼠Fc）重链抗体（hVR-mFcΔCH1）、缺少CH1结构域的骆驼化嵌合（人VR）/（小鼠Fc）重链抗体（hVR*-mFcΔCH1）、嵌合（人VR）/（小鼠Fc）重链抗体（hVR-mFc）、骆驼化嵌合（人VR）/（小鼠Fc）重链抗体（hVR*-mFc）、具有或不具有CH1结构域的mFc（分别为mFc和mFcΔCH1）。

图8显示了用抗小鼠IgG对来自野生型小鼠（左）及来自IgG1缺少CH1结构域且缺少铰链区的经遗传修饰的小鼠（杂合，右）的小鼠血清进行的还原性SDS-PAGE的Western印迹图像；提供了重链以及分子量标志物位置的示意图。

图9显示了来自野生型小鼠（WT）及来自四只IgG1缺少CH1结构域且缺少铰链区的经遗传修饰的小鼠（纯合；分别标记为HO 1、HO 2、HO 3、HO 4）的小鼠血清进行的非还原性SDS-PAGE的Western印迹图像，用抗小鼠IgG进行印迹；每只小鼠（WT或HO）都有两条泳道，泳道以上方的括号表示对应着每只动物血清的1:5及1:10稀释样品（对每只动物为从左到右的连续泳道）。

图10提供了正常IgG1抗体（左）及缺少CH1结构域并缺少铰链区的重链抗体的示意图。

图11显示了对野生型小鼠（WT）及包含缺少CH1结构域并缺少铰链区的IgG1的经遗传修饰的小鼠（HO；表达缺少CH1结构域并缺少铰链区的重链抗体的纯合小鼠）分别进行IgG1和IgG2b血清免疫球蛋白测定。对照为混合的人血清。

图12显示了扩增自小鼠（其在经修饰的内源小鼠重链基因座具有不含IgG1CH1及铰链区序列的小鼠重链基因序列）的脾RNA的11个独立RT-PCR克隆的蛋白质序列。B1=SEQ ID NO:19；B2=SEQ IDNO:21；B3=SEQ ID NO:23；B5=SEQ ID NO:25；D2=SEQ IDNO:27；D5=SEQ ID NO:29；D6=SEQ ID NO:31；E2=SEQ IDNO:33；E8=SEQ ID NO:35；E10=SEQ ID NO:37；F6=SEQ IDNO:39。小写字体的碱基表示由于重组过程中的突变和/或N添加产生的非种系碱基。点表示在序列中的人为缺口以使骨架区（FR）及互补决定区（CDR）之间能进行合适的比对，在序列上对骨架区和互补决定区有所标注。对每个克隆显示了内源IgG1（CH2）恒定区的CH2区域中的前九个氨基酸。

图13显示了扩增自小鼠（其在修饰的内源小鼠重链基因座具有不含IgG1 CH1区域序列的人重链基因序列）的脾RNA的7个独立RT-PCR克隆的蛋白质序列。A8=SEQ ID NO:51；C2=SEQ IDNO:53；D9=SEQ ID NO:55；C4=SEQ ID NO:57；H8=SEQ IDNO:59；A5=SEQ ID NO:61；A2=SEQ ID NO:63。小写字体的碱基表示由于重组过程中的突变和/或N添加产生的非种系碱基。点表示在序列中的人为缺口以使骨架区（FR）及互补决定区（CDR）之间能进行合适的比对，在序列上对骨架区和互补决定区有所标注。对每个克隆显示了内源IgG1（HINGE）恒定区的13个氨基酸铰链区的前七个氨基酸。

发明概述

提供了经遗传修饰的细胞、非人胚胎、非人动物及产生和使用其的方法，其中所述动物经遗传修饰为缺少免疫球蛋白G（IgG）的功能性CH1序列，任选的修饰为在经修饰的IgG上缺少功能性IgG铰链区，其中所述细胞、胚胎以及动物包含有功能性IgM CH1序列。在一些方面，所述小鼠包含一种或多种人免疫球蛋白重链可变区基因片段对一种或多种或全部内源小鼠免疫球蛋白重链可变区基因片段的取代。在一些方面，一种或多种人V、一种或多种人D以及一种或多种人J基因片段对所有内源小鼠V、D和J基因片段进行取代。

在一方面，提供了经遗传修饰的小鼠，其中遗传修饰包括对编码IgG恒定区的核苷酸序列的修饰，其中修饰引起IgG恒定区的CH1结构域的功能丢失。在一个实施方式中，引起功能丢失的修饰为编码CH1结构域的核苷酸序列的删除，或编码CH1结构域的核苷酸序列之内的删除。

在一个实施方式中，所述IgG选自IgG1、IgG2a、IgG2b及其组合。在一个实施方式中，所述IgG为IgG1。在一个实施方式中，所述IgG为IgG1、IgG2a以及IgG2b。

在一个实施方式中，所述修饰进一步包含编码含有所述CH1修饰的IgG的铰链区的核苷酸序列的删除。

在一个实施方式中，所述经遗传修饰的小鼠选自129种系、C57BL/6种系以及129xC57BL/6杂交系。在一个特定实施方式中，所述小鼠为50%的129及50%C57BL/6。

在一个实施方式中，经遗传修饰的小鼠为129种系，选自129P1、129P2、129P3、129X1、129S1（如、129S1/SV、129S1/SvIm）、129S2、129S4、129S5、129S9/SvEvH、129S6（129/SvEvTac）、129S7、129S8、129T1、129T2（见，例如Festing等人（1999）Revised nomenclaturefor strain 129 mice,Mammalian Genome 10:836）。在一个实施方式中，经遗传修饰的小鼠为C57BL种系，在一个特定实施方式中选自C57BL/A、C57BL/An、C57BL/GrFa、C57BL/KaLwN、C57BL/6、C57BL/6J、C57BL/6ByJ、C57BL/6NJ、C57BL/10、C57BL/10ScSn、C57BL/10Cr、C57BL/Ola。在一个特定实施方式中，所述经遗传修饰的小鼠为前述129种系及前述C57BL/6种系的杂交系。在另一个特定实施方式中，所述小鼠为前述129种系间的杂交系或前述BL/6种系之间的杂交系。在一个特定实施方式中，所述杂交的129种系为129S6（129/SvEvTac）种系。

在一个实施方式中，小鼠包含一个或多个未重排的内源小鼠重链免疫球蛋白可变区（mVR）基因片段、其可操作地地连接于经修饰的IgG恒定区序列。在一个实施方式中，所述一个或多个mVR基因片段来自小鼠VH基因家族、选自VH1、VH3、VH5、VH7、VH14及其组合。在一个实施方式中，所述一个或多个mVR基因片段选自mVH1-26、1-42、1-50、1-58、1-72、3-6、5-6、7-1、14-2及其组合。

在一个实施方式中，所述小鼠包含重排的基因，其编码缺少功能性CH1区域的IgG重链中的FR1、FR2及FR3，其中FR1、FR2及FR3各自独立地与衍生自选自VH1、VH3、VH5、VH7及VH14基因家族的mVH种系序列的FR1、FR2和FR3有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在一个实施方式中，所述mVH种系序列选自1-26、1-42、1-50、1-58、1-72、3-6、5-6、7-1及14-2序列。

在一个实施方式中，小鼠包含衍生自选自DH 1-1、2-14、3-1、3-2、3-3、4-1及其组合的DH基因片段的CDR3。在一个实施方式中，小鼠CDR3包含由JH（即JH1、JH2、JH3或JH4）编码的序列。

在一个实施方式中，小鼠包含编码CDR3的重排的抗体序列，其衍生自DH 1-1、2-14、3-1、3-2、3-3、4-1及JH1、JH2、JH3、或JH4的重排。

在一个实施方式中，小鼠包含编码缺少功能性CH1区域的IgG重链的FR4的重排基因、其中FR4与通过DH1-1、2-14、3-1、3-2、3-3或4-1和JH1、JH2、JH3或JH4重排而编码的FR4有至少90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

在一个实施方式中，小鼠在内源小鼠重链可变区基因座包含非重排的人重链免疫球蛋白可变区（hVR）基因片段。在一个实施方式中，小鼠在内源小鼠重链可变区基因座包含可操作地连接于经修饰的IgG恒定区序列的非重排hVR基因片段。在一个实施方式中，hVR基因片段来自人VH基因家族，选自VH1、VH3、VH4及其组合。在一个实施方式中，所述一种或多种hVR基因片段选自1-2、1-8、1-18、1-46、1-69、3-21、3-72、及4-59。在一个具体的实施方式中，所述一种或多种hVR基因片段选自1-8、1-18和1-69。

在一个实施方式中，所有或几乎所有小鼠重链V基因片段由一种或多种人重链V基因片段所取代。在一个实施方式中，所有小鼠重链V和D基因片段都由一种或多种人重链V和D基因片段所取代。在一个实施方式中，所有小鼠重链V、D和J基因片段都由一种或多种人重链V、一种或多种人重链D及一种或多种重链J基因片段所取代。在这些实施方式中，人重链V和/或D和/或J基因片段处于小鼠内源重链基因座并可操作地连接于小鼠恒定区基因或经修饰的小鼠恒定区基因。

在一个实施方式中，小鼠包含编码缺少功能性CH1区域的IgG重链的FR1、FR2和FR3序列的核苷酸序列，其与来自1-8、1-18或1-69的人免疫球蛋白重链可变区基因片段的人种系核苷酸序列的FR1、FR2、和FR3有至少80%的同一性；其中不考虑小鼠和人序列的CDR序列将经修饰的小鼠的FR1+FR2+FR3序列与所引用的人种系序列进行优化对比（即，对FR进行优化对比，而不在比较中考虑任何CDR的氨基酸的同一性）。在特定的实施方式中，FR1、FR2和FR3与重链可变区基因片段为1-8、1-18或1-69基因片段的人种系核苷酸序列FR1+FR2+FR3有大约85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

在一个实施方式中，小鼠进一步包含FR4，其与由人D6-19/J6重排、D6-7/J4重排、D4-4/J4重排、D6-6/J2重排、D3-16/J6重排、D6-6/J4重排及D1-7/J4重排形成的FR4有至少80%的同一性。在特定的实施方式中，所述FR4与由上述D/J重排形成的FR4有大约85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。

在一个实施方式中，小鼠包含编码FR1的核苷酸序列，所述FR1的氨基酸序列与由选自V1-8、V1-18和V1-69的人重链可变区基因片段的种系序列编码的FR1相差不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个氨基酸。在一个具体的实施方式中，编码所述FR1的核苷酸序列为重排序列，其可操作地连接于编码缺少功能性CH1序列的IgG恒定区的序列。

在一个实施方式中，小鼠包含编码FR2的核苷酸序列，所述FR1的氨基酸序列与由选自V1-8、V1-18和V1-69的人重链可变区基因片段的种系序列编码的FR2相差不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个或不超过5个氨基酸。在一个具体的实施方式中，编码所述FR2的核苷酸序列为重排序列，其可操作地连接于编码缺少功能性CH1序列的IgG恒定区的序列。

在一个实施方式中，小鼠包含编码FR3的核苷酸序列，所述FR1的氨基酸序列与由选自V1-8、V1-18和V1-69的人重链可变区基因片段的种系序列编码的FR3相差不超过1个、不超过2个、不超过3个、不超过4个、不超过5个、不超过6个、不超过7个、不超过8个、不超过9个、不超过10个或不超过11个氨基酸。在一个具体的实施方式中，编码所述FR3的核苷酸序列为重排序列，其可操作地连接于编码缺少功能性CH1序列的IgG恒定区的序列。

在一个实施方式中，小鼠包含编码FR4的核苷酸序列，所述FR4的氨基酸序列与由选自人D6-19/J6、D6-7/J4、D4-4/J4、D6-6/J2、D3-16/J6、D6-6/J4和D1-7/J4的重排编码的FR4氨基酸序列相差不超过1个、不超过2个、不超过3个氨基酸。在一个具体的实施方式中，编码所述FR4的核苷酸序列为重排序列，其可操作地连接于编码缺少功能性CH1序列的IgG恒定区的序列。

在一个实施方式中，小鼠包含编码衍生自人重链D区域基因片段（hDH）的重链CDR3的核苷酸序列。在一个实施方式中，所述hDH选自D1-7、D3-16、D4-4、D6-6、D6-7和D6-19。

在一个实施方式中，小鼠包含编码衍生自人重链连接基因片段（JH）的重链CDR3的核苷酸序列。在一个特定的实施方式中，所述JH选自J2、J4及J6。

在一个实施方式中，小鼠包含由衍生自人DH和人JH重排的核苷酸序列编码的重链CDR3。在一个具体的实施方式中，所述CDR3衍生自D1-7/J4、D3-16/J6、D4-4/J4、D6-6/J2、D6-6/J4、D6-7/J4或D6-19/J6重排。

在一个实施方式中，小鼠包含hVR基因片段对内源mVR基因片段的取代。在一个具体的实施方式中，hVR基因片段对内源mVR基因片段的取代与经修饰的重链恒定区在同一个等位基因上。在另一个具体的实施方式中，hVR基因片段对mVR基因片段的取代与经修饰的重链恒定区在不同的等位基因上。

在一个实施方式中，90-100%的mVR基因片段由至少一种hVR基因片段所取代。在一个具体的实施方式中，所有或几乎所有内源mVR基因片段被至少一种hVR基因片段所取代。在一个实施方式中，取代为用至少18、至少39或至少80或81个hVR基因片段进行取代。在一个实施方式中，取代是用至少12个功能性hVR基因片段、至少25个功能性hVR基因片段或43个功能性hVR基因片段进行取代。

在一个实施方式中，经遗传修饰的小鼠包含转基因，其包含至少一个非重排hVR基因片段、至少一个非重排人D片段、至少一个非重排人J片段以及至少一种人重链恒定序列。在一个实施方式中，内源小鼠重链可变区和κ轻链可变区基因座发生功能性沉默。在一个具体的实施方式中，小鼠能够反式转换而产生嵌合人/小鼠抗体，其包含与小鼠IgG序列相邻的人重链可变结构域，所述小鼠IgG序列缺少功能性CH1结构域并且任选的缺少所述缺少功能性CH1结构域的IgG的铰链区。在一个具体的实施方式中，转基因进一步包含缺少CH1结构域的IgG序列，且任选的包含具有功能性CH1结构域的IgM。在一个进一步的具体的实施方式中，IgG序列缺少铰链区。

在一个实施方式中，小鼠包含第一个重链可变区等位基因和第二个重链可变区等位基因，其中第一个等位基因和第二个等位基因都源自相同的小鼠种系。在一个实施方式中，第一个等位基因来自第一种小鼠种系，第二个等位基因来自第二种小鼠种系。在一个实施方式中，第一和第二个等位基因的其中一个等位基因包含至少一个hVR对mVR的取代。在另一个实施方式中，两个等位基因都包含至少一个hVR对mVR的取代。

在一方面，提供了经遗传修饰的小鼠，其中小鼠表达包含CH1结构域的IgM，且此小鼠表达缺少功能性CH1结构域的IgG或表达缺少功能性CH1结构域并缺少功能性铰链区的IgG。

在一个实施方式中，所述IgG为IgG1.

在一个实施方式中，小鼠表达四种IgG，为：经修饰的IgG1及野生型IgG3、IgG2a和IgG2b。在另一个实施方式中，小鼠表达不超过两种IgG，为：经修饰的IgG1和野生型IgG3。在一个具体的实施方式中，小鼠表达的重链同种型为：野生型IgM、野生型IgD、野生型IgG3、修饰的IgG1、野生型IgG2a、野生型IgG2b、野生型IgA以及野生型IgE。在另一个具体的实施方式中，小鼠表达的重链同种型为：野生型IgM、野生型IgD、野生型IgG3、修饰的IgG1、野生型IgA及野生型IgE。在多个实施方式中，IgG1的修饰包含CH1结构域的删除，以及任选的，含有铰链区的删除。

在一个实施方式中，小鼠来自选自129、C56BL/6、129xC57BL/6杂交系的种系。

在一个方面，提供了表达重链抗体的小鼠，其中重链抗体主要由二聚重链构成，其中重链缺少功能性CH1结构域或缺少功能性CH1结构域和功能性铰链区，所述重链包含哺乳动物重链可变结构域（其包含与种系可变区基因编码的哺乳动物重链可变结构域不相同的序列），且所述重链包含人或小鼠的CH2结构域及人或小鼠的CH3结构域，其中小鼠表达野生型人或小鼠IgM。

在一个实施方式中，小鼠包含功能性免疫球蛋白轻链基因基因座。

在一个实施方式中，其中哺乳动物重链可变结构域为人或小鼠重链可变结构域。

在一个实施方式中，重链抗体主要由缺少功能性CH1结构域并缺少功能性铰链区的二聚体重链构成，其中重链包含人可变结构域（其包含至少一个体细胞突变并包含CH2结构域和CH3结构域）。在一个具体的实施方式中，CH2结构域和CH3结构域独立地选自小鼠和人结构域。在一个具体的实施方式中，CH2和CH3结构域都来自人；在另一个实施方式中，CH2和CH3结构域都是小鼠。

在一个方面，提供了重链抗体，其中重链抗体包含的重链含有非骆驼可变结构域和缺少CH1结构域的重链恒定区。

在一个实施方式中，重链抗体还缺少铰链区。

在一个实施方式中，重链抗体包含主要由铰链区、CH2结构域以及CH3结构域构成的恒定区。在另一个实施方式中，重链抗体包含主要由CH2结构域以及CH3结构域构成的恒定区。

在一个实施方式中，非骆驼的可变结构域为体细胞突变的人或小鼠重链可变结构域，获自来自小鼠或包含人重链可变区基因片段的经遗传修饰的小鼠的B细胞的编码IgM或IgG的核苷酸序列。在一个特定的实施方式中，小鼠包含人源化的重链可变区基因片段。在另一个实施方式中，小鼠包含至少一种人可变区基因片段对内源小鼠重链可变区基因片段基因座的取代。在另一个实施方式中，小鼠包含至少一种人可变区基因片段、至少一种人D基因片段及至少一种人J基因片段对内源小鼠重链片段基因座的取代。在一个具体的实施方式中，内源小鼠免疫球蛋白可变区基因座全部地或几乎全部由包含多个人V、D和J基因片段的人重链可变区基因座取代。

在一个实施方式中，非骆驼的可变结构域为人或小鼠可变结构域。在另一个实施方式中，非骆驼的可变结构域为包含一种或多种骆驼化修饰的人或小鼠可变结构域。在一个具体的实施方式中，骆驼化修饰选自L11S、V37F、G44E、L45C、L45R和W47G（Kabat编号）。在一个具体的实施方式中，骆驼化修饰选自V37F、G44E和L45C。在一个具体的实施方式中，重链可变结构域包含互补决定区3（CDR3），其包含两个半胱氨酸。

在一个实施方式中，重链抗体包含第一种重链（包含第一种重链可变结构域）和第二种重链（包含第二种重链可变结构域）的二聚体，其中第一种和第二种重链每种都缺少CH1结构域（或缺少CH1结构域和铰链区）。在一个实施方式中，二聚体的第一种重链的人可变结构域结合第一个表位，而二聚体的第二种重链的人可变结构域结合第二种表位，其中第一个和第二个表位不相同。在一个具体的实施方式中，第一种和第二种重链的重链可变结构域包含如本文所描述的人重链可变结构域及/或人重链FR区。

在一方面，提供了经遗传修饰的非人细胞，其中遗传修饰包括删除IgG CH1结构域，且细胞表达功能性IgM。在一个具体的实施方式中，细胞包含的IgM基因包含编码CH1结构域的序列。

在一个实施方式中，细胞选自非人ES细胞、多能细胞及全能细胞。在一个具体的实施方式中，非人ES细胞选自小鼠ES细胞及大鼠ES细胞。

在一方面，提供了经遗传修饰的非人胚胎，其中遗传修饰包括如本文所描述的修饰。在一个实施方式中，遗传修饰包括删除IgG CH1结构域，且非人胚胎表达功能性IgM。在一个具体的实施方式中，非人胚胎包含的IgM基因包含CH1结构域。

在一个实施方式中，非人胚胎为小鼠胚胎或大鼠胚胎。

在一方面，提供了包含供体细胞的非人胚胎，其中供体细胞是经遗传修饰的，且其中遗传修饰为本文描述的修饰。在一个实施方式中，遗传修饰包括删除IgG CH1结构域，且细胞包含的IgM基因包含CH1结构域。

在一个实施方式中，非人胚胎为小鼠胚胎或大鼠胚胎，供体细胞分别为小鼠ES细胞或大鼠ES细胞。

在一方面，提供了DNA构建体。其中DNA构建体包含（a）同源于第一条序列5’并紧紧邻近于IgG CH1区域起始处的小鼠同源臂；（b）标记物或药物选择盒；以及（c）同源于第二条序列3’并紧紧邻近于IgGCH1区末端的小鼠同源臂或备选地，同源于第二条序列3’并紧紧邻近于IgG铰链区域末端的同源臂。

在一方面，提供了用于产生缺少CH1结构域的抗体的方法，包括（a）对如本文所描述的非人动物进行免疫，所述动物在IgG中缺少功能性CH1结构域或在IgG中缺少功能性CH1结构域且缺少功能性铰链区，其中小鼠表达包含功能性CH1结构域的IgM；（b）将所述非人动物维持在足以使非人动物产生抗体的条件下；（c）鉴定由缺少功能性CH1结构域或缺少功能性铰链区的小鼠产生的抗体；以及（d）从小鼠中分离抗体、产生抗体的细胞或编码抗体序列的核苷酸序列。

在一个实施方式中，非人动物包含功能性的免疫球蛋白轻链基因基因座。

在一个方面，提供了用于对小鼠重链抗体进行人源化的方法，包括用目的抗原免疫产生重链抗体的经遗传修饰的小鼠，使得小鼠不断产生（mount）免疫应答，鉴定小鼠B细胞中编码的小鼠VH区域（其中B细胞特异性结合目的抗原）以及对VH区域进行人源化。

在一个实施方式中，产生重链抗体的经遗传修饰的小鼠为如本文描述的小鼠。在一个实施方式中，小鼠包含可操作地连接于重链恒定基因座的至少一种mVR基因片段，该重链恒定区基因座包含完整的IgM基因并包含缺少CH1结构域或缺少CH1结构域并缺少铰链结构域的IgG基因。在一个实施方式中，IgG基因为IgG1基因。在一个实施方式中，IgG基因选自IgG1、IgG2A、IgG2B、IgG3及其组合。

在一个实施方式中，所述方法进一步包括将编码人源化VH区域的核苷酸序列克隆至人免疫球蛋白恒定区的核苷酸序列上。

在一个实施方式中，小鼠mVR基因片段来自小鼠VH基因家族，其选自VH1和VH14，并且人源化过程包括用来自人VH1基因的骨架取代小鼠骨架VH1或VH14。在一个实施方式中，人VH1基因选自1-2、1-3、1-8、1-17、1-18、1-24、1-45、1-46、1-58和1-69。在特定的实施方式中，所述mVR基因为1-58基因且所述人基因为1-18基因；mVR基因为1-26基因且人基因为1-2基因；mVR基因为1-50基因且人基因为1-46基因；mVR基因为1-17基因且人基因为1-2基因；mVR基因为1-42基因且人基因为1-2基因；mVR基因为14-1基因且人基因为1-2基因；或mVR基因为14-2基因且人基因为1-2基因。

在一个实施方式中，mVR基因片段来自小鼠VH基因，其选自VH4、VH5、VH6、VH7、VH10、VH11以及VH13基因，并且人源化过程包括用来自人VH3基因的骨架取代小鼠骨架。在一个实施方式中，人VH3基因选自3-7、3-9、3-11、3-13、3-15、3-16、3-20、3-21、3-23、3-30、3-33、3-35、3-38、3-43、3-48、3-49、3-53、3-64、3-66、3-72、3-73和3-74。在一个特定的实施方式中，mVR基因为7-1基因且人基因为3-72基因；mVR基因为3-6基因且人基因为4-59基因；mVR基因为5-6基因且人基因为3-21基因。

在一个实施方式中，mVR基因片段来自小鼠VH基因家族，其选自VH3和VH12，并且人源化过程包括用来自人VH4基因的骨架取代小鼠骨架。在一个实施方式中，人VH4基因选自4-4、4-28、4-31、4-34、4-39、4-59和4-61。

在一个实施方式中，mVR基因片段来自小鼠VH4基因家族，并且人源化过程包括用来自人VH6基因的骨架取代小鼠VH4骨架。在一个实施方式中，人VH基因为6-1。

在一个实施方式中，mVR基因片段来自小鼠VH9基因家族，并且人源化过程包括用来自人VH7家族的人VH基因的骨架取代小鼠VH9骨架。在一个实施方式中，人VH6基因选自7-4-1和7-81。

在一个实施方式中，人源化过程进一步包括产生小鼠CDR中的一个或多个保守性或非保守性置换、一个或多个删除、和/或一个或多个插入，以使小鼠CDR能更密切地对应于人的CDR。

在一个实施方式中，人源化过程进一步包括产生人骨架区中的一个或多个保守性或非保守性置换、一个或多个删除、和/或一个或多个插入，以使人骨架区能更密切地对应于小鼠骨架区。

在一个方面，提供了经遗传修饰的小鼠，其包含功能性免疫球蛋白轻链基因，其中小鼠表达缺少轻链并缺少CH1区域或缺少CH1区域和铰链区的重链抗体。

在一个实施方式中，小鼠包含缺少编码CH1区域的序列或缺少编码铰链和CH1区域的序列的免疫球蛋白基因。在一个实施方式中，缺少序列的免疫球蛋白是一种或多种重链恒定区基因。在一个具体的实施方式中，缺少序列的免疫球蛋白基因选自IgG1、IgG2a、IgG2b及IgG3基因。在一个具体的实施方式中，小鼠包含具有CH1区域，和/或铰链区，和/或CH1区域和铰链区的IgM。

在一个实施方式中，抗体在对抗原进行应答时得到表达，且抗体特异性结合所述抗原。

在一个实施方式中，抗体包含小鼠VH结构域。在一个具体的实施方式中，小鼠VH结构域包含小鼠VH基因片段，其选自1-26、1-42、1-50、1-58、1-72、3-6、5-6、7-1、14-1和14-2。

在一个实施方式中，抗体包含人VH结构域。在一个具体的实施方式中，人VH结构域包含衍生于选自1-2、1-18、1-46、3-21、3-72和4-59的人VH基因的序列。

在一个方面，提供了经遗传修饰的小鼠，其表达主要由各自缺少CH1结构域的两条IgG1重链构成的结合性蛋白质，其中小鼠表达的IgM包含由CH1区域，且其中小鼠不能够由其自身的基因组表达包含编码IgG1的CH1结构域的核苷酸序列的mRNA。

在一个实施方式中，各自缺少CH1结构域的免疫球蛋白重链从N端到C端主要由人或小鼠重链免疫球蛋白可变区、任选的铰链区、小鼠CH2区域及小鼠CH3区域构成。在一个具体的实施方式中，重链免疫球蛋白可变区为人可变区，存在有铰链区，并且小鼠包含功能性轻链基因基因座。

在一方面，提供了小鼠，其表达完全或部分缺少轻链及缺少CH1区域的重链抗体，其中小鼠在B细胞上表达B细胞受体，其表面上的B细胞受体展示了包含直接融合至免疫球蛋白铰链区或直接融合至CH2区域的免疫球蛋白重链可变结构域的结合分子，其中结合分子缺少CH1区域。在一个实施方式中，结合分子包含IgG1CH2和CH3区域。

在一个方面，提供了用于产生重链抗体的方法，包括用目的抗原免疫小鼠，其中小鼠包含缺少编码CH1区域的序列的IgG基因，其中小鼠包含完好的IgM恒定区基因，使得小鼠不断产生针对目的抗原的免疫应答，还包括从小鼠中分离特异性识别目的抗原的细胞或蛋白质，其中的细胞或蛋白质包含缺少CH1结构域并缺少同源轻链及特异性结合目的抗原的重链抗体。

在一个实施方式中，小鼠包含功能性轻链基因。在一个实施方式中，小鼠包含的功能性轻链基因，选自λ、κ及其组合。

在一个实施方式中，小鼠包含一种或多种人V、D、J基因片段对所有或几乎所有小鼠重链V、D、J基因片段的取代。

在一个实施方式中，缺少编码CH1的序列的IgG基因选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3及其组合。

在一个实施方式中，缺少CH1序列的IgG基因为IgG1，且小鼠缺少编码IgG2a、IgG2b、IgG3或其组合的基因。在一个实施方式中，缺少CH1序列的IgG基因为IgG2a，且小鼠缺少编码IgG1、IgG2b、IgG3或其组合的基因。在一个实施方式中，缺少CH1序列的IgG基因为IgG2b，且小鼠缺少编码IgG1、IgG2a、IgG3或其组合的基因。在一个实施方式中，缺少CH1序列的IgG基因为IgG3，且小鼠缺少编码IgG1、IgG2a、IgG3或其组合的基因。

在一个实施方式中，小鼠包含了在其表面有B细胞受体的B细胞，其中B细胞受体包含结合目的抗原的重排重链VDJ，其中B细胞受体包含的IgM包含CH1区域，且其中IgM包含轻链。在一个实施方式中，轻链是VJ重排的。在一个具体的实施方式中，轻链为与结合目的抗原的重排重链VDJ同源的κ或λ轻链。

在一个方面，提供了在根据本发明的小鼠中产生的小鼠重链抗体、人重链抗体或嵌合的人/小鼠重链抗体。

在一个方面，提供了使用根据本发明的小鼠中产生的重链可变区核苷酸序列或其片段产生的小鼠重链抗体、人重链抗体、嵌合的人/小鼠重链抗体或人源化重链抗体。

其他实施方式有所描述，并在本领域技术人员总览了接下来的详细描述后对其变得清楚。

发明详述

本发明不限于所描述的具体的方法和实验条件，这些方法和条件可以变化。本文所使用的术语只是用于描述特定的实施方式的目的，不意欲为限制性的，本发明的范围只会受到权利要求的限制。

除非另有限定，本文使用的所有技术的和科学的术语与使用本发明的本领域普通技术人员一般理解的意义相同。尽管可在本发明的实践或测试中使用任何类似于或等价于本文所描述的那些的方法和材料，然而现在描述的是具体的方法和材料。本文提到的所有出版物都以其全部并入本文作为参考。

CH1结构域及抗体产生

提供了经遗传修饰的非人动物，其生产缺少一个CH1结构域的抗体，包括重链抗体，即，缺少轻链的抗体。经遗传修饰的非人动物包含的遗传修饰包括缺少功能性免疫球蛋白重链结构域（CH1结构域），例如，IgG1 CH1结构域，并且在一些实施方式中，有进一步的修饰，其包括缺少功能性CH1结构域的免疫球蛋白重链中铰链区的删除，其中所述非人动物表达功能性IgM。其他修饰包括使得除IgG1和IgM之外的同种型变得无功能，例如，在IgD、IgG3、IgG2a、IgG2b、IgA和IgE的基因中制造删除或删除这些基因。还提供了经遗传修饰的非人胚胎、细胞及靶向构建体，用于产生所述非人动物、非人胚胎及细胞。

在产生能生产重链抗体（即缺少轻链的抗体）的经遗传修饰的细胞上的工作集中在模拟其他物种中的重链抗体上，例如，骆驼和特定的鱼类。此方法已经用于将小鼠ES细胞遗传修饰为删除IgM和IgG基因中免疫球蛋白恒定区的CH1结构域，并向此ES细胞中引入骆驼或骆驼化的（即，VHH或VHH样的）重链可变区。进行IgM和IgG CH1结构域的删除可能阻止内源、天然抗体的形成，其与形成于经遗传修饰的基因座的骆驼化抗体产生竞争。进行VHH基因片段的加入可能模拟与CH1删除相组合时重链抗体的形成。来自这些动物的重链抗体会包含VHH基因片段。VHH基因片段被认为可能对重链抗体合适的表达是必须的，因为体外研究显示非骆驼VH结构域存在于缺少CH1结构域的重链中时，不能理想地形成可表达的重链抗体。

然而，在骆驼中（以及在一些软骨鱼类中），存在包括CH1结构域或CH1样结构域的基因。认为包含VHH而缺少CH1结构域的抗体产生自RNA剪接或能够编码CH1区域的DNA序列的重排。因此，甚至骆驼都保留了编码CH1区域的DNA序列。因为（在一些情况下）人能够产生完全或部分缺少CH1区域的重链抗体（例如，在人的重链疾病中），可能可以驱使非骆驼动物如小鼠在特定的一组条件下形成缺少CH1区域的重链。此方法取决于不打乱CH的种系结构，但相反地使得此动物的轻链基因座无活性。这种方法的先决条件是带有无功能的轻链基因座时，那些需要同源轻链而表达的重链（例如，具有CH1区域的全长重链）由于缺少κ或λ轻链而不产生，这样只有那些能够在没有轻链时进行表达和分泌的重链（即，缺少CH1区域的重链）得到表达和分泌。该方法依赖于功能性κ或λ基因片段的缺失（其能重排形成功能性轻链基因），并取决于任何功能性重排的轻链基因的缺失，因此其需要进行遗传操作（例如，敲除）以破坏两个种系轻链基因座的功能性。该方法取决于导致内源CH1核苷酸序列不可用的“天然”过程，且所述CH1沉默的“天然”过程发生于类别转换中。似乎没有任何可能能在包含功能性轻链基因的动物中使用这样的过程。进一步地，似乎“天然”过程包括合成大量的正常RNA，即，包括编码CH1区域的区域的RNA。

提供了组合物和方法，用于产生小鼠，以生产缺少免疫球蛋白CH1结构域（及任选的铰链区），其包括重链抗体并包括含有VH结构域的抗体（例如，小鼠或人VH结构域）。这些方法包括选择性地使内源的非IgM CH1区域变得无功能（例如，通过删除CH1结构域的序列）以及在内源小鼠可变区基因座采用非重排的内源小鼠可变区（mVR）基因片段或非重排的人可变区（hVR）基因片段以在小鼠中产生嵌合的人/小鼠抗体。对CH1结构域的删除是在一种或多种IgG基因中而不是在IgM基因中进行的。此方法选择性地使得一个或多个IgG CH1结构域变得无功能，而同时保留功能性IgM。除了删除所述一个或多个IgGCH1结构域之外，提供了进一步的实施方式，用于删除其中的CH1结构域已经是删除或变得无功能的IgG的铰链区或使其无功能。

IgG CH1删除方法采用了对动物中天然B细胞发育的相对保守性的破坏，因为不是经遗传修饰的非人动物的所有Ig同种型会显示出无功能的CH1（以及任选的铰链区）或CH1（以及任选的铰链区）结构域的删除。因此，CH1修饰不发生于IgM分子中，并因此不会影响B细胞早期发育中依赖于具有功能性CH1的IgM的那些步骤。因为IgM没有经过修饰，因此具有IgG的CH1结构域（以及任选的IgG的铰链区）的一种或多种删除但不具有IgM的CH1结构域的删除的动物应当能够在就IgG而言可变结构域展示之前的克隆选择步骤中加工令人满意的大量可变区的库。因此，在多种实施方式中，对用于重链抗体的可变区的多样性上的遗传修饰的任何有害影响不会对用于就IgG进行选择的可变区的库有负面影响。进一步地，当种系中变得无功能（例如，删除）的CH1序列为IgG1时，小鼠会缺少产生任何编码CH1结构域的RNA的能力。

对非人动物进行遗传修饰以使一种或多种IgG同种型的CH1结构域或CH1结构域及铰链区变得无功能，可以产生小鼠，其能够从VH结构域的完全或几乎完全的库中选择合适的VH区以在重链抗体中表达。对IgG同种型（而非IgM）进行选择性修饰避免了由于缺少CH1结构域或IgM中缺少CH1结构域，在选择中存活的VH区的数量的潜在的减少。因此，有可用于在（缺少CH1结构域或缺少CH1结构域及缺少铰链区的）IgG情况下进行选择的更VH区的完全的库。因此，根据本发明，在经遗传修饰的小鼠中选择VH结构域不是根据例如哪种VH结构域可以帮助克服由于IgM结构修饰造成的早期IgM依赖的B细胞发育的障碍。相反地，早期IgM依赖的步骤应当如正常般发生，产生大的重链库，可用于根据其在缺少CH1结构域或缺少CH1结构域及缺少铰链区的IgG的情况下表达的合适度进行选择。

因此，在多种实施方式中，根据本发明，经遗传修饰的小鼠应当维持功能性IgM表达，其应当提供进行更天然的克隆选择过程的机会。例如，替代的轻链以及同源轻链二者在有功能性IgM（例如，不缺少CH1结构域的IgM）的情况下能够通过IgM的CH1结构域相联系并参与早期B细胞发育的选择过程。在根据本发明的经遗传修饰的小鼠中，认为发生向IgG同种型的类别转换是第一个选择步骤，其中发生了对能够在缺少CH1结构域或缺少CH1结构域及缺少铰链区的恒定结构域的情况下表达的重链可变结构域的任何选择。

B细胞发育中的IgM

尽管在骆驼、特定鱼类以及病理条件下的观察显示了在一定环境下，缺少其重链恒定的CH1结构域的抗体可在缺少同源轻链的情况下表达，然而生产抗体的B细胞的正常发育一般需要CH1结构域的存在。所有重链同种型，包括IgM，都包含CH1结构域。人们认为在IgM的情况下，替代的轻链和同源轻链都通过重链的CH1结构域与给定的重链相互作用。由于重链抗体的发育取决于IgM同种型重链的结构完整性或功能性，因此破坏IgM的结构完整性或功能是不可取的。

抗体的正常发育要求抗体在多重复杂的选择方案中存活，这些选择方案导致功能性的有用的抗体的存活及最终表达。抗体结构的破坏对抗体的存活或最终表达不利，破坏的程度达到抗体不能有效地竞争和进化以满足一种或多种天然抗体选择方案。

在抗体发育早期，抗体重链经历了一个选择过程，其中通过多种选择方案天然选择了合适的重链以进行进一步选择而最终形成功能性及亲和力成熟的抗体。始祖B细胞（或原B细胞）中表达自重组的抗体重链基因片段的重链正常地与替代轻链配对以在原B细胞表面上展示IgM同种型而形成称为前B细胞受体或前BCR的结构（其包括其他共受体）。一旦前BCR呈递在细胞表面上，认为前-BCR将其复合体合适的形成的信号传递至细胞，有效地向细胞说明重链已经通过此早期选择步骤。因此，细胞了解到重链可进行进一步的选择。如果在IgM及替代轻链的情况下呈递时重链包含对前BCR形成有害的缺陷，细胞将经历凋亡。如果细胞经历凋亡，则重链的重链可变区的用途及对多样性的帮助会失去。因此，抗体选择的一个非常早期步骤要求在IgM同种型的情况下呈递重链和替代的轻链。替代轻链被认为至少部分地通过IgM的CH1结构域与IgM相互作用。在此早期时机的抗体结构的错误或破坏（例如，无功能的CH1结构域）可导致克隆选择失败、表达重链的原B细胞丧失以及丧失在可用抗体中采用特定重链可变结构域的可能。

一旦具有前BCR的细胞通过了此选择步骤，下一步的选择步骤要求重链与同源轻链（例如，小鼠和人的κ或λ）配对。配对的重链/同源轻链结构在IgM同种型的情况下通过IgM的CH1结构域再次呈递在细胞（现在为初始

前B细胞）表面上。细胞表面的此复合体产生功能性的膜结合的B细胞受体（BCR）。认为此BCR将通知细胞重链适合于进行进一步选择以及细胞现在可以确定表达此具体的轻链并进行进一步的B细胞成熟步骤，包括亲和成熟及类别转换。如果在IgM及其同源轻链的情况下呈递时，重链包含对BCR形成有害的缺陷，细胞将经历凋亡。如果细胞经历凋亡，则重链的重链可变区的用途及对多样性的帮助会失去。因此，抗体选择一个的非常早期步骤要求在IgM同种型的情况下呈递重链和替代的轻链。再次地，在此早期的时机抗体结构的错误或破坏（例如，无功能的CH1结构域）可导致克隆选择失败、同时丧失表达重链的前B细胞。

迄今已经在筛选中存活的前B细胞在IgM的情况下呈递与同源轻链配对的重链，然后经历成熟过程，最终导致类别转换以及进一步的选择机制，其中重链和同源轻链在IgG同种型的情况下呈递在B细胞表面上。在此步骤中可发生对缺少CH1结构域或缺少CH1结构域及缺少铰链区的IgG重链的任何选择。在根据本发明的动物中，认为重链可变区的正常库可用于基于可变结构域是否存活而被表达于缺少CH1结构域或缺少CH1结构域及缺少铰链区的IgG重链中而进行选择。相反地，具有受损的IgM的小鼠可能不能呈递重链可变区的完全库，因为只有能够在受损IgM的情况下在筛选中存活的可变区可用于类别转换。

因此，缺少功能性IgM的动物在其他合适的重链可变基因片段发生重排之后其产生B细胞群体的能力可能有极大的减弱。在这样的情况下，甚至有丰富的重链可变区供应可用时（例如，动物具有合适数量的能够重排的重链可变区基因片段），展示有可取的多样化程度的令人满意的B细胞群体可能不能形成，因为IgM受到损害减少了选择过程中重链的存活。

用功能性IgM基因生产重链抗体

可取的是要维持在IgM环境下的B细胞发育中呈递时能够有效地在筛选中存活的重排重链可变区的合适数量以产生足够的多样性而通过用目的免疫原免疫非人动物产生抗体。因此，在免疫球蛋白重链中包含非功能性CH1结构域或非功能性CH1结构域及非功能性铰链区的经遗传修饰的非人动物应当不在IgM两个等位基因上都包含CH1删除。

在一些实施方式中，不可取的是删除所有Ig同种型的CH1结构域以在经遗传修饰的动物中产生重链抗体。因此，提供了方法和组合物，用于通过失活、删除或使得编码IgG的CH1结构域或其片段的核苷酸序列无功能（在一些实施方式中还有失活、删除或使得所述IgG的铰链区无功能）同时使得其他同种型（例如，IgM）保留功能性CH1结构域，而在经遗传修饰的非人动物中产生重链抗体。人们相信其他同种型的CH1结构域（除了一种或多种所选的IgG CH1结构域）的功能性引起B细胞发育的过程，其不会破坏或基本上不破坏重链可变区在非IgG同种型如IgM同种型的情况下呈递的发育步骤。因此例如B细胞发育中IgM依赖的步骤的破坏相对得到最小化。不受本发明的限制（其由权利要求描述），本发明者提出与重链可变结构域在IgM情况下呈递相关的早期选择步骤的最小破坏会产生更多具有重链可变区细胞，其存活下来进行类别转换成为IgG同种型，并在缺少CH1结构域或缺少CH1结构域及缺少铰链区的IgG的情况下进行选择。

因此，提供了经遗传修饰的非人动物，以及用于所述产生所述动物的方法和组合物，其中遗传修饰致使Ig结构域而不是IgM中功能性CH1结构域的缺失（在进一步的实施方式中缺失了功能性铰链区）。在多种实施方式中，在经遗传修饰的动物的基因组中删除了编码CH1或CH1及铰链区的序列（或其基本上的功能部分）。经遗传修饰的非人动物可用于产生重链抗体（即，缺少轻链的抗体），包括完全人抗体（经遗传修饰而包含人免疫球蛋白基因的小鼠中）以及嵌合的人/小鼠抗体（例如，在经遗传修饰而包含人可变区基因片段、D区域和J区域的小鼠中，或在具有能够反式转换为缺少CH1结构域或缺少CH1结构域及缺少铰链区的经遗传修饰的IgG同种型的人转基因的小鼠中）。

重链抗体

抗体可用作人治疗剂。重链抗体即缺少轻链的抗体也可用作人治疗剂。因为重链抗体缺少轻链，所以其更小并因此预期会比包含轻链的抗体显示更好的组织穿透性，然而其含有类似或更有利的药物动力学谱，并仍然保留与常规抗体相比的类似效应子功能。因为其较小，所以重链抗体还能够在给定体积中以更高的剂量进行施用。常用的施用抗体的方法是通过皮下注射，对于给定抗体剂量，施用体积减小能够对患者提供益处并避免了皮下注射大体积造成的并发症及痛楚。

重链抗体的另一个优势在于通过将对两个不同表位有特异性的重链异源二聚化于单一治疗剂中产生双特异性抗体。因为重链抗体缺少轻链，所以其尤其适合于产生双特异性抗体，因为不需要工程改造不干预任何一条重链的结合亲和力或特异性的普通轻链但还能够使得双特异性抗体得到合适的表达。

本发明的经遗传修饰的动物可用于产生广泛多样的重链抗体。本文所描述的遗传修饰可在例如任何合适的小鼠种系中产生。小鼠种系可具有任何适合于产生所选的重链抗体的遗传背景。下文提供了包括了特定实施方式的一些遗传背景。

所述经遗传修饰的动物可以为小鼠，其包含根据本发明的遗传修饰以及取代了内源的小鼠重链可变区基因座的一种或多种非重排的人可变区基因片段、一种或多种非重排的D区基因片段以及一种或多种非重排的J区基因片段。在这样的小鼠中，人源化的可变区基因座能够重组以形成内源小鼠恒定结构域上游的重排可变区基因（其中一种或多种免疫球蛋白恒定区基因得到本文所描述的修饰）。因此小鼠能够产生嵌合的人可变区/小鼠恒定区重链抗体。在接触目的免疫原时，小鼠将能够生成根据本发明的重链抗体，其为亲和成熟的并能够特异性结合目的免疫原的表位。

所述经遗传修饰的动物可以为小鼠，其包含的内源小鼠可变区包含非重排的内源小鼠可变区基因片段、非重排的内源小鼠D区基因片段以及非重排的内源小鼠J区基因片段，其中小鼠包含本文描述的小鼠重链恒定区的遗传修饰。小鼠因此能够产生小鼠重链抗体。在接触目的免疫原时，小鼠将能够生成根据本发明的重链抗体，其为亲和成熟的并能够特异性结合目的免疫原的表位。

所述经遗传修饰的动物可以为小鼠，其包含的人转基因含有非重排的人可变区基因片段、非重排的人D区基因片段以及非重排的人J区基因片段，mu基因及允许进行反式转换的序列。小鼠会进一步包含如本文所描述的小鼠重链恒定区的修饰。小鼠因此能够产生完全的人IgM抗体，并通过反式转换产生嵌合的人可变区/小鼠恒定区抗体，其中恒定区包含如本文所描述的遗传修饰。在接触目的免疫原时，小鼠将能够生成根据本发明的重链抗体，其为亲和成熟的并能够特异性结合目的免疫原的表位。

体外表达重链抗体

本发明者已经确认正常的人或小鼠重链可变区（hVR或mVR）可在缺少功能性CH1结构域的IgG的条件下在体外系统中表达。本发明者在具有野生型小鼠IgM的小鼠中从非重排的hVR微基因座表达hVR。将所表达的hVR克隆至缺少CH1结构域的IgG2b上，用hVR-IgG2bΔCH1瞬时转染CHO细胞，从而表达并分泌所产生的hVR-IgG2bΔCH1，这有效地确认了具有野生型IgM的小鼠中所选择的hVR在转换为缺少功能性CH1结构域的IgG（即，为重链抗体）时可由细胞表达并分泌。

本发明者构建了体外系统以在CHO细胞中表达缺少CH1结构域并具有hVR或人的骆驼化VR（hVR*）的重链。VR获自RAG小鼠，其包含用人重链可变区微基因座（有三个人V区基因片段，6-1、1-2及1-3，所有人DH基因片段，所有人JH基因片段）对内源小鼠重链基因座的取代。内源小鼠免疫球蛋白κ和λ轻链基因座是完好的并有功能的。

产生嵌合重链（hVR-mFc）及骆驼化重链（hVR*-mFc）构建体用于在CHO细胞中进行表达，使用了获自具有上文描述的微基因座的小鼠的VR序列。嵌合重链为小鼠中B细胞发育过程中正常的V-D-J重组的产物，以形成包含嵌合重链（hVR-mFc）和小鼠轻链的功能性抗体。所产生的hVR-mFc和hVR*-mFc构建体都具有CH1结构域并缺少CH1结构域。

hVR-mFc和hcVR-mFc构建体在CHO细胞中的瞬时转染显示没有CH1结构域时，具有hVR和hVR*的重链表达并保持溶于上清中。在存在有CH1结构域时，含有hVR或hVR*的重链不在上清中表达。此发现表明这些重链抗体可不采用骆驼VHH结构域而采用如人或小鼠VH结构域，在缺少CH1结构域的重链抗体中产生。

人源化的重链抗体

为产生本发明的重链抗体的人源化形式，用抗原免疫有纯合修饰的动物，一旦动物产生特异性免疫应答，则将来经免疫的动物脾脏的细胞与合适的永生化细胞相融合（例如，骨髓瘤细胞）以产生杂交瘤细胞。备选地，抗体可直接获自经免疫动物的B细胞。通过酶联免疫吸附测定（ELISA）筛选来自杂交瘤细胞的上清（或例如来自分离的B细胞）确定抗体的存在并根据需要的特征选择特异性针对所述免疫原的抗体。

重链可变区（VH）核酸可使用本领域已知的标准分子生物学技术分离自杂交瘤和/或B细胞而获得（Sambrook，等人1989.MolecularCloning:A Laboratory Manual,Second Edition,Cold Spring Harbor,N.Y.;Ausubel,et al.1995.Short Protocols in Molecular Biology,3rded.,Wiley & Sons）。一旦确定了VH核酸序列，则可获得推导的氨基酸序列并与其他人VH序列相比较以鉴定一组具有类似序列的相关VH序列。相关VH序列可使用本领域技术人员可得到的抗体数据库获得，例如，The International ImMunoGeneTics Information这种比较可通过用肉眼或备选地采用比对程序（如CLUSTAL）用电子方法比对所完成的序列而进行比对。在此比较中，鉴定出互补决定区（CDR）及骨架区（FR）。CDR和FR的残基根据标准序列定义而确定（例如，Kabat等人1987,Sequences ofProteins of Immunological Interest,National Institutes of Health,Bethesda Md.;Chothia and Lesk,1987.J.Mol Biol.196:901-917）。本领域技术人员会清楚可能偶尔存在对免疫球蛋白重链序列的CDR和FR区域的编号或确定方法上的分歧。在这些情况下，优选的是结构限定，然而，由序列限定方法鉴定出的残基被认为是用于确定基于重链序列比较可以置换哪些骨架区残基的重要FR残基。

一旦进行了比对，就能鉴定出VH序列中可置换的位置。如果与其他人VH序列相比，分离的VH序列的某一位置的氨基酸的同一性发生变化，则评估所述位置在分离的VH序列的所述位置进行置换的合适度。因此，分离的VH序列中与相比的其他相关人VH序列有不同的任何位置可潜在地作为能够用其他一种或任何相关人VH序列中相应位置的氨基酸所置换的位置。将与其他相关人VH序列有同一性的位置（即，未表现出变化性的位置）确定为不可置换位置。在多种实施方式中，采用上文的方法以提供保守的人重链抗体序列。

用于本文所描述的目的的人源化的重链抗体为免疫球蛋白氨基酸序列变体或其片段，其能够结合预先确定的抗原并包含具有与人FR氨基酸相比几乎类似或相同的氨基酸序列的FR区域以及具有与非人的CDR氨基酸相比几乎类似或相同的氨基酸序列的CDR。一般地，人源化的重链抗体具有一个或多个衍生自非人来源的氨基酸残基。这些残基通常衍生自重链可变结构域。进一步地，这些残基可能有相关的特征例如亲和力和/或特异性以及其他想要的与抗体功能相关的生物学活性。

在多种实施方式中，人源化的重链抗体基本上包含至少一个，在其他实施方式中至少两个这样的VH结构域，其中所有或几乎所有的CDR区域对应着非人VH结构域的CDR区域且所有或几乎所有的FR区域为人VH结构域序列的FR区域。人源化的重链抗体会包含唯一的免疫球蛋白恒定区（Fc），其在一个实施方式中缺少至少CH1结构域，在一个实施方式中还缺少人Fc的铰链区。在一个实施方式中，重链抗体不包含轻链并包含免疫球蛋白G（IgG）重链恒定区的CH2和CH3区域。在一个实施方式中，重链抗体的恒定区包括IgG重链Fc的铰链、CH2和CH3区域。在一个实施方式中，重链抗体的恒定区包括IgM的CH1区域。

人源化的重链抗体可选自任何类型的IgG，包括IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。在多种实施方式中，恒定区可包含来自超过一种类型IgG的序列，选择特定的恒定区以优化想要的效应子功能，这一点本领域技术人员能力范围内。

一般地，人源化重链抗体的重链FR和重链CDR区域不需要精确对应于亲本序列，例如，非人的重链CDR或人重链FR可通过置换、插入或删除至少一个残基而改变以使重链CDR或重链FR残基在给定的位点不对应于人重链FR序列或非人重链CDR区域。然而这些突变不会很剧烈。在一个实施方式中，至少75%的人源化的重链抗体残基对应亲本重链FR和重链CDR序列中的残基，在另一个实施方式中为90%，在另一个实施方式中超过95%。

如本文所公开的人源化的重链抗体在一个实施方式中是通过计算机分析亲本序列及多种概念化人源化合成物序列而制备的，使用本领域技术人员可得及已知的计算机程序。产生人源化形式及/或用于改变如免疫原性、亲和力等等的特征的序列修饰是采用本领域已知方法产生的（例如US 5,565,332 Hoogenboom等人；US 5,639,641 Pedersen等人；US 5,766,886 Studnicka等人；US 5,859,205 Adair等人US6,054,297 Carter等人；US 6,407,213 Carter等人；US 6,639,055 Carter等人；US 6,849,425 Huse等人；US 6,881,557 Foote;US 7,098,006Gorman等人；US 7,175,996 Watkins等人；US 7,235,643 Nicolaides等人；US 7,393,648 Rother等人；US 7,462,697 Couto等人）。

在多种实施方式中，对亲本重链抗体序列做出的产生亲本重链抗体变体的所需置换为在一个实施方式中维持了或在另一个实施方式中增加了亲本重链抗体的抗原结合活性的置换。一般地，亲本重链抗体的重链抗体变体对具体抗原的抗原结合亲和力为亲本重链抗体的结合亲和力的至少10%、至少20%、至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少80%、至少90%或至少100%（例如，至少150%、至少200%、至少500%、至少1000%或多至至少10,000%）。在一些实施方式中，变体重链抗体与亲本重链抗体相比包含单一置换。然而，在其他实施方式中，与亲本重链抗体序列相比，数个衍生自在特定位置具有同一性的其他人重链抗体序列的氨基酸如多至大约5或10个或更多的氨基酸得到置换。在一个实施方式中，置换为保守性的（即，氨基酸与要取代的残基具有类似的特性），在另一个实施方式中为非保守性的（即，氨基酸与要取代的残基具有不同的特性）。在多个实施方式中，测试所得的变体重链抗体以确认取代残基没有显著降低所需的结合亲和力及/或特异性。在一些实施方式中，通过用来自不同的人重链序列的氨基酸进行置换产生了改善的变体重链抗体。

已经表明天然发生的重链抗体（如，骆驼中发现的）在对应于传统抗体分子（即，两条重链和两条轻链的抗体）的重链轻链可变区交界处的位置上包含独特的氨基酸残基。已知传统抗体中这些交界处的残基影响这两条链相互之间的位置和方向。尽管已知这些天然重链抗体包含与缺少轻链可变区相关的残基的取代，然而与传统抗体相比其在序列的其他位置上保留了这些残基以保留特征性的免疫球蛋白折叠。发现于天然重链抗体中的置换为L11S、V37F、G44E、L45R或L45C、W47G以及添加的半胱氨酸残基，其有助于重链可变区的CDR1和CDR3之间二硫键的形成。在一些实施方式中，本发明的重链抗体可在这些位置保留亲本抗体的残基。在其他实施方式中，亲本抗体在这些位置有与天然重链抗体中残基相关联的突变。在一些实施方式中，可取的是在至少这些位置之一保留亲本重链抗体中发现的相同残基或，在一个实施方式中要产生衍生自来自如本文描述的经遗传修饰的小鼠的分离的VH序列的人源化重链抗体时保留这些位置的全部残基。在多种实施方式中，本领域技术人员会理解的是，合理地，不预期这些交界处残基参与由本文描述的经遗传修饰的小鼠产生的重链抗体中的链间相互作用。

产生经遗传修饰的动物

用于产生表达重链抗体的动物的遗传修饰通过使用小鼠作为说明方便地得到描述。根据本发明的经遗传修饰的小鼠可以多种方式产生，尤其是根据下文讨论的实施方式产生。

图1中提供了IgG1基因座的示意图（非等比例，上图）以显示IgG1基因座处的CH结构域排列。如图示的，结构域CH1、CH2和CH3及铰链区存在于转换区域下游，形成可容易鉴别的核苷酸范围。

缺少编码IgG1的CH1结构域的核苷酸序列但包含铰链区的经遗传修饰的小鼠可通过任何本领域已知方法产生。例如，可产生靶向载体，用缺少编码CH1结构域序列但包含铰链区序列的截短的IgG1取代IgG1基因。图2显示了由具有5'（相对于基因组IgG1基因转录方向）同源臂的靶向构建体所靶向的小鼠基因组（上图），所述5'同源臂包含内源CH1结构域上游的序列，接着为编码IgG1铰链、IgG1 CH2结构域、IgG1 CH3结构域、药物选择性盒（例如，lox抗性基因）和IgG1跨膜结构域的核苷酸序列以及含有相对跨膜结构域位于3'端的3'同源臂。在此基因座发生同源重组及移除药物选择性盒（例如通过Cre处理）时，内源IgG1由缺少CH1结构域的IgG1取代（图2的下图；lox位点未显示）。图1（IgG1ΔCH1，中图）显示了所产生的基因座的结构，其可表达具有融合至铰链序列的J区序列的IgG1。

缺少编码IgG1的CH1结构域的核苷酸序列并缺少编码铰链区的核苷酸序列的经遗传修饰的小鼠可通过本领域已知的任何方法产生。例如，可产生靶向载体，用缺少编码CH1结构域的序列并缺少编码铰链区的序列的截短的IgG1取代IgG1基因。图3显示了具有5'（相对于基因组IgG1基因转录方向）同源臂的靶向构建体所靶向的小鼠基因组（上图），所述5'同源臂包含内源CH1结构域上游的序列，接着为编码IgG1 CH2结构域、IgG1 CH3结构域、药物选择性盒（例如，lox抗性基因）和IgG1跨膜结构域的核苷酸序列以及含有相对跨膜结构域位于3'端的3'同源臂。在此基因座发生同源重组及移除药物选择性盒（例如通过Cre处理）时，内源IgG1由缺少CH1结构域的IgG1取代（图3的下图；lox位点未显示）。图1（IgG1ΔCH1-Δhinge，下图）显示了所产生的基因座的结构，其可表达具有融合至CH2结构域的J区序列的IgG1。

可通过删除一种或多种其他IgG同种型如删除或使编码IgG2b和IgG2a的序列失活，而对缺少IgG1 CH1序列（IgG1ΔCH1），或缺少IgG1 CH1序列并缺少铰链（IgG1ΔCH1-Δhinge）的经遗传修饰的小鼠进行进一步的修饰以增强经修饰的IgG1同种型的用途。例如，产生具有的靶向构建体，所述5'同源臂包含内源铰链区序列上游的序列（或内源CH1结构域序列上游的序列），编码IgG1 CH2和CH3结构域、药物选择性盒的序列，随后为编码IgG1跨膜结构域的序列，如果需要，后面还有另一个药物选择性盒。在此基因座发生同源重组及移除药物选择性盒（例如通过Cre处理）时，内源重链恒定区基因座只包含两种IgG基因：内源IgG3及IgG1ΔCH1（见图4，下图;重组酶位点未显示；见图6，下图）或IgG1ΔCH1-Δhinge（见图5，下图；重组酶位点未显示；见图6，下图）。

具有IgG1ΔCH1-Δhinge或IgG1ΔCH1ΔIgG2aΔIgG2b等位基因的经遗传修饰的小鼠中表达的IgG1将具有如图10右区所显示的结构，即VH结构域会融合至CH2结构域。作为比较，图10的左区提供了野生型IgG1抗体，显示其CH1结构域通过铰链区连接于CH2结构域，并通过二硫键连接于轻链恒定结构与CL。相反，所述经遗传修饰的小鼠产生的抗体缺少铰链和CH1结构域并因此缺少CL结构域。

如上文描述的以及其他的经遗传修饰的小鼠是通过如下方法产生：将合适的靶向构建体引入合适的小鼠ES细胞（产生一个或多个独立的靶向），鉴别出包含靶向构建体的标记物或选择性盒的阳性克隆并进行培养。然后在适合产生嵌合小鼠或完全的ES细胞衍生小鼠的条件下采用这些克隆作为供体ES细胞进入宿主胚胎。任选的，在ES细胞阶段或者在嵌合或ES细胞衍生小鼠阶段移除标记物或选择盒，例如通过使用lox盒并与包含Cre的种系杂交，或通过对ES细胞进行电穿孔引入Cre表达载体。

根据本发明一个实施方式产生具有IgG1ΔCH1-Δhinge等位基因（杂合）的经遗传修饰的小鼠。从小鼠分离血清并在使用抗小鼠IgG1抗体的Western（还原条件）中进行印迹以检测重链。野生型小鼠显示有对应于野生型IgG1重链大小的条带，与此相反，被修饰为含有IgG1ΔCH1-Δhinge等位基因的经遗传修饰的小鼠还表达与抗小鼠IgG1抗体反应的重链，其具有的大小为由一个VH、CH2和CH3结构域构成的重链抗体大小（见图8）。

实施例

实施例1：重链抗体的体外表达

嵌合重链构建体通过分子生物学技术产生（例如，见Maniatis等人1982.Molecular Cloning:A Laboratory Manual.Cold SpringHarbor Laboratory），将人可变区与小鼠IgG2b（mIgG2b）的恒定区相融合。每种构建体的人可变基因片段都为全长人可变基因片段，包含两个外显子（即，前导序列加成熟序列），其鉴定来自分离自初始RAG小鼠的IgM的hVR，所述小鼠包含用三个hVR基因片段、所有的hDH基因片段以及所有hJH基因片段对源小鼠免疫球蛋白重链基因座的取代。IgM抗体的轻链为小鼠轻链。

使用了mIgG2b序列的两种形式；一种具有另一种不具有CH1结构域。还构建了数种其他的构建体以作为转染及表达的对照。第一种对照构建体是使用融合至小鼠IgG2a（mIgG2a）恒定区的CH2和CH3结构域的细胞因子受体构建的（I号对照）。两种另外的对照是通过将小鼠ROR信号序列融合至具有及不具有CH1结构域的小鼠IgG2a序列而构建的（分别为II号和III号对照）。

还使用了PCR定点诱变技术构建了每种人可变区的骆驼化形式（例如，见Hutchinson等人1978.Mutagenesis at a specific positionin a DNA sequence.J.Biol.Chem.253（18）:6551-60）。对每种可变区使用了两个特异性引物组在人可变区序列内产生特异性区域，产生包含骆驼样特征的人可变区序列。引物L1（SEQ ID NO:1）和HH1.2 mut BOT（SEQ ID NO:2）用于扩增包含可变区5’半区的一个产物而引物HH1.2 mut TOP（SEQ ID NO:3）和m18.3.1（SEQ IDNO:4）用于扩增包含可变区的3’半区。这些产物得到纯化并相混合作为第三次PCR反应的模板，其中使用引物L1和m18.3.1。对产生的骆驼化人可变区PCR产物进行克隆、纯化并通过测序进行确认。

通过用包含限制性酶切位点的引物扩增人可变区（骆驼化及非骆驼化）及恒定区，随后可通过粘性末端而连接，产生全长重链构建体（可变区及恒定区）。将全长重链构建体克隆入表达载体，对其进行纯化并通过测序再次确认。表1列出了各个重链构建体，其SEQ ID NO及对各个构建体的简短描述。

将嵌合重链构建体瞬时转染中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1）中，分析不存在免疫球蛋白轻链时的表达情况。通过Western印迹检查上清及细胞裂解物，使用辣根过氧化物酶（HRP）缀合的抗小鼠IgG抗体（Promega）通过化学发光以检测重链的存在情况。对所有的嵌合重链构建体进行六（6）次独立的瞬时转染。转染产物代表性的Western印迹显示于图7。

所有嵌合重链构建体，具有和不具有CH1结构域，以及对照构建体都在细胞裂解物中检测到。只有缺少CH1结构域的构建体能在上清中观察到（图7，左）。I号和III号对照（缺少CH1结构域的小鼠Fc蛋白质）也检测到（图7），但是包含CH1结构域的小鼠Fc蛋白质没有检测到。包含CH1结构域的非骆驼化及骆驼化的重链构建体在任何转染的上清中都没有检测到（图7，右）。然而，缺少CH1结构域的非骆驼化及骆驼化的人重链构建体在所有转染的上清中都检测到。综上，结果确认了在没有免疫球蛋白轻链时，瞬时转染的CHO细胞可表达和分泌缺少CH1结构域的（正常或骆驼化的）hVR，而在没有轻链时，不分泌包含CH1结构域的（正常或骆驼化的）hVR。

实施例2：小鼠重链IgG1恒定区的修饰

A.小鼠IgG1-CH1-Hinge靶向载体的制备（图3）

构建了靶向构建体，用于对来自

小鼠（描述于下文）的ES细胞的C57BL/6等位基因引入小鼠IgG1恒定结构域的CH1和铰链区的删除。

靶向构建体是使用

技术产生的（见，例如美国专利号6,586,251及Valenzuela等人（2003）High-throughputengineering of the mouse genome coupled with high-resolutionexpression analysis,Nature Biotech.21（6）:652-659），以修饰细菌人工染色体（BAC）BMQ 70p08。修饰BMQ 70p08 BAC DNA以删除IgG1恒定结构域的CH1及铰链区同时使得剩余的IgG1基因保持完好（例如，CH2、CH3及转膜外显子）。

简言之，分别使用引物m102（SEQ ID NO:13）和m104（SEQ IDNO:14）和m100（SEQ ID NO:15）和m99（SEQ ID NO:16）产生上游和下游的同源臂。这些同源臂用于产生删除了IgG1恒定结构域的CH1及铰链区而保留IgG1恒定结构域的CH2、CH3及跨膜区的盒（见，例如图3）。靶向构建体包括位于IgG1基因的CH3和跨膜结构域外显子之间的lox潮霉素抗性基因。CH1及铰链外显子上游（例如，IgG3、IgD、IgM）的基因及IgG1转膜外显子下游的基因（例如，gG2b、IgG21、IgE、IgA等等）不受靶向构建体的修饰。所有恒定结构域的转化区域不受靶向构建体的修饰。穿过删除部分的核苷酸序列如下所示，其表示存在于删除点的剪接受体序列：TGACAGTGTAATCACATATA CTTTTTCTTG T（AG）TCCCAGA AGTATCATC（SEQ ID NO:17）。删除序列包含剪接受体（上文括号中包含的AG）及剪接受体5'端的前-CH1序列以及剪接受体3'端的前-CH2外显子序列。

B.小鼠IgG1-CH1靶向载体的制备（图2）

用于对来自

小鼠（描述于下文）的ES细胞的129/SvEvTac等位基因引入小鼠IgG1恒定结构域的CH1的删除的第二种靶向构建体是通过与本实施例的A部分中描述类似方式构建的。

靶向构建体是使用

技术产生的（见，例如美国专利号6,586,251及Valenzuela等人（2003）High-throughputengineering of the mouse genome coupled with high-resolutionexpression analysis,Nature Biotech.21（6）:652-659）以修饰细菌人工染色体（BAC）BMQ 70p08。修饰BMQ 70p08 BAC DNA以删除IgG1恒定结构域的CH1区域同时使得剩余的IgG1基因保持完好（例如，铰链、CH2、CH3及转膜外显子，见图2）。

第二种靶构建体的同源臂与CH1-Hinge靶向载体的相同（如上文实施例的A部分所描述）。这些同源臂用于产生删除了IgG1恒定结构域的CH1区域而保留IgG1恒定结构域的铰链、CH2、CH3及跨膜区的盒（见，例如图2）。靶向构建体包括位于IgG1基因的CH3和跨膜结构域外显子之间的lox潮霉素抗性基因。CH1外显子上游的基因（例如，IgG3、IgD、IgM）及IgG1转膜外显子下游的基因（例如，IgG2b、IgG21、IgE、IgA等等）不受靶向构建体的修饰。所有恒定结构域的转化区域不受靶向构建体的修饰。穿过删除部分的核苷酸序列如下所示，其表示存在于删除点的剪接受体序列：TGACAGTGTAATCACATATA CTTTTTCTTG T（AG）TGCCCAG GGATTGTGGTTGTAAGCCTT GCATATGTAC AGGTAAGTCA GTAGGCCTTTCACCCTGACC C（SEQ ID NO:64）。删除序列包含剪接受体（上文括号中包含的AG）及剪接受体5'端的前-CH1序列以及剪接受体3'端的铰链外显子序列。

实施例3：ES细胞中小鼠重链恒定区的修饰

A.用IgG1-CH1-Hinge靶向载体靶向小鼠ES细胞

用上文描述的靶向构建体靶向小鼠ES细胞（即，引入IgG1基因的CH1及铰链区的删除的靶向构建体）。ES细胞来自

小鼠，其为129种系和C57BL/6种系的50/50杂交种系，具有遗传修饰而包含用非重排的人重链和轻链可变区基因片段对小鼠重链和轻链可变区基因片段的取代。用来与C57BL/6杂交的129种系为包含用非重排的人重链和轻链可变区基因片段对小鼠重链和轻链可变区基因片段的取代的种系。

杂合的

小鼠在一个等位基因上有来自129种系的一组内源小鼠重链恒定区基因，在另一个等位基因上有来自C57BL/6种系的一组内源小鼠重链恒定区基因。129重链等位基因邻近重链可变区基因片段（为人重链可变区基因片段，取代了内源小鼠重链可变区基因片段（即，在内源小鼠基因座））的基因座。BL/6重链等位基因邻近野生型小鼠重链可变区基因片段。

小鼠还可具有野生型内源小鼠轻链恒定区基因。因此，通过用包含IgG、D、E或A的CH1删除的构建体靶向129等位基因可产生嵌合的人/小鼠重链抗体，而以类似的构建体靶向C57BL/6等位基因，可产生缺少CH1结构域并缺少铰链区的完全的小鼠重链抗体。

用实施例2的A部分的线性化靶向载体电穿孔来自上文描述的

小鼠的ES细胞并根据潮霉素抗性基因的存在情况进行选择。

B.用IgG1-CH1靶向载体靶向小鼠ES细胞

以相似的方式，用描述于实施例2的B部分的CH1靶向构建体靶向小鼠ES细胞（又见图2）。ES细胞来自

小鼠，其为129/SvEvTac种系和C57BL/6种系的50/50杂交种系，具有遗传修饰而包含非重排的人重链和轻链可变区基因片段对小鼠重链和轻链可变区基因片段的取代。用来与C57BL/6杂交的129/SvEvTac种系为包含用人重链和轻链可变区基因片段对小鼠重链和轻链可变区基因片段的取代的种系。

杂合的小鼠在一个等位基因上有来自129/SvEvTac种系的一组内源小鼠重链恒定区基因，在另一个等位基因上有来自C57BL/6种系的一组内源小鼠重链恒定区基因。129/SvEvTac重链等位基因邻近重链可变区基因片段（为人的重链可变区基因片段，取代了内源小鼠重链可变区基因片段（即，在内源小鼠基因座））的基因座。BL/6重链等位基因邻近野生型小鼠重链可变区基因片段。

小鼠还可具有野生型内源小鼠轻链恒定区基因。因此，通过用包含IgG、D、E或A CH1删除的构建体靶向129/SvEvTac等位基因可产生嵌合的人/小鼠重链抗体，而用类似的构建体靶向C57BL/6等位基因，可产生缺少CH1结构域并缺少铰链区的完全的小鼠重链抗体。

用实施例2的B部分的线性化靶向载体电穿孔来自上文描述的

小鼠的ES细胞并根据潮霉素抗性基因的存在情况进行选择。

实施例4：携带经修饰的IgG1恒定区的小鼠的产生

A.携带IgG1-CH1-Hinge删除的小鼠

将上文描述的所靶向的ES用作供体ES细胞并通过

方法引入8-细胞期小鼠胚胎中（见例如美国专利号7,294,754及Poueymirou等人（2007）F0 generation mice that areessentially fully derived from the donor gene-targeted ES cellsallowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech.25（1）:91-99.）。通过使用可检测出位于删除的铰链及CH1区上游及下游的序列的修饰的等位基因测定法（Valenzuela等人，见上文）进行基因分型鉴定出具有所靶向的C57BL/6 IgG1等位基因的

（完全衍生自供体ES细胞的F0小鼠）。

进行了IgG1 CH1和铰链区删除（在C57BL/6等位基因，即小鼠等位基因上）的基因分型的小鼠与Cre删除子的小鼠种系杂交（见例如，国际专利申请公开号WO 2009/114400）以移除IgG1 CH3外显子下游及IgG1跨膜外显子上游由靶向构建体引入的lox hyg盒（见例如图3）。对幼鼠进行基因分型，并选择IgG1 CH1及铰链区删除杂合的幼鼠检查该幼鼠血清中表达自C57BL/6等位基因的IgG1重链。

B.携带IgG1-CH1删除的小鼠

以类似的方式，将携带IgG1 CH1区域删除的靶标ES细胞用作供体ES细胞并通过

方法引入8-细胞期小鼠胚胎中（见例如美国专利号7,294,754及Poueymirou等人（2007）F0generation mice that are essentially fully derived from the donorgene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses NatureBiotech.25（1）:91-99）。通过使用可检测出位于删除的CH1区上游及下游的序列的修饰的等位基因测定法（Valenzuela等人，见上文）进行基因分型鉴定出具有靶标129SvEv/Tac等位基因的

（完全衍生自供体ES细胞的F0小鼠）。

进行了IgG1 CH1区删除（在129/SvEvTac等位基因，即人等位基因上）的基因分型的小鼠与Cre删除子的小鼠种系杂交（见例如，国际专利申请出版物号WO 2009/114400）以移除IgG1 CH3外显子下游及IgG1转膜外显子上游由靶向构建体引入的lox hyg盒（见例如图2）。对幼鼠进行基因分型，并选择IgG1 CH1区删除纯合的幼鼠检查修饰的IgG1重链的表达。

实施例5：来自携带经修饰的IgG1基因的小鼠的重链抗体

A.IgG1-ΔCH1-Δhinge小鼠

对如上文鉴定为包含CH1和铰链区删除的小鼠幼鼠与野生型幼鼠进行放血，制备来自放血的小鼠的血清用于Western印迹以使用抗-mIgG1抗体鉴定血清中任何表达的IgG。简言之，取10μL的小鼠血清1:100稀释液用于还原性SDS-PAGE，将凝胶转移至PVDF膜。以溶于含0.05% Tween-20（TBST；Sigma）的Tris缓冲盐溶液中的5%脱脂牛奶封闭杂交膜过夜，以TBST洗涤4次，每次5分钟，然后孵育一抗（缀合HRP的羊抗-mIgG1，Southern Biotech，1:1,000稀释于溶于TBST的1%脱脂牛奶），室温下孵育两个小时。杂交膜洗涤6次，每次5分钟。用SuperSignal^TM West Pico ChemiluminescentSubstrate（Thermo Scientific）对杂交膜进行5分钟的显色并用胶片曝光1分钟。

来自衍生于所靶向的供体ES的

（50%野生型BL/6;50%ΔCH1-Δhinge BL/6）的血清显示混合的条带：一条大约57.5kD，为野生型IgG的预期大小，还有一条带为大约45kD，为缺少CH1结构域及铰链区的IgG预期大小（图8）。这些结果与

表达来自野生型BL/6等位基因的正常小鼠重链及来自其ΔCH1-Δhinge BL/6等位基因的ΔCH1/Δhinge小鼠重链的情况相一致。此结果确认了具有功能性IgM基因及缺少CH1结构域及铰链结构域的IgG基因的经遗传修饰的小鼠能够在血清中表达重链抗体。

B.IgG1-ΔCH1小鼠

以类似的方式，对CH1删除纯合小鼠幼鼠与野生型幼鼠进行放血。由放血的小鼠制备血浆和血清（5个纯合子；2个野生型）用于Western印迹以使用抗-mIgG1抗体（如上文描述的）鉴定血清中任何表达的IgG。来自纯合IgG1-ΔCH1删除的小鼠的血清和血浆其Western印迹显示混合的条带：一条带为大约45kD，为缺少CH1结构域的单链IgG1的预期大小，还有一条带为大约75kD，为缺少CH1结构域的二聚体IgG预期大小（数据未显示）。这些结果符合纯合

从其一个或两个重链基因座表达IgG1-ΔCH1重链的情况。此结果确认了具有功能性IgM基因及缺少CH1结构域的IgG基因的经遗传修饰的小鼠能够在动物免疫系统的外周血淋巴细胞区室表达重链抗体。

实施例6：对IgG1-CH1-Hinge删除纯合的小鼠的鉴定

将对CH1-hinge删除杂合的

进行杂交以获得对该删除纯合的小鼠。鉴定出四个小鼠幼鼠为IgG1ΔCH1-Δhinge纯合子。将这四只小鼠及野生型小鼠放血并从放血的小鼠制备血清进行Western印迹，以抗-mIgG1抗体鉴定血清中任何表达的IgG（如上文所描述）。图9显示了此实验中PVDF膜曝光的胶片结果。血清以1:5和1:10稀释，对每只小鼠取10μL的每种稀释物挨个地加样至凝胶中。在凝胶图像的上部，标记了每只小鼠及IgG1（1）和IgG2a（2a）对照的泳道。

来自野生型小鼠的血清显示表达包含两条重链和两条轻链的正常抗体（大约150kD）的野生型小鼠的预期形式。所有四只（对IgG1ΔCH1-Δhinge纯合）小鼠各自显示出混合条带：一条带大约150kD，为野生型IgG而不是IgG1（例如IgG2a、IgG2b或IgG3）的预期大小，还有一条带为大约45kD，为缺少CH1结构域和铰链区的IgG的预期大小（图9）。这些结果符合小鼠表达缺少CH1结构域和铰链区并缺少轻链的IgG1重链抗体的情况。此结果进一步确认了具有功能性IgM基因及缺少CH1结构域及铰链结构域的IgG基因的经遗传修饰的小鼠能够在血清中表达重链抗体。

在另一个实施方式中，使用ELISA测定法测试来自对IgG1ΔCH1-Δhinge纯合的小鼠的IgG的血清表达。简言之，对特异于mIgG1或mIgG2b（Pharmingen）的抗体分别进行稀释并取100μl/well包被平板，浓度为2μg/mL溶于1x PBS（Irvine Scientific），在4℃孵育过夜。第二天，将平板用含有0.05%Tween-20的PBS（PBST;Sigma）洗涤四次。第四次洗涤之后，以250μL/孔的含5%BSA（Sigma）的PBST封闭平板，并在室温孵育一小时。在平板上（从上至下）对血清及标准品以含0.5%BSA（Sigma）的PBST进行梯度稀释（稀释系数为0.316），起始浓度为400ng/mL（mIgG1）或600ng/mL（mIgG2b）。封闭后，将平板PBST洗涤四次。第四次洗涤之后，将100μL的血清或标准品加至平板并在室温下孵育一小时。平板再次PBST洗涤四次。洗涤之后，将100μL的生物素化的检测抗体（10ng/mL的大鼠抗-mIgG1或250ng/mL的抗-mIgG2b;Pharmingen）加入平板，并在室温孵育一小时。然后再次如上文描述的洗涤平板。洗涤之后，将溶于PBST的1:20,000稀释的缀合至链霉亲和素的辣根过氧化物酶（HRP-SA）以100μL/孔加入平板，并将平板在室温孵育30分钟。然后将平板用PBST洗涤六次，此后以100μL/孔加入底物A和B（BD OptEIA^TM;BD Biosciences）的1:1稀释液，并将平板置于黑暗中。反应在黑暗中进行，在需要的时候以1N的磷酸终止（大约15分钟）。在Wallac 1420 Work StationVictor^TM Plate Reader上读出终止的反应物在450nm处的吸收波长（每次读数1.0秒），对结果进行作图（图11）。

来自野生型小鼠的血清显示了正常水平的IgG1和IgG2b。对IgG1ΔCH1-Δhinge纯合的小鼠能够在外周血中表达缺少CH1结构域和铰链区的IgG1（血清；图11左侧）。进一步地，其他IgG同种型（例如，IgG2b）的血清水平与野生型水平相比没有显著降低（图11右侧）。此结果进一步确认了具有功能性IgM基因及缺少CH1结构域和铰链区的IgG基因的经遗传修饰的小鼠能够在血清中表达可检测到的经修饰的IgG1同种型（即，缺少CH1结构域和铰链区）。

实施例7：分析IgG1修饰的小鼠中的V-D-J重排

A.对IgG1-CH1-Hinge删除纯合的小鼠

通过使用分离自脾细胞的RNA进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR），而分析对IgG1ΔCH1-Δhinge修饰纯合小鼠的V-D-J重组及重链基因的使用。

简言之，收获脾脏并在灭菌一次性袋子中以10mL含有5%HI-FBS的RPMI-1640（Sigma）进行灌流。然后将每个装有一个脾脏的袋子置于STOMACHER^TM（Seward）中并在培养基中进行30秒的处理而均质化。使用0.7μm细胞滤器过滤均质化的脾脏，然后通过离心（1000rpm 10分钟）进行沉淀，将血红细胞（RBC）于BD PHARMLYSE^TM（BD Biosciences）中裂解三分钟。以RPMI-1640稀释脾细胞并再次离心，随后重悬于1mL的PBS（Irvine Scientific）。使用本领域已知的标准技术从沉淀下的脾细胞中分离RNA。

使用一组特异性针对小鼠重链可变区（VH）基因片段的简并引物（Novagen）以及小鼠IgG1 CH2引物（CGATGGGGGCAGGGAAAGCT GCAC;SEQ ID NO:40）对脾细胞RNA进行RT-PCR。凝胶纯化PCR产物并克隆入pCR2.1-TOPO TA（Invitrogen），用位于载体序列内克隆位点两侧的M13正向（GTAAAACGAC GGCCAG;SEQ ID NO:41）及M13反向（CAGGAAACAG CTATGAC;SEQ ID NO:42）引物测序。对19个克隆进行测序以确定重链基因的使用及重排的VH和IgG1恒定区的CH2之间连接处的序列（表2）。

图12显示了19个RT-PCR克隆中11个的重排的VH结构域与IgG1恒定区的CH2的序列比对情况。图12中显示的序列说明了涉及不同小鼠重链V、D和J基因片段以及不含CH1及铰链区的小鼠IgG1的独特的重排情况。对内源IgG1恒定区基因的CH1和铰链区删除纯合的小鼠能够产生重链，其包含可操作地连接于来自不含CH1和铰链区的小鼠IgG1恒定区的CH2-CH3区域的小鼠VH结构域，并能产生B细胞，其表达不含CH1和铰链区的小鼠IgG1重链并缺少轻链（图8、9）。这些重排表明经修饰的基因座能够在这些小鼠中多个、独立的B细胞内独立地重排小鼠重链基因片段，以产生重链抗体，其类似于正常见于骆驼中的那些抗体。进一步地，此实施例表明删除内源IgG1的CH1和铰链区不会使基因座不可操作或阻止涉及经修饰的IgG1恒定区的重组。这些小鼠产生功能性的重链抗体（其包含不具有CH1和铰链区的IgG1）为内源抗体库的一部分，并在B细胞发育上没有任何可检测到的缺陷。

B.对IgG1-CH1删除纯合的小鼠

以类似的方式，通过使用分离自脾细胞的RNA进行逆转录聚合酶链式反应（RT-PCT），而分析对IgG1ΔCH1修饰纯合的小鼠的V-D-J重组及人重链基因的使用。

简言之，从两只如上文本实施例A部分描述的纯合IgG1-ΔCH1小鼠中分离脾脏。使用磁珠细胞分选术（MACS,Miltenyi Biotec）从脾细胞集合中分离出CD19⁺B细胞。使用Qiagen ALLPREP^TMDNA/RNA小提试剂盒（Qiagen）从分选出的CD19⁺B细胞中提取RNA。使用SUPERSCRIPT^TM III Reverse Transcriptase and Oligo（dT）20引物（Invitrogen）合成第一链cDNA。然后使用此cDNA作为PCR模板，其中使用了3’小鼠IgG1铰链区特异性引物及设计为结合人可变区前导序列的5’简并引物（表3）。将PCR产物克隆入pCR2.1 TOPO^TMTA载体（Invitrogen）并以M13正向和M13反向引物测序（如上文此实施例A部分中所描述）。

为确定对IgG1 ΔCH1纯合的小鼠中重链基因的使用，对28个RT-PCR克隆进行测序。这些克隆中，观察到人V、D和J基因片段的7个独特重排形式（表4）。

图13显示了表4中7种重排形式的重排的VH结构域与IgG1恒定区的铰链-CH2-CH3的序列比对情况。图13中显示的序列说明了涉及不同人重链V、D和J基因片段以及不含CH1区域的小鼠IgG1的独特的重排情况。对内源IgG1恒定区基因的CH1区域删除纯合的小鼠能够产生重链，其包含可操作地连接于来自不含CH1区域的小鼠IgG1恒定区的铰链-CH2-CH3区域的人VH结构域，并能产生B细胞，其表达不含CH1区的小鼠IgG1重链并缺少轻链（数据未显示）。这些重排表明修饰的基因座（IgG1ΔCH1-Δhinge及IgG1ΔCH1）中的一个或两个能够在这些小鼠中多个、独立的B细胞内独立地重排（人和小鼠）重链基因片段，以产生重链抗体，其类似于正常见于骆驼中的那些抗体。进一步地，此实施例表明删除内源IgG1的CH1不会使基因座不可操作或阻止涉及人重链V、D和J基因片段和经修饰的小鼠IgG1恒定区的重组。这些小鼠产生功能性的重链抗体（其包含人重链V结构域及不具有CH1的小鼠IgG1）为内源抗体库的一部分，并在B细胞发育上没有任何可检测到的缺陷。

Claims

1.包含种系遗传修饰的小鼠，其包含编码IgG的CH1的核苷酸序列的删除，其中该小鼠表达包含CH1结构域的IgM，并且该小鼠在其血清中表达缺少CH1结构域以及缺少轻链的IgG抗体，其中该小鼠不能表达包含编码CH1结构域的序列的IgG mRNA。

2.权利要求1的小鼠，其中对编码CH1的核苷酸序列的删除是在IgG1基因之中。

3.权利要求1的小鼠，其包含功能性的免疫球蛋白轻链基因基因座。

4.权利要求1的经遗传修饰的小鼠，其中缺少轻链的IgG抗体包含人可变结构域和缺少CH1结构域的小鼠恒定结构域。

5.权利要求1的经遗传修饰的小鼠，其中缺少轻链的IgG抗体包含小鼠可变结构域和缺少CH1结构域的小鼠恒定结构域。

6.权利要求1的经遗传修饰的小鼠，其包含IgG2a基因的删除。

7.权利要求1的经遗传修饰的小鼠，其包含IgG2b基因的删除。

8.权利要求1的经遗传修饰的小鼠，其包含IgG2a基因的删除和IgG2b基因的删除。

9.权利要求1的经遗传修饰的小鼠，其包含IgG2a基因的删除和IgG2b基因的删除。

10.权利要求1的经遗传修饰的小鼠，其包含一种或多种人重链可变区基因片段对一种或多种内源小鼠重链可变区基因片段的取代。

11.权利要求10的经遗传修饰的小鼠，其中所述一种或多种人重链可变区基因片段是人VH1家族基因片段。

12.权利要求11的经遗传修饰的小鼠，其中VH1家族基因片段包括FR1、FR2及FR3区域，其与人VH基因片段1-8、1-18及1-69的FR1、FR2及FR3基因片段有至少90%的同一性。

13.权利要求11的经遗传修饰的小鼠，其进一步包含人D基因片段及人J基因片段。

14.权利要求11的经遗传修饰的小鼠，其中该小鼠包含编码FR4的重排的免疫球蛋白基因，并且FR4与由人至少D1-7/J4、D3-16/J6、D4-4/J4、D6-6/J4、D6-6/J2、D6-7/J4或D6-19/J6编码的FR4有至少90%的同一性。

15.权利要求1的经遗传修饰的小鼠，其包含一种或多种骆驼化的人重链可变区基因片段对一种或多种内源小鼠重链可变区基因片段的取代。

16.用于在小鼠中产生体细胞突变的重链抗体的方法，包括以下步骤：

a.用抗原免疫小鼠，其中该小鼠包含非重排的人或小鼠重链免疫球蛋白可变区基因片段，且其中该小鼠缺少编码功能性IgG CH1结构域的至少一个等位基因的核苷酸，并且其中该小鼠表达包含CH1结构域的IgM；

b.将小鼠维持于足以引发针对所述抗原的免疫应答的条件下；以及

c.从小鼠中分离体细胞突变的重链抗体，其包含衍生自人或小鼠重链免疫球蛋白可变区基因片段的可变结构域，其中体细胞突变重链抗体特异性结合所述抗原。

17.经遗传修饰的小鼠，其包含一种或多种人V、人D和人J基因片段对所有或几乎所有V、D和J基因片段的取代，其中所述一种或多种人V、D和J基因片段可操作地在内源小鼠基因座处连接至小鼠重链恒定区基因基因座，其中小鼠重链恒定区基因基因座包含全长IgM基因，在编码选自IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG3及其组合的IgG基因中CH1结构域的核苷酸序列中包含删除的IgG基因；其中该小鼠表达B细胞受体，其包含具有CH1结构域的IgM，其中IgM包含与同源λ或κ轻链相连的重链。

18.权利要求17中的经遗传修饰的小鼠，其中所述一种或多种人V、D和J基因片段包含的人基因片段来自选自VH1、VH3、VH4及其组合的可变区家族。

19.权利要求18的经遗传修饰的小鼠，其中所述一种或多种人基因片段选自1-2、1-8、1-18、1-46、1-69、3-21、3-72、4-59及其组合。

20.权利要求18的经遗传修饰的小鼠，其中所述一种或多种人V、D和J基因片段包含D1-7、D3-16、D4-4、D6-6、D6-7、D6-19、J2、J3、J4及其组合。