KR20130055556A - 중쇄 항체를 만드는 마우스 - Google Patents

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Abstract

유전적으로 변형된 비-사람 동물 및 그것들을 만들고 사용하는 방법 및 조성물이 제공되는데, 유전적 변형은 IgG, IgA, IgD, 및/또는 IgE의 면역글로불린 불변 부위 CH1 유전자의 결실 (선택적으로 경첩 부위의 결실)을 포함하고, 마우스는 기능적 IgM을 발현할 수 있다. 기능적 IgM 유전자 및 IgM이 아닌 중쇄 불변 도메인에서, 예를 들어, IgG 중쇄 불벼 부위에서 CH1 도메인 및 경첩 부위의 결실을 갖기 위해 변형된 것을 포함하는, 유전적으로 변형된 마우스는 설명된다. 사람 가변/마우스 불변 키메라화 중쇄 항체 (경쇄가 결핍된 항체), 완전히 마우스 중쇄 항체, 또는 완전히 사람 중쇄 항체를 만드는 유전적으로 변형된 마우스가 제공된다.

Description

중쇄 항체를 만드는 마우스{MICE THAT MAKE HEAVY CHAIN ANTIBODIES}
본 발명의 분야는 중쇄 항체를 만드는 유전적으로 변형된 비-사람 동물, 특히 면역글로불린 감마 (IgG) 유전자의 CH1 도메인 (또는 CH1 도메인 및 경첩 부위)을 암호화하는 서열에서 뉴클레오티드 서열 결실을 포함하지만 기능적 CH1 도메인이 결핍되지 않은 IgM을 발현할 수 있는, 유전적으로 변형된 동물이고, 특히 야생형 IgM 분자를 만들 수 있지만 (즉, CH1 도메인이 있다) 기능적 CH1 도메인 (또는 CH1 도메인 및 경첩 부위)이 없는 중쇄 IgG 항체를 만드는 마우스이다.
대부분의 동물에서, 정상적인 면역글로불린 중쇄는 그들의 동족 경쇄와 결합하였을 때만 잘 발현된다. 사람에서, 단독 중쇄는 다양한 헤비, CH1, 또는 다양한 헤비 및 CH1의 서열이 결핍된 역기능적 중쇄에 의해 나타나는 중쇄 병에서 발견된다. 경쇄가 없는 중쇄는 물고기 특정 종 및 카멜에서 발생된다. 이러한 중쇄는 그들의 중쇄 가변 도메인에서 기능적인 CH1 도메인이 결핍되고 비-사람 특성을 갖는다. 카멜 또는 물고기 특정 종에서 발견되는 VHH 도메인을 모방한 카멜화된 유전자를 발현하기 위해 마우스의 변형에 의해, 부분적으로 IgM 및 IgG CH1 도메인의 제거 및 카멜 및/또는 물고기 특정 종의 그것과 닮은 중쇄 가변 부위와 부합에 의해 카멜화된 항체를 만들기 위한 시도가 되었다. 하지만, 카멜화된 항체는 비-카멜 동물에서 면역 반응을 유발하는 것으로 예상될 것이다.
비-카멜리드 VH 도메인을 갖는 중쇄 항체를 만드는, 유전적으로 변형된 비-사람 동물이 업계에 필요하다.
개요
유전적으로 변형된 세포, 비-사람 배아, 비-사람 동물 및 그것들을 만들고 사용하는 방법 및 조성물이 제공되는데, 동물은 면역글로불린 G (IgG)에서 기능적 CH1 서열이 결핍되도록 유전적으로 변형되고, 선택적으로 변형된 IgG에서 기능적 IgG 경첩 부위가 결핍되도록 변형되고, 세포, 배아, 및 동물은 기능적 IgM CH1 서열을 포함한다. 몇몇 양태에서, 마우스는 하나 이상의, 또는 모든 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트를 하나 이상의 사람 면역글로불린 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트로 대체하는 것을 포함한다. 몇몇 양태에서, 모든 내인성 마우스 V, D, 및 J 유전자 세그먼트는 하나 이상의 사람 V, 하나 이상의 사람 D, 및 하나 이상의 사람 J 유전자 세그먼트로 대체된다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스가 제공되는데, 유전적 변형은 IgG 불변 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 변형을 포함하고, 변형은 IgG 불변 부위의 CH1 도메인의 기능 상실을 초래한다. 한 구체예에서, 기능 변형의 상실은 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 결실, 또는 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열 내의 결실이다.
한 구체예에서, IgG는 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 이들의 조합으로부터 선택된다. 한 구체예에서, IgG는 IgG1이다. 한 구체예에서, IgG는 IgG1, IgG2a, 및 IgG2b이다.
한 구체예에서, 변형은 CH1 변형을 포함하는 IgG의 경첩 부위에 대한 뉴클레오티드 서열의 결실을 더 포함한다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 129 종, C57BL/6 종, 및 129 x C57BL/6의 혼합체으로부터 선택된다. 특이적 구체예에서, 마우스는 129 50% 및 C57BL/6 50%이다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 129P1, 129P2, 129P3, 129X1, 129S1 (예를 들어, 129S1/SV, 129S1/SvIm), 129S2, 129S4, 129S5, 129S9/SvEvH, 129S6 (129/SvEvTac), 129S7, 129S8, 129T1, 129T2 (예를 들어, Festing et al . (1999) Revised nomenclature for strain 129 mice, Mammalian Genome 10:836 참조)로 구성된 그룹으로부터 선택된 129 종이다. 한 구체예에서 유전적으로 변형된 마우스는 C57BL 종인데, 특이적 구체예에서 C57BL/A, C57BL/An, C57BL/GrFa, C57BL/KaLwN, C57BL/6, C57BL/6J, C57BL/6ByJ, C57BL/6NJ, C57BL/10, C57BL/10ScSn, C57BL/10Cr, C57BL/Ola로부터 선택된다. 특이적 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 상기 언급된 129 종 및 상기 언급된 C57BL/6 종의 혼합체이다. 다른 특이적 구체예에서, 마우스는 상기 언급된 129 종의 혼합체, 또는 상기 언급된 BL/6 종의 혼합체이다. 특이적 구체예에서, 혼합체의 129 종은 129S6 (129/SvEvTac) 종이다.
한 구체예에서, 마우스는 변형된 IgG 불변 부위 서열과 작동 가능하게 연결된 하나 이상의 재배열 되지 않은 내인성 마우스 중쇄 면역글로불린 가변 부위 (mVR) 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 하나 이상의 mVR 유전자 세그먼트는 VH1, VH3, VH5, VH7, VH14, 및 이들의 조합으로부터 선택된 마우스 VH 유전자 패밀리에서 온다. 한 구체예에서, 하나 이상의 mVR 유전자 세그먼트는 mVH 1-26, 1-42, 1-50, 1-58, 1-72, 3-6, 5-6, 7-1, 14-2, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 마우스는 기능적 CH1 부위가 결핍된 IgG 중쇄에서 FR1, FR2, 및 FR3을 암호화하는 재배열된 유전자를 포함하는데, FR1, FR2, 및 FR3는 각각 독립적으로 VH1, VH3, VH5, VH7, 및 VH14 유전자 패밀리로부터 선택된 mVH 생식세포계열 서열로부터 유도된 FR1, FR2, 및 FR3와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다. 한 구체예에서, mVH 생식세포계열 서열은 1-26, 1-42, 1-50, 1-58, 1-72, 3-6, 5-6, 7-1, 및 14-2 서열로부터 선택된다.
한 구체예에서, 마우스는 DH 1-1, 2-14, 3-1, 3-2, 3-3, 4-1 및 이들의 조합으로부터 선택된 DH 유전자 세그먼트로부터 유도된 CDR3을 포함한다. 한 구체예에서, 마우스 CDR3은 JH1, JH2, JH3, 또는 JH4인 JH에 의해 암호화되는 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 DH 1-1, 2-14, 3-1, 3-2, 3-3, 4-1, 및 JH1, JH2, JH3, 또는 JH4의 재배열로부터 유도된 CDR3을 암호화하는 재배열된 항체 서열을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 기능적 CH1 부위가 결핍된 IgG 중쇄에서 FR4를 암호화하는 재배열된 유전자를 포함하는데, FR4는 DH1-1, 2-14, 3-1, 3-2, 3-3, 또는 4-1를 a JH1, JH2, JH3, 또는 JH4로 재배열에 의해 암호화되는 RF4와 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
한 구체예에서, 마우스는 내인성 마우스 중쇄 가변 부위 자리에서 재배열되지 않은 사람 중쇄 면역글로불린 가변 부위 (hVR) 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 내인성 마우스 중쇄 가변 부위 자리에서 변형된 IgG 불변 부위 서열과 작동 가능하게 연결된 재배열되지 않은 hVR 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, hVR 유전자 세그먼트는 VH1, VH3, VH4 및 이들의 조합으로부터 선택된 사람 VH 유전자 패밀리에서 온다. 한 구체예에서, 하나 이상의 hVR 유전자 세그먼트는 1-2, 1-8, 1-18, 1-46, 1-69, 3-21, 3-72, 및 4-59로부터 선택된다. 특이적 구체예에서, 하나 이상의 hVR 유전자 세그먼트는 1-8, 1-18, 및 1-69로부터 선택된다.
한 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 마우스 중쇄 V 유전자 세그먼트는 하나 이상의 사람 중쇄 V 유전자 세그먼트에 의해 대체된다. 한 구체예에서, 모든 마우스 중쇄 V 및 D 유전자 세그먼트는 하나 이상의 사람 중쇄 V 및 D 유전자 세그먼트에 의해 대체된다된다. 한 구체예에서, 모든 마우스 중쇄 V, D, 및 J 유전자 세그먼트는 하나 이상의 사람 중쇄 V, 하나 이상의 사람 중쇄 D, 및 하나 이상의 사람 중쇄 J 유전자 세그먼트로 대체된다. 이 구체예들에서, 사람 중쇄 V 및/또는 D 및/또는 J 유전자 세그먼트는 마우스 내인성 중쇄 자리에 있고 마우스 불변 부위 유전자 (들) 또는 변형된 마우스 불변 부위 유전자 (들)과 작동 가능하게 연결된다.
한 구체예에서, 마우스는 기능적 CH1 부위가 결핍된 IgG 중쇄의 FR1, FR2, 및 FR3 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는데, 이것은 1-8, 1-18, 또는 1-69 사람 면역글로불린 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트의 사람 생식세포계열 뉴클레오티드 서열의 FR1, FR2, 및 FR3와 적어도 80% 동일하다; 변형된 마우스의 FR1 + FR2 + FR3 서열은 마우스 및 사람 서열의 CDRs 서열과 관련 없이 나열된 사람 생식세포계열 서열로 최선으로 정렬된다 (즉, 비교적 CDRs 아미노산의 동일성을 고려하지 않고 최선으로 FRs을 정렬). 특이적 구체예에서, FR1, FR2, 및 FR3은 1-8, 1-18, 또는 1-69 유전자 세그먼트인 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트의 FR1 + FR2 + FR3의 사람 생식세포계열 뉴클레오티드 서열과 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 D6-19/J6 재배열, D6-7/J4 재배열, D4-4/J4 재배열, D6-6/J2 재배열, D3-16/J6 재배열, D6-6/J4 재배열, 및 D1-7/J4 재배열에 의해 형성된 FR4와 적어도 80% 동일한 FR4를 더 포함한다. 특이적 구체예에서, FR4는 상기 언급되는 D/J 재배열에 의해 형성되는 FR4와 약 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 동일하다.
한 구체예에서, 마우스는 아미노산 서열이 V1-8, V1-18, 및 V1-69로부터 선택된 사람 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트의 생식세포계열 서열에 의해 암호화되는 FR1의 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 또는 5개 이하의 아미노산에 따라 다른 FR1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특이적 구체예에서, FR1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 기능적 CH1 서열이 결핍된 IgG 불변 부위를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결된 재배열된 서열이다.
한 구체예에서, 마우스는 아미노산 서열이 V1-8, V1-18, 및 V1-69로부터 선택된 사람 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트의 생식세포계열 서열에 의해 암호화되는 FR2의 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 또는 5개 이하의 아미노산에 따라 다른 FR2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특이적 구체예에서, FR2를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 기능적 CH1 서열이 결핍된 IgG 불변 부위를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결된 재배열된 서열이다.
한 구체예에서, 마우스는 아미노산 서열이 V1-8, V1-18, 및 V1-69로부터 선택된 사람 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트의 생식세포계열 서열에 의해 암호화되는 FR3의 1개 이하, 2개 이하, 3개 이하, 4개 이하, 5개 이하, 6개 이하, 7개 이하, 8개 이하, 9개 이하, 10개 이하, 또는 11개 이하의 아미노산에 따라 다른 FR3를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특이적 구체예에서, FR3를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 기능적 CH1 서열이 결핍된 IgG 불변 부위를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결된 재배열된 서열이다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 D6-19/J6, D6-7/J4, D4-4/J4, D6-6/J2, D3-16/J6, D6-6/J4, 및 D1-7/J4의 재배열에 의해 암호화되는 FR4 아미노산 서열의 1개 이하, 2개 이하, 또는 3개 이하의 아미노산에 따라 아미노산 서열이 다른 FR4를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특이적 구체예에서, FR4를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 기능적 CH1 서열이 결핍된 IgG 불변 부위를 암호화하는 서열과 작동 가능하게 연결된 재배열된 서열이다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 중쇄 D 부위 유전자 세그먼트 (hDH)로부터 유도된 중쇄 CDR3을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 한 구체예에서, hDH는 D1-7, D3-16, D4-4, D6-6, D6-7, 및 D6-19로부터 선택된다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 중쇄 결합 유전자 세그먼트 (JH)로부터 유도된 중쇄 CDR3을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 특이적 구체예에서, JH는 J2, J4, 및 J6으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 마우스는 사람 DH 및 사람 JH 재배열로부터 유도된 뉴클레오티드 서열에 의해 암호화되는 중쇄 CDR3을 포함한다. 특이적 구체예에서, CDR3은 D1-7/J4, D3-16/J6, D4-4/J4, D6-6/J2, D6-6/J4, D6-7/J4, 또는 D6-19/J6 재배열로부터 유도된다.
한 구체예에서, 마우스는 내인성 mVR 유전자 세그먼트를 hVR 유전자 세그먼트로 대체을 포함한다. 특이적 구체예에서, mVR 유전자 세그먼트를 hVR 유전자 세그먼트로 대체는 변형된 중쇄 불변 부위와 같이 같은 대립 유전자에 위에 있다. 다른 구체예에서, mVR 유전자 세그먼트를 hVR 유전자 세그먼트로 대체는 변형된 중쇄 불변 부위와 다른 대립 유전자에 위에 있다.
한 구체예에서, 90-100%의 mVR 유전자 세그먼트는 적어도 하나의 hVR 유전자 세그먼트로 대체된다. 특이적 구체예에서, 모든 또는 실질적으로 모든 내인성 mVR 유전자 세그먼트는 적어도 하나의 hVR 유전자 세그먼트로 대체된다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 18개, 적어도 39개, 또는 적어도 80개 또는 81개의 hVR 유전자 세그먼트로 된다. 한 구체예에서, 대체는 적어도 12개의 기능적 hVR 유전자 세그먼트, 적어도 25개의 기능적 hVR 유전자 세그먼트, 또는 적어도 43개의 기능적 hVR 유전자 세그먼트이다.
한 구체예에서, 유전적으로 변형된 마우스는 적어도 하나의 재배열되지 않은 hVR 유전자 세그먼트, 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 D 세그먼트, 적어도 하나의 재배열되지 않은 사람 J 세그먼트, 및 적어도 하나의 사람 중쇄 불변 서열을 포함하는 전이 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 내인성 마우스 중쇄 가변 부위 및 카파 경쇄 가변 부위 자리는 기능적으로 침묵한다. 특이적 구체예에서, 마우스는 기능적 CH1 도메인이 결핍된, 선택적으로 기능적 CH1 도메인이 결핍된 IgG의 경첩 부위가 결핍된 마우스 IgG 서열과 인접한 사람 중쇄 가변 도메인을 포함하는 키메라화 사람/마우스 항체를 생산하기 위해 트랜스 스위칭 할 수 있다. 특이적 구체예에서, 전이 유전자는 CH1 도메인이 결핍된 IgG 서열을 더 포함하고, 선택적으로 기능적 CH1 도메인을 갖는 IgM을 포함한다. 더 특이적 구체예에서, IgG 서열은 경첩 부위가 결핍된다.
한 구체예에서, 마우스는 첫 번째 중쇄 가변 부위 대립 유전자 및 두 번째 중쇄 가변 부위 대립 유전자를 포함하는데, 첫 번째 대립 유전자 및 두 번째 대립 유전자는 둘 다 같은 마우스 종에서 온다. 한 구체예에서, 첫 번째 대립 유전자는 첫 번째 마우스 종에서 오고, 두 번째 대립 유전자는 두 번째 마우스 종에서 온다. 한 구체예에서, 첫 번째 및 두 번째 대립 유전자의 한 대립 유전자는 mVR을 적어도 하나의 hVR로 대체하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 대립 유전자 둘 다는 mVR을 적어도 하나의 hVR로 대체하는 것을 포함한다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 마우스는 제공되는데, 마우스는 CH1 도메인을 포함하는 IgM을 발현하고, 마우스는 기능적 CH1 도메인이 결핍된 IgG를 발현하거나 기능적 CH1 도메인 및 기능적 경첩 부위 둘 다가 결핍된 IgG를 발현한다.
한 구체예에서, IgG는 IgG1이다.
한 구체예에서, 마우스는 변형된 IgG1 및 야생형 IgG3, IgG2a, 및 IgG2b인 4개의 IgG를 발현한다. 다른 구체예에서, 마우스는 변형된 IgG1 및 야생형 IgG3인 2개 이하의 IgGs를 발현한다. 특이적 구체예에서, 마우스는 야생형 IgM, 야생형 IgD, 야생형 IgG3, 변형된 IgG1, 야생형 IgG2a, 야생형 IgG2b, 야생형 IgA, 및 야생형 IgE인 중쇄 이소타입을 발현한다. 다른 특이적 구체예에서, 마우스는 야생형 IgM, 야생형 IgD, 야생형 IgG3, 변형된 IgG1, 야생형 IgA, 및 야생형 IgE인 중쇄 이소타입을 발현한다. 다양한 구체예에서, IgG1의 변형은 CH1 도메인의 결실, 선택적으로, 경첩 부위의 결실을 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 129, C56BL/6, 혼합된 129 x C57BL/6로부터 선택된 종에서 온다.
한 양태에서, 중쇄 항체를 발현하는 마우스는 제공되는데, 중쇄 항체는 본질적으로 다이머화 중쇄으로 구성되고, 중쇄는 기능적 CH1 도메인이 결핍되거나 기능적 CH1 도메인 및 기능적 경첩 부위 둘 다가 결핍되고, 중쇄는 생식세포계열 가변 부위 유전자에 의해 암호화되는 포유동물 중쇄 가변 도메인과 동일하지 않은 서열을 포함하는 포유동물 중쇄 가변 도메인을 포함하고, 중쇄는 사람 또는 마우스 CH2 도메인 및 사람 또는 마우스 CH3 도메인을 포함하고, 마우스는 야생형 사람 또는 마우스 IgM을 발현한다.
한 구체예에서, 마우스는 기능적 면역글로불린 경쇄 유전자 자리를 포함한다.
한 구체예에서, 포유동물 중쇄 가변성 도메인은 사람 또는 마우스 중쇄 가변 도메인이다.
한 구체예에서, 중쇄 항체는 본질적으로 기능적 CH1 도메인이 결핍되고 기능적 경첩 부위가 결핍된 다이머화 중쇄으로 구성되는데, 중쇄는 적어도 하나의 체세포 돌연변이를 포함하는 사람 가변 도메인을 포함하고 CH2 도메인 및 CH3 도메인을 포함한다. 특이적 구체예에서, CH2 도메인 및 CH3 도메인은 독립적으로 마우스 및 사람 도메인으로부터 선택된다. 특이적 구체예에서, CH2 및 CH3 도메인 둘 다는 사람이고; 또 다른 구체예에서, CH2 및 CH3 도메인 둘 다는 마우스이다.
한 양태에서, 중쇄 항체는 제공되는데, 중쇄 항체는 비-카멜리드 가변 도메인 및 CH1 도메인이 결핍된 중쇄 불변 부위를 포함하는 중쇄를 포함한다.
한 구체예에서, 중쇄 항체는 경첩 부위가 더 결핍된다.
한 구체예에서, 중쇄 항체는 본질적으로 경첩 부위, CH2 도메인, 및 CH3 도메인으로 구성되는 불변 부위를 포함한다. 다른 구체예에서, 중쇄 항체는 본질적으로 CH2 도메인 및 CH3 도메인으로 구성되는 불변 부위를 포함한다. 한 구체에에서, 비-카멜리드 도메인은 IgM 또는 IgG 암호화하는 마우스 또는 사람 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트를 포함하는 유전학적으로 변형된 마우스의 B세포 뉴클레오티드 서열로부터 얻은 체세포 돌연변이되는 사람 또는 마우스 중쇄 가변 부위이다. 특이적 구체예에서, 마우스는 사람화 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트를 포함한다. 다른 구체예에서, 마우스는 내인성 마우스 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트 자리를 적어도 하나의 사람 가변 부위 유전자 세그먼트로 대체하는 것을 포함한다. 다른 구체예에서, 마우스는 내인성 마우스 중쇄 자리를 적어도 하나의 사람 가변 부위 세그먼트, 적어도 하나의 사람 D 유전자 세그먼트, 및 적어도 하나의 사람 J 유전자 세그먼트로 대체하는 것을 포함한다. 특이적 구체예에서, 내인성 마우스 면역글로불린 가변 부위 자리는 모두 또는 거의 모두 복수의 사람 V, D, 및 J 유전자 세그먼트를 포함하는 사람 면역글로불린 가변 부위 자리로 대체된다.
한 구체예에서, 비-카멜리드 가변 도메인은 사람 또는 마우스 가변 도메인이다. 다른 구체예에서, 비-카멜리드 가변 도메인은 하나 이상의 카멜화 변형을 포함하는 사람 또는 마우스 가변 도메인이다. 특이적 구체예에서, 카멜화 변형은 L11S, V37F, G44E, L45C, L45R, 및 W47G (카바트 번호)로부터 선택된다. 특이적 구체예에서, 카멜화 변형은 V37F, G44E, 및 L45C로부터 선택된다. 특이적 구체예에서, 중쇄 가변 도메인은 2개의 시스테인을 포함하는 상보성 결정 부위 3 (CDR3)을 포함한다.
한 구체예에서, 중쇄 항체는 첫 번째 중쇄 가변 도메인을 포함하는 첫 번째 중쇄의 다이머 및 두 번째 중쇄 가변 도메인을 포함하는 두 번때 중쇄의 다이머를 포함하는데, 첫 번째 및 두 번째 중쇄는 각각 CH1 도메인이 결핍된다 (또는 CH1 도메인 및 경첩 부위가 결핍된다). 한 구체예에서, 다이머의 첫 번째 중쇄의 사람 가변 도메인은 첫 번째 에피토프와 결합하고, 다이머의 두 번째 중쇄의 사람 가변 도메인은 두 번째 에피토프와 결합하는데, 첫 번째 및 두 번째 에피토프는 동일하지 않다. 특이적 구체예에서, 첫 번째 및 두 번째 중쇄의 중쇄 가변 도메인은 여기에 설명되는 바와 같이 사람 중쇄 가변 도메인 및 사람 중쇄 FR 부위을 포함한다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 비-사람 세포는 제공되는데, 유전적 변형은 IgG CH1 도메인의 결실을 포함하고 세포는 기능적 IgM을 발현한다. 특이적 구체예에서, 세포는 CH1 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 IgM 유전자를 포함한다.
한 구체예에서, 세포는 비-사람 ES 세포, 만능세포, 및 전능세포로부터 선택된다. 특이적 구체예에서, 비-사람 ES 세포는 마우스 ES 세포 및 래트 ES 세포로부터 선택된다.
한 양태에서, 유전적으로 변형된 비-사람 태아는 제공되는데, 유전적 변형은 상기 설명되는 바와 같은 변형을 포함한다. 한 구체예에서, 유전적 변형은 IgG CH1 도메인의 결실을 포함하고 비 사람 태아는 CH1 도메인을 포함하는 IgM 유전자를 포함한다.
한 구체예에서, 비-사람 태아는 마우스 태아 또는 래트 태아이다.
한 양태에서, 공여 세포를 포함하는 비 사람 태아는 제공되는데, 공여 세포는 유전적으로 변형되고, 유전적 변형은 상기 설명되는 바와 같은 변형이다. 한 구체예에서, 유전적 변형은 IgG CH1 도메인의 결실을 포함하고 세포는 CH1 도메인을 포함하는 IgM 유전자를 포함한다.
한 구체예에서, 비 사람 태아는 마우스 태아 또는 래트 태아이고, 공여 세포는 마우스 ES 세포 또는 래트 ES 세포이다.
한 양태에서, DNA 구조는 제공되는데, DNA 구조는 (a) 첫 번째 서열 5'과 상동이고 IgG CH1 부위의 시작에 바로 인접한 마우스 상동성 팔 (homology arm); (b) 마커 또는 약물 선택 카세트; 및 (c) 두 번째 서열 3'에 상동이고 IgG CH1 부위의 말단에 바로 인접한 상동성 팔 또는, 대안으로, 두 번째 서열 3'에 상동이고 IgG 경첩 부위의 말단에 바로 인접한 상동성 팔을 포함한다.
한 양태에서, CH1 도메인이 결핍된 항체를 만드는 방법은 제공되는데, (a) 여기에 설명되는 바와 같이 IgG에 기능적 CH1 도메인이 결핍되거나 IgG에 기능적 경첩 부위가 결핍된 비-사람 동물을 면역화하는데, 마우스는 기능적 CH1 도메인을 포함하는 IgM을 발현하는 단계; (b) 항체를 만들기 위해 비-사람 동물에 대해 충분한 조건 하에 비-사람 동물을 유지하는 단계; 및 (c) 마우스로부터 항체, 항체를 만드는 세포, 또는 항체의 서열을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 분리하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 비 사람 동물은 기능적 면역글로불린 경쇄 유전자 자리를 포함한다.
한 양태에서, 마우스 중쇄 항체를 사람화하는 방법은 제공되는데, 흥미있는 항원으로 중쇄 항체를 만드는 유전적으로 변형된 마우스를 면역화하는 단계, 마우스가 면역 반응을 시작하는 것을 허용하는 단계, 특이적으로 흥미있는 항원과 결합하는 마우스의 B 세포에서 암호화되는 마우스의 마우스 VH 부위을 확인하는 단계, 및 VH 부위을 사람화하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 중쇄 항체를 만드는 유전적으로 변형된 마우스는 상기 설명되는 바와 같은 마우스이다. 한 구체예에서, 마우스는 온전한 IgM 유전자를 포함하고 CH1 도메인이 결핍되거나 CH1 도메인이 결핍되고 경첩 부위가 결핍된 IgG 유전자를 포함하는 중쇄 불변 자리와 최선으로 작동 가능하게 연결된 적어도 하나의 mVR 유전자 세그먼트를 포함한다. 한 구체예에서, IgG 유전자는 IgG1, IgG2A, IgG2B, IgG3 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
한 구체예에서, 방법은 사람 면역글로불린 불변 부위의 뉴클레오티드 서열에서 사람화 VH 부위을 암호화하는 뉴클레오티드의 클로닝을 더 포함한다.
한 구체예에서, 마우스 mVR 유전자 세그먼트는 VH1 및 VH14로부터 선택된 마우스 VH 유전자 패밀리이고, 사람화는 VH1 또는 VH14의 마우스 골격을 사람 VH1 유전자의 골격으로 대체하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 VH1 유전자는 1-2, 1-3, 1-8, 1-17, 1-18, 1-24, 1-45, 1-46, 1-58, 및 1-69로부터 선택된다. 특이적 구체예에서, mVR 유전자는 1-58 유전자이고 사람 유전자는 1-18 유전자이다; mVR 유전자는 1-26 유전자이고 사람 유전자는 1-2 유전자이다; mVR 유전자는 1-50 유전자이고 사람 유전자는 1-46 유전자이다; mVR 유전자는 1-17 유전자이고 사람 유전자는 1-2 유전자이다; mVR 유전자는 1-42 유전자이고 사람 유전자는 102 유전자이다; mVR은 14-1 유전자이고 사람 유전자는 1-2 유전자이다; 또는 mVR은 14-2 유전자이고 사람 유전자는 1-2 유전자이다.
한 구체예에서, mVㄲ 유전자 세그먼트는 VH4, VH5, VH6, VH7, VH10, VH11, 및 VH13 유전자로부터 선택된 마우스 VH 유전자이고, 사람화는 마우스 골격을 사람 VH3 유전자의 골격으로 대체하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 VH3 유전자는 3-7, 3-9, 3-11, 3-13, 3-15, 3-16, 3-20, 3-21, 3-23, 3-30, 3-33, 3-35, 3-38, 3-43, 3-48, 3-49, 3-53, 3-64, 3-66, 3-72, 3-73, 및 3-74로부터 선택된다. 특이적 구체예에서, mVR 유전자는 7-1 유전자이고 사람 유전자는 3-72유전자이다; mVR 유전자는 3-6 유전자이고 사람 유전자는 4-59 유전자이고; mVR 유전자는 5-6 유전자이고 사람 유전자는 3-21 유전자이다.
한 구체예에서, mVR 유전자 세그먼트는 VH3 및 VH12로부터 선택된 마우스 VH 유전자 패밀리이고 사람화는 마우스 골격을 사람 VH4 유전자의 골격으로 대체하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 VH4 유전자는 4-4, 4-28, 4-31, 4-34, 4-39, 4-59, 및 4-61로부터 선택된다.
한 구체예에서, mVR 유전자 세그먼트는 VH4 유전자 패밀리이고, 사람화는 마우스 VH4 골격을 사람 VH6 유전자의 골격으로 대체하는 것을 포함한다. 한 구체에에서, 사람 VH6 유전자는 6-1이다.
한 구체예에서, mVR 유전자 세그먼트는 VH9 유전자 패밀리이고, 사람화는 마우스 VH9 골격을 사람 VH7 패밀리의 사람 VH 유전자의 골격으로 대체하는 것을 포함한다. 한 구체예에서, 사람 VH 유전자는 7-4-1 및 7-81로부터 선택된다.
한 구체예에서, 사람화는 사람 CDR에 더 밀접하게 일치하는 마우스 CDR에서 하나 이상의 보존 또는 비-보존 대체, 하나 이상의 결실, 및/또는 하나 이상의 삽입을 만드는 것을 더 포함한다.
한 구체예에서, 사람화는 마우스 골격에 더 밀접하게 일치하는 사람 골격에서 하나 이상의 보존 또는 비-보존 대체, 하나 이상의 결실, 및/또는 하나 이상의 삽입을 만드는 것을 더 포함한다.
한 양태에서, 기능적 면역글로불린 경쇄 유전자를 포함하는 유전적으로 변형된 마우스는 제공되는데, 마우스는 경쇄가 결핍되고 CH1 부위이 결핍되거나 CH1 부위 또는 경첩 부위가 결핍된 중쇄 항체를 발현한다.
한 구체예에서, 마우스는 CH1 부위을 암호화하는 서열이 결핍되거나, 경첩 및 CH1 부위를 암호화하는 서열이 결핍된 면역글로불린을 포함한다. 한 구체예에서, 서열이 결핍된 면역글로불린 유전자는 하나 이상의 중쇄 불변 유전자이다. 특이적 구체예에서, 서열이 결핍된 면역글로불린 유전자는 IgG1, IgG2a, IgG2b, 및 IgG3 유전자로부터 선택된다. 특이적 구체예에서, 마우스는 CH1 부위, 및/또는 경첩 부위, 및/또는 CH1 부위 및 경첩 부위가 있는 IgM 유전자를 포함한다.
한 구체예에서, 항체는 항원에 반응하여 발현되고 항체는 특이적으로 항원에 결합한다.
한 구체예에서, 항체는 마우스 VH 도메인을 포함한다. 특이적 구체예에서, 마우스 VH 도메인은 1-26, 1-42, 1-50, 1-58, 1-72, 3-6, 5-6, 7-1, 14-1, 및 14-2로부터 선택된 마우스 Vh 유전자 세그먼트를 포함한다.
한 구체예에서, 항체는 사람 VH 도메인을 포함한다. 특이적 구체예에서, 사람 VH 도메인은 1-2, 1-18, 1-46, 3-21, 3-72, 및 4-59로부터 선택된 사람 VH 유전자 세그먼트로부터 유도된 서열을 포함한다.
한 양태에서, 본질적으로 각 CH1 도메인이 결핍된 2개의 IgG1 중쇄으로 구서되는 결합 단백질을 발현하는 유전적으로 변형된 마우스는 제공되는데, 마우스는 CH1 부위을 포함하는 IgM을 발현하고, 마우스는 그것의 게놈으로부터 IgG1의 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 mRNA를 발현할 수 있다.
한 구체예에서, 각 CH1 도메인이 결핍된 면역글로불린 중쇄는 본질적으로, N-말단에서 C-말단까지, 사람 또는 마우스 중쇄 면역글로불린 가변 부위, 선택적으로 경첩 부위, 마우스 CH2 부위, 및 마우스 CH3 부위으로 구성된다. 특이적 구체예에서, 중쇄 면역글로불린 가변 부위은 사람 가변 부위이고, 경첩 부위는 존재하고, 마우스는 기능적 면역글로불린 경쇄 유전자 자리를 포함한다.
한 양태에서, 경쇄가 결핍되고 전체에서 또는 일부에서 CH1 부위이 결핍된 중쇄 항체를 발현하는 마우스는 제공되는데, 마우스는 B세포에서 B 세포 수용체를 발현하고, 그것의 표면에서 B 세포 수용체는 직접적으로 면역글로불린 경첩 부위에 융합하거나 직접적으로 CH2 부위에 융합하는 면역글로불린 중쇄 가변 도메인을 포함하는 결합 분자를 나타내고, 결합 분자는 CH1 부위이 결핍된다. 한 구체예에서, 결합 분자는 IgG1 CH2 및 CH3 부위을 포함한다.
한 양태에서, 중쇄 항체를 만드는 방법은 제공되는데, 흥미있는 항원으로 CH1 부위을 암호화하는 서열이 결핍된 IgG 유전자를 포함하고, 인접한 IgM 불변 부위 유전자를 포함하는 마우스를 면역화하는 단계, 마우스가 흥미 있는 항원에 대한 면역 반응을 시작하는 것을 허용하는 단계, 및 마우스로부터 특이적으로 흥미있는 항원을 인지하는 CH1 도메인이 결핍되고 동족 경쇄가 결핍되고 특이적으로 흥미있는 항원과 결합하는 중쇄 항체를 포함하는 세포 또는 단백질을 분리하는 단계를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 기능적 경쇄 유전자를 포함한다. 한 구체예에서, 마우스는 람다, 카파, 및 이들의 조합으로부터 선택된 기능적 경쇄 유전자를 포함한다.
한 구체예에서, 마우스는 모든 또는 실질적으로 거의 모든 마우스 중쇄 V, D, J 유전자 세그먼트를 하나 이상의 사람 V, D, J 유전자 세그먼트로 대체하는 것을 포함한다.
한 구체예에서, CH1을 암호화하는 서열이 결핍된 IgG 유전자는 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 및 이들의 조합으로부터 선택된다.
한 구체예에서, CH1 서열이 결핍된 IgG 유전자는 IgG1이고, 마우스는 IgG2a, IgG2b, IgG3, 또는 이들의 조합을 암호화하는 유전자가 결핍된다. 한 구체예에서, CH1 서열이 결핍된 IgG 유전자는 IgG2a이고, 마우스는 IgG1, IgG2a, IgG3, 또는 이들의 조합을 암호화하는 유전자가 결핍된다. 한 구체예에서, CH1 서열이 결핍된 IgG 유전자는 IgG3이고, 마우스는 IgG1, IgG2a, IgG2b, 또는 이들의 조합을 암호화하는 유전자가 결핍된다.
한 구체예에서, 마우스는 표면에 B 세포 수용체가 있는 B 세포를 포함하는데, B 세포 수용체는 흥미있는 항원에 결합하는 재배열된 중쇄 VDJ를 포함하고, B 세포 수용체는 CH1 부위을 포함하는 IgM을 포함하고, IgM은 경쇄를 포함한다. 한 구쳉PP에서, 경쇄는 재배열된 VJ이다. 특이적 구체예에서, 경쇄는 흥미있는 항원과 결합하는 재배열된 중쇄 VDJ와 동족인 카파 또는 람다 경쇄가다.
한 앙태에서, 본 발명에 따라 마우스에서 만들어진 마우스 중쇄 항체, 사람 중쇄 항체, 또는 키메라화 사람/마우스 중쇄 항체는 제공된다.
한 양태에서, 중쇄 가변 부위 뉴클레오티드 서열을 사용하여 만들어진 마우스 중쇄 항체, 사람 중쇄 항체, 키메라화 사람/마우스 중쇄 항체, 또는 사람화 중쇄 항체 또는 본 발명에 따라 마우스에서 이들의 단편은 제공된다.
다른 구체예는 설명되고 다음 상세 설명의 재검토로부터 당업자들에게 분명해질 것이다.
도 1은 마우스에서 야생형 IgG1 자리 (IgG1, 위)를 도시하는데, 경첩 부위 다음에, CH1 유전자 세그먼트, CH2 유전자 세그먼트, 및 CH3 유전자 세그먼트에 융합하는 JH 부위 유전자 세그먼트; CH1 도메인이 결실되는 구조 (IgG1ΔCH1, 중간)로 표적화되는 IgG1 자리; 및 CH1 도메인 및 경첩 부위 둘다 결실되는 구조로 표적화되는 IgG1 자리 (IgG1ΔCH1-Δhinge, 아래)를 나타낸다.
도 2는 CH1 도메인이 결핍된 IgG1을 발현하는 유전적으로 변형된 자리를 만들기 위한 마우스 IgG1 유전자의 표적화를 도시한다.
도 3은 CH1 도메인이 결핍되고 경첩 부위가 결핍된 IgG1을 발현하는 유전적으로 변형된 자리를 만들기 위한 마우스 IgG1 유전자의 표적화를 도시한다.
도 4는 CH1 도메인이 결핍된 IgG1을 발현하고, IgG2b 또는 IgG2a를 발현하지않는 유전적으로 변형된 자리를 만들기 위한 마우스 중쇄 불변 부위 자리의 표적화를 도시한다.
도 5는 CH1 도메인 및 경첩 부위가 결실되고 IgG2b 유전자 및 IgG2a 유전자가 결실되는 구조로 표적화되는 마우스 중쇄 불변 부위를 도시한다.
도 6은 CH1 도메인이 결핍된 또는 CH1 도메인 및 경첩 부위가 결핍된 IgG1을 갖는 유전적으로 변형된 마우스의 중쇄 불변 부위 (위), 및 CH1 도메인이 결핍된 또는 CH1 도메인 및 경첩 부위가 결핍되고, IgG2a 유전자 및 IgG2b 유전자가 결핍된 IgG1을 갖는 유전적으로 변형된 마우스의 중쇄 불변 부위 (아래)를 도시한다.
도 7은 대조군 (시토킨 막외부 마우스 Fc와 융합), CH1 도메인이 결핍된 키메라화 (사람 VR)/(쥐 FC) 중쇄 항체 (hVR-mFCΔCH1), CH1 도메인이 결핍된 카멜화 키메라화 (사람 VR)/(쥐 FC) 중쇄 항체 (hVR*-mFCΔCH1), 키메라화 (사람 VR)/(쥐 FC) 중쇄 항체 (hVR-mFc), 카멜화 키메라화 (사람 VR)/(쥐 FC) 중쇄 항체 (hVR*-mFc), CH1 도메인이 있는 mFc (mFc) 또는 없는 mFc (mFcΔCH1)을 독립적으로 발현하기 위해 설계되는 CHO 세포의 CHO 세포 상층액의 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 8은 야생형 마우스 (왼쪽)의 마우스 혈청 및 IgG1의 CH1 도메인이 결핍되고 경첩 부위가 결핍된 유전적으로 변형된 마우스 (동형접합체)의 마우스 혈청의 감소되는 SDS-PAGE의 항 마우스 IgG로 블롯되는 웨스턴 블롯 이미지를 나타낸다; 중쇄의 도식이 제공되고, 분자량 마커 자리에 있다.
도 9는 야생형 마우스 (WT) 및 4마리의 IgG1의 CH1 도메인이 결핍되고 경첩 부위가 결핍된 유전적으로 변형된 마우스 (동형접합체; 각각 HO1, HO2, HO3, HO4로 표시됨))의 마우스 혈청의 비-감소되는 SDS-PAGE의 항 마우스 IgG로 블롯되는 웨스턴 블롯 이미지를 나타낸다; 각 마우스 (WT 또는 HO)는 상기 레인에 괄호에 의해 지시되는 각 동물의 혈청에 대한 1:5 및 1:10 희석과 일치하는 두 레인에 의해 대표된다 (각각 왼쪽부터 오른쪽까지 연속적인 레인).
도 10은 정상적인 IgG1 항체 (왼쪽) 및 CH1 도메인이 결핍되고 경첩부위가 결핍된 중쇄 항체의 개략도를 제공한다.
도 11은 야생형 (WT) 및 CH1 도메인이 결핍되고 경첩 부위가 결핍된 IgG1을 함유하는 유전적으로 변형된 마우스로부터 별도의 IgG1 및 IgG2b 혈청 면역글로불린 검정을 나타낸다 (HO; CH1 도메인이 결핍되고 경첩 부위가 결핍된 중쇄를 발현하는 동형 접합체 마우스). 대조군은 모아진 사람 혈청이다.
도 12는 IgG1 CH1 및 경첩 부위 서열이 없는 변형된 내인성 마우스 중쇄 자리에 마우스 중쇄 유전자 서열을 가진 마우스의 지라세포 RNA로부터 증폭되는 11개의 독립되는 RT-PCR 클론의 단백질 서열을 나타낸다. B1= SEQ ID NO:19; B2= SEQ ID NO:21; B3= SEQ ID NO:23; B5= SEQ ID NO:25; D2= SEQ ID NO:27; D5= SEQ ID NO:29; D6= SEQ ID NO:31; E2= SEQ ID NO:33; E8= SEQ ID NO:35; E10= SEQ ID NO:37; F6= SEQ ID NO:39. 소문자 염기는 돌연변이 및/또는 재조합 중 N 추가로 인한 비-생식세포계열 염기를 나타낸다. 점은 골격 (FR) 및 상보성 결정 부위 (CDR)의 적절히 정렬되는 서열에서 인위적인 간격을 대표하는데, 이것은 상기 서열에 표시된다. 내인성 IgG1 (CH2) 불변 부위의 CH2 부위으로부터 처음 9개의 아미노산은 각 클론에 대해 나타난다.
도 13은 도 12는 IgG1 CH1 서열이 없는 변형된 내인성 마우스 중쇄 자리에 마우스 중쇄 유전자 서열을 가진 마우스의 지라세포 RNA로부터 증폭되는 11개의 독립되는 RT-PCR 클론의 단백질 서열을 나타낸다. A8= SEQ ID NO:51; C2= SEQ ID NO:53; D9= SEQ ID NO:55; C4= SEQ ID NO:57; H8= SEQ ID NO:59; A5= SEQ ID NO:61; A2= SEQ ID NO:63. 소문자 염기는 돌연변이 및/또는 재조합 중 N 추가로 인한 비-생식세포계열 염기를 나타낸다. 점은 골격 (FR) 및 상보성 결정 부위 (CDR)의 적절히 정렬되는 서열에서 인위적인 간격을 대표하는데, 이것은 상기 서열에 표시된다. 내인성 IgG1 (HINGE) 불변 부위의 13 아미노산 경첩 부위의 처음 7개의 아미노산은 각 클론에 대해 나타난다.
본 발명은 특정 방법에 제한되지 않고, 방법 및 조건과 같이, 설명되는 실험 조건은 달라질 수도 있다. 여기에 사용되는 용어는 특정 구체예만을 설명하기 위한 목적이고, 본 발명의 범위는 청구항에 의해서만 제한될 것이기 때문에, 제한할 의도는 없다.
달리 정의되지 않으면, 여기에 사용되는 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명의 속한 당업자들에게 보통 이해되는 바와 같은 의미를 갖는다. 여기에 설명되는 것과 유사하거나 동등한 어떤 방법 및 재료도 본 발명의 수행 및 테스트에 사용될 수 있고, 특정 방법 및 재료는 지금 설명된다. 여기 언급되는 모든 출판물 전문은 본원에 참고로 포함된다.
CH1 도메인 및 항체 생산
중쇄 항체, 즉, 경쇄가 결핍된 항체를 포함하는, CH1 도메인이 결핍된 항체를 만드는 유전적으로 변형된 비-사람 동물은 제공된다. 유전적으로 변형된 비-사람 동물은 기능적 면역글로불린 중쇄 도메인, 예를 들어, IgG1 CH1 도메인의 부족을 포함하는 유전적 변형, 및 몇몇 구체예에서 기능적 CH1 도메인이 결핍된 면역글로불린 중쇄에서 경첩 부위의 결실을 포함하는 변형을 포함하는데, 비-사람 동물은 기능적 IgM을 발현한다. 다른 변형은 IgG1 및 IgM을 제외한 다른 이소타입을 IgD, IgG3, IgG2a, IgG2b, IgA, 및 IgE에 대해 비기능적으로 만드는 것, 예를 들어 유전자에서 결실을 만드는 것, 또는 유전자의 결실을 만드는 것을 포함한다. 유전적으로 변형된 비-사람 태아, 세포, 및 비-사람 동물, 비-사람 태아, 및 세포를 만들기 위한 표적화 구조는 또한 제공된다.
중쇄 항체 (즉 경쇄가 없는 항체)를 만들 수 있는 유전적으로 변형된 세포를 만들려는 노력은 다른 종, 예를 들어 카멜리드 및 특정 물고기의 중쇄 항체를 모방하는데 초점을 맞추었다. 이 접근은 IgMs 및 IgGs의 면역글로불린 불변 부위 유전자의 CH1 도메인을 결실하기 위해, 또한 중쇄 가변 부위를 카멜리드, 또는 카멜화된 (VHH 또는 VHH-유사) ES 세포 내로 도입하기 위해 유전적으로 변형된 마우스 ES 세포에 사용되었다. IgM 및 IgG CH1 도메인의 결실은 아마 유전적으로 변형된 자리의 카멜화된 항체 형성과 경쟁하는 내인성, 자연적 항체의 형성을 방지하기 위해 착수된다. VHH 유전자 세그먼트의 추가는 아마 CH1 결실된 조합에서 중쇄 항체 형성을 모방하기 위해 착수된다. 이러한 동물의 중쇄 항체는 VHH 유전자 세그먼트를 함유한다. VHH 유전자 세그먼트는 아마 시험관 내에서 연구는 CH1 도메인이 결실된 중쇄 존재할 때 비-카멜리드 VH 도메인이 발현 가능한 중쇄 항체를 만족스럽게 형성하지 않는다는 것을 나타내기 때문에, 중쇄 항체의 적절한 발현에 필수적인 것이라고 생각된다.
하지만, 카멜리드에서 (및 특정 연골 어류에서), CH1 도메인, 또는 CH1-유사 도메인을 포함하는 유전자는 존재한다. CH1 도메인이 결핍된 VHH-함유한 항체는 RNA 스플라이싱 또는 CH1 부위를 암호화할 수 있는 DNA 서열의 재배열에 대한 결과라고 생각된다. 따라서, 카멜리드는 CH1 부위를 암호화하는 DNA 서열을 유지한다. 사람 (몇몇 상황 하에)은 CH1 부위가 결핍된 중쇄 항체를 전체 또는 부분적으로 (예를 들어, 사람 중쇄 병에서) 만들 수 있기 때문에, 마우스 같은, 비-카멜리드가 주어진 상황의 설정 하에 CH1 부위가 결핍된 중쇄를 형성하도록 강요하는 것이 가능할 수도 있다. 이 접근은 CH의 생식세포계열 구조를 방해하지 않는 것에 의존하지만, 대신에 동물의 경쇄 자리를 비기능적으로 만든다. 이 접근은 비기능적 경쇄 로커스가 있는 발현에 대한 동족 경쇄를 필요로 하는 중쇄 (예를 들어, CH1 부위를 갖는 전체 길이 중쇄)은 카파 또는 람다 경쇄 때문에 만들어지지 않고 경쇄 없이 발현 및 분비할 수 있는 그것의 중쇄만 (즉, CH1 부위가 결핍된 중쇄) 발현되고 분비될 것이다. 접근은 기능적 경쇄 유전자를 형성하기 위해 재배열 할 수 있는 기능적 카파 또는 람다 유전자 세그먼트의 부재, 및 기능적 재배열된 경쇄 유전자에 의존하고, 따라서 생식세포계열 경쇄 자리 둘 다의 기능성을 파괴하기 위해 유전적 조작이 필요하다 (예를 들어, 넉아웃). 접근은 내인성 CH1 뉴클레오티드 서열의 비-사용으로 이끄는 "자연적" 과정, 및 CH1 침묵의 "자연적" 과정은 종류 스위칭에서 발생하는 것에 의존한다. 기능적 경쇄 유전자를 함유한 동물에서 이러한 과정을 사용할 가능성이 나타나지 않는다. 게다가, "자연적" 과정은 많은 양의 정상적인 RNA, 즉, CH1 부위를 암호화하는 부위를 포함하는 RNA의 합성을 포함한다.
조성물 및 방법은 중쇄 항체를 포함하고, VH 도메인 (예를 들어, 마우스 또는 사람 VH 도메인)을 포함하는 항체를 포함하는, 면역글로불린 CH1 도메인 (및 선택적으로 경첩 부위)이 결핍된 항체를 만드는 마우스를 만들기 위해 제공된다. 방법은 선택적으로 내인성 비-IgM CH1 부위를 비기능적으로 만드는 것 (예를 들어, CH1 도메인 서열의 결실에 의해), 및 마우스에서 키메라화 사람/마우스 항체를 만들기 위해 내인성 마우스 가변 부위 자리에서 재배열된 내인성 마우스 가변 부위 (mVR) 유전자 세그먼트 또는 재배열된 사람 가변 부위 (hVR) 유전자 세그먼트를 활용하는 것을 포함한다. CH1 도메인의 결실은 하나 이상의 IgG 유전자에서 만들어지지만 IgM 유전자에서는 아니다. 접근은 선택적으로 기능적 IgM을 유지하지만 하나 이상의 IgG CH1 도메인을 비기능적으로 만든다. 하나 이상의 IgG CH1 도메인의 결실에 추가로, 구체예는 CH1 도메인이 결실되거나 비기능적으로 만들어진 IgG(s)의 경첩 부위를 결실 또는 비기능적으로 만드는 것을 제공한다.
IgG CH1 결실 접근은 동물의 자연적 B 세포 발달에 상대적으로 보존적인 방해를 활용하는데 유전적으로 변형된 비-사람 동물의 모든 Ig 이소타입이 비기능적 CH1 또는 CH1 도메인 (및, 선택적으로, 경첩)의 결실을 나타낼 것이기 때문이 아니다. 따라서, CH1 변형은 IgM 분자에서 발생하지 않고 따라서 기능적 CH1을 갖는 IgM에 의존적인 초기 B 세포 발달의 단계에 영향을 미치지 않는다. IgM이 변형되지 않기 때문에, IgM의 CH1 도메인이 아니지만, IgG의 CH1 도메인 (및 선택적으로 IgG의 경첩 부위)의 하나 이상의 결실을 함유하는 동물은 IgG를 이용한 가변 도메인의 표현 전 클론의 선택 단계에서 만족스럽게 가변 부위의 큰 레파토리를 진행할 수 있어야 한다. 따라서, 다양한 구체예에서, 중쇄 항체에서 사용 가능한 가변 부위의 다양성에 대한 유전적 변형 (들)의 해로운 효과는 IgG를 l용한 선택에 대해 사용 가능한 가변 부위의 풀에 부정적으로 영향을 미치지 않아야 한다. 게다가, 생식세포계열에서 비기능적 (예를 들어, 결실된)이 되는 CH1 서열이 IgG1인 경우, 마우스는 CH1 도메인을 암호화하는 RNA를 만들 능력이 결핍될 것이다.
하나 이상의 IgG 이소타입의 CH1 도메인 또는 Ch1 도메인 및 경첩 부위를 비기능적으로 만들기 위해 유전적으로 변형된 비-사람 동물은, VH 부위의 전체 또는 실질적으로 전체 레파토리로부터, 중쇄 항체에서 발현하기 적합한 Vh 부위를 선택할 수 있는 마우스를 초래할 수도 있다. 선택적으로 변형된 IgG 이소타입 (하지만 IgM은 아니다)은 CH1 도메인의 결핍 또는 IgM에서 CH1 도메인의 결핍 때문에 선택에서 살아남은 VH 부위의 숫자의 잠재적 감소를 막는다. 따라서, VH 부위의 가득 찬 레파토리는 (CH1 도메인이 결핍되거나 CH1 도메인이 결핍되고 경첩 부위가 결핍되는) IgG를 이용한 선택에 사용 가능하다. 따라서, 본 발명의 따라 유전적으로 변형된 마우스에서 VH 도메인의 선택은 예를 들어, 변화된 IgM 구조 때문에 초기 IgM 의존적 B 세포 발달 장애의 극복을 도울 수도 있는 VH 도메인에 의존적이지 않다. 대신에, 초기 IgM 의존적 단계는 정상적으로서 발생해야하고, CH1 도메인이 결핍되거나 CH1 도메인이 결핍되고 경첩 부위가 결핍되는 IgG를 이용하여 발현되는 적합성과 관련된 선택에 대해 사용 가능한 중쇄의 큰 레파토리를 초래한다.
따라서, 다양한 구체예에서, 본 발명의 따라 유전적으로 변형된 마우스는 기능적 IgM 발현을 유지해야 하는데, 이것은 더 자연적 클론의 선택 과정에 대한 기회를 제공해야 한다. 예를 들어, 기능적 IgM (예를 들어, Ch1 도메인이 결핍되지 않은 IgM)을 가진, 대리 경쇄 및 동족 경쇄 둘 다는 IgM의 CH1 도메인을 통해 관련할 수 있을 것이고 초기 B 세포 발달의 선택 과정에 참여할 수 있을 것이다. 본 발명에 따라 유전적으로 변형된 마우스에서, 기능적 CH1 도메인이 결핍된 또는 기능적 CH1 도메인 및 경첩이 결핍되된 불변 도메인을 이용하여 발현할 수 있는 중쇄 가변 도메인의 선택이 발생한 경우, IgG 이소타입으로 종류 스위칭은 첫 번째 선택 단계이다.
B 세포 발달에서 IgM
카멜리드, 특정 물고기에서, 및 병리학적 조건에서 관찰은 몇몇 상황 하에 중쇄 불변 부위의 CH1 도메인이 결핍된 항체가 동족 경쇄 부재시 발현될 수 있다는 것을 나타내지만, 항체 생산하는 B 세포의 정상적인 발달은 일반적으로 CH1 도메인의 존재를 필요로 한다. IgM을 포함하여, 모든 중쇄 이소타입은 CH1 도메인을 포함한다. 대리 경쇄 및 동족 경쇄 둘 다는 IgM을 이용하여 중쇄의 CH1 도메인을 통해 주어진 중쇄와 상호작용하는 것으로 생각된다. 중쇄 항체의 발달이 IgM 이소타입 중쇄의 구조적 온전함 또는 기능성에 의존하는 정도에 대해, IgM'의 구조적 온전함 또는 기능의 붕괴는 바람직하지 않을 것이다.
항체의 정상적인 발달은 항체가 기능적 및 유용한 항체의 생존 및 궁극적 발현을 초래하는 복합체 선택 계획의 다양성을 통해 생존하는 것을 필요로 한다. 항체 구조의 붕괴는 효과적으로 경쟁하고 하나 이상의 자연의 항체 선택 계획의 만족을 수반하기 위해 구조적 붕괴가 항체의 무능력을 초래하는 정도로 항체의 생존 및 궁극적 발현에 해롭다고 입증할 수 있다.
항체 발달 초기에, 항체 중쇄는 선택 과정을 경험하는데, 자연은, 선택 계획의 다양성을 통해, 결국 기능적 및 친화도-성숙된 항체를 형성하기 위해 선택을 경험하기 적합한 중쇄를 선택한다. B 전구 세포 (또는, 전-B 세포)에서 재조합된 중쇄 유전자 세그먼트로부터 발현된 항체 중쇄는 전-B 세포 수용체, 또는 전-BCR으로 나타나는 구조 (이것은 다른 동시-수용체를 포함한다)를 형성하기 위해 IgG 이소타입의 전-B 세포의 표면에 표현되는 대리 경쇄와 정상적으로 짝을 이룬다.전-BCR은 세포 표면에 표현되고, 전-BCR은 세포에 대한 복합체의 적절한 형성을 전달하고, 효과적으로 세포에 중쇄 이 초기 선택 단계를 지났다고 지시하는 것으로 생각된다. 따라서 세포는 중쇄 선택을 경험할 수도 있다는 것을 알아낸다. 만약 IgM 및 대리 경쇄를 이용하여 표현될 때, 중쇄 전-BCR의 형성에 해로운 결점을 함유하면, 세포는 아폽토시스를 경험할 것이다. 만약 세포가 아폽토시스를 경험하면, 중쇄의 중쇄 가변 부위의 유용성, 또는 다양성에 대한 기여는 손실될 것이다. 따라서, 항체 선택의 아주 초기 단계는 IgM 이소타입을 이용한 대리 경쇄와 함께 중쇄의 표현이 필요하다. 대리 경쇄는 IgM의 CH1 도메인을 통해 적어도 부분적으로 IgM과 상호작용하는 것으로 생각된다. 이 초기 시점에서 항체 구조의 실패, 또는 붕괴 (예를 들어, 비기능적 CH1 도메인)는 클론의 선택 실패, 중쇄를 발현하는 전-B 세포의 손실, 및 유용한 항체에서 특정 중쇄 가변 도메인의 활용 가능성의 손실을 초래할 수도 있다.
전-BCR을 함유하는 세포는 이 선택 단계를 통과하고, 다음 선택 단계는 중쇄 동족 경쇄 (예를 들어, 마우스 및 사람에서 카파 또는 람다)과 짝을 이루는 것이 필요하다. 짝을 이룬 중쇄/동족 경쇄 구조는 IgM의 CH1 도메인을 통해 IgM 이소타입을 이용하여 세포, 이제 나이브 전-B 세포, 의 표면에 다시 나타난다. 표면의 이 복합체는 기능적, 막 결합된, B 세포 수용체 (BCR)을 초래한다. 이 BCR은 세포에 중쇄 선택에 대해 적합하고, 세포는 지금 이 특정 경쇄의 발현을 일으키고 친화도 성숙 및 종류 스위칭을 포함하는, B 세포 성숙화 과정을 진행할 수도 있다. 만약 IgM 및 그것의 동족 경쇄를 이용하여 표현될 때 중쇄가 BCR 형성에 해로운 결점을 함유하면, 세포는 아폽토시스를 경험할 것이다. 만약 세포가 아폽토시스를 경험하면, 중쇄의 중쇄 가변 부위의 유용성, 또는 다양성에 대한 기여는 손실될 것이다. 따라서, 항체 선택에서 아주 초기 단계는 IgM 이소타입을 이용하여 대리 경쇄와 함께 중쇄의 표현이 필요하다. 다시, 이 초기 시점에서 항체 구조의 실패 또는 붕괴 (예를 들어, 비-기능적 CH1 도메인)는 클론의 선택 실패 및 중쇄를 발현하는 전-B 세포의 수반되는 손실을 초래할 수 있다.
지금까지 생존된 선택을 갖는, IgM을 이용하여 동족 경쇄와 짝을 이룬 중쇄를 나타내는 전-B 세포는 궁극적으로 종류 스위칭 및 IgG 이소타입을 이용하여 중쇄 및 동족 경쇄가 B 세포 표면에 나타나는 선택 메카니즘을 초래하는 돌연변이화 과정을 경험한다. CH1 도메인이 결핍된 또는 CH1 도메인 및 경첩 부위가 결핍된 IgG 중쇄의 선택은 이 단계에서 발생할 것이다. 본 발명에 따라 동물에서, 중쇄 가변 부위의 정상적인 레파토리는 가변 도메이이 CH1 도메인이 결핍된 또는 Ch1 및 경첩 부위가 결핍된 IgG 중쇄에서 발현되어야 생존할 것인지에 기초한 선택에 사용 가능할 것이다. 반대로, 손상된 IgMs를 갖는 마우스는 손상된 IgM을 이용하여 선택에서 생존할 수 있는 가변 부위가 종류 스위칭에 대해 사용 가능할 것이기 때문에, 확실하지 않지만 중쇄 가변 부위이 전체 레파토리를 나타낼 것이다.
따라서, 기능적 IgM이 결핍된 동물은 달리 적합한 중쇄 가변 유전 세그먼트의 재배열 후 B 세포 집단을 만드는 능력의 현저한 감소를 경험할 수도 있다. 이러한 경우에, 중쇄 가변 부위의 충분한 공급이 사용 가능한 경우 (즉, 동물은 재배열 가능한 적합한 수의 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트를 갖는다), 선택 과정 중 중쇄의 생존에 대해 완화하는 IgM 장애 때문에 다양성의 바람직한 정도를 나타내는 B 세포의 만족 집단은 형성하지 않을 수도 있다.
기능적 IgM 유전자로 중쇄 항체 생산
IgM를 이용한 B 세포 발달 중 나타날 때 효과적으로 선택에서 살아남을 수 있는 적합한 수의 재배열된 중쇄 가변 부위는 흥미있는 면역원으로 비-사람 동물을 면역화함으로써 항체를 만드는데 충분한 다양성을 생성하기 위해 유지되는 것이 바람직하다. 따라서, 면역글로불린 중쇄에서 비기능적 CH1 도메인 또는 비기능적 CH1 도메인 및 비기능적 경첩 부위를 포함하는 유전적으로 변형된 비-사람 동물은 IgM 대립 유전자 둘 다에서 CH1 결실을 포함해서는 안 된다.
몇몇 구체예에서, 유전적으로 변형된 동물에서 중쇄 항체를 마들기 위해서 모든 Ig 이소타입의 CH1 도메인의 결실은 바람직하지 않다. 따라서, 방법 및 조성물은 다른 이소타입 (예를 들어, IgM)이 기능적 CH1 도메인을 유지하는 것을 허용하지 않지만 비활성화, 결실, 또는 IgG의 CH1 도메인 및 이것의 단편을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 비기능적으로 만드는 것 (및 몇몇 구체예에서 또한 불활성화, 결실, 또는 IgG의 비기능적 경첩 부위를 비기능적으로 만드는 것)에 의해 유전적으로 변형된 비-사람 동물에서 중쇄 항체를 만들기 위해 제공된다. 다른 이소타입 CH1 도메인의 기능성 (하나 이상의 선택된 IgG CH1 도메인 )은 비-IgG 이소타입, 예를 들어 IgM 이소타입를 이용한 중쇄 가변 도메인이 나타나는 발달 단계를 붕괴 또는 실질적으로 붕괴하지 않는 B 세포 발달 과정을 초래한다. 따라서 예를 들어, B 세포 발달 중 IgM 의존적 단계의 붕괴는 상대적으로 최소화된다. (청구항에 의해 설명되는) 본 발명에 관해 제한 없이 발명자는 IgM 맥락에서 중쇄 가변 도메인의 존재와 관련되는 초기 선택 단계의 최소화되는 붕괴는 기능적 CH1 도메인이 결핍된 또는 기능적 CH1 도메인이 결핍된 및 기능적 경첩 부위가 결핍된 IgG를 이용한 IgG 이소타입으로 종류 스위칭 및 선택을 경험하기 위해 생존하는, 중쇄 가변 부위를 함유하는 더 많은 세포를 초래할 것이라는 것을 제안한다.
따라서, 동물을 만드는 방법 및 조성물과 함께, 유전적으로 변형된 비-사람 동물은 제공되는데, 여기서 유전적 변화는 IgM 도메인이 아닌 Ig 도메인에서 기능적 CH1 도메인의 부족 (다른 구체예에서 기능적 경첩 부위의 부족)을 초래한다. 다양한 구체예에서, CH1 또는 CH1 및 경첩 부위 (또는 이것의 실질적으로 기능적 부분)를 암호화하는 서열은 유전적으로 변형된 동물의 게놈에서 결실된다. 유전적으로 변형된 비-사람 동물은 완전히 사람 항체 (사람 면역글로불린 유전자를 포함하도록 유전적으로 변형된 마우스에서) 및 키메라화 사람/마우스 항체 (예를 들어, 사람 가변 부위 유전자 세그먼트, D 부위, 및 J 부위을 포함하도록 유전적으로 변형된 마우스에서, 또는 기능적 CH1 도메인이 결핍된 또는 기능적 CH1 도메인이 결핍된 및 경첩 부위가 결핍된 유전적으로 변형된 IgG 이소타입으로 트랜스-스위칭이 가능한 사람 전이 유전자를 갖는 마우스에서)를 포함하는 중쇄 항체 (즉, 경쇄가 결핍된 항체)를 만드는데 유용하다.
중쇄 항체
항체는 사람 치료에 유용하다. 중쇄 항체, 즉, 경쇄가 결핍된 항체는 또한 사람 치료에 유용하다. 중쇄 항체는 경쇄가 부족하기 때문에, 그들은 더 작고 따라서 경쇄를 함유한 항체보다 더 나은 조직 투과를 보일 것으로 예상되지만, 유사한 또는 더 호의적인 약물동력학 프로필을 갖고 고전적 항체와 비교하여 유사한 효과기 기능을 유지한다. 그들이 더 작기 때문에 중쇄 항체는 또한 주어진 부피에 더 높은 투여량으로 투여할 수 있다. 항체를 투여하는 빈번한 방법은 피하주사이고, 항체의 주어진 투여량에 대한 투여 부피의 감소는 환자에게 이점을 제공하고 큰 부피의 피하주사에 의한 불평 및 고통을 피할 수 있다.
중쇄 항체의 다른 이점은 하나의 테라푸틱스에서 2개의 다른 에피토프에 대해 특이적인 중쇄의 헤테로다이머화에 의해 이중특이적 항체를 만드는 능력이다. 중쇄 항체는 경쇄가 부족하기 때문에, 결합 친화도 또는 중쇄의 특이성으로 방해하지 않지만 또한 이중특이적 항체의 발현에 적합한 일반적인 경쇄를 설계할 필요가 없기 때문에 그들은 특히 이중특이적 항체를 만드는데 적합하다.
본 발명의 유전적으로 변형된 동물은 다양한 중쇄 항체를 만드는데 사용될 수 있다. 여기에 설명되는 유전적 변형은, 예를 들어, 적합한 마우스 종에서 만들어질 수 있다. 마우스 종은 중쇄 항체를 선택하는데 적합한 유전적 배경을 가질 수 있다. 특정 구체예를 포함하는 몇몇 유전적 배경은 하기 제공된다.
유전적으로 변형된 동물은 본 발명에 따라 유전적 변형 및 내인성 마우스 중쇄 가변 부위 자리를 대체하는 하나 이상의 재배열되지 않은 사람 가변 부위 유전자 세그먼트, 하나 이상의 재배열되지 않은 D 부위 유전자 세그먼트, 및 하나 이상의 재배열되지 않은 J 부위 유전자 세그먼트를 포함하는 마우스 일 수 있다. 이러한 마우스에서, 사람화 가변 부위 자리는 내인성 마우스 불변 도메인 서열의 재배열된 가변 부위 유전자 업스트림을 형성하기 위해 재조합할 수 있다 (여기서 하나 이상의 면역글로불린 불변 부위 유전자는 여기에 설명되는 바와 같이 변형된다). 마우스는 키메라화 사람 가변/마우스 불변 중쇄 항체를 만들 수 있을 것이다. 흥미있는 면역원에 노출하면, 마우스는 본 발명에 따라 친화도 성숙화되고 흥미있는 면역원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 중쇄 항체를 생성할 수 있을 것이다.
유전적으로 변형된 동물은 사람 재배열되지 않은 사람 가변 부위 유전자 세그먼트, 재배열되지 않은 사람 D 유전자 세그먼트, 및 재배열되지 않은 사람 J 유전자 세그먼트, 뮤 유전자, 및 트랜스-스위칭을 허용하는 서열을 포함하는 전이 유전자를 포함하는 마우스일 수 있다. 마우스는 여기에 설명되는 바와 같이 마우스 중쇄 불변 부위 변형을 포함할 것이다. 마우스는 완전히 사람 IgM 항체, 및 트랜스-스위칭을 통해 키메라화 사람 가변/마우스 불변 항체를 만들 수 있는데, 여기서 불변 도메인은 여기에 설명되는 바와 같이 유전적 변형을 포함한다. 흥미있는 면역원에 노출하면, 마우스는 본 발명에 따라 친화도 성숙화되고 흥미있는 면역원의 에피토프에 특이적으로 결합할 수 있는 중쇄 항체를 생성할 수 있을 것이다.
시험관 내에서 중쇄 항체의 발현
발명자는 정상적인 사람 또는 마우스 중쇄 가변 부위 (hVR 또는 mVR)가 기능적 CH1 도메인이 결핍된 IgG를 이용한 생체 내 시스템에서 발현될 수 있다는 것을 성립시켰다. 발명자는 야생형 마우스 IgM인 마우스에서 재배열되지 않은 hVR 미니자리로부터 hVR을 발현하였다. 발현되는 hVR을 CH1 도메인이 결핍된 IgG2b로클로닝되었고, 얻어진 hVR-IgG2bΔCH1가 발현되었고 hVR-IgG2bΔCH1 구조로 일시적으로 트랜스펙션되는 CHO 세포에 의해 분비되었고, 기능적 CH1 도메인이 결핍된 IgG로 스자리될 때, 즉 중쇄 항체와 같이, 효과적으로 야생형 IgM을 갖는 마우스에서 선택된 hVR이 발현되고 세포에 의해 분비될 수 있다는 것이 성립된다.
발명자는 CHO 세포에서 CH1 도메인이 결핍되고 hVRs 또는 사람 카멜화 VRs (hVR*s)를 갖는 중쇄를 발현하기 위해서 생체 내 시스템을 구성하였다. VRs는 내인성 마우스 중쇄 자리를 (사람 V 부위 유전자 세그먼트, 6-1, 1-2, 및 1-3, 모든 사람 DH 유전자 세그먼트, 및 모든 사람 JH 유전자 세그먼트를 갖는) 사람 중쇄 가변 부위 미니자리로 대체하는 것을 함유하는 RAG 마우스로부터 얻었다. 내인성 마우스 면역글로불린 카파 및 람다 경쇄 자리는 온전하고 기능적이었다.
키메라화 중쇄 (hVR-mFc) 및 카멜화 중쇄 (hVR*mFC) 구조는, CHO 세포에서 별현을 위해, 상기 설명되는 미니자리를 함유한 마우스로부터 얻어진 VR 서열을 사용하여 만들어졌다. 키메라화 중쇄는 키메라화 중쇄 (hVR-mFc) 및 마우스 경쇄를 포함하는 기능적 항체를 형성하기 위해 마우스에서 B 세포 발달 중 정상적인 V-D-J 재조합의 산물이었다. hVR-mFc 및 hVR*-mFc 구조는 CH1 도메인을 갖고 CH1 도메인이 결핍된 것으로 만들어졌다.
CHO 세포에 hVR-mFc 및 hcVR-mFc의 일시적 트랜스펙션은 CH1 도메인 부재시, hVRs 및 hVR*s를 갖는 중쇄는 발현되었고 상층액에서 녹아있었다. CH1 도메인의 존재시, hVRs 또는 hVR*s를 함유한 중쇄는 상층액에서 발현되지 않는다. 이 관찰은 이러한 중쇄 항체가 CH1 도메인이 결핍된 중쇄 항체에서 카멜리드 VHH 도메인의 활용 없이, 예를 들어 사람 또는 마우스 VH 도메인의 활용으로 만들어질 수 있다는 것을 제안하였다.
사람화 중쇄 항체
본 발명의 중쇄 항체의 사람화 버전을 생산하기 위해, 변형을 위한 동물 동형접합체는 항원으로 면역화되고 동물의 특이적 면역 반응은 밝혀졌고, 면역화되는 동물의 비장의 세포는 혼성세포를 생산하기 위해 적합한 불멸 세포와 융합된다 (예를 들어, 골수세포). 대안으로, 항체는 면역화되는 동물의 B 세포로부터 직접적으로 얻어질 수 있다. 혼성세포의 (또는 분리되는 B 세포의) 상층액은 효소 관련되는 면역흡착제 검정 (ELISA)에 의해 항체의 존재에 대해 선별되고 항원에 대해 특이적인 항체는 원하는 성질에 기초하여 선택될 수 있다.
중쇄 가변 부위 (VH) 핵산은 업계에 알려진 표준 분자 생물학 기술 (Sambrook, et al . 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y.; Ausubel, et al . 1995. Short Protocols in Molecular Biology, 3rd ed.,Wiley & Sons)을 사용하여 혼성세포 및/또는 B 세포로부터 분리될 수 있다. VH 핵산 서열은 결정되었고, 추측되는 아미노산 서열은 얻어질 수 있고 유사한 서열을 갖는 관련되는 VH 서열의 그룹을 확인하기 위해서 다른 사람 VH 서열과 비교될 수도 있다. 관련되는 VH 서열은 당업자에게 사용 가능한 항체 데이터베이스, 예를 들어, The International ImMunoGeneTics Information System®(IMGT®)을 사용하여 얻어질 수 있다. 이 비교는 눈에 의해, 또는 대안으로, 전자적으로 정렬 프로그램 (예를 들어, CLUSTAL)의 활용에 의해 성취되는 서열의 정렬에 의해 수행될 수도 있다. 이 비교에서, 상보성 결정 부위 (CDRs) 및 골격 부위 (FRs)는 확인된다. CDR 및 FR 잔기는 표준 서열 정의 (예를 들어, Kabat et al . 1987, Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda Md.; Chothia 및 Lesk, 1987. J. Mol Biol. 196:901-917)에 따라 결정된다. 당업자는 면역글로불린 중쇄 서열의 CDR 및 FR 부위 넘버링 및 결정의 방법에 가끔 차이가 있을 수도 있다는 것을 인정할 것이다. 이러한 경우에서, 구조적 정의가 바람직하지만, 서열 정의 방법에 의해 정의되는 잔기는 중쇄 서열의 비교에 기초하여 대체하는 골격 잔기의 결정에 대해 중요한 FR 잔기로 생각된다.
정렬되면, VH 서열에서 대체 가능한 자리가 확인된다. 만약 다른 사람 VH 서열과 비교할 때 분리되는 VH 서열의 자리에서 아미노산 동일성이 다양하면, 그 자리는 분리되는 VH 서열의 그 자리에서 대체의 적합성에 대해 평가된다. 그러므로, 비교되는 다른 관련되는 사람 VH 서열 (들)에 의해 변하는 분리되는 VH 서열의 어떤 자리도 잠재적으로 하나 이상의 다른 관련되는 사람 VH 서열에서 발견되는 일치하는 자리에서 아미노산으로 대체될 수 있는 자리를 제공할 수 있다. 다른 관련되는 사람 VH 서열과 동일성을 공유하는 자리, 즉 가변성을 증명하지 않은 것들은 비대체 자리로 결정된다. 다양한 구체예에서, 상기 방법은 합의되는 사람 중쇄 항체 서열을 제공하기 위해 활용된다.
여기에 설명되는 목적에 대한 사람화 중쇄 항체는 미리 결정된 항원과 결합할 수 있고 사람 FR 아미노산 서열과 비교하여 실질적으로 유사하거나 동일한 아미노산 서열을 갖는 FR 부위, 및 실질적으로 비-사람 CDR 아미노산 서열과 유사하거나 동일한 아미노산 서열을 갖는 CDR을 포함하는 면역글로불린 중쇄 아미노산 서열 변종 또는 이것의 단편이다. 일반적으로, 사람화 중쇄 항체는 비-사람 공급원으로부터 유도된 하나 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 이러한 잔기는 전형적으로 중쇄 가변적 도메인으로부터 유도된다. 게다가, 이 잔기는, 예를 들어, 친화도 및/또는 특이성 뿐만 아니라 항체 기능과 관련되는 다른 바람직한 생물학적 활성과 같은 관련되는 성질을 가질 수도 있다.
다양한 구체예에서, 사람화 중쇄 항체는 실질적으로 적어도 하나의, 및 다른 구체예에서 적어도 2개의, 모든 또는 실질적으로 모든 CDR 부위가 비-사람 VH 도메인의 그것과 일치하고 모든 또는 실질적으로 모든 FR 부위는 사람 VH 도메인 서열의 그것인 VH 도메인 모두를 포함한다. 사람화 중쇄 항체는 독특한 면역글로불린 불변 부위 (Fc)를 포함할 것인데, 한 구체예에서 이것은 적어도 CH1 도메인이 결핍되고, 한 구체예에서 또한 사람 Fc의 경첩 부위가 결핍된다. 한 구체예에서, 중쇄 항체는 경쇄를 포함하지 않을 것이고 면역글로불린 G (IgG) 중쇄 불변 부위의 CH2 및 CH3 부위를 포함할 것이다. 한 구체예에서 중쇄 항체의 불변 부위는 IgG 중쇄 Fc의 경첩, CH2 및 CH3 부위를 포함할 것이다. 한 구체예에서, 중쇄 항체의 불변 부위는 IgM의 CH1 부위를 포함할 것이다.
사람화 중쇄 항체는 IgG1, IgG2, IgG3 및 IgG4를 포함하는, IgG의 클래스로부터 선택될 것이다. 다양한 구체예에서, 불변 부위는 하나 이상의 IgG 클래스의 서열을 포함할 수도 있고, 원하는 효과기 기능을 최적화하기 위해 특정 불변 부위를 선택하는 것은 업계에서 일상적이다.
일반적으로, 사람화 중쇄 항체의 중쇄 FR 및 중쇄 CDR 부위는 부모 서열과 정확히 일치할 필요는 없는데, 예를 들어, 비-사람 중쇄 CDR 또는 사람 중쇄 FR은 적어도 하나의 잔기의 대체, 삽입 또는 결실에 의해 달라질 수 있어서 주어진 위치에서 중쇄 CDR 또는 중쇄 RF 잔기가 사람 중쇄 FR 서열 또는 비-사람 중쇄 CDR 서열과 일치하지 않는다. 하지만, 이러한 돌연변이는 아주 많지 않을 것이다. 한 구체예에서, 적어도 75%의 사람화 중쇄 항체 잔기는 부모 중쇄 FR 및 중쇄 CDR 서열의 그것과 일치할 것이고, 다른 구체예에서 90%, 또 다른 구체예에서 95%보다 더 클 것이다.
한 구체예에서, 여기에 개시되는 바와 같은 사람화 중쇄 항체는 사용 가능하고 당업자에 알려진 컴퓨터 프로그램을 사용하여, 인실리코 부모 서열 및 다양한 개념의 사람화 합성 서열을 분석하는 과정에 의해 제조된다. 사람화 버전을 만들기 위해서 및/또는 면역원성, 친화도, 등과 같은 성질을 바꾸기 위한 서열 변형은 업계에 알려진 방법을 활용하여 이루어진다 (예를 들어, US 5,565,332 Hoogenboom et al.; US 5,639,641 Pedersen et al .; US 5,766,886 Studnicka et al .; US 5,859,205 Adair et al .; US 6,054,297 Carter et al .; US 6,407,213 Carter et al .; US 6,639,055 Carter et al .; US 6,849,425 Huse et al .; US 6,881,557 Foote; US 7,098,006 Gorman et al .; US 7,175,996 Watkins et al .; US 7,235,643 Nicolaides et al .; US 7,393,648 Rother et al .; US 7,462,697 Couto et al .).
다양한 구체예에서, 부모 중쇄 항체의 이형을 만들기 위해서 부모 중쇄 항체 서열과 원하는 대체는 부모 중쇄 항체의 항원 결합 활성을, 한 구체예에서 유지하는, 또는 한 구체예에서 증가시키는 것이다. 일반적으로 부모 중쇄 항체의 중쇄 항체 이형은 특정 항원에 대한 부모 중쇄 항체의 결합 친화도의 적어도 10%, 적어도 20%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90% 또는 적어도 100% (예를 들면, 적어도 150%, 적어도 200%, 적어도 500%, 적어도 1000%, 또는 적어도 10,000% 까지)인 항원 결합 친화도를 갖는다. 몇몇 구체예에서, 변종 중쇄 항체는 부모 중쇄 항체와 비교하여 단일 대체하는 것을 포함할 것이다. 하지만, 다른 구체예에서, 여러 아미노산은 , 예를 들어, 약 5 또는 10 이상 까지, 주어진 자리에서 동일성을 공유하는 다른 사람 중쇄 서열로부터 유도된 부모 중쇄 항체 서열과 비교하여 대체된다. 한 구체예에서 대체는 보존적이고 (즉, 대체되는 잔기와 유사한 성질을 공유하는 아미노산), 또 다른 구체예에서 비-보존적이다 (즉, 대체되는 잔기와 다른 성질을 공유하는 아미노산). 다양한 구체예에서, 결과로 생긴 변종 중쇄 항체는 원하는 결합 친화도 및/또는 특이성이 잔기 대체에 의해 크게 감소되지 않았다는 것을 확인하기 위해 테스트된다. 몇몇 구체예에서, 개선되는 변종 중쇄 항체는 다른 사람 중쇄 서열의 아미노산 대체에 의해 상산된다.
자연적으로 발생한 중쇄 항체 (예를 들어, 카멜리드에서 발견되는)는 전통적인 항체 분자의 헤비 및 경쇄 가변 부위 사이의 계면 (즉, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄)과 일치하는 자리에서 독특한 아미노산 잔기를 함유하는 것으로 증명되었다. 이 계면 잔기는 전통적인 항체에서 서로와 관련되는 2개의 체인의 근접성 또는 방향에 영향을 미치는 것으로 알려져 있다. 이 자연적 중쇄 항체는 경쇄 가변 부위의 부재와 연관성이 있는 잔기의 대체를 함유하는 것으로 알려져 있지만, 그들은 특유의 면역글로불린 폴드를 보존하기 위해 전통적인 항체와 비교하여 서열의 다른 자리에서 잔기를 유지한다. 자연적 중쇄 항체에서 발견되는 대체는 L11S, V37F, G44E, L45R, 또는 L45C, W47G 및 중쇄 가변 부위의 CDR1 및 CDR3 사이의 이황화 결합에 기여하는 추가적 시스테인 잔기이다. 몇몇 구체예에서, 본 발명의 중쇄 항체는이 자리에서 부모 항체의 잔기를 유지할 수도 있다. 다른 구체예에서, 부모 항체는 자연적 중쇄 항체의 잔기와 관련되는 이 자리에서 돌연변이를 나타낼 수도 있다. 몇몇 구체예에서, 여기에 설명되는 바와 같이 유전적으로 변형된 마우스로부터 분리되는 VH 서열로부터 유도된 사람화 중쇄 항체를 만들 때 부모 중쇄 항체에서 발견되는 것과 같은 잔기를 이 자리들 중 적어도 하나에서, 또는 한 구체예에서, 이 자리들 중 모두에서 유지하는 것이 바람직할 수도 있다. 다양한 구체예에서, 당업자는 이 계면 잔기가 여기에 설명되는 바와 같이 유전적으로 변형된 마우스에 의해 만들어진 중쇄 항체에서 체인 사이의 상호작용에 수반될 것이라고 합리적으로 예상되지 않는다
유전적으로 변형된 동물 만들기
중쇄 항체를 발현하는 동물을 만드는 유전적 변형은 삽도로서 마우스의 사용에 의해 편리하게 설명된다. 본 발명에 따라 유전적으로 변형된 마우스는 다양한 방법으로 만들어질 수 있는데, 이것의 특정 구체예는 하기 논의된다.
IgG1 자리의 도식적인 삽도 (확장되지 않는)는 IgG1 자리에서 CH 도메인 조정을 나타내기 위해 도 1 (위)에 제공된다. 도시되는 바와 같이, 도메인 CH1, CH2, 및 CH3 및 경첩 부위는 쉽게 인식가능한 스자리 부위의 뉴클레오티드 다운스트림의 범위에 존재한다.
IgG1의 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 결핍되지만 경첩 부위를 함유하는 유전적으로 변형된 마우스는 업계에 알려진 어떤 방법에 의해서도 만들어질 수 있다. 예를 들어, IgG1 유전자를 끝이 잘린 IgG1 부족 CH1 도메인으로 대체하지만 경첩 부위를 함유하는 표적화 벡터는 만들어질 수 있다. 도 2는 내인성 CH1 도메인의 서열 업스트림을 함유한 다음, IgG1 경첩, IgG1 CH2 도메인, IgG1 CH3 도메인, 약물 선택 카세트 (예를 들어, 액체 산소화되는 저항 유전자), 및 IgG1 트랜스막 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 5' (게놈의 IgG1 유전자의 전사의 방향에 대해) 상동성 팔, 및 트랜스막 도메인에 대한 서열 3'을 함유하는 3' 상동성 팔을 갖는 표적화 구조에 의해 표적화되는 마우스 게놈 (위)을 도시한다. 자리에서 상동 재조합 및 약물 선택 카세트 [예를 들어, 카바페넴 내성 장내세균 (Cre) 처리]의 제거에, 내인성 IgG1은 CH1 도메인 (도 2의 아래; 액체 산소화 위치 미도시)이 결핍된 IgG1에 의해 대체된다. 도 1 (IgG1ΔCH1, 중간)은 결과적인 자리의 구조를 나타내는데, 이것은 경첩 서열과 융합되는 J 부위 서열을 갖는 IgG1을 발현할 것이다.
IgG1의 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드가 결핍되고 경첩 부위를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 결핍된 유전적으로 변형된 마우스는 업계에 알려진 어떤 방법에 의해서도 만들어질 수 있다. 예를 들어, IgG1 유전자를 CH1 도메인을 암호화하는 서열이 결핍되고 경첩 부위를 암호화하는 서열이 결핍된 끝이 잘린 IgG1으로 대체한 표적화 벡터는 만들어질 수 있다. 도 3은 내인성 CH1 도메인의 서열 업스트림을 함유한 다음, IgG1 CH2 도메인, IgG1 CH3 도메인, 약물 선택 카세트 (예를 들어, lox 저항 유전자), 및 IgG1 트랜스막 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 함유하는 5' (게놈의 IgG1 유전자의 전사의 방향에 대해) 상동성 팔, 및 트랜스막 도메인에 대한 서열 3'을 함유하는 3' 상동성 팔을 갖는 표적화 구조에 의해 표적화되는 마우스 게놈 (위)을 도시한다. 자리에서 상동 재조합 및 약물 선택 카세트 (예를 들어, Cre 처리)의 제거에, 내인성 IgG1은 CH1 도메인 (도 3의 아래; lox 위치 미도시)이 결핍된 IgG1에 의해 대체된다. 도 1 (IgG1ΔCH1-Δ경첩, 아래)은 결과적인 자리의 구조를 나타내는데, 이것은 CH2 도메인과 융합되는 J 부위 서열을 갖는 IgG1을 발현할 것이다.
IgG1 CH1 서열이 결핍된 (IgG1ΔCH1), 또는 IgG1 CH1 서열이 결핍되고 경첩이 결핍된 (IgG1ΔCH1-Δ경첩), 유전적으로 변형된 마우스는 하나 이상의 다른 IgG 이소타입의 결실, 예를 들면, 결실 또는 기능적으로 IgG2b 및 IgG2a를 암호화하는 서열의 불능화에 의해 변형된 IgG1 이소타입의 사용법을 좋아하도록 더 변형될 수 있다. 예를 들어, 내인성 경첩 부위 서열의 서열 업스트림 (내인성 CH1 도메인 서열의 서열 업스트림)을 함유하는 5' 상동성 팔을 갖는 표적화 구조는 만들어지고, IgG1 CH2 및 CH3 도메인, 약물 선택 카세트를 암호화하는 서열에 이어, IgG1 트랜스막 도메인을 암호화하는 서열은 원하면 다른 약물 선택 카세트로 이어진다. 자리에서 상동성 재조합 및 약물 선택 카세트 (들) (예를 들어, Cre 처리)의 제거에, 내인성 중쇄 불변 자리는 단지 2개의 IgG 유전자만을 함유한다:내인성 IgG3 및 IgG1ΔCH1 [도 4 참조, 아래; 재조합효소 위치(들) 미도시; 도 6 참조, 아래] 또는 IgG1ΔCH1-Δ경첩 [도 5 참조, 아래; 재조합효소 위치 (들) 미도시; 도 6 참조, 아래].
IgG1ΔCH1-Δ경첩 또는 IgG1ΔCH1ΔIgG2aΔIgG2b 대립유전자를 갖는 유전적으로 변형된 마우스에서 발현되는 IgG1은 도 10의 오른쪽 패널에 나타난 바와 같이 구조를 갖는다, 즉, VH 도메인은 CH2 도메인과 융합될 것이다. 도 10의 왼쪽 패널은, 비교를 위해서, 야생형 IgG1 항체를 제공하는데,
CH2 도메인에 경첩 부위를 통해 작동 가능하게 연결된, 및 경쇄 불변 도메인 CL에 이황화 결합에 의해 작동 가능하게 연결된 그것의 CH1 도메인을 나타낸다. 반대로, 유전적으로 변형된 마우스에서 만들어진 항체는 경첩 및 CH1 도메인이 결핍되고 따라서 CL 도메인이 결핍된다.
상기 설명되는 바와 같이 유전적으로 변형된 마우스 및 다른 것들, 은 (하나 이상의 독립되는 표적에서) 적합한 표적화 구조를 적합한 마우스 ES 세포에 도입함으로써 만들어지고, 표적화 구조의 마커 또는 선택 카세트를 포함하는 양성 클론은 확인되고 성장된다. 클론은 키메라화 마우스 및 완전히 ES 세포 유도된 마우스를 만드는데 적합한 조건 하에 숙주 태아에서 기증자 ES 세포로서 활용된다. 마커 또는 선택 카세트는 ES 세포 단계 또는 키메라화 또는 ES 세포 유도된 마우스에서, 예를 들어 lox되는 카세트를 활용하고 Cre 함유한 종으로 번식함으로써, 또는 Cre 발현 벡터가 있는 ES 세포를 전기천공함으로써 선택적으로 제거될 수 있다.
IgG1ΔCH1-Δ경첩 대립 유전자를 갖는 유전적으로 변형된 마우스 (이형 접합체)가 본 발명의 구체예에 따라 만들어 졌다. 혈청은 마우스로부터 분리되었고 중쇄를 검출하기 위해 항-마우스 IgG1 항체를 사용하여 웨스턴으로 블롯되었다 (감소 조건). 야생성 마우스와 반대로, 이것은 야생형 IgG1 중쇄와 크기로 일치하는 밴드를 나타냈는데, IgG1ΔCH1-Δ경첩 대립 유전자를 함유하기 위해 유전적으로 변형된 마우스는 또한 VH, CH2, 및 CH3 도메인으로 구성되는 중쇄 항체의 크기가 예상되는 항-마우스 IgG1 항체와 반응하는 중쇄를 발현하였다 (도 8 참조).
실시예
실시예1 : 시험관 내에서 중쇄 항체의 발현
키메라화 중쇄 구조를 사람 가변 부위와 쥐 IgG2b (mIgG2b) 불변 부위를 융합하기 위해 분자 생물학 기술 (예를 들어, Maniatis et al . 1982. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory 참조)을 사용하여 만들었다. 각 구조에 대한 사람 가변 유전자 세그먼트는 내인성 마우스 면역글로불린 중쇄 자리를 3개의 hVR 유전자 세그먼트, 모든 hDH 유전자 세그먼트, 및 모든 hJH 유전자 세그먼트로 대체하는 것을 함유한 나이브 RAG 마우스로부터 분리되는 IgM의 hVR로부터 확인되는, 엑손 (즉, 선도 서열 더하기 성숙 서열)을 함유하는 전체 길이 사람 가변 유전자 세그먼트였다. IgM 항체의 경쇄는 마우스 경쇄가었다.
두 가지 버전의 mIgG2b 서열을 사용하였다; CH1 도메인이 있는 하나 및 없는 하나. 여러 다른 구조를 또한 트랜스펙션 및 발현 대조군으로 제공하기 위해 만들었다. 첫 번째 대조군 구조를 마우스 IgG2a (mIgG2a) 불변 부위의 CH2 및 CH3 도메인과 융합되는 시토킨 수용체를 사용하여 만들었다 (대조군 I). 2개의 다른 대조군을 쥐 ROR 시그날 서열과 쥐 IgG2a 서열을 CH1 도메인과 함께 및 CH1 도메인 없이 융합함으로써 구성하였다 (대조군 II 및 III, 각각).
카멜화 버전의 각 사람 가변 부위를 또한 PCR 위치 관련되는 돌연변이 생성 기술 (예를 들어, Hutchinson et al . 1978. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J. Biol. Chem. 253(18):6551-60 참조)을 사용하여 만들었다. 2개의 특이적 프라이머 세트를 카멜 유사 특징을 함유하는 사람 가변 부위 서열을 초래하는 사람 가변 부위 서열 내에 특이적 돌연변이를 창조하기 위해 각 가변 부위에 사용하였다. 프라이머 HH1.2 mut TOP (SEQ ID NO:3) 및 m18.3.1 (SEQ ID NO:4)을 가변 부위의 3' 절반을 증폭하기 위해 사용한 반면, 프라이머 L1 (SEQ ID NO:1) 및 HH1.2 mut BOT (SEQ ID NO:2)를 가변 부위의 5' 절반을 포함하는 하나의 산물을 증폭하기 위해 사용하였다. 이 산물들을 정제하였고 프라이머 L1 및 m18.3.1을 사용하여 세 번째 PCR 반응에 대해 주형으로서 제공하기 위해 함께 섞었다. 결과로 얻어진 카멜화되는 사람 가변 부위 PCR 산물을 클로닝하였고, 정제하였고, 시퀀싱에 의해 확인하였다.
전체 길이 중쇄 구조 (가변 및 불변)을 사람 가변 부위 (카멜화되는 및 비-카멜화되는) 및 불변 부위를 부착 말단을 통해 함께 다음 라이게이션에 대해 허용하는 제한 효소 부위를 함유하는 프라이머로 증폭함으로써 만들었다. 모든 전체 길이 중쇄 구조를 발현 벡터에 클로닝하였고, 정제하였고, 시퀀싱에 의해 다시 확인하였다. 표 1은 각 중쇄 구조, 그들의 SEQ ID NOs 및 각 구조에 대한 짧은 설명을 제시한다.
Figure pct00001
키메라화 중쇄 구조를 면역글로불린 경쇄의 부재시 발현을 분석하기 위해 중국 햄스터 난소 세포 (CHO-K1)에 일시적으로 트랜스펙션 하였다. 상층액 및 세포 용해물을 중쇄의 존재를 검출하기 위해 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP) 결합되는 항-마우스 IgG 항체 (Promega)를 사용하여 화학발광에 의해 웨스턴 블롯에 의해 검사하였다. 모든 키메라화 중쇄 구조를 독립적인 6번 일시적으로 트랜스펙션하였다. 트랜스펙션의 대표적인 웨스턴 블롯은 도 7에 나타난다.
CH1 도메인과 함께 및 CH1 도메인 없이, 모든 키메라화 중쇄 구조, 뿐만 아니라 대조군 구조물은 세포 용해물에서 검출되었다. 단지 CH1 도메인이 결핍된 구조만 상층액에서 관찰하였다 (도 7, 왼쪽). 대조군 I 및 대조군 III (CH1 도메인이 결핍된 마우스 Fc 단백질)은 또한 검출되었지만 (도 7), CH1 도메인을 함유한 마우스 Fc 단백질은 검출되지 않았다. CH1 도메인이 결핍된 비-카멜화되는 및 카멜화되는 사람 중쇄 구조는 모든 트랜스펙션에 대한 상층액에서 검출되었다. 함께, 결과는 CH1 도메인이 결핍된 hVRs (정상적인 또는 카멜화되는)은 발현될 수 있고 면역글로불린 경쇄의 부재시 일시적으로 트랜스펙션되는 CHO 세포로부터 분비될 수 있지만, CH1 도메인을 함유한 hVRs (정상적인 또는 카멜화되는)은 경쇄 부재시 분비될 수 없다.
실시예2 :마우스 중쇄 IgG1 불변 부위의 변형
A. 마우스 IgG1 - CH1 -경첩 표적화 벡터의 제조 (도 3)
VELOIMMUNE® 마우스 (하기 설명되는)의 ES 세포의 C57BL/6 대립 유전자에 대한 마우스 IgG1 불변 도메인의 CH1 및 경첩 부위의 결실을 나타내는 표적화 구조를 구성하였다.
표적화 구조를 박테리아 인공 염색체 (Bacterial Artificial Chromosome; BAC) BMQ 70p08을 변형하기 위해 VELOCIGENE® 기술 (예를 들어, US Pat. No. 6,586,251 및 Valenzuela et al . (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution espressioin analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659 참조)을 사용하여 만들었다. BMQ 70p08 BAC DNA를 IgG1 불변 도메인의 CH1 및 경첩 부위를 결실하기 위해 변형하였지만 IgG1 유전자의 나머지를 그대로 두었다 (예를 들어, CH2, CH3 및 트랜스막 엑손).
간단히 말하면, 업스트림 및 다운스트림 상동성 팔을 프라이머 m102 (SEQ ID NO:13) 및 m104 (SEQ ID NO:14) 및 m100(SEQ ID NO:15) 및 m99 (SEQ ID NO:16)을 각각 활용하여 만들었다. 이 상동성 팔을 IgG1 불변 도메인의 CH2, CH3 및 트랜스막 부위를 유지하는 반면, IgG1 불변 도메인의 CH1 및 경첩 부위가 결실되는 카세트를 만들기 위해 사용하였다 (예를 들어, 도 3 참조). 표적화 구조는 IgG1 유전자의 CH2, CH3 및 트랜스막 도메인 엑손 사이에 자리하는 lox되는 히그로마이신 저항 유전자를 포함하였다. CH1 및 경첩 엑손의 유전자 업스트림 (예를 들어, IgG3, IgD, IgM) 및IgG1 트랜스막 엑손의 다운스트림 (예를 들어, IgG2b, IgG21, IgE, IgA, 등)은 표적화 구조에 의해 변형되지 않았다. 모든 불변 도메인에 대한 스자리 부위는 표적화 구조에 의해 변형되지 않았다. 결실 전체의 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하는데, 이것은 결실 지점에 존재하는 스플라이스 수용체 서열을 나타내낸다: TGACAGTGTA ATCACATATA CTTTTTCTTG T(AG)TCCCAGA AGTATCATC (SEQ ID NO:17). 결실 서열은 스플라이스 수용체의 전-CH1 서열 5' 및 스플라이스 수용체의 CH2 엑손 서열 3'인 스플라이스 수용체 (상기 괄호 내 함유되는 AG)를 포함한다.
B. 마우스 IgG1 - CH1 표적화 벡터의 제조 (도 2)
마우스의 ES 세포의 129/SvEvTac 대립 유전자에 대한 마우스 IgG1 불변 도메인의 CH1의 결실을 도입한 두 번째 표적화 구조를 이 실시예의 섹션 A에 설명딘 바와 같이 유사한 방식으로 구성하였다. 표적화 구조를 박테리아 인공 염색체 (BAC) 70p08을 변형하기 위해 VELOCIGENE® 기술 (예를 들어, US Pat. No. 6,586,251 및 Valenzuela et al . (2003) High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis, Nature Biotech. 21(6):652-659 참조)을 사용하여 만들었다. BMQ 70p08 BAC DNA를 IgG1 불변 도메인의 CH1 부위를 결실하기 위해 변형하였지만 IgG1 유전자의 나머지를 그대로 두었다 (예를 들어, 경첩, CH2, CH3 및 트랜스막 엑손; 도 2 참조).
두 번째 표적화 구조에 대한 상동성 팔을 IgG1 불변 도메인의 CH2, CH3 및 트랜스막 부위를 유지하는 반면, IgG1 불변 도메인의 CH1 부위가 결실되는 카세트를 만들기 위해 사용하였다 (예를 들어, 도 2 참조). 표적화 구조는 IgG1 유전자의 경첩, CH2, CH3 및 트랜스막 도메인 엑손 사이에 자리하는 lox되는 히그로마이신 저항 유전자를 포함하였다. CH1 엑손의 유전자 업스트림 (예를 들어, IgG3, IgD, IgM) 및IgG1 트랜스막 엑손의 다운스트림 (예를 들어, IgG2b, IgG21, IgE, IgA, 등)은 표적화 구조에 의해 변형되지 않았다. 모든 불변 도메인에 대한 스자리 부위는 표적화 구조에 의해 변형되지 않았다. 결실 전체의 뉴클레오티드 서열은 다음을 포함하는데, 이것은 결실 지점에 존재하는 스플라이스 수용체 서열을 나타내낸다: TGACAGTGTA ATCACATATA CTTTTTCTTG T(AG)TGCCCAG GGATTGTGGT TGTAAGCCTT GCATATGTAC AGGTAAGTCA GTAGGCCTTT CACCCTGACC C (SEQ ID NO:64). 결실 서열은 스플라이스 수용체의 전-CH1 서열 5' 및 스플라이스 수용체의 경첩 엑손 서열 3'인 스플라이스 수용체 (상기 괄호 내 함유되는 AG)를 포함한다.
실시예3 : ES 세포에서 마우스 중쇄 불변 부위의 변형
A. IgG1 - CH1 -경첩 표적화 벡터로 마우스 ES 세포의 표적화
마우스 ES 세포를 상기 설명되는 표적화 구조 (즉, IgG1 유전자의 CH1 및 경첩 부위의 결실을 도입한 표적화 구조)로 표적화하였다. ES 세포는 129 종 및 C57BL/6 종의 50/50 혼합체이고, 마우스 헤비 및 경쇄 가변 부위 유전자 세그먼트를 재배열되지 않은 사람 헤비 및 경쇄 가변 부위 유전자 세그먼트로 대체하는 것을 포함하는 유전적 변형을 함유하는 VELOIMMUNE®이다. C57BL/6과 교배하기 위해 사용되는 129 종은 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 부위 유전자 세그먼트를 사람 헤비 및 경쇄 가변 부위 유전자 세그먼트로 대체하는 것을 포함하는 종이다.
이형접합체 VELOIMMUNE® 마우스는 하나의 대립 유전자에 129 종의 내인성 마우스 중쇄 불변 부위 유전자의 단일 세트를 함유하고 다른 대립 유전자에 C57BL/6 종의 내인성 마우스 중쇄 불변 부위 유전자의 단일 세트를 함유한다. 129 중쇄 대립 유전자는 내인성 마우스 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트를 대체하는 사람 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트인 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트의 자리와 인접하다 (즉, 내인성 마우스 자리에). BL/6 중쇄 대립 유전자는 야생형 마우스 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트와 인접하다. VELOIMMUNE® 마우스는 또한 야생형 내인성 마우스 경쇄 불변 부위 유전자를 함유한다. 따라서, IgG, D, E, 또는 A CH1 결실을 포함하는 구조로 129 대립 유전자를 표적화함으로써 키메라화 사람/마우스 중쇄 항체를 생산할 수 있지만, 유사한 구조로 C57ML/6 대립 유전자를 표적화함으로써, 완전히 CH1 도메인이 결핍되고 경첩이 결핍된 마우스 중쇄 항체를 생산할 수 있다.
상기 설명되는 VELOIMMUNE® 마우스의 ES 세포를 실시예 2의 섹션 A의 선형화되는 표적화 벡터로 전기천공하였고 히그로마이신 저항 유전자의 존재에 대해 선택하였다.
B. IgG - CH1 표적화 벡터로 마우스 ES 세포의 표적화
유사한 방식으로, 마우스 ES 세포를 실시예 2의 섹션 B에서 설명되는 CH1 표적화 구조로 표적화하였다 (또한 도 2 참조). ES 세포는 129 종 및 C57BL/6 종의 50/50 혼합체이고, 마우스 헤비 및 경쇄 가변 부위 유전자 세그먼트를 재배열되지 않은 사람 헤비 및 경쇄 가변 부위 유전자 세그먼트로 대체하는 것을 포함하는 유전적 변형을 함유하는 VELOIMMUNE®이다. C57BL/6과 교배하기 위해 사용되는 129/SvEvTac 종은 마우스 중쇄 및 경쇄 가변 부위 유전자 세그먼트를 사람 중쇄 및 경쇄 가변 부위 유전자 세그먼트로 대체하는 것을 포함하는 종이다.
이형접합체 VELOIMMUNE® 마우스는 하나의 대립 유전자에 129/SvEvTac 종의 내인성 마우스 중쇄 불변 부위 유전자의 단일 세트를 함유하고 다른 대립 유전자에 C57BL/6 종의 내인성 마우스 중쇄 불변 부위 유전자의 단일 세트를 함유한다. 129/SvEvTac 중쇄 대립 유전자는 내인성 마우스 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트를 대체하는 사람 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트인 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트의 자리와 인접하다 (즉, 내인성 마우스 자리에). BL/6 중쇄 대립 유전자는 야생형 마우스 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트와 인접하다. VELOIMMUNE® 마우스는 또한 야생형 내인성 마우스 경쇄 불변 부위 유전자를 함유한다. 따라서, IgG, D, E, 또는 A CH1 결실을 포함하는 구조로 129/SvEvTac 대립 유전자를 표적화함으로써 키메라화 사람/마우스 중쇄 항체를 생산할 수 있지만, 유사한 구조로 C57ML/6 대립 유전자를 표적화함으로써, 완전히 CH1 도메인이 결핍되고 경첩이 결핍된 마우스 중쇄 항체를 생산할 수 있다.
상기 설명되는 VELOIMMUNE® 마우스의 ES 세포를, 실시예 2의 섹션 B에서 설명되는, 선형화되는 표적화 벡터로 전기천공하였고 히그로마이신 저항 유전자의 존재에 대해 선택하였다.
실시예4 : 변형된 IgG1 불변 부위를 수반하는 마우스의 생성
A. IgG1 - CH1 -경첩 결실을 수반하는 마우스
상기 설명되는 표적화되는 ES 세포를 기증자 ES 세포로서 사용하였고 VELOCIMOUSE® 방법 (예를 들어, US Pat. No. 7,294,754 및 Poueymirou et al . (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99. 참조)에 의해 8-세포 단계 마우스 배아로 도입하였다. 표적화되는 C57BL/6 IgG1 대립유전자를 함유하는 VELOCIMICE® (기증자 ES 세포로부터 완벽히 유도된 F0 마우스)를 결실되는 경첩 및 CH1 부위의 업스트림 및 다운스트림에 자리한 서열의 존재를 검출하는 대립 유전자 검정 (Valenzuela et al ., supra)의 변형을 사용한 지노타이핑으로 확인하였다.
IgG1 CH1 및 경첩 결실 (C57BL/6 대립 유전자, 즉, 마우스 대립 유전자에서)에 대해 지노타이핑되는 마우스를, 표적화 구조에 의해 도입되는, IgG1 CH3 엑손의 lox되는 hyg 카세트 다운스트림 및 IgG1 트랜스막 엑손의 업스트림을 제거하기 위해 Cre 제거자 마우스 종 (예를 들어, International Patent Application Publication No. WO 2009/114400 참조)과 교배하였다 (예를 들어, 도 3 참조). 새끼를 지노타이핑하였고 IgG1 CH1 및 경첩 결실에 대한 새끼 이형접합체를 새끼 혈청의 C57BL/6 대립유전자로부터 발현되는 IgG1 중쇄를 검사하기 위해 선택하였다.
B. IgG1 - CH1 결실을 수반하는 마우스
유사한 방식으로, IgG1 CH1의 결실을 수반하는 표적화되는 ES 세포를 기증자 ES 세포로서 사용하였고 VELOCIMOUSE® 방법 (예를 들어, US Pat. No. 7,294,754 및 Poueymirou et al . (2007) F0 generation mice that are essentially fully derived from the donor gene-targeted ES cells allowing immediate phenotypic analyses Nature Biotech. 25(1):91-99. 참조)에 의해 8-세포 단계 마우스 배아로 도입하였다. 표적화되는 129/SvEvTac 대립유전자를 함유하는 VELOCIMICE® (기증자 ES 세포로부터 완벽히 유도된 F0 마우스)를 결실되는 CH1 부위의 업스트림 및 다운스트림에 자리한 서열의 존재를 검출하는 대립 유전자 검정 (Valenzuela et al ., supra)의 변형을 사용한 지노타이핑으로 확인하였다.
IgG1 CH1 결실 (129/SvEvTac 대립 유전자, 즉, 사람 대립 유전자에서)에 대해 지노타이핑되는 마우스를, 표적화 구조에 의해 도입되는, IgG1 CH3 엑손의 lox되는 hyg 카세트 다운스트림 및 IgG1 트랜스막 엑손의 업스트림을 제거하기 위해 Cre 제거자 마우스 종 (예를 들어, International Patent Application Publication No. WO 2009/114400 참조)과 교배하였다 (예를 들어, 도 2 참조). 새끼를 지노타이핑하였고 IgG1 CH1 결실에 대한 새끼 동형접합체를 변형된 IgG1 중쇄 발현을 검사하기 위해 선택하였다.
실시예5 : 변형된 IgG1 유전자를 수반하는 마우스의 중쇄 항체
A. IgG1 -Δ CH1 -Δ경첩 마우스
CH1 및 경첩 결실을 함유하는 것으로 상기 확인되는 마우스 새끼, 및 야생형 새끼를 교배하였고 교배되는 마우스의 혈청을 항-mIgG1 항체를 사용하여 혈청에서 발현되는 IgG를 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅에 대해 제조하였다. 간단히 말하면, 10 uL의 마우스 혈청의 1:100 희석액을 감소되는 SDS-PAGE에 사용하였고, 젤을 PVDF 막으로 옮겼다. 블롯을 하룻밤 동안 0.05% TWEEN-20이 들어있는 트리스-완충되는 식염수 (TBST; Sigma)에 5% 비지방 밀크로 차단하였고, TBST로 세척당 5분 동안 4번 세척하였고, TBST에 1% 비지방 밀크에서 1:1000으로 희석되는 1차 항체에 상온에서 2시간 동안 노출하였다. 블롯을 세척당 5분 동안 6번 씻었다. 블롯을 5분 동안 SUPERSIGNALTM West Pico Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific)로 현상하였고 1분 동안 필름에 노출하였다.
표적화되는 기증자 ES 세포로부터 유도된 VELOCIMOUSE® (50% 야생형 BL/6; 50% ΔCH1-Δ경첩 BL/6)의 혈청은 밴드의 혼합체를 나타내었다: 약 57.5 kD의 한 밴드, 야생형 IgG에 대해 예상되는 크기, 및 45 kD에 한 밴드, CH 도메인 및 경첩이 결핍된 IgG에 대해 예상되는 크기 (도 9). 결과는 야생형 BL/6 대립 유전자의 정상적인 마우스 중쇄 및 ΔCH1-Δ경첩 BL/6 대립 유전자의 ΔCH1/Δ경첩 마우스 중쇄를 발현하는 VELOCIMOUSE®와 일치한다. 이 결과는 기능적 IgM 유전자 및 CH1 도메인 및 경첩 부위가 결핍된 IgG 유전자를 함유하는 유전적으로 변형된 마우스는 혈청에서 중쇄 항체를 발현할 수 있다는 것을 입증한다.
B. IgG1 -Δ CH1 마우스
유사한 방식으로, CH1 결실에 대해 상동접합체인 마우스 새끼, 및 야생형 새끼를 교배하였다. 교배되는 마우스의 혈장 및 혈청 (5마리의 상동접합체; 2마리의 야생형)을 항-mIgG1 항체를 사용하여 혈청에서 발현되는 IgG를 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅에 대해 제조하였다 (상기 설명됨). IgG1-ΔCH1 결실에 대해 상동접합체인 마우스의 혈청 및 혈장의 웨스턴 블롯은 밴드의 혼합체를 나타내었다: 약 45 kD의 한 밴드, CH1 도메인이 결핍된 단일 체인 IgG에 대해 예상되는 크기, 및 75 kD에 한밴드, CH1 도메인이 결핍된 다이머 IgG에 대한 예상되는 크기 (데이터 미도시). 결과는 하나 또는 둘의 중쇄 자리의 IgG1-ΔCH1 중쇄를 발현하는 상동접합체 VELOCIMMICE®와 일치한다. 이 결과는 기능적 IgM 유전자 및 CH1 도메인이 결핍된 IgG 유전자를 함유하는 유전적으로 변형된 마우스는 동물의 면역 시스템의 말초 림프구에서 중쇄 항체를 발현할 수 있다는 것을 입증한다.
실시예6 : IgG1 - CH1 -경첩 결실에 대한 마우스 상동접합체의 정의
CH1-경첩 결실에 대한 VELOCIMICE® 이형접합체를 결실에 대한 마우스 상동접합체를 얻기 위해 함께 교배하였다. 4마리의 마우스 새끼는 IgG ΔCH1-Δ경첩에 대한 상동접합체로 확인되었다. 이 4마리의 마우스 및 야생형 마우스를 교배하였고 교배되는 마우스의 혈청을 혈청에서 항-mIgG1 항체를 사용하여 발현되는 IgG를 확인하기 위해 웨스턴 블롯팅을 준비하였다 (상기 설명되는 바와 같이). 도 9는 이 실험에 사용되는 PVDF 막으로부터 현상되는 필름을 나타낸다. 혈청을 1:5 및 1:10으로 희석하였고 각 희석액 10uL를 각 마우스에 대해 나란히 젤에 로딩하였다. 젤 이미지의 윗 부분에, 레인을 각 마우스 뿐만 아니라 IgG1 (1) 및 IgG2a (2a) 대조군에 대해 표시하였다.
야생형 마우스의 혈청은 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 정상적인 항체를 발현하는 야생형 마우스에 대한 예상되는 패턴으로 나타났다 (약 150 kD). 모든 4마리의 마우스 (IgG1ΔCH1Δ경첩에 대한 상동접합체)는 각각 밴드의 혼합체를 나타낸다:약 150 kD의 한 밴드, IgG1 (예를 들어, IgG2a, IgG2b 또는 IgG3) 외에 야생형 IgG에 대한 예상되는 크기, 및 45 kD에 한 밴드, CH1 도메인 및 경첩이 결핍된 IgG에 대한 예상되는 크기 (도 9). 이 결과들은 CH1 도메인 및 경첩 부위가 결핍되고 경쇄가 결핍된 IgG1 중쇄 항체를 발현하는 마우스와 일치한다. 이 결과는 기능적 IgM 유전자 및 CH1 도메인 및 경첩 부위가 결핍된 IgG 유전자를 함유하는 유전적으로 변형된 마우스가 혈청에서 중쇄 항체를 발현할 수 있다는 것을 더 입증한다.
또 다른 실험에서, IgG의 혈청 발현을 마우스 상동접합체로부터 IgG1ΔCH1-Δ경첩에 대해 ELISA를 사용하여 결정하였다. 간단히 말하면, mIgG1 또는 mIgG2b에 대해 특이적인 항체 (Pharmingen)를 따로 희석하였고 100ul/웰을 플레이트에 1X PBS에 2ug/mL로 덮었고 4℃에서 하룻밤 동안 배양하였다. 다음날 플레이트를 0.05% Tween-20이 들어있는 PBS (PBST; Sigma)로 네 번 세척하였다. 네 번째 세척 후, 플레이트를 5% BSA가 들어있는 PBST 250uL/웰로 블록하였고 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 혈청 및 표준을 0.5% BSA가 들어있는 PBST로 400ng/mL (mIgG1) 또는 600ng/mL (mIgG2b)의 시작 농도에서 플레이트 아래로 (위에서 아래로) 단계적으로 희석하였다 (3.16의 희석 인자). 블로킹 후, 플레이트를 다시 PBST로 네 번 세척하였다. 네 번째 세척 후, 혈청 또는 표준 100uL를 플레이트에 추가하였고 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 다시 PBST로 네 번 세척하였다. 세척 후, 비오티닐화 검출 항체 100uL (래트 항-mIgG1 10ng/mL 또는 항-mIgG2b 250ng/mL; Pharmingen)을 플레이트에 추가하였고 상온에서 1시간 동안 배양하였다. 플레이트를 다시 상기 설명되는 바와 같이 세척하였다. 세척 후, 스트렙타비딘과 결합되는 서양고추냉이 퍼옥시다제 (HRP-SA)의 PBST에 1:20,000 희석액 100uL/웰을 플레이트에 추가하였고 플레이트를 상온에서 30분 동안 배양하였다. 플레이트를 PBST로 여섯 번 세척하였고, 그 후 기질 A 및 B (BD OPTEIATM; BD Biosciences)의 1:1 희석액 100uL/웰을 추가하였고 플레이트를 어둠 속에 유지하였다. 반응을 어둠속에서 현상하였고 1N 인산으로 원하는 바와 같이 정지하였다 (약 15분). 정지되는 반응을 Wallac 1420 Work Station VICTORTM Plate Reader에서 450nm의 흡수 파장으로 읽었고 (1.0초/읽음) 결과는 그래프에 점의 자리를 정했다 (도 11).
야생형 마우스의 혈청은 IgG1 및 IgG2b의 정상적인 레벨을 나타내었다. IgG1ΔCH1-Δ경첩에 대한 마우스 상동접합체는 주변에서 CH1 도메인 및 경첩 부위가 결핍된 IgG1을 발현할 수 있었다 (혈청; 도 11의 왼쪽). 게다가, 다른 IgG 이소타입 (예를 들어, IgG2b)의 혈청 레벨은 야생형 레벨로부터 현저히 감소되지 않았다 (도 11의 오른쪽). 이 결과는 기능적 IgM 유전자 및 CH1 도메인 및 경첩 부위가 결핍된 IgG 유전자를 함유하는 유전적으로 변형된 마우스는 혈청에서 검출될 수 있는 변형된 IgG1 이소타입 (즉, CH1 도메인 및 경첩이 결핍된)을 발현할 수 있다는 것을 더 입증한다.
실시예7 : IgG1 변형된 마우스에서 V-D-J 재배열의 분석
A. IgG1 - CH1 -경첩 결실에 대한 마우스 상동접합체
IgG1 ΔCH1-Δ경첩 변형에 대한 마우스 상동접합체를 지라세포로부터 분리되는 RNA를 사용하여 역-트랜스크립타제 폴리머라제 사슬 반응 (RT-PCR)으로 V-D-J 재조합 및 중쇄 유전자 사용에 대해 분석하였다.
간단히 말하면, 비장을 수확하였고 멸균 1회용 봉지에 5% HI-FBS가 들어있는 10mL RPMI-1640 (Sigma)로 관류하였다. 단일 비장을 함유하는 각 봉지는 STOMACHERTM (Seward)에 두었고 중간 세팅으로 30초 동안 균질화하였다. 균질화되는 비장을 0.7um 세포 여과기를 사용하여 여과하였고 원심분리로 (10분 동안 1000rpm) 펠렛화하였고 적혈구 (RBCs)를 BD PHARM LYSETM (BD Biosciences)에서 3분 동안 용해하였다. 지라세포를 RPMI-1640으로 희석하였고 다시 원심분리한 후 PBS (Irvine Scientific) 1mL에 재현탁하였다. RNA를 업계에 알려진 표준 기술을 사용하여 펠렛화되는 지라세포로부터 분리하였다.
RT-PCR을 마우스 중쇄 가변 부위 (VH) 유전자 세그먼트 (Novagen)에 대해 특이적인 디제네레이트 프라이머 및 마우스 IgG1 CH2 프라이머 (CGATGGGGGC AGGGAAAGCT GCAC; SEQ ID NO:40)를 사용하여 지라세포 RNA에 수행하였다. PCR 산물을 젤-정제하였고 pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen)에 클로닝하였고 클로닝 위치 측면 자리의 벡터 서열 내에 자리하는 M13 정방향 (GTAAAACGAC GGCCAG; SEQ UD NO:41) 및 M13 역방향 (CAGGAAACAG CTATGAC; SEQ ID NO:42) 프라이머로 염기순서를 결정하였다. 19개의 클론을 중쇄 유전자 사용 및 재배열된 VH 및 IgG1 불변 부위의 CH2의 결합 지점의 서열을 결정하기 위해 염기순서를 결정하였다 (표 2).
Figure pct00002
도 12는 19개의 RT-PCR 클론 중 11개에 대해 IgG1 불변 부위의 CH2로 재배열된 VH 도메인의 서열 정렬을 나타낸다. 도 12에 나타난 서열은 다른 마우스 중쇄 V, D 및 J 유전자 세그먼트 및 CH1 및 경첩 부위가 없는 마우스 IgG1를 수반하는 독특한 재배열을 도시한다. 내인성 IgG1 불변 부위 유전자의 CH1 및 경첩 부위의 결실에 대한 마우스 상동접합체는 CH1 및 경첩 부위가 없는 마우스 IgG1 불변 부위의 CH2-CH3 부위와 결합되는 마우스 VH 도메인을 함유하는 중쇄를 생산할 수 있고 CH1 및 경첩 부위가 없고 경쇄가 결핍된 마우스 IgG1 중쇄를 발현하는 B 세포를 생산할 수 있었다 (도 8 및 9). 이 재배열은 변형된 자리가 카멜에서 정상적으로 발견되는 것들과 유사한 중쇄 항체를 생산하기 위해서 독립적으로 이 마우스의 복수의, 독립적인 B 세포에서 마우스 중쇄 유전자 세그먼트를 재배열할 수 있었다는 것을 입증한다. 게다가, 이 실시예는 내인성 IgG1 CH1 및 경첩 부위의 결실이 자리를 실행 불가능하게 만들지 않거나 변형된 IgG1 불변 부위를 수반하는 재조합을 방지하지 않는다는 것을 입증한다. 이 마우스는 B 세포 발달에서 어떤 검출가능한 결점 없이 내인성 레파토리의 일부로서 CH1 및 경첩 부위가 없는 IgG1을 함유하는 기능적 중쇄 항체를 만들었다.
B. IgG1 - CH1 결실에 대한 마우스 상동접합체
유사한 방식으로, IgG1 ΔCH1 변형에 대한 마우스 상동접합체를 지라세포로부터 분리되는 RNA를 사용하여 역-트랜스크립타제 폴리머라제 사슬 반응 (RT-PCR)으로 V-D-J 재조합 및 사람 중쇄 유전자 사용에 대해 분석하였다.
간단히 말하면, 비장을 이 실시예의 섹션 A에서 상기 설명되는 바와 같이 2마리의 상동접합체 IgG1-ΔCH1 마우스로부터 분리하였다. CD19+ B 세포를 모아진 지라세포로부터 자기장 세포 분류 (MACS, Miltenyi Biotec)를 사용하여 분리하였다. RNA를 Qiagen ALLPREPTM DNA/RNA 미니 키트 (Qiagen)를 사용하여 분류되는 CD19+ B 세포로부터 추출하였다. 첫 번째 가닥 cDNA를 SUPERSCRIPTTM III Reverse Transcriptase 및 Oligo (dT)20 프라이머 (Invitrogen)로 합성하였다. cDNA를 3' 마우스 IgG1 경첩 특이적 프라이머 및 사람 헤비 가변 선도 서열에 결합할 수 있도록 설계된 5' 디제네레이트 프라이머로 수행된 PCR에 대한 주형으로서 사용되었다.
PCR 산물을 젤-정제하였고 pCR2.1-TOPO TA 벡터 (Invitrogen)에 클로닝하였고 클로닝 위치 측면 자리의 벡터 서열 내에 자리하는 M13 정방향 및 M13 역방향 프라이머로 염기순서를 결정하였다 (이 실시예의 섹션 A에 설명된 바와 같이).
Figure pct00003
IgG1 ΔCH1에 대한 마우스 상동접합체에서 중쇄 유전자 사용을 결정하기 위해서, 28개의 RT-PCR 클론의 염기순서를 결정하였다 (표 4).
Figure pct00004
도 13은 표4에 나타난 7개의 재배열에 대해 IgG1 불변 부위의 경첩-CH2-CH3로 재배열된 VH 도메인의 서열 정렬을 나타낸다. 도 13에 나타난 서열은 다른 마우스 중쇄 V, D 및 J 유전자 세그먼트 및 CH1 부위가 없는 마우스 IgG1를 수반하는 독특한 재배열을 도시한다. 내인성 IgG1 불변 부위 유전자의 CH1 부위의 결실에 대한 마우스 상동접합체는 CH1이 없는 마우스 IgG1 불변 부위의 경첩-CH2-CH3 부위와 결합된 마우스 VH 도메인을 함유하는 중쇄를 생산할 수 있고 CH1 부위가 없고 경쇄가 결핍된 마우스 IgG1 중쇄를 발현하는 B 세포를 생산할 수 있었다 (데이터 미도시). 이 재배열은 하나 또는 둘 다의 변형된 자리 (IgG1 ΔCH1-Δ경첩 및 IgG1 ΔCH1)가 카멜에서 정상적으로 발견된 것들과 유사한 중쇄 항체를 생산하기 위해서 독립적으로 이 마우스의 복수의, 독립적인 B 세포에서 중쇄 유전자 세그먼트 (마우스 및 사람)를 재배열할 수 있었다는 것을 입증한다. 게다가, 이 실시예는 내인성 IgG1 CH1의 결실이 자리를 사용 불가능하게 만들지 않거나 사람 중쇄 V, D 및 J 유전자 세그먼트 및 변형된 IgG1 불변 부위를 수반하는 재조합을 방지하지 않는다는 것을 입증한다. 이 마우스는 B 세포 발달에서 어떤 검출가능한 결점 없이 내인성 레파토리의 일부로서 사람 중쇄 V 도메인 및 CH1이 없는 IgG1을 함유하는 기능적 중쇄 항체를 만들었다.
SEQUENCE LISTING <110> Regeneron Pharmaceuticals, Inc. <120> MICE THAT MAKE HEAVY CHAIN ANTIBODIES <130> 0761A-WO <140> To be assigned <141> 2010-12-10 <150> 61/285,250 <151> 2009-12-10 <160> 64 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 1 tcaccatgga ctggacctgg a 21 <210> 2 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 2 cccatcaact cacactcttg tccaggggcc tgtcgaaacc 40 <210> 3 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 3 ctggtttcga caggcccctg gacaagagtg tgagttgatg 40 <210> 4 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 4 acgttccgga tgaggagacg gtgaccaggg ttc 33 <210> 5 <211> 1449 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 5 atggactgga cctggaggat ccttttcttg gtggcagcag ccacaggagc ccactcccag 60 gtgcagctgg tgcagtctgg ggctgaggtg aagaagcctg gggcctcagt gaaggtctcc 120 tgcaaggctt ctggatacac cttcaccggc tactatatgc 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Ser Leu Arg Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Glu Glu Leu Glu Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys 115 120 <210> 60 <211> 378 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 60 caggtccagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctgggtcctc ggtgaaggtc 60 tcctgcaagg cttctggagg caccttcagc agctatgcta tcagctgggt gcgacaggcc 120 cctggacaag ggcttgagtg gatgggaggg atcatcccta tctttggtac agcaaactac 180 gcacagaagt tccagggcag agtcacgatt accacggacg aatccacgag cacagcctac 240 atggagctga gcagcctgag atctgaggac acggccgtgt attactgtgc gagagatggg 300 tatagtacct cgtccttaga ctactggggc cagggaaccc tggtcaccgt ctcctcagtg 360 cccagggatt gtggttgt 378 <210> 61 <211> 126 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic <400> 61 Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly 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Claims (20)

  1. IgG의 CH1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는 생식세포계열 유전적 변형을 포함하는 마우스로서, CH1 도메인을 포함하는 IgM을 발현하고 그것의 혈청에서 CH1 도메인이 결핍되고 경쇄가 결핍된 IgG 항체를 발현하고, CH1 도메인을 암호화하는 서열을 포함하는 IgG mRNA를 발현할 수 없는 것을 특징으로 하는 마우스.
  2. 제 1항에 있어서, CH1을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 결실은 IgG1 유전자에 있는 것을 특징으로 하는 마우스.
  3. 제 1항에 있어서, 기능적 면역글로불린 경쇄 유전자 자리를 포함하는 것을 특징으로 하는 마우스.
  4. 제 1항에 있어서, 경쇄가 결핍된 IgG 항체는 CH1 도메인이 결핍된 사람 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  5. 제 1항에 있어서, 경쇄가 결핍된 IgG 항체는 CH1 도메인이 결핍된 마우스 가변 도메인 및 마우스 불변 도메인을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  6. 제 1항에 있어서, IgG2a 유전자의 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  7. 제 1항에 있어서, IgG2b 유전자의 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  8. 제 1항에 있어서, IgG2a 유전자의 결실 및 IgG2b 유전자의 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  9. 제 1항에 있어서, IgG2a 유전자의 결실 및 IgG2b 유전자의 결실을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  10. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 내인성 마우스 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트를 하나 이상의 사람 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트로 대체하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  11. 제 10항에 있어서, 하나 이상의 사람 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트는 사람 VH1 패밀리 유전자 세그먼트인 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  12. 제 11항에 있어서, VH1 패밀리 유전자 세그먼트는 사람 VH 유전자 세그먼트 1-8, 1-18, 및 1-69의 FR1, FR2, 및 FR3과 적어도 90%동일한 FR1, FR2, 및 FR3 부위를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  13. 제 11항에 있어서, 사람 D 유전자 세그먼트 및 사람 J 유전자 세그먼트를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  14. 제 11항에 있어서, 마우스는 사람 D1-7/J4, D3-16/J6, D4-4/J4, D6-6/J4, D6-6/J2, D6-7/J4, 또는 D6-19/J6에 의해 암호화되는 FR4와 적어도 90% 동일한 FR4를암호화하는 재배열된 면역글로불린 유전자를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  15. 제 1항에 있어서, 하나 이상의 내인성 마우스 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트를 하나 이상의 카멜화 사람 중쇄 가변 부위 유전자 세그먼트로 대체하는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  16. 마우스에서 체세포 돌연변이된 중쇄 항체를 만드는 방법으로서,
    a. 재배열되지 않은 사람 또는 마우스 중쇄 면역글로불린 가변 부위 유전자 세그먼트를 포함하고, 기능적 IgG CH1 도메인을 암호화하는 적어도 하나의 대립 유전자의 뉴클레오티드 서열이 결핍되고, CH1 도메인을 포함하는 IgM을 발현하는 마우스를 항원으로 면역화하는 단계
    b. 항원에 대한 면역 반응을 시작하기 충분한 조건 하에 마우스를 유지하는 단계; 및
    c. 사람 또는 마우스 중쇄 면역글로불린 가변 부위 유전자 세그먼트로부터 유도된 가변 도메인을 포함하고, 특이적으로 항원에 결합하는 체세포 돌연변이된 중쇄 항체를 마우스로부터 분리하는 단계;
    를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 모든 또는 실질적으로 모든 V, D, 및 J 유전자 세그먼트를 하나 이상의 사람 V, 사람 D, 및 사람 J 유전자 세그먼트로 대체하는 것을 포함하는 유전적으로 변형된 마우스로서, 하나 이상의 사람 V, D, 및 J 유전자 세그먼트는 내인성 마우스 자리에서 마우스 중쇄 불변 부위 유전자 자리에 작동 가능하게 연결되고, 마우스 중쇄 불변 부위 유전자 자리는 전체-길이 IgM 유전자와, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, 및 이들의 조합으로부터 선택된 IgG 유전자의 CH1 도메인을 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 결실을 포함하는 IgG 유전자를 포함하고; 마우스는 CH1 부위가 있는 IgM을 포함하는 B 세포 수용체를 발현하고, IgM은 동족 람다 또는 카파 경쇄와 관련된 중쇄를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  18. 제 17항에 있어서, 하나 이상의 사람 V, D, 및 J 유전자 세그먼트는 VH1, VH3, VH4, 및 이들의 조합으로부터 선택된 가변 부위 패밀리의 사람 유전자 세그먼트를 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  19. 제 18항에 있어서, 하나 이상의 사람 유전자 세그먼트는 1-2, 1-8, 1-18, 1-46, 1-69, 3-21, 3-72, 4-59, 및 이들의 조합으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
  20. 제 18항에 있어서, 하나 이상의 사람 V, D, 및 J 유전자 세그먼트는 D1-7, D3-16, D4-4, D6-6, D6-7, D6-19, J2, J3, J4, 및 이들의 조합을 포함하는 것을 특징으로 하는 유전적으로 변형된 마우스.
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